KR102585956B1 - 조건부 활성 폴리펩티드 및 이를 제조하는 방법 - Google Patents

조건부 활성 폴리펩티드 및 이를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

돌연변이 DNA를 제조하기 위해, 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를, DNA 중 하전된 아미노산 잔기의 코돈의 총 수를 증가시키는 것과, DNA 중 비하전 아미노산 잔기의 코돈의 총 수를 감소시키는 것으로부터 선택되는 기술 한 가지 이상을 사용하여 모 폴리펩티드의 순 전하를 증가시킴으로써 진화시키는 단계; 돌연변이 폴리펩티드를 수득하기 위해, 이 돌연변이 DNA를 발현시키는 단계; 그리고 제1 검정시 어떤 조건의 제1 값에서의 활성의, 제2 검정시 동일 조건의 제2 값에서의 동일 활성에 비한 감소를 보이는 돌연변이 폴리펩티드들로부터 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하는 단계를 포함하는, 모 폴리펩티드로부터 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다. 본 조건부 활성 폴리펩티드, 이를 포함하는 약학 조성물, 이의 나노입자 및 약물 접합체, 그리고 이의 용도도 또한 제공된다.

Description

조건부 활성 폴리펩티드 및 이를 제조하는 방법
본 발명은 요망되는 활성을 가지는 개선된 폴리펩티드를 제공하는 분야에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 어느 한 조건 하에서의 활성이 다른 조건 하에서의 활성보다 더 큰, 조건부 활성 폴리펩티드와, 모 폴리펩티드로부터 이 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
단백질, 구체적으로 효소나 항체를 상이한 조건에서 다양한 특징에 대해 활성이거나 안정적이도록 진화시키는 방법을 기술하는 문헌은 상당히 많이 있다. 예를 들어 효소는 고온에서 안정적이도록 진화되었다. 고온에서 효소 활성이 개선되는 상황에서, 개선의 실질적 부분은 Q10 룰에 의해 공통적으로 기술되는 더 큰 운동 활성의 결과일 수 있으며, 이때 효소의 경우에 매 10℃의 증가에 대해 산출량이 배가되는 것으로 평가된다.
게다가 단백질을 자체의 정상 작동 조건에서 탈안정화함으로써, 정상 작동 조건에서 단백질 활성을 감소시키는 자연발생 돌연변이가 존재한다. 예를 들어 저온에서 활성을 띄지만, 돌연변이체의 기원이 되는 야생형 단백질에 비해서는 통상적으로 그 활성 수준이 감소한 공지의 온도 돌연변이체가 존재한다.
예를 들어 어느 한 조건에서는 활성이 더 작거나 실질적으로 비활성이지만, 다른 조건에서는 더 큰 활성을 보이는 것과 같이 조건부 활성인 폴리펩티드를 제조하는 것이 요망된다. 임의의 환경에서 활성화 또는 비활성화되거나, 또는 시간이 경과함에 따라 활성화 또는 비활성화되는 폴리펩티드를 제조하는 것도 또한 요망된다. 폴리펩티드가 조건부 활성에 대해 진화 또는 개선될 수 있는, 온도 이외의 다른 조건들로서는 pH, 삼투압, 삼투질농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도를 포함한다. 폴리펩티드의 활성 이외에, 진화 중 다른 특성들, 예컨대 내약성 및 단백분해 내성을 개선시키는 것이 종종 요망된다.
하나 이상의 아미노산 치환이 발생하여 개선된 특성들이 달성된, 개선된 특성을 가지는 공지의 돌연변이 폴리펩티드가 다수 존재한다. 예를 들어 미국 특허 제8,318,469호에는, G43D 및 F665Y와 같은 돌연변이 2개 중 하나를 가지는 돌연변이 서무스 브록키아누스(Thermus brockianus) 핵산 중합효소가 개시되어 있다. 이 돌연변이 중합효소는 돌연변이가 발생하지 않은 중합효소에 비하여 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 감소되었다. DNA 중합효소 효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성은 비보호 5'말단을 가지는 프라이머를 비롯한 핵산을 분해할 수 있으므로, 이 활성은 종종 요망되지 않기도 한다.
미국 특허 제8,536,301호에는, 피브로넥틴 α5β1, 또는 비트로넥틴 ανβ3 및 ανβ5 인테그린의 세포 표면 수용체와 큰 친화성으로 결합하는 돌연변이 폴리펩티드가 개시되어 있다. 이 돌연변이 펩티드는 RGD 인테그린 결합 모티프를 함유하는 종속 서열이 삽입된, 분자 스캐폴드(molecular scaffold)를 기반으로 한다. 종속 서열의 길이는 약 9개 내지 약 13개 아미노산으로서, RGD에는 다양한 아미노산이 측접하고 있다. 분자 스캐폴드는, 바람직하게 노틴(knottin), 예컨대 EETI, AgRP, 및 아가톡신 IVB를 기반으로 하되, 이 펩티드들은 엄격하게 규정된 3차원 입체구조를 가진다.
미국 특허 제8,921,086호에는, 활성 부위 영역에 대한 뉴클레오티드 유사체의 관용성이 개선된 돌연변이 DNA 중합효소가 개시되어 있다. 이 돌연변이 중합효소는 야생형 DNA 중합효소에 비하여 375번 위치와 512번 위치에 아미노산 치환을 가질 수 있다. 375번 위치의 치환으로서는 E375H, E375S, E375K, E375R, E375A, E375Q, E375W, E375Y 및 E375F를 포함한다. 52번 위치의 치환으로서는 K512W, K512Y, K512F, K512L, K512H, K512D 및 K512를 포함한다.
미국 특허 제6,329,178호에는 자연 발생 DNA 중합효소의 활성 부위에 있는 하나 이상의 아미노산을 돌연변이시킴으로써 이 자연 발생 DNA 중합효소로부터 유래된 돌연변이 DNA 중합효소가 개시되어 있다. 이 돌연변이 DNA 중합효소는 자연 발생 DNA 중합효소의 정확도 또는 효소 활성에 비하여 변경된 정확도 또는 변경된 효소 활성을 가진다. 자연 발생 DNA 중합효소는 아미노산 서열 모티프 AspTyrSerGlnIleGluLeuArg 또는 LeuLeuVa1AlaLeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArg를 포함하는 활성 부위를 가진다. 돌연변이 DNA 중합효소는 (a) 이 아미노산 서열 모티프 중 2개 이상의 아미노산 치환을 가지거나, 또는 (b) 이 아미노산 서열 모티프 중 Glu 이외의 아미노산의 치환을 가진다.
이러한 돌연변이 단백질은, 이것의 기원이 되는 야생형 단백질의 특성에 비하여 변경된 특성을 가진다. 그러나 이 돌연변이 단백질의 변경된 특성은 조건이 변함에 따라 바뀌지 않는다.
모 폴리펩티드가 어느 한 조건에서 비활성이거나 또는 실질적으로 비활성이 되도록(즉 50%, 30% 또는 10% 미만의 활성을 보이고, 특히 1%의 활성을 보이도록) 함과 동시에, 다른 조건에서는 동등하거나 더 큰 활성을 보이도록 유지하도록 이 모 폴리펩티드를 진화시키는 것은, 하나 이상의 활성 증가 돌연변이(들)와 하나 이상의 탈안정화 돌연변이(들)가 공존할 것을 필요로 할 수 있다. 조건부 활성 폴리펩티드의 개발이 필요하다.
미국 특허 제8,709,755호에는 야생형 항체를 암호화하는 DNA를 진화시켜 돌연변이 항체를 제조하는 단계, 돌연변이 항체와 야생형 항체를 제1 조건 하에서 검정시키고, 제2 조건 하에서 검정시키는 단계, 그리고 (a) 제1 조건하의 검정에서 항원에 대한 결합 활성의, 제1 조건하의 동일 검정에서 야생형 항체의 항원에 대한 결합 활성에 비한 감소와, (b) 제2 조건하의 검정에서 항원에 대한 결합 활성의, 제2 조건하의 동일 검정에서 야생형 항체의 항원에 대한 결합 활성에 비한 증가 둘 다를 보이는 돌연변이 항체 적어도 하나로부터 조건부 활성 항체를 선택하는 단계를 포함하는, 조건부 활성 항체를 제조하기 위한 방법이 개시되어 있다.
조건부 활성 항체가 치료 항체로서 사용될 때, 이 조건부 활성 항체는, 바람직하게 정상 생리학적 조건에서는 감소한 활성을 보이고, 치료 부위, 예컨대 종양 미세환경에 조성될 수 있는 비정상 조건에서는 증가한 활성을 보인다. 이러한 선택적 작용의 결과로서, 조건부 활성 항체는 정상 생리학적 조건이 조성되는 정상 조직/장기에 잠재적으로 덜 해로운 영향을 미칠 수 있으므로, 부작용도 덜 일으킬 수 있다. 이는, 더 연장된 치료 및/또는 조건부 활성 항체의 더 높은 용량의 사용을 허용할 수 있다.
본 발명은, 더욱 효율적인 생산을 위해 유도성 돌연변이유발을 이용하여 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하기 위한 신규 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이 방법에 의해 제조된 신규 조건부 활성 폴리펩티드를 제공하기도 한다.
일 양태에서, 본 발명은 모 폴리펩티드의 순 전하(net charge)를 증가시킴으로써 수득될 수 있는 조건부 활성 폴리펩티드를 제공하는데, 이 경우 상기 조건부 활성 폴리펩티드는 제1 검정시 어떤 조건의 제1 값에서의 활성의, 제2 검정시 동일 조건의 제2 값에서의 동일 활성에 비한 감소를 보인다. 하전된 아미노산 잔기들은 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신으로부터 선택될 수 있으며, 선택적으로는 히스티딘일 수도 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 순 전하는 폴리펩티드 중 하전된 아미노산 잔기의 총 수를 증가시키는 것, 폴리펩티드 중 비하전 아미노산 잔기의 총 수를 감소시키는 것, 아니면 이의 조합으로부터 선택되는 기술 한 가지 이상을 통하여 증가할 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건은 pH, 온도, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스, 전해질 농도, 단백질 농도 및 이것들 중 2가지 이상의 조합으로부터 선택될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건은 pH일 수 있으며, 조건부 활성 폴리펩티드는 정상 생리학적 pH에서 감소한 활성을, 그리고 정상 생리학적 pH와 상이한 비정상 pH에서 증가한 활성을 보일 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건부 활성은 분자량 900 a.m.u. 미만이고, 증가한 활성이 요망되는 pH로부터 pKa 2 단위 이하, 또는 3 단위 이하만큼 벗어난 종 적어도 하나의 존재하에 검정될 수 있다. 앞선 구현예들에서, 종의 pKa는 pH의 제1 값과 pH의 제2 값 사이일 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건부 활성은 히스티딘, 히스타민, 수소화된 아데노신 이인산염, 황화수소, 수소화된 아데노신 삼인산염, 시트르산염, 아세트산염, 젖산염, 이황화물, 암모늄, 중탄산염, 인산이수소 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 종 적어도 하나의 존재하에 검정될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 제1 검정 및 제2 검정은 혈청 부재하에 검정 용액 중에서 수행될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 순 전하는 아미노산 잔기 치환, 아미노산 삽입 또는 이의 조합을 통하여 모 폴리펩티드에 하전된 아미노 잔기 하나 이상을 도입함으로써 증가할 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기는 모 폴리펩티드의 활성 부위에 도입될 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 하나 이상의 하전된 아미노 잔기는 모 폴리펩티드의 활성 부위 외부 영역에 도입될 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건부 활성 폴리펩티드는 조건부 활성 항체일 수 있고, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기는 조건부 활성 항체의 상보성 결정 영역들 중 적어도 하나에 도입될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기는 5개 미만의 하전된 아미노산 잔기, 또는 4개 미만의 하전된 아미노산 잔기, 또는 3개 미만의 하전된 아미노산 잔기, 또는 2개 미만의 하전된 아미노산 잔기일 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기는 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 선택될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건부 활성 폴리펩티드는 조건의 제1 값에서 가역적으로 비활성화될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 제1 검정 및 제2 검정은 히스티딘, 히스타민, 수소화된 아데노신 이인산염, 황화수소, 수소화된 아데노신 삼인산염, 시트르산염, 아세트산염, 젖산염, 중탄산염, 이황화물, 암모늄, 인산이수소 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 종의 존재 하에 수행될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 어떤 조건의 제1 값은 대상체에 조건부 활성 폴리펩티드가 투여되는 부위, 또는 조건부 활성 폴리펩티드가 작용하는 대상체 내 부위의 장기 또는 조직에 있어서의 생리학적 조건의 정상 범위 안에 있는 정상 생리학적 조건의 값일 수 있고, 어떤 조건의 제2 값은 조건부 활성 폴리펩티드가 투여되는 부위, 또는 조건부 활성 폴리펩티드가 작용하는 부위의 장기 또는 조직에 있어서의 생리학적 조건의 정상 범위에서 이탈한 비정상 조건의 값일 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건부 활성 폴리펩티드는 단백질 또는 단백질 단편일 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건부 활성 폴리펩티드는 항체, 단일 사슬 항체 및 항체 단편일 수 있고, 활성은 항원, 항체의 Fc 영역 또는 효소에의 결합 활성이며, 활성은 효소 활성 또는 수용체, 조절 단백질, 가용성 단백질, 시토카인 및 수용체의 단편, 조절 단백질, 스트레스 단백질, 볼트(vault) 관련 단백질, 뉴런 단백질, 소화관 단백질, 성장 인자, 미토콘드리아 단백질, 세포기질 단백질, 동물 단백질, 구조 단백질 및 식물 단백질이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 앞선 구현예들 중 임의의 하나의 조건부 활성 폴리펩티드 유효량만큼과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 약학 조성물은 적어도 하나의 항암제를 추가로 포함할 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 적어도 하나의 항암제는 화학요법제, 방사선요법제, 호르몬요법제, 독소 또는 면역요법제일 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 적어도 하나의 항암제는 탁산, 메이탄시노이드, 오리스타틴, 칼리키아미신, 듀오크라마이신, MMAE, 수면제, 듀오마이신, 안트라사이클린, CC-1065 유사체, 도세탁셀, 카텝신, 리신, 겔로닌, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, RNase 및 독성 방사성동위원소로부터 선택되는 독소일 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건부 활성 폴리펩티드는 적어도 하나의 항암제, 또는 적어도 4개의 항암제, 또는 적어도 6개의 항암제에 접합될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 앞선 구현예들 각각의 조건부 활성 폴리펩티드의 고형 종양, 염증 관절, 또는 뇌 질환이나 장애의 치료, 또는 노화된 세포의 대상체로부터의 제거를 위한 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 앞선 구현예들 각각의 조건부 활성 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 고형 종양, 염증 관절 또는 뇌 질환이나 장애의 치료 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 앞선 구현예들 각각의 조건부 활성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 앞선 구현예들의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 또는 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 대상체의 세포 또는 조직과, 검출 가능하도록 표지화된, 앞선 구현예들 각각의 조건부 활성 폴리펩티드를 접촉시키는 단계[다만 여기서 조건부 활성 폴리펩티드는 암 세포상 표적에 결합함]; (b) 조건부 활성 폴리펩티드가 대상체의 세포나 조직에 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암의 존재를 진단하기 위한 방법을 제공한다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 세포 또는 조직을 조건부 활성 폴리펩티드와 접촉시키는 것은 시험관 내에서 진행될 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 세포 또는 조직을 조건부 활성 폴리펩티드와 접촉시키는 것은 상기 대상체 내에서 진행될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 앞선 구현예들의 조건부 활성 폴리펩티드들 중 적어도 하나를 함유하는 결합 도메인 적어도 하나를 포함하는 이중 특이적 항체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 상이한 결합 도메인 또는 촉매 도메인 2개를 함유하는 키메라 단백질을 제공하는데, 여기서 이 도메인들 중 하나 또는 둘 다는 앞선 구현예들의 조건부 활성 폴리펩티드들 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 앞선 구현예들의 조건부 활성 폴라리펩티드들 중 적어도 하나를 포함하는 암 살상 바이러스를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 모 폴리펩티드로부터 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 DNA 중 하전된 아미노산 잔기의 코돈의 총 수를 증가시키는 것, DNA 중 비하전 아미노산 잔기의 코돈의 총 수를 감소시키는 것, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 기술 한 가지 이상을 사용하여 돌연변이 DNA를 제조함으로써 폴리펩티드의 순 전하가 증가하도록 진화된다. 돌연변이 DNA는 돌연변이 폴리펩티드가 수득되도록 발현되고; 조건부 활성 폴리펩티드는 돌연변이 폴리펩티드들로부터 선택된다. 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는, 제1 검정시 어떤 조건의 제1 값에서의 활성의, 제2 검정시 동일 조건의 제2 값에서의 동일 활성에 비한 감소를 보인다. 하전된 아미노산 잔기는 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로부터 선택된다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 진화 단계는 선택적으로 올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발로부터 선택되는 부위 유도성 돌연변이유발 기술을 이용할 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 진화 단계는 코돈 치환 또는 코돈 삽입을 이용할 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 하전된 아미노산 잔기는 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 선택될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 하나 이상의 코돈이 모 폴리펩티드의 활성 부위를 암호화하는 DNA의 영역에 도입될 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 모 폴리펩티드는 모 항체일 수 있고, 활성 부위는 모 항체의 상보성 결정 영역일 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 하나 이상의 하전된 아미노 잔기는 모 폴리펩티드의 활성 부위 외부 영역에 도입될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 활성 부위 외부 영역은 항체의 불변 영역 또는 항체의 구조틀 영역일 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건부 활성 폴리펩티드는 조건의 제1 값에서 가역적으로 비활성화될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건은 pH, 온도, 삼투압, 삼투질농도, 산화 스트레스, 전해질 농도 및 단백질 농도로부터 선택될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 제1 검정 및 제2 검정은 혈액 중 발견된 단백질을 포함하는 검정 용액 중에서 수행될 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 혈액 단백질은 알부민일 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 제1 검정 및 제2 검정은 혈청의 부재하에 검정 용액 중에서 수행될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 제2 조건의 값은 대상체에 조건부 활성 폴리펩티드가 투여되는 부위, 또는 조건부 활성 폴리펩티드가 작용하는 대상체 내 부위의 장기 또는 조직에 있어서의 생리학적 조건의 정상 범위 안에 있는 정상 생리학적 조건의 값일 수 있고, 제1 조건의 값은 조건부 활성 폴리펩티드가 투여되는 부위, 또는 조건부 활성 폴리펩티드가 작용하는 부위의 장기 또는 조직에 있어서의 생리학적 조건의 정상 범위에서 이탈한 비정상 조건의 값일 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건은 pH일 수 있고, 제1 검정 및 제2 검정은 분자량 900 a.m.u. 미만이고, pKa가 제1 pH 값으로부터 3 단위 이하만큼 벗어난 종 적어도 하나를 포함하는 검정 매질 중에서 수행될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 조건은 pH일 수 있고, 제1 검정 및 제2 검정은 분자량 900 a.m.u. 미만이고, pKa가 제2 pH 값과 제1 pH 값 사이인 종 적어도 하나를 포함하는 검정 매질 중에서 수행될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 제1 검정 및 제2 검정은 히스티딘, 히스타민, 수소화된 아데노신 이인산염, 수소화된 아데노산 삼인산염, 시트르산염, 아세트산염, 젖산염, 황화수소, 이황화물, 암모늄, 중탄산염, 인산이수소 및 이의 조합으로부터 선택되는 종을 포함하는 검정 매질 중에서 수행될 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 선택 단계는 친화성, 발현 수준 및 인간화로부터 선택되는 특성을 기반으로 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하는 과정을 추가로 포함할 수 있다.
앞선 구현예들 각각에 있어서, 발현 단계는 파아지 전시 또는 진핵생물 세포 생산 숙주를 이용할 수 있다. 앞선 구현예들 각각에 있어서, 발현 단계는 진핵생물 세포 생산 숙주 내에서 수행될 수 있으며, 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 동일한 진핵생물 세포 생산 숙주 내에서 발현될 수 있다.
도 1은, 실시예 9에서 제조된 조건부 활성 항체의 pH 6.0에서의 선택성을, 이 항체의 pH 7.4에서의 선택성과 비교하여 보여준다.
도 2는, 상이한 완충제 용액 중에서 검정된, 몇 가지 상이한 조건부 활성 항체들의 어떤 항원에 대한 결합 활성들을 보여준다.
도 3은, 조건부 활성 항체의 결합 활성에 대한, 크렙스(Krebs) 완충제 조성 변화의 영향을 보여준다.
도 4는, 3개의 상이한 조건부 활성 항체의 결합 활성은 실시예 12에 기술된 바와 같이 pH 7.4에서 중탄산염의 농도와 이의 존재에 의존하였음을 보여준다.
도 5는, 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)의 구조를 보여주는 도해이다.
도 6은, 데옥시헤모글로빈(deoxyhemoglobin)에 있어 염 다리의 형성을 보여주는 도해로서, 여기서 3개의 아미노산 잔기는 데옥시헤모글로빈의 T 4차 구조를 안정화하는 염 다리를 2개 형성하고, 이로써 산소에 대한 낮은 친화성이 초래된다.
도 7은, 상이한 완충제 용액 중 ROR2에 대한 조건부 활성 항체의 활성을 보여준다.
도 8은, 상이한 완충제 용액 중 Axl에 대한 조건부 활성 항체의 활성을 보여준다.
도 9a ~ 9e는, pH 6.0 및 pH 7.4에서, 상이한 항체 농도로 야생형 항 Axl 항체와 조건부 활성 항 Axl 항체가 사용되었을 때, A549 세포에 대한 이 항체들의 세포 사멸 결과를 보여준다.
도 10a ~ 10d는, 상이한 완충제 중 상이한 pH 수준일 때, 인간 Axl 및 사이노몰거스 Axl에 대한 조건부 활성 항 Axl 항체의 결합 친화성을 보여준다.
도 11a ~ 11h는, 상이한 pH 수준일 때, 듀오마이신에 접합된 조건부 활성 항 Axl 항체에 의한 상이한 세포주의 세포 사멸을 보여준다.
도 12는, 상이한 pH 수준일 때, 듀오마이신에 접합된 조건부 활성 항 Axl 항체에 의한 A549 세포의 세포 사멸을 보여준다.
도 13은, 듀오마이신 접합 조건부 활성 항 Axl 항체에 의한 치료의, 이종이식 마우스 내 종양 부피에 대한 효과를 보여준다.
도 14a 및 14b는, 항 Axl 항체/듀오마이신 접합체 주입 후 시간이 경과함에 따라 사이노몰거스 원숭이 혈액 중 듀오마이신 접합 조건부 활성 항 Axl 항체의 존재가 확인됨을 보여준다.
도 15a는, 주입 바로 전(전 (D-3))으로부터 시작하여 듀오마이신 접합 조건부 활성 항 Axl 항체 주입 후 3일(후 (D-3))에 이르기까지의 시간이 경과함에 따라 사이노몰거스 원숭이의 혈액 중 아스파르트산염 아미노기전이효소(AST)의 존재가 확인됨을 보여준다.
도 15b는, 주입 바로 전(전 (D-3))으로부터 시작하여 듀오마이신 접합 조건부 활성 항 Axl 항체 주입 후 3일(후 (D-3))에 이르기까지의 시간이 경과함에 따라 사이노몰거스 원숭이의 혈액 중 알라닌 아스파르트산염 아미노기전이효소(ALT)의 존재가 확인됨을 보여준다.
도 16은, 듀오마이신 접합 조건부 활성 항 Axl 항체 주입 후 시간이 경과함에 따른, 사이노몰거스 원숭이 혈액 중 림프구 개수를 보여준다.
도 17a 및 17b는, 실시예 21에 기술된 바와 같이 파클리탁셀 접합 조건부 활성 항 Ror2 항체 치료 후 이 치료가 이종이식 마우스 내 종양 부피에 미치는 효과를 보여준다.
정의
본원에 제공된 실시예들의 이해를 돕기 위하여, 자주 등장하는 임의의 방법들 및/또는 용어들이 본원에 정의될 것이다. 하기 용어들의 정의들은 미국 특허 제8,709,755호(B2)를 참조로 내려진다: "제제(agent)", "모호한 염기 요구조건", "아미노산", "증폭(amplification)", "키메라 특성(chimeric property)", "동족체(cognate)", "비교 윈도우(comparision window)", "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)", "~에 대응하다", "분해 유효량", "한정된 서열 구조 틀", "한정된 서열 커널", "분해", "지향성 결찰(directional ligation)", "DNA 셔플링", "약물(drug)" 또는 "약물 분자", "유효량", "에피토프(epitope)", "효소", "진화(evolution)" 또는 "진화시키는 것(evolving)", "단편(fragment)" 또는 "유도체(derivative)" 또는 "유사체(analog)", "단일 아미노산 치환의 완전 범위", "유전자(gene)", "유전적 불안정성", "비 상동성(heterologous)", "상동성(homologous)" 또는 "부분 상동성(homeologous)", "산업적 응용", "동일한" 또는 "동일성", "동일성의 구역", "단리된(isolated)", "단리된 핵산", "리간드", "결찰(ligation)", "링커(linker)" 또는 "스페이서(spacer)", "미세환경", "진화될 분자 특성", "돌연변이(mutation)", "N,N,G/T", "정상 생리학적 조건" 또는 "야생형 작동 조건", "핵산 분자", "핵산 분자", "~를 암호화하는 핵산 서열" 또는 "~의 DNA 암호화 서열" 또는 "~를 암호화하는 뉴클레오티드 서열", "효소(단백질)를 암호화하는 핵산" 또는 "효소(단백질)를 암호화하는 DNA" 또는 "효소(단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드", "특이적 핵산 분자 종", "작업 핵산 시료를 핵산 라이브러리로 조립하는 것", "핵산 라이브러리", "구성물", "올리고뉴클레오티드"(또는 동의어로서 "올리고"), "상동성", "작동 가능하게 결합된", "모 폴리뉴클레오티드 세트", "환자(patient)" 또는 "대상체(subject)", "생리학적 조건", "집단(population)", "프로폼(pro-form)", "의사랜덤(pseudorandom)", "유사 반복 단위(quasi-repeated unit)", "랜덤 펩티드 라이브러리", "랜덤 펩티드 서열", "수용체", "재조합(recombinant)" 효소, "합성" 효소, "관련된 폴리뉴클레오티드", "환원 재편성(reductive reassortment)", "기준 서열", "반복 지수(RI)", "제한 부위", "선별성 폴리뉴클레오티드", "서열 동일성", "유사성", "특이적으로 결합하다", "특이적 잡종화(specific hybridization)", "특이적 폴리뉴클레오티드", "엄격한 잡종화 조건", "실질적으로 동일한", "실질적으로 순수한 효소", "실질적으로 순수한", "치료하는 것(treating)", "가변성 분절(variable segment)" 및 "변이체".
측정된 양과 관련하여 본원에 사용되는 바와 같이, "약"이라는 용어는 측정을 이루고 측정의 대상 및 사용되는 측정 기기의 정밀도에 대응하여 일정 수준의 주의를 기울이는 당업자에 의해 예측되는 측정된 양의 정상적인 변차를 지칭한다. 다른 식으로 나타내지 않은 한, "약"은 제공되는 값의 +/- 10%의 변차를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "활성"이란 용어는, 단백질이 수행할 수 있는 임의의 기능, 예컨대 촉매화 반응 및 파트너와의 결합을 지칭한다. 효소의 경우, 활성은 효소 활성일 수 있다. 항체의 경우, 활성은 항체와 이의 항원(들) 사이의 결합 활성(즉 결합 활성)일 수 있다. 수용체 또는 리간드의 경우, 활성은 수용체와 이의 리간드 사이의 결합 활성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "입양 세포 요법(adoptive cell therapy)"이란 용어는, 항종양 활성을 가지는 면역 세포를 암 환자에게 운반하는 것을 지칭한다. 입양 세포 요법은 항종양 활성을 가지는 림프구의 시험관 내 동정, 이러한 세포의 더 많은 개수만큼으로의 시험관 내 증식, 그리고 이러한 세포의 암 보유 숙주에의 주입이 수반되는 치료적 접근법이다. 특히 본 발명에 대한 관심은 자기 유래 입양 세포 요법, 즉 암 환자에 운반될, 항종양 활성을 가지는 면역 세포가 동일한 환자로부터 기원하는 입양 세포 요법에 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체"란 용어는, 비변형 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 항원의 에피토프와 결합할 수 있는 면역글로불린 분자의 단편, 예컨대 Fab, Fab', (Fab')2, Fv 및 SCA 단편을 지칭한다. 어떤 항체의 항원(예컨대 폴리펩티드 항원)에 선택적으로 결합하는 능력을 일부 보유하는 해당 항체 기원의 항체 단편은 당 분야에 널리 공지된 방법(예컨대 문헌(Harlow and Lane, 상동) 참조)을 사용하여 제조될 수 있으며, 이에 관하여는 이하에 추가로 기술된다. 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 예비적 양만큼의 항원을 단리하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체의 기타 다양한 용도로서는 질환(예컨대 종양형성)의 진단 및/또는 병기 판단, 그리고 질환, 예컨대 종양형성, 자가면역 질환, AIDS, 심혈관 질환 및 감염 등을 치료하기 위한 치료적 적용이 있다. 키메라, 인간 유사, 인간화 또는 완전 인간의 것인 항체가 인간 환자에의 투여에 특히 유용하다.
Fab 단편은 항체 분자의 1가 항원 결합 단편으로 이루어져 있으며, 전 항체 분자를 파페인 효소로 분해하여, 비변형 경쇄 및 중쇄 일부로 이루어진 단편을 수득함으로써 제조될 수 있다.
항체 분자의 Fab' 단편은 전 항체 분자를 펩신으로 처리한 후, 환원시켜, 비변형 경쇄와 중쇄의 일부로 이루어진 분자를 수득함으로써 제조될 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체 분자당 2개의 Fab' 단편이 수득된다.
항체의 (Fab')2 단편은 추후 환원 과정을 거치지 않고 펩신 효소로 전 항체 분자를 처리함으로써 수득될 수 있다. (Fab')2 단편은 Fab' 단편 2개가 이황화 결합 2개에 의해 서로 결합하여 이루어진 이량체이다.
Fv 단편은 사슬 2개로 발현되는 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 함유하는 유전자 조작된 단편으로서 정의된다.
단일 사슬 항체("SCA" 또는 scFv)는 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역이 적합하고 가요성인 폴리펩티드 링커에 의해 결합된 채 함유되어 있는 것으로서, 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에 부가 아미노산 서열을 포함할 수 있는 유전자 조작된 단일 사슬 분자이다. 예를 들어 단일 사슬 항체는 암호화 폴리뉴클레오티드에의 결합을 위한 테터 분절(tether segment)을 포함할 수 있다. 기능성 단일 사슬 항체는, 일반적으로 경쇄 가변 영역의 충분한 일부와, 중쇄 가변 영역의 충분한 영역을 함유하여, 특이적 표적 분자 또는 에피토프에의 결합에 대한 전장 항체의 특성을 보유한다.
"항체 의존적 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"란 용어는, 분비된 면역글로불린이 임의의 세포독성 세포(예컨대 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합함으로써, 이와 같은 세포독성 효과기 세포가 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합하게 만들고, 종국에는 세포독소가 표적 세포를 사멸시키게 되는 세포 독성의 한 형태를 지칭한다. 리간드 특이적 고 친화성 IgG 항체로서 표적 세포 표면에 대하여 유도된 IgG 항체는 세포독성 세포를 자극하고, 이러한 사멸에 필요하다. 표적 세포의 용해는 세포외에서 일어나는데, 이는 세포 대 세포의 직접 접촉을 필요로 하고, 보체(complement)를 수반하지 않는다.
임의의 특정 항체가 ADCC에 의한 표적 세포의 용해를 매개하는 능력이 검정될 수 있다. ADCC 활성을 평가하기 위해, 관심 항체는 항원-항체 복합체에 의해 활성화될 수 있는 면역 효과기 세포와 함께 표적 리간드를 전시하는 표적 세포에 부가되고, 이를 통해 표적 세포의 세포용해가 초래된다. 세포 용해는, 일반적으로 용해된 세포로부터 표지(예컨대 방사성 기질, 형광 염료 또는 자연발생 세포내 단백질)가 방출되는 것에 의해 확인된다. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포로서는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 시험관 내 ADCC 검정의 구체적인 예들은 문헌[Bruggemann et al, 1987, J. Exp. Med, vol.166, page 1351; Wilkinson et al, 2001, J. Immunol. Methods, vol.258, page 183; Patel et al, 1995 J. Immunol. Methods, vol.184, page 29]에 기술되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 항체의 ADCC 활성은 생체 내, 예컨대 동물 모델, 예컨대 문헌(Clynes et al, 1998, PNAS USA, vol.95, p. 652)에 개시된 동물 모델 내에서 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "항원" 또는 "Ag"란 용어는, 면역 반응을 촉발할 수 있는 분자로서 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산 또는 면역학적으로 수용성인 특이 세포의 활성화, 아니면 이 둘 다를 수반할 수 있다. 당 업자는 임의의 거대분자, 예컨대 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드가 항원으로서 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 항원은 생물 시료로부터 생성, 합성 또는 유래할 수 있음을 용이하게 알 수 있다. 이러한 생물 시료로서는 조직 시료, 종양 시료, 세포 또는 생물 유체(biological fluid)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "안티센스 RNA"란 용어는, 제2 RNA 분자와의 상보성 또는 부분 상보성을 통해 이 제2 RNA 분자와 이중체를 형성할 수 있는 RNA 분자를 지칭한다. 안티센스 RNA 분자는 제2 RNA 분자의 번역 영역 또는 미번역 영역에 상보성일 수 있다. 안티센스 RNA는 제2 RNA 분자에 완전히 상보성일 필요는 없다. 안티센스 RNA의 길이는 제2 RNA 분자의 길이와 동일할 수 있거나 동일할 수 없는데; 이 안티센스 RNA 분자는 제2 RNA 분자보다 더 길거나 더 짧을 수 있다. 만일 제2 RNA 분자가 mRNA이면, 안티센스 RNA의 결합은 mRNA가 기능성 단백질 생성물로 번역되는 것을 완전히, 또는 부분적으로 막을 것이다.
"바이오시밀러(biosimilar)"또는 "후속생산 생물제제(follow-on biologic)"란 용어는, (임상적으로 비활성인 성분간에 작은 차이가 있을 지라도) 기준 제품과 "매우 유사한" 제품으로서 바이오시밀러를 정의한, 미국 식품의약품안전청(FDA)에 의해 공표된 실용 정의와 일치하는 방식으로 사용된다. 실제로, 기준 제품과 바이오시밀러 제품 사이에는 안전성, 순도 및 효능의 관점에서 임상적으로 유의미한 차이가 존재할 수 있다(공중보건서비스법(PHS) 제262조). 바이오시밀러는 또한 2012년 5월 30일 유럽의약청(European Medicines Agency) 산하 약물사용자문위원회(Committee for Medicinal Products for Human Use; CHMP)에 의해 채택되고, 유럽연합에 의해 "모노클로날 항체를 함유하는 유사 생물 의약 제품에 대한 가이드라인(비임상적 및 임상적 문제들)"(서류 참조번호 EMA/CHMP/BMWP/403543/2010)으로서 공표된 하나 이상의 가이드라인을 만족시키는 것일 수도 있다. 예를 들어 "바이오시밀러 항체"란, 통상 상이한 회사에 의해 제조된, 도입자 항체(innovator's antibody)(기준 항체)의 후속 버전을 지칭한다. 바이오시밀러 항체와 기준 항체 사이의 차이는, 예컨대 다른 생화학 기, 예컨대 인산염, 다양한 지질 및 탄수화물의 항체에의 부착; 번역 후 단백 분해; 아미노산의 화학적 성질 변경(예컨대 포르밀화); 또는 기타 다수의 기작에 의한 번역후 변혀을 포함할 수 있다. 다른 번역후 변형은 제조 공정 운영의 결과일 수 있는데, 예컨대 당화 반응은 생성물이 환원당에 노출될 때 일어날 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 보관 조건은 임의의 분해 경로, 예컨대 산화, 탈아민화 또는 응집이 발생하는 것을 허용할 수 있다. 이와 같이 제품과 관련된 변이체 전부는 바이오시밀러 항체에 포함될 수 있다.
"암" 및 "암성"이란 용어는, 통상 비조절 세포 성장/증식에 의해 특징지어지는 포유동물 내 생리학적 조건을 지칭하거나 기술하는 것이다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 암의 예들로서는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병, 또는 림프성 악성종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 암의 더욱 구체적인 예들로서는 편평세포 암(예컨대 상피 편평세포 암), 폐암, 예컨대 소세포 폐암, 비소세포 폐암("NSCLC"), 폐의 선암종과 폐의 편평세포 암종, 복막의 암, 간 세포 암, 위 또는 위장 암, 예컨대 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막암종 또는 자궁암종, 타액선 암종, 신징 또는 콩팥 암, 전립선암, 외음부암, 갑상샘암, 간암종, 항문암종, 음경암종, 그리고 두경부암을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR" 또는 "CAR들"이란 용어는, 항원 특이성이 세포독성 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포 및 대식세포 상에 이식되어 조작된 수용체를 지칭한다. 본 발명의 CAR은 적어도 하나의 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 세포외 스페이서 도메인(ESD), 경막 도메인(TM), 하나 이상의 보조자극 도메인(CSD), 그리고 세포내 신호전달 도메인(ISD)을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, ESD 및/또는 CSD는 선택적이다. 일 구현예에서, ASTR은 이중 특이적으로서, 2개의 상이한 항원 또는 에피토프를 인지할 수 있다. ASTR이 표적 항원에 특이적으로 결합한 후, ISD는 세포독성 세포의 세포내 신호전달을 활성화한다. 예를 들어 ISD는, CAR의 항원 결합 특성에 의존하며, T 세포의 특이성과 세포독성을, 선택된 표적을 향하여 비 MHC 제한 방식으로 재인도(redirecting)할 수 있다. 비 MHC 제한 항원 인지는, CAR 발현 세포독성 세포에게 항원 가공과 독립적으로 항원을 인지하는 능력을 부여하므로, 종양 도피의 주요 기작을 우회시킨다. 더욱이 CAR이 T 세포에서 발현되면, 이 CAR은 유리하게 내인성 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬들과 이량체를 형성하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"이란 용어는, 항원 결합에 수반되는 아미노산 잔기들이 위치하고 있는 항체의 영역을 지칭한다. CDR은 항체 가변 도메인의 아미노산 배열에 있어 최고의 가변성을 보인다. 데이터베이스, 예컨대 Kabat 데이터베이스는 CDR 동정에 사용될 수 있는데, 다만 이 경우 CDR은, 예컨대 경쇄 가변 도메인의 24 ~ 34번 아미노산 잔기(L1), 50 ~ 56번 아미노산 잔기(L2) 및 89 ~ 97번 아미노산 잔기(L3)와, 중쇄 가변 도메인의 31 ~ 35번 아미노산 잔기(H1), 50 ~ 65번 아미노산 잔기(H2) 및 95 ~ 102번 아미노산 잔기(H3)를 포함하는 것으로서 정의된다(Kabat et al., The Journal of Immunology, vol.147, pp.1709-1719, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242). 대안적으로 CDR은 "초가변 루프"로부터 유래하는 잔기들(경쇄 가변 도메인의 26 ~ 33번 잔기(L1), 50 ~ 52번 잔기(L2) 및 91 ~ 96번 잔기(L3)와, 중쇄 가변 도메인의 26 ~ 32번 잔기(H1), 53 ~ 55번 잔기(H2) 및 96 ~ 101번 잔기(H3)로서 정의될 수 있다)(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917). 통상적으로, 가변 도메인의 아미노산 잔기의 번호메김은 문헌(Kabat et al., 상동)에 기술된 방법으로 이루어진다. 본원에서 "Kabat 부위", "Kabat 잔기" 및 "Kabat에 따라서"와 같은 어구들은, 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 Kabat외 다수의 문헌에 기술된 번호메김 체계를 지칭한다. Kabat 번호메김 체계가 사용될 때, 가변 도메인의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 구조틀(FR) 또는 CDR의 단축 또는 여기에의 삽입에 대응하는 아미노산들을 거의 함유하지 않을 수 있거나 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 52번 잔기 뒤에 아미노산 삽입(Kabat에 따른 52a, 52b 및 52c번 잔기)을 포함할 수 있으며, 중쇄 FR의 82번 잔기 뒤에 삽입된 잔기들(예컨대 Kabat에 따른 82a, 82b 및 82c번 잔기 등)을 포함할 수 있다. 잔기들의 Kabat 번호메김은, "표준" Kabat 번호메김 서열과 항체 서열간에 상동성을 보이는 영역에서의 배열에 의하여 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
"조건부 활성 폴리펩티드"란 용어는, 적어도 하나의 조건 하에서 모 폴리펩티드보다 활성이 더 크고, 제2 조건 하에서는 모 폴리펩티드보다 활성이 더 작은 모 폴리펩티드의 변이체 또는 돌연변이체, 또는 제2 조건 하에서보다 제1 조건 하에서 활성이 적어도 1.3배 더 큰, 모 폴리펩티드의 변이체 또는 돌연변이체 폴리펩티드를 지칭한다. 이 조건부 활성 폴리펩티드는 체내 하나 이상의 선택된 병소에서 활성을 보일 수 있으며/있거나 체내 다른 병소에서 증가 또는 감소한 활성을 보일 수 있다. 예를 들어 일 양태에서, 진화된 조건부 활성 폴리펩티드는 실제로 체온에서는 비활성이지만, 이보다 더 낮은 온도에서는 활성을 띈다. 조건부 활성 폴리펩티드는 조건부 활성 단백질, 단백질 단편, 항체, 항체 단편, 효소, 효소 단편, 수용체 및 수용체 단편, 시토카인 및 이의 단편, 호르몬 및 이의 단편, 리간드 및 이의 단편, 조절 단백질 및 이의 단편, 그리고 성장 인자 및 이의 단편을 포함한다. 본원에 기술된 조건부 활성 폴리펩티드 각각은, 바람직하게 조건부 활성 생체 폴리펩티드이다.
본원에 사용된 바와 같은 "시토카인" 또는 "시토카인들"이란 용어는, 면역계의 세포를 동작시키거나/이 세포에 영향을 미치는 생물학적 분자의 일반 군을 지칭한다. 이 정의는 국부적으로 작용하거나, 혈류를 타고 와서 분비 부위로부터 멀리 떨어진 다른 병소에서 개체의 면역 반응을 조절 또는 조정하는 역할을 하는 생물학적 분자들을 포함함을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적 시토카인으로서는 인터페론-알파(IFN-α), 인터페론-베타(IFN-β), 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨(예컨대 IL-1 내지 IL-29, 구체적으로 IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 및 IL-18), 종양 괴사 인자(예컨대 TNF-알파 및 TNF-베타), 에리트로포이에틴(EPO), MIP3a, 단핵구 화학주성 단백질(MCP)-1, 세포내 부착 분자(ICAM), 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "전해질"이란 용어는, 혈액 또는 기타 체액 중 전하를 운반하는 무기물을 정의하는데 사용된다. 예를 들어 일 양태에서, 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건은 "전해질 농도" 값이 상이할 수 있다 예시적 전해질로서는 이온화 칼슘, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 염화물, 시트르산염, 젖산염, 중탄산염 및 인산염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"전장 항체"란 용어는, 항원 결합 가변 영역(VH 또는 VL) 뿐만 아니라, 경쇄 불변 도메인(CL), 그리고 중쇄 불변 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 항체를 지칭한다. 불변 도메인은 원산 서열 불변 도메인(예컨대 인간 원산 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 항체 중쇄의 불변 도메인 아미노산 서열에 따라서, 전장 항체는 상이한 "군"으로 분류될 수 있다. 전장 항체의 주요 군으로서는 5가지, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이것들 중 일부는 "하위군"(이소타입)으로 추가로 구분될 수 있다(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2). 항체의 상이한 군에 대응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로서 칭하여진다.
본원에 사용된 바와 같은 "성장 인자"란 용어는, 세포의 분화를 유발시킬 수 있는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 성장 인자의 예들로서는 상피 성장 인자(EGF), 형질전환성장인자-알파(TGFα), 형질전환성장인자-베타(TGF-β), 인간내피세포성장인자(ECGF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 골형성단백질(BMP), 신경성장인자(NGF), 혈관내피성장인자(NEGF), 섬유아세포성장인자(FGF), 인슐린유사성장 인자(IGF), 연골유래형태형성단백질(CDMP) 및 혈소판유래성장인자(PDGF)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "호르몬"이란 용어는, 종종 매개체로 동정되는 물질로서, 통상 장기 일부의 선 또는 세포에 의해 방출되어, 유기체의 다른 부분에의 전령으로서 역할을 하는 물질을 나타낸다. 예시적 호르몬으로서는 혈류에 직접 방출되는 내분비 호르몬과, 관으로 직접 분비되고, 관으로부터 혈류로 흐르거나, 확산에 의해 세포에서 세포로 흐르는(이 과정은 측분비 신호전달(paracrine signaling)이라 공지됨) 외분비 호르몬(또는 외분비호르몬(ectohormone))을 포함한다. 척추동물의 호르몬은 3개의 화학 군, 즉 펩티드 호르몬, 지질 및 인지질 유래 호르몬, 그리고 모노아민으로 분류될 수 있다. 펩티드 호르몬은 폴리펩티드 사슬들로 이루어져 있다. 펩티드 호르몬의 예들로서는 인슐린과 성장 호르몬을 포함한다. 지질 및 인지질 유래 호르몬은 지질, 예컨데 리놀레산과 아라키돈산, 그리고 인지질로부터 유래한다. 주요 군은 콜레스테롤과 에이코사노이드로부터 유래하는 스테로이드 호르몬이다. 스테로이드 호르몬의 예들로서는 테스토스테론과 코르티졸이 있다. 모노아민은, 방향족 아미노산 탈카르복실화효소의 작용에 의하여 방향족 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로부터 유래한다. 모노아민의 예들로서는 티록신 및 아드레날린이 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역조정제"란 용어는, 면역계에 대한 작용이, 면역 반응에 수반되는 경로 적어도 하나의 활성의 즉시 또는 지연 향상 또는 감소를 초래하는 제제를 지칭한다. 이러한 반응은 선천적 면역계 또는 적응성 면역계, 아니면 이 둘 다의 일부로서 인위적으로 촉발될 수 있거나, 자연 발생할 수 있다. 면역조정제의 예들로서는 시토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 예컨대 종양 괴사 인자(TNF), 그리고 조혈 인자, 예컨대 인터루킨(예컨대 인터루킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 및 IL-21), 콜로니자극인자(예컨대 과립구-콜로니자극인자(G-CSF) 및 과립구대식세포-콜로니자극인자(GM-CSF)), 인터페론(예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ), "S1 인자"로 명명되는 줄기세포성장인자, 에리트로포이에틴 및 트롬보포이에틴을 포함한다. 적합한 면역조정제 기의 예로서는 IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론 및 TNF(예컨대 TNF-α) 등을 포함한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물로서는 가축(예컨대 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예컨대 인간 및 인간 이외의 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류(예컨대 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "라이브러리"란 용어는, 단일 풀(pool) 내 단백질 무리를 지칭한다. 라이브러리는 DNA 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 cDNA, 또는 임의의 기타 단백질 암호화 DNA 무리는 발현 벡터 내에 삽입되어, 단백질 라이브러리를 이룰 수 있다. cDNA 또는 단백질 암호화 DNA 무리는 또한 파아지 게놈에 삽입되어, 야생형 단백질의 박테리오파아지 전시 라이브러리를 이룰 수 있다. cDNA 무리는 선택된 세포 집단 또는 조직 시료로부터, 예컨대 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 선택된 세포 유형으로부터 유래하는 cDNA 무리는 또한 판매회사, 예컨대 Stratagene®으로부터 시판되고 있다. 본원에 사용된 바와 같은 야생형 단백질의 라이브러리는 생물학적 시료의 무리가 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "리간드"란 용어는, 특정의 수용체에 의해 인지되고, 하나 이상의 결합 부위 내 수용체와 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 리간드의 예들로서는 세포막 수용체에 대한 효현제 및 길항제, 독소 및 뱀독, 바이러스 에피토프, 호르몬, 호르몬 수용체 펩티드, 효소, 효소 기질, 보조인자, 약물(예컨대 아편, 스테로이드 등), 렉틴, 당, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 올리고당체, 단백질 및 모노클로날 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 통상적으로 리간드는 2개의 구조부, 즉 리간드와 이의 수용체의 결합에 수반되는 제1 부, 그리고 이러한 결합에 수반되지 않는 제2 부를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "수용체"란 용어는, 주어진 리간드에 대해 친화성을 가지는 분자를 지칭한다. 수용체는 자연 발생 분자 또는 합성 분자일 수 있다. 수용체는 변경되지 않은 상태로 이용될 수 있거나 다른 종과의 응집체로서 이용될 수 있다. 수용체는 직접적으로 또는 특이 결합 물질을 통해 결합원과 공유 또는 비공유 부착할 수 있다. 수용체의 예들로서는 특이적인 항원 결정기(예컨대 바이러스, 세포 또는 기타 물질)과 반응성인 항체, 예컨대 모노클로날 항체 및 항혈청, 세포막 수용체, 복합 탄수화물 및 당단백, 효소 및 호르몬 수용체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 리간드와 이의 수용체의 결합은, 특이적 분자 인자를 통하여 리간드와 리간드 자체의 수용체 분자가 합하여져, 당업자에게 공지된 다양한 리간드 수용체 결합 검정에 의해 검출될 수 있는 복합체를 형성하는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 "마이크로 RNA" 또는 "miRNA"는, miRNA 유전자로부터 유래하는 미가공 또는 가공 RNA 전사체를 지칭한다. 미가공 마이크로 RNA 유전자 전사체는 통상 길이 약 70개 내지 약 100개 뉴클레오티드인 RNA 전사체를 포함한다. 전사된 마이크로 RNA는 RNase(예컨대 Dicer, Argonaut 또는 RNase III)에 의한 19개 ~ 25개 뉴클레오티드 활성 RNA 분자로의 분해에 의해 가공될 수 있다. 이 19개 ~ 25개 뉴클레오티드 활성 RNA 분자는 또한 "가공" 마이크로 RNA 유전자 전사체 또는 "성숙" 마이크로 RNA라 칭하여지기도 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "다중 특이적 항체"란 용어는, 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 지칭한다. 예시적 다중 특이적 항체는 BBB-R 및 뇌 항원 둘 다와 결합할 수 있다. 다중 특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예컨대 F(ab′)2 이중 특이적 항체)로서 제조될 수 있다. 기능성 항원 결합 부위들을 2개, 3개 또는 이 이상(예컨대 4개) 가지도록 조작된 항체도 또한 고려된다(예컨대 미국 특허 출원 제2002/0004587호(A1) 참조).
본원에 사용된 바와 같은"돌연변이유발 프라이머(mutagenic primer)"란 용어는, 선형의 주기적 증폭 반응(예컨대 중합효소연쇄반응, 즉 PCR)에서 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 지칭하는데, 여기서 프라이머는 주형 DNA 서열과 정확하게 매칭(matching)되지는 않는다. 돌연변이유발 프라이머 중 미스매칭(mismatching)된 뉴클레오티드는 돌연변이유발 프라이머와 관련하여 돌연변이 부위라 지칭된다. 그러므로 증폭 반응 동안, 프라이머의 미스매칭된 뉴클레오티드는 증폭 생성물에 통합되고, 이로 말미암아 돌연변이유발 프라이머를 포함하는 돌연변이유발 DNA 가닥의 합성이 초래된다. 그러므로 돌연변이유발 프라이머는 특이적 돌연변이들을 주형 DNA 서열에 도입할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "나노입자"란 용어는, 그 크기가 나노미터(nm) 단위이고, 최장 길이가 약 1000 nm 미만 또는 약 500 nm 미만, 또는 약 200 nm 미만, 또는 약 100 nm 미만, 또는 약 50 nm 미만인 미시적 입자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 길이는 나노입자상 임의의 두 지점 간 직선으로 측정된 거리를 지칭한다. 본 발명의 나노입자는 그 형상과 크기가 결합 상호작용을 허용하는 한, 울퉁불퉁할 수 있거나, 장방형, 나선형, 막대형, 원반형, 팬케이크형, 원통형, 적혈구세포 유사형, 구형 또는 실질적으로 구형의 형상을 가질 수 있다. 본 발명의 나노입자는, 바람직하게 생체적합성 물질(중합체 또는 지질)로 제조된다.
본원에 사용된 바와 같은 "자연 발생"이란 용어는, 어떤 대상에 대해 사용될 때, 해당 대상이 자연에서 발견될 수 있는 사실을 지칭한다. 예를 들어 자연에 있는 공급원으로부터 단리될 수 있으며, 실험실에서 인간이 의도하는 바에 따라 변형되지 않은, (바이러스를 비롯한) 유기체 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생 서열이다. 대형 폴리펩티드로부터 절제된 폴리펩티드는, 절제된 폴리펩티드의 말단 기들이 절제된 형태로서, 더 이상 인접 폴리펩티드에 결합하지 않을 것이기 때문에, 이보다 큰 자연 발생 폴리펩티드의 말단 기들과 상이할 것이므로, 자연 발생 폴리펩티드가 아니다. 일반적으로 "자연 발생"이란 용어는 어떤 대상이 병에 걸리지 않은(비 발병) 개체에 존재하는 경우, 예컨대 해당 종에 통상적인 경우를 지칭한다.
폴리펩티드의 "순 전하"란 용어는, 폴리펩티드 내 하전된 아미노산 잔기의 총 수와 폴리펩티드 내 아미노산 잔기의 총 수의 비이다. 하전된 아미노산 잔기는 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신을 포함하고, 선택적으로 히스티딘도 포함한다. 비하전 아미노산 잔기는 이외의 자연 발생 아미노산 15개를 포함한다. 폴리펩티드의 순 전하는 폴리펩티드 내 하전된 아미노산 잔기의 총 수를 증가시키거나, 또는 폴리펩티드 내 비하전 아미노산 잔기의 총 수를 감소시키거나, 아니면 이 둘을 조합함으로써 증가할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "산화 스트레스"란 용어는, 예를 들어 분자 산소가 이용되는 대사 과정의 부산물로서 생성된 반응성 산소 라디칼(예컨대 과산화물 음이온(O2 "), 산화질소, 하이드록시 라디칼(OH) 및 과산화수소(H2O2))의 생성(예컨대 문헌 Coyle et al., Science 262:689-695 (1993) 참조)과, 반응성 중간체를 용이하게 해독하거나 이로 인한 손상을 용이하게 회복하는 생물계의 능력 사이의 불균형을 지칭한다. 산화 스트레스는 동물의 조직이나 세포의 시험관 내 또는 생체 내 상태를 지칭할 수 있다. 생 세포 내 정상적인 산화환원 상태의 교란은 세포의 모든 구성성분, 예컨대 단백질, 지질 및 DNA를 손상시키는 과산화물 및 유리 라디칼의 생성을 통해 유해한 영향을 초래할 수 있다.
인간에 있어서, 산화 스트레스는 다수의 질환, 예컨대 죽상경화증, 파킨슨병, 심부전, 심근경색, 알츠하이머병, 여린 X 증후군 및 만성 피로 증후군에 수반되지만, 단기 산화 스트레스는 또한 미토호메시스(mitohormesis) 유도에 의하여 노화를 예방함에 있어 중요할 수 있다. 반응성 산소 종은 병원체를 공격하여 이를 사멸하는 수단으로서 면역계에 의해 이용되므로 유익할 수 있다. 반응성 산소 종은 또한 세포 신호전달에서 사용될 수도 있다. 이는 산화환원 신호전달이라 칭하여진다.
화학 용어들 중 산화 스트레스는 세포 내 환원 전위의 증가(음의 절대값 감소) 또는 세포내 산화환원 커플, 예컨대 글루타치온의 환원 능의 감소이다. 산화 스트레스의 영향력은 이러한 변화의 크기에 의존적인데, 이 경우 세포는 작은 교란을 극복하고 자체의 원래 상태를 되찾을 수 있다. 그러나 더욱 심각한 산화 스트레스는 세포 사멸을 유발시킬 수 있으며, 심지어 중간 정도의 산화는 세포자살을 촉발할 수 있는 한편, 더욱 강력한 스트레스는 세포괴사를 유발시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "모 폴리펩티드" 및 "모 단백질"이란 용어는, 본 발명의 방법을 사용하여 진화됨으로써 조건부 활성 폴리펩티드 또는 단백질로 생성될 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 모 폴리펩티드 단백질은 야생형 단백질 또는 비 야생형 단백질일 수 있다. 예를 들어 치료 폴리펩티드 또는 단백질이나, 돌연변이체 또는 변이체 폴리펩티드 또는 단백질은 모 폴리펩티드 또는 단백질로서 사용될 수 있다. 모 폴리펩티드 및 단백질의 예들로서는 항체, 항체 단편, 효소, 효소 단편, 시토카인 및 이의 단편, 호르몬 및 이의 단편, 리간드 및 이의 단편, 수용체 및 이의 단편, 조절 단백질 및 이의 단편, 그리고 성장 인자 및 이의 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "pH-의존적"이란 용어는, 어떤 폴리펩티드가 상이한 pH 값에서 상이한 특성 또는 활성을 가지는 경우를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "폴리펩티드"란 용어는, 단량체가 아미노산이고, 이 단량체들이 펩티드 결합 또는 이황화 결합을 통해 서로 연결되는 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드는 전장 자연 발생 아미노산 사슬이거나, 이의 단편, 돌연변이체 또는 변이체, 예컨대 결합 상호작용에 있어서 이해관계를 가지는 아미노산 사슬의 선택된 영역일 수 있다. 폴리펩티드는 또한 합성 아미노산 사슬이거나, 아니면 자연 발생 아미노산 사슬 또는 이의 단편과, 합성 아미노산 사슬의 조합일 수 있다. 단편이란, 전장 단백질의 일부분으로서, 그 길이가 통상 약 8개 내지 약 500개 아미노산, 그 길이가, 바람직하게 약 8개 내지 약 300개 아미노산, 더욱 바람직하게 약 8개 내지 약 200개 아미노산, 그리고 더욱더 바람직하게 약 10개 내지 약 50개 또는 약 100개 아미노산인 아미노산 서열을 지칭한다. 추가로 자연 발생 아미노산 이외의 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 페닐 글리신 및 호모아르기닌이 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 유전자 암호화되지 않는 것으로서 통상적으로 마주하게 되는 아미노산도 또한 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 아미노산은 D-광학 이성체 또는 L-광학 이성체 중 어느 하나일 수 있다. D-이성체는 하기 추가로 기술된 특이 상황에 사용하기 바람직하다. 더욱이 기타 펩티도모의체도 또한, 예컨대 폴리펩티드의 링커 서열에 유용하다(문헌(Spatola, 1983, in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins, Weinstein, ed., Marcel Dekker, New York, p.267) 참조). 일반적으로 "단백질"이란 용어는 2개 또는 수 개의 폴리펩티드 사슬이 공유 결합이나 비공유 결합에 의해 서로 모여 포함되어 있는 구조를 포함한다는 점을 제외하고는, "폴리펩티드"란 용어로부터 임의의 유의미한 차이를 전하도록 의도되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "전구약물"이란 용어는, 생체 내에서 대사 활성화를 수행하여 활성 약물로 생성될 전구체 화합물을 지칭한다. 철저한 논의가 문헌(T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," V.14 of the A.C.S. Symposium Series) 및 문헌(Edward B. Roche, ed.,"Bioreversible Carriers in Drug Design," American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987))에 제공되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "재조합 항체"란 용어는, 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 의해 발현된 항체(예컨대 키메라, 인간화 또는 인간의 항체 또는 이것들의 항원 결합 단편)를 지칭한다. 재조합 항체 생산용"숙주 세포"의 예들로서는 (1) 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO), COS, 골수종 세포(Y0 및 NS0 세포 포함), 새끼 햄스터 신장(BHK), Hela 및 Vero 세포; (2) 곤충 세포, 예컨대 sf9, sf21 및 Tn5; (3) 식물 세포, 예컨대 니코티아나(Nicotiana) 속에 속하는 식물(예컨대 니코티아나 타바큠(Nicotiana tabacum)); (4) 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스(Saccharomyces) 속에 속하는 것들(예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)) 또는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 것들(예컨대 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger)); (5) 박테리아 세포, 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia . coli) 세포 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "조절 단백질"이란 용어는, 다른 폴리펩티드 또는 RNA 분자의 활성을 증가 또는 감소시키거나; 다른 폴리펩티드 또는 RNA 분자의 존재비를 증가 또는 감소시키거나; 다른 폴리펩티드 또는 RNA 분자와 또 다른 폴리펩티드, DNA 또는 RNA 분자, 아니면 또 다른 임의의 결합 기질 사이의 상호작용을 변경시키고/변경시키거나; 다른 폴리펩티드 또는 RNA 분자의 세포 내 자리를 변경시키는 임의의 단백질을 지칭한다. 조절 단백질이 어떤 유전자의 전사 속도를 증가 또는 감소시킬 때, 이 조절 단백질은 종종 해당 유전자의 촉진인자 또는 인핸서 영역에 영향을 미치는 전사 인자라 지칭된다. 전사 인자의 예들로서는 포유동물 전사 인자, 예컨대 NFkB, NFl, 환형 AMP 반응 요소 결합 단백질(CREB), MyoD1, 호메오박스 전사 인자, Spl, 발암유전자 및 jun, Mep-1, GATA-1, Isl-1, LFB1, NFAT, Pit-1, OCA-B, Oct-1 및 Oct-2, 효모 A/α, cErb-A, myc, mad 및 max, p53, mdml, 그리고 기타 문헌(Latchman, 1998, Eukaryotic Transcription Factors, 3rd. Ed., Academic Press: New York)에 제시된 바와 같은 것들을 포함한다. 결합 특이성을 제공하는, 융합 단백질의 적어도 DNA 결합 모티프가 소분자 조절인자 결합 부위에 융합된, 이러한 전사 인자 또는 또 다른 전사 인자의 융합 단백질 유도체도 또한 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은"부위 유도성 돌연변이유발"이란 용어는, 예정된 돌연변이를 모 폴리펩티드의 특정된 부위에 발생시키는 방법을 지칭한다. 특정된 부위란, 연구자의 필요에 따라 요망되는 바대로 선택된 부위를 지칭한다. 예정된 돌연변이는 특정된 부위에 있는 아미노산 잔기를 특정의 아미노산으로 치환시키거나, 특정의 아미노산 잔기를 특정된 부위에 삽입하거나, 또는 특정된 부위에 있던 특정의 아미노산을 결실시키는 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "소 간섭 RNA" 또는 "siRNA"란 용어는, siRNA와 서열 상동성을 공유하는 mRNA 분자와 상호작용하여 이의 파괴를 유발할 수 있는 RNA 분자 또는 RNA 유사 분자를 지칭한다(Elbashir et al., Genes Dev, vol.15, pp.188-200, 2001). siRNA는 RNA-유도성 침묵 복합체(RNA-Induced Silencing Complex; RISC)로 공지된 리보핵산단백질에 통합될 수 있는 것으로 생각된다. 이 RISC는 통합된 siRNA 가닥에 적어도 부분적으로 상보성인 mRNA 분자를 동정하기 위해 siRNA 서열을 이용하고, 이후에는 이 표적 mRNA 분자를 절단하거나 이의 번역을 억제한다. 통상의 siRNA는, 각각의 가닥이 약 19개 내지 약 28개의 뉴클레오티드(즉 약 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28 개의 뉴클레오티드)를 가지는 이중 가닥 핵산 분자이다. siRNA는 또한 단일 가닥 RNA일 수도 있는데, 다만 이 경우는 이중 가닥 siRNA보다 그 효율이 떨어진다. 단일 가닥 siRNA의 길이는 약 19개 내지 약 49개 뉴클레오티드이다. 단일 가닥 siRNA는 5' 인산염을 가지거나, 또는 5'위치가 제자리에서 아니면 생체 내에서 인산화된다. 단일 가닥 siRNA는 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 시험관 내 전사에 의해 합성될 수 있거나, 또는 발현 벡터나 발현 카세트로부터 내부적으로 발현될 수 있다. 5' 인산염 기는 키나아제를 통해 부가될 수 있거나, 아니면 RNA의 뉴클레아제에 의한 절단의 결과로 생성될 수 있다.
"소분자"란 용어는, 통상적으로 분자량이 900 a.m.u. 미만이거나, 또는 더욱 바람직하게 500 a.m.u. 미만이거나, 또는 더욱 바람직하게 200 a.m.u. 미만이거나, 또는 더욱더 바람직하게 100 a.m.u. 미만인 분자나 이온을 지칭한다. 본 발명의 검정 및 환경에 있어서, 소분자는 주로 검정이나 환경의 pH에 따라서, 종종 분자와 분자의 탈양성자화된 이온의 혼합물로서 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료 단백질"이란 용어는, 포유동물에 투여되었을 때, 예를 들어 연구자나 임상의에 의해 추구되는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 반응 또는 의학 반응을 유도할 수 있는 임의의 단백질 및/또는 폴리펩티드를 지칭한다. 치료 단백질은 한 가지를 초과하는 생물학적 반응 또는 의학 반응을 유도할 수 있다. 치료 단백질의 예들로서는 항체, 효소, 호르몬, 시토카인, 조절 단백질 및 이것들의 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료적 유효량"이란 용어는, 치료적 유효량만큼이 투여되지 않은 대응 대상체에 비하여, 어떤 질환, 장애 또는 부작용의 치유, 예방 또는 경감을 초래하거나, 또는 어떤 질환이나 장애의 진행 속도의 감소를 초래하는 임의의 양을 의미한다. 이 용어는, 자체의 범위 내에 정상 생리학적 기능을 향상시키는데 유효한 양뿐만 아니라, 제2 약학 제제의 치료 효과를 향상시키거나 보조하는 생리학적 기능을 환자에서 유발시키는데 유효한 양도 또한 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "종양 미세환경"이란 용어는, 고형 종양 내부 및 고형 종양을 둘러싸고 있으면서 종양 세포의 성장과 전이를 지지하는 미세환경을 지칭한다. 종양 미세환경은 주위 혈관, 면역 세포, 섬유아세포, 기타 세포, 가용성 인자, 신호전달 분자, 세포외 기질, 그리고 신생물 형질전환을 촉진할 수 있고, 종양 성장과 침습을 지지할 수 있으며, 종양을 숙주의 면역계로부터 보호할 수 있고, 치료 내성을 조장할 수 있으며, 잠재적 전이를 위한 니치(niche)를 제공하여 잘 자랄 수 있도록 만들어주는 기계적 신호를 포함한다. 종양과 이를 둘러싸고 있는 미세환경은 밀접하게 관련되어 있으면서 지속적으로 상호작용을 한다. 종양은, 세포외 신호를 방출시키고, 종양의 혈관신생을 촉진하며, 주위 면역 관용성을 유도함으로써 자체의 미세환경에 영향을 미칠 수 있는 한편, 미세환경 내 면역 세포는 암성 세포의 성장과 진화에 영향을 미칠 수 있다. 문헌[Swarts et al."Tumor Microenvironment Complexity: Emerging Roles in Cancer Therapy," Cancer Res, vol., 72, pages 2473-2480, 2012; Weber et al.,"The tumor microenvironment," Surgical Oncology, vol.21, pages 172-177, 2012; Blagosklonny,"Antiangiogenic therapy and tumor progression," Cancer Cell, vol.5, pages 13-17, 2004; Siemann,"Tumor microenvironment," Wiley, 2010; and Bagley,"The tumor microenvironment," Springer, 2010]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은, "야생형"이란 용어는, 어떠한 돌연변이도 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "야생형 단백질", "야생-형 단백질", "야생-형 생체 단백질" 또는 "야생형 생체 단백질"은, 자연에서 발견되는 활성 수준으로 활성을 띄고, 자연에서 발견되는 아미노산 서열을 포함할, 자연에서 단리될 수 있는 단백질을 지칭할 수 있다. "모 분자" 및 "표적 단백질"이란 용어는, 또한 야생형 단백질을 포함한다.
상세한 설명
A. 조건부 활성 폴리펩티드
본 발명은 조건부 활성 폴리펩티드와, 모 폴리펩티드로부터 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 조건부 활성 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비하여 순 전하가 증가하였다. 순 전하 증가는 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기를 모 폴리펩티드에 도입하거나, 모 폴리펩티드로부터 하나 이상의 비하전 아미노산 잔기를 결실시키거나, 또는 이 둘 다를 행하여, 모 폴리펩티드의 순 전하를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 하전된 아미노산 잔기는 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로부터 선택된다. 일 양태에서, 돌연변이는 모 폴리펩티드 내 하나 이상의 비하전 아미노산 잔기를 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기로 치환하는 치환일 수 있다. 다른 양태에서, 돌연변이는 추가의 하전된 아미노산 잔기 하나 이상을 모 폴리펩티드에 삽입하는 삽입일 수 있다. 이러한 치환과 삽입의 조합도 또한 이용될 수 있다. 다른 양태에서, 돌연변이는 모 폴리펩티드로부터 하나 이상의 비하전 아미노산 잔기를 결실시키는 것일 수 있다.
모 폴리펩티드에 도입되는 하전 아미노산 잔기는 D(아스파르트산 또는 Asp), E(글루탐산 또는 Glu), R(아르기닌 또는 Arg), K(리신 또는 Lys), 그리고 H(하스티딘 또는 His)이다. D와 E는 음 하전 아미노산 잔기이다. R, K 및 H는 양 하전 아미노산 잔기이다. 아스파르트산, 글루탐산, 리신 및 아르기닌은 통상적으로 정상 생리학적 pH에서 하전된다. 히스티딘은 또한 정상 생리학적 pH에서 하전될 수 있다.
하전된 아미노산 잔기의 수가 증가되어 제공되는 조건부 활성 폴리펩티드는, (a) 제1 검정시 어떤 조건의 제1 값에서의 활성의, 제1 검정시 모 폴리펩티드의 동일 활성에 비한 감소와, (b) 제2 검정시 동일 조건의 제2 값에서의 동일 활성의, 제2 검정시 모 폴리펩티드의 동일 활성에 비한 증가 둘 다를 보인다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 제1 검정시 어떤 조건의 제1 값에서의 활성의, 제2 검정시 동일 조건의 제2 값에서의 동일 활성에 비한 감소를 보인다.
일 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 서열 번호 1을 가지는 모 경쇄 가변 영역으로부터 생성된, Axl 단백질에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(서열 번호 2 ~ 5)일 수 있다. 다른 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 서열 번호 6을 가지는 모 중쇄 가변 영역으로부터 생성된, Axl 단백질에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(서열 번호 7 ~ 9)일 수 있다. 또 다른 양태에서, 조건부 활성 항체는 서열 번호 2 ~ 5로부터 선택되는 경쇄 가변 영역과, 서열 번호 7 ~ 9로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 둘 다를 함유할 수 있다.
다른 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 서열 번호 10을 가지는 모 경쇄 가변 영역으로부터 생성된, Ror2 단백질에 대한 항체의 경쇄 가변 영역(서열 번호 11 ~ 13)이다. 다른 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 서열 번호 14를 가지는 모 중쇄 가변 영역으로부터 생성된, Ror2 단백질에 대한 항체의 중쇄 가변 영역(서열 번호 15 ~ 18)이다. 또 다른 양태에서, 조건부 활성 항체는 서열 번호 11 ~ 13으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역과, 서열 번호 15 ~ 18로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 둘 다를 함유할 수 있다.
Axl 또는 Ror2에 대한 조건부 활성 항체는 본 발명의 실시예 15 ~ 22에 추가로 기술되어 있다. 이러한 조건부 활성 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역은, 하전된 아미노산 잔기, 특히 E 및 D가 모 경쇄 가변 영역과 모 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역에 도입된 아미노산 치환을 포함한다.
검정이 수행되는 조건은 동일한 조건이되, 다만 제1 및 제2 값 또는 범위는 상이한 조건이다. 예를 들어 조건이 pH일 수 있을 때, 제2의 정상 생리학적 pH(정상 생리학적 조건)는 7.0 내지 7.8, 또는 7.2 내지 7.6인 반면에, 제1의 비정상 pH(비정상 조건)는 5.8 내지 7.0, 또는 6.2 내지 6.8이다. 조건은 또한 온도, 전해질 농도, 유기 분자 농도 또는 삼투압일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
일 양태에서, 조건은 pH이고, 조건부 활성 폴리펩티드는 pKa가, 활성이 요망되는 pH의 2 pH 단위, 또는 3 pH 단위 이내인 종의 존재 하에 pH 의존적 활성을 가진다. 다른 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 4 내지 약 10, 또는 약 4.5 내지 약 9.5, 또는 약 5 내지 약 9, 또는 약 5.5 내지 약 8, 또는 약 6.0 내지 약 7.0인 종의 존재 하에 pH 의존적 활성을 가지는 조건부 활성 폴리펩티드에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 이황화물, 중탄산염, 히스티딘, 시트르산염, 아세트산염, 젖산염 및 이것들의 혼합물의 존재 하에 pH 의존적 활성을 가지는 조건부 활성 폴리펩티드에 관한 것이다.
조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 유의미한 영향을 미치는, 검정 매질 중에 존재하는 종들은 적어도 2가지의 이온화 상태, 즉 비하전 상태 또는 저 하전 상태, 그리고 하전 상태 또는 고 하전 상태를 가지는 종인 경향이 있다. 결과적으로 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는 종의 pKa는, 해당 종이 특정 pH에서 폴리펩티드의 특정 활성에 영향을 미치게 될 영향의 정도를 결정하는데 있어서 어떤 역할을 한다.
pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드는 제1 pH에서가 제2의 상이한 pH에서보다 더 큰 활성을 가지는데, 여기서 상기 두 경우의 활성은 상기 나열된 종들 중 하나 이상이 존재할 때의 검정에서 측정된다. 조건부 활성 폴리펩티드의 pH 의존성을 측정하기 위해, 이 폴리펩티드의 동일 활성은 2가지의 상이한 pH 값에서의 동일한 검정 매질 중에서 검정된다.
동일 검정 매질 중 제1 pH에서의 활성 대 제2 pH에서의 동일 활성의 비는 pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드의 선택성이라 칭하여질 수 있다. pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드의 선택성은 적어도 약 1.3, 또는 적어도 약 1.5, 또는 적어도 약 1.7, 또는 적어도 약 2.0, 또는 적어도 약 3.0, 또는 적어도 약 4.0, 또는 적어도 약 6.0, 또는 적어도 약 8.0, 또는 적어도 약 10.0, 또는 적어도 약 20.0, 또는 적어도 약 40.0, 또는 적어도 약 60.0, 또는 적어도 약 100.0이다.
pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드는 통상 검정 매질 중 상이한 종들이 존재할 때 상이한 활성을 가지는 것이 관찰되었다. 적어도 2가지의 이온화 상태, 즉 비하전 상태 또는 저 하전 상태, 그리고 하전 상태 또는 고 하전 상태를 가지는 종은 특정 pH에서 pKa 값에 따라 더 큰 정도로 해리될 수 있으며, 이에 따라서 조건부 활성 폴리펩티드 내에 존재하는 하전된 아미노산 잔기와의 상호작용 확률은 증가하게 된다. 이 인자는, 조건부 활성 폴리펩티드의 선택성 및/또는 pH 의존적 활성을 향상시키기 위해 이용될 수 있다.
이론에 의해 국한되지 않을 때, 모 폴리펩티드에 도입된 하전 아미노산 잔기는, 검정 매질 중 pH가 바뀜에 따라 조건부 활성 폴리펩티드의 하전을 변경시킴으로써, 상이한 pH에서 조건부 활성 폴리펩티드의 활성을 바꾸는 것으로 생각된다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드 내 음 하전 아미노산 잔기(예컨대 E 및 D)는, 검정 매질 중 pH가 산성 pH 범위에 있을 때에는 비하전 또는 저 하전되지만, 검정 매질 중 pH가 중성 또는 염기성 pH 범위에 있을 때에는 음으로 하전된다. 조건부 활성 폴리펩티드의 하전 변화는, 상이한 pH값에서 상기 논의된 종들 중 하나와 이 폴리펩티드가 상이하게 상호작용할 수 있도록 만드는 것으로 생각된다. 일 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 어떤 한 pH에서는 검정 매질 중 하전된 종들과 더욱 쉽게 상호작용할 수 있을 듯하지만, 또 다른 pH로서 상이한 pH에서는 동일 검정 매질 중 동일한 하전 종들과 좀처럼 상호작용하기가 쉽지 않을 듯하다. 즉 이 점은 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
조건부 활성 폴리펩티드의 하전 성질은 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는데 적합한 종을 결정하는데 사용되는 하나의 인자일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비하여 양으로 하전된 아미노산 잔기, 즉 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 더 많이 가질 수 있다. 그러므로 조건부 활성 폴리펩티드는, 활성이 요망되는 환경에 존재하는 특정 종과의 상호작용을 요망되는 수준으로 보이고/보이거나 감소된 활성이 요망되는 환경에 존재하는 특정의 종과의 상호작용을 요망되는 수준으로 보이는 것으로 선택될 수 있다. 이와 유사하게, 조건부 활성 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비하여 음으로 하전된 아미노산 잔기, 즉 아스파르트산염 및 글루탐산염을 더 많이 가질 수 있다.
pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드상 하전된 아미노산 잔기의 자리도 또한 활성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드의 결합 부위에 대한 하전 아미노산 잔기의 근접성은 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는데 사용될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드에 대한 하전된 환경 종의 상호작용은 pH 의존적 조건부 활성 폴리펩티드의 활성을 차단하거나 방해할 수 있다. 예를 들어 하전된 환경 종과 상호작용하는 하전 아미노산은 조건부 활성 폴리펩티드의 결합 부위에 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 나타낼 수 있다.
다른 구현예들에서, 하전된 환경 종과 조건부 활성 폴리펩티드의 상호작용은, 폴리펩티드상 상이한 기들, 특히 하전되었거나 분극된 기들 사이에 염 다리를 형성할 수 있는 경우가 있을 수 있다. 염 다리의 형성은 폴리펩티드 구조를 안정화하는 것으로 공지되어 있다(Donald, et al.,"Salt Bridges: Geometrically Specific, Designable Interactions," Proteins, 79(3): 898-915, 2011; Hendsch, et al.,"Do salt bridges stabilize proteins? A continuum electrostatic analysis," Protein Science, 3:211-226, 1994). 염 다리는 보통 "호흡(breathing)"이라고 칭하여지는, 부수적이지만 항상적인 구조 변형을 수행하는 단백질 구조를 안정화하거나 고정시킬 수 있다(Parak,"Proteins in action: the physics of structural fluctuations and conformational changes," Curr Opin Struct Biol., 13(5):552-557, 2003). 구조 변동은 조건부 활성 단백질이 자체의 파트너를 효율적으로 인지하여 결합하는 것을 허용하므로, 단백직의 구조적 "호흡"은 단백질 기능과, 단백질 및 자체의 파트너와의 결합에 중요하다(Karplus, et al.,"Molecular dynamics and protein functions," PNAS, vol.102, pp.6679-6685, 2015). 아마도 염 다리는 파트너가 결합 부위에 접근하는 것을 직접적으로 차단할 수 있을 것이므로, 염 다리가 형성됨으로 말미암아 조건부 활성 폴리펩티드상 결합 부위, 특히 결합 포켓(binding pocket)은 이 폴리펩티드 자체의 파트너에의 접근성을 떨어뜨릴 수 있다. 심지어 결합 부위로부터 멀리 떨어져 있는 염 다리일지라도, 알로스테릭 효과가 결합 부위의 입체구조를 변경시켜 결합을 억제할 수 있다. 그러므로 염 다리가 조건부 활성 폴리펩티드의 구조를 안정화(고정)하면, 이 폴리펩티드는 자체의 파트너와의 결합에 있어서 활성이 더 작아질 수 있으며, 그 결과 활성의 감소가 초래된다.
폴리펩티드와, 이 폴리펩티드의 구조가 염 다리에 의해 어떻게 안정화되는지에 관한 한 가지 공지된 예는 헤모글로빈이다. 구조적 및 화학적 연구는, 화학기 세트 적어도 2개, 즉 pKa 값이 pH 7에 가까운 히스티딘 β146 및 α122 측쇄와 아미노 말단이 염 다리 형성에 관여함을 규명하였다. 데옥시헤모글로빈에 있어서, β146의 말단 카르복실산염기는 또 다른 αβ 이량체의 α 서브유닛 내 리신 잔기와 염 다리를 형성한다. 이러한 상호작용은, 히스티딘 β146의 측쇄가 동일 사슬 내 94번 음 하전 아스파르트산염과의 염 다리 형성에 참여할 수 있는 위치에서 히스티딘 β146의 측쇄를 잠그는데(locking), 다만 이 때 히스티딘 잔기의 이미다졸기는 양성자화된다(도 6). pH가 높을 때, 히스티딘 β146의 측쇄는 양성자화되지 않고, 염 다리도 형성하지 않는다. 그러나, pH가 떨어지면 히스티딘 β146의 측쇄는 양성자화되고, 히스티딘 β146 및 아스타르트산염 β94 사이에는 염 다리가 형성되는데, 이 염 다리로 말미암아 데옥시헤모글리빈의 4차 구조가 안정화되고, 이로써 능동적으로 대사작용을 하는 조직(낮은 pH)에서 산소가 방출되는 경향은 더 커지게 된다. 헤모글로빈은 낮은 pH에서 산소에 대한 pH 의존적 결합 활성을 보이는데, 이 경우 산소에 대한 결합 활성은 염 다리 형성으로 말미암아 감소한다. 다른 한편, 높은 pH에서는 산소에 대한 결합 활성은 염 다리 부재로 말미암아 증가한다.
이와 유사하게, 소분자, 예컨대 중탄산염은 조건부 활성 폴리펩티드 내에 염 다리를 형성함으로써 조건부 활성 폴리펩티드와 이의 파트너의 결합 활성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어 pKa 6.4보다 낮은 pH에서 중탄산염은 양성자화되므로 하전되지 않게 된다. 비하전 중탄산염은 염 다리를 형성할 수 없으므로, 조건부 활성 폴리펩티드와 이의 파트너의 결합에 미약하게 영향을 미친다. 그러므로 조건부 활성 폴리펩티드는 낮은 pH에서 자체의 파트너와 높은 결합 활성을 보이게 된다. 다른 한편으로, 중탄산염의 pKa보다 높은, 높은 pH에서 중탄산염은 양성자를 잃음으로써 이온화되므로, 음으로 하전된다. 음 하전 중탄산염은 조건부 활성 폴리펩티드상 양 하전 기 또는 분극된 기 사이에 염 다리를 형성하여, 이 조건부 활성 폴리펩티드의 구조를 안정화할 것이다. 이는 조건부 활성 폴리펩티드와 이의 파트너의 결합을 차단하거나 감소시킬 것이다. 그러므로 조건부 활성 폴리펩티드는 높은 pH에서 작은 활성을 가지게 된다. 그러므로 조건부 활성 폴리펩티드는 중탄산염이 존재할 때, 높은 pH에서보다 낮은 pH에서 결합 활성이 더 큰, 조건부로 활성인 활성을 가지게 된다.
중탄산염과 같은 종이 검정 매질 중에 존재하지 않을 때, 조건부 활성 폴리펩티드는 자체의 조건부 활성을 잃을 수 있다. 이 점은, 아마도 조건부 활성 폴리펩티드 상에 이 폴리펩티드의 구조를 안정화(고정)하는 염 다리가 형성되지 않기 때문일 것이다. 그러므로 파트너는 임의의 pH에서 조건부 활성 폴리펩티드상 결합 부위에 대하여 유사한 접근경로를 가지게 되어, 제1 pH 및 제2 pH에서 유사한 활성을 보일 것이다.
다른 구현예들에서, 소분자 또는 이온과, 조건부 활성 폴리펩티드 사이의 상호작용은 자체의 활성을 증가시키는 방식으로 폴리펩티드의 구조를 변경할 수 있다. 예를 들어 구조 변경은, 결합 친화성에 필요한 결합 부위에 대한 결합 에너지, 입체 장해 또는 자리를 변경함으로써 조건부 활성 폴리펩티드의 결합 친화성을 개선할 수 있다. 이러한 경우들에서, 활성이 요망되는 pH에서 조건부 활성 폴리펩티드에 결합하는 소분자를 선택할 것이 요망될 수 있다.
비록 염 다리(이온 결합)는 화합물 및 이온이 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는 가장 강력하고도 일반적인 방식이지만, 이러한 화합물 및 이온과 조건부 활성 폴리펩티드 사이의 또 다른 상호작용도 또한 이 조건부 활성 폴리펩티드의 구조를 안정화(고정)하는데 기여할 수 있음이 이해될 것이다. 또 다른 상호작용으로는 수소 결합, 소수성 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용(van der Waals interaction)을 포함한다.
몇몇 구현예들에서, 적합한 화합물이나 이온을 선택하기 위해 조건부 활성 폴리펩티드는 이의 진화 기원인 모 폴리펩티드와 비교됨으로써, 이 조건부 활성 폴리펩티드가 음 하전 아미노산 잔기 또는 양 하전 아미노산 잔기를 더 높은 비율로 가지는지 여부가 확인된다. 제2 pH에서 적합하게 하전된 화합물은 이후 각각 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 영향을 미치는 것으로 선택될 수 있다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드가 모 폴리펩티드보다 양 하전 아미노산 잔기를 더 높은 비율로 가질 때, 적합한 소분자는 조건부 활성 폴리펩티드와 상호작용하기 위해서 통상 제2 pH에서 음으로 하전되어야 할 것이다. 다른 한편, 조건부 활성 폴리펩티드가 모 폴리펩티드보다 음 하전 아미노산 잔기를 더 높은 비율로 가질 때, 적합한 소분자는 조건부 활성 폴리펩티드와 상호작용하기 위해서 통상 제2 pH에서 양으로 하전되어야 할 것이다.
다른 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성은, 조건부 활성 폴리펩티드의 결합 파트너인 표적 폴리펩티드와 소분자 또는 이온의 상호작용에 의해 제어된다. 이 경우, 그 목적이 소분자 또는 이온과 표적 폴리펩티드 사이에 상호작용을 발생시키는 것이라는 점을 제외하고 상기 논의된 바와 동일한 원리가 또한 적용될 수 있다. 표적 폴리펩티드는, 예를 들어 조건부 활성 항체에 대한 항원일 수 있거나, 또는 조건부 활성 수용체에 대한 리간드일 수 있다.
적합한 소분자는 제1 pH에서의 비하전 또는 저 하전 상태로부터, 제2 pH에서의 하전 또는 고 하전 상태로의 전이가 진행되는 임의의 무기 분자 또는 유기 분자일 수 있다. 그러므로 소분자는, 통상 pKa가 제1 pH와 제2 pH 사이일 수 있다. 예를 들어 중탄산염의 pKa는 6.4이다. 그러므로 더 높은 pH, 예컨대 pH7.4 일 때, 음 하전 중탄산염은 조건부 활성 폴리펩티드 내 하전된 아미노산 잔기와 결합할 것이고, 그 활성을 감소시킬 것이다. 다른 한편으로, 더 낮은 pH, 예컨대 pH6.0일 때, 저 하전 중탄산염은 조건부 활성 폴리펩티드와 동일한 양으로 결합할 것이고, 이에 따라 조건부 활성 폴리펩티드의 더 큰 활성 발휘가 허용될 것이다.
이황화물의 pKa는 7.05이다. 그러므로 더 높은 pH, 예컨대 pH7.4 일 때, 더 많은 음 하전 이황화물은 조건부 활성 폴리펩티드 내 양 하전 아미노산 잔기와 결합할 것이고, 그 활성을 감소시킬 것이다. 다른 한편, 더 낮은 pH, 예컨대 pH6.2 ~ 6.8일 때, 저 하전 황화수소/이황화수소는 조건부 활성 폴리펩티드와 동일한 수준으로 결합하지는 않을 것이고, 이에 따라 조건부 활성 폴리펩티드의 더 큰 활성 발휘가 허용될 것이다.
pKa가 제1 pH와 제2 pH 사이인 소분자가 본 발명에 사용되기 바람직하다. 바람직한 종은 이황화물, 중탄산염, 히스티딘, 히스타민, 시트르산염, 아세트산염 및 젖산염으로부터 선택된다. 이러한 소분자 각각의 pKa는 6.2 내지 7.0이다. 또한, 기타 소분자, 예컨대 트리신(pKa 8.05) 및 비신(pKa 8.26)도 또한 사용될 수 있다. 기타 적합한 소분자는 본 출원의 원리들을 이용하는 내용이 담긴 교과서들, 예컨대 문헌(CRC Handbook of Chemistry and Physics, 96th Edition, by CRC press, 2015; Chemical Properties Handbook, McGraw-Hill Education, 1998)에서 살펴볼 수 있다.
검정 매질 또는 환경 중 소분자의 농도는, 바람직하게 대상체 내 소분자의 생리학적 농도이거나 또는 이에 가까운 농도이다. 예를 들어 (인간의 혈청 중) 중탄산염의 생리학적 농도는 15 mM 내지 30 mM의 범위이다. 그러므로 검정 매질 중 중탄산염의 농도는 10 mM 내지 40 mM, 또는 15 mM 내지 30 mM, 또는 20 mM 내지 25 mM, 또는 약 20 mM일 수 있다. 이황화물의 생리학적 농도도 또한 낮다. 검정 매질 중 이황화물의 농도는 3 mM 내지 100 mM, 또는 5 mM 내지 80 mM, 또는 10 mM 내지 50 mM, 또는 10 mM 내지 30 mM일 수 있다.
본 발명에 있어서, 조건부 활성 폴리펩티드는 농도들에서 선택 및 이용되며, 이로 인하여 환경 중 특정 종의 정상 생리학적 농도는 관심 pH 범위에서 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 유의미한 영향을 미칠 것이다. 그러므로 다수의 치료적 처치에 있어 조건부 활성 폴리펩티드는, 조건부 활성 폴리펩티드가 활성화되는 것이 최소화되거나 방지되면서, 혈액 또는 인간 혈청의 pH인 pH 약 7.2 ~ 7.4에서 낮은 활성을 가지는 연고로, 혈류를 통하여 치료적 처치의 전달을 허용하는 것이 유리할 수 있다. 결과적으로 이러한 처치를 위해서는 pKa가 pH 7.2 ~ 7.4보다 낮은 소분자를 선택함으로써, 혈류 pH에서 조건부 활성 폴리펩티드의 활성에 유의미한 영향을 미치기에 충분한 정도의 소분자 이온화를 보장하는 것이 유리할 것이다. 이와 동시에, 소분자의 pKa는, 조건부 활성 폴리펩티드상 결합 부위들이 노출되도록 소분자 양성자화에 의한 조건부 활성 폴리펩티드의 활성화를 보장하기 위해 조건부 활성 폴리펩티드의 활성이 요망되는 pH이거나 또는 그 이상이어야 한다.
소분자는, 입체 장해를 최소화하여 표적 폴리펩티드 또는 조건부 활성 폴리펩티드상 작은 포켓들에의 접근을 최대한 보장하도록, 비교적 작은 입체구조 및/또는 작은 분자량을 가지는 것이 바람직하다. 이러한 이유로, 소분자는 통상 분자량이 900 a.m.u. 미만, 또는 더욱 바람직하게 500 a.m.u. 미만, 또는 더욱 바람직하게 200 a.m.u. 미만, 또는 더욱더 바람직하게 100 a.m.u. 미만이다. 예를 들어 이황화물과 중탄산염은 둘 다 분자량이 작고, 작은 구조를 가져서, 이하 실시예 13 및 14에 보인 바와 같이 표적 폴리펩티드 또는 조건부 활성 폴리펩티드상 포켓들에의 접근경로를 제공한다.
소분자는 실질적으로 동일한 농도, 예컨대 약 20 μM(중탄산염)로 검정 또는 환경에 존재할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 소분자는 상이한 환경에 상이한 농도로 존재할 수 있으므로, 이 점을 검정에서 모의하는 것이 요망될 수 있다. 예를 들어 이황화물은 인간 혈청 중에서보다 종양 미세환경 중에 더 높은 농도로 존재한다. 그러므로 하나의 검정은 산성 pH를 띄고 이황화물의 농도가 더 높은 종양 미세환경을 모의할 수 있는 한편, 제2 검정은 중성 또는 약염기성 pH를 띄고 이황화물의 농도가 더 낮은 인간 혈청을 모의할 수 있다. 산성 pH는 6.0 내지 6.8의 범위일 수 있는 한편, 중성 또는 약염기성 pH는 약 7.4일 수 있다. 제1 검정에 있어 더 높은 이황화물 농도는 30 μM일 수 있는 한편, 제2 완충제에 있어 더 낮은 이황화물 농도는 10 μM 이하 또는 5 μM일 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 2개 이상의 상이한 소분자가 존재할 때(예를 들어 중탄산염과 히스티딘이 함께 존재할 때) 조건부 활성 폴리펩티드는 pH 의존적이다.
소분자가 존재하지 않을 때, 조건부 활성 폴리펩티드는 자체의 pH 의존성을 잃을 수 있다. 그러므로 소분자가 존재하지 않을 때, 조건부 활성 폴리펩티드는 소분자가 존재하지 않을 때 제1 pH와 제2 pH 사이에서 유사한 활성을 가질 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 제1 pH는 산성 pH인 반면, 제2 pH는 염기성 또는 중성 pH이다. 다른 구현예들에서, 제1 pH는 염기성 pH인 반면, 제2 pH는 산성 또는 중성 pH이다. 예를 들어 제1 pH는 약 5.5 내지 7.2, 또는 약 6.0 내지 약 7.0, 또는 약 6.2 내지 약 6.8의 범위의 pH일 수 있다. 제2 pH는 약 7.0 내지 약 7.8, 또는 약 7.2 내지 약 7.6의 범위의 pH일 수 있다.
산성 pH에서 더 큰 활성을 보이고, 염기성 또는 중성 pH에서는 더 작은 활성을 보이는 조건부 활성 폴리펩티드는, pH가 약 5.5 내지 7.2, 또는 약 6.2 내지 약 6.8로 산성인 종양 미세환경을 표적화할 수 있다.
다른 구현예들에서, pH 의존적 폴리펩티드가 더 큰 활성을 보일 때의 제1 pH는 활액의 pH와 같이 염기성 pH, 예컨대 pH 7.6 ~ 7.9일 수 있다(Jebens et al.,"On the viscosity and pH of synovial fluid and pH of blood," Journal of Bone and Joint Surgery, vol.41 B, pp.388-400, 1959 참조). 제2 pH는 혈액의 pH인 pH 약 7.2 내지 7.6일 수 있는데, 이 pH에서 조건부 활성 폴리펩티드는 그 활성이 더 작다. 이와 같은 조건부 활성 폴리펩티드는 관절 질환, 특히 관절의 염증을 표적화하는데 적합할 수 있다.
다른 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 뇌를 표적화하도록 디자인될 수 있다. 혈액 뇌 장벽을 중심으로 양 쪽은 pH에 차이가 나는데, 즉 뇌 쪽의 pH는 혈액의 pH보다 약 0.2 pH 단위만큼 낮다. 그러므로 조건부 활성 폴리펩티드가 더 큰 활성을 보이는 뇌의 제1 pH(뇌 pH)는 약 7.0 내지 약 7.2일 수 있는 반면, 제2 pH(혈액 pH)는 약 7.4일 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는 효소, 시토카인, 수용체, 특히 세포성 수용체, 조절 폴리펩티드, 가용 폴리펩티드, 항체 또는 호르몬일 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는 모 폴리펩티드의 단편일 수 있다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드는 항체 단편, 단일 사슬 항체, 효소의 단편, 수용체의 단편, 시토카인의 단편 또는 호르몬의 단편일 수 있다. 항체 단편은 항체의 Fc 단편일 수 있다.
Fc 단편은, 제1 pH에서의 보체에 대한 결합 활성이, 제2 pH에서의 동일 보체에 대한 결합 활성보다 더 큰 조건부 활성 Fc 단편을 제조하기 위한 모 폴리펩티드로서 사용될 수 있다. Fc 단편과 보체의 결합은 항체 의존적 세포 매개 세포독성을 제공하는데 사용될 수 있다. 제1 pH는 5.5 내지 7.2, 또는 6.2 내지 6.8의 범위로 산성(예컨대 종양 미세환경의 pH)일 수 있는 반면, 제2 pH는 7.2 내지 7.6의 범위이다. 제1 pH는 pH가 통상 약 4.0인 리소좀 내부 pH와 상이하다. 또한 리소좀은 여타의 폴리펩티드와 같이 Fc 단편이 표적화되어 분해되는 장소이다. 리소좀에는 보체가 존재하지 않으며, 리소좀을 통한 세포 매개성 세포독성도 유발되지 않는다.
조건부 활성 폴리펩티드는 2개의 기능성 도메인을 가질 수 있는데, 이 기능성 도메인 중 적어도 하나, 바람직하게 둘 다는 pH 의존적 활성을 가진다. 이 기능성 도메인 2개는 동시에 진화될 수 있고, 동일한 돌연변이 폴리펩티드 내 두 기능성 도메인을 동정하기 위해 선택이 이루어질 수 있다. 대안적으로 이 기능성 도메인 2개는 독립적으로 진화 및 선택되고, 이로써 pH 의존적 활성이 별도로 동정될 수 있다. 만일 기능성 도메인 2개가 동일한 돌연변이 폴리펩티드 내에 존재하지 않으면, 이것들은 별도로 동정된 기능성 도메인 둘 다를 가지는 키메라 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는 제1 조건 또는 정상 생리학적 조건에서 가역적으로나 비가역적으로 비활성화되지만, 제2 조건 또는 비정상 조건에서는 제1 조건 또는 정상 생리학적 조건에서의 활성 수준과 동일하거나 동등한 수준으로 활성을 가진다. 이러한 조건부 활성 폴리펩티드와, 이 폴리펩티드를 제조하는 방법은 미국 특허 제8,709,755호(B2)에 기술되어 있다. 조건부 활성 폴리펩티드는 숙주 내 단기간 또는 제한된 기간 동안 활성을 가지는 신규 치료제를 개발하는데 특히 유용하다. 이 점은, 주어진 용량의 치료제가 오랜 기간 동안 작용하는 것이 숙주에 유해하되, 요망되는 치료를 수행함에 있어 제한된 활성이 필요한 경우에 특히 유용하다. 유리한 응용예들로서는 고 용량 국소 또는 전신 처치뿐만 아니라, 고 농도 국부 처치를 포함한다. 제1 조건 또는 정상 생리학적 조건 하에서의 비활성화는, 폴리펩티드의 투여량과 비활성화 속도의 조합에 의해 결정될 수 있다. 이와 같은 조건 기반 비활성화는, 촉매 활성이 비교적 짧은 기간에 실질적으로 부정적인 영향을 일으키는 효소 치료제에 특히 중요하다.
조건부 활성 폴리펩티드는 시간이 경과함에 따라서 가역적으로나 비가역적으로 활성화 또는 비활성화거나, 또는 체내 임의의 미세환경, 예컨대 체내 특정 장기(예컨대 종양 미세환경, 활액, 방광 또는 신장)에 있을 때에만 활성화 또는 비활성화된다. 몇몇 양태들에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 표적 단백질(항원)에 대한 항체 또는 항체 단편이다.
조건부 활성 폴리펩티드는 pH 의존적 활성을 가지는 단리된 폴리펩티드일 수 있는데, 이 경우 제1 pH에서의 활성은 중탄산염, 히스티딘, 히스타민, 이황화물, 시트르산염, 젖산염 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 종이 존재할 때 제2 pH에서의 활성의 적어도 약 1.3배이다. 동일한 활성은 소분자가 존재하지 않을 때에는 pH 의존적이지 않다. 몇몇 구현예들에서, 제1 pH에서의 활성은 제2 pH에서의 동일 활성의 적어도 약 1.5배, 또는 적어도 약 1.7배, 또는 적어도 약 2.0배, 또는 적어도 약 3.0배, 또는 적어도 약 4.0배, 또는 적어도 약 6.0배, 또는 적어도 약 8.0배, 또는 적어도 약 10.0배, 또는 적어도 약 20.0배, 또는 적어도 약 40.0배, 또는 적어도 약 60.0배, 또는 적어도 약 100.0배이다. 제1 pH는 약 5.5 내지 약 7.2, 또는 약 6.2 내지 약 6.8의 범위로 비정상 pH일 수 있는 반면에, 제2 pH는 약 7.2 내지 약 7.6의 범위로 정상 생리학적 pH일 수 있다.
선택된 조건부 활성 폴리펩티드가 사용되어, 조건부 활성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 예컨대 DNA 서열이 동정 또는 합성될 수 있다. 핵산은 조건부 활성 폴리펩티드를 다량으로 제조하기 위한 재조합 기술에 사용될 수 있다. 예를 들어 핵산은 발현 벡터에 삽입될 수 있는데, 이 경우 발현 벡터는 조건부 활성 폴리펩티드의 발현 수준을 높게 보장하기 위해 핵산에 작동 가능하게 결합된 촉진인자를 가진다. 발현 벡터는 숙주 세포, 예컨대 효모, 곤충 세포 생산 숙주, 또는 포유동물 세포 생산 숙주에 도입될 수 있다. 숙주 세포의 예들로서는 3T3 마우스 섬유아세포; BHK21 시리아 햄스터 섬유아세포; MDCK, 개 상피세포; Hela, 인간 상피 세포; PtK1 래트 캥거루 상피 세포; SP2/0 마우스 혈장 세포; 및 NS0 마우스 혈장 세포; HEK 293 인간 배 신장 세포; COS 원숭이 신장 세포; CHO, CHO-S 중국 햄스터 난소 세포; R1 마우스 배 세포; E14.1 마우스 배 세포; H1 인간 배 세포; H9 인간 배 세포; 그리고 PER C.6, 인간 배 세포를 포함한다.
B. 조건부 활성 폴리펩티드의 조작
조건부 활성 폴리펩티드는 본원에 기술된 단백질 조작 기술 한 가지 이상에 의해 조작될 수 있다. 단백질 조작 기술의 비제한적 예들로서는 조건부 활성 폴리펩티드를 핵산에 접합시키는 방법, 조건부 활성 폴리펩티드를 나노입자에 접합시키는 방법, 키메라 항원 수용체 내 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하는 방법, 그리고 마스킹(masking)된 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하는 방법을 포함한다.
본 발명의 조건부 활성 폴리펩티드는 링커(linker)를 통하여 핵산 분자 예컨대 DNA 또는 RNA 분자에 접합될 수 있다. 조건부 활성 폴리펩티드는 핵산 분자를 대상체의 표적 병소, 즉 조건부 활성 폴리펩티드가, 어떤 조건이 조성되지 않는 다른 병소에서보다 더 큰 활성을 보이는, 대상체의 표적 병소에 운반하는 것을 도울 수 있다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 미세환경의 조건에서의 자체의 항원에 대한 결합 활성이, 다른 병소의 조건, 예컨대 인간 혈청에서의 자체의 항원에 대한 결합 활성보다 더 큰, 조건부 활성 항체일 수 있다. 이 효과는 핵산 분자를 조건부 활성 폴리펩티드에 접합시킨 후, 이 접합체를 대상체에 투여함으로써, 종양 미세환경에 핵산 분자를 전달하는데 사용될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 핵산 분자는 표적 병소에서의 유전자 발현을 조정하는 제제일 수 있다. 비정상 유전자 발현은 다수의 질환과 연관되어 있다. 그러므로, 비정상 유전자 발현을 교정하는 것은, 이러한 질환의 제어에 기여할 수 있거나, 또는 심지어 치유에도 기여할 수 있다. 예를 들어 비정상 유전자 발현은 다수의 암 세포의 특징인데, 몇몇 유전자는 암 세포에서 발현 수준이 더 높다(예컨대 다수의 발암유전자(예컨대 상피 성장 인자 수용체 2(HER2)의 유전자)는 유방암 세포에서 과발현된다). 발암유전자의 구성적으로 증가한 발현의 선택적 억제는, 암 세포의 증식을 억제할 기회를 제공한다.
유전자 발현을 억제할 수 있는 핵산 분자는 안티센스 RNA, 소 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA, 올리고 DNA, 그리고 핵염기들이 결합하는 비하전 비대칭 폴리아미드 주쇄를 가지는 올리고뉴클레오티드 모의체를 포함한다(Pooga et al., Curr Cancer Drug Targets, 1(3):231-9, 2001; Pandey et al., Expert Opin Biol Ther., 9(8):975-89, 2009).
안티센스 RNA는, 염기쌍 형성에 의해 mRNA의 특이적 상보성 영역에 결합하여, mRNA가 서열 특이적 방식으로 발현되는 것을 억제할 수 있는 짧은 RNA 분자이다. 안티센스 RNA는, 이 안티센스 RNA와 결합하는 mRNA 부위를 절단하는 RNaseH를 유도할 수 있거나, 또는 mRNA 가공 및 단백질 합성에서 번역 또는 기타 단계들을 물리적으로 차단할 수 있다.
소 간섭 RNA(siRNA)는 통상 짧은 이중 가닥 RNA 분절로서, 이것의 서열 중 적어도 일부분은 mRNA 서열에 상보성이어서, 이 mRNA 서열의 번역은 적어도 일부분은 번역이 차단된다. siRNA는 크로마틴 리모델링(remodeling), 단백질 번역 억제 또는 mRNA의 직접 분해(진핵생물 세포 내라면 도처에서 일어남)가 이용되는 유전자 침묵의 전사후 기작을 통해 기능을 수행한다(Caplen,"Gene therapy progress and prospects. Downregulating gene expression: the impact of RNA interference," Gene Ther., 11(16):1241-1248, 2004) and Bertrand et al.,"Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo," Biochem Biophys Res Commun., 296(4):1000-1004, 2002).
구체적으로 siRNA는, siRNA에 대한 상동성을 보유하는 mRNA의 서열 특이적 분해의 강력한 케스케이드를 RISC를 통해 개시할 수 있다(Fire et al.,"Potent and specific genetic interference by doubles-stranded RNA in Caenorhabditis elegans," Nature 391:806-811, 1998). siRNA가 세포에 도입될 때, 이는 긴 siRNA를 짧은(21개 내지 23개 뉴클레오티드) 이중체(2개 내지 3개의 대칭적 뉴클레오티드로 된 3' 돌출부(overhang)와 5' 인산염, 그리고 3' 하이드록실기를 가짐)로 절단하는 RNase III 효소(Dicer라 칭하여짐)에 의해 가공된다(Tuschl et al.,"Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro," Genes Dev.13:3191-3197, 1999; Hamilton and Baulcombe,"A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants," Science, 286:950-952, 1999). 따라서, 유효 siRNA는 siRNA 매개성 침묵을 촉발하기 위해 mRNA와 쌍을 이루는 연속 상보성 서열의 소분절만을 필요로 한다(Jackson and Linsley,"Noise amidst the silence: off-target effects of siRNAs?" Trends Genet., 20:521-524, 2004). siRNA는 게놈에 통합되지 않으므로, 플라스미드나 바이러스 비이클보다 더 큰 안전성을 제공한다.
마이크로 RNA(miRNA)는 자연 발생 소형 비암호화 RNA 분자 군으로서, 그 길이는 21개 내지 25개 뉴클레오티드이다. 마이크로 RNA는 이 마이크로 RNA가 작용하는 mRNA 분자와 부분적으로 상보성이다. 마이크로 RNA의 주요 기능은 번역 억제, mRNA 절단 및 탈아데닐화를 통해 유전자 발현을 줄이는 것이다. miRNA 종, 서열 데이터, 주석 및 표적 예상치에 대한 중앙 온라인 저장소는 miRBase라 불리우고 있으며, 이는 영국의 생어 연구소(Sanger Institute)에 의해 운영되고 있다. 마이크로 RNA 유전자는 RNA 중합효소 II에 의해 전사되고, 그 결과 5'-캡과 폴리-A 미부를 가지는 프리(pri)-miRNA가 생성된다. 핵 내에서 이 프리-miRNA는 RNAse III 효소 Drosha 및 이중 가닥 RNA Pasha/DGCR8로 이루어진 마이크로프로세서 복합체(microprocessor complex)에 의해 가공되어, 프레(pre)-miRNA로 생성된다. 이러한 프레-miRNA는 카리오페린 엑스포틴(karyopherin exportin)(Exp5)과, Ran-GTP 복합체에 의해 세포기질로 배출되고, 여기에서 Ran GTPase가 Exp5와 결합하게 되면, 프레-miRNA와의 핵내 이종삼량체가 생성된다. 이러한 프레-miRNA는 RNAse III 효소 Dicer에 의해 추가로 가공되고, 그 결과 성숙한 마이크로 RNA가 생성된다.
핵산의 다른 군은, 핵염기들이 결합되는 비하전 비대칭 폴리아미드 주쇄를 포함하는 올리고뉴클레오티드 모의체인 조건부 활성 폴리펩티드에 의해 전달될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 모의체는 종종 펩티드 핵산(PNA)이라고도 칭하여진다. 더욱 구체적으로 PNA는, N-(2-아미노에틸)글리신 폴리아미드가 인산염-리보스 고리 주쇄를 대신하고, 메틸렌-카보닐 링커가 자연 및 비자연 핵염기를, N-(2-아미노에틸)글리신의 중심 아민에 연결시키는 DNA 유사체이다. 주쇄 구조에 대한 근본적인 변화에도 불구, PNA는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성 규칙에 따라 DNA 및 mRNA와 서열 특이적 결합을 할 수 있다.
PNA는 자연 핵산이 상보성 DNA/RNA와 결합할 때보다 더 큰 친화성으로 상보성 DNA/RNA와 결합하는데, 이는 부분적으로 주쇄 상에 음 전하가 없는 관계로 전하-전하간 반발력이 감소할 뿐만 아니라, 유리한 기하학적 요인이 작용하기 때문이다. PNA와 DNA/mRNA의 복합체는 생물학적 유체 중에서 매우 안정적인데, 이 점은 DNA 또는 mRNA에의 특이적 잡종화에 의한 표적 유전자의 전사 및 번역 억제를 초래한다. 일반적으로 PNA는 널리 공지된 고체상 펩티드 합성 프로토콜이 사용되어 합성된다. 문헌(Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 115, 6477-6481, 1993; Hyrup et al., J. Am. Chem. Soc., 116, 7964-7970, 1994; Egholm et al., Nature, 365, 566-568, 1993; Dueholm et al., New J. Chem., 21, 19-31, 1997; Wittung et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 7049-7054, 1996; Leijon et al., Biochemistry,33, 9820-9825, 1994, Orum et al., BioTechniques, 19, 472-480, 1995; Tomac et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 5544-5552, 1996)을 참조한다. 강산 처리 및 알칼리성 수산화물 중에서의 가수분해시 탈퓨린화되는 DNA와는 대조적으로, PNA는 산에 완전히 안정적이고, 약염기에는 충분히 안정적이다.
조건부 활성 폴리펩티드에 의해 전달될 수 있는 핵산의 또 다른 군은 올리고 DNA이다. 올리고 DNA는 세포의 세포질에 도입될 때 올리고 DNA에 서열 상보성인 유전자의 발현을 선택적으로 억제할 수 있는, DNA의 짧은 단일 가닥 분절이다. 안티센스 적용에 있어서, 올리고 DNA는 표적 mRNA 또는 프레-mRNA와 상호작용하여 이중체를 형성하고, 이 이중체의 번역 또는 가공을 억제함으로써, 결과적으로 단백질 생합성을 억제한다. 항원 적용에 있어서, 올리고 DNA는 세포 핵에 도입되어 이중 가닥 게놈 DNA와 삼중체를 형성하고, 유전자의 전사를 억제함으로써 mRNA를 덜 생산하여야 하고, 이로써 합성되고 있는 단백질의 유전자 생성물도 덜 생산된다.
조건부 활성 폴리펩티드에 의해 전달될 수 있는 핵산의 추가 군은 구형 핵산(SNA, 문헌(Zhang, J Am Chem Soc., 134(40):16488-16491, 2012) 참조)이다. SNA는 조밀하게 작용화되고, 고도의 배향성을 가지는 핵산으로서, 금속, 반도성 또는 절연성 무기 또는 중합체 코어 물질 표면에 공유 부착되는 핵산을 포함한다. SNA는 또한 거의 전부가 핵산 분자로 이루어진, 코어가 없이 속이 빈 구조를 가질 수도 있다. 이러한 구형 핵산은 외부 핵산에 대한 대상체의 자연 방어체계를 우회할 수 있다. 구형 핵산은 자체의 조밀하게 팩킹(packing)된 고도의 배향성을 가지는 핵산 외피로부터 기인하는 독특한 특성들을 이용하여, 핵산의 효율적 전달 및 방어를 달성한다. 이러한 외피는 입체적 억제(steric inhibition)와 함께 작용할 때 핵산분해효소의 활성을 감소시키고, 핵산이 효소에 의해 분해되는 것을 막는 역할을 하는, 염의 국부 농도가 높은 구역을 형성한다. 뿐만 아니라, 이러한 구형 핵산은 세포외 자연조성 환경으로부터 유래하는 스캐빈저 단백질(scavenger protein)을 자체의 표면에 보충하여 내포작용을 촉진한다.
구형 핵산이 세포기질에 도입되면, 이는 안티센스 또는 siRNA 경로 중 어느 하나를 통하여 표적 유전자 발현을 억제할 수 있다. 결과적으로 구형 핵산은 바이러스 벡터 및 기타 다수의 합성 계에 비하여 몇 가지 이점, 예컨대 작은 독성, 작은 면역원성, 효소 분해에 대한 내성, 그리고 더욱 지속적인 유전자 녹다운(gene knockdown)을 제공한다. 조건부 활성 폴리펩티드, 특히 조건부 활성 항체는 구형 핵산을 표적 병소, 예컨대 발병되었거나 염증이 발생한 조직(예컨대 종양 및 염증성 관절)에 전달할 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는 또한 링커를 통하여 나노입자에 접합됨으로써, 나노입자가 표적 병소(즉 조건부 활성 폴리펩티드가 더 큰 활성을 보이는 조건이 조성된 병소)에 전달되는 것을 도울 수 있다. 나노입자는, 이 나노입자 내에 캡슐화되는 독소, 방사능 제제 또는 기타 치료제에 대한 공지의 비이클이다.
나노입자 내에 캡슐화된 치료제는 종양 세포를 탈분화하여, 종양 세포를 다시 정상 세포로 역전시킬 수 있는 단백질일 수 있다(Friedmann-Morvinski and Verma,"Dedifferentiation and reprogramming: origins of cancer stem cells," EMBO Reports, 15(3):244-253, 2014). 나노입자는 조건부 활성 항체와 결합할 수 있고, 이처럼 결합한 나노입자와 캡슐화된 치료제는 환경, 즉 조건부 활성 항체가 가장 큰 활성을 보이는 환경에 선택적으로 전달될 수 있다.
입체구조가 상이한 나노입자의 몇 가지 유형이 본 발명에 사용될 수 있다. 나노입자는 다양한 생체적합성 재료, 예컨대 생체안정성 중합체(biostable polymer), 생분해성 중합체, 풀러렌, 지질 또는 이것들의 조합으로 제조될 수 있다. 생체안정성 중합체란, 생체 내에서 분해되지 않는 중합체를 지칭한다. 생분해성 중합체란, 환자에 전달된 후 분해될 수 있는 중합체를 지칭한다. 예를 들어 중합체가 체액, 예컨대 혈액에 노출되면, 이 중합체는 체내 효소들에 의해 점진적으로 흡수 및/또는 제거될 수 있다. 다양한 분해 속도를 가지는 나노입자를 제조하는 방법은 당 업자들에게 공지되어 있으며, 미국 특허 제6,451,338호, 동 제6,168,804호 및 동 제6,258,378호를 참조한다.
본 발명의 예시적 나노입자로서는 리포좀, 중합체주머니(polymersome) 및 중합체 입자를 포함한다. 리포좀이란, 통상 인지질로 이루어진 이중층에 의해 완전히 가두어진 구획을 지칭한다. 리포좀은 당 업자들에게 공지된 표준적 기술에 따라 제조될 수 있다. 한 가지 기술은, 적합한 지질, 예컨대 포스파티딜 콜린을 수성 매질에 현탁한 후, 이 혼합물에 초음파처리를 하는 것이다. 또 다른 기술은, 바늘을 사용하여 지질을 교반된 에탄올-물 용액에 주입함으로써 에탄올-물 중 지질 용액을 신속하게 혼합하는 것이다. 몇몇 구현예들에서, 리포좀은 또한 추가적으로나 대안적으로 다른 양친매성 물질, 예컨대 스핑고미엘린 또는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG)을 함유하는 지질을 포함할 수 있다.
중합체주머니는 리포좀과 유사한 이중층 구조를 형성하도록 변형된 2 블록 또는 3 블록 공중합체를 포함한다. 블록 공중합체의 길이와 조성에 따라서, 중합체주머니는 실질적으로 리포좀보다 더 견고할 수 있다. 뿐만 아니라, 블록 공중합체의 각 블록의 화학적성질을 제어하는 능력은 중합체주머니의 조성을 요망되는 응용에 부합하도록 변조하는 것을 허용한다. 예를 들어 중합체주머니의 막 두께, 즉 이중층 구조의 두께는 블록 공중합체의 개별 블록들의 사슬 길이에 변화를 줌으로써 제어될 수 있다. 공중합체 중 각 블록의 유리 전이 온도를 조정하는 것은 유동성에 영향을 미칠 것이므로, 중합체주머니 막의 투과성에도 영향을 미칠 것이다. 심지어 캡슐화된 제제의 방출 기작조차도 공중합체의 특징을 변경함으로써 변할 수 있다.
중합체 주머니는 (i) 유기 용매에 블록 공중합체를 용해하는 단계, (ii) 생성된 용액을 용기 표면에 적용하는 단계, 그리고 이후 (iii) 용매를 제거하여 용기 벽에 공중합체 막을 남기는 단계를 수반하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 그 다음, 막은 수화되어 중합체주머니로 형성된다. 대안적으로, 용매에 블록 공중합체를 용해하는 것과, 이후 공중합체의 블록들 중 하나를 위하여 희석 용매(weak solvent)를 첨가하는 것도 또한 중합체주머니를 형성할 것이다.
치료제는 몇 가지 기술을 사용하여 중합체주머니 안에 캡슐화될 수 있다. 예를 들어 치료제는 물에 혼합될 수 있으며, 이때 물은 추후 공중합체 막을 재수화하는데 사용된다. 또 다른 예는, 삼투작용에 의해 치료제를 예비성형 중합체주머니의 코어에 집어넣는 것인데, 이 과정은 강제 로딩(force loading)이라고 공지되어 있다. 또 다른 일례는, 상대적 일분산성과 높은 로딩 효율을 보이는 중합체주머니를 제조할 수 있는, 이중 에멀전 기술을 이용하는 것이다. 이중 에멀전 기술은, 미세유동 기술을 이용하여 유기 용매 층으로 둘러싸인 물 소적을 포함하는, 이중 에멀전을 만드는 것을 수반한다. 이와 같은 액적 중 소적(droplet-in-a-drop) 구조는 이후 연속 수상 중에 분산된다. 블록 공중합체는 유기 용매 중에 용해된 다음, 이중 에멀전의 동심성 계면상에서 원형 중합체주머니(proto-polymersome)로 자가조립된다. 원형 중합체주머니의 외피로부터 유기 용매가 완전히 증발되면 최종 중합체주머니가 형성된다. 이 기술은 중합체주머니 크기에 대한 미세한 제어를 허용한다. 뿐만 아니라, 방법 전반에 걸쳐 내부 유체의 외부 유체로부터의 완전한 분리를 유지시키는 능력은 치료제의 매우 효율적인 캡슐화를 허용한다.
리포좀 및 중합체주머니의 외피 구조와는 대조적으로, 중합체 입자는 고체 또는 다공성 입자를 지칭한다. 치료제를 중합체 입자 구조의 표면에 부착시키거나, 생물활성 제제를 중합체 입자 구조 내부에 통합시키기 위한 방법은 당 업자들에게 공지되어 있다.
본 발명의 나노입자를 제조하기 위해 사용될 수 있는 중합체로서는 폴리(N-아세틸글루코사민)(키틴), 키토산, 폴리(3-하이드록시발레르산염), 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리(3-하이드록시부티르산염), 폴리(4-하이드록시부티르산염), 폴리(3-하이드록시부티르산염-코-3-하이드록시발레르산염), 폴리오르토에스테르, 폴리무수물, 폴리(글리콜산), 폴리(글리콜리드), 폴리(L-젖산), 폴리(L-락티드), 폴리(D,L-젖산), 폴리(D,L-락티드), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드), 폴리(카프로락톤), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤), 폴리(D,L-락티드-코-카프로락톤), 폴리(글리콜리드-코-카프로락톤), 폴리(트리메틸렌 탄산염), 폴리에스테르 아미드, 폴리(글리콜산-코-트리메틸렌 탄산염), 코폴리(에테르-에스테르)(예컨대 PEO/PLA), 폴리포스파젠, 생체분자(예컨대 피브린, 피브린 글루(fibrin glue), 피브리노겐, 셀룰로스, 전분, 콜라겐 및 히알루론산, 엘라스틴 및 히알루론산), 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌 및 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 아크릴 중합체 및 폴리아크릴산염 이외의 공중합체, 비닐 할로겐화물 중합체 및 공중합체(예컨대 폴리비닐 염화물), 폴리비닐 에테르(예컨대 폴리비닐 메틸 에테르), 폴리비닐리덴 할로겐화물(예컨대 폴리비닐리덴 염화물), 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 방향체(예컨대 폴리스티렌), 폴리비닐 에스테르(예컨대 폴리비닐 아세트산염), 아크릴로니트릴-스티렌 공중합체, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS) 수지, 폴리아미드(에컨대 나일론 66 및 폴리카프로락탐), 폴리탄산염, 예컨대 티로신 기반 폴리탄산염, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 폴리우레탄, 레이온, 레이온-삼아세트산염, 셀룰로스. 셀룰로스 아세트산염, 셀룰로스 부티르산염, 셀룰로스 아세트산염 부티르산염, 셀로판, 셀룰로스 질산염, 셀룰로스 프로피온산염, 셀룰로스 에테르 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
몇몇 구현예들에서, 나노입자는 또한 조건부 활성 폴리펩티드로부터 유래하는 선택성 이외에도 코팅을 통한 조직 선택성을 제공할 수 있다. 예를 들어 나노입자는 코어 입자의 외부 조성을 변경하기 위해 정전기적으로 흡착되는 폴리(글루탐산) 기반 펩티드 코팅에 의해 코팅될 수 있다. 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 리간드를 함유하고 음 하전 폴리글루탐산을 기반으로 하는 펩티드는, RGD 대신 RDG를 함유하고 뒤섞인 순서로 코팅된 입자에 비하여 내피 세포에의 시험관 내 유전자 전달을 증가시킬 수 있다. 이러한 펩티드는 3개의 성분, 즉 음하전을 제공하는 폴리(글루탐산) 확장부, 폴리글리신 링커, 그리고 하전상태가 가변적이고 입자의 생물물리학적 특성과 조직 선택성을 변경시킬 잠재성을 가지는 말단 서열로 이루어져 있다. 코팅뿐만 아니라, 입자 자체는 이것들의 아미드 및 에스테르 결합 각각을 통해 생분해될 수 있다. 문헌(Harris et al.,"Tissue-Specific Gene Delivery via Nanoparticle Coating," Biomaterials, vol.31, pp.998-1006, 2010)을 참조한다.
T 세포는 외래 항원을 가지는 물질이나 세포를 공격하기 위해 포유동물 면역계에 의해 사용된다. T 세포가 고형 종양과 맞닥뜨릴 때, 이 T 세포는 종종 유효 반응을 개시하는데 실패한다. 심지어 T 세포가 종양 부위에 도달하였을 때조차도 이 T 세포는 암 세포가 면역계로부터 도피할 수 있게 해주는 면역억제인자 보(barrage)와 마주하게 된다. CAR-T 기술은 유전자 조작 방법을 이용하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 T 세포에 삽입함으로써 특이성이 큰 CAR-T 세포[다만 여기서 CAR은 표적 조직의 표면 상에 있는 항원과의 특이적 결합에 의해, 조작된 CAR-T 세포를 표적 조직으로 인도함]를 만들어 자연 순환성 T 세포를 재프로그래밍(reprogramming)한다. 그러므로 CAR-T 세포는 종양 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는데, 이때의 CAR-T 세포는 자연 순환 T 세포보다 훨씬 더 효율적으로 된다. CAR-T 세포는 또한 또 다른 표적 조직, 예컨대 염증성 관절 및 뇌 조직을 표적화하도록 조작될 수도 있다.
본 발명의 CAR은 적어도 하나의 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 세포외 스페이서 도메인(ESD), 경막 도메인(TM), 하나 이상의 보조자극 도메인(CSD), 그리고 세포내 신호전달 도메인(ISD)를 포함한다(도 5 및 문헌(Jensen et al.,"Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells," Immunol. Rev., vol. 257, pp.127-144, 2014) 참조). ASTR이 종양 또는 기타 표적화된 조직 상의 표적 항원과 특이적으로 결합하면, ISD는 CAR-T 세포 내에서의 세포 내 신호전달을 활성화한다. 예를 들어 ISD는 항체의 항원 결합 특성을 이용하면서, CAR-T 세포의 특이성과 반응성을 선택된 표적(예컨대 종양 세포 또는 기타 표적화된 세포)을 향하여 비 MHC 제한 방식으로 재인도할 수 있다. 비 MHC 제한 항원 인지는 CAR-T 세포에게 종양 세포를 인지하여 항원 가공을 개시하는 능력을 부여하고, 이로써 면역계의 감시로부터의 종양 도피 주요 기작은 우회된다. 한 구현예에서, ESD 및/또는 CSD는 선택적이다. 다른 구현예에서, ASTR은 이중특이성을 가져서, 이 ASTR과 2개의 상이한 항원 또는 에피토프와의 특이적 결합이 허용된다.
본 발명의 조건부 활성 폴리펩티드는 ASTR 또는 이의 일부로서 조작될 수 있으며, 그 결과 CAR은 특정의 환경, 예컨대 종양 미세환경 또는 활액에서, 이와 상이한 환경이 조성되는 몸의 다른 부분 또는 혈액에서보다 표적 항원과의 결합에 대해 더 큰 활성을 띄게 된다. 이러한 CAR은 T 세포를 질환 부위에 우선적으로 전달할 수 있으므로, T 세포가 정상 조직을 공격함에 의하여 유발되는 부작용이 극적으로 감소할 수 있다. 이는 치료 효능을 높이고 대상체의 치료에 대한 관용성을 개선하기 위해 T 세포가 고 용량으로 사용되는 것을 허용한다.
이와 같은 CAR은 대상체 내에서 짧은 기간 또는 제한된 기간 동안만 요구되는 신규 치료제를 개발하는데 특히 유용하다. 유리한 응용예로서는 고 투여량 전신 치료뿐만 아니라, 고 농도 국부 치료를 포함한다. 문헌[Maher, "Immunotherapy of Malignant Disease Using Chimeric Antigen Receptor Engrafted T Cells," ISRN Oncology, vol.2012, article ID 278093, 2012]을 참조한다.
ASTR은 종양이나 다른 표적화 조직상에 존재하는 항원과 특이적으로 결합하는 조건부 활성 폴리펩티드, 예컨대 항체, 특히 단일 사슬 항체, 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. ASTR에 적합한 폴리펩티드의 몇몇 예들로서는 결합형 시토카인(시토카인 수용체 보유 세포의 인지 유도), 아피바디(affibody), 자연 발생 수용체 유래 리간드 결합 도메인 및, 예컨대 종양 세포 상 어떤 수용체에 대한 가용 단백질/펩티드 리간드를 포함한다. 실상, 주어진 항원에 고 친화도로 결합할 수 있는 임의의 분자 대부분이 ASTR에 사용될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명의 CAR은 동일 항원상 상이한 항원 적어도 2개 또는 에피토프 적어도 2개를 표적화하는 ASTR 적어도 2개를 포함한다. 일 구현예에서, CAR은 적어도 3개 또는 그 이상의 상이한 항원 또는 에피토프를 표적화하는 ASTR을 3개 이상 포함한다. 다수의 ASTR이 CAR에 존재하면, 이 ASTR들은 나란히 배열될 수 있고, 링커 펩티드에 의해 격리될 수 있다(도 5).
또 다른 구현예에서, ASTR은 다이아바디(diabody)를 포함한다. 다이아바디에서, scFv는 2개의 가변 영역이 함께 폴딩(folding)되기에 지나치게 짧은 링커 펩티드와 함께 생성되고, 이로 말미암아 scFv는 이량체화된다. 훨씬 더 짧은(1개 또는 2개의 아미노산) 링커는, 삼량체, 소위 트리아바디(triabody) 또는 트리바디(tribody)의 생성을 초래한다. 테트라바디(tetrabody)도 또한 ASTR에 사용될 수 있다.
CAR에 의해 표적화되는 항원은, 제거를 위해 표적화되는 조직, 예컨대 종양, 선(예컨대 전립선) 증식증, 사마귀 및 원치않는 지방 조직 내 세포의 표면 또는 그 내부에 존재한다. 표면 항원이 CAR의 ASTR에 의해 더 효율적으로 인지되어 결합될 때, 세포내 항원도 또한 CAR에 의해 표적화될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 표적 항원은, 바람직하게 암, 염증성 질환, 신경장애, 당뇨병, 심혈관질환 또는 감염성 질환에 특이적이다. 표적 항원의 예들로서는 다양한 면역 세포, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식세포 종양, 아세포종 및 다양한 혈액학적 질환과 연관된 세포, 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환에 의해 발현되는 항원을 포함한다.
ASTR에 의해 표적화될 수 있고, 암에 특이적인 항원으로서는 4-IBB, 5T4, 선암종 항원, 알파-태아단백질, BAFF, B-림프종 세포, C242 항원, CA-125, 탄산무수화효소 9(CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23(IgE 수용체), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 피브로넥틴 잉여 도메인-B, 엽산염 수용체 1, GD2, GD3 강글리오시드, 당단백 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, 인간 산란인자 수용체 키나아제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgGl, LI-CAM, IL-13, IL-6, 인슐린 유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 ανβ3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 뮤신 CanAg, N-글리콜릴뉴라민산, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, 포스파티딜세린, 전립선암종 세포, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나신 C, TGF 베타2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2 또는 비멘틴 중 하나 이상을 포함한다.
염증성 질환에 특이적인 항원으로서, ASTR에 의해 표적화될 수 있는 것으로서는 AOC3(VAP-1), CAM-3001, CCL11(에오탁신-1), CD125, CD147(바시긴(basigin)), CD154(CD40L), CD2, CD20, CD23(IgE 수용체), CD25(IL-2 수용체의 한 사슬), CD3, CD4, CD5, IFN-a, IFN-γ, IgE, IgE Fc 영역, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-6 수용체, 인테그린 a4, 인테그린 α4β7, 라마 글라마(Lama glama), LFA-1(CD11a), MEDI-528, 미오스타틴, OX-40, rhuMAb β7, 스클레로신(scleroscin), SOST, TGF 베타1, TNF-a 또는 VEGF-A 중 하나 이상을 포함한다.
신경장애에 특이적인 항원으로서, 본 발명의 ASTR에 의해 표적화될 수 있는 것으로서는 베타 아밀로이드 또는 MABT5102A 중 하나 이상을 포함한다. 당뇨병에 특이적인 항원으로서, 본 발명의 ASTR에 의해 표적화될 수 있는 것으로서는 L-Iβ 또는 CD3 중 하나 이상을 포함한다. 심혈관질환에 특이적인 항원으로서, 본 발명의 ASTR에 의해 표적화될 수 있는 것으로서는 C5, 심장 미오신, CD41(인테그린 알파-lib), 피브린 II, 베타 사슬, ITGB2(CD18) 및 스핑고신-1-인산염 중 하나 이상을 포함한다.
감염성 질환에 특이적인 항원으로서, 본 발명의 ASTR에 의해 표적화될 수 있는 것으로서는 탄저균 독소, CCR5, CD4, 군집 인자(clumping factor) A, 거대세포바이러스, 거대세포바이러스 당단백 B, 내독소, 에스케리치아 콜라이, B형 간염 표면 항원, B형 간염 바이러스, HIV-1, Hsp90, 인플루엔자 A 혈구응집소, 리포테이코산, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 광견병 바이러스 당단백, 호흡기융합바이러스 및 TNF-a 중 하나 이상을 포함한다.
표적 항원의 또 다른 예들로서는 암 세포 상에서 특이적으로나 증폭된 형태로서 발견되는 표면 단백질들, 예컨대 IL-14 수용체, CD19, CD20 및 CD40(B 세포 림프종), 루이스 Y 및 CEA 항원(다수의 암종), Tag72 항원(유방암 및 결장직장암), EGF-R(폐암), 엽산염 결합 단백질 및 HER-2 단백질(종종 인간의 유방암종 및 난소 암종에서 증폭됨), 또는 바이러스 단백질, 예컨대 HIV의 gpl20 및 gp41 외막 단백질, B형 및 C형 간염 바이러스 유래 외막 단백질, 인간 거대세포바이러스의 당단백 B 및 기타 외막 당단백, 그리고 발암바이러스, 예컨대 카포시(Kaposi) 육종 연관 헤르페스 바이러스 유래 외막 단백질을 포함한다. 기타 잠재적 표적 항원으로서는, 리간드가 HIV gpl20 외막 당단백인 CD4와, 기타 바이러스 수용체, 예컨대 ICAM(인간 리노바이러스의 수용체), 그리고 소아마비바이러스와 관련된 수용체 분자를 포함한다.
다른 구현예에서, CAR은 암 치료 세포, 예컨대 NK 세포를 끌어들여 항원을 표적화하여, 암 치료 세포가 면역 효과기 세포로서 작용을 하도록 함으로써 이 세포를 활성화할 수 있다. 이에 관한 일례로서는, CD30 발현 악성종양과 싸우기 위해 NK 세포를 끌어들이는 CD16A 항원을 표적화하는 CAR이 있다. 이중 특이적, 4가의 AFM13 항체는 이러한 효과를 전달할 수 있는 항체의 한 예이다. 이러한 유형의 구현예에 관한 추가의 설명은, 예를 들어 문헌(Rothe, A., et al.,"A phase 1 study of the bispecific anti-CD30/CD16A antibody construct AFM13 in patients with relapsed or refractory Hodgkin lymphoma," Blood, 25 June 2015, Vl.125, no.26, pp.4024-4031)에서 살펴볼 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 세포외 스페이서 도메인과 경막 도메인은 유비퀴틴화(ubiquitylation) 내성일 수 있어서, CAR-T 세포의 신호전달을 향상시켜, 항종양 활성을 증진시킬 수 있다(Kunii et la.,"Enhanced function of redirected human t cells expressing linker for activation of t cells that is resistant to ubiquitylation," Human Gene Therapy, vol.24, pp.27-37, 2013). 이 영역 안에서 세포외 스페이서 도메인은 CAR-T 세포의 외부에 존재하므로, 상이한 조건에 노출되고, 이로 말미암아 잠재적으로 조건부 유비퀴틴화 내성이 될 수 있다.
C. 마스킹(masking)된 조건부 활성 폴리펩티드 조작
본 발명의 조건부 활성 폴리펩티드, 특히 조건부 활성 항체는 자체의 조건부 활성을 마스킹할 수 있으며/있거나, 자체에 접합된 제제의 활성을 마스킹 기에 의해 마스킹할 수 있다. 마스킹된 활성은, 일단 마스킹 기가 조건부 활성 폴리펩티드로부터 제거되거나 절단되면 발휘될 수 있을 것이다. 적합한 마스킹 기술은, 예컨대 문헌(Desnoyers et al.,"Tumor-Specific Activation of an EGFR-Targeting Probody Enhances Therapeutic Index," Sci. Transl. Med.5, 207ra144, 2013)에 기술되어 있다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 항체는, 이 항체의 조건부 활성 및/또는 이 항체에 접합된 제제의 활성을 마스킹하는 마스킹 기와 결합된다. 예를 들어 조건부 활성 항체가 마스킹 기에 커플링(coupling)되면, 이러한 커플링 또는 변형은 구조 변화를 일으킬 수 있으며, 이러한 구조 변화는 조건부 활성 항체가 자체의 항원과 특이적으로 결합하는 능력을 감소시키거나 억제한다. 일단 조건부 활성 항체가 표적 조직 또는 미세환경에 도달하면, 마스킹 기는 표적 조직 또는 미세환경에 존재하는 효소에 의해 절단되고, 이로써 마스킹되었던 활성이 발휘된다. 예를 들어 효소는 보통 종양 미세환경에서 활성을 띄는 프로테아제로서, 마스킹 기를 절단하여 종양 조직 내에서 활성을 보이는 조건부 활성 항체를 방출시킬 수 있는 것이다.
몇몇 구현예들에서, 활성은 원래 활성의 약 50% 미만, 또는 원래 활성의 약 30% 미만, 또는 원래 활성의 약 10% 미만, 또는 원래 활성의 약 5% 미만, 또는 원래 활성의 약 2% 미만, 또는 원래 활성의 약 1% 미만, 또는 원래 활성의 약 0.1% 미만, 또는 원래 활성의 약 0.01% 미만이 되도록 마스킹된다. 몇몇 구현예들에서, 예를 들어 전달에 적당한 시간을 보장하기 위해 마스킹 효과는 생체 내에서 측정되거나, 시험관 내 면역흡착 검정에서 표적 치환을 통해 측정될 때 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96 시간, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월, 또는 이 이상 동안 지속되도록 디자인된다.
임의의 구현예들에서, 마스킹 기는 조건부 활성 항체의 자연 결합 파트너(항원)와 구조적으로 유사하다. 마스킹 기는 조건부 활성 항체의 변형된 자연 결합 파트너로서, 조건부 활성 항체와의 결합에 대한 친화성 및/또는 결합능(avidity)을 적어도 약간이나마 감소시키는 아미노산 변이들을 함유하는 것일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 마스킹 기는 조건부 활성 항체의 자연 결합 파트너에 대한 상동성을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 다른 구현예들에서, 조건부 활성 항체의 자연 결합 파트너에 대한 마스킹 기의 서열 동일성은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이하이다.
마스킹 기는 다수의 상이한 형태로 제공될 수 있다. 임의의 구현예들에서, 마스킹 기는, 조건부 활성 항체의 공지의 결합 파트너일 수 있되, 다만 마스킹 기는, 마스킹 기가 표적과의 요망되는 결합을 방해하는 것을 감소시키기 위해 이 마스킹 기가 절단됨에 따라 조건부 활성 항체가 표적화하는 표적 단백질보다는, 조건부 활성 항체와 더 작은 친화성 및/또는 결합능으로 결합한다. 그러므로 마스킹 기는, 바람직하게 이 마스킹 기가 절단되기 전 조건부 활성 항체가 표적과 결합하는 것을 마스킹하는 것이되, 다만 마스킹 기가 항체로부터 절단된 후에는 표적과 활성 분자의 결합을 실질적으로나 유의미하게 방해하지 않거나 이러한 결합에 대해 경쟁하지 않는다. 특정 구현예에서, 조건부 활성 항체와 마스킹 기는 자연 발생 결합 파트너 쌍의 아미노산 서열을 함유하지 않으므로, 조건부 활성 항체와 마스킹 기 중 적어도 하나는 자연 발생 결합 파트너의 일원의 아미노산 서열을 가지지 않는다.
대안적으로, 마스킹 기는 조건부 활성 항체와 특이적으로 결합할 수 없고, 오히려 비특이적 상호작용, 예컨대 입체 장해를 통해 조건부 활성 항체-표적 간의 결합을 방해할 수 있다. 예를 들어 마스킹 기는, 예를 들어 하전 기반 상호작용을 통해 마스킹기가 조건부 활성 항체를 마스킹하는 것을 항체의 구조나 입체형상이 허용하도록 배치될 수 있으며, 이에 따라 조건부 활성 항체로 표적이 접근하는 것을 막는다.
몇몇 구현예들에서, 마스킹 기는 공유 결합에 의해 조건부 활성 항체와 커플링된다. 다른 구현예에서, 조건부 활성 항체는, 마스킹기가 이 조건부 활성 항체의 N-말단에 결합함에 따라 자체의 표적과 결합하는 것이 방지된다. 또 다른 구현예에서, 조건부 활성 항체는 마스킹 기와 조건부 활성 항체 사이의 시스테인-시스테인 이황화물 가교에 의해 마스킹 기와 커플링된다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 항체는 절단 가능 기(Cleavable Moiety: CM)에 추가로 커플링된다. CM은 효소에 의해 절단될 수 있거나, 또는 CM은 환원제에 의해 환원될 수 있거나, 또는 CM은 광분해될 수 있다. 일 구현예에서, CM의 아미노산 서열은 마스킹 기와 중첩될 수 있거나, 또는 이에 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, CM은 조건부 활성 항체와 마스킹 기 사이에 있다. CM의 전부 또는 일부는 절단 전 조건부 활성 항체의 마스킹을 촉진할 수 있음을 주목하여야 할 것이다. CM이 절단되면, 조건부 활성 항체는 자체의 항원과의 결합에 있어서 더 큰 활성을 띄게 된다.
CM은 대상체 내 치료 부위에서 표적 항원과 함께 국부화되는, 효소에 대한 기질일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, CM은 이황화물 결합의 환원의 결과로서 절단 가능한 시스테인-시스테인 이황화물 결합을 가질 수 있다. CM은 또한 광원에 의해 활성화될 수 있는 광불안정 기질일 수도 있다.
CM을 절단하는 효소는 우선적으로 조건부 활성 항체가 요망되는 표적 조직에 존재하여야 하는데, 이 경우 조건부 활성 항체는 표적 조직에 조성된 조건(비정상 조건), 예컨대 발병 조직 또는 종양 조직에서 더 큰 활성을 보인다. 예를 들어 다수의 암, 예컨대 고형 종양에서 그 수준이 증가하는 공지의 프로테아제가 존재한다. 예컨대 문헌(La Rocca et al, (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421)을 참조한다. 이러한 질환의 비제한적 예들로서는 모든 유형의 암(유방암, 폐암, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 췌장암 등), 류머티즘성 관절염, 크론병, 흑색종, SLE, 심혈관 손상, 허혈증 등을 포함한다. 그러므로 종양 조직에 존재하는 프로테아제, 특히 비 암성 조직에서의 수준에 비하여 높은 수준으로 종양 조직에 존재하는 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩티드 기질을 포함하는, 적합한 CM이 선택될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, CM은 레구마인, 플라스민, TMPRSS-3/4, MMP-9, MTl-MMP, 카텝신, 카스파아제, 인간 호중구 엘라스타아제, 베타-세크라타아제, uPA 및 PSA로부터 선택되는 효소에 대한 기질일 수 있다. CM을 절단하는 효소는 비 치료 부위의 조직(예컨대 건강한 조직)보다는 치료 부위의 표적 조직(예컨대 발병된 조직 또는 종양 조직; 예컨대 치료적 처치 또는 진단적 처치를 위함)에 비교적 높은 수준으로 존재한다. 그러므로 발병된 조직이나 종양 조직에서 더 큰 활성을 보일 수 있는 항체의 조건부 활성 이외에도, 발병된 조직이나 종양 조직에 존재하는 효소는 CM을 절단할 수 있으며, 이로써 조건부 활성 항체의 활성 또는 접합된 제제의 활성은 더 향상된다. 비변형 또는 비절단 CM은 조건부 활성 항체 활성의 효율적 억제 또는 마스킹을 허용할 수 있어서, 조건부 활성 항체는 정상 조직(정상 생리학적 조건)에서는 더 작은 활성을 보인다. 정상 조직에서 조건부 활성 항체의 활성을 억제하는 이중 기작(조건부 활성 및 마스킹 기)은, 유의미한 부작용을 일으키지 않으면서, 사용될 조건부 활성 항체가 훨씬 높은 투여량만큼 사용되는 것을 허용한다.
몇몇 구현예들에서, CM은 하기 표 1에 나열된 효소들로부터 선택되는 효소의 기질일 수 있다.
[표 1]
대안적으로나, 추가적으로, CM은 시스테인 쌍의 이황화물 결합을 포함할 수 있으므로, 고형 종양 조직 또는 그 주위에 다량으로 존재할 수 있는 환원제, 예컨대 세포성 환원제, 예컨대 글루타치온(GSH), 티오리독신, NADPH, 플라빈, 아스코르브산염 등에 의해 절단 가능하다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 항체는 CM과 마스킹 기 둘 다를 함유한다. 조건부 활성 항체의 활성은 CM이 효소에 의해 절단됨에 따라 탈 마스킹(unmasking)된다. 몇몇 구현예들에서, 가요성을 제공하기 위해 하나 이상의 링커, 예컨대 가요성 링커를 항체, 마스킹 기 및 CM 사이에 삽입하는 것이 요망될 수 있다. 예를 들어 마스킹 기 및/또는 CM은 요망되는 가요성을 제공하는 잔기(예컨대 Gly, Ser, Asp, Asn, 특히 Gly 및 Ser, 특히 Gly)를 충분한 수만큼 함유할 수 없다. 그러므로 하나 이상의 아미노산을 도입하여, 가요성 링커를 제공하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어 마스킹된 조건부 활성 항체는 하기와 같은 구조를 가질 수 있다(하기 식은 N 말단 → C 말단 방향 또는 C 말단 → N 말단 방향 중 어느 한 방향의 아미노산 서열을 나타냄):
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L1-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
사이클로[L1-(MM)-L2-(CM)-L3-(AB)]
[상기 식 중, MM은 마스킹 기이고, AB는 조건부 활성 항체이며; L1, L2 및 L3는 각각 독립적으로, 그리고 선택적으로 존재하거나 존재하지 않는 것으로서, 적어도 하나의 가요성 아미노산(예컨대 Gly)을 포함하는 동일하거나 상이한 가요성 링커를 나타내고; "사이클로"는 (존재할 경우) 해당 구조의 N 말단과 C 말단 둘 다에, 또는 이 두 말단들에 인접하여 존재하는 시스테인 쌍들 사이의 이황화물 결합이 존재함으로 말미암아 전체 구조가 환형 구조의 형태를 가짐을 나타냄]
본 발명에 사용하기 적합한 링커는, 일반적으로 마스킹 기에 가요성을 제공하여 조건부 활성 항체의 활성이 억제되는 것을 촉진하는 것이다. 이러한 링커는, 일반적으로 가요성 링커라 지칭된다. 적합한 링커는 용이하게 선택될 수 있으며, 상이하면서 적합한 길이, 예컨대1개 아미노산(예컨대 Gly) 내지 20개 아미노산, 2개 아미노산 내지 15개 아미노산, 3개 아미노산 내지 12개 아미노산, 예컨대 4개 아미노산 내지 10개 아미노산, 5개 아미노산 내지 9개 아미노산, 6개 아미노산 내지 8개 아미노산, 또는 7개 아미노산 내지 8개 아미노산 중 임의의 길이를 가질 수 있으며, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개 아미노산일 수 있다.
예시적 가요성 링커로서는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체(예컨대 (GS)n, (GSGGS)n 및 (GGGS)n[식 중 n은 적어도 1인 정수임], 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 그리고 당 분야에 공지된 기타 가요성 링커를 포함한다. 예시적 가요성 링커로서는 Gly-Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Ser-Gly-Gly, GIy- Ser-Gly-Ser-Gly, Gly-Ser-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser-Gly 및 Gly-Ser-Ser-Ser-Gly등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
조건부 활성 항체의 활성을 마스킹하기 위해 사용되는 기술들 중 몇 가지가 WO 2010081173A2에 기술되어 있다.
몇몇 양태들에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 본원에 기술된 기술을 사용하여 조작될 수 있는 조건부 활성 항체이다. 항체 조작 기술의 비제한적 예들로서는 항체 접합, 다중 특이적 항체의 조작, 면역 효과기 세포 표면 항원 및 표적 항원에 대한 이중 특이적 조건부 활성 항체의 조작, 그리고 항체의 Fc 영역 조작을 포함한다.
조건부 활성 항체를 접합하기 위한 방법이 WO 2015/175375에 기술되어 있다. 일 양태에서, 조건부 활성 항체는 항체의 Fc 영역에 접합될 수 있다. 상기 기술된 접합 분자, 화합물 또는 약물은 미국 특허 제8,362,210호에 기술된 바와 같이 Fc 영역에 접합될 수 있다. 예를 들어 Fc 영역은 시토카인이나 독소에 접합되어 조건부 활성 항체가 우선적 활성을 보이는 부위에 전달될 수 있다. 폴리펩티드를 항체의 Fc영역에 접합시키기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,336,603호, 동 제5,622,929호, 동 제5,359,046호, 동 제5,349,053호, 동 제5,447,851호, 동 제5,723,125호, 동 제5,783,181호, 동 제5,908,626호, 동 제5,844,095 및 동 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 및 WO 99/04813; 문헌들(Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, pages 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, vol.331, pages 84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., vol. 154, pages 5590-5600, 1995; and ViI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.89, pages 11337-11341, 1992)을 참조한다.
일 양태에서, 조건부 활성 항체는 적어도 2개의 반응성 기, 즉 조건부 활성 항체와 반응하는 기 하나와, 접합된 제제와 반응하는 기 또 다른 하나를 가지는 중간 링커를 통하여 접합될 제제에 공유 부착될 수 있다. 임의의 양립 가능한 유기 화합물을 포함할 수 있는 링커는, 조건부 활성 항체 또는 이에 접합된 제제와의 반응이 조건부 활성 항체의 반응성 및/또는 선택성에 악영향을 미치지 않는 것으로서 선택될 수 있다. 더욱이 접합된 제제에 링커가 부착되면, 접합된 제제의 활성은 파괴되지 않을 수 있다.
산화된 조건부 활성 항체에 적합한 링커로서는 1급 아민, 2급 아민, 히드라진, 하디라지드, 하이드록실아민, 페닐히드라진, 세미카바지드 및 티오세미카바지드 기로부터 선택되는 기를 함유하는 링커를 포함한다. 환원된 조건부 활성 항체에 적합한 링커로서는 이 환원된 조건부 활성 항체의 설프히드릴기와 반응할 수 있는 임의의 반응기를 가지는 링커를 포함한다. 이러한 반응기로서는 반응성 할로알킬기(예컨대 할로아세틸기 포함), p-머큐리벤조산염기, 그리고 Michael형 부가 반응을 할 수 있는 기(예컨대 말레이미드 및 문헌(Mitra and Lawton, J. Amer. Chem. Soc. Vol.101, pages 3097-3110, 1979)에 기술된 유형의 기 포함)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다중 특이적 조건부 활성 항체를 조작하기 위한 방법은 WO 2015/175375에 기술되어 있다. 조건부 활성 항체는 면역 효과기 세포 표면 항원 및 표적 항원에 대한 이중 특이적 조건부 활성 항체로 생성되도록 조작될 수 있다. 본 발명의 이중 특이적 조건부 활성 항체는 면역 효과기 세포를 표적 항원이 존재하는 질환 발생 부위로 유인할 수 있다. 이중 특이적 조건부 활성 항체는 2개의 상이한 항원, 즉 면역 효과기 세포 표면 항원 및 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 이중 특이적 항체는 2개의 팔(arm)[여기서 팔 하나는 면역 효가기 세포 표면 항원과 결합하고, 또 다른 팔은 표적 항원에 결합함]을 포함하는 전장 항체일 수 있다. 이중 특이적 항체는 오로지 중쇄 가변 도메인(VH)과 경쇄 가변 도메인(VL)만을 포함하는 항체 단편일 수 있다. 일 구현예에서, 항체 단편은 적어도 2개의 VHVL 단위를 포함하는데; 다만 이 단위들 중 하나는 면역 효과기 세포 표면 항원과 결합하고, 또 다른 팔은 표적 항원과 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 단편은 적어도 2개의 단일 가변 도메인(VH 또는 VL)을 포함하는데; 다만 이 단일 가변 도메인 중 하나는 면역 효과기 세포 표면 항원과 결합하고, 또 다른 팔은 표적 항원과 결합한다. 몇몇 구현예들에서, 이중 특이적 조건부 활성 항체는 scFv를 2개 포함하는데; 이 scFv 중 하나는 면역 효과기 세포 표면 항원과 결합하고, 또 다른 하나는 표적 항원과 결합한다.
유인된 면역 효과기 세포는 면역 효과기 세포와 발병된 세포 또는 발병된 조직 상의 표적 항원 둘 다에 대한 결합 활성으로써 면역 효과기 세포를, 표적 항원을 함유하는 발병 세포 또는 발병 조직에 유인할 수 있다. 그 다음, 유인된 면역 효과기 세포는 발병된 세포 또는 발병된 조직을 공격하여 해당 질환이 치유되는 것을 도울 것인데, 그 이유는 면역 효과기 세포는 발병된 세포 또는 발병된 조직을 억제하거나, 심지어 파괴할 수 있기 때문이다. 예를 들어 면역 효과기 세포는 종양 세포 또는 감염된 세포를 파괴할 수 있다. 면역 효과기 세포는 자연 살해 세포(NK 세포), 대식세포, 림포카인 활성화 살해(LAK) 세포 및 T 세포를 포함한다.
이중 특이적 조건부 활성 항체는 2가지 결합 활성, 즉 면역 효과기 세포 표면 항원에 대한 활성과 표적 항원에 대한 활성을 가진다. 일 구현예에서, 이러한 결합 활성 둘 다는 조건부인데, 즉 이중 특이적 조건부 활성 항체와, 면역 효과기 세포 표면 항원 및 표적 항원의 결합 활성은, 정상 생리학적 조건 하에서의 모 항체와, 면역 효과기 세포 표면 항원 및 표적 항원의 결합 활성보다 더 작고, 비정상 조건 하에서의 모 항체와, 면역 효과기 세포 표면 항원 및 표적 항원의 결합 활성보다 더 큼을 의미한다. 일 구현예에서, 2개의 결합 활성 중 오로지 하나만이 조건부인데, 즉 이중 특이적 조건부 활성 항체의 면역 효과기 세포 표면 항원에 대한 결합 활성, 또는 이중 특이적 조건부 활성 항체의 표적 항원에 대한 결합 활성 중 어느 하나가 조건부임을 의미한다. 이러한 경우, 이중 특이적 조건부 활성 항체의 면역 효과기 세포 표면 항원에 대한 결합 활성, 또는 이중 특이적 조건부 활성 항체의 표적 항원에 대한 결합 활성 중 하나는, 정상 생리학적 조건 하에서의 모 항체의 대응하는 활성보다 더 작고, 비정상 조건 하에서의 모 항체의 대응하는 활성보다 더 크다.
이중 특이적 조건부 활성 항체 중 2개의 팔(예컨대 2개의 VHVL 단위, 또는 2개의 scFv)은 종래의 방법에 의해 연결될 수 있다. 당 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 완전 항원 결합 부위를 함유하는 최소의 항체 단편은 비공유 결합에 의해 중쇄 가변 도메인(VH) 하나와 경쇄 가변 도메인(VL) 하나로 이루어진 이량체를 가진다. 이러한 입체구조는, 각각의 가변 도메인의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상 항원 결합 부위를 한정하는, 원산 항체에서 발견되는 입체구조에 대응한다. 종합적으로, CDR 6개가 항체에 항원 결합 특이성을 제공한다. CDR에 측접하는 구조틀(FR)은, 인간과 마우스만큼 다양한 종들의 원산 면역글로불린에 본질적으로 보존되는 3차 구조를 가진다. 이러한 FR들은 CDR을 자체의 적당한 배향으로 고정하는데 사용된다. 불변 도메인은 결합 기능에 필요하지 않지만, VH-VL 상호작용을 안정화하는 것을 도울 수 있다. 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 CDR을 3개만 포함하는 Fv의 절반)조차도 항원을 인지하고 이에 결합하는 능력을 가지긴 하지만, 보통은 전체 결합 부위보다는 작은 친화성으로 결합한다(Painter et al.,"Contributions of heavy and light chains of rabbit immunoglobulin G to antibody activity. I. Binding studies on isolated heavy and light chains," Biochemistry, vol.11 pages 1327-1337, 1972). 그러므로, 이중 특이적 조건부 활성 항체의 결합 부위의 상기 도메인은 상이한 면역글로불린의 VH-VL, VH-VH 또는 VL-VL 도메인 쌍으로서 구성될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 이중 특이적 조건부 활성 항체는 재조합 DNA 기술에 의해, 예컨대 이중 특이적 조건부 활성 항체를 암호화하는 핵산 분자가 연속 폴리펩티드 사슬을 구성하도록 발현되는 방식으로, 연속 폴리펩티드 사슬로서 구성될 수 있다[예컨대 문헌(Mack et al.,"A small bispecific antibody construct expressed as a functional single-chain molecule with high tumor cell cytotoxicity," Proc. Natl. Acad. Sci. USA , vol.92, pages 7021-7025, 2005) 참조]. 항원 결합 부위들이 적절히 폴딩되어 면역 효과기 세포 표면 항원에 대한 결합 부위 하나와 표적 항원에 대한 결합 부위 하나를 형성할 수 있도록 VH 도메인과 VL 도메인이 배열되는 한, VH 도메인과 VL 도메인의 폴리펩티드 사슬 내 순서는 본 발명에 중요하지 않다.
본원에 기술된 다중 특이적 조건부 활성 항체를 조작하기 위한 기술들 중 몇 가지가 면역 효과기 세포 표면 항원 및 표적 항원에 대한 이중 특이적 조건부 활성 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.
이중 특이적 항체는 문헌[WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Bruhl, J. Immunol., (2001), 166, 2420-2426]에 기술된 바와 같이, 단일 폴리펩티드 사슬로서 입체배열될 수 있다. 이중 특이적 항체의 특히 바람직한 입체구조는 VH 영역 및 VL 영역이 서로 링커-도메인에 의해 결합되어 있는 폴리펩티드 구조체이다. 이 단일 폴리펩티드 사슬 내 VH 영역 및 VL 영역의 순서는 중요하지 않다. 일 구현예에서, 단일 폴리펩티드 사슬은 VH1-링커 도메인-VL1-링커 도메인-VH2-링커 도메인-VL2와 같이 입체배열된다. 다른 구현예에서, 단일 폴리펩티드 사슬은 VL1-링커 도메인-VH1-링커 도메인-VL2-링커 도메인-VH2와 같이 입체배열된다. 다른 구현예에서, 단일 폴리펩티드 사슬은 VH1-링커 도메인-VH2-링커 도메인-VL1-링커 도메인-VL2와 같이 입체배열된다. 다른 구현예에서, 단일 폴리펩티드는 VH1-링커 도메인-VL2-링커 도메인-VL1-링커 도메인-VH2와 같이 입체배열된다. 단일 폴리펩티드 사슬은, 각각의 팔이 면역 효과기 세포 표면 항원 또는 표적 항원과 결합할 수 있는, 2개의 팔로 폴딩될 수 있다.
이중 특이적 조건부 활성 항체 내 링커 도메인은 이러한 VH 도메인 및 VL 도메인 사이의 분자간 결합을 허용하기에 충분히 긴 펩티드 단편이다. 이 목적에 적합한 링커의 디자인은 선행 기술, 예컨대 EP 623679 B1, 미국 특허 제5,258,498호, EP 573551 B1 및 미국 특허 제5,525,491호에 기술되어 있다. 링커 도메인은, 바람직하게 글리신, 세린 및/또는 글리신/세린으로부터 선택되는 아미노산 1개 내지 25개로 이루어진 친수성 가요 링커이다. 일 구현예에서, 링커 도메인은 서열 (Gly4Ser)3의 15개 아미노산 링커이다.
추가의 링커 도메인은 올리고머화 도메인을 포함한다. 올리고머화 도메인은 2개 또는 수 개의 VH 도메인 및 VL 도메인의 조합이, 각각이 면역 효과기 세포 표면 항원 또는 표적 항원과 결합할 수 있는, 2개의 팔로 폴딩되는 것을 촉진할 수 있다. 올리고머화 도메인의 비제한적 예로서는 루신 지퍼(예컨대 jun-fos, GCN4, E/EBP; Kostelny, J. Immunol.148 (1992), 1547-1553; Zeng, Proc. Natl. Acad. Sci.94 (1997), 3673-3678, Williams, Genes Dev. 5 (1991), 1553-1563; Suter,"Phage Display of Peptides and Proteins", Chapter 11, (1996), Academic Press), 항체 유래 올리고머화 도메인, 예컨대 불변 도메인 CH1 및 CL(Mueller, FEBS Letters 422 (1998), 259-264) 및/또는 사량체화 도메인, 예컨대 GCN4-LI(Zerangue, Proc. Natl. Acad. Sci.97 (2000), 3591-3595)를 포함한다.
몇몇 구현예들에서, 단일 폴리펩티드 사슬 이중 특이적 조건부 항체의 폴딩을 안정화하는데 납-인-홀(knob-in-hole) 기술이 사용될 수 있다. 납-인-홀 기술은 문헌[Ridgway et al., "'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization," Protein Eng.1996 Jul; 9(7):617-21]에 기술되어 있다. 이 접근법은 인접 a-나선체들 사이에 아미노산 측쇄를 팩킹하기 위해 사용되어 왔는데, 여기서 a-나선체 내 잔기들의 측쇄는 인접 a-나선체의 납과 교합할 수 있는, 홀과 번갈아 가며 이격되어 원통 표면 상에 존재하는 납으로 제시된다(O'Shea et al., (1991) Science, 254, 539-544).
면역 효과기 세포 표면 항원은 면역 효과기 세포 하나 또는 면역 효과기 세포 군에 특이적이어야 한다. 면역 효과기 세포 다수에 대한 표면 항원이 공지되어 있다. 자연 살해 세포는 CD56, CD8, CD16, KIR 군 수용체, NKp46, NKp30, CD244 (2B4), CD161, CD2, CD7, CD3와, 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체를 비롯한 표면 항원을 가진다(Angelis et al.,"Expansion of CD56-negative, CD16-positive, KIR-expressing natural killer cells after T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation," Acta Haematol.2011;126(1):13-20; Dalle et al.,"Characterization of Cord Blood Natural Killer Cells: Implications for Transplantation and Neonatal Infections," Pediatric Research (2005) 57, 649-655; Agarwal et al.,"Roles and Mechanism of Natural Killer Cells in Clinical and Experimental Transplantation," Expert Rev. Clin. Immunol.2008;4(1):79-91).
대식세포는 CD11b, F4/80, CD68, CSF1R, MAC2, CD11c, LY6G, LY6C, IL-4Rα, CD163, CD14, CD11b, F4/80(마우스)/EMR1(인간), CD68 및 MAC-1/MAC-3, PECAM-1(CD31), CD62, CD64, CD45, Ym1, CD206, CD45RO, 25F9, S100A8/A9, 그리고 PM-2K를 비롯한 표면 항원을 가진다(Murray et al.,"Protective and pathogenic functions of macrophage subsets," Nature Reviews Immunology, 11, 723-737; Taylor et al.,"Macrophage receptors and immune recognition," Annu. Rev. Immunol.2005; 23:901-44; Pilling, et al.,"Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts," PLoS ONE 4(10): e7475. doi:10.1371/journal.pone.0007475, 2009).
림포카인 활성화 살해(LAK) 세포는 T3, T4 T11, T8, TII, Leu7, Leu11을 비롯한 표면 항원을 가진다(Ferrini et al.,"Surface markers of human lymphokine-activated killer cells and their precursors," Int J Cancer.1987 Jan 15;39(1):18-24; Bagnasco et al.,"Glycoproteic nature of surface molecules of effector cells with lymphokine-activated killer (LAK) activity," Int J Cancer.1987 Jun 15;39(6):703-7; Kaufmann et al.,"Interleukin 2 induces human acute lymphocytic leukemia cells to manifest lymphokine-activated-killer (LAK) cytotoxicity," The Journal of Immunology, August 1, 1987, vol.139 no.3977-982).
T 세포, 특히 세포독성 T 세포는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, T58, CD27, CD45, CD84, CD25, CD127, 및 CD196 (CCR6), CD197 (CCR7), CD62L, CD69, TCR, T10, T11, 및 CD45RO를 비롯한 표면 항원을 가진다(Ledbetter et al.,"Enhanced transmembrane signaling activity of monoclonal antibody heteroconjugates suggests molecular interactions between receptors on the T cell surface," Mol. Immunol.1989 Feb;26(2):137-45; Jondal et al.,"SURFACE MARKERS ON HUMAN T AND B LYMPHOCYTES," JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, VOLUME 136, 1972, 207-215; Mingari et al.,"Surface markers of human T lymphocytes," Ric Clin Lab.1982 Jul-Sep;12(3):439-448).
이중 특이적 조건부 활성 항체는 면역 효과기 세포와 결합한 후, 이 면역 효과기 세포를 세포나 조직, 즉 표적 항원이 존재하는 세포나 조직, 바람직하게는 표면에 가져다 놓을 수 있다. 일단 이중 특이적 조건부 활성 항체가 (면역 효과기 세포와 함께) 표적 항원과 결합하면, 면역 효과기 세포는 발병 세포나 발병 조직을 공격할 수 있다. 면역 효과기 세포, 예컨대 자연 살해 세포, 대식세포, LAK 세포, T 세포(세포독성)는 모두 발병 세포나 조직을 사멸 및/또는 파괴할 수 있다(예를 들어 종양 조직을 파괴할 수 있다).
발병 세포나 발병 조직은 암, 염증성 질환, 신경장애, 당뇨병, 심혈관질환 또는 감염성 질환 발병 세포나 발병 조직으로부터 선택될 수 있다. 표적 항원의 예로서는 다양한 면역 세포, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식세포 종양, 아세포종, 그리고 다양한 혈액학적 질환과 연관된 세포, 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환에 의해 발현되는 항원을 포함한다.
이중 특이적 조건부 활성 항체에 의해 표적화될 수 있는 암에 특이적인 표적 항원은, 4-IBB, 5T4, 선암종 항원, 알파-태아단백질, BAFF, B-림프종 세포, C242 항원, CA-125, 탄산무수화효소 9(CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE 수용체), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 피브로넥틴 잉여 도메인-B, 엽산염 수용체 1, GD2, GD3 강글리오시드, 당단백 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, 인간 산란인자 수용체 키나아제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgGl, LI-CAM, IL-13, IL-6, 인슐린 유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 ανβ3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 뮤신 CanAg, N-글리콜일뉴라민산, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, 포스파티딜세린, 전립선암종 세포, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나신 C, TGF 베타2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2 또는 비멘틴 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물 또는 유전자 조작된 세포독성 세포로 치료될 암의 유형으로서는 암종, 아세포종 및 육종, 그리고 임의의 백혈병 또는 림프성 악성종양, 양성 및 악성 종양, 그리고 악성종양, 예컨대 육종, 암종 및 흑색종을 포함한다. 암은 비 고형 종양(예컨대 혈액학적 종양) 또는 고형 종양일 수 있다. 성인의 종양/암과 소아의 종양/암도 또한 포함된다.
혈액학적 암은 혈액이나 골수의 암이다. 혈액학적(또는 혈행성) 암의 예로서는 백혈병, 예컨대 급성 백혈병(예컨대 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수아구성, 전골수아구성, 골수단핵구성, 단핵구성 백혈병 및 적백혈병), 만성 백혈병(예컨대 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병), 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨병(나태성 및 고등급형), 다발성 골수종, 발덴스트롬(Waldenstrom) 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 골수이형성증후군, 모양세포 백혈병 및 골수이형성증을 포함한다.
고형 종양은 보통 낭포 또는 액체 구역을 함유하지 않는, 조직의 비정상적 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 고형 종양의 상이한 유형은 이 고형 종양을 형성하는 세포의 유형에 대해 명명된다(예컨대 육종, 암종 및 림프종). 치료될 수 있는 고형 종양의 예들로서는 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종 및 기타 육종, 활막종, 중피종, 유잉(Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프성 악성종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 거대종격동전이암, 유두갑상샘암종, 크롬친화성세포종 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질암종, 기관지원성암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막암종, 빌름(Wilms) 종양, 자궁경부암, 고환암, 정상피종, 방광 암종, 흑색종 및 CNS 종양(예컨대 신경교종(예컨대 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교모세포종(다형성신경교아종이라고도 공지됨) 성상세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 슈반(Schwannoma) 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 뇌수막종, 신경아세포종, 망막모세포종 및 뇌전이)를 포함한다.
이중 특이적 조건부 활성 항체에 의해 표적화될 수 있는 염증성 질환에 특이적인 표적 항원으로서는, AOC3 (VAP-1), CAM-3001, CCL11(에오탁신-1), CD125, CD147(바시긴), CD154(CD40L), CD2, CD20, CD23 (IgE 수용체), CD25(IL-2 수용체의 한 사슬), CD3, CD4, CD5, IFN-a, IFN-γ, IgE, IgE Fc 영역, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-6 수용체, 인테그린 a4, 인테그린 α4β7, LFA-1(CD11a), MEDI-528, 미오스타틴, OX-40, rhuMAb β7, 스클레로스틴, SOST, TGF 베타1, TNF-a 또는 VEGF-A 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 이중 특이적 조건부 활성 항체에 의해 표적화될 수 있는 신경 장애에 특이적인 표적 항원은 베타 아밀로이드 또는 MABT5102A 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 이중 특이적 조건부 활성 항체에 의해 표적화될 수 있는 당뇨병에 특이적인 항원은 L-Iβ 또는 CD3 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 이중 특이적 조건부 활성 항체에 의해 표적화될 수 있는 심혈관 질환에 특이적인 항원은 C5, 심장 미오신, CD41(인테그린 알파-lib), 피브린 II, 베타 사슬, ITGB2(CD18) 및 스핑고신-1-인산염 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 이중 특이적 조건부 활성 항체에 의해 표적화될 수 있는 감염성 질환에 특이적인 표적 항원은 탄저균 독소, CCR5, CD4, 군집 인자A, 거대세포바이러스, 거대세포바이러스 당단백 B, 내독소, 에스케리치아 콜라이, B형 간염 표면 항원, B형 간염 바이러스, HIV-1, Hsp90, 인플루엔자 A 혈구응집소, 리포테이코산, 슈도모나스 아에루기노사, 광견병 바이러스 당단백, 호흡기융합바이러스 및 TNF-a 중 하나 이상을 포함한다.
표적 항원의 추가 예들로서는 암 세포 상에서 특이적으로나 증폭되는 형태로서 발견되는 표면 단백질들, 예컨대 IL-14 수용체, CD19, CD20 및 CD40(B 세포 림프종), 루이스 Y 및 CEA 항원(다수의 암종), Tag72 항원(유방암 및 결장직장암), EGF-R(폐암), 엽산염 결합 단백질 및 HER-2 단백질(종종 인간의 유방 암종 및 난소 암종에서 증폭됨), 또는 바이러스 단백질, 예컨대 HIV의 gpl20 및 gp41 외막 단백질, B형 및 C형 간염 바이러스 유래 외막 단백질, 인간 거대세포바이러스의 당단백 B 및 기타 외막 당단백, 그리고 발암바이러스, 예컨대 카포시 육종 연관 헤르페스 바이러스 유래 외막 단백질을 포함한다. 기타 잠재적 표적 항원으로서는, 리간드가 HIV gpl20 외막 당단백인 CD4와, 기타 바이러스 수용체, 예컨대 ICAM(인간 리노바이러스의 수용체), 그리고 소아마비바이러스와 관련된 수용체 분자를 포함한다.
인간 면역결핍증 바이러스(HIV)는, 처음에 세포 표면상 2개의 핵심 분자들, 즉 CD4 및 보조수용체(co-receptor)에 결합하지 않으면 인간 세포에 도입될 수 없다. 처음에 인지되는 보조수용체는 CCR5이고, 또 다른 케모카인 수용체 CXCR4는 바이러스 생애 주기 후반부에 HIV-1에 대한 보조수용체가 된다(D'Souza, Nature Med.2, 1293 (1996); Premack, Nature Med.2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996)). 대부분 성 접촉에 의해 바이러스 전염을 일으키는 HIV-1 균주는 M-트로픽(M-tropic) 바이러스라 칭하여진다. 이 HIV-1 균주(비 융합 유도성(Non Syncytia Inducing; NSI) 주요 바이러스라고도 공지되어 있음)는 주요 CD4+ T 세포 및 대식세포 내에서 증식하고, 자체의 보조수용체로서 케모카인 수용체 CCR5(드물게는 CCR3)를 이용한다. T-트로픽(T-tropic) 바이러스(종종 융합 유도성(Syncytia Inducing; SI) 주요 바이러스라고도 칭하여짐)도 또한 주요 CD4+ T 세포 내에서 복제할 수 있지만, 이외에도 확립된 CD4+ T 세포주를 케모카인 수용체 CXCR4(푸신(fusin))를 통해 시험관 내에서 감염시킬 수 있다. 이와 같은 T-트로픽 균주 다수는 CXCR4 이외에도 CCR5를 이용할 수 있으며, T-트로픽 균주 일부는 적어도 임의의 시험관 내 조건에서 CCR5를 통해 대식세포에 도입된다(D'Souza, Nature Med. 2, 1293 (1996); Premack, Nature Med.2, 1174; Fauci, Nature 384, 529 (1996)). M-트로픽 HIV-1 균주는 HIV 성적 전염의 약 90%에 연루되어 있으므로, CCR5는 환자에 있어 이 바이러스의 우세한 보조수용체이다.
표적 세포 상 보조수용체 분자의 수와 동일성, 그리고 HIV-1 균주가 상이한 보조수용체들을 통해 세포에 도입될 수 있는 능력은 질환의 진행에 있어서 중요한 결정요소이다. 호지킨병 환자로부터 유래한 림프 소절의 T 세포와 B 세포에서 CCR3 및 CCR5의 고 발현이 또한 관찰되었다. I형 당뇨병은 T 세포 매개 자가면역 질환인 것으로 간주된다. 췌장 내 CCR5 수용체의 발현은 관련 동물 모델에 있어 I형 당뇨병의 진행과 연관되었다(Cameron (2000) J. Immunol.165, 1102-1110). 일 구현예에서, 이중 특이적 조건부 활성 항체는 표적 항원인 CCR5에 결합하는데, 이 점은 숙주 세포의 HIV 감염을 억제하고, 다른 질환의 진행을 늦추는데 이용될 수 있다.
(인간) CCR5에 특이적으로 결합하는 항체 몇 개가 당 분야에 공지되어 있으며, MC-1(Mack (1998) J. Exp. Med.187, 1215-1224) 또는 MC-5(Blanpain (2002) Mol. Biol. Cell.13:723-37, Segerer (1999) Kidney Int.56:52-64, Kraft (2001) Biol. Chem.14; 276:34408-18)를 포함한다. 그러므로 이중 특이적 조건부 활성 항체는, 예를 들어 CCR5, 바람직하게 인간 CCR5에 특이적인 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인(즉 Ig 유래 제2 도메인)과, T-세포상 CD3 항원에 특이적인 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 것이 바람직하다.
다른 구현예에서, 본 발명은 T 세포상 CD3과 CD19(표적 항원)에 대한 이중 특이적 조건부 활성 항체를 제공한다. CD19는 매우 유용한 의학적 표적임이 입증되었다. CD19는 프로 B 세포로부터 성숙 B 세포에 이르기까지 전체 B 세포 계통에서 발현될 뿐 아니라 모든 림프종 세포 상에 균일하게 발현되고, 줄기 세포에는 존재하지 않는다(Haagen, Clin Exp Immunol 90 (1992), 368-75; Uckun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8603-7). CD19에 대해 생성된 항체와 추가의 면역조절 항체 둘 다를 사용하는 병용 요법이, B 세포 악성종양의 치료(WO 02/04021, US2002006404, US2002028178) 및 자가면역 질환의 치료(WO 02/22212, US2002058029)에 대해 개시되었다. WO 00/67795에는, B 세포 림프종의 나태성 및 공격성 형태뿐만 아니라 림프성 백혈병의 급성 및 만성 형태를 치료하기 위해 CD19에 대한 항체를 사용하는 것이 개시되어 있다. WO 02/80987에는, B 세포 비 호지킨 림프종, 호지킨 림프종 또는 B 세포 백혈병(예컨대 B 세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL)(예컨대 모양 세포 림프종), B 세포 전구체 급성 림프성 백혈병(전 B-ALL), B 세포 만성 림프성 백혈병(B-CLL)과 같은 질환을 치료하기 위한, 항원 CD19에 대한 항체를 기반으로 하는 면역독소를 치료적으로 사용하는 것이 개시되어 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 T 세포상 CD3 및 CD20(표적 항원)에 대한 이중 특이적 조건부 활성 항체를 제공한다. CD20은 B 림프구상에 존재하는 세포 표면 단백질들 중 하나이다. CD20 항원은 정상 및 악성 전 B 림프구 및 성숙 B 림프구, 예컨대 B 세포 비호지킨 림프종(NHL)의 90% 이상에서 보이는 B 림프구에서 발견된다. 항원은 조혈 줄기 세포, 활성화된 B 림프구(혈장 세포) 및 정상 조직에는 존재하지 않는다. 대부분 쥐과 동물 기원의 몇몇 항체가 기술되어 있다: 1F5(Press et al., 1987, Blood 69/2, 584-591), 2B8/C2B8, 2H7, 1H4(Liu et al., 1987, J Immunol.139, 3521-3526; Anderson et al., 1998, 미국 특허 제5,736,137호; Haisma et al., 1998, Blood 92, 184-190; Shan et al., 1999, J. Immunol.162, 6589-6595).
CD20은 담체 단백질에 결합된 scFv를 암호화하는 DNA에 의한 백신화가 이용되어 혈장 세포 악성종양을 치료하기 위한 면역요법 전략(Treon et al., 2000, Semin. Oncol.27(5), 598)에서 기술된 바 있으며, CD20 항체(IDEC-C2B8)를 이용하는 면역요법치료는 비호지킨 B 세포 림프종 치료에 유효한 것으로 보였다.
몇몇 구현예들에서, 이중 특이적 조건부 활성 항체는 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 암호화된 단일 폴리펩티드 사슬이다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 DNA, cDNA, RNA, 또는 합성에 의해 생산된 DNA 또는RNA, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 것 단독 또는 임의의 것들을 조합하여 포함하는, 재조합에 의해 생산된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파아지를 포함하는 발현 벡터, 또는 유전공학에서 통상 사용되는 임의의 발현계의 일부일 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포와 적합한 조건 하에 벡터의 선택을 허용하는 추가의 유전자, 예컨대 마커 유전자를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포 내에서의 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 결합된다. 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래하는 발현 벡터는, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포유동물 세포에 전달하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 세포성 숙주의 유형에 따라서 달라지는, 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로 옮겨질 수 있다. 예를 들어 염화칼슘 트랜스펙션은 원핵생물 세포용으로 보통 사용되는 반면에, 인산칼슘 처리 또는 전기천공법은 기타 세포성 숙주용으로 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 이중 특이적 조건부 활성 폴리펩티드로 생산되도록 조작될 수 있다. 이중 특이적 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하기 위한 방법은, WO 2015/175375에 기술된 바와 같은, 이중 특이적 조건부 활성 항체를 조작하기 위한 방법과 유사하다. 예를 들어 이중 특이적 조건부 활성 폴리펩티드는 각각이 조건부 활성을 보이는 활성 부위들을 2개 가질 수 있는데, 즉 정상 생리학적 조건 하에서는 야생형 부위보다 더 작은 활성을 보이고, 비정상 조건 하에서는 야생형 부위보다 더 큰 활성을 보이는 활성 부위 2개를 가질 수 있다. 이러한 2개의 조건부 활성 부위는 독립적으로 진화 및 스크리닝(screening)될 수 있으며, 이후 2개의 활성 부위들은 연결되어 링커와 함께 동일한 이중 특이적 조건부 활성 폴리펩티드에 통합될 수 있다. 일 양태에서, 이중 특이적 조건부 활성 항체에 사용된 링커는 조건부 활성 폴리펩티드 내 2개의 조건부 활성 부위를 연결함으로써 이중 특이적 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는데 적합하다.
조건부 활성 항체의 Fc 영역을 조작하기 위한 방법은 WO 2015/175375에 기술되었다. 조건부 활성 바이러스 입자를 조작하기 위한 방법도 또한 WO 2015/175375에 기술되었다.
몇몇 양태들에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 WO 2015/175375에 기술된 방법이 이용되어 암 살상 바이러스인 바이러스 입자에 삽입될 수 있다. 암 살상 바이러스는 종양 세포와 접촉할 때 이 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 바이러스이다. 암 살상 바이러스에 삽입된 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 미세환경에서 더 큰 활성을 보이지만, 대상체의 다른 부위에서는 더 작은 활성을 보인다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 미세환경 pH(예컨대 pH 6.2 ~ 6.8)에서는 더 큰 활성을 보이지만 대상체의 다른 부위에 조성된 pH에서는 더 작은 활성을 보인다. 암 살상 바이러스에 삽입된 조건부 활성 폴리펩티드는 이 암 살상 바이러스가 종양에 전달될 수 있도록 만들 것이며, 여기에서 암 살상 바이러스는 종양 세포를 표적화하여 이를 사멸할 수 있다.
관심 암 살상 바이러스로서는 아데노바이러스; 헤르페스 심플렉스 바이러스-1; 백시니아 바이러스; 파보바이러스; 레오바이러스; 및 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스 등을 포함한다. 백시니아 바이러스가 특히 관심이 간다.
일 양태에서, 암 살상 바이러스는 파라믹소바이러스, 레오바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 양태에서, 파라믹소바이러스는 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 홍역 바이러스 및 유행성이하선염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 양태에서, NDV는 MTH68/H, PV-701 및 73-T로 이루어진 군으로부터 선택되는 균주로부터 유래한다.
다른 양태에서, 암 살상 바이러스는 헤르페스바이러스, 레오바이러스, E1B 결실 아데노바이러스, 수포성구내염 바이러스 및 폭스 바이러스로부터 선택된다. 이러한 암 살상 바이러스는 종양 세포를 파괴하는 것뿐만 아니라 파괴된 종양 세포로부터 항원을 방출시켜 면역 반응을 촉발하는 잠재성을 가진다.
암 살상 바이러스의 구체예로서는 아데노바이러스(예컨대 델타-24, 델타-24-RGD, ICOVIR-5, ICOVIR-7, Onyx-015, ColoAdl, H101 , AD5/3-D24-GMCSF), 레오바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV; OncoVEX GMCSF), 뉴캐슬병 바이러스, 홍역 바이러스, 레트로바이러스(예컨대 인플루엔자 바이러스), 폭스바이러스(예컨대 백시니아 바이러스, 예컨대 코펜하겐(Copenhagen), 웨스턴 리저브(Western Reserve), 와이어스(Wyeth) 균주), 점액종 바이러스, 랍도바이러스(예컨대 수포성구내염 바이러스(VSV)), 피코나바이러스(예컨대 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus; SW-001)), 콕사키바이러스 및 파보바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 양태에서, 암 살상 바이러스는 아데노바이러스, 예컨대 이의 57가지 인간 혈청형들(HAdV-1 내지 57) 중 임의의 것의 일원이다. 일 구현예에서, 아데노바이러스는 Ad5 혈청형이다. 다른 양태들에서, 아데노바이러스는 Ad5 성분을 포함할 수 있거나 포함할 수 없는 하이브리드 혈청형이다. 적합한 아데노바이러스의 비제한적 예들로서는 델타-24, 델타-24-RGD, ICOVIR-5, ICOVIR-7, ONYX-015, ColoAdl, H101 및 AD5/3-D24-GMCSF를 포함한다. ONYX-015는 E1B-55K 영역 및 E3B 영역에 결실이 일어나 암 선택성이 향상된 바이러스 혈청형 Ad2 및 Ad5의 하이브리드이다. HI01은 Onyx-015의 변형된 형태의 것이다. ICOVIR-5 및 ICOVIR-7은 El A의 Rb 결합 부위 결실과, El A 촉진인자의 E2F 촉진인자로의 치환을 포함한다. Colo Ad 1은 키메라 Addl lp/Ad3 혈청형이다. AD5/3-D24-GMCSF(CGTG-102)는 GM-CSF를 암호화하는, 혈청형 5/3 캡시드 변형 아데노바이러스이다(Ad5 캡시드 단백질 납은 혈청형 3의 납 도메인으로 치환됨).
하나의 특히 바람직한 구현예에서, 암 살상 바이러스는 델타-24 또는 델타-24-RGD 아데노바이러스이다. 델타-24는 미국 특허 출원 공보 제2003/0138405호 및 동 제2006/0147420호에 기술되어 있다. 델타-24 아데노바이러스는 아데노바이러스 5형(Ad-5)으로부터 유래하고, El A 유전자의 CR2부 내에 24개 염기쌍 결실을 함유한다. 델타-24-RGD는 (ανβ3 및 ανβ5 인테그린과 강력하게 결합하는) RGD-4C 서열의, 섬유 납 단백질 HI 루프로의 삽입을 추가로 포함한다(Pasqualini R. et al., Nat. Biotechnol., 15:542-546, 1997).
암 살상 아데노바이러스는 또한, 이 암 살상 아데노바이러스가 암을 치료하는 능력이 개선되도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 암 살상 아데노바이러스의 변형은 문헌(Jiang et al. (Curr. Gene Ther., 2009 Oct 9(5):422-427)에 기술되어 있으며, 또한 미국 특허 출원 공보 제2006/0147420호도 참조한다.
암 살상 바이러스는 조건부 활성 폴리펩티드와 함께 국부 또는 전신 투여될 수 있다. 예를 들어 비제한적으로 암 살상 바이러스는 혈관내(동맥내 또는 정맥내), 종양내, 근육내, 피내, 복막내, 피하, 경구, 비경구, 비 내, 기관내, 경피, 척추내, 안내 또는 두개골내 투여될 수 있다.
암 살상 바이러스는 단일 투여 또는 다수회 투여로서 투여될 수 있다. 이 바이러스는 적어도 1 x 105 플라크 형성 단위(PFU), 적어도 5 x 105 PFU, 적어도 1 x 106 PFU, 적어도 5 x 106 또는 적어도 5 x 106 PFU, 1 x 107, 적어도 1 x 107 PFU, 적어도 1 x 108 또는 적어도 1 x 108 PFU, 적어도 1 x 108 PFU, 적어도 5 x 108 PFU, 적어도 1 x 109 또는 적어도 1 x 109 PFU, 적어도 5 x 109 또는 적어도 5 x 109 PFU, 적어도 1 x 1010 PFU 또는 적어도 1 x 1010 PFU, 적어도 5 x 1010 또는 적어도 5 x 1010 PFU, 적어도 1 x 1011 PFU 또는 적어도 1 x 1011 PFU, 적어도 1 x 1012 PFU, 또는 적어도 1 x 1013 PFU의 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어 암 살상 바이러스는 약 107 내지 약1013 PFU, 약 108 내지 약 1013 PFU, 약 109 내지 약 1012 PFU, 또는 약 108 내지 약 1012 PFU의 투여량으로 투여될 수 있다.
임의의 양태들에서, 암 살상 바이러스로 치료될 암은 임의의 고형 종양, 예컨대 폐, 난소, 유방, 자궁경부, 췌장, 위, 결장, 피부, 후두, 방광 및 전립선 암을 포함한다. 일 양태에서, 암은 중추신경계의 암이다. 암은 신경상피 종양, 예컨대 신경교종(예컨대 성상세포종, 역형성 성상세포종, 교모세포종, 교육종, 모양세포성 성상세포종, 거대세포 성상세포종, 다형성황색성상세포종), 핍지교종, 상의세포종, 핍지교성상세포종, 해면아세포종, 성상아세포종, 맥락총유두종, 맥락총암종, 신경절세포종, 신경절교세포종, 신경세포종, 신경상피종양, 신경아세포종, 송과선부위종양(예컨대 송과체종, 송과체아세포종 또는 혼합 송과체종/송과체아세포종), 수질상피종, 수질아세포종, 신경아세포종 또는 신경절아세포종, 망막아세포종 또는 상의아세포종)일 수 있다. 암은 중추신경계 신생물형성, 예컨대 안장 부위의 종양(예컨대 뇌하수체선종, 뇌하수체암종 또는 두개인두종), 조혈 종양(예컨대 원발성 악성 림프종, 형질세포종 또는 과립구육종), 생식 세포 종양(예컨대 배아세포종, 배아암종, 난황낭종양, 융모막암종, 기형종 또는 혼합 생식 세포 종양), 뇌수막종, 중간엽종양, 멜라닌세포종, 또는 뇌신경 또는 척수신경의 종양(예컨대 슈반종 또는 신경섬유종)일 수 있다. 암은 저등급 신경교종(예컨대 상의세포종, 성상세포종, 핍지교종 또는 혼합 신경교종) 또는 고등급(악성) 신경교종(예컨대 다형성신경교아종)일 수 있다. 암은 원발성 또는 전이성 뇌 종양일 수 있다.
D. 조건부 활성 폴리펩티드의 제조
모 폴리펩티드로부터 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법은, 돌연변이 DNA를 제조하기 위해, DNA 중 하전된 아미노산 잔기의 총 수를 증가시키는 것, DNA 중 비하전 아미노산 잔기의 코돈 총 수를 감소시키는 것, 그리고 이러한 것들의 조합으로부터 선택되는 기술 한 가지 이상을 이용하여 모 폴리펩티드의 순 전하가 증가하도록 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 진화시키는 단계; 이 돌연변이 DNA를 발현시켜 돌연변이 폴리펩티드를 제조하는 단계; 그리고 돌연변이 폴리펩티드와 모 폴리펩티드를 대상으로, 정상 생리학적 조건일 수 있는 제1 조건 하에서 스크리닝 검정하고, 비정상 조건일 수 있는 제2 조건 하에서 스크리닝 검정하는 단계를 포함한다. 조건부 활성 폴리펩티드는, (a) 제1 검정시 조건의 제1 값에서의 활성의, 제1 검정시 모 폴리펩티드의 동일한 활성에 비한 감소, (b) 제2 검정시 동일 조건의 제2 값에서의 동일 활성의, 제2 검정시 모 폴리펩티드의 동일한 활성에 비한 증가 둘 다를 보이는 돌연변이 폴리펩티드들로부터 선택된다. 제1 조건 또는 정상 생리학적 조건에서 조건부 활성 폴리펩티드 활성의 감소는 가역적이거나 비가역적일 수 있다.
i. 모 폴리펩티드
모 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드, 야생형 폴리펩티드로부터 유래한 돌연변이 폴리펩티드, 예컨대 치료 폴리펩티드, 상이한 야생형 폴리펩티드들로부터 유래한 키메라 폴리펩티드, 또는 심지어 합성 폴리펩티드일 수 있다. 모 폴리펩티드는 항체, 효소, 사이토카인, 조절 단백질, 호르몬, 수용체, 리간드, 바이오시밀러, 면역조정제, 성장 인자, 스트레스 단백질, 볼트 관련 단백질, 뉴런 단백질, 소화관 단백질, 성장 인자, 미토콘드리아 단백질, 세포기질 단백질, 동물 단백질, 구조 단백질, 식물 단백질 및 이러한 폴리펩티드들의 단편이다.
몇몇 구현예들에서, 모 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드의 단편, 치료 폴리펩티드의 단편 또는 항체 단편일 수 있다. 몇몇 다른 구현예들에서, 모 폴리펩티드는, 요망되는 특성, 예컨대 고 결합 활성, 고 발현 수준 또는 인간화를 보이는 폴리펩티드를 선택하는 돌연변이유발 방법에 의해 제조된 돌연변이 폴리펩티드들로부터 선택된 폴리펩티드일 수 있다. 선택된 폴리펩티드(이 경우에는 야생형 폴리펩티드가 아님)는 본원에 개시된 방법에서 진화될 모 폴리펩티드로서 사용될 수 있다.
적합한 야생형 폴리펩티드에 관한 기술과, 이 폴리펩티드를 진화시켜 조건부 활성 폴리펩티드로 제조된 것을 선택할 수 있는 방법은 미국 특허 제8,709,755호(B2)에 기술되었다.
몇몇 구현예들에서, 모 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드 또는 돌연변이 폴리펩티드의 라이브러리, 예컨대 박테리오파아지 전시 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 이러한 구현예들에서, 다수의 후보 폴리펩티드는, 특히 표면 전시 기술에 의해 박테리오파아지 라이브러리 내에서 발현된다. 라이브러리 유래 후보 폴리펩티드는 적합한 모 폴리펩티드에 대해 스크리닝된다. 통상의 박테리오파아지 라이브러리는 수천개, 또는 심지어 수백만개의 후보 폴리펩티드를 박테리아 숙주 내에서 발현시키는 박테리오파아지를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 박테리오파아지 라이브러리는 다수의 박테리오파아지를 포함할 수 있다.
박테리오파아지 라이브러리를 구성하기 위해, 통상 사상 박테리오파아지(filamentous bacteriophage), 예컨대 사상 콜라이파아지 M13은, 후보 폴리펩티드를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 박테리오파아지 피막 단백질들 중 하나의 암호화 서열에 삽입함으로써, 유전적으로 변형된다. 박테리오파아지의 피막 단백질은 추후 후보 폴리펩티드와 함께 발현되고, 이로써 후보 폴리펩티드는 박테리오파아지 입자의 표면에 전시된다. 이후 전시된 후보 폴리펩티드는 적합한 모 폴리펩티드에 대해 스크리닝될 수 있다.
적합한 모 폴리펩티드를 스크리닝하기 위한 한 가지 통상적인 기술은, 지지체상에 요망되는 후보 폴리펩티드와 함께 박테리오파아지 입자를 부동화시키는 것에 의한다. 지지체는 요망되는 후보 폴리펩티드와 결합할 수 있는 "미끼(bait)"로 코팅된 플라스틱 평판일 수 있다. 비제한적 박테리오파아지 입자는 평판으로부터 씻겨나갈 수 있다. (요망되는 후보를 가지는) 평판에 결합한 박테리오파아지 입자는 세정에 의해 용리되고, 용리된 박테리오파아지 입자는 박테리아 내에서 증식한다. 선택된 박테리오파아지 입자 내에서 후보 폴리펩티드를 암호화하는 서열(들)은 이후 서열결정에 의해 확인될 수 있다. 후보 폴리펩티드와 미끼 사이의 관계는, 예를 들어 리간드-수용체 또는 항원-항체 관계일 수 있다.
적합한 모 폴리펩티드에 대해 스크리닝하는 또 다른 통상의 기술은, 개별 박테리오파아지 클론을, 후보 폴리펩티드에 의해 발휘되는 요망 효소 활성에 대해 검정하는, 효소 검정을 이용하는 것에 의한다. 특이적 효소 활성에 따라서, 당 업자는 효소 활성을 요망되는 수준으로 보이는 모 폴리펩티드에 대해 스크리닝하기에 적당한 검정을 디자인할 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 박테리오파아지 라이브러리는 각각의 박테리오파아지 클론이 어레이(array)의 특정 자리를 점유하는 어레이로서 제공된다. 이러한 어레이는 고체 지지체, 예컨대 막, 아가 평판 또는 미세적정평판 상에 제공될 수 있으며, 여기에서 라이브러리의 각 박테리오파아지는 고체 지지체상 특정의 소정 위치에 자리잡거나 부착된다. 아가 평판의 경우, 이러한 평판은, 바람직하게 박테리아 성장 배지를 포함하여서, 박테리아의 성장을 지지해준다. 어레이가 막, 예컨대 니트로셀룰로스 또는 나일론 막 위에 제공될 때, 박테리아 배지는 이 막 위에 적용되고, 이 막은 영양 성장 배지에 담그어진다. 뿐만 아니라, 박테리오파아지 클론은 또한 비드 상에도 제공될 수 있는데, 이 경우 단일 박테리오파아지 클론은 단일 비드에 부착될 수 있다. 대안적으로 박테리오파아지 클론은 각각 광섬유의 말단에 제공될 수 있는데, 이 경우 섬유는 광원으로부터 나오는 자외 복사선과 광학적으로 소통하는데 사용된다.
통상의 박테리오파아지 라이브러리는 106개 내지 1010개 박테리오파아지를 함유할 수 있는데, 이 때 이 박테리오파아지 각각은 상이한 후보 폴리펩티드를 보유하는 피막 단백질(예컨대 M13 파아지의 경우 gp3 또는 gp8)에 의해 구별된다. 박테리오파아지 라이브러리에 대한 박테리아 숙주는, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 쉬겔라(Shigella), 리스테리아(Listeria), 캄필로박터(Campylobacter), 크렙시엘라(Klebsiella), 여시니아(Yersinia), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 에스케리치아(Escherichia) 박테리아 속으로부터 선택될수 있다.
후보 폴리펩티드를 암호화하는 올리고뉴클레오티드는 야생형 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 무리일 수 있다. 생물 시료로부터 cDNA를 합성하기 위한 방법이 공지되어 있으며, 이 방법에 의해 적합한 모 폴리펩티드가 발현될 수 있다. 전사체를 통해 생리학적 활성을 발현하는 임의의 유전 정보는 cDNA로서 획득될 수 있다. cDNA 생산시 전장 cDNA를 합성하는 것은 필수이다. 전장 cDNA를 합성하는데 사용될 수 있는 방법이 몇 가지 있다. 예를 들어 적합한 방법으로서는, 효모 또는 Hela 세포의 Cap 결합 단백질을 이용하여 5' Cap 부위를 표지화하는 방법(I. Edery et al., "An Efficient Strategy To Isolate Full-length cDNAs Based on a mRNA Cap Retention Procedure (CAPture)", Mol. Cell. Biol., vol.15, pages 3363-3371, 1995); 그리고 5' Cap 없는 불완전 cDNA의 인산염을 알칼리성 포스파타아제에 의해 제거한 후, 전체 cDNA를 담배 모자이크 바이러스의 탈캡핑 효소(de-capping enzyme)로 처리하여, 오로지 전장 cDNA만이 인산염을 가지게 하는 방법(K. Maruyama et al., "Oligo-capping: a simple method to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides", Gene, vol.138, pages 171-174, 1995 and S. Kato et al., "Construction of a human full-length cDNA bank", Gene, vol.150, pages 243-250, 1995)을 포함한다.
모 폴리펩티드가 항체인 구현예들에서, 후보 항체의 라이브러리는 유기체의 완전 항체 레파토리로부터 유래한 재조합 항체가 사용되어 제조될 수 있다. 이 레파토리를 나타내는 유전 정보는 요망되는 항원 결합 활성 및/또는 하나 이상의 기타 기능상의 특징들을 가지는 적합한 모 항체에 대해 스크리닝될 수 있는 전장 항체의 큰 무리로 조립된다. 몇몇 구현예들에서, 항원으로 면역화된 동물, 예컨대 면역화된 인간, 마우스 또는 토끼로부터 B 세포가 단리된다. 단리된 B 세포로부터 mRNA가 수집되고, 이는 cDNA로 전환된 후, 서열결정된다. 가장 빈번히 출현하는 cDNA 단편으로서, 경쇄를 암호화하는 cDNA 단편과, 가장 빈번히 출현하는 cDNA 단편으로서, 중쇄를 암호화하는 cDNA 단편이 조립되어 항체가 된다. 일 구현예에서, 가장 빈번히 출현하는 cDNA 단편으로서, 경쇄를 암호화하는 cDNA 단편 100개와, 가장 빈번히 출현하는 cDNA 단편으로서, 중쇄를 암호화하는 cDNA 단편 100개는 조립되어 후보 항체로 제조된다. 다른 구현예에서, 가장 빈번히 출현하는 cDNA 단편은 오로지 중쇄의 가변 영역과, 경쇄의 가변 영역만을 암호화하고, 이것들은 조립되어 항체 단편으로 제조되며, 이때의 항체 단편은 오로지 가변 영역만을 함유하고, 불변 영역은 함유하지 않게 된다.
몇몇 구현예들에서, IgG 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 cDNA 단편은 IgK 또는 IgK 경쇄의 가장 빈번히 출현하는 가변 영역과 조립된다. 조립된 항체는 IgG 유래 중쇄 가변 영역과, IgK 또는 IgK 유래 경쇄 가변 영역을 함유하게 된다.
이후, 조립된 항체를 암호화하는 cDNA는, 바람직하게 평판 기반 포맷으로 클로닝 및 발현된다. 발현된 항체의 결합 활성은 비드 기반 ELISA 검정으로 검정될 수 있고, 적합한 모 항체는 ELISA 검정을 기반으로 선택될 수 있다. 조립된 항체를 암호화하는 cDNA는 또한 박테리오파아지 전시 라이브러리 내에서 발현될 수 있는데, 이는 추후 본원에 개시된 기술들 중 임의의 하나에 의하여, 요망되는 모 항체 하나 이상에 대해 스크리닝될 수 있다.
모 폴리펩티드가 항체인 구현예들에서, 모 항체는, 바람직하게 모 항체를 조건부 활성 항체로 훨씬 용이하게 진화시키는 특정한 특징을 적어도 하나 가진다. 임의의 구현예들에서, 모 항체는 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에서 유사한 결합 활성 및/또는 특징을 가질 수 있다. 이러한 구현예들에서, 모 항체는 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에서의 가장 유사한 결합 활성 및/또는 하나 이상의 특징의 가장 유사한 조합을 기반으로 선택된다. 예를 들어 만일 정상 생리학적 조건과 비정상 조건이 각각 pH 7.4 및 pH 6.0이라면, pH 7.4 및 pH 6.0에서 덜 유사한 결합 활성을 가지는 항체에 비해 pH 7.4 및 pH 6.0에서 가장 유사한 결합 활성을 가지는 모 항체가 선택될 수 있다.
ii. 모 폴리펩티드의 진화
몇몇 양태들에서, 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기를 모 폴리펩티드에 도입시키는 부위 유도성 돌연변이유발 기술 한 가지 이상이 사용되어 돌연변이된다. 일 양태에서, 하전된 아미노산 잔기는 모 폴리펩티드 내 임의의 자리에 도입될 수 있다. 다른 양태에서, 하전된 아미노산 잔기는 모 폴리펩티드의 활성 부위에 도입된다. 활성 부위는 모 폴리펩티드의 특정한 특성 발휘에 관여하는, 모 폴리펩티드 내 영역이다. 특성은 효소-기질 특이성, 효소 생성물 선택성, 단백질 분비 특성, 리간드 선택성, 리간드 결합 활성, 단백질 안정성 및 항체 결합 활성일 수 있다. 활성 부위의 예들로서는, 효소의 촉매 부위, 리간드 또는 수용체의 결합 부위, 항체의 상보성 결정 영역, 그리고 항원의 에피토프를 포함한다.
일 양태에서, 하전된 아미노산 잔기는 모 항체 가변 영역 또는 모 항체의 상보성 결정 영역 2개 이상에 도입된다. 다른 양태에서, 하전된 아미노산 잔기는 리간드, 수용체 또는 호르몬과의 결합에 수반되는, 모 폴리펩티드의 영역 2개 이상에 도입된다. 또 다른 양태에서, 하전된 아미노산 잔기는 촉매 활성, 예컨대 효소의 촉매 포켓을 형성하는 활성에 수반되는 모 폴리펩티드의 영역 2개 이상에 도입된다.
다른 양태에서, 하전된 아미노산 잔기는 모 폴리펩티드의 활성 부위 외부 영역에 도입될 수 있다. 예를 들어 이러한 영역은 활성 부위 다음에 있을 수 있거나, 이를 둘러싸고 있을 수 있거나, 또는 심지어 이로부터 멀리 떨어져 있을 수 있다. 일 양태에서, 이 영역은 항체의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역이다. 이 영역은 또한 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 구조틀 영역일 수도 있다.
하나 이상의 하전된 아미노산 잔기를 모 폴리펩티드에 도입하기 위하여, 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는, DNA 내 코돈들을 하전된 아미노산의 코돈들로 치환하거나, 또는 하전된 아미노산의 코돈들을 DNA에 삽입하거나 둘 중 어느 하나에 의해 돌연변이되고, 그 결과 발현될 때 돌연변이 폴리펩티드를 생산할 수 있는 돌연변이 DNA가 제조된다. 하전된 아미노산 잔기의 코돈의 치환 또는 삽입은 본원에 기술된 부위 유도성 돌연변이유발 기술 한 가지 이상을 사용하여 달성될 수 있다.
하전된 아미노산 잔기의 코돈으로서, 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 도입된 코돈이 표 2에 보인다.
[표 2]
일 양태에서, 돌연변이 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비하여 6개 미만의 돌연변이, 또는 5개 미만의 돌연변이, 또는 4개 미만의 돌연변이, 또는 3개 미만의 돌연변이, 또는 2개 미만의 돌연변이를 가진다. 이러한 돌연변이 수는 요망되는 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하기 충분할 수 있다.
몇몇 양태들에서, 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 비하전 아미노산 잔기의 코돈 하나 이상을 결실시키는 부위 유도성 돌연변이유발 기술 한 가지 이상을 사용하여 돌연변이된다. 모 폴리펩티드 내 비하전 아미노산 잔기 하나 이상의 결실은 모 폴리펩티드의 순 전하를 증가시킨다.
다른 양태에서, 모 폴리펩티드는 하전된 아미노산 잔기가 없거나 아주 극소수 존재하는 영역을 결실시켜 돌연변이될 수 있고, 이로써 돌연변이된 폴리펩티드의 순 전하는 모 폴리펩티드의 순 전하에 비하여 증가하게 된다. 예를 들어 전장 항체는 하전된 아미노산 잔기가 없거나 아주 극소수 존재하는 불변 영역을 가질 수 있다. 불변 영역을 결실시키고, 항체의 가변 영역 2개를 연결시켜 단일 사슬 항체를 만들면, 모 폴리펩티드의 순 전하에 비한 돌연변이 단일 사슬 항체의 순 전하의 증가도 또한 초래될 수 있다. 일례에서, 전장 항체는 IgG 항체이고, 이는 순 전하가 증가한 단일 사슬 항체로 전환된다.
몇몇 양태들에서, 임의의 부위 유도성 돌연변이유발 기술, 예컨대 미국 특허 제6,391,548호, 동 제7,132,265호 및 동 제6,713,285호에 기술된 기술이 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 돌연변이시키는데 사용될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 사용될 수 있는 부위 유도성 돌연변이유발 기술로서는 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법 및 카세트 돌연변이유발법을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이유발법은 코돈 하나 이상을, 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에서 치환 또는 이 DNA에 삽입하기에 적합한 방법이다. 이 기술은 이전에 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, second edition, chapter 15.51, "Oligonucleotide-mediated mutagenesis.")에 기술된 바 있다. 요약하면, DNA는 요망 돌연변이(들)를 운반하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 단일 가닥 형태로 환원된 DNA에 잡종화함으로써 변경된다. 잡종화 후 DNA의 제2 상보성 가닥 전체를 합성하기 위해 DNA 중합효소가 사용되고, 이를 통하여 올리고뉴클레오티드 프라이머가 통합되어 요망 돌연변이(들)를 함유하는 생성물이 제조될 것이다.
일반적으로 길이가 적어도 25개 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 선택적 올리고뉴클레오티드는 돌연변이(들)의 어느 한 쪽에 있는 주형에 완전히 상보성인 뉴클레오티드 12개 내지 15개를 가질 것이다. 이 점은, 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA에 적절하게 잡종화될 것을 보장한다. 올리고뉴클레오티드는 당 분야에 공지된 기술, 예컨대 문헌(Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765, 1978)에 기술된 기술을 사용하여 용이하게 합성된다.
일 양태에서, 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 환형 DNA 분자, 예컨대 플라스미드 또는 코스미드 내에 존재한다. 올리고뉴클레오티드는 적합한 잡종화 조건 하에서 단일 가닥 환형 DNA 분자에 잡종화된다. 이후, DNA 중합효소, 보통은 DNA 중합효소 I의 Klenow 단편이 첨가되고, 합성용 프라이머로서 올리고뉴클레오티드가 사용되어 단일 가닥 환형 DNA 분자의 상보성 가닥이 합성된다. 이에 따라 이종이중체 분자가 생성되는데, 이 경우 DNA의 한 가닥은 돌연변이(들)를 가지고, 또 다른 가닥(원래 가닥)은 돌연변이(들)를 가지지 않는다. 그 다음, 이 이종이중체 분자는 적합한 숙주 세포, 보통은 원핵생물, 예컨대 이. 콜라이 JM101에 도입되어 이 숙주 세포를 형질전환시킨다. 세포가 성장하면, 이 세포는 아가로스 평판상에 도말되고, 32-인산염으로 방사능 표지화된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되어 스크리닝되며, 그 결과 돌연변이된 DNA를 함유하는 박테리아 콜로니가 동정된다. 돌연변이된 DNA는 이후 분리되고, 적당한 발현 벡터 내에 도입됨으로써 단백질 생산이 도모된다.
이 절차는, 플라스미드 가닥 둘 다가 돌연변이(들)를 함유하는 동종이중체 분자가 제조되도록 수정될 수 있다. 수정은 다음과 같다: 올리고뉴클레오티드 프라미머는 전술된 바와 같은 단일 가닥 환형 DNA 분자에 어닐링(annealing)된다. 3가지의 데옥시리보뉴클레오티드, 즉 데옥시리보아데노신(dATP), 데옥시리보구아노신(dGTP) 및 데옥시리보티미딘(dTTP)의 혼합물은 변형된 티오-데옥시리보시토신(dCTP-(aS)라 지칭됨)과 합하여진다. 이 혼합물은 단일 가닥 환형 DNA 분자-올리고뉴클레오티드 잡종화 복합체에 첨가된다. DNA 중합효소가 이 혼합물에 첨가되면, 돌연변이(들)가 발생한 점을 제외하고는 단일 가닥 환형 DNA 분자와 동일한 DNA 가닥이 생성된다. 뿐만 아니라, 이 DNA 신규 가닥은 dCTP 대신에 dCTP-(aS)를 함유할 것인데, 이 dCTP-(aS)는 신규 DNA 가닥을 제한 엔도뉴클레아제 분해로부터 보호한다. 적당한 제한 효소에 의해 이종이중체에 닉(nick)이 생성된 후, 이종이중체 내 단일 가닥 환형 DNA 분자는 돌연변이될 부위(들)를 함유하는 영역을 지나친 곳에서 ExoIII 뉴클레아제 또는 또 다른 적당한 뉴클레아제로 분해될 수 있다. 이후, 반응이 중단되고, 오로지 부분적으로만 단일 가닥인 DNA 분자가 제조된다. 그 다음에는 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산염 4가지 모두, ATP 및 DNA 리가아제의 존재 하에 DNA 중합효소가 사용됨으로써, 전체가 이중 가닥인 DNA 동종이중체가 형성된다. 이후, 이러한 동종이중체 분자는 전술된 바와 같이 적합한 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 JM101에 도입되어, 이 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다.
2개 이상의 돌연변이를, 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 도입(삽입 및/또는 치환)하는 것은 몇 가지 방법들 중 한 가지에서 달성될 수 있다. 만일 돌연변이될 자리들이 DNA 분자 내에서 서로 가까이 인접하게 되면, 이 자리들은 요망되는 돌연변이를 모두 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 하나가 사용되어 동시에 돌연변이될 수 있다. 그러나 만일 돌연변이될 자리들이 서로 간에 어느 정도 거리를 두고 존재하면(예컨대 약 25개 초과하는 만큼의 뉴클레오티드에 의해 떨어져 있으면), 요망되는 돌연변이를 모두 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머 하나를 제조하는 것은 더욱 어렵다. 그 대신 2가지 대안적 방법들 중 한 가지가 이용될 수 있다.
일 대안에 있어서, 별도의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 각각의 돌연변이를 위해 사용된다. 그 다음, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 단일 가닥 환형 DNA 분자에 동시에 어닐링되고, 별도 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 합성된 DNA의 제2의 상보성 가닥은 요망되는 돌연변이 전부를 함유할 것이다.
또 다른 대안은, 모든 돌연변이를 가지는 요망 DNA를 제조하기 위해 부위 유도성 돌연변이유발의 라운드를 2회 이상 수반한다. 제1 라운드는 단일 돌연변이에 대해 기술된 바와 같은데: 요망되는 제1 돌연변이를 가지는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이종이중체 DNA 분자를 제조하는데 사용된다. 돌연변이유발법의 제2 라운드는 제1 라운드에서 제조된 이종이중체 DNA 분자를 주형(하나의 돌연변이를 이미 함유함)으로서 이용한다. 그 다음, 추가 돌연변이를 암호화하는 제2 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이 주형에 어닐링되고, 그 결과 돌연변이유발법의 제1 라운드와 제2 라운드 둘 다로부터 얻어진 돌연변이들을 함유하는 제2 DNA 분자가 생성된다. 원한다면 제2 DNA 분자는 돌연변이유발법의 제3 라운드에서 주형으로 사용될 수 있는 식이다.
적합한 부위 유도성 돌연변이유발 방법의 또 다른 방법으로서는 PCR 돌연변이유발법이 있는데, 이 방법은 모 폴리펩티드에 삽입 및/또는 치환 돌연변이를 발생시키기 위해 사용될 수 있다. PCR은 주기적 증폭 기술로서, 부위 유도성 돌연변이유발법에서 널리 채택되고 있으며, 여기에서는 요망되는 돌연변이를 도입하는데 돌여변이유발성 프라이머가 사용된다[문헌(Allemandou et al., J Biomed. Biotechnol. S, 202-207, (2003); An et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. S 68, 774-778, (2005); Jeltsch et al., Methods MoI. Biol. S 182, 85-94 (2002); Hall, et al. Protein Eng.4:601 (1991); Hemsley, et al. Nucleic Acids Research 17:6545-6551 (1989); Ho, et al. Gene 77:51-59 (1989); Hultman, et al. Nucleic Acids Research 18:5107-5112 (1990); Jones, et al. Nature 344:793-794 (1990); Jones, et al. Biotechniques 12:528-533 (1992); Landt, et al. Gene 96:125-128 (1990); Nassal, et al. Nucleic Acids Research 18:3077-3078 (1990); Nelson, et al. Analytical Biochemistry 180:147-151 (1989); Vallette, et al. Nucleic Acids Research 17:723-733 (1989); Watkins, et al. Biotechniques 15:700-704 (1993); Weiner, et al. Gene 126:35-41 (1993); and Yao, et al. PCR Methods and Applications 1:205-207 (1992)) 참조].
구체적으로 PCR에서 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 소량이 주형 DNA로서 사용된다. 돌연변이유발성 프라이머는 서열에 있어서 이와 대응하는 주형 DNA 영역, 즉 주형 DNA와 돌연변이유발성 프라이머간에 차이를 보이는 위치에만 요망 돌연변이가 발생한 특이 DNA 단편을 비교적 다량으로 제조하기 위한 주형 DNA 내 영역과 약간 상이하다. 돌연변이를 환형 DNA에 도입하기 위해, 프라이머들 중 하나는 돌연변이위 위치와 중첩되고, 돌연변이를 함유하도록 디자인되고; 또 다른 프라이머의 서열은 환형 DNA의 반대 가닥 서열 확장부와 동일할 수 있지만, 이 서열은 환형 DNA를 따라서 어느 곳에든 위치하게될 수 있다. 그러나, 제2 프라이머의 서열은 제1 프라이머의 서열로부터 200개 뉴클레오티드 이내에 위치하므로, 마침내 프라이머가 결합한 DNA의 전체 증폭 영역은 돌연변이(들)의 확인을 위해 용이하게 서열결정될 수 있게 된다. 프라이머 쌍을 이용하는 PCR 증폭은 돌연변이유발성 프라이머 내 돌연변이 위치가 상이한 DNA 단편을 만들어낸다.
별도 위치들에서의 돌연변이들은, 제2 돌연변이유발성 프라이머가 사용되거나, 또는 상이한 돌연변이유발성 프라이머가 사용되는 PCR의 제2 라운드를 진행하고, 이때 생성된 PCR 단편 2개를 3 단계(또는 이 이상의 단계) 결찰 방식으로 벡터에 동시 결찰시킴으로써, 동시에 도입될 수 있다.
PCR 돌연변이유발법의 구체적 예에 있어서, 주형 플라스미드 DNA(1 μg)는, 플라스미드 DNA 내 증폭될 영역 외부에 독특한 인지 부위를 가지는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해에 의해 선형화된다. 이러한 물질 100 ng만큼이, 4가지 데옥시뉴클레오티드 삼인산염을 함유하는 PCR 완충제 함유 PCR 혼합물에 첨가되고, 종국에는 GeneAmp® 키트(Perkin-Elmer Cetus(Norwalk, Conn. and Emeryville, Calif.)에서 입수)에 담기게 되며, 또한 각 올리고뉴클레오티드 프라이머도 25 pmole씩 담기게 되어, 최종 부피는 50 μl가 된다. 반응 혼합물은 미네랄 오일 35 μl로 덮인다. 반응물은 100℃에서 5분 동안 변성된 후, 간편하게 얼음 위에 방치된 다음, 서무스 아쿠아티쿠스(Taq) DNA 중합효소(5 유닛/μl, Perkin-Elmer Cetus(Norwalk, Conn. and Emeryville, Calif.)로부터 구입) 1 μl가 미네랄 오일 층 밑에 첨가된다. 그 다음, 반응 혼합물은 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Cetus로부터 구입)(55℃에서 2분, 72℃에서 30초 동안 진행되도록 프로그래밍)에 넣어지고, 이후에는 다음과 같은 주기, 즉 94℃에서 30초 → 55℃에서 30초 → 72℃에서 30초의 주기가 19회 진행된다. 이 과정의 막바지에 반응 바이알은 Thermal Cycler로부터 꺼내어지고, 수성 상은 새 바이알에 옮겨담아진 다음, 페놀/클로로포름(50:50:vol.)에 의한 추출과 에탄올 침전이 이루어지고 나면, DNA는 표준 절차에 의해 회수된다. 추후 이 물질에는 벡터에의 삽입을 위한 적당한 처리가 행하여진다.
카세트 돌연변이유발법은 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 삽입 및/또는 치환을 도입하는데 사용될 수 있는, 또 다른 부위 유도성 돌연변이유발 기술이다. 이 기술은 문헌[Wells et al. (Gene, 34:315, (1985))]에 기술되어 있다. 돌연변이(들)가 발생한 쪽 각각에 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 존재하여야 한다. 만일 이러한 제한 부위가 존재하지 않는다면, 돌연변이는, 이 돌연변이를 DNA 내 적당한 자리에 도입하기 위한 기술로서, 전술된 올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이유발 기술이 사용되어 발생될 수 있다. 모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 이러한 제한 부위들에서 절단된다. 제한 부위들 사이의 DNA 서열과 동일한 서열을 가지되, 요망 돌연변이(들)를 함유하는, 별도의 이중 가닥 DNA 단편은 표준 화학 합성 절차가 사용되어 합성된다. 이처럼 합성된 DNA 단편으로서, 돌연변이(들)를 함유하는 DNA 단편은 카세트라 지칭된다. 이 카세트는 제한 엔도뉴클레아제 처리된 DNA의 말단과 양립 가능한 3'말단 및 5'말단을 가지도록 디자인되므로, 제한 엔도뉴클레아제 처리된 DNA에 직접 결찰될 수 있다. 이로써 결찰된 DNA는 요망 돌연변이들을 함유하게 된다.
모 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 한 가지 이상의 부위 유도성 돌연변이유발 기술이 사용되어 돌연변이될 때, 하전된 아미노산 잔기의 코돈 하나 이상이 도입된다. 이로써 생성된 돌연변이 DNA는 도입된 코돈에 대응하는 하전 아미노산 잔기들을 가지는 돌연변이 폴리펩티드를 암호화하게 된다. 결과적으로 돌연변이 폴리펩티드의 하전 아미노산 잔기 총 수는 모 폴리펩티드의 하전 아미노산 잔기 총 수에 비하여 증가할 수 있다.
iii. 돌연변이 폴리펩티드의 발현
한 가지 이상의 부위 유도성 돌연변이유발 기술이 사용되어 돌연변이 DNA들이 생성된 후, 이 돌연변이 DNA는 발현되어 돌연변이 폴리펩티드를 생산하게된다. 돌연변이 DNA를 발현시켜 돌연변이 폴리펩티드를 생산하는데 적합한 방법은 미국 특허 제8,709,755호(B2)에 기술되어 있다.
일 양태에서, 돌연변이 DNA는 조건부 활성 폴리펩티드의 효율적 스크리닝을 도모하기 위해 펩티드 전시 방법이 사용되어 발현될 수 있다. 이러한 방법들은 PCT 특허출원공보 WO 91/17271, WO 91/18980, WO 91/19818 및 WO 93/08278에 추가로 기술되어 있다.
WO 93/08278에는, 융합 단백질 라이브러리 생산을 수반하는, 펩티드 리간드 전시를 위한 재조합 DNA 방법이 기술되어 있는데, 다만 여기서 각각의 융합 단백질은, 통상 거대분자와의 잠재적 결합을 위해 이용 가능한 가변 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 부와, DNA, 예컨대 개별 융합 단백질을 암호화하는 DNA 벡터와 결합하는 제2 폴리펩티드 부로 이루어져 있다. 형질전환된 숙주 세포가, 융합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양될 때, 이 융합 단백질은 이를 암호화하는 DNA 벡터와 결합한다. 숙주 세포가 용해될 때, 융합 단백질/벡터 DNA 복합체는, 파아지 기반 전시 계에서 박테리오파아지 입자가 스크리닝되는 방법과 동일한 방법으로, 부동화된 거대분자에 대해 스크리닝될 수 있는데, 다만 이 경우 선택된 융합 단백질/벡터 DNA 복합체 내 DNA 벡터의 복제 및 서열결정은 선택된 폴리펩티드 서열(들) 동정의 기반으로서 사용된다.
펩티드 전시 방법은, 단일 사슬 항체(예컨대 폴리좀 상 신생 scFv 또는 파아지 상 전시된 scFv)를, 시험관 내 및 생체 내 전시하기 위한 방법들로서, 가변 영역 서열들의 광범위한 다양성과 결합 특이성을 가지는 scFv 라이브러리의 대규모 스크리닝을 가능하게 하는 방법들을 포함한다.
돌연변이 폴리펩티드를 발현하는 또 다른 방법은, 돌연변이 폴리펩티드의 시험관 내 합성을 달성하기 위해 무세포 효소 기구를 사용한다. 일반적으로 안정화된 폴리좀 복합체를 포함하는, 시험관 내 번역에 의존하는 이와 같은 방법들은 PCT 특허출원공보 WO 88/08453, WO 90/05785, WO 90/07003, WO 91/02076, WO 91/05058 및 WO 92/02536에 추가로 기술되어 있다.
친화성 증진 방법은, 돌연변이 폴리펩티드의 매우 큰 라이브러리가 스크리닝되는 것과, 요망되는 폴리펩티드(들)를 암호화하는 돌연변이 DNA가 선택되는 것을 허용한다. 이후, 돌연변이 DNA는 단리 및 셔플링(shuffling)되며, 그 결과 선택된 폴리펩티드(들)(또는 이의 소정 부분들) 또는 단일 사슬 항체(또는 단지 이의 VH, VL 또는 CDR 부분들)의 아미노산 서열들은 섞여 재조합된다. 이러한 방법이 사용되면, 돌연변이 폴리펩티드 또는 단일 사슬 항체가 어떤 분자에 대하여 요망되는만큼의 결합 친화성을 가짐이 확인될 수 있으며, 셔플링 방법이 이용되어 요망되는만큼의 고 친화성 돌연변이 폴리펩티드 또는 scFv를 신속하게 모을 수 있다.
iv. 조건부 활성 폴리펩티드의 스크리닝
조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위해 돌연변이 폴리펩티드를 스크리닝하는 방법은 미국 특허 제8,709,755호(B2)에 기술되어 있는데, 여기에 기술된 방법은 본원에 참조로 인용되어 있다.
v. 조건부 활성 폴리펩티드의 스크리닝 및 선택을 위한 검정 조건들
스크리닝 단계에 사용되는 검정을 위한 제1 조건과 제2 조건, 또는 정상 생리학적 조건과 비정상 조건은, 온도, pH, 삼투압, 삼투질농도, 산화 스트레스, 전해질 농도, 단백질 농도, 그리고 이러한 조건 2가지 이상의 조합으로부터 선택되는 조건이 이용되어 조성될 수 있다. 예를 들어 온도에 관한 정상 생리학적 조건은 정상 인간 체온인 37.0℃인 한편, 온도에 관한 비정상 조건은 온도 37.0℃와는 상이한 온도, 예컨대 정상 생리학적 온도보다 1℃ 내지 2℃ 더 높을 수 있는 종양 미세환경 온도일 수 있다. 또 다른 예에서, 정상 생리학적 조건과 비정상 조건은 또한 7.2 ~ 7.8 또는 7.2 ~ 7.6의 범위의 pH(정상 생리학적 pH) 및 종양 미세환경에 조성되는 5.5 ~ 7.2, 6 ~ 7 또는 6.2 ~ 6.8의 범위의 pH(비정상 pH)일 수 있다.
제1 조건과 제2 조건 둘 다, 또는 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에서의 검정은 검정 매질 중에서 수행될 수 있다. 검정 매질은, 예를 들어 완충제뿐만 아니라 다른 성분들을 함유할 수 있는 용액일 수 있다. 검정 매질에 사용될 수 있는 통상의 완충제로서는 시트르산염 완충제, 예컨대 시트르산나트륨, 인산염 완충제, 중탄산염 완충제, 예컨대 크렙스 완충제, 인산염 완충 염수(PBS) 완충제, Hank 완충제, Tris 완충제, HEPES 완충제 등을 포함한다. 기타 당 업자에게 공지된 완충제로서 검정에 적합한 완충제가 사용될 수 있다. 이러한 완충제는 인간이나 동물의 체액, 예컨대 혈장 또는 림프액 조성물의 성분 또는 이의 특징을 모의하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 검정 용액은 무기 화합물, 이온 및 유기 분자 바람직하게는 포유동물, 예컨대 인간이나 동물의 체액에서 보통 발견되는 것들로부터 선택되는 성분 적어도 하나를 함유할 수 있다. 이러한 성분의 예들로서는 영양 성분 및 대사산물뿐만 아니라, 체액에서 발견될 수 있는 기타 임의의 성분들을 포함한다. 본 발명은 이 성분이 완충제 계의 일부일 수 있거나 일부일 수 없음을 고려한다. 예를 들어 검정 용액은 중탄산염이 PBS 완충제의 일부가 아닌, 중탄산염 이온이 부가된 PBS 완충제일 수 있다. 대안적으로 중탄산염 이온은 크렙스 완충제의 한 성분이다.
성분은 두 검정 용액(제1 조건용 및 제2 조건용 검정 용액) 중에 실질적으로 동일한 농도로 존재할 수 있는 반면에, 이들 검정 용액 2개는 다른 양태 예컨대 pH, 온도, 전해질 농도 또는 삼투압에 있어서 차이가 난다. 그러므로 성분은, 제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건과 같이 2가지 조건 사이에 차이를 보이며 사용되기 보다는 이들 사이에 일정하게 유지되며 사용된다.
몇몇 구현예들에서, 성분은 포유동물, 특히 인간내 해당 성분의 정상 생리학적 농도와 동일하거나 이에 가까운 농도로 두 검정 용액 중에 존재한다.
무기 화합물 또는 이온은 붕산, 염화칼슘, 질산칼슘, 인산이암모늄, 황산마그네슘, 인산 모노암모늄, 인산 모노칼륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 황산구리, 황산철, 황산망간, 황산아연, 황산마그네슘, 질산칼슘, 칼슘, 구리, 철, 망간 및 아연의 킬레이트, 몰리브덴암모늄, 황산암모늄, 탄산칼슘, 인산마그네슘, 중탄산칼륨, 질산칼륨, 염화수소산, 이산화탄소, 황산, 인산, 탄산, 요산, 염화수소, 우레아, 인 이온, 황 이온, 염화물 이온, 마그네슘 이온, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 암모늄 이온, 철 이온, 아연 이온 및 구리 이온 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
무기 화합물 중 몇몇의 정상 생리학적 농도의 예로서는, 요산은 2 mg/dL ~ 7.0 mg/dL의 농도 범위, 칼슘 이온은 8.2 mg/dL ~ 11.6 mg/dL의 농도 범위, 염화물 이온은 355 mg/dL ~ 381 mg/dL의 농도 범위, 철 이온은 0.028 mg/dL ~ 0.210 mg/dL의 농도 범위, 칼륨 이온은 12.1 mg/dL ~ 25.4 mg/dL의 농도 범위, 나트륨 이온은 300 mg/dL ~ 330 mg/dL의 농도 범위, 탄산은 15 mg/dL ~ 30 mg/dL의 농도 범위, 시트르산염 이온은 약 80 μM, 히스티딘 이온은 0.05 mM ~ 2.6 mM의 범위, 히스타민은 0.3 μM ~ 1 μM의 범위, HAPT 이온(수소화 아데노신 삼인산염)은 1 μM ~ 20 μM, 그리고 HADP 이온은 1 μM ~ 20 μM을 포함한다.
몇몇 구현예들에서, 제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 이온은, 수산화물 이온, 할로겐화물 이온(염화물, 브롬화물, 요오드화물 이온), 할로겐산화물 이온, 황산염 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 중황산염 이온, 탄산염 이온, 중탄산염 이온, 설폰산염 이온, 할로겐산화물 이온, 질산염 이온, 아질산염 이온, 인산염 이온, 인산수소 이온, 인산이수소 이온, 과황산염 이온, 모노과황산염 이온, 붕산염 이온, 암모늄 이온 또는 유기 이온, 예컨대 카르복실산염 이온, 페놀산염 이온, 설폰산염 이온(유기황산염, 예컨대 황산메틸), 바나듐산염 이온, 텅스텐산염 이온, 붕산염 이온, 유기보론산염 이온, 시트르산염 이온, 옥살산염 이온, 아세트산염 이온, 오붕산염 이온, 히스티딘 이온 및 페놀산염 이온으로부터 선택된다.
제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은, 예를 들어 아미노산, 예컨대 히스티딘, 알라닌, 이소루신, 아르기닌, 루신, 아스파라긴, 리신, 아스파르트산, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글리신, 발린, 피롤리신, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 티로신 및 이것들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
아미노산들 중 일부의 정상 생리학적 농도의 예들로서는, 알라닌 3.97 mg/dL ± 0.70 mg/dL, 아르기닌 2.34 mg/dL ± 0.62 mg/dL, 글루탐산 3.41 mg/dL ± 1.39 mg/dL, 글루타민 5.78 mg/dL ± 1.55 mg/dL, 글리신 1.77 mg/dL ± 0.26 mg/dL, 히스티딘 1.42 mg/dL ± 0.18 mg/dL, 이소루신 1.60 mg/dL ± 0.31 mg/dL, 루신 1.91 mg/dL ± 0.34 mg/dL, 리신 2.95 mg/dL ± 0.42 mg/dL, 메티오닌 0.85 mg/dL ± 0.46 mg/dL, 페닐알라닌 1.38 mg/dL ± 0.32 mg/dL, 트레오닌 2.02 mg/dL ± 6.45 mg/dL, 트립토판 1.08 mg/dL ± 0.21 mg/dL, 티로신 1.48 mg/dL ± 0.37 mg/dL 및 발린 2.83 mg/dL ± 0.34 mg/dL을 포함한다.
제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 비 단백질 질소 함유 화합물, 예컨대 크레아틴, 크레아티닌, 구아니디노 아세트산, 요산, 알란토인, 아데노신, 우레아, 암모니아 및 콜린으로부터 선택될 수 있다. 이러한 화합물들 중 몇몇의 정상 생리학적 농도의 예로서는, 크레아틴 1.07 mg/dL ± 0.76 mg/dL, 크레아티닌 0.9 mg/dL 내지 1.65 mg/dL, 구아니디노 아세트산 0.26 mg/dL ± 0.24 mg/dL, 요산 4.0 mg/dL ± 2.9 mg/dL, 알란토인 0.3 mg/dL 내지 0.6 mg/dL, 아데노신 1.09 mg/dL ± 0.385 mg/dL, 우레아 27.1 mg/dL ± 4.5 mg/dL 및 콜린 0.3 mg/dL 내지 1.5 mg/dL을 포함한다.
제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 유기산, 예컨대 시트르산, α-케토글루타르산, 숙신산, 말산, 푸마르산, 아세토아세트산, β-하이드록시부티르산, 젖산, 피루브산, α-케톤산, 아세트산 및 휘발성 지방산으로부터 선택될 수 있다. 이러한 유기산들 중 몇몇의 정상 생리학적 농도의 예로서는, 시트르산 2.5 mg/dL ± 1.9 mg/dL, α-케토글루타르산 0.8 mg/dL, 숙신산 0.5 mg/dL, 말산 0.46 mg/dL ±0.24 mg/dL, 아세토아세트산 0.8 mg/dL 내지 2.8 mg/dL, β-하이드록시부티르산 0.5 mg/dL ± 0.3 mg/dL, 젖산 8 mg/dL 내지 17 mg/dL, 피루브산 1.0 mg/dL ±0.77 mg/dL, α-케톤산 0.6 mg/dL 내지 2.1 mg/dL, 휘발성 지방산 1.8 mg/dL을 포함한다.
제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 당(탄수화물), 예컨대 글루코스, 펜토스, 헥소스, 자일로스, 리보스, 만노스 및 갈락토스뿐만 아니라, 이당체, 예컨대 락토스, GlcNAcβ1-3Gal, Galα1-4Gal, Manα1-2Man, GalNAcβ1-3Gal 및 O-, N-, C- 또는 S-글리코시드로부터 선택될 수 있다. 이러한 당들 중 몇몇의 정상 생리학적 농도의 예로서는, 글루코스 83 mg/dL ± 4 mg/dL, 다당체 102 mg/dL ± 73 mg/dL(헥소스로서), 글루코사민 77 mg/dL ± 63 mg/dL, 헥수론산염 0.4 mg/dL 내지 1.4 mg/dL(글루쿠론산으로서) 및 펜토스 2.55 mg/dL ± 0.37 mg/dL를 포함한다.
제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 지방 및 이의 유도체, 예컨대 콜레스테롤, 레시틴, 세팔린, 스핑고미엘린 및 담즙산으로부터 선택될 수 있다. 이러한 화합물들 중 몇몇의 정상 생리학적 농도의 예로서는, 유리 콜레스테롤 40 mg/dL 내지 70 mg/dL, 레시틴 100 mg/dL 내지 200 mg/dL, 세팔린 0 mg/dL 내지 30 mg/dL, 스핑고미엘린 10 mg/dL 내지 30 mg/dL 및 담즙산 0.2 mg/dL 내지 0.3 mg/dL(콜산으로서)를 포함한다.
제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 단백질, 예컨대 피브리노겐, 항혈우병 글로불린, 면역 γ-글로불린, 면역 유글로불린, 동종응집소, β-슈도글로불린, 당단백, 지단백 및 알부민으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 포유동물 혈청 알부민의 정상 생리학적 농도는 3.5 g/dL ~ 5.0 g/dL이다. 일 구현예에서, 알부민은 소 혈청 알부민이다.
몇몇 양태들에서, 검정 용액은 혈액 단백질, 예컨대 대상체의 혈액에서 발견되는 혈액 단백질을 포함할 수 있다. 당 업자는 특정 대상체의 혈액 시료로부터 적합한 혈액 단백질을 확인할 수 있다. 예를 들어 적합한 인간 혈액 단백질은 알부민과 헤모글로빈을 포함할 수 있다.
제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액 중에 존재하는 유기 화합물은 비타민, 예컨대 비타민 A, 카로틴, 비타민 E, 아스코르브산, 티아민, 이노시톨, 엽산, 비오틴, 판토텐산, 리보플라빈으로부터 선택될 수 있다. 이러한 비타민들 중 몇몇의 정상 생리학적 농도의 예로서는, 비타민 A 0.019 mg/dL 내지 0.036 mg/dL, 비타민 E 0.90 mg/dL 내지 1.59 mg/dL, 이노시톨 0.42 mg/dL 내지 0.76 mg/dL, 엽산 0.00162 mg/dL 내지 0.00195 mg/dL 및 비오틴 0.00095 mg/dL 내지 0.00166 mg/dL를 포함한다.
(제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건에서의 검정 둘 다를 위한) 검정 용액 중 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 농도는, 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 인간 또는 동물 혈액 혈청 중 생리학적 농도의 정상 범위에 있을 수 있다. 그러나 정상 생리학적 범위에 속하지 않는 농도들도 적용될 수 있다. 예를 들어 인간 혈청 중 마그네슘 이온의 정상 범위는 1.7 mg/dL ~ 2.2 mg/dL이고, 칼슘의 정상 범위는 8.5 mg/dL ~ 10.2 mg/dL이다. 검정 용액 중 마그네슘 이온의 농도는 약 0.17 mg/dL 내지 약 11 mg/dL일 수 있다. 검정 용액 중 칼슘 이온의 농도는 약 0.85 mg/dL 내지 약 51 mg/dL일 수 있다. 일반적인 규칙으로서, 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 검정 용액 중 농도는, 이 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 인간 혈청 중 정상 생리학적 농도의 5%, 또는 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 70%, 또는 80% 정도로 낮을 수 있거나, 또는 이 무기 화합물, 이온 또는 유기 분자의 인간 혈청 중 정상 생리학적 농도보다 1.5배, 또는 2배, 또는 3배, 또는 4배 또는 5배, 또는 7배 또는 9배 또는 10배 또는 심지어 20배 정도로 높을 수 있다. 검정 용액의 상이한 성분들은 이 성분들 각각의 정상 생리학적 농도 수준과 상이한 농도 수준으로 사용될 수 있다.
제1 조건과 제2 조건, 즉 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건에서의 검정은 돌연변이 폴리펩티드의 활성을 측정하는데 사용된다. 검정이 실시되는 동안 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 둘 다는 검정 용액 중에 존재한다. 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 관계는, 예를 들어 항체-항원, 리간드-수용체, 효소-기질 또는 호르몬-수용체일 수 있다. 돌연변이 폴리펩티드가 자체의 활성을 발휘하기 위해서, 이 돌연변이 폴리펩티드는 자체의 결합 파트너와 접촉하여 이와 결합할 수 있어야 한다. 즉 이 돌연변이 폴리펩티드와 자체의 결합 파트너 사이의 결합 후에, 돌연변이 폴리펩티드의 이의 결합 파트너에 대한 활성이 발휘 및 측정된다.
몇몇 구현예들에서, 검정에 사용된 이온, 특히 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 이온은 스크리닝되는 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이에 가교를 형성하는 역할을 할 수 있다. 즉 이온은 수소 결합 및/또는 이온 결합을 통하여 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 둘 다와 결합할 수 있다. 이 점은, 큰 분자(돌연변이 폴리펩티드 또는 이의 결합 파트너)가 도달하기 어려울 수 있는 부위에 이온이 도달할 수 있게 만듦으로써, 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 검정 용액 중 이온은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너가 서로 간에 결합하게 될 확률을 증가시킬 수 있다. 또한, 이온은 더 큰 분자(돌연변이 폴리펩티드 또는 이의 결합 파트너)와의 결합에 의해서 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 추가적으로나 대안적으로 보조할 수 있다. 이러한 결합은, 큰 분자의 입체구조를 변경시킬 수 있고/있거나 이 큰 분자가, 자체의 결합 파트너와의 결합을 촉진하는 특정의 입체구조로서 유지되도록 만들 수 있다.
이온이 돌연변이 폴리펩티드 및 이의 결합 파트너와 이온 결합을 형성함으로써 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 도울 수 있음이 관찰되었다. 따라서, 스크리닝은 훨씬 더 효율적일 수 있고, 이온이 사용되지 않는 동일 검정에 비하여 더 많은 히트(hit)(후보 조건부 활성 폴리펩티드)가 동정될 수 있다. 마그네슘 이온, 황산염 이온, 중황산염 이온, 탄산염 이온, 시트르산염 이온, HAPT 이온, HADP 이온, 중탄산염 이온, 질산염 이온, 아질산염 이온, 인산염 이온, 인산수소 이온, 인산이수소 이온, 과황산염 이온, 모노과황산염 이온, 붕산염 이온, 젖산염 이온, 시트르산염 이온, 히스티딘 이온, 히스타민 이온 및 암모늄 이온으로부터 적합한 이온이 선택될 수 있다.
이온이, 해당 이온의 pKa에 가까운 pH에서 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조하는 역할을 함이 발견되었다. 이러한 이온은, 바람직하게 돌연변이 폴리펩티드에 비하여 그 크기가 비교적 작다.
일 구현예에서, 비정상 조건이 정상 생리학적 조건에서의 정상 생리학적 pH와 상이한 pH일 때, 후보 조건부 활성 폴리펩티드에 대한 히트 수를 증가시키기에 적합한 이온은, 검정에서 시험될 비정상 pH와 가까운 pKa를 보이는 이온들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 이온의 pKa는 비정상 pH로부터 3 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 2 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 1 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.8 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.6 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.5 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.4 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.3 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.2 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 또는 비정상 pH로부터 0.1 pH 단위 이하만큼 떨어져 있을 수 있다.
본 발명에 유용한 이온의 예시적 pKa(이 pKa는 상이한 온도에서 약간씩 차이가 있을 수 있음)는 하기와 같은데: 즉 암모늄 이온의 pKa는 약 9.24이고, 인산이수소의 pKa는 약 7.2이며, 아세트산의 pKa는 약 4.76이고, 히스티딘의 pKa는 약 6.04이며, 중탄산염 이온의 pKa는 6.4이고, 시트르산염의 pKa는 6.4이며, 젖산염 이온의 pKa는 약 3.86이고, 히스타민의 pKa는 약 6.9이며, HATP의 pKa는 6.95(HATP3- ↔ ATP4- + H+)이고, HADP의 pKa는 6.88(HADP3- ↔ ADP4- + H+)이다.
일 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 이황화물의 존재 하에서 검정 및 선택된다. 이황화물의 pKa는 7.05이다. 몇몇 구현예들에서, 상이한 농도의 이황화물이 정상 및 비정상 생리학적 조건을 보이는 검정들에 사용될 수 있다. 대안적으로 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 매질들은 거의 동일한 농도의 이황화물을 가지고, 또한 특정 조건의 값에서는 약간의 차이를 보이는데, 예를 들어 검정은 상이한 pH에서 수행될 수 있다. 검정에 사용될 이황화물의 농도는 1 mM 내지 100 mM일 수 있다. 바람직하게 검정 매질 중 이황화물의 농도는 2 mM 내지 50 mM, 또는 3 mM 내지 35 mM, 또는 5 mM 내지 20 mM 만큼이다. 이황화물의 존재 하에 행하여지는 검정이 공지되어 있다.
임의의 구현예들에서, 일단 비정상 조건에 대한 pH(즉 비정상 pH)가 공지되어 있다면, 후보 조건부 활성 폴리펩티드에 대한 히트를 증가시키는데 적합한 이온은, pKa가 비정상 pH이거나 이와 가까운 이온들로부터 선택될 수 있는데, 예를 들어 후보 이온은 그 pKa가 비정상 pH로부터 3 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 2 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 1 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.8 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.6 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.5 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.4 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.3 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 비정상 pH로부터 0.2 pH 단위 이하만큼 떨어져 있거나, 또는 비정상 pH로부터 0.1 pH 단위 이하만큼 떨어져 있을 수 있다.
전술된 바와 같이, 이온은 해당 이온의 pKa와 같거나 이에 가까운 pH에서 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조하는데 가장 유효하다. 예를 들어 pH 7.2 ~ 7.6인 검정 용액 중 중탄산염 이온(pKa 약 6.4)은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조하는데 그다지 유효하지 않음이 발견되었다. 검정 용액의 pH가 6.7로 떨어지고, 더 떨어져 약 6.0이 됨에 따라, 중탄산염 이온은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조하는데 있어서 점점 유효하게 되었다. 결과적으로, pH 6.0에서의 검정에서가 pH 7.2 ~ 7.6에서의 검정에서보다 더 많은 히트가 동정될 수 있었다. 이와 유사하게 히스티딘은 pH 7.4에서 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조하는데 있어서 그다지 유효하지 않다. 검정 용액의 pH가 6.7로 떨어지고, 더 떨어져 약 6.0이 됨에 따라, 히스티딘은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조하는데 있어서 점점 유효하게 되고, 또한, 예를 들어 약 6.2 ~ 약 6.4의 범위의 pH에서 더 많은 히트의 동정이 허용된다.
본 발명은 놀랍게도, 정상 생리학적 조건(즉 정상 생리학적 pH) 및 비정상 조건(즉 비정상 pH)에 대한 검정 용액의 pH가 상이하고, pKa가 정상 생리학적 pH와 비정상 pH의 거의 중간 지점 부근으로부터 비정상 pH 부근의 범위인 이온이, 스크리닝될 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 크게 도울 수 있음을 발견하였다. 결과적으로 스크리닝 검정은 비정상 조건에서 활성이 큰 히트 또는 후보 조건부 폴리펩티드를 더 많이 발견함에 있어 훨씬 더 효율적이다.
몇몇 구현예들에서, pKa는 심지어 비정상 pH로부터 적어도 하나의 pH 단위만큼 떨어져 있을 수 있다. 비정상 pH가 산성 pH일 때, 적합한 이온의 pKa는 (비정상 pH - 1)로부터, 비정상 pH와 정상 생리학적 pH의 중간 지점에 이르기까지의 범위일 수 있다. 비정상 pH가 염기성 pH일 때, 적합한 이온의 pKa는 (비정상 pH + 1)로부터, 비정상 pH와 정상 생리학적 pH의 중간 지점에 이르기까지의 범위일 수 있다. 이온은 본 출원에 기술된 이온들로부터 선택될 수 있다. 그러나 본 출원에 명백히 기술되어 있지 않은, 더 많은 이온도 또한 사용될 수 있다. 일단 비정상 pH와 정상 생리학적 pH가 스크리닝 검정을 위해 선택되면, 당 업자는 비정상 조건에서 활성이 큰 히트를 더 많이 동정함에 있어 스크리닝 효율을 증가시키는데 적합한 pKa를 보이는 임의의 이온을 선택하기 위해 본 발명의 가이드 원리들을 이용할 수 있다.
예를 들어 예시적 스크리닝에 대해 비정상 pH가 8.4이고, 정상 생리학적 pH가 7.4이면, pKa가 약 7.9(중간 지점) 내지 9.4(즉 8.4 + 1)의 범위인 임의의 이온이 스크리닝에 사용될 수 있다. pKa가 이 범위인 이온 몇몇으로서는 트리신(pKa 8.05), 히드라진(pKa 8.1), 비신(pKa 8.26), N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)(pKa 8.3), N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판설폰산(pKa 8.4), 타우린(pKa 9.06)로부터 유래하는 이온들을 포함한다. 다른 예로서, 예시적 스크리닝에 대해 비정상 pH가 6이고, 정상 생리학적 pH가 7.4이면, pKa가 약 5(즉 6 - 1) 내지 6.7(중간 지점)의 범위인 임의의 이온이 스크리닝에 사용될 수 있다. pKa가 이 범위인 이온 몇몇으로서는 말산염(pKa 5.13), 피리딘(pKa 5.23), 피페라진(pKa 5.33), 카코딜산염(pKa 6.27), 숙신산염(pKa 5.64), 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(pKa 6.10), 시트르산염(pKa 6.4), 히스티딘(pKa 6.04) 및 비스-트리스(6.46)로부터 유래하는 이온들을 포함한다. 당 업자는 다수의 화학 매뉴얼들과 참고서들을 참고하여, pKa가 어떤 범위에 포함되는 이온으로 전환될 수 있는, 무기 화합물 및 유기 화합물 둘 다 포함하는 공지의 화합물들을 확인할 수 있을 것이다. 적합한 pKa를 보이는 화합물들 가운데, 분자량이 더 작은 화합물들이 바람직할 수 있다.
결과적으로 본 발명은, 궁극적으로 동정된 조건부 활성 폴리펩티드의 제조는 야생형 폴리펩티드로부터 올바른 폴리펩티드 돌연변이체를 생산해 내는 것에 달려있을 뿐만 아니라, 검정 용액 중 적합한 pKa를 보이는 이온을 사용하는 것에도 달려있음을 뜻밖에 발견하였다. 이온은 대형 라이브러리로부터 활성이 큰 돌연변이체를 효율적으로 선택하는 것을 촉진할 수 있으므로, 본 발명은 (예컨대 CPE 및 CPS를 통하여) 돌연변이 폴리펩티드의 대형 라이브러리를 제조하는 것 이외에도, (적당한 pKa를 보이는) 검정 용액에 사용되기에 적합한 이온을 찾는 노력 또한 이루어져야 한다는 사실을 고려한다. 적합한 이온이 존재하지 않을 경우 스크리닝도 그 효율이 떨어지고, 활성이 큰 돌연변이체를 발견할 확률도 감소한다는 사실도 또한 고려된다. 결과적으로, 적합한 이온이 존재하지 않으면 활성이 큰 돌연변이체를 적합한 이온이 존재할 때와 동일한 수만큼 수득하기 위해서 스크리닝의 라운드가 여러 번 진행되어야 할 수 있는 것이다.
검정 용액 중 이온은 현장에서 검정 용액의 한 성분으로부터 생성될 수 있거나, 아니면 검정 용액에 직접 포함될 수 있다. 예를 들어 공기로부터 유래하는 CO2는 검정 용액 중에 용해되어, 탄산염 이온과 중탄산염 이온을 제공할 수 있다. 다른 예로서, 인산이수소 이온을 제공하기 위해 인산이수소나트륨이 검정 용액에 첨가될 수 있다.
(제1 조건 또는 정상 생리학적 조건 하에서의 검정과, 제2 조건 또는 비정상 조건 하에서의 검정 둘 다를 위한) 검정 용액 중 이 성분의 농도는, 통상 포유동물, 예컨대 인간의 자연 발생 체액 중에서 발견되는 동일 성분의 농도와 동일할 수 있거나, 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 다른 구현예들에서, 특히 어떤 성분이 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조하는 역할을 할 수 있는 이온일 때, 이러한 이온의 더 높은 농도는 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이에서 이온 결합을 형성할 수 있고, 실질적으로 이 결합을 가속화하여, 더 많은 히트 또는 후보 조건부 활성 폴리펩티드를 발견할 확률을 증가시킬 수 있음이 관찰되었던 것으로 보아, 해당 성분의 농도는 더 높을 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 특히 정상 생리학적 농도를 초과하는 농도가 적용될 때, 검정 용액 중 이온의 농도는 검정을 통하여 더 많은 히트를 발견할 확률과 양의 상관관계에 있을 수 있다. 예를 들어 인간 혈청 중 중탄산염 이온의 농도는 약 15 mM ~ 30 mM이다. 일례에서, 검정 용액 중 중탄산염 이온의 농도가 3 mM로부터, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM 그리고 100 mM로 증가할 때, 중탄산염 농도가 증가할 때마다 검정 중 히트의 수 또한 증가한다. 이러한 관점에서, 검정 용액 중 중탄산염은 약 3 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 150 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 100 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 100 mM 또는 약 20 mM 내지 약 100 mM 또는 약 25 mM 내지 약 100 mM 또는 약 30 mM 내지 약 100 mM 또는 약 35 mM 내지 약 100 mM 또는 약 40 mM 내지 약 100 mM 또는 약 50 mM 내지 약 100 mM 범위의 농도만큼 적용될 수 있다.
다른 구현예에서, 검정 용액 중 시트르산염의 농도는 약 30 μM 내지 약 120 μM, 또는 약 40 μM 내지 약 110 μM, 또는 약 50 μM 내지 약 110 μM, 또는 약 60 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 μM 내지 약 90 μM, 또는 약μM 일 수 있다.
일 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 7.2 ~ 7.6 범위의 정상 생리학적 pH이고, 비정상 조건은 5.5 ~ 7.2, 6 ~ 7, 또는 6.2 ~ 6.8 범위의 비정상 pH이다. 정상 생리학적 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액은 정상 생리학적 pH를 보이고, 중탄산염 이온 50 mM을 함유한다. 비정상 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액은 비정상 pH를 보이고, 중탄산염 이온 50 mM을 함유한다. 중탄산염 이온의 pKa는 약 6.4이므로, 중탄산염 이온은 비정상 pH인 pH 6.0 ~ 6.4, 예를 들어 pH 6.0 또는 6.2에서 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간 결합을 보조할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 7.2 ~ 7.6 범위의 정상 생리학적 pH이고, 비정상 조건은 5.5 ~ 7.2, 6 ~ 7, 또는 6.2 ~ 6.8 범위의 비정상 pH이다. 정상 생리학적 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액은 정상 생리학적 pH를 보이고, 시트르산염 이온을 80 μM 함유한다. 비정상 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액은 비정상 pH를 보이고, 시트르산염 이온을 80 μM 함유한다. 시트르산염 이온의 pKa는 6.4이므로, 시트르산염 이온은 비정상 조건 pH 6.0 ~ 6.4에서의 검정 용액 중 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너 간 결합을 효과적으로 보조할 수 있다. 그러므로, pH 6.0 ~ 6.4의 조건 하에서 더 큰 결합 활성을 보이고, pH 7.2 ~ 7.8의 조건 하에서는 더 작은 활성을 보이는 후보 조건부 활성 폴리펩티드가 더 많이 동정될 수 있다. 다른 이온, 예를 들어 아세트산염, 히스티딘, 중탄산염, HATP 및 HADP는 유사한 방식으로 작용을 하여, 어떤 이온을 함유하는 검정 용액이, 해당 이온의 pKa와 거의 동일한 pH에서 더 큰 결합 활성을 보이고, 해당 이온의 pKa와 상이한 pH(예를 들어 정상 생리학적 pH)에서 더 작은 결합 활성을 보이는 돌연변이 폴리펩티드를 효과적으로 스크리닝할 수 있도록 만들 수 있다.
또 다른 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 37 ℃의 정상 생리학적 온도이고, 비정상 조건은 38℃ ~ 39℃의 비정상 온도(몇몇 종양 미세환경의 온도)이다. 정상 생리학적 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액은 정상 생리학적 온도를 보이고, 중탄산염 이온을 20 mM 함유한다. 비정상 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액은 비정상 온도를 보이고, 중탄산염 이온을 20 mM 함유한다.
또 다른 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 정상 인간 혈청 중 전해질의 특정 농도이고, 비정상 조건은, 동물 또는 인간의 체내 상이한 병소에 조성될 수 있거나, 또는 인간 혈청 중 전해질의 정상 생리학적 농도를 변경하는, 동물 또는 인간의 조건으로부터 말미암을 수 있는 동일 전해질의 농도(상이하고 비정상적인 농도)이다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너 간 결합은 또한 다수의 기타 방식으로 영향받을 수 있다. 통상적으로, 이 영향력은 하나 이상의 추가 성분이 검정 용액에 포함됨으로써 발휘될 것이다. 이와 같은 추가의 성분들은 돌연변이 폴리펩티드, 이의 결합 파트너 중 어느 하나, 또는 둘 다와 상호작용하도록 디자인될 수 있다. 또한, 이 같은 추가의 성분들은 2개 이상의 상호작용의 조합뿐만 아니라, 결합에 영향을 주는 상호작용들 중 2개 이상의 유형의 조합을 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 관심 있는 결합 상호작용은 항체와 항원 사이의 상호작용이다. 이 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분들은 검정 용액에 포함되어, 항체 또는 항원, 아니면 이 둘 다에 영향력을 발휘할 수 있다. 이러한 방식으로, 요망되는 결합 상호작용은 향상될 수 있다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 이온 결합을 형성하여, 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너 간 결합을 보조할 수 있는 이온 이외에, 본 발명은 또한 돌연변이 폴리펩티드 및 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조하는데에 사용될 수 있는 기타 성분들도 포함한다. 일 구현예에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 수소 결합을 형성할 수 있는 분자들이 사용된다. 다른 구현예에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 소수성 상호작용을 할 수 있는 분자들이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 분자들이 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이 "수소 결합"이란 용어는, 음전기 원자, 예를 들어 탄소, 질소, 산소, 황, 염소 또는 플루오르(수소 결합 공여체)와, 전자 공여 원자, 예를 들어 질소, 산소, 황, 염소 또는 플루오르(수소 결합 수용체)의 비 공유 전자쌍 사이의 비교적 약한 비 공유성 상호작용을 지칭한다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 수소 결합을 형성할 수 있는 성분들은 유기 분자뿐만 아니라, 극성 결합을 가지는 무기 분자를 포함한다. 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이 돌연변이 폴리펩티드에 대한 결합 파트너는 통상 수소 결합을 형성할 수 있는 아미노산을 함유한다. 적합한 아미노산은 수소 결합을 형성할 수 있는 극성기를 가지는 측쇄를 가진다. 적합한 아미노산의 비 제한적 예들로서는 글루타민(Gln), 글루탐산(Glu), 아르기닌(Arg), 아스파라긴(Asn), 아스파르트산(Asp), 리신(Lys), 히스티딘(His), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met) 및 트립토판(Trp)을 포함한다.
이와 같은 아미노산은 수소 공여체 및 수소 수용체 둘 다로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들어 -OH기(Ser, Thr 및 Tyr에서 살펴볼 수 있음)에서의 산소 원자, -C=O기(Glu 및 Asp에서 살펴볼 수 있음)에서의 산소 원자, -SH기 또는 -SC기(Cys 및 Met에서 살펴볼 수 있음)에서의 황 원자, -NH3 +기(Lys 및 Arg에서 살펴볼 수 있음)에서의 질소 원자, 그리고 -NH-기(Trp, His 및 Arg에서 살펴볼 수 있음)에서의 질소 원자는 모두 수소 수용체로서의 역할을 할 수 있다. 또한 본 목록 중 수소 원자를 포함하는 기들(예를 들어 -OH, -SH, NH3 + 및 -NH-)은 수소 공여체로서의 역할을 할 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너의 주쇄는 또한 하나 이상의 수소 결합을 형성하는데에 참여할 수도 있다. 예를 들어 주쇄는 펩티드 결합에서와 같이 -(C=O)-NH-의 반복 구조를 가질 수 있다. 이 구조 내 산소 및 질소 원자는 수소 수용체로서의 역할을 할 수 있는 한편, 수소 원자는 수소 결합에 참여할 수 있다.
수소 결합에 사용될 수 있는 수소 또는 산소 원자를 수반하는 극성 결합 적어도 하나를 가지는 무기 화합물은, 예를 들어 H2O, NH3, H2O2, 히드라진, 탄산염, 황산염 및 인산염을 포함할 수 있다. 유기 화합물은, 예를 들어 알코올; 페놀; 티올; 지방족, 아민, 아미드; 에폭시화물, 카르복실산; 케톤, 알데히드, 에테르, 에스테르, 유기염화물 및 유기 플루오르화물을 포함할 수 있다. 수소 결합을 형성할 수 있는 화합물은 화학 문헌, 예를 들어 "The Nature of the Chemical Bond," by Linus Pauling, Cornell University Press, 1940, pages 284 ~ 334에 널리 공지되어 있다.
몇몇 구현예들에서, 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 펜탄올, 1-헥산올, 2-옥탄올, 1-데칸올, 사이클로헥산올, 그리고 고급 알코올; 디올, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 디에틸렌 글리콜 및 폴리알킬렌 글리콜을 포함할 수 있다. 적합한 페놀은 하이드로퀴논, 레소르시놀, 카테콜, 페놀, o-, m- 및 p-크레졸, 티몰, 알파 및 베타-나프톨, 피로갈롤, 구아이아콜 및 플로로글루신올을 포함한다. 적합한 티올은 메탄티올, 에탄티올, 1-프로판티올, 2-프로판티올, 부탄티올, tert-부틸 머캅탄, 펜탄티올, 헥산티올, 티오페놀, 디머캅토숙신산, 2-머캅토에탄올 및 2-머캅토인돌을 포함한다. 적합한 아민은 메틸아민, 에틸아민, 프로필아민, 이소프로필아민, 아닐린, 디메틸아민 및 메틸에틸아민, 트리메틸아민, 아지리딘, 피페리딘, N-메틸피페리딘, 벤지딘, 사이클로헥실 아민, 에틸렌 디아민, 헥사메틸렌 디아민, o-, m- 및 p-톨루이딘 및 N-페닐피페리딘을 포함한다. 적합한 아미드는 에탄아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N,N-디메틸 포름아미드, N,N-디메틸 메톡시 아세트아미드 및 N-메틸-N-p-시아노에틸 포름아미드를 포함한다. 에폭시화물은 산화에틸렌, 산화프로필렌, tert-부틸 하이드로퍼옥사이드, 산화스티렌, 에폭시화물 글리시돌, 산화사이클로헥센, 과산화 디-tert-부틸, 큐멘 하이드로퍼옥사이드, 에틸벤젠 하이드로퍼옥사이드, 산화이소부틸렌 및 1,2-에폭시옥탄을 포함할 수 있다. 카르복실산은 테레프탈산, 이소프탈산, 프탈산, 살리실산, 벤조산, 아세트산, 라우르산, 아디프산, 젖산, 시트르산, 아크릴산, 글리신, 헥사-하이드로벤조산, o-, m- 및 p-톨루산, 니코틴산, 이소니코틴산 및 파라-아미노벤조산을 포함할 수 있다. 케톤은 아세톤, 3-프로파논, 부타논, 펜타논, 메틸에틸 케톤, 디이소부틸 케톤, 에틸 부틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 메틸 tert-부틸 케톤, 사이클로헥사논, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 프로필 케톤, 메틸 부틸 케톤, 메틸 아밀 케톤, 메틸 헥실 케톤, 디에틸 케톤, 에틸 부틸 케톤, 디프로필 케톤, 디이소부틸 케톤, 디아세톤 알코올, 포론, 이소포론, 사이클로헥사논, 메틸 사이클로헥사논 및 아세토페논을 포함할 수 있다. 알데히드는 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부티르알데히드, 벤잘데히드, 신남알데히드, 소부티르알데히드, 발레르알데히드, 옥탈데히드, 벤잘데히드, 신남알데히드, 사이클로헥사논, 살리실알데히드 및 퍼푸랄을 포함할 수 있다. 에스테르는 아세트산에틸, 아세트산메틸, 포름산에틸, 아세트산부틸, 젖산에틸, 부티르산에틸, 아세트산프로필, 포름산에틸, 포름산프로필, 포름산부틸, 포름산아밀, 아세트산메틸, 아세트산에틸, 아세트산프로필, 아세트산부틸, 아세트산아밀, 아세트산메틸이소아밀, 아세트산메톡시부틸, 아세트산헥실, 아세트산사이클로헥실, 아세트산벤질, 프로피온산메틸, 프로피온산에틸, 프로피온산부틸, 프로피온산아밀, 부티르산메틸, 부티르산에틸, 부티르산부틸, 부티르산아밀, 아세토아세트산메틸 및 아세토아세트산에틸을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 에테르는 디메틸 에테르, 메틸 에틸 에테르, 디에틸 에테르, 메틸 프로필 에테르 및 디메톡시에탄을 포함한다. 에테르는 사이클릭일 수 있는데, 예를 들어 산화에틸렌, 테트라하이드로푸란 및 디옥산일 수 있다.
유기 염화물은 클로로포름, 펜타클로로에탄, 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 사염화탄소, 테트라클로로메탄, 테트라클로로에탄, 펜타클로로에탄, 트리클로로에틸렌, 테트라클로로에틸렌 및 이염화에틸렌을 포함한다. 유기플루오르화물은 플루오로메탄, 디플루오로메탄, 트리플루오로메탄, 트리플루오로에탄, 테트라플루오로에탄, 펜타플루오로에탄, 디플루오로프로판, 트리플루오로프로판, 테트라플루오로프로판, 펜타플루오로프로판, 헥사플루오로프로판 및 헵타플루오로프로판을 포함할 수 있다.
수소 결합은 결합의 세기에 의해 강한 수소 결합, 중간 수소 결합 또는 약한 수소 결합으로 구분될 수 있다(Jeffrey, George A.: An introduction to hydrogen bonding, Oxford University Press, 1997). 강한 수소 결합은 공여체-수용체 간 거리가 2.2 ~ 2.5 Å이고, 에너지는 14 ~ 40 kcal/mol의 범위이다. 중간 수소 결합은 공여체-수용체 간 거리가 2.5 ~ 3.2 Å이고, 에너지는 4 ~ 15 kcal/mol의 범위이다. 약한 수소 결합은 공여체-수용체 간 거리가 3.2 ~ 4.0 Å이고, 에너지는 4 kcal/mol 미만이다. 에너지 준위를 가지는 수소 결합의 몇몇 예들은 다음과 같은 것들이 있다: F-H...:F(38.6 kcal/mol), O-H...:N(6.9 kcal/mol), O-H...:O(5.0 kcal/mol), N-H...:N(3.1 kcal/mol) 및 N-H...:0(1.9 kcal/mol). 추가로 문헌[Perrin et al. "Strong" hydrogen bonds in chemistry and biology, Annual Review of Physical Chemistry, vol. 48, pages 511-544, 1997; Guthrie, "Short strong hydrogen bonds: can they explain enzymic catalysis?" Chemistry & Biology March 1996, 3: 163-170]을 참조한다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명에 사용된 성분들은 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 강한 수소 결합을 형성할 수 있다. 이러한 성분들은 강한 전기 음성도를 보이는 원자를 가지는 경향이 있다. 가장 강한 전기 음성도를 가지는 것으로 알려진 원자들 및 그 순서는 F > O > Cl > N와 같다. 그러므로, 바람직하게 본 발명은 수소 결합을 형성함에 있어서 플루오르, 하이드록실기 또는 카르보닐기를 포함하는 유기 화합물을 사용한다. 일 구현예에서, 유기플루오르는 강한 수소 결합을 형성하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 소수성 상호작용을 할 수 있는 성분들이 사용된다. 이러한 성분들은 소수성 기를 가지는 유기 화합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "소수성 상호작용"이란 용어는, 소수성 화합물 또는 어느 화합물의 소수성 영역과, 또 다른 소수성 화합물 또는 또 다른 화합물의 소수성 영역 간에 가역적으로 유인하는 상호작용을 지칭한다. 이러한 상호작용 유형은 문헌["Hydrophobic Interactions," A. Ben-Nairn (1980), Plenum Press, New York]에 기술되어 있다.
소수성 물질은 자체의 무극성으로 말미암아 물 분자에 의해 반발된다. 수용액 중 비교적 무극성인 분자 또는 기가 물보다는 다른 무극성 분자와 회합될 때, "소수성 상호작용"이라 지칭된다.
돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너는 통상적으로 소수성 상호작용을 할 수 있는 아미노산을 포함한다. 이와 같은 아미노산은 통상적으로 소수성 상호작용을 할 수 있는 무극성 기와 함께 적어도 하나의 측쇄를 가지는 것으로 특징지어질 것이다. 소수성 아미노산은, 예를 들어 알라닌(Ala), 이소루신(Ile), 루신(Leu), 페닐알라닌(Phe), 발린(Val), 프롤린(Pro), 글리신(Gly)을 포함하며, 드물게는 메티오닌(Met) 및 트립토판(Trp)도 포함한다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 소수성 상호작용을 할 수 있는 성분들은 소수성 분자, 또는 소수성 기를 적어도 하나 함유하는 분자인 유기 화합물들을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 이 같은 소수성 성분들은 방향족 탄화수소, 치환된 방향족 탄화수소, 다 방향족 탄화수소, 방향족 또는 비 방향족 헤테로사이클, 사이클로알칸, 알칸, 알켄 및 알킨으로부터 선택된 탄화수소일 수 있다. 소수성 기는 방향족 기, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐 및 알키닐 기를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "알킬", "알케닐" 및 "알키닐"이란 용어는, 1개 내지 30개의 탄소 원자를 가지는 불포화 지방족 기, 예를 들어 직쇄 알케닐/알키닐 기, 분지쇄 알케닐/알키닐 기, 사이클로알케닐(비 사이클릭) 기, 알킬 치환 사이클로알킬 기 및 사이클로알킬 치환 알케닐/알키닐 기를 지칭한다. 이러한 탄화수소 기들은 또한 하나 이상의 탄소 원자 상에서 치환될 수도 있다.
소수성 상호작용의 세기는 서로 상호작용할 수 있는 "소수성 물질(hydrophobe)"의 가용 양을 기반으로 결정됨이 이해될 수 있다. 그러므로 소수성 상호작용은, 예를 들어 소수성 상호작용에 수반되는 분자들 내 소수성 기의 "소수"성 및/또는 이 "소수"성의 정도를 증가시킴으로써 조정될 수 있다. 예를 들어 원래 형태가 소수성인 기는 탄화수소 사슬을 포함할 수 있고, 탄소 주쇄를 이루는 탄소들 중 하나에 소수성 측쇄를 결합시킴으로써 소수성(소수성기가 수반되는 소수성 상호작용의 세기를 증가시키는 능력)이 증가하도록 변형될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 이는 다양한 폴리사이클릭 화합물, 예를 들어 다양한 스테로이드 화합물 및/또는 이의 유도체, 예를 들어 스테롤 류 화합물, 더욱 구체적으로는 콜레스테롤의 결합을 포함할 수 있다. 일반적으로 측쇄는 선형 사슬, 방향족, 지방족, 사이클릭, 폴리사이클릭일 수 있거나, 또는 당 업계의 숙련자들에 의해 고려되는 바와 같은 소수성 측쇄의 기타 임의의 다양한 유형일 수 있다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 성분의 유형은 일반적으로 극성기를 가지는 화합물이지만, 항상 그러한 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 "반 데르 발스 상호작용"이란, 쌍극자-쌍극자 간 상호작용에 의해 유발되는 원자들, 기들, 분자들 및 표면들 사이의 인력 및/또는 근처 원자들, 기들 또는 분자들의 양자 역학으로 말미암은 유동적 분극 시 상관관계를 지칭한다.
본 발명에 있어서의 반 데르 발스 상호작용은 돌연변이 폴리펩티드 또는 결합 파트너 및 성분 사이의 인력이다. 반 데르 발스 상호작용은 3가지 발생원으로부터 발생할 수 있다. 첫 번째, 일부 분자들/기들은 전기적으로 중성일지라도 영구 전기 쌍극자일 수 있다. 일부 분자들/기들의 구조에 있어서 전자 전하 분포의 고정된 왜곡으로 말미암아, 분자/기의 한쪽은 항상 어느 정도 "+"이고, 반대쪽은 어느 정도 "-"이게 된다. 이와 같은 영구 쌍극자가 서로 배열되는 경향은 순 인력(net attractive force)을 초래한다. 이는 2개의 영구 쌍극자들 간의 상호작용이다(Keesom 힘).
두 번째, 영구 쌍극자인 분자들의 존재는 일시적으로 또 다른 근처 극성 또는 무극성 분자의 전자 전하를 왜곡시킬 수 있고, 이로 말미암아 추가의 분극이 유도된다. 추가의 인력이 영구 쌍극자와 이웃하는 유도 쌍극자의 상호작용으로부터 기인하게 된다. 이는 영구 쌍극자와 대응하는 유도 쌍극자 사이의 상호작용으로서, Debye 힘이라 칭하여질 수 있다. 세 번째, 수반된 어떠한 분자들도 영구 쌍극자가 아니지만(예를 들어 유기 액체 벤젠), 분자들 내에 일시적으로 유도된 쌍극자 2개를 가지는 분자들 사이에 인력이 존재한다. 이는, 일시적 유도 쌍극자 2개 사이의 상호작용으로서, London 분산 력이라 칭하여질 수 있다.
반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 결합 파트너 및/또는 돌연변이 폴리펩티드 내에 다수의 아미노산이 존재한다. 이러한 아미노산, 예를 들어 글루타민(Gln), 아스파라긴(Asn), 히스티딘(His), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp)은 극성 측쇄를 가질 수 있다. 이러한 아미노산들, 예를 들어 알라닌(Ala), 이소루신(Ile), 루신(Leu), 페닐알라닌(Phe), 발린(Val), 프롤린(Pro), 글리신(Gly)은 또한 무 극성기를 가지는 측쇄를 가질 수도 있다.
돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너와 반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 성분들은, 검정 용액에 가용성인 극성 또는 무극성 무기 화합물을 포함한다. 검정 용액은 일반적으로 수용액이므로, 이 같은 극성 또는 무극성 무기 화합물은 물에 가용성인 것이 바람직하다. 반 데르 발스 상호작용에 바람직한 물질들은 극성이어서, 쌍극자-쌍극자 상호작용을 할 수 있는 것들이다. 예를 들어 AlF3는 극성 Al-F 결합들을 가지고, 물에 가용성(20 ℃에서 물 100 ㎖ 중 약 0.67 g 용해)이다. HgCl2는 극성 Hg-Cl 결합들을 가지고, 20 ℃에서 물 100 ㎖ 중 약 7.4 g 용해된다. PrCl2는 극성 Pr-Cl 결합들을 가지고, 20 ℃에서 물 100 ㎖ 중 약 1 g 용해된다.
반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 적합한 극성 화합물은 알코올, 티올, 케톤, 아민, 아미드, 에스테르, 에테르 및 알데히드를 포함한다. 이와 같은 화합물의 적합한 예들은 수소 결합과 관련하여 전술되어 있다. 반 데르 발스 상호작용을 할 수 있는 적합한 무극성 화합물은 방향족 탄화수소, 치환된 방향족 탄화수소, 폴리방향족 탄화수소, 방향족 또는 비 방향족 헤테로사이클, 사이클로알칸, 알칸, 알켄, 알킨을 포함한다.
수소 결합 성분, 소수성 성분 및 반 데르 발스 성분은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너의 결합에 다수의 방식으로 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 수소 결합, 소수성 상호작용 및/또는 반 데르 발스 상호작용은 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간에 가교를 형성할 수 있다. 이러한 가교는 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너가 서로 더 근접하도록 만들어, 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 결합 파트너가 서로에 대해 결합을 촉진하는 형태로서 결합하고/결합하거나 자리 잡도록 촉진한다.
다른 구현예에서, 수소 결합 및/또는 소수성 상호작용은, 예를 들어 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너가, 결합 확률을 높이는 형태로서 서로 모이거나 회합하도록 유도하여, 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너의 결합 확률을 높일 수 있다. 그러므로 이러한 상호작용들 중 하나 이상은, 돌연변이 폴리펩티드 및 결합 파트너가 더 가까이 모이도록 만들거나, 또는 이 돌연변이 폴리펩티드와 결합 파트너가, 예를 들어 결합 부위들이 서로 더 가까이에 끌어당겨지도록 유도하거나, 분자들의 비 결합 부분들이 서로 더 멀리 떨어지도록 배열시켜 결합 부위들이 서로 더욱 가까이 위치하도록 허용함으로써 결합을 촉진하는 형태로 배열되도록 만들기 위해 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 수소 결합 및/또는 소수성 상호작용은 돌연변이 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 파트너의 입체구조에 영향을 미쳐, 이 입체구조가, 돌연변이 폴리펩티드 및 이의 결합 파트너의 결합에 더욱 유연하도록 만들 수 있다. 구체적으로 돌연변이 폴리펩티드의 아미노산들 중 하나 이상 및/또는 결합 파트너의 결합 또는 상호작용은, 돌연변이 폴리펩티드/결합 파트너 결합 반응에 유리한, 돌연변이 폴리펩티드 또는 결합 파트너 내 입체구조 변형 하나 이상을 유발시킬 수 있다.
본 발명은 검정들 2쌍을 수행하는데, 하나의 검정은, 정상 생리학적 조건에서의 돌연변이 폴리펩티드의 기원이 된 모 폴리펩티드 활성과 비교되었을 때, 이러한 정상 생리학적 조건에서의 검정에서 돌연변이 폴리펩티드 활성의 감소를 추구하는 것이고, 다른 하나의 검정은, 비정상 조건에서 돌연변이 폴리펩티드의 기원이 된 모 폴리펩티드 활성과 비교되었을 때, 이러한 비정상 조건에서의 검정에서 돌연변이 폴리펩티드 활성의 증가를 추구하는 것이다. 몇몇 경우들에서, 돌연변이 폴리펩티드의 기원이 된 모 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드로부터 유래하였다. 다른 경우에서, 모 폴리펩티드 자체는 본원의 어디엔가에 기술된 돌연변이 기술들 중 한 가지 이상이 이용되어 제조되었던 돌연변이 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 검정들의 쌍들에 사용된 조건은 검정 용액 또는 매질의 온도, pH, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스, 전해질 농도, 그리고 기타 임의의 성분의 농도로부터 선택될 수 있다. 그러므로, 검정 배지의 특정 성분은 검정들의 쌍 둘 다에서와 실질적으로 동일한 농도로 사용될 수 있다. 이러한 경우, 성분은 통상 인간이나 동물의 특정 환경, 예를 들어 혈청, 종양 미세환경, 활액막 환경, 신경 환경 또는 투여 점에서 우연히 마주할 수 있거나, 투여된 치료제가 횡단할 수 있거나, 또는 치료지점에서 우연히 마주할 수 있는 임의의 기타 환경을 모의하기 위한 목적으로 존재한다. 이 같은 환경들을 모의하는 성분 하나 이상을 선택함에 있어서 한 가지 중요한 양태는, 검정들의 쌍들이 사용되어 수행된 선택 공정의 결과들을 이러한 성분이 개선할 수 있다는 점이다. 예를 들어 특정 환경을 모의하는 것은, 해당 환경 중 특정 성분의 돌연변이 폴리펩티드에 대한 다양한 효과들이 선택 공정에서 평가될 수 있도록 허용한다. 특정 환경의 성분들은, 예를 들어 돌연변이 폴리펩티드를 변경할 수 있거나 이와 결합할 수 있거나, 돌연변이 폴리펩티드의 활성을 억제할 수 있거나, 돌연변이 폴리펩티드를 비활성화할 수 있는 식일 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 검정 용액의 성분 하나 이상은 바람직하게 소분자, 예를 들어 이황화물, 중탄산염, 히스티딘, 히스타민, 시트르산염, 젖산염 및 아세트산염이다. 일 구현예에서, 소 분자 성분은 바람직하게 검정 용액 중 약 100 μM 내지 약 100 mM, 더욱 바람직하게 약 0.5 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 존재한다.
검정 용액 중 성분의 농도는, 포유동물, 예를 들어 인간의 자연 발생 체액 중에서 통상 발견되는 동일 성분의 농도와 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 이는, 체액 중 성분의 정상 생리학적 농도라고 칭하여질 수 있다. 다른 구현예들에서, 검정 용액 중 특정 성분의 농도는, 포유동물, 예를 들어 인간의 자연 발생 체액 중에서 통상 발견되는 동일 성분의 농도에 못 미치거나 이보다 더 높을 수 있다.
다른 구현예에서, 성분은 검정들의 쌍들 각각에 실질적으로 상이한 농도로 존재할 수 있다. 이러한 경우, 성분의 존재, 부재 또는 농도는 검정 대상 조건이 되는데, 그 이유는 성분의 농도가, 정상 생리학적 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액과, 비정상 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액 사이에 차이가 나는 조건이기 때문이다. 그러므로, 본 발명의 방법에 관한 이 구현예에 의해 생산되는 조건부 활성 폴리펩티드는 적어도 부분적으로 성분의 농도에 의존적인 활성에 대해 선택될 것이다.
몇몇 구현예들에서, 성분은 검정 용액들 한 쌍에 존재할 수 있지만, 검정 용액들 다른 쌍에는 전혀 존재하지 않을 수 있다. 예를 들어 비정상 조건에 대한 검정 용액 중 젖산염의 농도는 종양 미세환경 내 젖산염의 농도를 모의하는 수준으로 설정될 수 있다. 젖산염은 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액들의 쌍에는 존재하지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 정상 생리학적 조건은 정상 생리학적 조건을 나타내는 제1 젖산염 농도이고, 비정상 조건은 체내 특정 병소에 존재하는 비정상 조건을 나타내는 제2 젖산염 농도이다.
다른 예에서, 글루코스는 종양 미세환경에서 발견될 수 있는 글루코스의 부재를 모의하기 위해 비정상 조건에 대한 검정 용액 중에 존재하지 않을 수 있는 한편, 글루코스는 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액들 쌍에서 혈장 글루코스 농도를 모의하는 수준으로 설정될 수 있다. 이 특징은, 수송 중 활성이 없어진다거나 최소화되지 않고, 또한 조건부 활성 폴리펩티드가 비정상 조건에 대한 검정 용액의 성분 농도가 조성된 환경에 도달할 때 이 조건부 활성 폴리펩티드가 활성화되지 않으면서, 조건부 활성 폴리펩티드를 병소 또는 환경에 우선적으로 전달하기 위해 이용될 수 있다.
예를 들어 종양 미세환경은 인간 혈청과 비교되었을 때, 통상 더 낮은 글루코스 농도와 더 높은 젖산염 농도를 보인다. 글루코스의 정상 생리학적 농도는 혈청 중 약 2.5 mM 내지 약 10 mM의 범위에 있다. 다른 한편, 글루코스 농도는 통상 종양 미세환경에서 0.05 mM 내지 0.5 mM의 범위로 매우 낮다. 일 구현예에서, 정상 생리학적 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액의 글루코스 농도는 약 2.5 mM 내지 약 10 mM의 범위이고, 비정상 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액의 글루코스 농도는 약 0.05 mM 내지 약 0.5 mM의 범위에 있다. 이와 같이 제조된 조건부 활성 폴리펩티드는 저 글루코스 환경(종양 미세환경)에서의 활성이 고 글루코스 환경(정상 조직 또는 혈액)에서의 활성보다 더 크다. 이 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 미세환경에서는 기능성일 것이지만, 수송시에는 혈류 중 낮은 활성을 보일 것이다.
혈청 중 젖산염의 정상 생리학적 농도는 약 1 mM 내지 약 2 mM의 범위에 있다. 다른 한편, 젖산염 농도는 통상 종양 미세환경에서 10 mM 내지 20 mM의 범위에 있다. 일 구현예에서, 정상 생리학적 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액의 젖산염 농도는 약 1 mM 내지 약 2 mM의 범위에 있고, 비정상 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액의 젖산염 농도는 약 10 mM 내지 약 20 mM의 범위에 있다. 이와 같이 제조된 조건부 활성 폴리펩티드는 고 젖산염 농도 환경(종양 미세환경)에서의 활성이 저 젖산염 농도 환경(정상 조직 또는 혈액)에서의 활성보다 더 크다. 그러므로 이 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 미세환경에서는 기능성일 것이지만, 수송시에는 혈류 중 낮은 활성을 보일 것이다.
유사하게, 근육통의 젖산염 농도는 정상보다 더 높다(비정상이다). 그러므로 근육통 환경에서 활성을 보이게 될 돌연변이 폴리펩티드를 찾을 때, 비정상 조건에서의 검정들의 쌍은 근육통 환경을 모의하도록 더 높은 농도의 젖산염 존재 하에서 수행될 수 있는 한편, 정상 생리학적 조건에서의 검정들의 쌍은 더 낮은 농도의 젖산염 존재 하에서, 또는 젖산염 부재 하에서 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 돌연변이 폴리펩티드는 젖산염 농도가 증가한 근육통 환경에서 향상된 활성에 대해 선택될 수 있다. 이러한 조건부 활성 폴리펩티드는, 예를 들어 소염제로서 유용할 수 있다.
다른 구현예에서, 2개 이상의 성분은 검정 용액들의 쌍 둘 다에서 사용될 수 있다. 이와 같은 유형의 검정에 있어서, 조건부 활성 폴리펩티드는 전술된 2가지 유형의 검정 둘 다의 특징들이 이용되어 선택될 수 있다. 대안적으로, 조건부 활성 폴리펩티드의 선택성은 2개 이상의 성분이 사용될 때 증가할 수 있다. 예를 들어 종양 미세환경으로 되돌아가는 것(비정상 조건에서의 검정들의 쌍)은 높은 젖산염 농도와 낮은 글루코스 농도 둘 다가 조성된 검정 배지 중에서 수행될 수 있는 한편, 정상 생리학적 조건에서의 검정들의 대응하는 쌍은 비교적 더 낮은 젖산염 농도와 비교적 더 높은 글루코스 농도 둘 다가 조성된 검정 배지 중에서 수행될 수 있다.
본 발명은, 무기 화합물, 이온 및 유기 분자로부터 선택된 각각의 성분이, 해당 성분의 상이한 농도에서보다 이 성분의 어느 한 농도에서 더욱 활성인 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위해, 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있음을 고려한다.
정상 환경(정상 생리학적 조건) 및 비정상 환경(비정상 조건) 사이의 조건(들)을 차별화하는 것으로서 대사물질 하나 이상의 농도를 상이하게 조성하는 것을 바탕으로 하는 검정은, 특히 혈장 중에서보다 종양 미세환경에서 더욱 활성인 조건부 활성 폴리펩티드의 선택에 적합할 수 있는데, 그 이유는 종양 미세환경은 통상 혈장 중 대사물질의 농도와 비교되었을 때, 상이한 농도의 동일 대사물질을 유의미한 수만큼 가지기 때문이다.
Kinoshita외 다수는 정상 뇌 및 뇌 종양에서의 대사물질들을 비교하였다["Absolute Concentrations of Metabolites in Human Brain Tumors Using In Vitro Proton Magnetic Resonance Spectroscopy," NMR IN BIOMEDICINE, vol. 10, pp.2-12, 1997]. 이 연구팀은, 정상 뇌 내 N-아세틸 아스파르트산염 농도는 5000 ~ 6000 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 그 농도가 300 ~ 400 μM에 불과하고, 성상세포종의 경우에는 1500 ~ 2000 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 600 ~ 1500 μM임을 발견하였다. 또한, 정상 뇌 내 이노시톨 농도는 1500 ~ 2000 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 그 농도가 2500 ~ 4000 μM이고, 성상세포종의 경우에는 2700 ~ 4500 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 3800 ~ 5800 μM이다. 정상 뇌 내 포스포릴에탄올아민의 농도는 900 ~ 1200 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 그 농도가 2000 ~ 2800 μM이고, 성상세포종의 경우에는 1170 ~ 1370 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 1500 ~ 2500 μM이다. 정상 뇌 내 글리신 농도는 600 ~ 1100 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 그 농도가 4500 ~ 5500 μM이고, 성상세포종의 경우에는 750 ~ 1100 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 1900 ~ 3500 μM이다. 정상 뇌 내 알라닌 농도는 700 ~ 1150 μM이지만, 교모세포종의 경우에는 그 농도가 2900 ~ 3600 μM이고, 성상세포종의 경우에는 800 ~ 1200 μM이며, 악성 성상세포종의 경우에는 300 ~ 700 μM이다. 이러한 대사물질들은 또한 혈중 농도가 상이할 수 있는데, 예를 들어 N-아세틸 아스파르트산염의 혈중 농도는 약 85000 μM이고; 이노시톨의 혈중 농도는 약 21700 μM이며; 글리신의 혈중 농도는 약 220 ~ 400 μM이고; 알라닌의 혈중 농도는 약 220 ~ 300 μM이다.
그러므로 적어도 N-아세틸 아스파르트산염, 이노시톨, 글리신 및 알라닌을 비롯한 이러한 대사물질들은 뇌 종양에서는 활성이지만, 혈액 또는 정상 뇌 조직에서는 활성이 아닌 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위해 검정 용액 중에 상이한 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어 교모세포종의 종양 미세환경에서는 활성이지만, 혈액 또는 정상 뇌 조직에서는 활성이 아니거나 적어도 활성이 작은 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위해서, N-아세틸 아스파르트산염 농도가 85000 μM인 검정 용액은 정상 생리학적 조건 하에서의 검정들 쌍에 사용될 수 있고, N-아세틸 아스파르트산염 농도가 350 μM인 검정 용액은 비정상 조건 하에서의 검정들 쌍에 사용될 수 있다.
Mayers외 다수는, 췌장 환자의 예비 진단 혈장 중 분지 쇄 아미노산을 비롯한 다수의 상이한 대사물질들의 농도를 연구하였다["Elevated circulating branched chain amino acids are an early event in pancreatic adenocarcinoma development," Nature Medicine, vol. 20, pp. 1193-1198, 2014]. 췌장암 환자에는 몇 가지 대사물질이, 췌장암이 발병하지 않은 인간의 혈액 중 해당 대사물질의 농도와는 상이한 농도로 혈류 중에 존재함이 발견되었다. Mayers외 다수는 또한, 췌장암 환자는 자신의 혈장 중에, 정상 대상체의 혈장 중과는 비교되게 유의미하게 증가한 분지형 아미노산을 가진다는 것을 발견하였다. 증가한 농도로 존재하는 분지형 아미노산은 이소루신, 루신 및 발린을 포함한다(Mayers의 표 1). Mayers의 도 1에 보인 다른 대사물질들도 췌장암 환자의 혈장 중에, 정상의 건강한 인간의 혈장 중 농도와 유의미하게 상이한 농도로 존재한다. 이러한 대사물질들은 적어도 아세틸글리신, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 2-아미노아디프산염, 타우로데옥시콜산염/타우로케노데옥시콜산염, 아코니트산염, 이소시트르산염, 젖산염, α-글리세로인산염 및 요산염을 포함한다. 그러므로 임의의 대사물질들은 췌장암 환자와 정상의 건강한 환자의 혈류 중에 상이한 농도로 존재한다는 발견을 바탕으로 하였을 때, 췌장암 환자의 종양 미세환경은 또한, 건강한 환자의 췌장 미세환경에 존재할 대사물질의 농도와 상이한 농도로 이 같은 대사물질을 가질 것임이 예상될 수 있다.
그러므로 일 구현예에서, 이러한 대사물질 중 하나 이상은 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액 중에, 건강한 개체의 혈장 중 해당 대사물질의 농도(즉 대사물질의 정상 생리학적 농도)와 근사한 양만큼 사용될 수 있다. 예를 들어 건강 개체의 혈장 중 정상 생리학적 농도로서 공지된 농도는, 이소루신의 경우 약 1.60 ± 0.31 ㎎/dL이고, 루신의 경우 약 1.91 ± 0.34 ㎎/dL이며, 발린의 경우 약 2.83 ± 0.34 ㎎/dL이다. 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액은 이와 같은 분지형 아미노산들 중 하나 이상을 상기와 같은 범위 내에 속하는 정상적인 생리학적 농도만큼 가질 수 있다. 비정상 조건에 대한 검정 용액은 동일한 분지형 아미노산을, 건강한 개체 중 이와 대응하는 분지형 아미노산의 정상 생리학적 농도보다 약 5배, 또는 약 10배, 또는 약 20배, 또는 약 50배, 또는 약 70배, 또는 약 100배, 또는 약 150배, 또는 약 200배, 또는 약 500배 높은 농도로 가질 수 있다. 이는, Mayer외 다수가 발견한 것을 바탕으로 하였을 때 췌장암 미세환경이 이러한 분지형 아미노산을 유의미하게 증가한 농도만큼 가질 것으로 예상된다는 사실을 반영할 것인데, 그 이유는 Mayers외 다수에 의해 검출된, 혈장에서 발견되는 더 높은 농도의 분지형 아미노산들은 종양 미세환경으로부터 기인하여 혈류 중에 희석되기 때문이다. 유사하게 비정상 조건 하에서의 검정은 특정 대사물질의 농도가 정상 개체에서보다 췌장암 환자에서 유의미하게 낮더라도, 이 췌장암 환자의 혈액 중 다른 대사물질의 농도를 반영할 수 있다. 이러한 방식으로, 스크리닝은 실제 환경을 모의할 수 있으며, 이로써 해당 특정 환경에 대하여 최고의 활성을 보이는 돌연변이체가 선택되는 것이 보장된다.
다른 몇몇 구현예들에서, 췌장암 환자의 실제 혈장 환경을 모의하기 위해서, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액은 하나 이상의 분지형 아미노산을 췌장암 환자의 혈장 중 농도를 모의하는 농도로 포함할 수 있다. 이러한 구현예들에서, 비정상 조건용 검정 용액은 동일한 분지형 아미노산을, 췌장암 환자의 혈장 중 대응 분지형 아미노산의 농도보다 약 2배, 또는 약 3배, 또는 약 4배, 또는 약 5배, 또는 약 7배, 또는 약 8배, 또는 약 10배, 또는 약 15배, 또는 약 20배 또는 약 50배 높은 농도로 가질 수 있으며, 이는, 이처럼 높은 농도가 종양 미세환경으로부터 기인하고, 혈류 중 농도는 종양의 미세환경 중 실제 농도의 희석된 만큼을 나타낸다는 사실을 반영한다. 유사하게, 기타 대사물질은 또한 정상 생리학적 조건용 및 비정상 조건용 검정 용액 중 상이한 농도로 존재할 수 있으며, 이는, 혈류에 대해 수집된 데이터로부터 예상되는 실제 차이들을 반영한다. 몇몇 경우들에서, 특정 대사물질의 결핍은 췌장 환자의 혈류 중에서 주목될 수 있는데, 이 경우, 혈류 중 측정된 농도를 반영하는 농도는 정상 생리학적 조건에 대한 검정에 사용될 수 있고, 더욱더 낮은 농도는 비정상 조건에 대한 검정에 사용될 수 있으며, 이로부터 상기 대사물질이 종양 미세환경에서 소모될 것 같다는 예상이 뒷받침된다. 검정 용액이 사용되어 이처럼 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 췌장암 환자의 혈장 중에서보다 췌장암 미세환경에서 활성이 더욱 클 것이다.
몇몇 구현예들에서, 췌장암 환자의 전체 혈장이 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어 일 구현예에서, 췌장암 환자의 혈장 성분 하나 이상의 모의는 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 하에서의 검정들 중 어느 하나 또는 둘 다를 위한 검정 용액에 적용될 수 있다. 예시적 구현예에서, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액의 pH는 췌장암 환자의 혈장이 30 wt.% 첨가되어 7.2 내지 7.6의 범위이고, 비정상 조건에 대한 검정 용액의 pH는 췌장암 환자의 혈장이 30 wt.% 첨가되어 6.2 내지 6.8의 범위이다. 이 구현예에서, 췌장암 환자의 혈장은 (1) 조건부 활성 폴리펩티드가 pH 7.2 ~ 7.6의 혈액 중에서 활성화되지 않도록 보장하고, 또한 (2) 췌장암 환자의 혈액 중에서 발견되는 대사물질의 이러한 조성물의 존재 하에서조차도 종양 미세환경 내 pH 5.5 ~ 7.2, 6 ~ 7, 또는 6.2 ~ 6.8에서 조건부 활성 폴리펩티드가 활성화될 수 있도록 보장하기 위해 제시된다. 이는, 췌장암 환자를 위한 치료를 조정할 것이다.
또 다른 예시적 구현예에서, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액의 pH는 췌장암 환자의 혈장이 30 wt.% 첨가되어 7.2 내지 7.6의 범위이고, 비정상 조건에 대한 검정 용액의 pH는 췌장암 환자의 임의의 혈장이 첨가되지 않고 5.5 내지 7.2 또는 6.2 내지 6.8의 범위이다.
무기 화합물, 이온 및 유기 분자로부터 선택된 동일 성분은 상기 논의된 몇 가지 유형의 검정 각각에서 사용될 수 있다. 예를 들어 젖산염의 경우, 이 젖산염은 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액들의 쌍들 중 실질적으로 동일한 농도로 사용될 수 있다. 그 다음, 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건은 하나 이상의 다른 양태, 예를 들어 온도, pH, 다른 성분의 농도 등에서 차이가 날 것이다. 상이한 구현예에서, 젖산염은 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건 간 차별화 요인들 중 하나로서 사용될 수 있는데, 이는 젖산염이 정상 생리학적 조건(비 종양 미세환경)에서보다 비정상 종양 미세환경에서 더 높은 농도로 존재하는 사실을 반영한다.
몇몇 구현예들에서, 2개 이상의 성분은 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건에 대한 검정 용액 둘 다에 실질적으로 동일한 농도로 첨가된다. 예를 들어 시트르산염 및 소 혈청 알부민(BSA) 둘 다가 검정 용액에 첨가된다. 시트르산염 농도는 약 80 μM일 수 있으며, BSA 농도는 두 검정 용액들 중 약 10% ~ 약 20%일 수 있다. 더욱 구체적으로, 정상 생리학적 조건 하에서의 검정들의 쌍을 위한 검정 용액의 pH는 농도 약 80 μM의 시트르산염과, 농도 약 10% ~ 약 20%의 BSA가 포함될 때 7.2 ~ 7.6의 범위에 있을 수 있다. 비정상 조건 하에서의 검정들의 쌍을 위한 검정 용액의 pH는 농도 약 80 μM의 시트르산염과, 농도 약 10% ~ 약 20%의 BSA가 포함될 때 6.2 ~ 6.8의 범위에 있을 수 있다.
일 구현예에서, 혈청은 정상 생리학적 조건과 비정상 조건에 대한 두 검정 용액들에 실질적으로 동일한 농도로 첨가될 수 있다. 혈청은 다수의 무기 화합물, 이온, 유기 분자(예를 들어 폴리펩티드)를 가지므로, 검정 용액은 두 검정 용액들 간에 실질적으로 동일한 농도로 제시되는, 무기 화합물, 이온, 유기 분자로부터 선택되는 성분들 다수개 및 다수 개를 함유할 수 있다. 검정 용액은 혈청을 5 ~ 30 vol.%, 또는 7 ~ 25 vol.%, 또는 10 ~ 20 vol.%, 또는 10 ~ 15 vol.% 함유할 수 있다. 다른 몇몇 구현예들에서, 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액들은 혈청을 함유하지 않는다. 혈청은 인간의 혈청, 소 혈청, 또는 임의의 다른 포유동물 유래 혈청일 수 있다. 다른 몇몇 구현예들에서, 검정 용액은 혈청을 함유하지 않는다.
정상 생리학적 조건과 비정상 조건에 대한 검정 용액들은 pH가 상이할 수 있다. 이러한 검정 용액의 pH는 중탄산염을 사용하는 것을 통하여 완충제 중 CO2 및 O2 수준을 이용해 조정될 수 있다.
몇몇 다른 구현예들에서, 2개 이상의 성분들 중 적어도 하나가 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건에 대한 검정 용액에 상이한 농도로 첨가된다. 예를 들어 젖산염 및 소 혈청 알부민(BSA) 둘 다가 검정 용액에 첨가된다. 젖산염 농도는 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액과 비정상 조건에 대한 검정 용액 간에 상이할 수 있는 한편, BSA는 상기 두 검정 용액 중에 동일한 농도로 존재할 수 있다. 비정상 조건에 대한 검정 용액 중 젖산염의 농도는 30 ㎎/dL 내지 50 ㎎/dL의 범위일 수 있고, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액 중 젖산염의 농도는 8 ㎎/dL 내지 15 ㎎/dL의 범위일 수 있다. 다른 한편, BSA는 상기 두 검정 용액 중에 동일한 농도, 예를 들어 약 10% ~ 20%로 존재한다. 이러한 검정 용액들이 사용되어 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 BSA의 존재 하에 젖산염이 낮은 농도, 즉 8 ㎎/dL ~ 15 ㎎/dL로 존재할 때보다 젖산염이 높은 농도, 즉 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL로 존재할 때 활성이 더 크다.
몇몇 구현예들에서, 검정 용액은 활성이 2개 이상의 조건에 의존적인 조건부 활성 폴리펩티드의 선택을 위해 디자인될 수 있다. 하나의 예시적 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성은 pH 및 젖산염 둘 다에 의존적일 수 있다. 이러한 조건부 활성 폴리펩티드의 선택을 위한 검정 용액은, pH 7.2 ~ 7.6이고, 젖산염 농도는 8 ㎎/dL 내지 15 ㎎/dL의 범위인, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액일 수 있다. 비정상 조건에 대한 검정 용액의 pH는 6.2 ~ 6.8이고, 젖산염 농도는 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL의 범위일 수 있다. 선택적으로, 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액은 또한 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간 결합을 보조하는 이온을 포함할 수 있어서, 후보 생체 활성 폴리펩티드에 대한 히트의 수가 증가할 수 있다.
또 다른 예시적 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 pH, 글루코스 및 젖산염에 의존적인 활성을 가질 수 있다. 이러한 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위한 검정 용액은 pH 7.2 ~ 7.6이고, 글루코스 농도가 2.5 mM ~ 10 mM의 범위이며, 젖산염 농도가 8 ㎎/dL ~ 15 ㎎/dL의 범위인, 정상 생리학적 조건에 대한 검정 용액일 수 있다. 비정상 조건에 대한 검정 용액은 pH 6.2 ~ 6.8이고, 글루코스 농도가 0.05 mM ~ 0.5 mM의 범위이며, 젖산염 농도가 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL의 범위일 수 있다. 선택적으로 정상 생리학적 조건과 비정상 조건 둘 다에 대한 검정 용액은 또한 돌연변이 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 사이의 결합을 보조하여, pH 6.2 ~ 6.8에서 결합 파트너와 결합하는 후보 생물학적 활성 폴리펩티드의 수를 증가시키기 위한 이온을 포함할 수도 있다. 이러한 검정 용액이 사용되어 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는, pH 7.2 ~ 7.6, 글루코스 농도 2.5 mM ~ 10 mM, 그리고 젖산염 농도 8 ㎎/dL 내지 15 ㎎/dL의 환경에서보다, pH 6.2 ~ 6.8, 글루코스 농도 0.05 mM ~ 0.5 mM, 그리고 젖산염 농도 30 ㎎/dL 내지 50 ㎎/dL의 환경에서 더욱 활성이 크다.
무기 화합물, 이온 및 유기 분자로부터 선택되는 성분 2개 이상은, 선택된 조건부 활성 폴리펩티드가 전달될 병소/부위(즉 표적화된 부위)에서의 환경을 모의하는 비정상 조건에 대한 검정 용액을 제조하기 위한 것이다. 몇몇 구현예들에서, 표적화된 부위에서의 환경에 제시된 성분 적어도 3개가 검정 용액에 첨가될 수 있거나, 또는 표적화된 부위에서의 환경에 제시된 성분 적어도 4개가 검정 용액에 첨가될 수 있거나, 또는 표적화된 부위에서의 환경에 제시된 성분 적어도 5개가 검정 용액에 첨가될 수 있거나, 또는 표적화된 부위에서의 환경에 제시된 성분 적어도 6개가 검정 용액에 첨가될 수 있다.
일 구현예에서, 표적화된 부위(즉 조건부 활성 폴리펩티드가 더 큰 활성을 보일 부위)에서 채취된 유체가 비정상 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액으로서 직접 사용될 수 있다. 예를 들어 활액막 액은 대상체, 바람직하게는 관절 질환을 앓고 있어서 그의 치료를 필요로 하는 대상체로부터 채취될 수 있다. 채취된 활액막 액(선택적으로는 희석액)은 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하기 위하여 비정상 조건에서의 검정들 쌍에서 검정 용액으로서 사용될 수 있다. 채취된 활액막 액(선택적으로는 희석된 활액막 액)이 비정상 조건 하에서의 검정을 위한 검정 용액, 그리고 정상 생리학적 조건 하에서의 검정을 위한 인간 혈장을 모의하는 검정 용액으로 사용되면, 선택된 조건부 활성 폴리펩티드(예를 들어 TNF-알파)는 다른 병소나 장기에서보다 관절에서 더욱 활성이 클 것이다. 예를 들어 염증성 관절을 가지는 대상체(예를 들어 관절염이 발병한 대상체)는 TNF-알파로 치료될 수 있다. 그러나 TNF-알파는 통상 다른 조직과 장기에 피해를 주는 심각한 부작용을 보인다. 활액막 액 중에서 더욱 활성이 크지만 혈액 중에서는 활성이 없거나 활성이 작은 조건부 활성 TNF-알파는, 몸의 나머지 부분에 대한 TNF-알파의 부작용을 줄이거나 잠재적으로는 없애면서, 관절에 대한 TNF-알파의 활성을 발휘시킬 것이다.
다수의 조건에 따라서 활성을 보이는 조건부 활성 폴리펩티드의 개발은, 대상체 몸속 표적 부위에 대한 조건부 활성 폴리펩티드의 개선된 선택성을 달성할 것이다. 조건들 중 오로지 몇 가지만이 조성되는 다른 병소에 조건부 활성 폴리펩티드가 제공되었을 때, 이 조건부 활성 폴리펩티드는 비활성이거나 적어도 유의미하게 활성이 작은 것이 이상적이다. 일 구현예에서, pH 6.2 ~ 6.8, 글루코스 농도 0.05 mM ~ 0.5 mM, 그리고 젖산염 농도 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL에서 활성인 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 미세환경에 특이적으로 전달될 수 있는데, 그 이유는 이 조건들이 모두 종양 미세환경에서 조성되기 때문이다. 다른 조직 또는 장기는 이와 같이 조성된 조건들 3개 전부는 아니고 이 조건들 중 1개 또는 2개를 보일 수 있으므로, 조건부 활성 폴리펩티드를 다른 조직 또는 장기 내에서 완전히 활성화하는 것은 충분치 않다. 예를 들어 운동을 마친 근육은 pH가 6.2 ~ 6.8의 범위로 낮을 수 있다. 그러나, 이 근육은 또 다른 검정 대상 조건을 보이지 않을 수도 있는 것이다. 그러므로, 조건부 활성 폴리펩티드는 운동을 마친 근육에서 비활성이거나 적어도 활성이 작다
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드의 활성이, 이 조건부 활성 폴리펩티드를 선택하는데에 사용된 조건에 진정으로 의존하는지를 확인하기 위한 단계들이 수행될 수 있다. 예를 들어 조건부 활성 폴리펩티드는 3가지 조건, 즉 pH 6.2 ~ 6.8, 글루코스 농도 0.05 mM ~ 0.5 mM, 그리고 젖산염 농도 30 ㎎/dL ~ 50 ㎎/dL에 의존하는 것으로 선택된다. 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 이후 3가지 조건 각각에서 따로따로, 그리고 3가지 조건들의 쌍들이 조성된 환경들에서 시험될 수 있고, 그 결과 이 조건부 활성 폴리펩티드가 이와 같은 시험 조건들 또는 환경들에서 비활성인지 또는 활성이 작은지가 확인될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 혈청 중 임의의 성분들은 의도적으로 최소화될 수 있거나, 또는 검정 배지에서 제하여질 수 있다. 예를 들어 항체가 스크리닝될 때, 항체와 결합하거나 이에 흡착하는 혈청의 성분들은 검정 배지 중에 최소로 포함될 수 있거나 이에서 제하여질 수 있다. 조건부 활성이 아니고, 오히려 다수의 상이한 조건들 하에서 오로지 혈청 중에 존재하는 성분과만 결합하는 결합 돌연변이 항체를 포함하여, 이와 같은 결합 항체는 위 양성(false positive)을 보일 수 있다. 그러므로, 검정에서 돌연변이체와 잠재적으로 결합할 수 있는 성분들을 최소화하거나 제하기 위해서는 검정 성분의 조심스러운 선택이 이루어질 수 있고, 그 결과 검정에서 요망되는 결합 파트너 이외의 성분과 결합함으로 말미암는 조건부 활성에 대해 양성인 것으로 부주의하게 확인될 수 있는, 비 기능성 돌연변이체의 수가 감소할 수 있다. 예를 들어 인간 혈청 중 성분들과 결합하는 성향을 갖는 돌연변이 폴리펩티드가 스크리닝되는 몇몇 구현예들에서, 인간 혈청 성분들에 결합하는 돌연변이 폴리펩티드에 의해 유발되는 위 양성 가능성을 줄이거나 없애기 위하여 BSA가 검정 용액 중에 사용될 수 있다. 기타 유사한 대체물도 또한 동일한 목적을 달성하기 위해 구체적인 경우에 제조될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 검정 조건들은 세포 막 가까이, 예컨대 세포 막 내부, 세포 막 또는 세포 막 외부에 있는 환경, 또는 관절 내부 환경을 모의한다. 세포 막 환경에서 스크리닝될 때 결합 활성에 영향을 줄 수 있는 몇몇 요인들로서는 수용체 발현, 내부화, 항체 약물 복합체(ADC) 효능 등을 포함한다.
검정 포맷은 당 업자에게 공지된 임의의 적합한 검정일 수 있다. 그 예들로서는, ELISA, 효소 활성 검정, 시험관 내 실제 조직 스크리닝(장기 등), 조직 슬라이드, 전체 동물, 세포주 및 3D 시스템 사용을 포함한다. 예를 들어 적합한 세포 기반 검정은 WO 2013/040445에 기술되어 있고, 조직 기반 검정은 미국특허 제7,993,271호에 기술되어 있으며, 전체 동물 기반 스크리닝 방법은 미국특허출원 제2010/0263599호에 기술되어 있고, 3D 시스템 기반 스크리닝 방법은 미국특허출원 제2011/0143960호에 기술되어 있다.
몇몇 구현예들에서, 진화 단계는 상기 논의된 조건부 활성 특징들 이외에도 기타 요망되는 특성들을 동시에 가질 수 있는 돌연변이 폴리펩티드를 제조해 낼 수 있다. 진화될 수 있는 기타 요망되는 특성들로서 적합한 것들은 결합 활성, 발현, 인간화 등을 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 이 같은 기타 요망되는 특성들 중 적어도 하나 또는 그 이상이 개선된 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는데에 사용될 수 있다. 선택 단계(들)는 조건부 활성과, 돌연변이 폴리펩티드의 기타 요망되는 특성 하나 이상 둘 다에 대해 선택이 이루어지도록 이용될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명은 조건부 활성 폴리펩티드를 제조한다. 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는, 예를 들어 선택된 조건부 활성 폴리펩티드의 다른 특성, 예를 들어 결합 활성, 발현, 인간화 등을 개선하기 위한 제2 진화 단계에서, 본원에 개시된 돌연변이유발 기술들 중 하나가 사용되어 추가로 돌연변이될 수 있다. 제2 진화 단계 후, 돌연변이 폴리펩티드는 조건부 활성과 개선된 특성 둘 다에 대해 스크리닝될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 모 폴리펩티드가 진화되어 돌연변이 폴리펩티드로 제조된 후에는, (a) 모 폴리펩티드와 비교되었을 때 정상 생리학적 조건하의 검정에서 제1 활성의 감소 및 (b) 모 폴리펩티드와 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 제1 활성의 증가 둘 다를 보이는 제1 조건부 활성 폴리펩티드가 선택된다. 그 다음, 상기 제1 조건부 활성 폴리펩티드는 추가로 하나 이상의 추가 진화, 발현 및 선택 단계의 대상이 될 수 있고, 그 결과 (1) (a) 모 폴리펩티드와 비교되었을 때 정상 생리학적 조건하의 검정에서 제2 활성의 감소 및 (b) 모 폴리펩티드와 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 제2 활성의 증가 둘 다를 보이거나, 또는 (2) 비정상 조건에서의 제1 활성과 정상 생리학적 조건에서의 제1 활성 간 비가, 제1 조건부 활성 폴리펩티드 및/또는 모 폴리펩티드에서보다 더 큰, 적어도 제2 조건부 활성 폴리펩티드가 선택된다. 제2 조건부 활성 폴리펩티드는, 모 폴리펩티드에 비하여 비정상 조건 하에서 제1 활성과 제2 활성 둘 다가 더 클 수 있을 뿐만 아니라, 모 폴리펩티드에 비하여 정상 생리학적 조건 하에서 제1 활성과 제2 활성이 더 작을 수 있음을 주목한다.
몇몇 양태들에서, 발현 단계는 진핵생물 세포 생산 숙주 내에서 수행된다. 숙주는 3T3 마우스 섬유아세포; BHK21 시리아 햄스터 섬유아세포; MDCK, 개 상피 세포; Hela 인간 상피 세포; PtK1 래트 캥거루 상피 세포; SP2/0 마우스 혈장 세포; 및 NS0 마우스 혈장 세포; HEK 293 인간 배 신장 세포; COS 원숭이 신장 세포; CHO, CHO-S 중국 햄스터 난소 세포; R1 마우스 배 세포; E14.1 마우스 배 세포; H1 인간 배 세포; H9 인간 배 세포; 그리고 PER C.6, 인간 배 세포; 에스. 세레비지아에 효모 세포; 및 피치아 효모 세포일 수 있다. 이후, 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 동일한 진핵생물 세포 생산 숙주에서 다량으로 생산될 수 있다. 발현 단계와 최종 생산 단계 둘 다에서 동일한 진핵생물 세포 생산 숙주가 사용되면, 조건부 활성 폴리펩티드에 대해 더 높은 발현 수준이 달성될 수 있다.
임의의 구현예들에서, 본 발명은 비정상 조건(또는 제2 조건)에서의 활성과 정상 생리학적 조건(또는 제1 조건)에서의 활성의 활성 비가 큰(예컨대 비정상 조건과 정상 생리학적 조건 간 선택성이 더 큰) 조건부 활성 폴리펩티드를 제조하는 것을 목표로 한다. 비정상 조건(또는 제2 조건)에서의 활성과 정상 생리학적 조건(또는 제1 조건)에서의 활성의 비 또는 선택성은 적어도 약 2:1, 또는 적어도 약 3:1, 또는 적어도 약 4:1, 또는 적어도 약 5:1, 또는 적어도 약 6:1, 또는 적어도 약 7:1, 또는 적어도 약 8:1, 또는 적어도 약 9:1, 또는 적어도 약 10:1, 또는 적어도 약 11:1, 또는 적어도 약 12:1, 또는 적어도 약 13:1, 또는 적어도 약 14:1, 또는 적어도 약 15:1, 또는 적어도 약 16:1, 또는 적어도 약 17:1, 또는 적어도 약 18:1, 또는 적어도 약 19:1, 또는 적어도 약 20:1, 또는 적어도 약 30:1, 또는 적어도 약 40:1, 또는 적어도 약 50:1, 또는 적어도 약 60:1, 또는 적어도 약 70:1, 또는 적어도 약 80:1, 또는 적어도 약 90:1, 또는 적어도 약 100:1일 수 있다.
일 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 비정상 조건에서의 활성과 정상 생리학적 조건에서의 활성 간 비가 적어도 약 5:1, 또는 적어도 약 6:1, 또는 적어도 약 7:1, 또는 적어도 약 8:1, 또는 적어도 약 9:1, 또는 적어도 약 10:1, 또는 적어도 약 15:1, 또는 적어도 약 20:1, 또는 적어도 약 40:1, 또는 적어도 약 80:1일 수 있는 항체이다. 일 구현예에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 부위를 표적화하는데에 사용되는데, 이 경우 조건부 활성 폴리펩티드는 종양 부위(종양 미세환경)에서 활성을 가지고, 종양 부위가 아닌 곳(정상 생리학적 조건)에서는 유의미하게 활성이 작거나 비활성이다.
일 구현예에서, 본 조건부 활성 폴리펩티드는 다른 제제, 예컨대 본원의 어딘가에 개시되어 있는 제제와 접합되도록 의도되는 항체이다. 조건부 활성 항체는 비정상 조건에서의 활성과 정상 생리학적 조건에서의 활성의 비가 더 클 수 있다. 예를 들어 다른 제제와 접합될 조건부 활성 항체는 비정상 조건에서의 활성과 정상 생리학적 조건에서의 활성의 비가 적어도 약 10:1, 또는 적어도 약 11:1, 또는 적어도 약 12:1, 또는 적어도 약 13:1, 또는 적어도 약 14:1, 또는 적어도 약 15:1, 또는 적어도 약 16:1, 또는 적어도 약 17:1, 또는 적어도 약 18:1, 또는 적어도 약 19:1, 또는 적어도 약 20:1일 수 있다. 이는, 접합된 제제가, 예를 들어 독성이거나 방사성일 때 특히 중요할 수 있는데, 그 이유는 이처럼 접합된 제제는 발병 부위나 치료 부위(즉 비정상 조건이 조성된 부위)에서 농축될 것이 요망되기 때문이다.
E. 조건부 활성 폴리펩티드의 제조
가역적이거나 비가역적 활성을 보이는, 선택된 조건부 활성 폴리펩티드는 치료, 진단, 연구 및 관련된 용도를 위해 제조될 수 있고/제조될 수 있거나 하나 이상의 추가 진화 및 선택 주기의 대상이 될 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는 폴리펩티드 발현용 세포 생산 숙주 또는 유기체가 사용되어 제조될 수 있다. 이 생산 과정을 더 효율적으로 만들기 위해, 조건부 활성 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 세포 생산 숙주 또는 유기체에 대해 코돈 최적화를 수행할 수 있다. 코돈 최적화는, 예컨대 마우스 계에서의 코돈 최적화가 기술되어 있는 문헌(Narum et al., "Codon optimization of gene fragments encoding Plasmodium falciparum merzoite proteins enhances DNA vaccine protein expression and immunogenicity in mice". Infect. Immun. 2001 December, 69(12): 7250-3); 효모 계에서의 코돈 최적화가 기술되어 있는 문헌(Outchkourov et al., "Optimization of the expression of Equistatin in Pichia pastoris, protein expression and purification", Protein Expr. Purif. 2002 February; 24(1): 18-24); 이.콜라이에서의 코돈 최적화가 기술되어 있는 문헌(Feng et al., "High level expression and mutagenesis of recombinant human phosphatidylcholine transfer protein using a synthetic gene: evidence for a C-terminal membrane binding domain" Biochemistry 2000 Dec. 19, 39(50): 15399-409); 코돈 선호도가 이.콜라이에서 이루어지는 단백질 분비에 어떻게 영향을 주는지가 기술되어 있는 문헌(Humphreys et al., "High-level periplasmic expression in Escherichia coli using a eukaryotic signal peptide: importance of codon usage at the 5' end of the coding sequence", Protein Expr. Purif. 2000 Nov. 20(2):252-64)에 이미 기술된 바 있다.
세포 생산 숙주는 CHO, HEK293, IM9, DS-I, THP-I, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK-MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 116, Mia PACA-2, ACHN, Jurkat, MMl, Ovcar 3, HT 1080, Panc-1, U266, 769P, BT-474, Caco-2, HCC 1954, MDA-MB-468, LnCAP, NRK-49F, 및 SP2/0 세포주; 그리고 마우스 비장세포 및 토끼 PBMC로 이루어진 군 중 하나로부터 선택되는 포유동물 계일 수 있다. 일 구현예에서, 포유동물 계는 CHO 또는 HEK293 세포주로부터 선택된다. 하나의 특정 양태에서, 포유동물 계는 CHO-S 세포주이다. 다른 구현예에서, 포유동물 계는 HEK293 세포주이다.
몇몇 구현예들에서, 세포 생산 숙주는 효모 세포 계, 예컨대 에스.세레비지아에 효모 세포 또는 피치아 효모 세포이다. 몇몇 구현예들에서, 세포 생산 숙주는 원핵생물 세포, 예컨대 이.콜라이이다(Owens RJ and Young RJ, J. Immunol. Meth., vol. 168, p.149, 1994; Johnson S and Bird RE, Methods Enzymol., vol. 203, p.88, 1991). 조건부 활성 폴리펩티드는 또한 식물 내에서 생산될 수도 있다(Firek et al. Plant Mol. Biol., vol. 23, p.861, 1993).
본 조건부 활성 폴리펩티드는 또한 당 분야에 널리 공지된 화학적 방법이 사용되는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 문헌[Caruthers "New chemical methods for synthesizing polynucleotides", Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn, "Synthesis of oligonucleotides on cellulose. Part II: design and synthetic strategy to the synthesis of 22 oligodeoxynucleotides coding for Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP)", Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980; Banga, A. K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Lancaster, Pa, 1995]을 참조하시오. 예를 들어 펩티드 합성은 다양한 고체상 기술이 사용되어 수행될 수 있고[예를 들어 문헌(Roberge "A strategy for a convergent synthesis of Nlinked glycopeptides on a solid support", Science 269:202, 1995; Merrifield "Concept and early development of solid-phase peptide synthesis", Methods Enzymol. 289:3-13, 1997) 참조], 자동화된 합성은, 예를 들어 제조업자에 의해 제공되는 지침에 따라 ABI 43 IA 펩티드 합성기(Perkin Elmer)가 사용되어 달성될 수 있다.
고체상 화학적 펩티드 합성 방법은 1960년대 초부터 당 분야에 공지되어 있으며(Merrifield, R. B., "Solid-phase synthesis.I. The synthesis of a tetrapeptide", J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154, 1963) (문헌(Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, 111., pp. 11-12)도 또한 참조함), 최근에는 시판용 실험실 펩티드 디자인 및 합성 키트(Cambridge Research Biochemicals)에 사용되고 있다. 이러한 시판용 실험실 키트는 일반적으로 문헌[H. M. Geysen et al., "Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid," Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984)]의 교시를 이용하였으며, 단일 평판에 모두 결합된 다수의 "봉" 또는 "핀"의 끝 부분 상에서 펩티드를 합성하는 것을 제공한다. 이러한 계가 이용될 때, 봉 또는 핀의 평판은 뒤집혀서, 핀 또는 봉의 끝 부분에 적절한 아미노산을 결합 또는 고정하기 위한 용액이 담긴, 대응하는 웰 또는 저장기의 제2 평판 내에 끼워진다. 이러한 방법의 단계, 즉 봉 및 핀을 뒤집어서 적절한 용액 내에 봉 및 핀의 끝 부분을 담그는 것을 반복함으로써, 아미노산은 요망되는 펩티드로 구축된다. 또한, 다수의 이용 가능한 FMOC 펩티드 합성 계가 이용될 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드 또는 단편의 조립은 Applied Biosystems, Inc.의 Model 431ATM 자동화 펩티드 합성기가 사용되어 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 이러한 장치는 직접 합성에 의하거나 다른 공지된 기술이 사용되어 커플링될 수 있는 일련의 단편의 합성에 의해 본 발명의 펩티드에 대한 준비된 접근 수단을 제공한다.
본 조건부 활성 폴리펩티드는 또한 글리코실화될 수 있다. 글리코실화는 화학적으로 또는 세포 생합성 기구에 의해 번역 후에 수행될 수 있는데, 여기서 세포 생합성 기구는 공지된 글리코실화 모티브들의 사용을 통합한다[다만, 모티브는 서열에 원산인 것이거나, 펩티드로서 첨가될 수 있거나, 아니면 핵산 암호화 서열에 첨가될 수 있음]. 글리코실화는 O-결합되거나 N-결합될 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드는 "모의체" 및 "펩티도모의체" 형태 모두를 포함한다. "모의체" 및 "펩티도모의체"라는 용어는, 본 발명의 폴리펩티드의 구조적 및/또는 기능적 특징과 실질적으로 동일한 구조적 및/또는 기능적 특징을 갖는 합성 화합물을 지칭한다. 모의체는 전체가 합성된 아미노산의 비 자연 유사체로 구성될 수 있거나, 일부는 자연 펩티드 아미노산이고 일부는 아미노산의 비 자연 유사체인 키메라 분자일 수 있다. 모의체는 또한 치환이 모의체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 한, 임의의 양의 자연 아미노산 보존적 치환을 통합할 수도 있다. 보존적 변이체인 본 발명의 폴리펩티드가 사용되는 일상적 실험은, 모의체가 본 발명의 범위 내에 있는지 여부, 즉 모의체의 구조 및/또는 기능이 실질적으로 변경되지 않았는지를 확인할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 모의체 조성물은 비 자연 구조적 성분의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 대안적 양태에서, 본 발명의 모의체 조성물은 하기 3가지 군들 중 하나 또는 전부를 포함한다: a) 자연 아미드 결합("펩티드 결합")에 의한 결합 이외의 잔기 결합 기; b) 자연 발생 아미노산 잔기를 대신하는 비 자연 잔기; 또는 c) 이차 구조적 모방을 유도하는 잔기, 즉 이차 구조, 예를 들어 베타 터언, 감마 터언, 베타 시트, 알파 나선 입체구조 등을 유도하거나 안정화시키기 위한 잔기. 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드는 이의 잔기 전부 또는 일부가 자연 펩티드 결합 이외의 화학적 수단에 의해 결합될 때 모의체로서 특징지어질 수 있다. 개별적 펩티도모의체 잔기는, 예를 들어 글루타르알데히드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 이작용성 말레이미드, N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 N,N'- 디이소프로필카르보디이미드(DIC)와 같은 펩티드 결합, 다른 화학적 결합 또는 커플링 수단에 의해 결합될 수 있다. 통상적 아미드 결합("펩티드 결합")에 대한 대안일 수 있는 결합 기는, 예를 들어 케토메틸렌[예를 들어 -C(=O)-NH-에 대한 -C(=O)CH2-], 아미노메틸렌(CH2-NH), 에틸렌, 올레핀(CH=CH), 에테르(CH2-O), 티오에테르(CH2-S), 테트라졸(CN4--), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드 또는 에스테르를 포함한다[예를 들어 문헌(Spatola(1983), Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide backbone Modification," Marcell Dekker, N. Y.)을 참조하시오].
본 발명의 폴리펩티드는 또한 자연 발생 아미노산 잔기 대신에 비 자연 잔기의 전부 또는 일부를 함유할 때 모의체로서 특징지어질 수 있다. 비 자연 잔기는 과학 및 특허 문헌에 잘 기술되어 있으며; 자연 아미노산 잔기의 모의체로서 유용한 예시적 비 자연 조성물 소수 개와 가이드라인이 아래 기술되어 있다. 방향족 아미노산의 모의체는, 예를 들어 D- 또는 L-나프틸알라닌; D- 또는 L-페닐글리신; D- 또는 L-2 티에네일알라닌; D- 또는 L- 1,-2, 3- 또는 4-피레네일알라닌; D- 또는 L-3 티에네일알라닌; D- 또는 L-(2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐알라닌; D-p-플루오로-페닐알라닌; D- 또는 L-p-비페닐페닐알라닌; D- 또는 L-p-메톡시-비페닐페닐알라닌; D- 또는 L-2-인돌(알킬)알라닌; 및 D- 또는 L-알킬알라닌에 의한 치환으로써 제조될 수 있으며, 다만 알킬은 치환 또는 비치환 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소-부틸, sec-이소틸, 이소-펜틸 또는 비 산성 아미노산일 수 있다. 비 자연 아미노산의 방향족 고리는, 예를 들어 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤즈이미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다.
산성 아미노산의 모의체는, 예를 들어 음전하를 유지하는 비 카르복실레이트 아미노산; (포스포노)알라닌; 황산화된 트레오닌에 의한 치환에 의해 제조될 수 있다. 카르복실 측기(예를 들어 아스파르틸 또는 글루타밀)는 또한 예를 들어 1-사이클로헥실-3(2-모폴리닐-(4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3(4-아조니아-4,4-디메톨펜틸) 카르보디이미드와 같은 카르보디이미드(R'~N--C--N--R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형될 수 있다. 아스파르틸 또는 글루타밀은 또한 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환될 수 있다. 염기성 아미노산의 모의체는, 예를 들어 (리신 및 아르기닌 이외에) 아미노산 오르니틴, 시트룰린, 또는 (구아니디노)-아세트산 또는 (구아니디노)알킬-아세트산과의 치환에 의해 제조될 수 있되, 다만 알킬은 상기 정의되어 있다. 아스파라긴 또는 글루타민에 대해 (예를 들어 COOH 대신에 CN-기를 함유하는) 니트릴 유도체가 치환될 수 있다. 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기는 대응하는 아스파르틸 또는 글루타밀 잔기로 탈아민화될 수 있다. 아르기닌 잔기 모의체는, 바람직하게 알칼리성 조건하에 아르기닐을, 예를 들어 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로-헥산디온 또는 닌히드린을 포함하는 하나 이상의 통상적인 시약과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 티로신 잔기 모의체는 티로실을, 예를 들어 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄은 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 잔기 모의체는 시스테이닐 잔기를, 예를 들어 2-클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 알파-할로아세트산염 및 대응하는 아민과 반응시킴으로써 제조될 수 있고; 그 결과 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체가 제공된다. 시스테인 잔기 모의체는 또한 시스테이닐 잔기를, 예를 들어 브로모-트리플루오로아세톤, 알파-브로모-베타-(5-이미도조일)프로피온산; 클로로아세틸 인산염, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 이황화물; 메틸 2-피리딜 이황화물; p-클로로머큐리벤조산염; 2-클로로머큐리-4-니트로페놀; 또는 클로로-7-니트로벤조-옥사-1,3-디아졸과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 리신 모의체는 리시닐을, 예를 들어 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다(그리고 아미노 말단 잔기는 이 처럼 반응시킴으로써 변경될 수 있다). 리신 및 다른 알파-아미노 함유 잔기 모의체는 또한 메틸피콜리니미데이트와 같은 이미도에스테르, 피리독살 인산염, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트리니트로-벤젠술폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온과의 반응, 그리고 글리옥실레이트와의 트랜스아미다아제-촉매 반응에 의해 제조될 수 있다. 메티오닌의 모의체는, 예를 들어 메티오닌 술폭시드와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 프롤린의 모의체는, 예를 들어 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 3- 또는 4-하이드록시 프롤린, 데하이드로프롤린, 3- 또는 4-메틸프롤린, 또는 3,3-디메틸프롤린을 포함한다. 히스티딘 잔기 모의체는 히스티딜을, 예를 들어 디에틸프로카보네이트 또는 파라-브로모페나실 브롬화물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 다른 모의체는, 예를 들어 프롤린 및 리신의 하이드록실화; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화; 리신, 아르기닌 및 히스티딘의 알파-아미노기의 메틸화; N-말단 아민의 아세틸화; 주 사슬 아미드 잔기의 메틸화 또는 N-메틸 아미노산과의 치환; 또는 C-말단 카르복실기의 아미드화에 의해 제조되는 것들을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 잔기, 예를 들어 아미노산은 또한 반대 키랄성을 가지는 아미노산(또는 펩티도모의체 잔기)에 의해 치환될 수 있다. 따라서, (화학적 실체의 구조에 의존하여 R 또는 S로서 지칭될 수도 있는) L-입체구조로 자연 발생하는 임의의 아미노산은 D-아미노산으로서 지칭되는, 반대 키랄성을 가지되 동일한 화학 구조적 형태 또는 펩티도모의체의 아미노산으로 치환될 수 있을뿐더러, R- 또는 S-형으로서 지칭될 수 있다.
본 발명은 또한 번역 후 가공과 같은 자연 가공(예를 들어 인산화, 아실화 등)에 의하거나, 또는 화학적 변형 기술에 의해 본 조건부 활성 폴리펩티드를 변형시키기 위한 방법을 제공한다. 변형은 펩티드 주쇄, 아미노산 측쇄, 그리고 아미노 또는 카르복시 말단을 포함하여 폴리펩티드 중 어디에서나 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형이 소정의 폴리펩티드 내 여러 개의 부위에서 동일한 정도 또는 다양한 정도로 존재할 수 있음이 인지될 것이다. 또한, 소정의 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 가질 수 있다. 변형은, 아세틸화, 아실화, PEG화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합, 헴 기의 공유결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합, 포스파티딜이노시톨의 공유결합, 가교 고리화, 이황화물 결합 생성, 탈메틸화, 공유 가교의 생성, 시스테인의 생성, 피로글루타메이트의 생성, 포르밀화, 감마-카르복시화, 글리코실화, GPI 앵커 생성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백 분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 및 아르기닐화와 같이 아미노산의 단백질로의 운반-RNA 매개 첨가를 포함한다[예를 들어 문헌(Creighton, T. E., Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)) 참조]
F. 약학 조성물
선택된 조건부 활성 폴리펩티드, 또는 이 조건부 활성 폴리펩티드로부터 조작된 생성물이 약학 조성물에 사용될 수 있다. 일 양태에서, 이러한 조건부 활성 폴리펩티드 또는 조작된 조건부 활성 폴리펩티드는 본원에 개시된 방법들 중 하나가 사용되어 상업적으로 제조된다. 몇몇 적합한 약학 조성물이 미국 특허 제8,709,755호(B2)에 기술되어 있다.
약학 조성물은 여러 유형의 암, 예컨대 암종, 아세포종 및 육종, 그리고 임의의 백혈병 또는 림프성 악성종양, 약성 및 악성 종양, 그리고 악성종양, 예컨대 육종, 암종 및 흑색종을 치료하는데 사용될 수 있다. 암은 비 고형 종양(예컨대 혈액학적 종양) 또는 고형 종양일 수 있다. 성인 종양/암과 소아 종양/암도 또한 포함된다.
혈액학적 암은 혈액이나 골수의 암이다. 혈액학적(또는 혈행성) 암의 예로서는 백혈병, 예컨대 급성 백혈병(예컨대 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수아구성, 전골수아구성, 골수단핵구성, 단핵구성 백혈병 및 적백혈병), 만성 백혈병(예컨대 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병), 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종(나태성 및 고등급형), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 골수이형성증후군, 모양세포 백혈병 및 골수이형성증을 포함한다.
고형 종양은 보통 낭포 또는 액체 구역을 함유하지 않는, 조직의 비정상적 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 고형 종양의 상이한 유형은 이 고형 종양을 형성하는 세포의 유형에 대해 명명된다(예컨대 육종, 암종 및 림프종). 치료될 수 있는 고형 종양의 예들로서는 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종 및 기타 육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프성 악성종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 거대종격동전이암, 유두갑상샘암종, 크롬친화성세포종 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질암종, 기관지원성암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막암종, 빌름 종양, 자궁경부암, 고환암, 정상피종, 방광 암종, 흑색종 및 CNS 종양(예컨대 신경교종(예컨대 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교모세포종(다형성신경교아종이라고도 공지됨) 성상세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 슈반 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 뇌수막종, 신경아세포종, 망막모세포종 및 뇌전이)를 포함한다.
조건부 활성 폴리펩티드는 또한 대상체에서 노화 세포를 제거하는데 사용될 수 있다. 노화 세포는 본질적으로 영구 성장 정지가 일어난 것에 의해 특징지어지는 세포들을 포함한다. 노화 세포는 본질적으로 증식 신호에 미반응성이다. 노화 현상은 정상 세포의 증식성 수명(proliferative lifespan)의 막바지에 일어날 수 있거나, 또는 예를 들어 화학요법제, 방사선, DNA 손상 또는 기타 세포 손상에 반응하여 정상 세포 또는 종양 세포에서 일어날 수 있다. 노화 세포는 p53-p21ciP 1 또는 p l6ink4a(다만 이것들 각각은 비증식 상태를 각각 유도 및 유지시키기에 충분한 것으로 기술되어 있음)의 독립적인 활성을 통하여 세포 주기로부터 퇴출된다고 당 분야에 기술되어 있다(Rodier et al., J Cell Biol 192:547- 556 (2011)).
노화된 세포를 제거하는 것이 유익한 질환 또는 병태가 다수 존재한다. 이러한 질환 또는 병태로서는 암, 바람직하게는 흑색종, 더욱 바람직하게는 전이성 흑색종, 만성 염증성 질환 또는 신경질환, 예컨대 알츠하이머병이나 파킨슨병을 포함할 수 있다. 기타 질환으로서는 죽상경화증, 만성 염증성 질환, 예컨대 관절염 또는 관절증, 암, 골관절염, 당뇨병, 당뇨병성 궤양, 척추후만증, 척추측만증, 간부전, 경화증, 허치슨-길포드(Hutchinson-Gilford) 조로증(HGPS), 경추척수증(laminopaties), 골다공증, 치매, (심)혈관 질환, 비만, 대사증후군, 급성 심근경색, 폐기종, 인슐린 감수성, 보턴열, 근육감소증, 신경퇴행성질환, 예컨대 알츠하이머병, 헌팅톤병 또는 파킨슨병, 백내장, 빈혈, 고혈압, 섬유증, 노인성 황반변성, COPD, 천식, 신부전, 실금, 청력 상실, 예컨대 난청, 시력 상실, 예컨대 실명, 수면장애, 통증, 예컨대 관절 통증 또는 다리 통증, 불균형, 공포감, 우울증, 호흡곤란, 체중 감소, 탈모, 근육 감소, 골밀도 감소, 노쇠 및/또는 체력 저하를 포함할 수 있다.
조건부 활성 폴리펩티드, 또는 이 조건부 활성 폴리펩티드로부터 조작된 생성물을 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물을 제조하기 위한 방법으로서 공지된 방법에 따자 제제화될 수 있다. 이러한 방법에서, 조건부 활성 폴리펩티드는, 통상 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 혼합물, 용액 또는 조성물과 합하여진다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 수용체인 환자에 의해 관용될 수 있는 물질이다. 멸균 인산염 완충 염수는 약학적으로 허용 가능한 담체의 일례이다. 기타 약학적으로 허용 가능한 담체로서 적합한 것은 당업자들에게 널리 공지되어 있다. (예를 들어 문헌(Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995))을 참조한다). 제형은 하나 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 바이알 표면상 단백질 손실을 막기 위한 알부민 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 약학 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 투여계획은 원래 치료될 병태, 병의 심각성, 환자의 나이, 체중 및 성별 등에 의존한다. 이러한 고려사항들은 적합한 약학 조성물을 제형화함에 있어서 숙련자에 의해 고려될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 국소, 경구, 비 경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 안 내 투여 등의 목적으로 제형화될 수 있다.
바람직하게 약학 조성물은 주사될 수 있는 제형에 대해 약학적으로 허용 가능한 비이클을 함유한다. 이 비이클은, 구체적으로 등장성, 멸균성, 염수 용액(인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등, 또는 이러한 염의 혼합물)일 수 있거나, 아니면, 예를 들어 멸균수나 생리 식염수가 첨가될 때 주사 용액의 구성이 허용되는 건조 조성물, 특히 동결 건조 조성물일 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 때때로 "안정화제"로도 공지된 긴장제는 조성물 중 액체의 긴장성을 조정하거나 유지하기 위해 존재한다. 긴장제가 크기가 큰 하전 생체 분자, 예컨대 단백질 및 항체와 함께 사용될 때, 이는 종종 "안정화제"라고 칭하여지는데, 그 이유는 이 긴장제가 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용하여, 분자내 상호작용과 분자간 상호작용의 잠재성을 줄여주기 때문이다. 긴장제는 약학 조성물의 0.1 중량% 내지 25 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 5 중량%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 긴장제는 다가 당 알코올, 바람직하게 삼가 또는 이 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가의 부형제들로서는 다음, 즉 (1) 증량제, (2) 가용성 증진제(solubility enhancer), (3) 안정화제 및 (4) 변성 또는 용기벽에의 접착을 막아주는 제제 중 하나 이상으로서 사용될 수 있는 제제들을 포함한다. 이러한 부형제들로서는 다가 당 알코올(상기 나열됨); 아미노산, 예컨대 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 루신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 미오이니시토스, 미오이노시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예컨대 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타치온, 티옥토산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨; 저분자량 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 기타 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당체(예컨대 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스); 이당체(예컨대 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당체, 예컨대 라피노스; 그리고 다당체, 예컨대 덱스트린 또는 덱스트란을 포함할 수 있다.
비이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"라고도 공지됨)가 치료제의 용해를 돕고, 또한 치료 단백질을 교반 유도성 응집(이는 또한 활성의 치료 단백질 또는 항체의 변성이 일어나지 않으면서 제형이 전단 표면 스트레스에 노출되는 것을 허용하기도 함)으로부터 보호하기 위해 사용될 수 있다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 1.0 ㎎/㎖, 바람직하게 약 0.07 ㎎/㎖ 내지 약 0.2 ㎎/㎖ 범위의 농도로 존재할 수 있다.
적합한 비이온성 계면활성제로서는 폴리솔베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아르산염, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자 오일 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아르산염, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제로서는 라우릴황산나트륨, 설포숙신산디옥틸나트륨 및 설폰산디옥틸나트륨을 포함한다. 양이온성 세제로서는 염화벤잘코늄 또는 염화벤제토늄을 포함한다.
일 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 암 치료를 위한 항암제 하나 이상과 함께 약학 조성물 중에 사용될 수 있다. 예를 들어 항암제는 화학요법제, 방사선요법제, 호르몬요법제, 독소 또는 면역요법제일 수 있다. 항암제는 탁산, 메이탄시노이드, 오리스타틴, 듀오카르마이신, 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 수면제, 듀오마이신, 칼리키아마이신, 안트라사이클린, CC-1065 유사체, 도세탁셀, 카텝신, 리신, 겔로닌, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, RNase 및 독성 방사성동위원소(이에 한정되는 것은 아님)로부터 선택될 수 있다.
다른 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 항암제에 접합될 수 있다. 접합은 항암제를 조건부 활성 폴리펩티드와 공유 결합시킬 수 있다. 몇몇 경우들에서, 접합은 항암제와 조건부 활성 폴리펩티드 사이의 비공유 결합, 예컨대 이온 결합일 수 있다.
접합된 항암제 분자 대 조건부 활성 폴리펩티드 분자의 비는 3:1 이하, 또는 4:1 이하, 또는 5:1 이하, 또는 6:1 이하이다. 일례에서, 항암제 대 조건부 활성 폴리펩티드의 비는 약 4:1이다.
투여에 사용될 용량은 다양한 매개변수에 따라 달리 조정될 수 있으며, 구체적으로는 사용된 투여 방식, 관련 병상, 또는 대안적으로 요망되는 치료 지속 기간에 따라 달리 조정될 수 있다. 약학 조성물을 제조하기 위해, 조건부 활성 폴리펩티드 또는 이 조건부 활성 폴리펩티드를 추가로 조작하여 얻어진 생성물 유효량만큼이, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질 중에 용해 또는 분산될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학 제형은 멸균 수용액 또는 수분산액; 담체, 예컨대 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜; 그리고 멸균 주사 용액이나 분산액을 즉석 제조하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 제형은 멸균되어야 하고, 쉽게 주사될 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 이는, 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 활동에 대해 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서의 조건부 활성 폴리펩티드 용액은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물 중에 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이것들의 혼합물, 그리고 오일 중에 제조될 수도 있다. 보통의 보관 및 사용 조건 하에서 이러한 제조물은 미생물의 성장을 막기 위한 보존제를 함유한다.
조건부 활성 폴리펩티드와, 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하여 제조된 생성물은 염 형태로서 조성물로 제형될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 (단백질의 유리 아미노기로 생성되고), 무기산, 예컨대 염화수소산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 주석산, 만델산 등으로 생성된 산 부가 염을 포함한다. 유리 카르복실기로 생성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철과, 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 및 프로카인 등으로부터 유래할 수도 있다.
담체는 또한, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이것들의 적합한 혼합물, 그리고 식물성 오일을 함유하는 분산 매질이나 용매일 수도 있다. 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴을 적용시키고, 분산액의 경우 요구되는 입도를 유지시키며, 계면활성제가 사용될 때 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물의 활동 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우, 등장제, 예컨대 당이나 염화나트륨이 포함되는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 이 조성물 중에 흡수 지연제, 예컨대 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 사용함으로써 달성될 수 있다.
멸균 주사용 용액은, 요구될 수 있는 바에 따라, 상기 나열된 기타 성분들 중 하나 이상과 함께 조건부 활성 폴리펩티드를 필요량만큼 적당한 용매에 혼입한 후 멸균 여과함으로써 제조된다. 일반적으로 분산액은, 다양한 멸균 활성 성분들을, 기본 분산 매질과 상기 나열된 것들로부터 선택된 기타 필요 성분들을 함유하는 멸균 비이클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로서는, 앞서 멸균 여과한 활성 성분과 임의의 요망 부가 성분의 용액으로부터 이 활성 성분과 임의의 요망 부가 성분의 분말을 만들어내는 진공 건조 기술과 동결 건조 기술이 있다.
더 농축되었거나 고도로 농축된 직접 주사용 용액의 제조도 또한 고려되는데, 이 경우 용매인 설폭시화디메틸(DMSO)의 사용은 매우 신속한 침투, 고 농도 활성 제제의 종양 소 구역으로의 전달을 달성할 것으로 예상된다.
제형시 용액은 투여 제형과 양립 가능한 방식, 그리고 치료적으로 유효한 양만큼 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여형, 예컨대 전술된 주사용 용액의 유형으로서 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등도 또한 사용될 수 있다.
수용액으로서의 비 경구 투여에 있어서, 예를 들어 용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 제일 먼저 충분한 염수나 글루코스와 등장성이 되어야 한다. 이와 같은 특정의 수용액은 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복막 내 투여에 특히 적합하다. 이와 연관하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명에 비추어 보았을 때 당 업자들에게 공지될 것이다. 예를 들어 1회 투여량은 등장성 NaCl 용액 1 ㎖ 중에 용해된 다음, 피하주입용 유체 1000 ㎖에 첨가되거나, 또는 주입 부위로서 제안된 부위에 주사될 수 있었다(예를 들어 문헌("Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580)을 참조한다). 치료 중인 대상체의 상태에 따라서 투여량에 약간의 변화가 반드시 있을 것이다. 투여를 책임지는 인력은 어떠한 경우에도 개인 대상체에 적당한 용량을 결정할 것이다.
본 조건부 활성 폴리펩티드와, 이 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하여 제조된 생성물은, 용량당 약 0.0001 내지 약 10.0 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 약 5 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 약 1 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 약 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 내지 약 1.0 밀리그램, 또는 심지어 약 10 밀리그램을 전달하도록 치료용 혼합물 중에 제형화될 수 있다. 다수 회분의 용량들은 또한 선택된 시간 간격을 두고 투여될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 본 출원에 개시된 질환 및 병태를 치료하기 위한 조건부 활성 폴리펩티드의 투여량 상한치는 대상체의 체액 1 ml 중 2.0 μg, 또는 더욱 바람직하게 대상체의 체액 1 ml 중 1.11 μg이다.
비 경구 투여, 예컨대 정맥 내 또는 근육 내 주사용으로 제형화된 화합물 이외에, 기타 약학적으로 허용 가능한 제형으로서는, 예컨대 정제 또는 기타 경구 투여용 고체; 경시 방출형 캡슐; 그리고 현재 사용되고 있는 기타 임의의 제형을 포함한다.
임의의 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드, 또는 조건부 활성 폴리펩티드를 추가로 조작하여 제조된 생성물의 숙주 세포로의 도입을 위해 리포좀 및/또는 나노입자의 사용이 고려된다. 제형과, 리포좀 및/또는 나노입자의 사용은 당업자들에게 공지되어 있다.
나노입자는, 일반적으로 화합물을 안정하고 재현 가능한 방식으로 포집할 수 있다. 세포 내 중합체 과부하로 인한 부작용들을 피하기 위해, 생체 내 분해될 수 있는 중합체가 사용되어, 보통 (크기 약 0.1 ㎛의) 초미세 입자가 디자인된다. 이러한 요구조건들을 충족하는 생분해성 폴리알킬시아노아크릴산염 나노입자가 본 발명에 사용되는 것이 고려된다.
리포좀은 수성 매질에 분산된 인지질들이 자발적으로 다층의 동심 이중층 소포(다층판형 소포(MultiLamellar Vesicle; MLV)라고도 지칭됨)를 형성함으로써 만들어진다. MLV의 직경은, 일반적으로 25 ㎚ 내지 4 ㎛이다. MLV의 초음파 처리는 직경이 200 Å 내지 500 Å의 범위이고, 코어(core)부에 수용액을 함유하는 소형의 단일층판형 소포(Small Unilamellar Vesicle; SUV)의 생성을 초래한다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 세기 및 이가 양이온의 존재에 의존적이다.
본원에 기술된 바와 같이, 조건부 활성 폴리펩티드, 또는 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하여 제조된 생성물을 함유하는 약학 제형은, 이 조건부 활성 폴리펩티드, 또는 조건부 화성 폴리펩티드를 조작하여 제조된 생성물과, 약학적으로 허용 가능한 선택적 담체 하나 이상이 혼합됨으로써 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 약학적으로 허용 가능한 담체들로서는 완충제, 예컨대 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 염화 옥타데실디메틸벤질암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당체, 이당체 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 칼레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염 형성 짝 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예컨대 Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 약학적으로 허용 가능한 예시적 담체로서는, 개재성 약물(insterstitial drug), 분산제, 예컨대 가용성 중성 활성화 히알루로니다아제 당단백(sHASEGP), 예컨대 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)를 추가로 포함한다. rHuPH20을 비롯하여 임의의 예시적 sHASEGP와, 이의 사용 방법은 미국 특허공보 제2005/0260186호 및 동 제2006/0104968호에 기술되어 있다. 하나의 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 합하여진다.
예시적 동결건조 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 WO 2006/044908에 기술된 것들을 포함하는데, 이것들 중 WO 2006/044908에 기술된 제형은 히스티딘-아세트산염 완충제를 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료중인 특정의 적응증에 필요한 활성 성분을 하나 초과하여 함유할 수도 있다. 바람직하게 서로 악영향을 미치지 않고, 상보적 활성을 가지는 성분들은 하나의 제형안에 합하여질 수 있다. 예를 들어 본 발명의 조건부 활성 항체, 항체 단편 또는 면역접합체 이외에, EGFR 길항제(예컨대 에를로티닙), 항 혈관신생제(예컨대 항 VEGF 항체일 수 있는 VEGF 길항제) 또는 화학요법제(예컨대 탁소이드 또는 백금 제제)를 제공하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 합하여져 적합하게 제공된다.
활성 성분은, 예를 들어 코아세르베이트화 기술 또는 계면 중합에 의하여 제조된 마이크로캡슐 안에 캡슐화될 수 있다. 예를 들어 콜로이드 약물 전달 계(예컨대 리포좀, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀전, 나노 입자 및 나노 캡슐) 또는 마크로에멀전 내 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크캡슐 및 폴리(메틸메타크릴산염) 마이크로캡슐 각각이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))에 개시되어 있다.
지속 방출 제제도 또한 제조될 수 있다. 이러한 지속 방출 제제의 적합한 예들로서는, 항체나 항체 단편을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 다만 이 매트릭스는 성형품, 예컨대 막 또는 마이크로캡슐의 형태를 가질 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 조건부 활성 폴리펩티드 2개 이상은 대상체 치료에서 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 이러한 치료 방법은 독성을 극적으로 줄여줄 수 있다.
다른 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 병용요법에 적합한 면역조정활성을 가진다. 예를 들어 이러한 조건부 활성 폴리펩티드는 전구약물과의 병용요법에 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드 자체는 전구약물 활성을 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 조건부 활성 폴리펩티드는 대상체에서 암을 진단하는데 사용될 수 있다. 조건부 활성 폴리펩티드는 대상체의 세포 또는 조직에 노출될 수 있는데, 이 경우 조건부 활성 폴리펩티드는 암 세포상 표적에 결합한다. 조건부 활성 폴리펩티드와 암 세포의 결합 여부는, 조건부 활성 폴리펩티드가 표지화되어 확인될 수 있다. 표지는 방사성제제 또는 형광단, 예컨대 피코에리트린 또는 플루오레세인 이소티오시안산염(플루오로이소티오시안산염 또는 FITC라고도 공지됨)일 수 있다. 세포 또는 조직과 조건부 활성 폴리펩티드의 접촉은 시험관 내에서 또는 대상체 신체 내부에서 이루어진다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 폴리펩티드, 또는 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하여 제조된 생성물은 기술된 질환들의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품을 제조하는데 사용될 수 있다. 제조품은 용기, 용기상에 있거나 용기와 합체되는 표지 또는 팩키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예컨대 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리나 플라스틱으로 제조될 수 있다. 용기는 본 조성물 자체, 또는 어떤 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 유효한 또 다른 조성물과 합하여진 조성물을 담으며, 멸균된 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚤릴 수 있는 마개를 가지는 정맥 내 투여 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성 제제는 본 발명의 조건부 활성 폴리펩티드이거나, 또는 본 발명의 조건부 활성 폴리펩티드를 추가로 조작하여 제조된 생성물이다. 표지나 팩키지 삽입물에는, 조성물이 특정의 병태를 치료하기 위해 사용됨이 기재되어 있다. 더욱이, 제조품은 (a) 내부에 조성물이 담긴 제1 용기(다만 이 조성물은 조건부 활성 폴리펩티드 또는 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하여 제조된 생성물을 포함함)와; (b) 내부에 조성물이 담긴 제2 용기(다만 이 조성물은 추가의 세포독성 또는 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 발명의 이와 같은 구현예에서 제조품은, 조성물이 특정의 병태를 치료하는데에 사용될 수 있음이 기재되어 있는 팩키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예컨대 주사용 정균수(BWFI), 인산염 완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기(또는 제3 용기)를 추가로 포함할 수 있다. 이는, 상업적으로나 사용자의 입장에서 요망되는 기타 물질들/부재들, 예컨대 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
제조품은 비 경구, 피하, 근육 내, 정맥 내, 관절강 내, 기관지 내, 복부 내, 낭 내, 연골 내, 강 내, 복강 내, 소뇌 내, 대뇌뇌실 내, 결장 내, 자궁경부 내, 위 내, 간 내, 심근 내, 골질 내, 골반 내, 심막 내, 복막 내, 흉막 내, 전립선 내, 폐 내, 직장 내, 신장 내, 망막 내, 척추 내, 활막 내, 흉 내, 자궁 내, 방광 내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비 내 또는 경피 전달 장치 또는 계의 부품으로서 용기를 선택적으로 포함할 수 있다.
본 조건부 활성 폴리펩티드, 또는 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하여 제조된 생성물은, 이 조건부 활성 폴리펩티드 또는 조건부 활성 폴리펩티드를 추가로 조작하여 제조된 생성물의 접촉, 또는 비 경구, 피하, 근육 내, 정맥 내, 관절강 내, 기관지 내, 복부 내, 낭 내, 연골 내, 강 내, 복강 내, 소뇌 내, 대뇌뇌실 내, 결장 내, 자궁경부 내, 위 내, 간 내, 심근 내, 골질 내, 골반 내, 심막 내, 복막 내, 흉막 내, 전립선 내, 폐 내, 직장 내, 신장 내, 망막 내, 척수 내, 활막 내, 흉 내, 자궁 내, 방광 내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비 내 또는 경피 투여로부터 선택되는 방식 적어도 하나에 의한 투여에 적합한 의료용 장치에 포함될 수 있다.
몇몇 추가 구현예들에서, 본 조건부 활성 폴리펩티드, 또는 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하여 제조된 생성물은, 이를 동결 건조 형태로 제1 용기에 포함하고, 선택적으로는 무균 수, 무균 완충 수, 또는 수성 희석제 중 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 페닐수은 아질산염, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘, 알킬파라벤, 염화펜잘코늄, 염화벤제토늄, 나트륨 데하이드로아세트산염 및 티메로살, 또는 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 보존제 적어도 하나를 제2 용기에 포함하는, 제1 용기와 제2 용기를 포함하는 키트에 포함될 수 있다. 하나의 양태에서, 키트 내 제1 용기 중의 조건부 활성 폴리펩티드 또는 조건부 활성 폴리펩티드를 조작하여 제조된 생성물의 농도는 제2 용기의 함유물이 사용되어 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 500㎎/㎖의 농도로 재구성된다. 또 다른 양태에서, 제2 용기는 등장제를 더 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 용기는 생리학적으로 허용 가능한 완충제를 더 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 모 단백질-단백질 매개 병태를 치료하는 방법으로서, 키트에 제공되었다가 투여 전 재구성되는 제형을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
이하 실시예들은 본 발명을 예시하는 것이지 제한하는 것은 아니다. 보통 당 분야에서 우연히 마주할 수 있으며 당 업자들에게 명백한, 다양한 조건과 매개변수에 관한 기타 적합한 수정과 적응은 본 발명의 범위에 포함된다.
실시예
조건부 활성 폴리펩티드를 제조하기 위한 실시예 1 ~ 5는, 본원에 참조로서 인용되어 있는 미국 특허 제8,709,755호(B2)에 기술되어 있다.
실시예 6: 항체 경쇄 또는 중쇄의 진화
항체 F1-10F10의 중쇄 및 경쇄를 CPE를 사용하여 별도로 진화시켰다. 경쇄 돌연변이체를 스크리닝하여 조건부 활성을 가지는 경쇄 돌연변이체 26개를 발견하였는데, 이 경우 돌연변이체는 pH 6.0에서 야생형보다 더 큰 활성을 보였고, 돌연변이체는 pH 7.4에서 야생형보다 더 작은 활성을 보였다. 26개의 경쇄 돌연변이체는 경쇄 내 8개의 상이한 위치에서 자체의 돌연변이가 발생하였다. 8개 위치 중 3개는 26개 경쇄 돌연변이체 중 5개 초과에서 나타났다. 이러한 3개의 위치는 경쇄 내 핫 스팟(hot spot)인 것으로 간주하였다. 중쇄 돌연변이체를 스크리닝하여 조건부 활성을 가지는 중쇄 돌연변이체 28개를 발견하였다. 28개의 중쇄 돌연변이체는 중쇄 내 8개의 상이한 위치에서 자체의 돌연변이가 발생하였다. 8개의 위치들 중 3개는 28개 중쇄 돌연변이체 중 5개 초과에서 나타났다. 이러한 3개의 위치는 중쇄 내 핫 스팟인 것으로 간주하였다. 경쇄 돌연변이체 및 중쇄 돌연변이체의 조건부 활성을 ELISA 검정으로 확인하였다.
본 실시예에서 생성된 최선의 조건부 활성 항체는 pH 7.4에서의 활성에 대한 pH 6.0에서의 활성 차이가 17 배였다. 또한, 조건부 활성 항체 다수는 정상 생리학적 pH인 pH 7.4 및 비정상 pH인 pH 6.0 사이의 pH에서 가역성이었던 활성을 가졌다. 흥미롭게도, 실시예로부터 생성된 조건부 활성 항체의 대부분은, 조건부 활성 항체의 활성이 ELISA 검정에 의해 pH 범위 5.0 내지 7.4에서 시험되었을 때, pH 약 5.5 내지 약 6.5에서 최적의 결합 활성을 보였다.
본 실시예에 의해 생성된 조건부 활성 항체의 활성을 또한 전세포가 사용되는 FACS(형광 활성화된 세포 분류) 검정에 의해 확인하였는데, 이 경우 pH 6.0 및 pH 7.4에서 항체의 항원을 발현하기 위해 CHO 세포가 사용되었다. 결합 활성을 측정하기 위해 조건부 활성 항체를 CHO 세포에 첨가하였다. FACS 검정은, pH 7.4에서의 조건부 활성 항체의 선택성에 비한 pH 6.0에서의 조건부 활성 항체의 선택성에 대한 ELISA 검정 결과에 있어서의 일반적인 경향을 확인하였다.
실시예 7: 특수 완충제 중 조건부 활성 항체의 선택
본 발명에 따라 진화 단계에서 제조된 돌연변이체 항체를 대상으로 정상 생리학적 pH인 pH 7.4에서, 그리고 비정상 pH인 pH 6.0에서 검정을 수행하였다. 상기 두 검정은, 인간 혈청 중에서 발견되는 중탄산염을 포함하는 인산염 완충 염수(PBS) 용액이 사용되어 수행되었다. 용액 중 중탄산염의 농도는 인간 혈청 중 중탄산염의 통상적인 농도(즉 생리학적 농도)였다. 동일하되 중탄산염은 함유하지 않는 PBS 용액을 사용하여 비교 시험을 수행하였다.
본 실시예에서 돌연변이 항체 또는 조건부 활성 항체에 대한 결합 활성을 측정하기 위한 검정은 다음과 같이 수행되었던 ELISA 검정이었다:
1. ELISA 수행 전날, 웰을 PBS와 함께 항체 Ab-A ECO his 태그(2.08 ㎎/㎖) 항원 100 ul(1 ug/㎖)로 코팅하였다.
3. 완충 용액을 항체 Ab-A-His 항원으로 코팅된 96웰 평판으로부터 털어내어 제거하였으며, 이 평판을 페이퍼 타올로 눌러 건조하였다.
4. 평판을 완충제 N 또는 PBS로 3회 세정하여였다.
5. 평판을 실온에서 1시간 동안 소정의 완충제 200 ul로 차단하였다.
6. 선택된 CPE/CPS 돌연변이체 및 야생형 단백질을 배치(layout)에 따라서 소정 완충 용액 75 ng/㎖로 희석하였다. 완충 용액의 pH는 6.0 또는 7.4 중 어느 하나로 설정하였다(이하 "지정 완충 용액"이라 칭함)
6. 완충제를 털어내어 제거하였으며, 평판 배치에 따라서 75 ng/㎖의 시료 100 ul를 각각의 웰에 첨가하였다.
7. 평판을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.
8. 완충제를 96웰 평판으로부터 털어내어 제거하였으며, 이 평판을 페이퍼 타올로 눌러 건조하였다.
9. 평판을 배치에 따라서 지정 완충 용액 200 ul로 총 3회 세정하였다.
10. 항-Flag HRP를 지정 완충 용액 중에 1:5000 희석률로 제조하였고, 항-Flag 호오스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP) 100 uL를 배치에 따라서 각각의 웰에 가하였다.
11. 평판을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.
13. 평판을 지정 완충 용액 200 ul로 총 3회 세정하엿다.
14. 평판을 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 50 ul로 1.5분 동안 전개하였다.
중탄산염을 함유하는 PBS 완충 용액 중에서의 검정 결과, 조건부 활성 항체 선택에 대한 성공률이 유의미하게 더 높았음이 발견되었다. 또한 중탄산염 함유 PBS 완충 용액이 사용되어 선택된 조건부 활성 항체는, pH 6.0에서 자체의 활성 대 pH 7.4에서 자체의 활성 비가 훨씬 더 커서, 유의미하게 더 큰 선택성을 제공하는 경향을 보였다.
또한, (중탄산염을 함유하는 PBS 완충 용액이 사용되어) 선택된 조건부 활성 항체가 중탄산염을 함유하지 않는 PBS 완충 용액 중에서 시험되었을 때, 조건부 활성 항체의 pH 7.0에서의 선택성에 비한 pH 6.0에서의 선택성은 유의미하게 감소하였음도 관찰되었다. 그러나, 중탄산염이 이 PBS 완충 용액에 생리학적 양으로 첨가되었을 때, 동일한 조건부 활성 항체의 선택성은 회복되었다.
다른 검정에서는, 선택된 조건부 활성 항체를 중탄산염이 첨가된 크렙스 완충 용액 중에서 시험하였다. pH 6.0에서의 활성 대 pH 7.4에서의 활성의 더욱 큰 비 또한 중탄산염이 첨가된 크렙스 완충 용액 중에서 관찰되었다. 이는, 크렙스 완충 용액 중 중탄산염의 존재로 말미암아 적어도 부분적으로 달성될 수 있는 것으로 보인다.
PBS 완충 용액 중 중탄산염의 농도가 중탄산염의 생리학적 농도 이하의 농도로 감소할 때, 정상 생리학적 pH인 pH 7.4에서의 조건부 활성 항체의 활성은 증가하였음이 관찰되었다. pH 7.4에서 조건부 활성 항체의 활성 증가는 PBS 완충 용액 중 중탄산염의 농도 감소와 관련되는 것으로 관찰되었다.
조건부 활성 항체에 대해 시험되었던, PBS 완충 용액 중 중탄산염의 농도와 동일한 중탄산염의 모든 농도에서 야생형 항체의 활성은 동일하게 유지되었음과 같이, 야생형 항체가 pH 7.4에서 검정되었을 때 이 야생형 항체는 PBS 완충 용액 중 중탄산염의 상이한 양에 의해 영향받지 않았다.
실시예 8: 상이한 완충제 중 조건부 활성 항체의 선택
본 발명에 따라 진화 단계에 의해 생성된 돌연변이 항체를 대상으로 정상 생리학적 pH인 pH 7.4에서, 그리고 비정상 pH인 pH 6.0에서 ELISA 검정을 수행하였다. 상기 두 ELISA 검정은, 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 크렙스 완충제 기반 완충제, 그리고 중탄산염과 BSA를 포함하는 PBS 완충제 기반 완충제를 비롯하여 상이한 완충제를 사용하여 수행하였다.
ELISA 검정은 다음과 같이 수행되었다:
1. ELISA 수행 전날, 웰을 코팅 완충제(탄산염-중탄산염 완충제)와 함께 항체 Ab-A ECO his 태그(2.08 ㎎/㎖) 항원 100 ul(1 ug/㎖)로 코팅하였다.
2. 완충 용액을 항체 Ab-A-His 항원으로 코팅된 96웰 평판으로부터 털어내어 제거하였으며, 이 평판을 페이퍼 타올로 눌러 건조하였다.
3. 평판을 20개 완충제 200 ul로 3회 세정하였다.
4. 평판을 실온에서 1시간 동안 20개 완충제 200 ul로 차단하였다.
5. 돌연변이체 및 키메라를 배치에 따라서 20개 완충제 중 75 ng/㎖로 희석하였다.
6. 완충제를 털어내어 제거하였으며, 희석된 시료 100 ul를 평판 배치에 따라서 각각의 웰에 첨가하였다.
7. 평판을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.
8. 완충제를 96웰 평판으로부터 털어내어 제거하였으며, 이 평판을 페이퍼 타올을 사용하여 눌러 건조하였다.
9. 평판을 20개 완충제 200 ul로 총 3회 세정하였다.
10. 항-Flag IgG HRP를 20개 완충제 중에 1:5000 희석률로 제조하였고, 항-Flag IgG HRP 용액 100 ㎕를 각각의 웰에 가하였다.
11. 평판을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.
12. 평판을 20개 완충제 200 ul로 총 3회 세정하였다.
13. 평판을 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 50 ul로 30초 동안 전개하였다.
중탄산염을 함유하는 PBS 완충 용액 중 검정을 이용하여 선택된 조건부 활성 항체는, 중탄산염을 함유하지 않는 PBS 완충 용액 중 검정을 이용하여 선택된 조건부 활성 항체와 비교되었을 때, pH 6.0에서의 활성 대 pH7.4에서의 활성 비가 훨씬 더 컸다. 또한 중탄산염이 첨가된 크렙스 완충 용액도 또한 중탄산염을 함유하지 않는 PBS 완충 용액과 비교되었을 때, 검정시 pH 6.0에서의 활성 대 pH7.4에서의 활성 비가 더 컸다. 중탄산염은 요망되는 조건부 활성 항체의 선택에 중요한 것으로 보인다.
실시예 9: 상이한 완충제 중 조건부 활성 항체의 선택
야생형 항체보다 pH 6.0에서 더 큰 활성을 보이고, 야생형 항체보다 pH 7.4에서 더 작은 활성을 보이는, 항원에 대한 조건부 활성 항체를 본 실시예에서 스크리닝하였다. 스크리닝 단계들을 이하 표 2 및 표 3의 완충제들을 사용하여 수행하였다. 표 2의 완충제들은 크렙스 완충제를 기반으로 하고, 표 2의 컬럼 1에 보인 바와 같은 추가의 성분들이 첨가된 것들이었다.
[표 2]
추가 성분들이 포함되고, PBS 완충제를 기반으로 한 일부 검정 완충제들은 이하 표 3에 보였다. 표 3및 표 4의 완충제들 중 성분들은 완충제 1 리터 중 첨가된 양(g)으로 제시되어 있다. 그러나, 인간 혈청 농도는 완충제의 10 wt.%이다.
[표 3]
이러한 검정 완충제들을 함유하는 ELISA 검정을 사용하여 스크리닝을 수행하였다. ELISA 검정은 실시예 7~8에 기술된 바와 같이 수행하였다. 10개 검정 완충제 각각에 대하여 선택된 조건부 활성 항체를 이하 표 4에 제시하였다. OD450 흡광도는 ELISA 검정에서의 결합 활성과 역으로 상관되어 있다.
[표 4]
선택된 조건부 활성 항체들 중 일부의 선택성은 완충제 8 및 9가 사용되어 확인되었으며, 이 항체들은 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 요망되는 선택성을 보였음이 발견되었다(도 1 참조). 상이한 완충제 사용은 조건부 활성 항체의 선택성에 영향을 미쳤음을 주목한다.
실시예 10. 상이한 완충제들 중 조건부 활성 항체의 활성
2개의 모노클로날 항체(모 항체로서 mAb 048-01 및 mAb 048-02)로부터 진화된 조건부 활성 항체의 활성을 상이한 완충제 2개 중에서 각각 측정하였다(도 2). 2개의 완충제는 인산염 완충제(조건 IV)와 크렙스 완충제(조건 I)였다. 6개의 조건부 활성 항체를 mAb 048-01: CAB Hit 048-01, CAB Hit 048-02, CAB Hit 048-03, CAB Hit 048-04, CAB Hit 048-05 및 CAB Hit 048-06로부터 진화시켰다. 3개의 조건부 활성 항체를 mAb 048-02: CAB Hit 048-07, CAB Hit 048-08 및 CAB Hit 048-09로부터 진화시켰다.
본 연구는, 조건부 활성 항체의 선택성(pH6.0에서의 검정에 있어 활성 대 pH7.4에서의 검정에 있어 활성의 비)은 검정에 사용된 완충제에 의해 영향을 받는다는 것을 보여주었다. 야생형 mAb 048-02로부터 진화된 조건부 활성 항체는, 인산염 완충제에서보다 크렙스 완충제에서 유의미하게 더 큰 선택성을 보였다(도 2).
실시예 11. 조건부 활성 항체 및 중탄산염의 선택성
실시예 10에서는 조건부 활성 항체의 선택성이, 인산염 완충제(조건 IV)에서보다 크렙스 완충제(조건 I)에서가 더 컸음이 관찰되었다. 이는, 실시예 10에서 관찰된, 더 큰 선택성에 가장 유의미하게 기여하는 것이 크렙스 완충제 중 성분임을 확인하는 것에 관한 것이었다. 하나의 조건부 활성 항체의 선택성을, 크렙스 완충제로부터 유래하되, 이로부터 다양한 성분들을 차례로 하나씩 배제한 완충제 중에서 다시 시험하였다(도 3, 좌측 막대 군). 완전 크렙스 완충제를 사용하였을 때, 조건부 활성 항체의 선택성은, pH 6.0/7.4에서의 활성비 약 8로서 컸다. 성분 A ~ F를 크렙스 완충제로부터 각각 배제하였을 때, 조건부 활성 항체의 선택성은 없어지진 않았지만, 조건부 활성 항체는 성분 C와 D 각각이 배제되었을 때 그 선택성이 줄어들었다. 그러나 성분 G(중탄산염)를 크렙스 완충제로부터 배제하였을 때, 조건부 활성 항체의 선택성은 완전히 없어졌다. 도 3을 참조한다. 이는, 중탄산염이 크렙스 완충제 중 조건부 활성 항체의 선택성을 높이는데 적어도 부분적으로나마 관여함을 말해주는 것이다.
그 다음, 상기 조건부 활성 항체의 선택성을, 중탄산염을 포함하지 않는 인산염 완충제(조건 IV) 중에서 측정하였는데, 이 때 이 인산염 완충제 중에서 조건부 활성 항체의 선택성은 완전히 없어지는 것이 관찰되었다. 중탄산염을 인산염 완충제에 첨가하였을 때, 조건부 활성 항체의 선택성 수준은, 크렙스 완충제 중에서 관찰되었던 수준으로 회복되었다. 이는, 중탄산염이 이 조건부 활성 항체의 선택성에 필요하다는 것을 확인시켜주는 것이다.
실시예 12: 중탄산염은 pH7.4에서의 결합을 억제한다
본 실시예는, 중탄산염 농도가 0에서 생리학적 중탄산염 농도(약 20 mM, 도 4)에 이르기까지 상이한 완충제 중에서, 3개의 조건부 활성 항체들(CAB Hit A, CAB Hit B 및 CAB Hit C)에 대한 pH 7.4에서의 결합 활성을 측정하는 것이다. 중탄산염 농도가 0에서 생리학적 농도에 이르기까지 증가함에 따라, 조건부 활성 항체 3개 모두는 pH 7.4에서 용량 의존적 방식으로 결합 활성이 감소하는 것이 관찰되었다(도 4). 다른 한편, 야생형 항체의 결합 활성은 중탄산염에 의해 영향받지 않았다. 이 연구는, pH 7.4에서, 중탄산염 존재시 조건부 활성 항체의 선택성은, 이 조건부 활성 항체와 중탄산염과의 상호작용으로 인한 이 항체 자체의 결합 활성 상실에 적어도 부분적으로 기인하였음을 보여주었다.
실시예 13: 상이한 완충제들 중 ROR2에 대한 조건부 활성 항체의 활성
ROR2에 대한 조건부 활성 항체로서, (실시예 9에 기술된 바와 같이) 중탄산나트륨을 함유하는 검정 용액을 사용하여 선택된 항체를 상이한 완충제 중에서 시험하였다: CAB-P는 pH 6.0 또는 7.4에서 사용되는 표준 인산염 염수 완충제(PBS 완충제)였고; CAB-PSB는 이 중탄산나트륨 15 mM이 보충된, pH 6.0 또는 7.4을 벗어난 PBS 완충제였으며; CAB-PSS는 황화나트륨 9수화물 10 mM이 보충된, pH 6.0 또는 7.4을 벗어난 PBS 완충제였다.
이러한 조건부 활성 항체의 활성을 하기 ELISA 프로토콜에 따라서 측정하였다:
1. ELISA 하루 전: 평판을, 4℃에서 PBS 중에 밤새도록 1 ug/㎖ 항원 100 ul로 코팅.
2. 이 평판을, 평판의 배치에 따라 CAB-P, CAB-PSB 또는 CAB-PSS 완충제 200 ul로 2회 세정.
3. 실온에서 1시간 동안 평판의 배치에 따라 CAB-P, CAB-PSB 또는 CAB-PSS 완충제 200 ul로 평판 차단.
4. 평판 배치에 명시된 바와 같이 CAB-P, CAB-PSB 또는 CAB-PSS 완충제로 항체 시료와 양성 대조군 희석.
5. 96웰 평판으로부터 차단 완충제를 털어내어 제거하고, 페이어 타올로 눌러 건조함.
6. 평판 배치에 따라, 희석된 항체 시료, 양성 대조군 또는 음성 대조군 100 ul를 각각의 웰에 첨가.
6. 평판을 실온에서 1 시간 동안 항온처리함.
7. 평판 배치에 따라서 CAB-P, CAB-PSB 또는 CAB-PSS 완충제 중 2차 항체 제조.
8. 완충제를 96웰 평판으로부터 털어내어 제거하고, 페이어 타올로 눌러 건조함.
9. 평판 배치에 따라서 CAB-P, CAB-PSB, 또는 CAB-PSS 완충제 200 ul로 총 3회 평판 세정.
10. 평판 배치에 따라서 CAB-P, CAB-PSB 또는 CAB-PSS 완충제로 희석된 2차 항체를 각각의 웰에 첨가함.
11. 평판을 실온에서 1시간 동안 항온처리.
12. 96웰 평판으로부터 완충제를 털어내어 제거하고, 페이어 타올로 눌러 건조함.
13. CAB-P, CAB-PSB, 또는 CAB-PSS 완충제로 총 3회 평판 세정.
14. 3,3', 5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질의 온도를 실온으로 만듦.
15. 평판으로부터 완충제를 털어내어 제거하고, 페이어 타올로 눌러 건조함.
16. 여기에 TMB 기질 50 ul 첨가.
17. 1N HC1 50 ul로 전개를 중지시킴. 전개 시간은 3분으로 하였음
18. OD450 ㎚에서 평판 판독기로 판독함.
이러한 조건부 활성 항체의 ROR2에 대한 활성을 도 7에 제시하였다. 조건부 활성 항체는 CAB-PSB 완충제 중 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 더 큰 활성을 보였는데, 즉 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 더 큰 선택성을 보였다. 몇몇 조건부 활성 항체들의 경우, 이러한 선택성은 CAB-P 완충제 중 없어졌거나 유의미하게 감소하였다. 그러나, 이 선택성은 또한 CAB-PSB 완충제 중 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 관찰되기도 하였다. 이와는 대조적으로, 야생형 항체는, 어떠한 완충제에서도 비교적 최소한의 선택성을 보였거나 아니면 아예 선택성을 보이지 않았다.
본 실시예는, 이황화물이 시험된, ROR2에 대한 조건부 활성 항체의 조건부 결합을 매개함에 있어서 중탄산염과 유사한 기능을 가짐을 입증하는 것이다.
실시예 14: 상이한 완충제 중 Axl에 대한 조건부 활성 항체의 활성
(실시예 9에 기술된 바와 같이) 중탄산나트륨을 함유하는 검정 용액들을 사용하여 선택된, Axl에 대한 조건부 활성 항체를, 실시예 13에 기술된 바와 같은 상이한 완충제, 즉 CAB-P, CAB-PSB 및 CAB-PSS 중에서 시험하였다. 이와 같이 Axl에 대한 조건부 활성 항체의 활성을, 실시예 13에 기술된 바와 동일한 ELISA 프로토콜을 이용하여 측정하여, 도 8에 제시하였다. CAB-PSB 완충제 중에서 본 조건부 활성 항체는 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 더 큰 활성을 보였는데, 즉 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 더 큰 선택성을 보였다. 이들 조건부 활성 항체에 대한 이러한 선택성은, CAB-P 완충제 중에서는 없어지거나 유의미하게 감소하였다. CAB-PSS 완충제 중 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 선택성이 관찰되었다. 이와는 대조적으로, 야생형 항체는 본질적으로 완충제 중 그 어떤 것에서도 선택성을 보이지 않았다.
본 실시예는 또한, Axl에 대해 시험된 조건부 활성 항체의 조건부 결합을 매개함에 있어 이황화물이 중탄산염과 유사한 기능을 가짐을 입증하는 것이다.
실시예 15: 항 Axl 항체에 의한 세포 사멸
A549 세포를 사용하여 몇몇 조건부 활성 항 Axl 항체의 세포 사멸 활성을 시험하였다. 세포 사멸 활성을 2가지의 pH 수준, 즉 pH 6.0 및 pH 7.4(각각 종양 미세환경 pH와 정상 생리학적 pH를 나타냄)에서 측정하였다. 다양한 항체 농도에서의 세포 사멸 %를 도 9a ~ 도 9e에 보였다.
상기 두 시험은 일관된 결과들을 제공하였다. 음성 대조군(항 Axl 인간화 WT)은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 A549 세포에 대해 유사한 세포 사멸 활성을 보였다(도 9a). 이와는 대조적으로 조건부 활성 항 Axl 항체는 pH 6.0에서, 특히 항체가 A549 세포를 포화시키지 않았던 낮은 항체 농도일 때, pH 7.4에서의 세포 사멸 활성에 비하여 유의미하게 더 큰 세포 사멸 활성을 보였다(도 9b ~ 9e).
실시예 16: 항 Axl 항체의, 사이노-Axl과의 결합 친화성
PBS 및 크렙스 완충제 중 pH 6.0 및 pH 7.4에서 조건부 활성 항 Axl 항체의, 사이노-Axl과의 결합 친화성을 측정하고, 인간 Axl(hAxl)과의 결합 친화성과 비교하였다(도 10a ~10d). 사이노-Axl은 인간 이외의 영장류, 즉 사이노몰거스 마카쿠스 원숭이로부터 유래하는 Axl 단백질이다.
음성 대조군(BA-3831-WT)은 PBS 및 크렙스 완충제 중 pH 6.0 및 pH 7.4 둘 다에서 인간 Axl(hAxl)과 사이노몰거스 Axl(사이노-Axl) 둘 다에 대해 유사한 결합 친화성을 보였다(도 10a). 조건부 활성 항 Axl 항체는 pH 7.4에서, pH 6.0에서의 사이노-Axl에 대한 결합 친화성에 비하여 더 작은 결합 친화성을 보였다(도 10b ~ 10d). PBS 완충제 중에는 중탄산염 이온이 없었던 관계로, PBS 완충제 중 pH 6.0 및 pH 7.0에서의 결합 친화성들 간 차이는 유의미하지 않았다.
실시예 17: 듀오마이신에 접합된 항 Axl 항체의 세포독성
듀오마이신은 단백질 합성을 중단시킴으로써 세포 성장을 억제하므로 세포독성이다. 조건부 활성 항 Axl 항체들 중 하나인 BAP063.94007을 듀오마이신에 접합시켰다. 이 시험에서는 음성 대조군 2개, 즉 BAP063 hum WT(BAP063.9 4007의 기원인 야생형 항 Axl 항체) 및 B12(항 B12 항체)(이것들 둘 다 또한 듀오마이신에 접합시킴)를 사용하였다.
pH 6.0 및 pH 7.4에서 몇몇 세포주를 듀오마이신 접합 항체 3가지(BAP063.94007, BAP063 hum WT 및 B12)로 처리하였다(도 11a ~ 11h). 듀오마이신 접합 항체 BAP063.94007은 pH 6.0에서, pH 7.4에서의 세포주 DU145(전립선암 세포), MDA-MD-231(유방암 세포), PL45(췌장암 세포) 및 A549(선암종 세포)에 대한 세포독성에 비하여, 이들 세포주에 대하여 유의미하게 더 큰 세포독성을 보였다. 다른 한편, 음성 대조군은 pH 6.0 및 pH 7.4 사이에서 세포독성에 차이를 보이지 않았다.
실시예 18: 모델 독소에 접합된 항 Axl 항체
조건부 활성 항 Axl 항체를 모델 독소(예컨대 듀오마이신)에 접합시켜, 조건부 활성 항체-약물 접합체(CAB-Axl-ADC)를 제조하였다. 처음에 CAB-Axl-ADC를 시험하여 조건부 세포 사멸 활성이 약물 접합 방법에 의해 변경되지 않았음을 확인하였다. 이 시험은, CAB-Axl-ADC가 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 유의미하게 더 많은 세포를 사멸하였음을 보여주었다(도 12).
그 다음, CAB-Axl-ADC를 MiaPaCa2 이종이식편 종양을 보유하는 마우스에 1 mg/kg 용량으로 매주 2회씩 총 3주 동안 주사하였다. 몇몇 대조군, 예컨대 나출된(naked) CAB(접합시키지 않은 동일 항 Axl 항체), 비이클, 독소(겜시타빈) 단독 주사, 대조군 ADC(종양 세포와 결합하지 않는 항체에 접합된 듀오마이신), 그리고 듀오마이신과 친화성 매칭(affinity matching) 항 Axl ADC(AM-ADC)을 본 연구에서 사용하였다. 본 연구는, CAB-Axl-ADC(CAB-ADC)와 듀오마이신, 그리고 AM-ADC와 듀오마이신이 대조군들에 비하여 종양 크기의 유의미하게 더 큰 감소를 제공하였음을 보여주었다(도 13). 독소 단독 주사 또는 비이클 단독 주사 그 어느 경우도 종양의 크기를 줄이지 못하였다. 이 연구는, 독소에 접합된 조건부 활성 항 Axl 항체가 친화성 매칭 항체(AM-ADC)로서 종양 크기를 줄이는데 유효함을 보여준다.
실시예 19: 사이노몰거스 마카쿠스 원숭이에 있어서 항 Axl 항체 약물 접합체의 혈청 중 농도
조건부 활성 항 Axl 항체(CAB-ADC)의 약물(듀오마이신) 접합체를 수컷 및 암컷 사이노몰거스 마카쿠스 원숭이에 3가지 용량, 즉 0.1 mg/kg, 1 mg/kg 및 10 mg/kg으로 주사하였다. 비접합 항 Axl 항체를 대조군으로 사용하였다. 친화성 매칭 항체 약물 접합체(AM-ADC)도 또한 대조군으로 사용하였다. (CAB-ADC)의 혈청 중 농도를 1주일(168시간)의 기간에 걸쳐 측정하였다(도 14a 및 도 14b 참조). CAB-ADC는 AM-ADC 대조군보다 더 오랫동안 원숭이 혈청 중에 지속적으로 존재하였다(도 14b). 수컷 원숭이와 암컷 원숭이 간에는 유의미한 차이가 없었다(도 14a 및 도 14b).
실시예 20: 사이노몰거스 마카쿠스 원숭이에 있어서 항 Axl 항체 약물 접합체의 독성
사이노몰거스 마카쿠스 원숭이에서 CAB-ADC의 독성을 시험하였다. 아스파르트산염 아미노기전이효소(AST) 및 알라닌 아미노기전이효소(ALT)는 식품의약국(FDA)에 의해 약물 간독성 지표로서 사용되어 왔다. 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이 둘 다에서 혈청 중 AST 수준 및 ALT 수준을 측정하였다(도 15a 및 도 15b). 비이클(PBS)은 혈청 중 AST 수준 및 ALT 수준의 변화를 유발하지 않았던 반면에, 매칭 항체 약물 접합체(AM-ADC)와 듀오마이신은 매우 높은 AST 수준 및 ALT 수준을 보였다. CAB-ADC는 AM-ADC 대조군에 비하여, 유의미하게 감소한 AST 수준 및 ALT 수준을 보였다. 이 점은, 본 발명의 항 Axl 항체 약물 접합체가 매칭 항체 약물 접합체 AM-ADC에 비하여 유의미하게 감소한 간 독성을 보임을 나타낸다.
듀오마이신과 CAB-ADC는 또한 원숭이에 있어서 염증을 덜 유발시키는 것으로 확인되었다(도 16). CAB-ADC, AM-ADC 및 PBS 주사 후 원숭이의 혈액 내 림프구를 수집하여 이것의 갯수를 계수하였다. 원숭이에서 유의미한 염증을 유발시켰던 AM-ADC와는 대조적으로, CAB-ADC는 오로지 경증의 염증만을 유발시켰다.
실시예 21: 모델 독소에 접합된 항 Ror2 항체
조건부 활성 항 Ror2 항체를 모델 독소(예컨대 파클리탁셀)에 접합시켜, 조건부 활성 항체-약물 접합체(Ror2-CAB-ADC)를 제조하였다.
이종이식 마우스를 제조하기 위해 MDA-MB-436 종양 세포를 주입하여 마우스에서 종양을 유도하였다. 그 다음, Ror2-CAB-ADC를 이종이식편이 주입된 마우스에 0.3 mg/kg 또는 1 mg/kg의 용량으로 1주일에 1회씩 총 2주 동안 주사하였다. 본 연구에 사용된 대조군들은 비이클로서 PBS 완충제와, 독소(파클리탁셀)만을 포함하였다. 본 연구는, Ror2-CAB-ADC가 대조군들에 비하여, 종양 크기의 유의미하게 더 큰 감소를 제공하였음을 보여주었다(도 17a ~ 17c). 0.3 mg/kg 투여군에 대한 결과들을 도 17b에 제시하였으며, 1 mg/kg 투여군에 대한 결과들을 도 17c에 제시하였다. 본 연구는, 독소에 접합된 조건부 활성 항 Ror2 항체가 마우스에 있어서의 종양 크기 감소에 유효함을 보여주었다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태를 나타내는 "하나", "하나의", 그리고 "상기"는 복수의 인용대상들을 포함하는 것임이 주목되어야할 것이다. 또한, "하나"(또는 "하나의"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나"라는 용어는 본원에서 호환되어 사용될 수 있다. "~를 포함하는(comprising)", "~를 포함하는(including)", "~를 가지는" 및 "~로부터 구성된"이라는 용어도 또한 호환되어 사용될 수 있다.
달리 명시되지 않으면, 명세서 및 청구의 범위에 사용된 성분의 양, 예컨대 분자량, 퍼센트, 비, 반응 조건 등과 같은 특성 등을 표현하는 모든 수치는, 모든 경우 ("약"이라는 용어가 존재하건 존재하지 않건 간에) 이 "약"이라는 용어에 의해 변경되는 것으로 이해되어야 한다. 그러므로, 달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구의 범위에 제시된 수치 매개 변수는 본 발명에 의해 얻고자 하는 요망 특성에 따라서 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 청구 범위에 균등론의 적용을 제한하려는 시도가 아닌 것으로서, 각각의 수치 매개변수는 적어도 보고된 유의미한 숫자들의 수를 고려하고, 통상의 반올림 기법을 적용하여 해석되어야할 것이다. 수치 범위와 본 발명의 넓은 범주를 제시하는 매개변수들이 근사치임에도 불구, 특정 예에 제시된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 원래, 그 각각의 시험 측정치에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 기인하는 임의의 오차들을 포함한다.
본 명세서에 개시된 각 구성 요소, 화합물, 치환기 또는 매개변수는 단독 사용, 또는 본 명세서에 개시된 또 다른 구성 요소, 화합물, 치환기 또는 매개변수 각각 및 모두 중 하나 이상과의 조합 사용에 대해 개시되는 것으로 해석되어야 함이 이해될 것이다.
본 명세서에 개시된 각각의 구성 요소, 화합물, 치환기 또는 매개 변수에 대한 각각의 양/수치 또는 양/수치 범위는, 본 명세서에 개시된 임의의 기타 구성 요소(들), 화합물(들), 치환기(들) 또는 매개 변수(들)에 대해 개시된 각각의 양/수치 또는 양/수치 범위와 함께 개시되는 것으로 해석되어야 할 것임과, 본 명세서에 개시된 2개 이상의 구성 요소(들), 화합물(들), 치환기(들) 또는 매개 변수(들)에 대한 양/수치 또는 양/수치 범위의 임의의 조합도 또한 본 명세서의 목적을 위해 개시되기도 함도 또한 이해되어야 할 것이다.
또한 본 명세서에 개시된 각각의 범위는 유의미한 숫자와 동일한 값을 가지는, 개시된 범위 내 각각의 특정 수치에 관한 개시로서 해석되어야 함도 추가로 이해된다. 그러므로 1 ~ 4의 범위는 수치 1, 2, 3 및 4의 분명한 개시로서 해석되어야한다. 또한 본 명세서에 개시된 각각의 범위 중 각각의 하한은, 동일한 구성 성분, 화합물들, 치환기 또는 매개변수에 대해 본 명세서에 개시된 각각의 범위의 각각의 상한 및, 각각의 범위 내 각각의 특정 수치와 함께 개시되는 것으로 해석되어야 함도 추가로 이해된다. 따라서, 본 발명은 각각의 범위의 각각의 하한과, 각각의 범위의 각각의 상한 또는 각각의 범위 내 각각의 특정 수치를 조합하거나, 또는 각각의 범위의 각각의 상한과, 각각의 범위 내 각각의 특정 수치를 조합함으로써 도출되는 모든 범위의 개시로서 해석되어야 한다.
또한, 본 명세서 또는 실시예에 개시된 구성 성분, 화합물, 치환기 또는 매개변수의 특정 양/수치는 어떤 범위의 하한 또는 상한 중 어느 하나의 개시로서 해석되어야 하므로, 본 출원의 어느 곳에 개시된 동일 구성 성분, 화합물, 치환기 또는 매개변수에 대한 범위 또는 특정 양/수치의 기타 임의의 하한 또는 상한과 조합되어 이 구성 성분, 화합물, 치환기 또는 매개변수에 대한 어떤 범위를 이룰 수 있다.
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그러나, 본 발명의 다수 특징 및 이점이 전술된 본 발명의 설명에 제시되어 있긴 하지만, 본 발명의 기능과 구조에 관한 세부 설명과 함께 본 발명은 오로지 예시를 위한 것으로서, 특히 본 발명의 원리에 속하는 부분들의 형태, 크기 및 배열의 문제에 있어서의 변화는, 첨부된 청구항에 표현된 용어들의 일반적인 넓은 의미들에 의해 지정되는 최대한도로 세부적으로 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
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100 105 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Human <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic sequence <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Ala 20 25 30 Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly 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Val Thr Val Ser Ser 115 120

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  55. 모 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편으로부터 조건부 활성 항체 또는 항체 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    i. 돌연변이 DNA를 제조하기 위해, DNA 중 하전된 아미노산 잔기의 코돈의 총 수를 증가시키는 것, DNA 중 비하전 아미노산 잔기의 코돈의 총 수를 감소시키는 것, 그리고 이의 조합으로부터 선택되는 한 가지 이상의 기술을 사용하여 모 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편의 순 전하가 증가하도록 모 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 DNA를 진화시키는 단계;
    ii. 돌연변이 항체 또는 항체 단편을 수득하기 위해, 상기 돌연변이 DNA를 발현시키는 단계; 및
    iii. 제1 검정시 제1 pH 값에서 가역적으로 비활성화되고
    제2 검정시 제2 pH 값에서의 동일 활성에 비해 제1 검정시 제1 pH 값에서 활성의 감소를 보이는 돌연변이 항체들 또는 항체 단편들로부터 조건부 활성 항체 또는 항체 단편을 선택하는 단계
    를 포함하고, 상기 하전된 아미노산 잔기는 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 리신 및 히스티딘으로부터 선택되는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 진화 단계는 부위 유도성 돌연변이유발을 이용하고, 상기 부위 유도성 돌연변이유발은 올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발로부터 선택되는 방법.
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  58. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 진화 단계는 하전된 아미노산 잔기의 하나 이상의 코돈을 DNA에 도입하는 과정을 포함하는 방법.
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  61. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 진화 단계는 하전된 아미노산 잔기의 하나 이상의 코돈을 DNA에 도입하는 과정을 포함하고, 상기 하전된 아미노산 잔기는 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 선택되는 방법.
  62. 제58항에 있어서, 상기 하나 이상의 코돈은 모 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편의 활성 부위를 암호화하는 DNA 영역에 도입되는 방법.
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  64. 제58항에 있어서, 상기 하나 이상의 하전된 아미노 잔기는 모 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편의 활성 부위 외부 영역에 도입되는 방법.
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  68. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 제1 검정 및 제2 검정은 알부민을 포함하는 검정 용액 중에서 수행되는 방법.
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  70. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 제1 검정 및 제2 검정은 혈청의 부재 하에 검정 용액 중에서 수행되는 방법.
  71. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 제1 pH 값은 대상체에 조건부 활성 항체 또는 항체 단편이 투여되는 부위, 또는 조건부 활성 항체 또는 항체 단편이 작용하는 대상체 내 부위의 장기 또는 조직에 있어서의 생리학적 조건의 정상 범위 안에 있는 정상 생리학적 pH 값이고, 상기 제2 pH 값은 조건부 활성 항체 또는 항체 단편이 투여되는 부위, 또는 조건부 활성 항체 또는 항체 단편이 작용하는 부위의 장기 또는 조직에 있어서의 생리학적 조건의 정상 범위에서 이탈한 비정상 pH 값인 방법.
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  75. 제55항 또는 제56항에 있어서, 활성은 항원에 대한 결합 활성인 방법.
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  79. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 선택 단계는 친화성, 발현 수준 및 인간화로부터 선택되는 특성을 기반으로 조건부 활성 항체 또는 항체 단편을 선택하는 과정을 추가로 포함하는 방법.
  80. 삭제
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  82. 제61항에 있어서, 상기 하나 이상의 코돈은 모 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편의 활성 부위를 암호화하는 DNA 영역에 도입되는 방법.
  83. 제61항에 있어서, 상기 하나 이상의 하전된 아미노 잔기는 모 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편의 활성 부위 외부 영역에 도입되는 방법.
  84. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 진화단계는 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기를 상기 모 항체, 단일쇄 항체 또는 항체 단편의 상보성 결정 영역에 도입하기 위해 DNA를 진화시키는 과정을 포함하는 방법.
  85. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 하전된 아미노산 잔기는 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌 및 리신으로부터 선택되는 방법.
  86. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 제1 pH값의 범위는 pH 7.2~7.6 이고, 제2 pH 값의 범위는 pH 5.8~7.0인 것을 특징으로 하는 방법.
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