KR102578480B1 - 항원에 노출된 cd8 t 세포의 활성화 및 증식 방법 그리고 그에 의해 제조된 항암 활성이 강화된 cd8 t 세포 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 활성화 방법 및 그에 의해 활성화된 세포 및 그의 용도에 것으로서, 보다 구체적으로는 개체에서 분리된 CD8 T 세포, 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 또는 상기 CD8 T 세포를 유전적으로 형질전환한 CAR-CD8 T세포 등에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 상기 탈진 단계 CD8 T 세포의 기능 향상, 회복 및 증식 방법, 상기 방법에 의해 Klf4 단백질이 과발현되어 항암 활성이 강화된 CD8 T 세포 및 그의 용도를 제공한다.

Description

항원에 노출된 CD8 T 세포의 활성화 및 증식 방법 그리고 그에 의해 제조된 항암 활성이 강화된 CD8 T 세포 및 그의 용도{A method of activating and proliferating exhausted CD8 T cells, CD8 T cells with enhanced activity prepared by the same, and use thereof}
본 발명은 세포 증식과 활성화 방법 및 그에 의해 활성화된 세포 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 항원에 만성적으로 노출된 CD8 T 세포의 활성화와 증식 방법 및 그에 의해 제조된 항암 활성이 강화된 CD8 T 세포 및 그의 용도에 관한 것이다.
종양 조직 내에 존재하는 CD8 T 세포는 암세포의 항원을 인지하여 활성화된 후 그랜자임 B(Granzyme B), 인터페론-감마(IFN-γ), 퍼포린(Perforin)과 같은 활성 사이토카인(Effector Cytokine)들을 분비함으로써 암세포를 제거하는 기능을 가지고 있다. 따라서, 종양 조직 내의 CD8 T 세포의 활성을 높여준다면 효과적으로 암을 제어할 수 있을 것이다. 하지만 일반적인 면역반응과는 달리 암이라는 특수한 환경에서는 이 면역세포들이 암 항원에 지속적으로 노출되면서 그 특성이 변화되어, 이들의 활성을 제어하는 것은 훨씬 더 어려운 것으로 알려져 있다.
암 환경 내에서는, 지속해서 존재하는 암세포 항원의 만성적인 자극에 의해 CD8 T 세포에서 탈진현상(Exhaustion)이 일어나게 된다. 이렇게 탈진된 CD8 T 세포는 정상적인 활성 사이토카인 분비 및 세포분열 기능이 약화되어 정상적인 면역반응을 수행하지 못하여 암세포를 효율적으로 제거하지 못하게 된다. 특히, 이렇게 탈진된 CD8 T 세포는 시간이 지나더라도 다시 정상적인 기능을 가지는 세포로 쉽게 돌아가지 못하는 특성을 가진다. 따라서, 종양 조직 내 CD8 T 세포의 탈진현상을 막고, 탈진된 세포의 기능을 활성화는 것이 암을 제어할 수 있는 핵심적 요소라 할 수 있다. 최근의 연구결과로 항원에 지속적으로 노출된 CD8 T 세포는 몇 단계의 탈진과정을 거치는 서브셋 세포그룹으로 구성되어 있는 것이 알려졌다 ; 만성전구세포 서브셋(탈진전구세포 1, 탈진전구세포 2), 만성효과기세포 서브셋(중간탈진세포) 및 말기탈진세포 서브셋(말기탈진세포) 등이다. 이 들 중 만성효과기세포는 암세포를 인식하여 제거하는 효과기 기능을 가지고 있으나, 말기탈진세포는 그 기능을 상당 부분 상실한 상태로 알려져 있다. 일반적으로, 암 조직에 존재하는 CD8 T 세포들은 대부분 말기탈진상태에 있어 면역 기능이 제대로 작동하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, 암세포에 특이적인 CD8 T 세포에서 만성효과기세포로의 발생 및 기능을 촉진시키는 방법을 개발한다면 이를 암세포 제어에 효과적으로 활용할 수 있을 것이다.
CD8 T 세포를 이용한 항암 치료와 관련하여 미국 특허 US8106092는 2차 암을 가진 개체에 국소적 및/또는 종양내로 ingenol-3-angelate를 투여함으로서 암세포의 일차적 괴사를 유도하고 CD8 T 세포와 같은 항암-특이적 T 세포의 생성을 촉진하는 2차암의 치료방법이 개시되어 있고, 미국 특허공개공보 US20190218515A는 암환자로부터 분리된 T 세포를 암세포와 CD123/CD3에 대한 이중 특이성 항체, CD19/CD3에 대한 이중 특이성 항체 또는 EpCAM/CD3에 대한 이중 특이성 항체와 함께 반응시켜 활성화된 T 세포를 생산하는 방법이 개시되어 있다.
한편, T 세포치료제는 현재까지 3세대까지 개발되고 있는데 제1세대 T 세포치료제는 혈액 또는 암 조직 내 존재하는 모든 T 세포(bulk T cells)를 증식시켜 환자에게 투여하였기 때문에 암세포에 대한 특이성이 낮아 효력을 기대할 수 없었고, 제2세대 T 세포치료제는 종양 항원 특이적 T 세포만(Ag-specific T cells)을 분리/대량 배양하여 암 환자에게 투여하는 방법으로 증진된 치료 효과를 보였으나, 배양기간이 길고 공정이 복잡하다는 문제가 대두되었으며, 제3세대 T 세포치료제는 1) 특정 암항원을 인식하는 TCR 유전자를 T 세포에 직접 도입하거나, 2) 특정 항원을 인식하는 단클론항체의 항원인식부위(scFv)에 T세포 활성화 도메인(T cell activation domain)을 결합시켜 T 세포에 도입함으로써, 항원 특이성을 높이고 제조기간을 단축하였을 뿐 아니라, 그 치료 효능 또한 매우 뛰어나 일부 백혈병 및 림프종에서 100%에 가까운 치료 효과를 유도하였다. 이중 두 번째 형태의 제3세대 T 세포치료제는 이른바 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, 이하, 'CAR'라고 약칭함)를 발현하도록 유전자조작된 것을 특징으로 하고 있다.
상기 CAR 도입 T 세포 기술을 기반으로 가장 앞서가고 있는 기업은 미국의 Novartis, Juno Therapeutics사 그리고 Kite Pharma사로 모두 B 세포 특이 항원인 CD19를 표적화하는 CAR 도입 T 세포를 개발하였으며, 저항성/재발성 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 비호지킨 림프종(NHL)에서 80 내지 90%에 육박하는 높은 치료율을 보여 표적지향성 면역세포치료제 분야의 선두주자로 자리매김하고 있다(Hartmann et al., EMBO Mol. Med. 9(9): 1183-1197, 2017)으며, 최근 한국노바티스㈜가 허가 신청한 세계 최초 키메라 항원 수용체 T세포(CAR-T) 치료제 '킴리아주(티사젠렉류셀)'를 「첨단재생바이오법」에 따른 제1호 첨단바이오의약품으로 허가된 바 있다.
그러나, 상기 선행기술들 역시 체내에서 CD8 T 세포가 탈진되는 현상을 고려하지 않아 이들 특정화된 세포를 활용하거나, 이 상태를 극복하는 것을 목표하고 있지 않다는 한계점을 가지고 있다.
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, CD8 T 세포의 생체 내 탈진과정을 조절하여 암을 제어할 수 있는 방법 및 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 상기 목적에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, a) 개체에서 분리된 CD8 T 세포, b) 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 및 c) 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 CD8 T 세포의 탈진 상태 억제 방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, a) 개체에서 분리된 CD8 T 세포, b) 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 및 c) 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 CD8 T 세포의 면역반응 강화방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, a) 개체에서 분리된 CD8 T 세포, b) 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 및 c) 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 CD8 T 세포의 증식 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, Klf4 단백질이 과발현되도록 형질전환된 형질전환 CD8 T 세포 또는 Klf4 단백질 및 키메라 항원 수용체가 과발현되도록 형질전환된 형질전환 CAR-CD8 T 세포를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, Klf4 단백질이 과발현되도록 형질전환된 형질전환 CD8 T 세포가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 외래성 Klf4 단백질 및 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)가 발현되도록 형질전환된 형질전환 CAR-CD8 T 세포가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 형질전환 CD8 T 세포 또는 형질전환 CAR-CD8 T 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 암에 걸린 개체에서 분리된 CD8 T 세포 또는 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계; 및 Klf4 단백질이 과발현된 CD8 T 세포 또는 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 방법은 면역세포의 탈진현상을 방지함으로써 보다 효율적인 항암 세포치료제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 CD8 T 세포에 대한 항원의 반복자극 시험의 설계를 개략적으로 나타내는 개요도이고, 도 1b는 상기 도 1a의 실험 설계에 따라 수행된 실험결과로서 항원의 자극 정도에 따른 CD8 T 세포의 탈진 상태에 관한 마커인 Tox(좌측) 및 Klf4(우측)의 mRNA 수준에서의 발현 정도를 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프이며, 도 1c는 생쥐에 MC38 대장암 세포를 주입하여 유발된 암조직 및 비장에 존재하는 여러 단계의 CD8 T 세포 서브셋들에 대한 마커 표현형을 나타내는 개요도이고, 도 1d는 이들 CD8 T 세포 각 서브셋의 Klf4 단백질 발현 정도를 mRNA 수준에서 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, 대조군 레트로바이러스 벡터(MigRI)로 형질전환된 CD8 T 세포 또는 Klf4 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터(Klf4) 로 형질전환된 CD8 T 세포의 특성을 분석한 것이다. 도 2a는 대조군(MigRI) 과 Klf4 유본 발명의 일 관점에 따르면, 개체에서 분리된 CD8 T 세포, 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 또는 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 상기 CD8 T 세포의 탈진 상태 억제 방법이 제공된다.전자로 형질전환된 CD8 T 세포들을 앞서 언급된 서브셋들의 마커를 이용하여 FACS 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 2b는 대조군(MigRI) 과 Klf4 유전자로 형질전환된 CD8 T 세포와 타겟암세포를 함께 배양하였을 때, 죽어있는 암세포의 비율을 FACS 분석을 통해 분석한 결과에 대한 그래프이다. 도 2c는 대조군(MigRI)과 Klf4 유전자로 형질전환된 CD8 T 세포에서의 Klf4(좌측) 및 Tox(우측)의 유전자 발현수준을 mRNA 수준에서 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2d는 대조군(MigRI) 및 Klf4 유전자로 형질전환된 CD8 T 세포(Klf4)에서의 그랜자임 B의 발현 정도를 FACS 분석으로 분석하여 각 세포들(MigRI GFP-, MigRI GFP+, Klf4 GFP-, Klf4 GFP+)에서 CD8 T세포의 표적세포 살해 기능에 핵심적인 그랜자임 B를 발현하는 세포의 비율을 측정한 결과에 대한 그래프(좌측) 및 2차원 히스토그램(우측)를 나타내고, 도 2e는 대조군(MigRI) 및 Klf4 유전자로 형질전환된 CD8 T 세포의 기능에 핵심적인 IFN-γ의 발현 정도를 FACS 분석으로 분석하여 각 세포들(MigRI GFP-, MigRI GFP+, Klf4 GFP-, Klf4 GFP+)에서 IFN-γ를 발현하는 세포의 비율을 측정한 결과에 대한 그래프(좌측) 및 2차원 히스토그램(우측)를 나타낸다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 Klf4 유전자가 형질도입된 CD8 T 세포를 이용한 동물실험의 투여 스케쥴을 개략적으로 도시한 개요도이고, 도 3b는 대조군과 Klf4 유전자가 형질도입된 CD8 T 세포의 Klf4 유전자의 발현수준을 mRNA 수준으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 3c는 대조군(MigRI) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 Klf4 유전자가 형질도입된 CD8 T 세포가 투여된 암 모델 동물에서의 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3d는 상기 동물실험 후 희생된 동물의 종양조직에서 분리된 CD8 T 세포 서브셋들에서 세포분열 정도를 나타내는 Ki-67 발현 정도를 FACS 분석으로 분석한 것으로, 분리된 CD8 T 세포의 마커 표현형에 따른 전체 CD8 T 세포 중 Ki-67 발현 세포의 비율을 측정한 결과에 대한 그래프(좌측) 및 2차원 히스토그램(우측)을 나타낸다. 도 3e는 상기 동물실험 후 희생된 동물의 종양조직에서 분리된 CD8 T 세포의 그랜자임 B 발현 정도를 FACS 분석으로 분석하여 분리된 CD8 T 세포의 마커 표현형에 따른 전체 CD8 T 세포 중 그랜자임 B 발현 세포의 비율을 측정한 결과에 대한 그래프(좌측) 및 2차원 히스토그램(우측)을 나타내며, 도 3f는 상기 동물실험 후 희생된 동물의 종양조직에서 분리된 CD8 T 세포의 TNF-α 및 INF-γ 발현 정도를 FACS 분석으로 분석하여 분리된 CD8 T 세포의 마커 표현형에 따른 전체 CD8 T 세포 중 TNF-α 및 INF-γ 발현 세포의 비율을 측정한 결과에 대한 그래프(좌측) 및 2차원 히스토그램(우측)을 나타낸다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 APTO-253이 처리된 CD8 T 세포를 이용한 동물실험의 투여 스케쥴을 개략적으로 도시한 개요도이고, 도 4b는 대조군(PBS)과 APTO-253이 처리된 CD8 T 세포를 투여한 실험동물에서 Klf4 유전자의 발현수준을 mRNA 수준에서 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 4c는 대조군(PBS) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 APTO-253이 처리된 CD8 T 세포가 투여된 암 모델 동물에서의 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 CAR 컨스트럭트(EpCAM CAR, Trop-2 CAR, CEACAM6 CAR 및 CEACAM5 CAR)의 구조를 개략적으로 나타낸 개요도이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, a) 개체에서 분리된 CD8 T 세포, b) 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 및 c) 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 CD8 T 세포의 탈진 상태 억제 방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, a) 개체에서 분리된 CD8 T 세포, b) 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 및 c) 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 CD8 T 세포의 면역반응 강화방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, a) 개체에서 분리된 CD8 T 세포, b) 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 및 c) 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 CD8 T 세포의 증식 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 Klf4 단백질의 과발현은 Klf4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터로 상기 CD8 T 세포를 형질감염시키거나, 상기 CD8 T 세포에 Klf4 단백질을 발현하는 mRNA를 도입하거나, Klf4 유도제를 상기 CD8 T 세포에 처리함으로써 수행될 수 있다. 상기 Klf4 단백질은 서열번호 4 또는 5로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 Klf4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 또는 6으로 기재되는 핵산서열을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명이 상기 특정 서열로 한정되는 것은 아니며, 다른 포유동물 유래의 것이라면 어느 것이라도 사용될 수 있으며, 바람직하게는 침팬지, 고릴라, 오랑우탄, 기본 원숭이, 게잡이 원숭이, 붉은 원숭이 등과 같은 영장류 유래의 Klf4 단백질 또는 그를 암호화하는 핵산분자가 사용될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터일 수 있고 상기 바이러스성 벡터는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있으며 상기 비바이러스성 벡터는 DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜일 수 있고 상기 DNA 벡터는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터 또는 인공 인간 염색체일 수 있다.
상기 발현벡터는 상기 CD8 T 세포 내에서 상기 Klf4 단백질이 과발현될 수 있도록 상기 Klf4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 연결되는 적절한 조절서열을 포함할 수 있고, 상기 조설서열은 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하도록 연결될 수 있으며, 이 경우 조절서열과 그에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 통합하여 "유전자 컨스트럭트"로 지칭할 수 있다. 상기 유전자 컨스트럭트는 발현벡터 내에 적절한 클로닝을 위해 양 말단에 절절한 제한효소 인식부위를 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다. 상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 원핵세포 내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX27(특허 제1442254호), pX(Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), 효모 2-하이브리드(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris (1995) Cell 75, 791-803) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham-Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더서열이다.
또한, 본 발명에서 사용되는 발현벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있다.
아울러, 상기 방법에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트는 하나 또는 둘 이상의 면역증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있고, 이 경우 상기 면역 증진 펩타이드는 별도의 조절서열에 연결된 형태 즉 bicistron 형태로 발현벡터에 포함되거나 하나의 조절서열에 연결되지만 두 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 사이에 IRES(internal ribosome entry site)가 삽입이 되어 하나의 mRNA로 전사 후 각각의 단백질로 각각 번역되는 형태로 나타낼 수 있다. 상기 면역증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD40L, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L[ligand for CD134(OX40), CD252]의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 Klf4 유도제는 APTO-253{2-(5-fluoro-2-methyl- 1H-indol-3-yl)-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthroline}일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, Klf4 유전자가 과발현되도록 형질전환된 형질전환 CD8 T 세포가 제공된다.
상기 형질전환 CD8 T 세포는 개체로 부터 분리된 CD8 T 세포 또는 그를 포함하는 세포집단에 Klf4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 형질도입함으로써 제조될 수 있다. 상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터일 수 있고, 상기 바이러스성 벡터는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있으며 상기 비바이러스성 벡터는 mRNA, DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜일 수 있고, 상기 mRNA는 Klf4 단백질을 암호화하는 mRNA 단독 또는 상기 mRNA 이외의 상기 비바이러스성 벡터와의 조합으로 사용될 수 있으며, 상기 DNA 벡터는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터 또는 인공 인간 염색체일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 외래성 Klf4 단백질 및 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)이 발현되도록 형질전환된 형질전환 CAR-CD8 T 세포가 제공된다.
상기 형질전환 CAR-CD8 T 세포는, Klf4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트 및 상기 CAR를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 컨스트럭트로 CD8 T 세포 바람직하게는 치료를 필요로하는 환자로부터 단리된 CD8 T 세포 또는 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단을 형질감염시킴으로써 제조될 수 있고, 상기 두 가지 유전자컨스트럭트는 별개의 벡터에 클로닝되어 공형질감염될 수 있고, 아니면 하나의 벡터 내에 클로닝되어 숙주 CD8 T 세포에 형질도입될 수 있다. 이 경우 각각의 유전자는 별도의 조절부위 예컨대 프로모터 및/또는 인핸서 등과 작동가능하게 연결되어 별개의 mRNA로 발현이 될 수도 있고, 하나의 전사조절 인자 아래 IRES로 연결되어 하나의 mRNA로 발현된 후 번역 및 수식과정만 별도로 수행될 수도 있다. 외래 유전자의 형질도입을 위한 벡터 및 프로모터 등 다양한 기술에 대하여는 상술한 바와 같다.
본 문서에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)" 는 항원 인식부위로 scFv, sdAb와 같은 단일쇄 기반의 항체 유사체-세포막 통과 도메인-보조자극 도메인-세포내 신호전달 도메인으로 구성된 합성 단백질로서 T 세포 등 면역세포에 형질도입되어 암세포 특이적인 항원을 인식하여 이들 면역세포의 암세포에 대한 항암 활성을 향상시키는 것으로 잘 알려져 있다.
상기 형질전환 CAR-CD8 T 세포에서 있어서, 상기 CAR는 항체 유사체-세포막 통과 도메인-보조자극인자-세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합단백질일 수 있다. 상기 단일쇄 기반 항체 유사체는 암 항원 또는 병원체 유래 항원에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는데, 상기 암 항원은 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), Trop-2(trophoblast cell surface antigen 2), CEACAM5(CEA cell adhesion molecule 5), CEACAM6(CEA cell adhesion molecule 6), 암배아항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 산 포스파테이즈(prostatic acid phosphatase, PAP), 전립선 특이적 막항원(PSMA), Her2/neu, MUC-1, BCR/ABL, 알파-페토프로테인(AFP), LMP2a와 같은 엡스타인-바 바이러스(EBV) 유래 항원, B형 인간간염바이러스 (HBV) 유래 항원, C형 인간간염바이러스(HCV) 유래 항원, Proteinase 3, WT-1, PAP(prostatic acid phosphatase), G250, 멜라노마 항원 유전자(MAGE, melanoma antigen gene), BAGE, GAGE, NY-ESO-1, 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제-관련 단백질-1(TRP-1), TRP-2, gp100, MART-1, Ig Idiotype, CDK4, caspase-8, β-catenin, BCR/ABL, 인간 유두종 바이러스(HPV E6/E7), HHV-8, 5T4, p53, 암항원125(CA-125), 암항원-72-4(CA-72-4), 암항원-15-3(CA-15-3), 또는 암항원-19-9(CA-19-9)일 수 있다. 상기 병원체 유래 항원은 병원성 미생물(pathogenic microorganism), 바이러스 또는 기생충 유래의 항원일 수 있고, 상기 병원성 미생물은 병원성 세균(pathogenic bacteria) 또는 병원성 진균(pathogenic funji)일 수 있으며, 상기 병원성 세균은 백일해균(Bordetella pertussis) 파상풍균(tetanus), 디프테리아균(diphtheria), 헬리코박터균 파이로리(Helicobacter pylori) 폐렴구균(Pneumococcus sp.), 결핵균(Mycobacterium tuberoculosis), 콜레라(Cholera sp), 포도상구균(Staphylococcus sp.) 적리균(Shigella sp.), 보렐리아균(Borrelia sp.) 또는 살모넬라균(Salmonella sp.)일 수 있고, 상기 병원성 진균은 칸디다균(Candida sp.) 트리코파이톤균(Trichophyton sp.), 아스퍼질러스균(Aspergillus sp.) Fonsecaea sp. Epidermophyton sp., Piedraia sp., Malassezia sp., Pseudallescheria sp., Basidiobolus sp., Conidiobolus sp., Rhinosporidium sp., Paracoccidioides sp., Cryptococcus sp., Blastomyces sp., Sporothrix sp., Mucor sp., Absidia sp., Rhizopus sp., Pneumocystis sp., Wangiella sp.,, Phialophora sp., Schizophyllum sp.일 수 있다. 아울러, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV), 소수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV), A형 간염바이러스 항원(hepatitis A virus, HAV), B형 간염바이러스(hepatitis B virus, HBV), C형 간염C(HCV), D형 간염바이러스(HDV) 및 G형 간엽바이러스(HGV), 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV), 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 항원 또는 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)일 수 있다. 상기 기생충은 회충, 요충, 갈고리촌충, 간흡충, 폐흡충, 주혈흡충, 간디스토마, 폐디스토마, 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 또는 톡소플라스마(Toxoplasma)일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사합체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, 항체로부터 유래했으나 두 개의 사슬로 구성된 것이 아니라 단일 사슬로 이루어진 항원-결합 단편 또는 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체와 유사한 기능 즉, 항원 결합능을 갖는 단백질을 의미한다. 구체적으로, 이러한 항체 유사체로는 항체 기반의 단일쇄 항체 단편으로 항체의 VH와 VL을 링커로 연결하여 제조된 단일쇄 항체 단편인 scFv(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990), 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편인 sdAb(single domain antibody), 경쇄가 없이 중쇄만으로 구성되는 항체인 낙타과 또는 연골어류 유래의 항체의 항원-결합 단편(VHH, VNAR 등) 등이 존재하고, 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체 유사단백질에는 단백질 A의 Z domain 유래의 Affibody(Nygren, P. A., FEBS J. 275(11): 2668-2676, 2008), Gamma-B crystallin 또는 Ubiquitin 유래의 Affilin(Ebersbach et al., J. Mol. Biol. 372(1): 172-185, 2007), Cystatin 유래의 Affimer(Johnson et al., Anal. Chem. 84(15): 6553-6560, 2012), Sac7d 유래의 Affitin(Krehenbrink et al., J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-1068, 2008), Triple helix coiled coil 단백질 유래의 Alphabody(Desmet et al., Nat. Commun. 5: 5237, 2014), lipocalin 유래의 Anticalin(Skerra et al., FEBS J. 275(11): 2677-2683, 2008), 다양한 막 수용체의 도메인 유래의 Avimer(Silverman et al., Nat. Biotechnol. 23(12): 1556-1561, 2005), Ankyrin repeat motif 유래의 DARPin(Stumpp et al., Drug Discov. Today. 13(15-16): 695-701, 2008), Fyn 단백질의 SH3 도메인 유래의 Fynomer(Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282(5): 3196-3204, 2007), 다양한 단백질 저해제의 Kunitz 도메인 유래의 Kunitz domain peptide(Nixon and Wood, Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 9(2): 261-268, 2006), 피브로넥틴의 10번째 제3형 도메인 유래의 monobody(Koide and Koide, Methods Mol. Biol. 352: 95-109, 2007), 탄수화물 결합 모듈 32-2 유래의 nanoCLAMP(Suderman et al., Protein Exp. Purif. 134: 114-124, 2017), 먹장어 유래의 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR)(Boehm et al., Ann. Rev. Immunol. 30: 203-220, 2012), 및 상기 VLR을 기반으로 항원 친화성을 향상시키도록 조작된 repebody(Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109: 3299-3304, 2012) 등이 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 "single chain variable fragment"의 약어로서 실제 항체의 단편은 아니며, 항체의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 약 25 a.a. 크기의 링커 펩타이드로 연결하여 제조한 일종의 융합단백질로서 고유의 항체 단편이 아님에도 불구하고 항원 결합능을 지닌 것으로 알려지고 있다(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990).
상기 형질전환 CAR-CD8 T 세포에서 있어서, 상기 세포막 통과 도메인은 4-1BB/CD137, 활성화 NK 세포 수용체, 이뮤노글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 제타, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8알파, CD8베타, CD96 (Tactile), CDl la, CDl lb, CDl lc, CDl ld, CDS, CEACAM1, CRT AM, 시토카인 수용체, DAP-10, DNAM1 (CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파 (CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 유도성 T 세포 공동자극자 (ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGBl, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1; CDl-la/CD18), MHC 부류 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG (CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), SLAM (SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4 (CD244; 2B4), SLAMF6 (NTB-A; Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, 톨 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1, 또는 VLA-6 유래의 막통과 도메인일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "보조자극 도메인(costimulatory domain)"은 T/NK 활성화를 보조하는 면역관련 단백질인 보조자극 인자(costimulatory factor)의 T 세포 보조자극 기능을 담당하는 세포질 도메인(cytoplasmic domain)을 의미한다.
상기 형질전환 CAR-CD8 T 세포에서 있어서, 상기 보조자극 도메인은 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L(CD252)의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 면역세포에서 리간드가 수용체에 결합될 때 면역반응을 매개하는 세포내 신호를 전달하는 기능을 담당하는 세포질 내 도메인을 의미한다.
상기 형질전환 CAR-CD8 T 세포에서 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2Rβ/CD122, IL-2Rα/CD132, DAP10, DAP12, 그리고 CD40 중에서 하나 또는 그 이상의 세포질 내 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 형질전환 CAR-CD8 T 세포는 탈진현상을 최대한 억제하고 암-항원에 대한 인식 및 인식된 암-항원에 대한 면역반응을 증가시킴으로써 항암치료에 있어서 상가 또는 상승효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 형질전환 CD8 T 세포 또는 상기 형질전환 CAR-CD8 T 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 Klf4 유전자가 과발현된 CD8 T 세포는 치료를 필요로 하는 개체로부터 분리된 자가 유래 CD8 T 세포 또는 타인으로부터 분리된 타가 유래 CD8 T 세포일 수 있으나, 자가 유래 CD8 T 세포인 것이 바람직하다. 상기 Klf4 유전자가 과발현된 CD8 T 세포는 CD8 T 세포에 Klf4 유전자 포함된 발현벡터의 형질도입 및/또는 상기 CD8 T 세포에 Klf4 유도제의 처리를 통해 제조될 수 있다.
상기 형질도입과 Klf4 유도제에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 조성물은 선천성 면역반응이 필요한 질환의 치료에 사용될 수 있으며, 상기 선천성 면역반응이 필요한 질환은 암, 세균성 감염증, 진균성 감염증, 바이러스 감염증 또는 기생충 감염증일 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 형질전환 CD8 T 세포 또는 상기 형질전환 CAR-CD8 T 세포를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 조성물은 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있는데, 일반적인 전신성 투여 또는 국소성 투여, 예컨대, 피하 주사, 활막강내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사 또는 정맥내 주사 방식으로 투여될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 일 실시예에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
아울러 본 발명의 조성물은 치료적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 암에 걸린 개체에서 분리된 CD8 T 세포 또는 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단에서 Klf4 유전자의 과발현을 유도하는 단계; 및 Klf4 유전자가 과발현된 CD8 T 세포 또는 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
상기 암 치료방법에 있어서, 상기 CD8 T 세포 또는 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단은 추가로 암항원을 표적으로 한 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예
일반적 방법
Klf4 유전자 형질도입을 위한 레트로바이러스의 제작
플래티넘 E 세포주(platinum E cell line, platE, CELL BIOLABS, USA)을 10% FBS(Gibco, USA), 항생제인 스트렙타마이신&페니실린(100 U/ml, WELGENE), 블라스토마이신(10 μg/ml, Gibco), 퓨로마이신(1 μg/ml, Gibco)이 보충된 DMEM 배지(WELGENE)에서 세포 포화도에 주의하여 과성장하지 않도록 37℃ 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 세포 포화도가 90% 정도에 이르면 배지를 제거한 후 PBS(Sigma)를 5 ml 가하여 세정한 후 제거하였으며, 이러한 세정 과정을 한 번 더 반복하였다. 이어, 트립신-EDTA 용액(WELGENE) 2~3 ml을 적가한 후, 37℃ 세포배양기에서 3분간 반응시켰다. 이후 DMEM 배지 10 ml로 분리된 세포들을 잘 파이펫팅한 후 15 ml 튜브에 옮긴 후 4℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 펠렛을 10% FBS만 첨가된 DMEM 배지(무-항생제 배지)로 재현탁한 후 세포를 계수하였다. 60 mm 배양접시에 2.5x106개의 platE 세포를 3 ml의 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 재현탁한 후 균일하게 파종하고 6~8시간동안 37℃ 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 6~8시간이 경과한 후 칼슘 형질감염을 위해 위하여 2X HBS, 2M CaCl2, 3차 증류수, 그리고 MigRI 벡터(Addgene, USA)에 마우스 klf4 유전자의 CDS 서열(서열번호 1)을 삽입함으로써 MigRI-Klf4 벡터를 제조하였다. 이 때, 마우스 klf42 유전자의 클로닝은 MigI 벡터로의 클로닝을 위한 제한효소(BglII 및 EcoRI) 인식부위를 부가한 프라이머 세트(서열번호 2 및 3)을 사용한 PCR 증폭을 통해 수행되었는데, 포워드 프라이머에는 BglII 인식부위와 개시코돈(ATG) 사이에는 코작 서열(Kozak sequence)로 ACC를 삽입하였다. 그런 다음, X HBS를 한쪽 1.5 ml 원심분리 튜브에 312.5 μl 분주한 후 다른 한쪽 원심분리 튜브에는 2 M CaCl2 38.75 μl, DNA 벡터 10 μg에 해당하는 부피를 첨가하고, 잔부는 3차 증류수를 이용하여 312.5 μl를 맞춰주었다. 그런 다음, 2X HBS가 분주되어 있는 원심분리 튜브를 낮은 강도로 볼텍싱하며 DNA 벡터가 분주되어 있는 원심분리 튜브의 용액을 파이펫을 이용하여 적가방식으로 2X HBS가 분주되어 있는 원심분리 튜브로 옮겨주고, 30분간 상온에서 반응시켰다. 이어, 혼합 용액을 파이펫을 이용하여 미리 파종하여 준비해둔 platE 배양접시에 적가 방식으로 가하였다. 그런 다음, 37℃ 5% CO2 세포 배양기에서 16시간 정도 배양하였다. 배양을 마친 후 배양배지를 제거하고 따뜻한 PBS를 이용하여 두 번 세정해 준 후 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지를 60 mm 배양접시 당 3 ml씩 분주한 후 37℃ 5% CO2 세포 배양기에서 추가적으로 48시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 후 배양 상등액만 옮겨 담은 후 0.45 μm 필터(ADVANTEC)를 이용하여 여과하였다. 여과가 완료된 바이러스가 포함된 상등액은 바로 실험에 사용하거나 액체질소를 이용하여 급속 냉동시킨 후 초저온 냉동고(deep freezer)에서 -80℃의 온도조건으로 보관하였다.
미접촉 CD8 T 세포의 분리 및 활성화
마우스를 희생하여 비장을 적출하였다. 그런 다음 PBS에 담긴 비장을 잘게 분쇄한 후 메쉬로 걸러 15 ml 원심분리 튜브에 옮긴 후 4℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 상등액은 제거하고 펠렛은 Ack 용해 완충액 1 ml로 재현탁한 하여 상온에서 3분간 반응시켰다. 이어, PBS 10 ml을 추가하고 4℃ 1500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 형광 표지된 항-CD8 항체, 항-CD44 항체를 PBS에 100:1 부피비로 혼합하여 항체 혼합물을 제조한 후 원심분리되어 가라앉은 세포 펠렛에 가한 후 재현탁하고, 4℃에서 30분가 반응시켰다. 그런 다음, PBS 10 ml을 추가하여 준 후 4℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 펠렛을 PBS 1 ml로 재현탁한 후, 세포 여과기(cell strainer)로 걸러주고 적당량의 PBS 혹은 RPMI 배지(WELGENE)를 첨가하여 세포 밀도를 조절하였다. 이어, 세포 분리기(SH800, Sony Biotechnology, USA)를 이용하여 CD8+CD44low 세포(미접촉 CD8 T 세포)를 분리하였다.
48-웰 플레이트(SPL Life Sciences)에 분리가 완료되기 1시간 30분~2시간 전에 항-CD3 항체를 코팅하는데, 구체적으로 항-CD3 항체(Biolegend)가 5 μg/ml의 농도가 되도록 PBS를 이용하여 희석한 후 48-웰 플레이트의 각 웰에 150 μl 씩 분주하였다. 이 후 37℃ 세포 배양기에서 1시간 30분~2시간 정도 반응시킴으로써 항체를 코팅하였다. 항체 코팅이 완료된 플레이트의 각 웰에서 항체 혼합물을 제거하고 PBS 150 μl를 이용하여 세척하였으며, 동일 세척과정을 한 번 더 반복하였다. 분리가 완료된 미접촉 CD8 T 세포를 4℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 펠렛을 10% FBS, 스트렙토마이신&페니실린(100 U/ml), 2-머캅토에탄올(Gibco)이 첨가된 RPMI 배지를 이용하여 재현탁하였다. 준비된 항-CD3 항체가 코팅된 플레이트의 한 웰 당 1.5x106개의 세포를 첨가하였다. 이 때, 추가로 항-CD28 항체(2 μg/ml, BD Pharmigen), mIL-2(100 U/ml, R&D Systems)를 처리하였다. 그런 다음 37℃ 5% CO2 세포 배양기에서 18~24시간 배양하였다.
활성화된 CD8 세포의 증식 및 레트로바이러스를 이용한 Klf4 유전자 형질도입
고효율의 레트로바이러스 형질도입 효율을 얻기 위해 활성화된 CD8 T 세포의 증식 과정을 먼저 수행하였다. 상기에서 18~24 시간동안 활성화 처리된 세포들을 15 ml 원심분리 튜브에 잘 옮겨 담은 후 25℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 이어 100% 퍼콜(percoll), RPMI 배지 그리고 PBS를 이용하여 각각 30% 및 60%로 희석된 Percoll 용액을 제조하였다. 원심분리된 펠렛을 30% Percoll 용액 4 ml로 재현탁한 후, 60% Percoll 용액 3 ml을 조심스럽게 아래층에 배치하였다. 그런 다음, 25℃ 2,000 rpm의 조건으로 20분간 원심분리하였다. 이 때, 가속과 감속은 최소로 설정하였다. 원심분리 후 상층의 3 ml은 제거하고 계면에 위치한 세포들을 새로운 15 ml 원심분리 튜브에 이동시켰다. 이어, PBS 10 ml을 추가하여 세정해준 후 25℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 펠렛을 PBS 10 ml로 다시 한 번 세정해준 후 25℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하고, 세포 펠렛을 RPMI 배지에 재현탁시킨 후 세포를 계수하였다. 이어, 12-웰 비-코팅 플레이트(SPL Life Sciences)에 웰 당 5x105개씩 세포를 분주하였다.
상기에서 준비된 레트로바이러스 상등액(MigRI-Klf4 및 MigRI) 1~2 ml을 각 웰에 첨가한 후 mIL-2(100 U/ml), 폴리브렌(8 μg/ml, Sigma)을 추가하였다. 이어, 파라필름으로 틈을 밀봉하고 25℃ 1,800 xg의 조건으로 1시간동안 원심분리하였다. 이 때도 마찬가지로 가속 및 감속은 최소로 설정하였다. 원심분리가 끝나면 파라필름을 제거하고 37℃ 5% CO2 세포 배양기에서 30분간 배양하였다. 이후 세포를 15 ml 원심분리 튜브로 옮기고 RPMI 배지 10 ml을 추가하여 세척해준 후 25℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리후 세포 펠렛을 RPMI 배지 10 ml로 재현탁하고 다시 한 번 세정해준 후 25℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 세포 펠렛을 PBS로 재현탁하고 이를 곧바로 마우스에 정맥 내 주사함으로써 면역세포 이식(adoptive cell transfer)을 하거나, 추가적인 배양을 통해 세포실험에 사용하였다.
APTO-253을 이용한 Klf4의 과발현 유도
본 발명자들은 레트로바이러스를 이용한 Klf4 유전자 형질도입 외에도 전사인자인 Klf4의 상위 신호전달 경로를 조절함으로써 미접촉 CD8 T 세포의 내재적인 Klf4 유전자의 과발현이 가능할 것으로 예상하였다. 이에, Klf4 발현 유도제로 알려져 있는 APO-253(Cercek et al., Invest. New. Drug. 33(5): 1086-1092, 2015)을 미접촉 CD8 세포에 처리하여 Klf4 유전자를 과발현시킬 경우에도 레트로바이러스 벡터를 이용한 형질도입과 유사한 효과를 나타낼 것으로 추정하였다.
이에, 상기의 방법과 동일하게 미접촉 CD8 T 세포를 분리한 후, 항-CD3 항체가 코팅된 플레이트에 미접촉 CD8 T 세포를 넣고 활성화시키는 과정에서, 항-CD28 항체(2 μg/ml) 및 mIL-2(100 U/ml)를 처리할 때, 3 μM의 APTO-253 (MedChemExpress, LLC)을 처리하였다. 이어, 37℃ 5% CO2 세포 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 세포를 15 ml 원심분리 튜브로 옮긴 후 RPMI 배지를 추가하여 부피를 3 ml로 조정하였다. 그 후 아래층에 Histopaque(Sigma) 3 ml을 조심스럽게 배치하였다. 이어 25℃ 2,000 rpm의 조건으로 30분간 원심분리시켰으며, 이 때, 가속과 감속은 최소로 설정하였다. 원심분리 후, 상층부의 배양액을 제거한 뒤 계면에 존재하는 세포를 회수하여 15 ml 원심분리 튜브에 옮겨 PBS 10 ml로 재현탁한 후 4℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 PBS 10 mL로 한 번 더 세정하고 4℃ 1,500 rpm의 조건으로 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 적정량의 PBS에 재현탁한 후 세포를 계수하였다. 최종적으로 5x105개의 세포를 200 μl의 PBS에 희석하여 1 ml 주사기에 적재한 후, 마우스에 정맥 내 주사하여 면역세포 이식을 하였다.
실시예 1: CD8 T 세포의 탈진현상 기전 연구
상술한 바와 같이, CD8 T 세포가 암 항원 등에 만성적으로 노출이 되면 탈진현상이 일어나고 이렇게 탈진된 CD8 T 세포는 정상적인 활성 사이토카인 분비 및 세포분열을 하지 못하게 되어, 제대로된 면역반응을 수행하지 못할 뿐만 아니라, 시간이 지나더라도 다시 정상적인 기능을 가지는 세포로 회복이 되지 않는다.
이에, 본 발명자들은 CD8 T 세포가 활성화되었다가 시간이 경과함에 따라 탈진되는 현상의 원인을 규명하기 위해 시험관 내 조건에서 탈진 상황을 모방하기 위한 실험을 수행하였다.
1-1: 탈진 모방 시험관 내 시험
이를 위해 구체적으로 본 발명자들은 OVA(ovalbumin)-펩타이드 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 가지는 OT-I 형질전환 마우스의 CD8 T 세포를 분리하여 5일간 반복적으로 OVA 펩타이드를 처리하는 실험을 수행하였다. 모든 실험 세트에서는 CD8 T 세포의 생존도를 높이기 위해 IL-15(5 ng/ml) 및 IL-7(5 ng/ml)를 처리하여 주었다. OVA 펩타이드(10 ng/ml)을 처리하고 그 다음날 세정 후 다시 사이토카인 및 OVA 펩타이드를 동일 조성으로 처리하여주는 방식으로 5일간 반복적으로 자극을 가하였다(반복적 자극 처리군). 이 때 대조군으로서 OVA 펩타이드를 처리하지 않고 사이토카인만 처리한 그룹과 OVA 펩타이드(10 ng/ml)를 2일간 처리하고 세정한 후 사이토카인만 처리하여 휴지시키는 단일 자극 처리군을 추가하였다. 또한, CD8 T 세포의 활성화를 돕는 인자로 알려진 IL-21을 처리한 세트도 추가하였다(반복 자극 + IL-21 처리군)(도 1a). 5일이 지난 시점에서 살아있는 CD8 T 세포들을 세포 분리기(cell sorter)를 이용하여 분리한 후 RNA를 추출하고 cDNA로 역전사한 후 다양한 유전자의 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, 탈진 상태를 모방한 반복 자극 처리군에서 탈진현상의 대표적 마커인 Tox 유전자의 발현이 증가되며 IL-21 을 처리한 반복 자극 + IL-21 처리군에서는 Tox 유전자의 발현이 다시 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 상황에서 Klf4의 발현 양상을 확인한 결과, 반복 자극 처리군에서 Klf4 유전자의 발현이 증가되었으며, Tox와는 다르게 반복 자극 + IL-21 처리군에서는 오히려 Klf4 유전자의 발현이 더 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 1b). 이는 활성화 인자인 IL-21에 CD8 T 세포가 반응하여 Klf4 유전자의 발현이 더 높아진 것으로, Klf4가 탈진 상태에서 CD8 T 세포의 활성화와 관련된 요소일 것임을 추측할 수 있게 해준다.
1-2: 탈진 모방 생체 내 실험
상기 실시예 1-1의 세포실험에서의 결과가 동물실험에서도 재현이 되는지 확인하기 위해 본 발명자들은 탈진 모방을 실험동물을 이용하여 생체 내 조건에서 수행하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스에 MC38 암 세포(3x105)을 접종한 후 18일째에 비장 및 종양조직을 적출하였다. 한편, 상기 동물실험은 서울대학교 동물실험 윤리위원회의 규정에 따라 수행되었다. 비장에서는 CD44의 발현이 낮은 CD44low 미접촉(Naㅿve) CD8 T 세포와 항원 자극을 받아 CD44의 발현이 높은 CD44high 효과기(effector) CD8 T 세포를 세포 분리기를 이용하여 분리하였다. 종양 조직에서는 기존의 연구들에서 알려진 정보의 근거하여, 만성 선조세포(chronic progenitor cell)로 알려진 Ly108+ CD8 T 세포, 만성 효과기 세포(chronic effector cell)로 알려진 Ly108-CD69-Tim3+ CD8 T 세포, 그리고 최종 탈진 상태의 CD8 T 세포로 알려진 Ly108-CD69+Tim3+ CD8 T 세포를 세포 분리기를 이용하여 분리하였다(도 1c). 이렇게 분리된 5 그룹의 세포들의 RNA를 추출하고 cDNA로 역전사한 후 다양한 유전자의 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 확인하였다.
그 결과, Klf4의 경우, 종양 조직에 존재하는 탈진 상태의 CD8 T 세포들(만성 전구세포, 만성 효과기 세포 및 최종 탈진상태 세포)에서 미접촉 CD8 T 세포에 비해 전반적으로 모두 발현량이 높은 것을 확인할 수 있었는데, 특히 만성 효과기 세포로 알려진 Ly108-CD69-Tim3+ CD8 T 세포에서 Klf4 유전자의 발현이 가장 높음을 확인할 수 있었다(도 1d). 이상을 통해 시험관 내 조건에서뿐만 아니라 생체 내 조건 모두에서 탈진상태에서 활성도가 높은 CD8 T 세포가 보다 더 높은 Klf4 유전자 발현 레벨을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 유전자 형질도입을 통한 Klf4 과발현 CD8 T 세포의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1의 결과로부터 탈진 상태에서 Klf4의 유전자 발현이 높아지나, 탈진 상태에서 그나마 항암 활성을 유지하고 있는 효과기 세포에서 Klf4의 발현이 더 높다는 점에 착안하여 Klf4가 효과기 세포의 발생 및 기능을 촉진시킬 수 있을 것이라는 가설을 수립하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 가설이 맞는지 확인하기 위해 CD8 T 세포에서 Klf4의 발현을 인위적으로 증가시킬 경우, 효과기 세포의 발생이 촉진되는지 여부 및 항원에 대한 만성 자극에 의해 발생하는 탈진현상이 억제되고 효과기 세포로써의 기능이 촉진되는지 여부를 확인하고자 하였다.
이를 위해 우선 본 발명자들은 분리된 CD8 T 세포에 Klf4 유전자를 형질도입시켜 Klf4 유전자를 과발현시키는 실험을 수행하였다.
구체적으로, CD8 T 세포에 24시간동안 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 mIL-2 를 처리한 후, CD8 T 세포들에 레트로바이러스를 이용하여 대조군인 MigRI 벡터, 실험군으로는 MigRI 벡터에 Klf4가 삽입된 벡터(이하, 'Klf4'로 약칭함)를 과발현시켰다. 레트로바이러스를 이용한 형질도입은 상술한 일반적 방법을 이용하여 수행하였다. 이후 3일간 mIL-7 및 mIL-15을 처리하여 휴지상태의 CD8 T 세포를 유도하였으며, MigRI 벡터에서는 기본적으로 GFP를 발현하기 때문에 과발현이 된 세포는 GFP+임을 이용하여 FACS 분석을 수행하였다. 형질전환되지 않은 대조군인 MigRI GFP-, MigRI GFP+, Klf4 GFP-의 Klf4가 과발현 되지 않은 세포들에 비해, Klf4 GFP+ CD8 T 세포의 경우, 앞서 언급되었던 만성 효과기 세포(Ly108-CD69-) 서브셋이 크게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 2a). 이를 통해 Klf4의 과발현이 만성 효과기 세포 세브셋의 발생에 중요한 요소임을 알 수 있었다.
다음으로, Klf4 과발현이 효과기 세포의 기능을 촉진시키는 지 확인하기 위해 gp100 항원을 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체를 가지는 PmelI 마우스 유래의 CD8 T 세포를 분리하고 상기의 방법으로 대조군(MigRI) 및 Klf4 유전자를 과발현시킨 후 gp100 항원을 과발현하고 있는 표적 암세포(MC38-gp100) 와 6시간동안 함께 배양하여 죽은 표적 암세포의 비율을 측정하였다. 그 결과, 대조군(MigRI) 에 비해 Klf4 유전자를 과발현시킨 PmelI 유래 CD8 T 세포와 함께 배양한 경우, 죽은 타겟암세포의 비율이 증가하는 것을 통해, Klf4 과발현 CD8 T 세포가 더 효과적으로 암세포를 살해할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 2b).
뿐만 아니라 직접적인 탈진 상태에서 Klf4 과발현이 만성 효과기 세포의 기능을 촉진시키는 지 확인하기 위해 실시예 1-1에서 수행하였던 시험관 내 탈진 모델을 응용하였다. OVA 펩타이드를 처리하고 24시간이 경과한 시점에서 CD8 T 세포들에 레트로바이러스를 이용하여 대조군인 MigRI 벡터, Klf4 벡터를 과발현시켰다. 이후 나머지 4일간 반복적으로 OVA 펩타이드를 처리하여 in vitro 탈진 상태를 유도하였으며, MigRI GFP+ 및 Klf4 GFP+ CD8 T 세포들을 세포 분리기를 이용하여 분리한 후 유전자 발현을 표 1에 기재된 프라이머쌍을 이용한 qRT-PCR을 통해 분석하였다. 그 결과, Klf4 과발현 CD8 T 세포들은 Klf4 유전자 발현이 MigRI 벡터 대조군에 비해 매우 높은 것을 확인하였고, 동시에 탈진 상태의 마커인 Tox 유전자 발현은 반대로 매우 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 2c). 또한 FACS 분석을 통해 이들 CD8 T 세포에서 분비되는 그랜자임 B(Granzyme B) 및 인터페론-감마(IFN-γ)의 양을 측정해보았는데, Klf4가 과발현된 CD8 T 세포에서 유의미하게 사이토카인 분비량이 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 2d 및 2e). 이상을 통해, 보다 더 높은 Klf4 유전자의 발현 수준이 만성 효과기 세포(Ly108-CD69-)의 형성을 촉진하고 타겟암세포를 살해하는 능력을 촉진시키며, 탈진상태의 CD8 T 세포에서 더 이상의 탈진 현상을 억제하고 활성 사이토카인의 더 많은 분비를 촉진함을 확인할 수 있었다.
qRT-PCR에 사용된 프라이머 정보
유전자 프라이머명 핵산서열 (5' -> 3') 서열번호
klf4 forward primer GTGCCCCGACTAACCGTTG 7
reverse primer GTCGTTGAACTCCTCGGTCT 8
tox forward primer CAACTCAAAGCCGTCAGTAT 9
reverse primer GCTGAGGAGTCATTCCTGGT 10
실시예 3: 동물 실험을 통한 탈진 상태 억제 분석
3-1: Klf4 유전자 형질도입을 통한 동물실험
상기 결과들로부터 본 발명자들은 in vivo 상황에서도 CD8 T 세포에서의 Klf4 과발현이 세포 활성을 증가시켜 암 발생을 억제할 수 있는지 마우스 종양모델을 사용하여 확인해보았다. 이를 위해 구체적으로, T 세포가 존재하지 않는 Rag2 KO 마우스에 gp100을 발현하는 MC38 암세포(MC38-gp100)를 3x105개 접종하고 하루 뒤 MigRI 및 gp100-특이적 TCR을 발현하도록 형질전환된 PmelI 형질전환 마우스(Jackson Laboratory, 국립암센터로부터 분양받음) 유래의 CD8 T 세포를 상기 발현벡터로 형질전환시켜 Klf4이 과발현되도록 형질전환된 CD8 T 세포 1x106개를 정맥 내 주사를 통해 투여하였다. 암세포를 접종하고 15일째 되는 날까지 종양 부피를 체크하였고 15일째 마우스를 희생시켜 실험에 이용하였다(도 3a). 마우스의 분석에 앞서 MigRI 및 Klf4를 과발현시킨 CD8 T 세포에서 Klf4 유전자의 발현 수준을 확인한 결과, Klf4 유전자가 성공적으로 과발현되었음을 확인할 수 있었다(도 3b). Klf4를 과발현시킨 CD8 T 세포가 투여된 마우스의 경우, MigRI만 이용한 대조군에 비해 암의 발생이 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 3c). 아울러 종양조직 내에 존재하는 침윤성 CD8 T 세포 서브셋들에서 세포 분열의 척도로 나타내어지는 Ki-67의 발현정도를 FACS로 분석한 결과, 대조군(MigRI)에 비해 Klf4가 과발현된 CD8 T 세포 서브셋들, 특히 만성 효과기 세포에서의 증식이 효율적으로 이루어지고 있음을 알 수 있었다(도 3d). 뿐만 아니라, 그랜자임 B, IFN-γ, TNF-α와 같은 활성 사이토카인들이 모두 증가 되어있는 것을 확인할 수 있었다(도 3e 및 3f). 이상을 통해 Klf4를 과발현시킨 CD8 T 세포가 훨씬 더 뛰어난 항암 면역반응을 나타냄을 확인할 수 있었다.
3-2: Klf4 유도제를 이용한 탈진 상태 억제 분석
상기 실시예 3-1의 결과로부터, 본 발명자들은 Klf4 유전자 형질도입 대신 Klf4를 과발현시킬 수 있는 약물을 이용한다면 상술한 바와 같이 Klf4 유전자 발현 증가에 따른 항암 효과를 확인할 수 있을 것이라 생각하였고, 기존 연구를 통해 Klf4의 유도제로 알려진 APTO-253을 이용하여 동물실험을 수행하였다. 이를 위해 구체적으로, 림프구가 결여된 Rag2 KO 마우스에 MC38 암세포 3x105개를 주입하고 그 다음날 PBS 혹은 APTO-253가 3일간 처리된 CD8 T 세포 5x105개를 정맥 내 주사를 통해 투여하였다. 암세포를 접종하고 15일째 되는 날까지 종양 부피를 체크하였고 15일째 마우스를 희생시켜 실험에 이용하였다(도 4a). 마우스의 분석에 앞서 APTO-253를 3일간 처리한 CD8 T 세포에서 Klf4 유전자 발현수준을 확인해본 결과, APTO-253를 처리한 CD8 T 세포의 경우, PBS를 처리한 CD8 T 세포에 비해 Klf4 유전자 발현수준이 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 4b). 아울러, APTO-253를 처리한 CD8 T 세포를 투여한 마우스의 경우, PBS를 처리한 CD8 T 세포를 도입한 마우스에 비해 암의 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 4c). 이상을 통해 Klf4 유전자 형질도입 외에도 Klf4 유도제인 APTO-253를 통한 CD8 T 세포의 Klf4 유전자 발현 증가 역시 CD8 T 세포의 항암 면역반응을 강화시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
이는, 본원발명의 일 실시예에 따라 유전자 형질도입 또는 약물처리에 의해 Klf4 유전자가 과발현된 CD8 T 세포가 체내에서 반복적인 항원 자극에 의해 유발되는 면역 탈진효과를 억제함으로써 선천성 면역반응을 통해 암세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 입증하는 결과이다.
실시예 4: 발현이 유도된 CAR-CD8 T 세포의 제조
4-1: EpCAM-결합 CAR 컨스트럭트의 구축
예시적인 CAR 구축물을 보여주는 개요도가 도 5에 제공된다. CAR 컨스트럭트는 하기와 같은 방법을 통해 생성된다. 항-EpCAM scFv(서열번호: 11), CD8α 힌지(서열번호: 12), CD28 TM(서열번호: 13), CD28 ICD(서열번호: 14) 및 CD3ζ ICD(서열번호: 15)를 순차적으로 포함하는 CAR 컨스트럭트(EpCAM-CD28-CD3ζ, 도 5)의 아미노산 서열을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 cDNA에 대한 핵산서열은 표준기술에 의해 합성되고, PCR로 증폭되고, pRRL-SIN-CMV-eGFP-WPRE(Dull et al., J. Virol. 72: 8463-8471, 1998) 또는 pELNS(Carpenito et al., Proc. Natl.. Acad. Sci. USA 106: 3360-3365, 2009)에 기반한 3세대 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터인, pCLPS(Parry et al., J. Imuunol., 171: 166-174, 2003)에 연결된다. 다만, 본 발명에서 사용된 벡터는 외래유전자 발현을 위한 프로모터로서 CMV를 EF-1α로 대체한 점에서 pCLPS와 상이하다. 암호화된 CAR는 EpCAM(서열 번호 11)에 결합하기 위한 scFv를 포함한다.
4-2: 항-Trop-2 CAR 컨스트럭트의 구축
항-Trop-2 scFv(서열 번호: 16), CD8α 힌지, CD28 및 CD3ζ ICD이 순차적으로 연결된 CAR(항-Trop-2-CD28-CD3ζ, 도 5)를 발현하기 위한 렌티바이러스 벡터는 anti-EpCAM-scFv를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 anti-Trop-2 scFv의 핵산서열로 대체된다는 점을 제외하고는 실시예 4-1에서 제조된 방법과 동일하게 제조된다.
4-3: 항-CEACAM6 CAR 컨스트럭트의 구축
항-CEACAM6 scFv(서열번호: 17), CD8α 힌지, CD28 TM, 및 CD3ζ ICD이 순차적으로 연결된 CAR(항-CEACM6-CD28-CD3ζ, 도 5)를 발현하기 위한 렌티바이러스 벡터는 anti-EpCAM-scFv를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 anti-CEACAM6 scFv의 핵산서열로 대체된다는 점을 제외하고는 실시예 4-1에서 제조된 방법과 동일하게 제조된다.
4-4: 항-CEACAM5 CAR 컨트럭트 구축
항-CEACAM5 scFv(서열번호: 18), CD8α 힌지, CD28 TM, 및 CD3ζ ICD이 순차적으로 연결된 CAR(항-CEACAM5-CD28-CD3ζ, 도 5)를 발현하기 위한 렌티바이러스 벡터는 anti-EpCAM-scFv를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 anti-CEACAM5 scFv의 핵산서열로 대체된다는 점을 제외하고는 실시예 4-1에서 제조된 방법과 동일하게 제조된다.
실시예 5: CAR 구축물을 포함하는 렌티바이러스 입자의 생산
상기 실시예에 기재된 바와 같이 작제된 고역가, 복제-결함 렌티바이러스 벡터는 Parry 등(J. Immunol., 171: 166-174, 2003)에 기재된 방법에 의해 제조가 된다. 간단히 말해서, HEK 293T 세포(ATCC CRL-3216)는 RPMI 1640, 10% 열 불활성화 FCS, 2 mM 글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 설페이트에서 배양된다. 세포는 7 ㎍의 pMDG.1(VSV-G 외피), 18 ㎍의 pRSV.rev(HIV-1 Rev 암호화 플라스미드), 18 ㎍의 pMDLg로 형질감염시키기 24시간 전에 T 150 조직 배양 플라스크당 5ㅧ106 cells로 파종된다. p.RRE(패키징 플라스미드) 및 Fugene 6(Roche Molecular Biochemicals)을 사용하여 형질도입될 렌티바이러스 벡터 15 μg를 처리한다. 배지는 형질감염 6시간 후 교체되고 바이러스 상층액은 형질감염 후 24시간 및 48시간에 수확된다. 바이러스 입자는 Beckman SW28 로터를 사용하여 28,000 rpm에서 3시간 동안 초원심분리에 의해 10배 농축된다.
실시예 6: CAR 렌티바이러스를 사용한 T 세포의 형질도입
특정 목적을 위해, 정상 개체의 T 세포는 구성체 테스트 및 설계를 위해 대상 CAR 구성체와 함께 사용될 수 있다. 초도배양 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 RosetteSep 키트(Stem Cell Technologies)를 사용한 음성 선택에 의해 백혈구 성분의 채집 후 건강한 지원자 기증자 또는 암환자의 PBMC에서 분리된다. T 세포는 완전 배지(10% 열 불활성화 FCS, 2 mM 글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 설페이트 및 10 mM HEPES가 보충된 RPMI 1640)에서 배양되고, 단일클론 항-CD3 및 항-CD28 항체가 코팅된 비드를 12~24시간 동안 처리하고 MOI(감염 다중도) 5~10에서 형질도입 대상 렌티바이러스 벡터로 형질도입한다. 인간 재조합 IL-2를 격일로 50 U/mL의 최종 농도 및 0.5 ~ 1.0 x 106 cells/mL의 세포 밀도가 유지되도록 한다. Klf4 컨스트럭트를 이용한 형질도입은 CAR 컨스트럭트내에 Klf4를 암화하는 폴리뉴클레오트가 포함되어 형질도입되거나, 별도의 CAR 컨스트럭의 형질도입과 동시에 수행되거나 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
실시예 7: 암 환자로부터의 자가 CAR-T 세포의 생성 및 평가
암환자로부터 자가 CAR-T 세포의 생성 여부는 Brentjens 등(Sci. Transl. Med. 5: 177ra38, 2013)의 방법에 의해 조사된다. 간단히 말해서, PBMC는 백혈구 성분채집술에 의해 암 환자로부터 수득되고, 세척되고, 냉동보존된다. T 세포는 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 마그네틱 비드(Invitrogen)로 활성화되고 대상 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 해동된 백혈구 성분채집 집단에서 분리된다. 형질도입된 T 세포는 요구되는 형질도입 T 세포 용량을 달성하기 위해 WAVE 생물반응기로 추가로 증식된다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Seoul National University R&DB Foundation MEDGENE THERAPEUTICS, INC. <120> A method of activating and proliferating exhausted CD8 T cells, CD8 T cells with enhanced activity prepared by the same, and use thereof <130> PD22-6177 <150> KR 10-2021-0047002 <151> 2021-04-12 <150> US 17/478,445 <151> 2021-09-17 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1452 <212> DNA <213> Mus msculus <400> 1 atgaggcagc cacctggcga gtctgacatg gctgtcagcg acgctctgct cccgtccttc 60 tccacgttcg cgtccggccc ggcgggaagg gagaagacac tgcgtccagc aggtgccccg 120 actaaccgtt ggcgtgagga actctctcac atgaagcgac ttcccccact tcccggccgc 180 ccctacgacc tggcggcgac ggtggccaca gacctggaga gtggcggagc tggtgcagct 240 tgcagcagta acaacccggc cctcctagcc cggagggaga ccgaggagtt caacgacctc 300 ctggacctag actttatcct ttccaactcg ctaacccacc aggaatcggt ggccgccacc 360 gtgaccacct cggcgtcagc ttcatcctcg tcttccccgg cgagcagcgg ccctgccagc 420 gcgccctcca cctgcagctt cagctatccg atccgggccg ggggtgaccc gggcgtggct 480 gccagcaaca caggtggagg gctcctctac agccgagaat ctgcgccacc tcccacggcc 540 cccttcaacc tggcggacat caatgacgtg agcccctcgg gcggcttcgt ggctgagctc 600 ctgcggccgg agttggaccc agtatacatt ccgccacagc agcctcagcc gccaggtggc 660 gggctgatgg gcaagtttgt gctgaaggcg tctctgacca cccctggcag cgagtacagc 720 agcccttcgg tcatcagtgt tagcaaagga agcccagacg gcagccaccc cgtggtagtg 780 gcgccctaca gcggtggccc gccgcgcatg tgccccaaga ttaagcaaga ggcggtcccg 840 tcctgcacgg tcagccggtc cctagaggcc catttgagcg ctggacccca gctcagcaac 900 ggccaccggc ccaacacaca cgacttcccc ctggggcggc agctccccac caggactacc 960 cctacactga gtcccgagga actgctgaac agcagggact gtcaccctgg cctgcctctt 1020 cccccaggat tccatcccca tccggggccc aactaccctc ctttcctgcc agaccagatg 1080 cagtcacaag tcccctctct ccattatcaa gagctcatgc caccgggttc ctgcctgcca 1140 gaggagccca agccaaagag gggaagaagg tcgtggcccc ggaaaagaac agccacccac 1200 acttgtgact atgcaggctg tggcaaaacc tataccaaga gttctcatct caaggcacac 1260 ctgcgaactc acacaggcga gaaaccttac cactgtgact gggacggctg tgggtggaaa 1320 ttcgcccgct ccgatgaact gaccaggcac taccgcaaac acacagggca ccggcccttt 1380 cagtgccaga agtgtgacag ggccttttcc aggtcggacc accttgcctt acacatgaag 1440 aggcactttt aa 1452 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer coloning klf4 gene <400> 2 agatctacca tgaggcagcc acctggcga 29 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for cloning klf4 gene <400> 3 gaattcttaa aagtgcctct tcatgtgtaa ggcaag 36 <210> 4 <211> 483 <212> PRT <213> Mus musulus <400> 4 Met Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ser Asp Met Ala Val Ser Asp Ala Leu 1 5 10 15 Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys 20 25 30 Thr Leu Arg Pro Ala Gly Ala Pro Thr Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu 35 40 45 Ser His Met Lys Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp Leu 50 55 60 Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly Ala Ala 65 70 75 80 Cys Ser Ser Asn Asn Pro Ala Leu Leu Ala Arg Arg Glu Thr Glu Glu 85 90 95 Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser Leu Thr 100 105 110 His Gln Glu Ser Val Ala Ala Thr Val Thr Thr Ser Ala Ser Ala Ser 115 120 125 Ser Ser Ser Ser Pro Ala Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala Pro Ser Thr 130 135 140 Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ile Arg Ala Gly Gly Asp Pro Gly Val Ala 145 150 155 160 Ala Ser Asn Thr Gly Gly Gly Leu Leu Tyr Ser Arg Glu Ser Ala Pro 165 170 175 Pro Pro Thr Ala Pro Phe Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp Val Ser Pro 180 185 190 Ser Gly Gly Phe Val Ala Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu Asp Pro Val 195 200 205 Tyr Ile Pro Pro Gln Gln Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly Leu Met Gly 210 215 220 Lys Phe Val Leu Lys Ala Ser Leu Thr Thr Pro Gly Ser Glu Tyr Ser 225 230 235 240 Ser Pro Ser Val Ile Ser Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp Gly Ser His 245 250 255 Pro Val Val Val Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Pro Pro Arg Met Cys Pro 260 265 270 Lys Ile Lys Gln Glu Ala Val Pro Ser Cys Thr Val Ser Arg Ser Leu 275 280 285 Glu Ala His Leu Ser Ala Gly Pro Gln Leu Ser Asn Gly His Arg Pro 290 295 300 Asn Thr His Asp Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Thr Arg Thr Thr 305 310 315 320 Pro Thr Leu Ser Pro Glu Glu Leu Leu Asn Ser Arg Asp Cys His Pro 325 330 335 Gly Leu Pro Leu Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly Pro Asn Tyr 340 345 350 Pro Pro Phe Leu Pro Asp Gln Met Gln Ser Gln Val Pro Ser Leu His 355 360 365 Tyr Gln Glu Leu Met Pro Pro Gly Ser Cys Leu Pro Glu Glu Pro Lys 370 375 380 Pro Lys Arg Gly Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys Arg Thr Ala Thr His 385 390 395 400 Thr Cys Asp Tyr Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Lys Ser Ser His 405 410 415 Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr His Cys 420 425 430 Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr 435 440 445 Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly His Arg Pro Phe Gln Cys Gln Lys 450 455 460 Cys Asp Arg Ala Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Ala Leu His Met Lys 465 470 475 480 Arg His Phe <210> 5 <211> 504 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Val Ser Asp Ala Leu Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser 1 5 10 15 Gly Pro Ala Gly Arg Glu Lys Thr Leu Arg Gln Ala Gly Ala Pro Asn 20 25 30 Asn Arg Trp Arg Glu Glu Leu Ser His Met Lys Arg Leu Pro Pro Val 35 40 45 Leu Pro Gly Arg Pro Tyr Asp Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Thr Asp 50 55 60 Leu Glu Ser Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gly Gly Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Pro Leu Pro Arg Arg Glu Thr Glu Glu Phe Asn Asp Leu Leu Asp Leu 85 90 95 Asp Phe Ile Leu Ser Asn Ser Leu Thr His Pro Pro Glu Ser Val Ala 100 105 110 Ala Thr Val Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser 115 120 125 Ser Ser Gly Pro Ala Ser Ala Pro Ser Thr Cys Ser Phe Thr Tyr Pro 130 135 140 Ile Arg Ala Gly Asn Asp Pro Gly Val Ala Pro Gly Gly Thr Gly Gly 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Gly Arg Glu Ser Ala Pro Pro Pro Thr Ala Pro Phe 165 170 175 Asn Leu Ala Asp Ile Asn Asp Val Ser Pro Ser Gly Gly Phe Val Ala 180 185 190 Glu Leu Leu Arg Pro Glu Leu Asp Pro Val Tyr Ile Pro Pro Gln Gln 195 200 205 Pro Gln Pro Pro Gly Gly Gly Leu Met Gly Lys Phe Val Leu Lys Ala 210 215 220 Ser Leu Ser Ala Pro Gly Ser Glu Tyr Gly Ser Pro Ser Val Ile Ser 225 230 235 240 Val Ser Lys Gly Ser Pro Asp Gly Ser His Pro Val Val Val Ala Pro 245 250 255 Tyr Asn Gly Gly Pro Pro Arg Thr Cys Pro Lys Ile Lys Gln Glu Ala 260 265 270 Val Ser Ser Cys Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Pro Leu Ser Asn Gly 275 280 285 His Arg Pro Ala Ala His Asp Phe Pro Leu Gly Arg Gln Leu Pro Ser 290 295 300 Arg Thr Thr Pro Thr Leu Gly Leu Glu Glu Val Leu Ser Ser Arg Asp 305 310 315 320 Cys His Pro Ala Leu Pro Leu Pro Pro Gly Phe His Pro His Pro Gly 325 330 335 Pro Asn Tyr Pro Ser Phe Leu Pro Asp Gln Met Gln Pro Gln Val Pro 340 345 350 Pro Leu His Tyr Gln Gly Gln Ser Arg Gly Phe Val Ala Arg Ala Gly 355 360 365 Glu Pro Cys Val Cys Trp Pro His Phe Gly Thr His Gly Met Met Leu 370 375 380 Thr Pro Pro Ser Ser Pro Leu Glu Leu Met Pro Pro Gly Ser Cys Met 385 390 395 400 Pro Glu Glu Pro Lys Pro Lys Arg Gly Arg Arg Ser Trp Pro Arg Lys 405 410 415 Arg Thr Ala Thr His Thr Cys Asp Tyr Ala Gly Cys Gly Lys Thr Tyr 420 425 430 Thr Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr Gly Glu 435 440 445 Lys Pro Tyr His Cys Asp Trp Asp Gly Cys Gly Trp Lys Phe Ala Arg 450 455 460 Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly His Arg Pro 465 470 475 480 Phe Gln Cys Gln Lys Cys Asp Arg Ala Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 485 490 495 Ala Leu His Met Lys Arg His Phe 500 <210> 6 <211> 1515 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atggctgtca gcgacgcgct gctcccatct ttctccacgt tcgcgtctgg cccggcggga 60 agggagaaga cactgcgtca agcaggtgcc ccgaataacc gctggcggga ggagctctcc 120 cacatgaagc gacttccccc agtgcttccc ggccgcccct atgacctggc ggcggcgacc 180 gtggccacag acctggagag cggcggagcc ggtgcggctt gcggcggtag caacctggcg 240 cccctacctc ggagagagac cgaggagttc aacgatctcc tggacctgga ctttattctc 300 tccaattcgc tgacccatcc tccggagtca gtggccgcca ccgtgtcctc gtcagcgtca 360 gcctcctctt cgtcgtcgcc gtcgagcagc ggccctgcca gcgcgccctc cacctgcagc 420 ttcacctatc cgatccgggc cgggaacgac ccgggcgtgg cgccgggcgg cacgggcgga 480 ggcctcctct atggcaggga gtccgctccc cctccgacgg ctcccttcaa cctggcggac 540 atcaacgacg tgagcccctc gggcggcttc gtggccgagc tcctgcggcc agaattggac 600 ccggtgtaca ttccgccgca gcagccgcag ccgccaggtg gcgggctgat gggcaagttc 660 gtgctgaagg cgtcgctgag cgcccctggc agcgagtacg gcagcccgtc ggtcatcagc 720 gtcagcaaag gcagccctga cggcagccac ccggtggtgg tggcgcccta caacggcggg 780 ccgccgcgca cgtgccccaa gatcaagcag gaggcggtct cttcgtgcac ccacttgggc 840 gctggacccc ctctcagcaa tggccaccgg ccggctgcac acgacttccc cctggggcgg 900 cagctcccca gcaggactac cccgaccctg ggtcttgagg aagtgctgag cagcagggac 960 tgtcaccctg ccctgccgct tcctcccggc ttccatcccc acccggggcc caattaccca 1020 tccttcctgc ccgatcagat gcagccgcaa gtcccgccgc tccattacca aggtcagtcc 1080 cggggatttg tagctcgggc tggggagccc tgtgtgtgct ggccccactt cgggacacac 1140 gggatgatgc tcaccccacc ttcttcaccc ctagagctca tgccacccgg ttcctgcatg 1200 ccagaggagc ccaagccaaa gaggggaaga cgatcgtggc cccggaaaag gaccgccacc 1260 cacacttgtg attacgcggg ctgcggcaaa acctacacaa agagttccca tctcaaggca 1320 cacctgcgaa cccacacagg tgagaaacct taccactgtg actgggacgg ctgtggatgg 1380 aaattcgccc gctcagatga actgaccagg cactaccgta aacacacggg gcaccgcccg 1440 ttccagtgcc aaaaatgcga ccgagcattt tccaggtcgg accacctcgc cttacacatg 1500 aagaggcatt tttaa 1515 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting klf4 gene <400> 7 gtgccccgac taaccgttg 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting klf4 gene <400> 8 gtcgttgaac tcctcggtct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting tox gene <400> 9 caactcaaag ccgtcagtat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting tox gene <400> 10 gctgaggagt cattcctggt 20 <210> 11 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EpCAM scFv <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Thr Pro Ser His Asn Ser His Gln Val Pro Ser Ala Gly Gly 115 120 125 Pro Thr Ala Asn Ser Gly Thr Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln 130 135 140 Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Val Arg Ile Ser Cys 145 150 155 160 Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys 165 170 175 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr 180 185 190 Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe 195 200 205 Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Ser Leu 210 215 220 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ala Ile Lys 225 230 235 240 Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 12 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 alpha hinge <400> 12 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 13 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 transmembrane domain <400> 13 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28 (CD <400> 14 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 zeta ICD <400> 15 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 16 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Trop-2 scFv <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 180 185 190 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 <210> 17 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEACAM6 scFv <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Ala Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Ala Asn Lys Ala Asn Gly His Thr Thr Asp Tyr Ser Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Ala Arg Asp Met Gly Ile Arg Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser 145 150 155 160 Ala Ser Ser Arg Val Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln Trp Ser Tyr Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 225 230 235 240 Ile Lys Arg <210> 18 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEACAM5 scFv <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 130 135 140 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val 180 185 190 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Arg

Claims (48)

  1. a) 개체에서 분리된 CD8 T 세포, b) 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 및 c) 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 CD8 T 세포의 탈진 상태 억제 방법.
  2. a) 개체에서 분리된 CD8 T 세포, b) 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 및 c) 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 CD8 T 세포의 증식 방법.
  3. a) 개체에서 분리된 CD8 T 세포, b) 상기 CD8 T 세포를 포함하는 세포집단, 및 c) 상기 CD8 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 유전자를 형질도입한 CAR-CD8 T세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포에서 Klf4 단백질의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는 시험관 내 조건에서의 CD8 T 세포의 항암 면역반응 강화방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Klf4 단백질의 과발현은 Klf4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터로 상기 CD8 T 세포를 형질감염시키거나 APTO-253을 상기 CD8 T 세포에 처리함으로써 달성되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 바이러스성 벡터는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 비바이러스성 벡터는 mRNA, DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 mRNA는 상기 Klf4 단백질을 암호화하는 mRNA 단독 또는 상기 mRNA 이외의 상기 비바이러스성 벡터와의 조합으로 사용되는, 방법.
  9. 제4항에 있어서,
    상기 발현벡터는 하나 또는 둘 이상의 면역증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 면역증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD40L, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, 방법.
  11. 삭제
  12. Klf4 유전자가 과발현되어 탈진현상이 억제된 CD8 T 세포를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 Klf4 유전자가 과발현되어 탈진현상이 억제된 CD8 T 세포는 치료를 필요로 하는 개체로부터 분리된 자가 유래 CD8 T 세포 또는 타인으로부터 분리된 타가 유래 CD8 T 세포인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 Klf4 유전자가 과발현되어 탈진현상이 억제된 CD8 T 세포는 CD8 T 세포에 대한 Klf4 유전자 포함된 발현벡터의 형질도입 및/또는 상기 CD8 T 세포에 대한 APTO-253의 처리에 의해 제조되는, 조성물.
  15. Klf4 유전자가 과발현되도록 형질전환되어 탈진현상이 억제된, 형질전환 CD8 T 세포.
  16. 제15항에 있어서,
    개체로부터 분리된 CD8 T 세포 또는 그를 포함하는 세포집단를 숙주세포로 하여 상기 숙주세포에 Klf4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 형질도입함으로써 제조되는, 형질전환 CD8 T 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인, 형질전환 CD8 T 세포.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 바이러스성 벡터는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 형질전환 CD8 T 세포.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 비바이러스성 벡터는 mRNA, DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜인, 형질전환 CD8 T 세포.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 mRNA는 Klf4 단백질을 암호화하는 mRNA 단독 또는 상기 mRNA 이외의 상기 비바이러스성 벡터와의 조합으로 사용되는, 형질전환 CD8 T 세포.
  21. 외래성 Klf4 단백질 및 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)가 발현되도록 형질전환되어 탈진현상이 억제된, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 CAR는 scFv, sdAb(single domain antibody), VHH, VNAR, Affibody, Affilin, Affimer, Affitin, Alphabody, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, Kunitz domain peptide, monobody, nanoCLAMP, 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR) 및 repebody로 구성되는 군으로부터 선택되는 단일쇄 기반 항체 유사체-세포막 통과 도메인-보조자극인자-세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합단백질인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 단일쇄 기반 항체 유사체는 암 항원 또는 병원체 유래 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 유사체인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 암 항원은 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), Trop-2(trophoblast cell surface antigen 2), CEACAM5(CEA cell adhesion molecule 5), CEACAM6(CEA cell adhesion molecule 6), 암배아항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 산 포스파테이즈(prostatic acid phosphatase, PAP), 전립선 특이적 막항원(PSMA), Her2/neu, MUC-1, BCR/ABL, 알파-페토프로테인(AFP), LMP2a와 같은 엡스타인-바 바이러스(EBV) 유래 항원, B형 인간간염바이러스 (HBV) 유래 항원, C형 인간간염바이러스(HCV) 유래 항원, Proteinase 3, WT-1, PAP(prostatic acid phosphatase), G250, 멜라노마 항원 유전자(MAGE, melanoma antigen gene), BAGE, GAGE, NY-ESO-1, 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제-관련 단백질-1(TRP-1), TRP-2, gp100, MART-1, Ig Idiotype, CDK4, caspase-8, β-catenin, BCR/ABL, 인간 유두종 바이러스(HPV E6/E7), HHV-8, 5T4, p53, 암항원125(CA-125), 암항원-72-4(CA-72-4), 암항원-15-3(CA-15-3), 또는 암항원-19-9(CA-19-9)인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 병원체 유래 항원은 병원성 미생물(pathogenic microorganism), 바이러스 또는 기생충 유래의 항원인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 병원성 미생물은 병원성 세균(pathogenic bacteria) 또는 병원성 진균(pathogenic fungus)인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 병원성 세균은 백일해균(Bordetella pertussis) 파상풍균(tetanus), 디프테리아균(diphtheria), 헬리코박터균 파이로리(Helicobacter pylori) 폐렴구균(Pneumococcus sp.), 결핵균(Mycobacterium tuberoculosis), 콜레라(Cholera sp), 포도상구균(Staphylococcus sp.) 적리균(Shigella sp.), 보렐리아균(Borrelia sp.) 또는 살모넬라균(Salmonella sp.)인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 병원성 진균은 칸디다균(Candida sp.) 트리코파이톤균(Trichophyton sp.), 아스퍼질러스균(Aspergillus sp.) Fonsecaea sp. Epidermophyton sp., Piedraia sp., Malassezia sp., Pseudallescheria sp., Basidiobolus sp., Conidiobolus sp., Rhinosporidium sp., Paracoccidioides sp., Cryptococcus sp., Blastomyces sp., Sporothrix sp., Mucor sp., Absidia sp., Rhizopus sp., Pneumocystis sp., Wangiella sp.,, Phialophora sp., Schizophyllum sp.인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  29. 제25항에 있어서,
    상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV), 소수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV), A형 간염바이러스 항원(hepatitis A virus, HAV), B형 간염바이러스(hepatitis B virus, HBV), C형 간염C(HCV), D형 간염바이러스(HDV), G형 간엽바이러스(HGV), 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV), 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus), 또는 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  30. 삭제
  31. 제22항에 있어서,
    상기 세포막 통과 도메인은 4-1BB/CD137, 활성화 NK 세포 수용체, 이뮤노글로불린 단백질, B7-H3, BAFFR, BLAME(SLAMF8), BTLA, CD100(SEMA4D), CD103, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 제타, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8알파, CD8베타, CD96(Tactile), CDl la, CDl lb, CDl lc, CDl ld, CDS, CEACAM1, CRT AM, 시토카인 수용체, DAP-10, DNAM1(CD226), Fc 감마 수용체, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, Ig 알파(CD79a), IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, 유도성 T 세포 공동자극자(inducible T-cell costimulator, ICOS), 인테그린, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGBl, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, LIGHT, LTBR, Ly9(CD229), 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1; CDl-la/CD18), MHC 부류 1 분자, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), PSGL1, SELPLG(CD162), 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), SLAM(SLAMF1; CD150; IPO-3), SLAMF4(CD244; 2B4), SLAMF6(NTB-A; Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNF 수용체 단백질, TNFR2, TNFSF14, 톨 리간드 수용체, TRANCE/RANKL, VLA1, 또는 VLA-6 유래의 막통과 도메인인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  32. 제22항에 있어서,
    상기 보조자극인자는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L(CD252)의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  33. 제22항에 있어서,
    상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2Rβ/CD122, IL-2Rα/CD132, DAP10, DAP12, 그리고 CD40 중에서 하나 또는 그 이상의 세포질 내 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는, 형질전환 CAR-CD8 T 세포.
  34. 제14항의 형질전환 CD8 T 세포 또는 제21항의 형질전환 CAR-CD8 T 세포를 유효성분으로 포함하는 암, 세균성 감염증, 진균성 감염증, 바이러스 감염증 및 기생충 감염증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 선천성 면역반응이 필요한 질환의 치료용 조성물.
  35. 제2항에 있어서,
    상기 Klf4 단백질의 과발현은 Klf4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터로 상기 CD8 T 세포를 형질감염시키거나 APTO-253을 상기 CD8 T 세포에 처리함으로써 달성되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 바이러스성 벡터는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  38. 제36항에 있어서,
    상기 비바이러스성 벡터는 mRNA, DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜인, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 mRNA는 Klf4 단백질을 암호화하는 mRNA 단독 또는 상기 mRNA 이외의 상기 비바이러스성 벡터와의 조합으로 사용되는, 방법.
  40. 제35항에 있어서,
    상기 발현벡터는 하나 또는 둘 이상의 면역증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 면역증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD40L, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, 방법.
  42. 제3항에 있어서,
    상기 Klf4 단백질의 과발현은 Klf4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터로 상기 CD8 T 세포를 형질감염시키거나 APTO-253을 상기 CD8 T 세포에 처리함으로써 달성되는, 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인, 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 바이러스성 벡터는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
  45. 제43항에 있어서,
    상기 비바이러스성 벡터는 mRNA, DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜인, 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 mRNA는 상기 Klf4 단백질을 암호화하는 mRNA 단독 또는 상기 mRNA 이외의 상기 비바이러스성 벡터와의 조합으로 사용되는, 방법.
  47. 제42항에 있어서,
    상기 발현벡터는 하나 또는 둘 이상의 면역증진 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 면역증진 펩타이드는 CD28, ICOS(inducible costimulator), CTLA4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4), PD1(programmed cell death protein 1), BTLA(B and T lymphocyte associated protein), DR3(death receptor 3), 4-1BB, CD2, CD40, CD40L, CD30, CD27, SLAM(signaling lymphocyte activation molecule), 2B4(CD244), NKG2D(natural-killer group 2, member D)/DAP12(DNAX-activating protein 12), TIM1(T-Cell immunoglobulin and mucin domain containing protein 1), TIM2, TIM3, TIGIT, CD226, CD160, LAG3(lymphocyte activation gene 3), B7-1, B7-H1, GITR(glucocorticoid-induced TNFR family related protein), Flt3 리간드(fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 플라젤린(flagellin), HVEM(herpesvirus entry mediator) 또는 OX40L의 세포질 도메인 또는 이들 중 둘 이상의 연결체인, 방법.
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