KR102574286B1 - 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐암 치료, 특히 비소세포폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 개체의 특정 유전자에 변이가 존재함을 확인하면, 그 개체의 폐암, 특히 비소세포폐암을 치료함에 따른 예후를 예측할 수 있다. 또한, 본 발명은, 폐암 치료와 관련하여 외과적 절제술에 이어서 보조 요법을 적용해야 하는지의 여부를 결정하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있다.

Description

폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 바이오마커 및 이의 용도{BIOMARKER FOR PREDICTING PROGNOSIS OF LUNG CANCER TREATMENT AND USE THEREOF}

본 발명은 폐암 치료의 예후, 특히 비소세포폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 외과적 절제술에 이어 보조 요법을 받았거나 받을 예정인 폐암 환자의 예후를 예측하기 위한 것이다.

클론성 조혈증(CH)은 백혈병 관련 유전자에 체세포 돌연변이를 보유하는 클론 유래 조혈 줄기 세포(HSC)의 확장으로 정의되는 상태이며, 이는 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 검출될 수 있다(문헌[Genovese G, Kahler AK, Handsaker RE, et al: Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. N Engl J Med 371:2477-87, 2014]; 문헌[Park SJ, Bejar R: Clonal hematopoiesis in cancer. Exp Hematol 83:105-112, 2020]; 및 문헌[Jaiswal S, Ebert BL: Clonal hematopoiesis in human aging and disease. Science 366, 2019] 참조). CH의 발생은 노화와 관련이 있으며, 혈액 악성 종양 없이 발견될 수도 있다. 이는 담배의 사용, 방사선 요법(RTx) 및/또는 화학요법(CTx)에의 노출과도 상당한 관련성이 있다. 또한, CH는 후속 심혈관 질환 및 혈액 악성 종양의 발병률을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

한편, 폐암은 가장 흔하게 진단되는 암이며, 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이다. 폐암 치료를 위해 가능한 경우 수술에 의한 절제가 우선적으로 시행되지만 수술 후 5년간 생존율은 65%에 머무르고 있다. 따라서, 수술 후 추가 치료, 재발의 조기 발견 등을 통해 생존율을 높이기 위해서는 폐암 수술 후 예후를 예측할 수 있는 예측 인자의 개발이 중요하다. 연령, 성별, 및 암 병기와 같은 몇 가지 예후 인자가 확인되었지만, NGS 시대를 맞아 새로운 인자를 탐색할 필요가 있다.

Jaiswal S, Ebert BL: Clonal hematopoiesis in human aging and disease, Science 366, 2019. Park SJ, Bejar R: Clonal hematopoiesis in cancer, Exp Hematol 83:105-112, 2020. Genovese G, Kahler AK, Handsaker RE, et al: Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence, N Engl J Med 371:2477-87, 2014.

본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 폐암 환자에서 폐암 치료의 예후를 예측하는 방법 또는 폐암 치료의 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것을 일 목적으로 한다.

본 발명은 폐암 환자에서 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

본 발명은 폐암 환자에서 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 폐암 환자에서 폐암 치료의 예후를 예측하기 위해 클론성 조혈증의 유전자 변이를 검출할 수 있는 유전자 분석용 패널을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 폐암 치료 방법 또는 폐암 치료를 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 폐암에 대해 치료받는 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 통해 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 개체의 폐암 치료의 예후를 예측하는 방법 또는 개체의 폐암 치료의 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 폐암에 대해 치료받는 개체로부터 분리한 생물학적 시료를 이용하여 클론성 조혈증의 존재를 확인하기 위한 제제를 유효성분으로 포함하는 개체의 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 개체의 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 클론성 조혈증의 유전자 변이를 검출하기 위한 유전자 분석용 패널이 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 폐암 치료를 위한 치료제의 투여 전에, 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 통해 상기 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 폐암의 치료 방법 또는 폐암의 치료를 위한 정보의 제공 방법이 제공된다.

본 발명에 따라 개체의 클론성 조혈증(CH) 관련 유전자에 변이가 존재함을 확인하면, 그 개체의 폐암, 특히 비소세포폐암의 치료에 따른 예후를 예측할 수 있다. 또한, 본 발명은 폐암 치료와 관련하여, 외과적 절제술에 이어서 보조 요법의 적용을 결정하는 데 유용한 정보, 폐암 치료를 위한 치료제의 투여 여부를 결정하는 데 유용한 정보 등을 제공할 수 있으며, 나아가 폐암 치료를 위한 약물 후보 물질의 임상시험에서 환자에 대한 약물 후보 물질의 유효성, 안전성 등의 평가에 유용한 정보를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 사용된 CONSORT(Consolidated Standards of Reporting Trials) 다이어그램을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 전체 코호트에서 클론성 조혈증(CH) 돌연변이의 존재에 따른 환자의 전체 생존율 및 무재발 생존율을 각각 나타낸다. 도 2c는 성향 점수 매칭(PSM) 후 CH 돌연변이의 존재에 따른 환자의 전체 생존율을 도시한다.
도 3은 CH 존재에 따른 누적 사망률을 나타낸다. 구체적으로, 도 3a, 도 3b 및 도 3c는 각각 CH의 존재에 따른 누적 폐암 사망률, CH의 존재에 따른 누적 비-폐암 사망률, 및 CH의 존재에 따른 원인 불명의 누적 사망률을 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 각각 PSM 전과 후의 병기 IIB기 폐암에 대한 보조 요법을 받은 환자에서 CH 돌연변이의 존재에 따른 전체 생존율을 나타낸다. 도 4c 및 도 4d는 각각 PSM 전과 후의 IIB기 폐암에 대한 보조 요법이 수행되지 않은 환자에서 CH 돌연변이 존재에 따른 전체 생존율을 나타낸다(Tx, Treatment).
도 5a 내지 도 5c는 전체 코호트에서 확인된 CH 돌연변이의 특성을 나타낸다. 도 5a는 코호트에서 환자의 연령에 따른 CH 유병률을 나타낸다. 도 5b는 환자당 보유한 돌연변이의 수를 나타낸다. 도 5c는 각 CH 유전자의 돌연변이 수를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6c는 각각 병기 IIB기, IIIA기 및 IIIB기에서 CH 돌연변이의 존재에 따른 환자의 전체 생존율을 나타낸다.

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 구현예/실시예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 명세서에 사용된 기술 및 학술 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.

정의

본 명세서 사용되는 용어 "약"은 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 조건, 조성, 양 등을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.

용어 "클론성 조혈증(Clonal haematopoiesis)"은 조혈 줄기 세포에 체세포 돌연변이가 발생하여 선택적 증식의 기회를 얻게 되는 경우, 돌연변이가 발생한 클론이 확장하여 백혈구의 일정 부분을 차지하는 증상을 의미한다.

용어 "개체"는 "환자"와 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 폐암이 발병하거나 폐암에 대한 치료를 필요로 하는 포유 동물, 예를 들어, 영장류(예: 인간), 반려 동물(예: 개, 고양이 등), 가축 동물(예: 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예: 랫트, 마우스, 기니피그 등)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 개체는 인간이다.

용어 "예후"는 폐암과 같은 질환의 발병, 재발, 전이성 확산, 생존율, 무병 생존율, 약물 내성 또는 감수성을 비롯한 폐암에 기인한 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 구체적으로, 예후는 폐암 환자에서 수술, 항암 화학 요법, 항암 면역 요법, 화학방사선 요법 또는 이들 요법의 조합을 포함하는 폐암 치료에 따른 생존 예후를 의미하는 것일 수 있다. 또한, 폐암 치료의 예후는 환자의 폐암 치료를 위한 치료제에 대한 반응성을 의미하는 것일 수 있다.

용어 "예측"은 환자가 항암 화학 요법, 화학방사선 요법 등 치료법 또는 폐암 치료제에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 생존할 가능성을 미리 판단하는 것을 의미한다. 생존 예후를 예측하는 것은 환자에 가장 적절한 치료 방법을 선택하도록 도움을 줄 수 있고, 해당 치료 방법에 선호적으로 반응하는지 확인하거나, 해당 치료 방법을 수행한 후 환자의 장기 생존 여부를 예측할 수 있다.

용어 "생물학적 시료"라는 용어는 개체로부터 얻은 임의의 생물학적 표본으로서, 폐암 치료의 예후를 예측하고자 하는 개체로부터 분리된 조직, 종양 조직, 폐종양 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 타액, 객담, 점액 또는 소변과 같은 시료를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.

용어 "보조 요법"은 화학요법(CTx), 화학방사선 요법(CRTx), 분자 타겟 요법, 고주파온열암치료, 생물학적 제제 등을 이용한 면역요법을 포함하며, 종양 제거 수술 전후에 시행하여 암을 국소적 또는 전신적으로 치료하는 데 보조적으로 사용될 수 있는 것이라면 어떠한 요법도 포함될 수 있다.

용어 "전체 생존율"은 암 환자가 수술을 받은 후 5년 동안 암이 재발하거나 전이되었을지라도 생존한 비율을 의미한다.

용어 "무재발 생존율"은 수술을 받은 후 5년 동안 암의 재발없이 생존한 비율을 의미한다.

용어 "미스센스 변이"는 DNA 사슬 위의 어떤 부위에 하나의 염기 치환이 일어나서 mRNA의 유전암호가 변해 본래의 것과는 다른 아미노산으로 지정되어 단백질에 영향을 주게 되는 유전자 변이를 지칭한다.

용어 "프레임시프트 변이"는 염기가 3으로 나누어지지 않는 개수로 삽입되거나 결실되어 일어나는 유전자 변이를 지칭한다.

용어 "넌센스 변이"는 하나의 염기 치환으로 본래의 어느 한 아미노산을 암호화하는 코돈이 아미노산을 암호화하지 않는 종결코돈으로 변화되어 단백질의 합성이 그 코돈이 있는 곳에서 중단되는 유전자 변이를 지칭한다.

용어 "스플라이스 변이"는 전사된 RNA 분자 내 또는 개별적으로 전사된 RNA 분자 사이에 대안적인 스플라이싱 부위의 사용을 통해 발생하는 변이를 지칭한다.

용어 "프라이머"란 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산(nucleoside triphosphate)의 존재하에 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로서, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

용어 "안티센스 핵산"은 타겟으로 하는 유전자 변이체에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 타겟 유전자 변이체와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, 타겟 유전자 변이체를 검출하는 데 사용될 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.

용어 "유전자 패널(gene panel)"은 복수 개의 목적 유전자에 대한 돌연변이를 검출할 수 있는 복수 개의 제제가 하나의 패널로 구성된, 유전자 변이 검출 도구를 의미한다.

용어 "폐암 치료를 위한 치료제" 또는 "폐암 치료제"는 폐암이 발병한 환자의 증상을 개선, 경감 또는 치료하는 효과를 나타내는 물질을 의미하며, 폐암 세포의 형태학적, 생리학적 또는 유전학적 변화를 유의하게 나타내는 한, 이들의 물리적 성상, 화학적 성상, 생물학적 기원 등은 특별히 제한되지 않는다. 치료제는 상기 보조 요법 즉, 화학요법(CTx), 화학방사선 요법(CRTx), 분자 타겟 요법, 생물학적 제제 등을 이용한 면역요법 등에서 사용될 수 있는 모든 종류의 물질을 포함한다.

용어 "임상시험"은 인간을 대상으로 의약품의 적용을 연구하는 모든 과정을 의미하며, 의약품의 안전성, 유효성 등을 확증하고자 시행하는 연구 절차뿐만 아니라 오리지널 의약품과 복제의약품의 생물학적 동등성을 입증하는 생동성 시험, 이미 허가되어 시판 중인 의약품에 대한 임상 연구 또는 부작용 연구 등을 모두 포함한다.

폐암 치료의 예후 예측을 위한 클론성 조혈증의 진단

본 발명은 부분적으로 폐암 치료를 받는 개체에 클론성 조혈증(Clonal haematopoiesis, CH)이 존재하는지 여부가 폐암 치료의 예후와 유의미한 관련성이 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 또한, 클론성 조혈증에 관여하는 유전자들 중 특정 유전자에서의 돌연변이가 보다 큰 관련성이 있음을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명은 폐암의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 폐암에 대해 치료받는 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 개체에 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 확인된 경우에 클론성 조혈증이 존재하지 않는 경우에 비해 폐암 치료의 예후가 양호하지 않음을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 클론성 조혈증이 있는 개체는 그렇지 않은 개체와 비교하여 전체 생존율이 더 불량하였으며, 성향 점수 매칭(PSM) 기법을 적용하여 클론성 조혈증 외의 다른 변수를 배제한 후에도 여전히 클론성 조혈증이 있는 환자는 그렇지 않은 환자와 비교하여 더 불량한 생존율을 보였다(실시예 6.3 및 도 2a 내지 도 2c 참조). 이와 같이, 클론성 조혈증의 존재는 폐암 환자의 치료에 있어 불량한 예후의 주요 인자로 작용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 폐암에 의한 사망율은 클론성 조혈증의 존재 유무와 관계없이 유사하였지만, 비-폐암 사망률 및 원인 불명의 사망률은 클론성 조혈증이 없는 환자와 비교하여 클론성 조혈증이 있는 환자에서 유의하게 더 높았다(실시예 6.3 및 도 3a 내지 도 3c 참조). 또한, 보조 요법을 받은 환자의 경우 클론성 조혈증의 존재는 더 불량한 전체 생존율과 연관되어 있었지만, 보조 요법을 받지 않은 환자의 경우에 클론성 조혈증의 존재는 전체 생존율에 큰 영향을 미치지 못함을 확인하였다(실시예 6.3 및 도 4a 내지 도 4d 참조). 이러한 결과는 폐암의 악화 외의 다른 원인 예컨대, 심폐 질환, 패혈증, 뇌졸중 등의 발생에 의해 사망률이 증가한 것이고 클론성 조혈증의 존재 자체가 보조 요법과 관련된 불리한 결과를 증폭시켜 폐암 치료의 예후를 더욱 악화시킬 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

따라서, 본 발명에 따라 클론성 조혈증의 존재 유무를 확인하는 것은 폐암 치료의 예후를 예측할 수 있는 동시에 폐암 수술 후 후속하는 적절한 후속 요법의 선택에 도움을 주어 폐암 치료 후 개체의 생존율을 높일 수 있다. 또한, 치료제 투여 전에 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하여 보조 요법 등 폐암 치료에 사용되는 치료제의 효능을 평가하기 위한 개체를 선별함으로써 치료제의 효능 평가를 보다 효율적이고 정확하게 할 수 있고, 이러한 치료제의 효능 평가(예컨대, 임상시험)의 비용을 낮출 수 있다. 예컨대, 치료제의 임상시험을 위한 환자군(피험자) 모집에 있어서, 치료제를 투여하기 전에 대상 환자에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하고, 클론성 조혈증이 존재하는 환자를 환자군에서 제외하여 폐암 치료제의 효능 평가를 보다 효율적이고 정확하게 할 수 있다. 나아가, 치료제를 투여하기 전 개체에서 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하여 폐암 치료에 사용되는 치료제에 대한 반응성이 높은 개체를 선별함으로써, 개체에서 치료제 효능을 높이고 폐암 치료 효과를 높일 수 있다.

폐암 치료의 예후 예측 방법

본 발명의 일 태양에 따르면, 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 통해 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 개체의 폐암 치료의 예후를 예측하는 방법이 제공된다. 또한, 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 통해 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 개체의 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.

상기 클론성 조혈증과 관련된 체세포 돌연변이가 발생하는 유전자로는 APC, ASXL1, ASXL2, ATM, BCL11B, BCOR, BCORL1, BIRC3, BRAF, BRCC3, CARD11, CASP8, CBL, CD58, CD79B, CNOT3, CREBBP, CUX1, DDX3X, DNMT3A, EP300, ETV6, EZH2, FAM46C, FBXW7, FLT3, FOXP1, GNAS, GNB1, GPS2, HIST1H1C, IDH2, IKZF1, IKZF2, JAK1, JAK2, JAK3, JARID2, KDM6A, KIT, KLHL6, KMT2D, KRAS, LUC7L2, MAP3K1, MPL, MYD88, NF1, NFE2L2, NOTCH1, NOTCH2, NRAS, PDS5B, PDSS2, PHF6, PHIP, PIK3CA, PIK3R1, PPM1D, PRDM1, PRPF40B, PTEN, PTPN11, RAD21, RIT1, RPS15, SETD2, SETDB1, SF1, SF3A1, SF3B1, SMC1A, SMC3, SRSF2, STAG1, STAG2, STAT3, SUZ12, TBL1XR1, TET1, TET2, TNFAIP3, TNFRSF14, TP53, U2AF1, VHL, WT1, ZRSR2 및 CHEK2가 포함된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 개체로부터 분리한 생물학적 시료를 이용한 유전자 분석을 통해 상기 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하는지 여부에 기초하여 클론성 조혈증의 존재 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 DNMT3A, ASXL1, TET2, PPM1D, ATM, BCL11B, CARD11, CBL, CD79B, CHEK2, CUX1, ETV6, FOXP1, JAK2, KMT2D, MAP3K1, MPL, NF1, NOTCH1, NOTCH2, PHIP, PRPF40B, RAD21, SETD2, SF3B1, TET1, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 ASXL1, CBL, CHEK2, CUX1, DNMT3A, FOXP1, JAK2, KMT2D, MPL, NOTCH1, PPM1D, PRPF40B, SF3B1, TET2, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 DNMT3A, ASXL1, TET2, PPM1D, SF3B1, ATM, 및 TNFAIP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 상기 언급된 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자를 포함할 수 있으며, 이 때, 상기 하나 이상의 유전자는 상기 선택된 하나의 유전자를 제외한 나머지 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 하나 이상의 유전자는 DNMT3A를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 하나 이상의 유전자는 ASXL1, TET2, PPM1D, ATM, BCL11B, CARD11, CBL, CD79B, CHEK2, CUX1, ETV6, FOXP1, JAK2, KMT2D, MAP3K1, MPL, NF1, NOTCH1, NOTCH2, PHIP, PRPF40B, RAD21, SETD2, SF3B1, TET1, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 하나 이상의 유전자는 ASXL1, CBL, CHEK2, CUX1, FOXP1, JAK2, KMT2D, MPL, NOTCH1, PPM1D, PRPF40B, SF3B1, TET2, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 하나 이상의 유전자는 ASXL1, TET2, PPM1D, SF3B1, ATM, 및 TNFAIP3로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 유전자에 변이가 존재하는지 여부 및 변이 대립 유전자 빈도(variant allele frequency, VAF)에 기초하여 클론성 조혈증의 존재 여부를 결정할 수 있다. 예컨대, 개체로부터 분리한 생물학적 시료를 이용한 유전자 분석을 통해, 상기 유전자 군의 유전자들 중 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하고 변이 대립 유전자 빈도가 일정 수준 이상, 예를 들어 약 1.8% 이상, 약 1.9% 이상, 또는 약 2% 이상인 경우에, 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 진단할 수 있다.

상기 "개체"는 폐암에 대해 치료받는 환자를 의미할 수 있다. 구체적으로 개체는 폐암이 발병한 환자를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로 개체는 종양 제거 수술을 받기 전 또는 받은 후의 환자를 의미할 수 있다. 또한, 개체는 보조 요법을 받기 전 환자일 수 있다.

상기 "폐암"은 폐에서 기원한 종양을 의미하며, 편평상피암, 선암, 대세포암과 같은 비소세포암 및 소세포암을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 폐암은 비소세포폐암일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 개체의 비소세포폐암은 병기가 I기, II기 또는 그 이후의 병기일 수 있다. 보다 더 구체적으로 상기 개체의 비소세포폐암 병기는 IA기, IB기, IIA기, IIB기, IIIA기 또는 IIIB기일 수 있고, 보다 구체적으로 IIB기일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 폐암 치료의 예후는 개체에서 수술, 항암 화학 요법, 항암 면역 요법, 화학방사선 요법 또는 이들 요법의 조합 또는 이를 포함하는 폐암 치료에 따른 생존 예후를 의미하는 것일 수 있다. 예컨대, 폐암 치료의 예후는 종양 제거 수술 전후에 이루어지는 보조 요법 또는 이를 포함하는 폐암 치료에 따른 전체 생존율 또는 무재발 생존율을 의미하는 것일 수 있다. 또한, 폐암 치료의 예후는 종양 제거 수술 이후 또는 종양 제거 수술에 이은 보조 요법 적용 이후 전체 생존율 또는 무재발 생존율을 포함하는 것일 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 폐암 치료의 예후는 폐암에 대해 치료받는 개체에서 수술 후 항암 화학 요법, 방사선 요법 등 보조 요법에 대한 반응성, 이에 따른 생존 예후, 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. 항암 화학 요법은 항암제를 이용하는 치료 요법을 의미하는 것일 수 있다. 예후는 예를 들면, 백금계 약물, 탁센계 약물, 빈카 알칼로이드계 약물, 대사길항제 등을 포함하는 항암제를 투여한 폐암 환자에서 항암제에 대한 반응성 및/또는 이에 따른 생존 예후를 의미하는 것일 수 있다. 폐암 환자의 경우에 수술을 진행하고 보조 요법을 진행하는데, 비슷한 임상적 특징 또는 비슷한 병기를 가지는 환자들 중에도 각 보조 요법에 대한 반응이 다양하고 생존 예후에도 상당한 차이를 나타낼 수 있다. 상기 클론성 조혈증과 관련된 유전자 변이 마커를 이용하는 경우, 보조 요법에 대한 반응성 및/또는 이에 따른 생존 예후를 예측할 수 있으며, 그에 따라 추가 필요한 치료 방법의 진행 방향을 결정할 수 있다. 이로써 폐암 발병 후의 생존율을 현저히 높일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 비소세포폐암 수술을 받은 환자에 CH가 존재하는지 여부에 따른 환자 사망률을 확인한 결과, 환자 사망률에 있어 CH의 존재에 따른 유의한 차이가 폐암 사망률이 아닌 비-폐암 사망률 및 원인 불명의 사망률에서 확인되었고, 이러한 유의한 차이는 CH가 있는 환자에서 CH와 관련된 여러 불리한 결과(예컨대 심폐 질환, 패혈증, 뇌졸중 등)가 CTx 또는 RTx에 의해 증폭되어 결국 생존에 영향을 미칠 수 있음을 뒷받침한다. 따라서, 폐암 치료를 받는 개체에 CH의 존재 유무는 보다 적절한 보조 요법의 선택을 가능하게 한다. 예컨대, 폐암 치료를 받는 개체 중 CH가 존재하는 것으로 진단된 환자의 경우, 폐암 치료의 예후를 개선하기 위해, 통상의 항암 보조 요법 또는 선별된 항암 보조 요법과 함께, 또는 단독으로 항염증제(예: 카나키누맙)를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계는 종양 제거 수술을 받기 전, 종양 제거 수술을 받은 후, 종양 제거 수술 후 보조 요법 적용 전, 또는 종양 제거 수술에 이은 보조 요법 적용 후에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 종양 제거 수술을 받기 전에는 클론성 조혈증의 존재 여부를 확인함으로써 외과적 절제술 대신 화학요법이나 방사선 요법 등이 환자의 예후에 더 유리한지 여부를 판단할 수 있다. 다른 예로, 종양 제거 수술을 받은 후에는 클론성 조혈증의 존재 여부에 따라 추가적인 보조 요법을 적용하는 것이 환자의 예후에 유리한지 여부를 판단할 수 있다. 또 다른 예로, 종양 제거 수술 및 보조 요법 적용 후에는 클론성 조혈증의 존재 여부 및/또는 돌연변이가 발생한 유전자의 종류에 따라 어떤 보완 요법을 추가로 실시할 것인지 여부를 결정할 수 있다.

상기 클론성 조혈증과 관련된 유전자 변이는 미스센스(missense) 변이, 프레임시프트(frameshift mutation) 변이, 넌센스(nonsense) 변이, 스플라이스(splice) 변이, 뉴클레오티드 삽입, 결실 또는 치환, 이들의 조합 등의 형태일 수 있다.

예를 들어, 상기 DNMT3A 유전자의 돌연변이는 하기 표 1에 기재된 변이 중 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 TET2 유전자의 돌연변이는 하기 표 2에 기재된 변이 중 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 ASXL1 유전자의 돌연변이는 하기 표 3에 기재된 변이 중 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PPM1D 유전자의 돌연변이는 하기 표 4에 기재된 변이 중 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 ATM, BCL11B, CARD11, CBL, CD79B, CHEK2, CUX1, ETV6, FOXP1, JAK2, KMT2D, MAP3K1, MPL, NF1, NOTCH1, NOTCH2, PHIP, PRPF40B, RAD21, SETD2, SF3B1, TET1, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2 유전자의 돌연변이는 각각 하기 표 5에 기재된 변이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 JAK2 유전자 5073770 위치의 돌연변이는 1849번 위치의 염기 G가 T로 치환되는 미스센스 돌연변이일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 통해 상기 변이가 존재하는 것으로 확인된 경우에, 상기 변이가 존재하지 않는 경우에 비해, 개체의 폐암 치료의 예후가 양호하지 않음을 나타내는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 폐암 환자들의 수술 후 보조 요법 치료 경과를 추적 관찰한 결과, 상기 CH 관련 유전자 변이가 존재하는 폐암 환자들의 경우에 CH 관련 유전자 변이가 없는 폐암 환자들에 비해 수술 후 5년간 생존율이 통계적으로 유의하게 낮은 양상을 나타내었다.

상기 유전자 분석은 차세대 유전체 시퀀싱 분석법(Next Generation Sequencing, NGS) 및 PCR-기반 기법, 예를 들어, 실시간 정량적 PCR, blocker PCR, 디지털 액적(droplet) PCR(ddPCR), 클램핑 PCR, ICE-COLD PCR, castPCR, ARMS PCR, BEAMing 등을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다. 실시자는 공지된 유전자 분석 기법을 제한 없이 이용하여 클론성 조혈증과 관련된 상기 유전자 변이를 검출 및 식별할 수 있다. 바람직하게는 상기 유전자 분석은 차세대 유전체 시퀀싱 분석법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 차세대 유전체 시퀀싱 분석법을 이용하여, 전유전체 염기서열분석(Whole Genome Sequencing), 전엑솜 염기서열분석(Whole Exome Sequencing), RNA 염기서열분석(RNA Sequencing) 등의 데이터 처리를 통해 생성된 정보를 분석할 수 있다.

조성물, 키트 및 유전자 패널

본 발명의 다른 태양에 따르면, 폐암에 대해 치료받는 개체로부터 분리한 생물학적 시료를 이용하여 클론성 조혈증을 진단하기 위한 제제를 유효성분으로 포함하는 개체의 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 본 발명에 따른 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 클론성 조혈증의 진단 또는 폐암 치료의 예후를 예측하는 방법에 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 제제는 DNMT3A, ASXL1, TET2, PPM1D, ATM, BCL11B, CARD11, CBL, CD79B, CHEK2, CUX1, ETV6, FOXP1, JAK2, KMT2D, MAP3K1, MPL, NF1, NOTCH1, NOTCH2, PHIP, PRPF40B, RAD21, SETD2, SF3B1, TET1, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 제제를 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 제제는 ASXL1, CBL, CHEK2, CUX1, DNMT3A, FOXP1, JAK2, KMT2D, MPL, NOTCH1, PPM1D, PRPF40B, SF3B1, TET2, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 제제를 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 제제는 DNMT3A, ASXL1, TET2, PPM1D, SF3B1, ATM, 및 TNFAIP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 제제를 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 제제는 상기 유전자 군으로부터 선택되는 하나의 유전자에 변이가 존재하는지 검출하기 위한 제제를 포함할 수 있으며, 이 때, 상기 제제는 상기 선택된 하나의 유전자를 제외한 나머지 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 제제는 DNMT3A에 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 제제를 포함할 수 있으며, 이 때, 상기 제제는 ASXL1, TET2, PPM1D, ATM, BCL11B, CARD11, CBL, CD79B, CHEK2, CUX1, ETV6, FOXP1, JAK2, KMT2D, MAP3K1, MPL, NF1, NOTCH1, NOTCH2, PHIP, PRPF40B, RAD21, SETD2, SF3B1, TET1, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 제제를 추가로 포함할 수 있거나, ASXL1, CBL, CHEK2, CUX1, DNMT3A, FOXP1, JAK2, KMT2D, MPL, NOTCH1, PPM1D, PRPF40B, SF3B1, TET2, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 제제를 추가로 포함할 수 있거나, ASXL1, TET2, PPM1D, SF3B1, ATM, 및 TNFAIP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 제제를 추가로 포함할 수 있거나, ASXL1, TET2, PPM1D, SF3B1, ATM, 및 TNFAIP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 제제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 제제는, 예를 들어 변이 유전자, 이로부터 유래되는 mRNA, 또는 변이 유전자로부터 코딩되는 단백질을 검출할 수 있는 제제를 포함할 수 있다.

상기 유전자 또는 mRNA 발현을 검출할 수 있는 제제는 상기 변이 유전자 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 센스 및 안티센스 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 핵산일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 제제는 구체적으로 클론성 조혈증의 유전자 변이를 검출하기 위한 제제, 예를 들어 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있다.

클론성 조혈증 관련 유전자의 변이의 존재를 확인하기 위해 사용할 수 있는 제제의 예시로서 하기 표 6 내지 표 9에 프로브의 서열 정보를 제공한다.

Chromosome	Start	Stop	Gene	Probe Sequence	서열번호
2	25564672	25564792	DNMT3A	GCGGGCGGCGGCGGCGGCGAGAGCAGAGGACGAGCCGGGACGCGGCGCCGCGGCACCAGGGCGCGCAGCCGGGCCGGCCCGACCCCACCGGCCATACGGTAATGAGCGCCGCTGCTGGCG	1
2	25537472	25537592	DNMT3A	CAGAGCCAACCAGGCCTGCAGCCTGAGCTCAGACCTCAGCTTTCTCTGGGCCCAGGCACCGGTCCTGAAGTGAGGTGACATTCATTTCACTACATCCTGTGACTGCACTCACTTCCTCCA	2
2	25537290	25537410	DNMT3A	GGGCCTCTGGGGGAGGCTGGGATTTCCCAGGGGCTGGTTGGGGTGGGAGGGAGGATGCGGGAAGCTTTCAAAGGAGAGAGAGGCTGTGAATGAAGAGAAGGGAGGAGGCGGAGGCAGCTG	3
2	25537170	25537290	DNMT3A	GAGGTCCCAGAAGTGGCACCCATTGGCCGCAGCGACACGGAGGGGAGACTGCTGCCACTCCAAGGCTCTCAGAGGCTGCTGGGGTAGGAGGTGGCCCTGAAGGGAGCCTGCCTCGGTTTC	4
2	25537050	25537170	DNMT3A	TCTGCTCTCTGGGGTGCTGGTGAGGCCAGAAGGAGGAGCAACACCCCAGGCCTCACAGGCCAGGTGTGGCCCTGGGCTGAGGGCCTGACCCAGGGAGGGTGGGGTGCTCCGCCCCACTGA	5
2	25536966	25537086	DNMT3A	CTGACCCAGGGAGGGTGGGGTGCTCCGCCCCACTGATCCTCTTCTCTCCCCCACAGGTGGAGCCATCGAAGCCCCCACCCACAGGCTGACAGAGGCACCGTTCACCAGAGGGCTCAACAC	6
2	25536846	25536966	DNMT3A	CGGGATCTATGTTTAAGTTTTAACTCTCGCCTCCAAAGACCACGATAATTCCTTCCCCAAAGCCCAGCAGCCCCCCAGCCCCGCGCAGCCCCAGCCTGCCTCCCGGCGCCCAGATGCCCG	7
2	25536726	25536846	DNMT3A	CCATGCCCTCCAGCGGCCCCGGGGACACCAGCAGCTCTGCTGCGGAGCGGGAGGAGGACCGAAAGGTGAGCAGCGGGCTCTGCTGGGGACCCTCTGGCCTGGGAGAGGGAGAGCCCTGTC	8
2	25523000	25523120	DNMT3A	GCCTGCAGGACGGAGAGGAGCAGGAGGAGCCGCGTGGCAAGGAGGAGCGCCAAGAGCCCAGCACCACGGCACGGAAGGTGGGGCGGCCTGGGAGGAAGCGCAAGCACCCCCCGGTGAGTG	9
2	25504380	25504500	DNMT3A	CCTCCCAGGGCCCTGCCAGGTTGTTTTGCATATGTGCATTTTAATTTCAAAAAGTCTTCCTTCCAAGCGTGTATGATGAAATGAGTAAATTGATTAATTGGCGTAACTTATTTTGCATGG	10
2	25504282	25504402	DNMT3A	TGGCGTAACTTATTTTGCATGGATCCAACCTAATGTTCATGCAGGATAGAGAACATTTCCAGAATACAAATTTCCAAACTTATTAAGAAGCTTTTATTCATTTATTATTCGACAAATATG	11
2	25504745	25504865	DNMT3A	TTGCTGTATTTGTAGCCCCTGGCCTGGGCACTCAAGGGCAGCAGATACCCTGTTTGCCTCCCTGAGTGCAGAGGTCCTGAGCCCACCCTAGTTGGGCTGACTCAACTGGAAATTTGGTTG	12
2	25504650	25504770	DNMT3A	GCTGACTCAACTGGAAATTTGGTTGTGACAGTGGCGTGGGGAGAGGGCTGGGTGATTGTATTCTGTGTACTGCCCAGCCCAGGCCTCTTCATCTGGGGACTTTTTGGCCTAACCCTGGAA	13
2	25504555	25504675	DNMT3A	GGGACTTTTTGGCCTAACCCTGGAAGCCTGGAAAGTTGCCCACTTTTCTCTTTCAGGTTAAGCCAGCAATTTCAGGGCCAACCGAGCTGTAAACATGTTAGTAATGAGGACAACTAGCAT	14
2	25505503	25505623	DNMT3A	ACTGATCTAACCCTCCTCTTGTGTATCTTTCTTACATTTGCAGGTGGAAAGCGGTGACACGCCAAAGGACCCTGCGGTGATCTCCAAGTCCCCATCCATGGCCCAGGACTCAGGCGCCTC	15
2	25505383	25505503	DNMT3A	AGAGCTATTACCCAATGGGGACTTGGAGAAGCGGAGTGAGCCCCAGCCAGAGGAGGGGAGCCCTGCTGGGGGGCAGAAGGGCGGGGCCCCAGCAGAGGGAGAGGGTGCAGCTGAGACCCT	16
2	25505263	25505383	DNMT3A	GCCTGAAGCCTCAAGAGCAGTGGAAAATGGCTGCTGCACCCCCAAGGAGGGCCGAGGAGCCCCTGCAGAAGCGGGTGAGTCCTCAGCACCAGGGGCAGCCTCTTCTGGGCCCACCAGCAT	17
2	25505144	25505263	DNMT3A	ACCCTGAGAGTCAGGGACTTGGCTCTCCAGCAGGTCCCAGGAAGGATGGTCTGGGTCGTGGCTAAAGGTCTGCTTGCCAAGGCTATGGCCTGGAGGCTACTGGCTGGATGCAGCCTGCG	18
2	25498330	25498450	DNMT3A	ACCAACGAACTGGTCCCTTTGTTCTTCCCTCTCCACAGGCAAAGAACAGAAGGAGACCAACATCGAATCCATGAAAATGGAGGCAAGTGTTCCACCCCCAGGGGCTCTGTGGATCCTGAT	19
2	25497882	25498002	DNMT3A	CGTCAGTGCCCACCCTAATGCCCTAATGTCTGTCTCTCTGTCCTAGGGCTCCCGGGGCCGGCTGCGGGGTGGCTTGGGCTGGGAGTCCAGCCTCCGTCAGCGGCCCATGCCGAGGCTCAC	20
2	25497762	25497882	DNMT3A	CTTCCAGGCGGGGGACCCCTACTACATCAGCAAGCGCAAGCGGGACGAGTGGCTGGCACGCTGGAAAAGGGAGGTGAGGCGCCTTCTGGCCTGGGCCCCAGCCCGTCCTGCAGAACTGGA	21
2	25475123	25475243	DNMT3A	CTAGACAAAGAAAATGTTCCCTCCCTCCCCCCCGCCGCCCCCCTCCCCTCCCAGTGGCCCCCTCCGCCCCCAGCCCCATCGCCCCCTTCCCCTCCCCCAAGACGGGCAGCTACTTCCAGA	22
2	25475003	25475123	DNMT3A	GCTTCAGGGCCGCGGCTCACACCTGAGCGCGACTGCAGAGGGGCTGCACCTGGCCTTATGGGTAGGTTCCTGGACGGAGCCCCGGGGAGACCGGGGGCGGGGAGGCGGCAGGGCCGGTGG	23
2	25472499	25472619	DNMT3A	ATCAAGGATTTCATTCTCCTTTGTAGGGATCCTGGAGCGGGTTGTGAGAAGGAATGGGCGCGTGGATCGTAGCCTGAAAGACGAGTGTGATACGGTGAAAGGATGGAGGCTGTGCAATGG	24
2	25471013	25471133	DNMT3A	TTGTTTCCCCAGGCTGAGAAGAAAGCCAAGGTCATTGCAGGAATGAATGCTGTGGAAGAAAACCAGGGGCCCGGGGAGTCTCAGAAGGTGGAGGAGGCCAGCCCTCCTGCTGTGCAGCAG	25
2	25470893	25471013	DNMT3A	CCCACTGACCCCGCATCCCCCACTGTGGCTACCACGCCTGAGCCCGTGGGGTCCGATGCTGGGGACAAGAATGCCACCAAAGCAGGCGATGACGAGCCAGAGTACGAGGTGAGCGGCTTC	26
2	25470538	25470658	DNMT3A	GTGACCACTGTGTAATGATTTCTGCTCCTTGGGGCTCCAGGACGGCCGGGGCTTTGGCATTGGGGAGCTGGTGTGGGGGAAACTGCGGGGCTTCTCCTGGTGGCCAGGCCGCATTGTGTC	27
2	25470418	25470538	DNMT3A	TTGGTGGATGACGGGCCGGAGCCGAGCAGCTGAAGGCACCCGCTGGGTCATGTGGTTCGGAGACGGCAAATTCTCAGTGGTAAGTTGTGGGGTTTGGCAGTAGCCTGGGGTGGGGGAAGG	28
2	25469913	25470033	DNMT3A	CCCCAGGTGTGTGTTGAGAAGCTGATGCCGCTGAGCTCGTTTTGCAGTGCGTTCCACCAGGCCACGTACAACAAGCAGCCCATGTACCGCAAAGCCATCTACGAGGTCCTGCAGGTGAGT	29
2	25469567	25469687	DNMT3A	AGCCTGTCCTGACAACCCCAACCCTGGCGTGTCACCCTCCAGGTGGCCAGCAGCCGCGCGGGGAAGCTGTTCCCGGTGTGCCACGACAGCGATGAGAGTGACACTGCCAAGGCCGTGGAG	30
2	25469447	25469567	DNMT3A	GTGCAGAACAAGCCCATGATTGAATGGGCCCTGGGGGGCTTCCAGCCTTCTGGCCCTAAGGGCCTGGAGCCACCAGAAGGTAAATGAGGGCACCCAGCTTTCTGGGACCCCTGCCCGCCA	31
2	25469103	25469223	DNMT3A	CCTGTCAGCCTGTAACTGACCTTGGCACCTGCTTTCCTCCTCCAGAAGAGAAGAATCCCTACAAAGAAGTGTACACGGACATGTGGGTGGAACCTGAGGCAGCTGCCTACGCACCACCTC	32
2	25468983	25469103	DNMT3A	CACCAGCCAAAAAGCCCCGGAAGAGCACAGCGGAGAAGCCCAAGGTCAAGGAGATTATTGATGAGCGCACAAGAGGTAGTTGGCCTGCTTCTGGAGAGGGTGGCACCAGGAGGCCTGCAT	33
2	25468851	25468971	DNMT3A	CGCGGCCTCCTCTGACGCCAGCTCTCCTCCCCTTGCAGAGCGGCTGGTGTACGAGGTGCGGCAGAAGTGCCGGAACATTGAGGGTAAGTTTGTTGCCTGGGAACTCTGGCACTCCTAGTG	34
2	25468101	25468221	DNMT3A	CCCCTCCCTCTGCTTTCCAGACATCTGCATCTCCTGTGGGAGCCTCAATGTTACCCTGGAACACCCCCTCTTCGTTGGAGGAATGTGCCAAAACTGCAAGGTAGGAGCACACCCACCCAG	35
2	25467405	25467525	DNMT3A	CTAGAACTGCTTTCTGGAGTGTGCGTACCAGTACGACGACGACGGCTACCAGTCCTACTGCACCATCTGCTGTGGGGGCCGTGAGGTGCTCATGTGCGGAAACAACAACTGCTGCAGGTG	36
2	25467115	25467235	DNMT3A	CTCCTCTGCTCACTGGGTCTCCTTCCAGGTGCTTTTGCGTGGAGTGTGTGGACCTCTTGGTGGGGCCGGGGGCTGCCCAGGCAGCCATTAAGGAAGACCCCTGGAACTGCTACATGTGCG	37
2	25466995	25467115	DNMT3A	GGCACAAGGGTACCTACGGGCTGCTGCGGCGGCGAGAGGACTGGCCCTCCCGGCTCCAGATGTTCTTCGCTAATAACCACGACCAGGAATTTGTGAGTGCTGGGCCTGGGGCGCGGTCTC	38
2	25466749	25466869	DNMT3A	GTTGTGCTCACTGCTTAGGACCCTCCAAAGGTTTACCCACCTGTCCCAGCTGAGAAGAGGAAGCCCATCCGGGTGCTGTCTCTCTTTGATGGAATCGCTACAGGTGAGGGGTGCAGGCCC	39
2	25464503	25464623	DNMT3A	CCAGGGAGATGGCTCCAAGTAACGGTGCTGTCTGCTGGCTGGTGCAGGGCTCCTGGTGCTGAAGGACTTGGGCATTCAGGTGGACCGCTACATTGCCTCGGAGGTGTGTGAGGACTCCAT	40
2	25464383	25464503	DNMT3A	CACGGTGGGCATGGTGCGGCACCAGGGGAAGATCATGTACGTCGGGGACGTCCGCAGCGTCACACAGAAGCATGTATGTCCATGCTGTGGGGCGCAGCCCGTCTTCCCCTCCCTGCACAC	41
2	25463493	25463613	DNMT3A	CTTTATCCTCCCAGATCCAGGAGTGGGGCCCATTCGATCTGGTGATTGGGGGCAGTCCCTGCAATGACCTCTCCATCGTCAACCCTGCTCGCAAGGGCCTCTACGGTAGGTACCATCCTG	42
2	25463245	25463365	DNMT3A	CTATGCAGACAGCCCCAGCTGATGGCTTTCTCTTCCGACCTCTCAGAGGGCACTGGCCGGCTCTTCTTTGAGTTCTACCGCCTCCTGCATGATGCGCGGCCCAAGGAGGGAGATGATCGC	43
2	25463125	25463245	DNMT3A	CCCTTCTTCTGGCTCTTTGAGAATGTGGTGGCCATGGGCGTTAGTGACAAGAGGGACATCTCGCGATTTCTCGAGGTATAGCCAGCAACCTTGGTTTGGCCAGCTCACTAATGGCTTCTA	44
2	25461981	25462101	DNMT3A	CGTCTCCTGTTTTGTAGTCCAACCCTGTGATGATTGATGCCAAAGAAGTGTCAGCTGCACACAGGGCCCGCTACTTCTGGGGTAACCTTCCCGGTATGAACAGGTTGGTGAAAGCTCCTG	45
2	25459779	25459899	DNMT3A	TTACAGTCTCTCTTCTGCCTCCTAGGCCGTTGGCATCCACTGTGAATGATAAGCTGGAGCTGCAGGAGTGTCTGGAGCATGGCAGGATAGCCAAGGTCAGCTCCAGCGTCTAGAACCTCT	46
2	25458574	25458694	DNMT3A	TTCAGCAAAGTGAGGACCATTACTACGAGGTCAAACTCCATAAAGCAGGGCAAAGACCAGCATTTTCCTGTCTTCATGAATGAGAAAGAGGACATCTTATGGTGCACTGAAATGGAAAGG	47
2	25457218	25457338	DNMT3A	CCTGGTCTGGCCAGCACTCACCCTGCCCTCTCTGCCTTTTCTCCCCCAGGGTATTTGGTTTCCCAGTCCACTATACTGACGTCTCCAACATGAGCCGCTTGGCGAGGCAGAGACTGCTGG	48
2	25457098	25457218	DNMT3A	GCCGGTCATGGAGCGTGCCAGTCATCCGCCACCTCTTCGCTCCGCTGAAGGAGTATTTTGCGTGTGTGTAAGGGACATGGGGGCAAACTGAGGTAGCGACACAAAGTTAAACAAACAAAC	49

Chromosome	Start	Stop	Gene	Probe_Sequence	서열번호
4	106155077	106155197	TET2	GGATGGCCCCGAAGCAAGCCTGATGGAACAGGATAGAACCAACCATGTTGAGGGCAACAGACTAAGTCCATTCCTGATACCATCACCTCCCATTTGCCAGACAGAACCTCTGGCTACAAA	50
4	106156157	106156277	TET2	TTCAGGTTCCAGCAGCAATTTGCAAGCTCCTGGTGGCAGCTCTGAACGGTATTTAAAACAAAATGAAATGAATGGTGCTTACTTCAAGCAAAGCTCAGTGTTCACTAAGGATTCCTTTTC	51
4	106156277	106156397	TET2	TGCCACTACCACACCACCACCACCATCACAATTGCTTCTTTCTCCCCCTCCTCCTCTTCCACAGGTTCCTCAGCTTCCTTCAGAAGGAAAAAGCACTCTGAATGGTGGAGTTTTAGAAGA	52
4	106156397	106156517	TET2	ACACCACCACTACCCCAACCAAAGTAACACAACACTTTTAAGGGAAGTGAAAATAGAGGGTAAACCTGAGGCACCACCTTCCCAGAGTCCTAATCCATCTACACATGTATGCAGCCCTTC	53
4	106156517	106156637	TET2	TCCGATGCTTTCTGAAAGGCCTCAGAATAATTGTGTGAACAGGAATGACATACAGACTGCAGGGACAATGACTGTTCCATTGTGTTCTGAGAAAACAAGACCAATGTCAGAACACCTCAA	54
4	106156637	106156757	TET2	GCATAACCCACCAATTTTTGGTAGCAGTGGAGAGCTACAGGACAACTGCCAGCAGTTGATGAGAAACAAAGAGCAAGAGATTCTGAAGGGTCGAGACAAGGAGCAAACACGAGATCTTGT	55
4	106156757	106156877	TET2	GCCCCCAACACAGCACTATCTGAAACCAGGATGGATTGAATTGAAGGCCCCTCGTTTTCACCAAGCGGAATCCCATCTAAAACGTAATGAGGCATCACTGCCATCAATTCTTCAGTATCA	56
4	106156877	106156997	TET2	ACCCAATCTCTCCAATCAAATGACCTCCAAACAATACACTGGAAATTCCAACATGCCTGGGGGGCTCCCAAGGCAAGCTTACACCCAGAAAACAACACAGCTGGAGCACAAGTCACAAAT	57
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4	106157237	106157357	TET2	TTCAAACTCACACCTTTTGCAACATAAGCCTCATAAACAGGCAGCACAAACACAACCATCCCAGAGTTCACATCTCCCTCAAAACCAGCAACAGCAGCAAAAATTACAAATAAAGAATAA	60
4	106155197	106155317	TET2	GCTCCAGAATGGAAGCCCACTGCCTGAGAGAGCTCATCCAGAAGTAAATGGAGACACCAAGTGGCACTCTTTCAAAAGTTATTATGGAATACCCTGTATGAAGGGAAGCCAGAATAGTCG	61
4	106157357	106157477	TET2	AGAGGAAATACTCCAGACTTTTCCTCACCCCCAAAGCAACAATGATCAGCAAAGAGAAGGATCATTCTTTGGCCAGACTAAAGTGGAAGAATGTTTTCATGGTGAAAATCAGTATTCAAA	62
4	106157477	106157597	TET2	ATCAAGCGAGTTCGAGACTCATAATGTCCAAATGGGACTGGAGGAAGTACAGAATATAAATCGTAGAAATTCCCCTTATAGTCAGACCATGAAATCAAGTGCATGCAAAATACAGGTTTC	63
4	106157597	106157717	TET2	TTGTTCAAACAATACACACCTAGTTTCAGAGAATAAAGAACAGACTACACATCCTGAACTTTTTGCAGGAAACAAGACCCAAAACTTGCATCACATGCAATATTTTCCAAATAATGTGAT	64
4	106157717	106157837	TET2	CCCAAAGCAAGATCTTCTTCACAGGTGCTTTCAAGAACAGGAGCAGAAGTCACAACAAGCTTCAGTTCTACAGGGATATAAAAATAGAAACCAAGATATGTCTGGTCAACAAGCTGCGCA	65
4	106157837	106157957	TET2	ACTTGCTCAGCAAAGGTACTTGATACATAACCATGCAAATGTTTTTCCTGTGCCTGACCAGGGAGGAAGTCACACTCAGACCCCTCCCCAGAAGGACACTCAAAAGCATGCTGCTCTAAG	66
4	106157957	106158077	TET2	GTGGCATCTCTTACAGAAGCAAGAACAGCAGCAAACACAGCAACCCCAAACTGAGTCTTGCCATAGTCAGATGCACAGGCCAATTAAGGTGGAACCTGGATGCAAGCCACATGCCTGTAT	67
4	106158077	106158197	TET2	GCACACAGCACCACCAGAAAACAAAACATGGAAAAAGGTAACTAAGCAAGAGAATCCACCTGCAAGCTGTGATAATGTGCAGCAAAAGAGCATCATTGAGACCATGGAGCAGCATCTGAA	68
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4	106158317	106158437	TET2	ACTTGATAGCCACACCCCAGCTTTAGAGCAGCAAACAACTTCTTCAGAAAAGACACCAACCAAAAGAACAGCTGCTTCTGTTCTCAATAATTTTATAGAGTCACCTTCCAAATTACTAGA	70
4	106158437	106158557	TET2	TACTCCTATAAAAAATTTATTGGATACACCTGTCAAGACTCAATATGATTTCCCATCTTGCAGATGTGTAGGTAAGTGCCAGAAATGTACTGAGACACATGGCGTTTATCCAGAATTAGC	71
4	106155317	106155437	TET2	TGTGAGTCCTGACTTTACACAAGAAAGTAGAGGGTATTCCAAGTGTTTGCAAAATGGAGGAATAAAACGCACAGTTAGTGAACCTTCTCTCTCTGGGCTCCTTCAGATCAAGAAATTGAA	72
4	106158557	106158677	TET2	AAATTTATCTTCAGATATGGGATTTTCCTTCTTTTTTTAAATCTTGAGTCTGGCAGCAATTTGTAAAGGCTCATAAAAATCTGAAGCTTACATTTTTTGTCAAGTTACCGATGCTTGTGT	73
4	106158677	106158797	TET2	CTTGTGAAAGAGAACTTCACTTACATGCAGTTTTTCCAAAAGAATTAAATAATCGTGCATGTTTATTTTTCCCTCTCTTCAGATCCTGTAAAATTTGAATGTATCTGTTTTAGATCAATT	74
4	106158797	106158917	TET2	CGCCTATTTAGCTCTTTGTATATTATCTCCTGGAGAGACAGCTAGGCAGCAAAAAAACAATCTATTAAAATGAGAAAATAACGACCATAGGCAGTCTAATGTACGAACTTTAAATATTTT	75
4	106158917	106159037	TET2	TTAATTCAAGGTAAAATATATTAGTTTCACAAGATTTCTGGCTAATAGGGAAATTATTATCTTCAGTCTTCATGAGTTGGGGGAAATGATAATGCTGACACTCTTAGTGCTCCTAAAGTT	76
4	106159037	106159156	TET2	TCCTTTTCTCCATTTATACATTTGGAATGTTGTGATTTATATTCATTTTGATTCCCTTTTCTCTAAAATTTCATCTTTTTGATTAAAAAATATGATACAGGCATACCTCAGAGATATTG	77
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4	106155557	106155677	TET2	TGTAGCCCAAGAAAATGCAGTTAAAGATTTCACCAGTTTTTCAACACATAACTGCAGTGGGCCTGAAAATCCAGAGCTTCAGATTCTGAATGAGCAGGAGGGGAAAAGTGCTAATTACCA	79
4	106155677	106155797	TET2	TGACAAGAACATTGTATTACTTAAAAACAAGGCAGTGCTAATGCCTAATGGTGCTACAGTTTCTGCCTCTTCCGTGGAACACACACATGGTGAACTCCTGGAAAAAACACTGTCTCAATA	80
4	106155797	106155917	TET2	TTATCCAGATTGTGTTTCCATTGCGGTGCAGAAAACCACATCTCACATAAATGCCATTAACAGTCAGGCTACTAATGAGTTGTCCTGTGAGATCACTCACCCATCGCATACCTCAGGGCA	81
4	106155917	106156037	TET2	GATCAATTCCGCACAGACCTCTAACTCTGAGCTGCCTCCAAAGCCAGCTGCAGTGGTGAGTGAGGCCTGTGATGCTGATGATGCTGATAATGCCAGTAAACTAGCTGCAATGCTAAATAC	82
4	106156037	106156157	TET2	CTGTTCCTTTCAGAAACCAGAACAACTACAACAACAAAAATCAGTTTTTGAGATATGCCCATCTCCTGCAGAAAATAACATCCAGGGAACCACAAAGCTAGCGTCTGGTGAAGAATTCTG	83
4	106161458	106161578	TET2	AATAAAACGAGGTATGCCTGTATTTTTAAAAAAAGCTTTTTGTTAAAATTCAGGATATGTAATAGGTCTGTAGGAATAGTGAAATATTTTTGCTGATGGATGTAGATATATACGTGGATA	84
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4	106162658	106162778	TET2	CACACAAAGCAGTAAACAATTGTAAATTGAGTAATTATTAGTAGGCTTAGCTATTCTAGGGTTGCCAACACTACACACTGTGCTATTCACCAGAGAGTCACAATATTTGACAGGACTAAT	86
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4	106163498	106163618	TET2	TATTTCTAGGACTATTCCATATTTTCCATGTGGCTGGATACTAACTATTTGCCAGCCTCCTTTTCTAAATTGTGAGACATTCTTGGAGGAACAGTTCTAACTAAAATCTATTATGACTCC	93
4	106163618	106163738	TET2	CCAAGTTTTAAAATAGCTAAATTTAGTAAGGGAAAAAATAGTTTATGTTTTAGAAGACTGAACTTAGCAAACTAACCTGAATTTTGTGCTTTGTGAAATTTTATATCGAAATGAGCTTTC	94
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20	30954286	30954406	ASXL1	TGCTTAACATGAGGGTTTCATAGGATATGTGTCTTTCTGTAGTTGTAGTGATATGAGTAAGTACACCTGTGTATGTATTTGTGCTTCTGTGTCTGGTAGTGAGATGGAACTATCCATTTC	131
20	30956811	30956931	ASXL1	TTACAGTGGGACTTCCCCTCTCGCATGCCTCAATGCTATGCTACATTCCAATTCAAGAGGAGGAGAGGGGTTGTTTTATAAACTGCCTGGCCGAATCAGCCTTTTCACGCTCAAGGTAAG	132
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20	30960120	30960239	ASXL1	TAACTGCCTTTGGCTTTATGTTGCTTATCCTTCATAGTATCTTGTTCATTGGCCTTTTACATCCATAGGCATCACTTCTCTGATATTCGTTGTGCTCTTTTAATGGATTAATGGTTTGC	135
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20	31021643	31021763	ASXL1	TTCGTAACACAATTGAAAGTGTTCACACCGAAAAGCCACAGCCCACTAAAGAGGAGCCCAAAGTCCCGCCCATCCGGGTAGGAGACTGTTTGATTCCTGGCTGCCCTGGAGCCAGGTTTT	152
20	31022188	31022308	ASXL1	AGATCACCCAGTCAGTTAAAACTATTTTCTAATTCTTTTTTTGCAGATTCAACTTTCACGTATCAAACCACCCTGGGTGGTTAAAGGTCAGCCCACTTACCAGATATGCCCCCGGATCAT	153
20	31023268	31023388	ASXL1	CATACCATCTGTTGAGCCCCAGGTTGGAGAGGAGTGGGAGAAAGCTGCTCCCACCCCTCCTGCATTGCCTGGGGATTTGACAGCTGAGGAGGGTCTAGATCCTCTTGACAGCCTTACTTC	154
20	31023388	31023508	ASXL1	ACTCTGGACTGTGCCATCTCGAGGAGGCAGTGACAGCAATGGCAGTTACTGTCAACAGGTGGACATTGAAAAGCTGAAAATCAACGGAGACTCTGAAGCACTGAGTCCTCACGGTGAGTC	155
20	31023508	31023628	ASXL1	CACGGATACAGCCTCTGACTTTGAAGGTCACCTCACGGAGGACAGCAGTGAGGCTGACACTAGAGAAGCTGCAGTGACAAAGGGATCTTCGGTGGACAAGGATGAGAAACCCAATTGGAA	156
20	31023628	31023748	ASXL1	CCAATCTGCCCCACTGTCCAAGGTGAATGGTGACATGCGTCTGGTTACAAGGACAGATGGGATGGTTGCTCCTCAGAGCTGGGTGTCTCGAGTATGTGCGGTCCGCCAAAAGATCCCAGA	157
20	31023748	31023868	ASXL1	TTCCCTACTGCTGGCCAGTACTGAGTACCAGCCAAGAGCCGTGTGCCTGTCCATGCCTGGGTCCTCAGTGGAGGCCACTAACCCACTTGTGATGCAGTTGCTGCAGGGTAGCTTGCCCCT	158
20	31023868	31023988	ASXL1	AGAGAAGGTTCTTCCACCAGCCCACGATGACAGCATGTCAGAATCCCCACAAGTACCACTTACAAAAGACCAGAGCCATGGCTCGCTACGCATGGGATCTTTACATGGTCTTGGAAAAAA	159
20	31023988	31024108	ASXL1	CAGTGGCATGGTTGATGGAAGCAGCCCCAGTTCTTTAAGGGCTTTGAAGGAGCCTCTTCTGCCAGATAGCTGTGAAACAGGCACTGGTCTTGCCAGGATTGAGGCCACCCAGGCTCCTGG	160
20	31024108	31024228	ASXL1	AGCACCCCAAAAGAATTGCAAGGCAGTCCCAAGTTTTGACTCCCTCCATCCAGTGACAAATCCCATTACATCCTCTAGGAAACTGGAAGAAATGGATTCCAAAGAGCAGTTCTCTTCCTT	161
20	31024228	31024348	ASXL1	TAGTTGTGAAGATCAGAAGGAAGTCCGTGCTATGTCACAGGACAGTAATTCAAATGCTGCTCCAGGAAAGAGCCCAGGAGATCTTACTACCTCGAGAACACCTCGTTTCTCATCTCCAAA	162
20	31024348	31024468	ASXL1	TGTGATCTCCTTTGGTCCAGAGCAGACAGGTCGGGCCCTGGGTGATCAGAGCAATGTTACAGGCCAAGGGAAGAAGCTTTTTGGCTCTGGGAATGTGGCTGCAACCCTTCAGCGCCCCAG	163
20	31022308	31022428	ASXL1	CCCCACCACGGAGTCCTCCTGCCGGGGTTGGACTGGCGCCAGGACCCTCGCAGACATTAAAGCCCGTGCTCTGCAGGTCCGAGGGGCGAGAGGTCACCACTGCCATAGAGAGGCGGCCAC	164
20	31024468	31024588	ASXL1	GCCTGCGGACCCGATGCCTCTTCCTGCTGAGATCCCTCCAGTTTTTCCCAGTGGGAAGTTGGGACCAAGCACAAACTCCATGTCTGGTGGGGTACAGACTCCAAGGGAAGACTGGGCTCC	165
20	31024588	31024708	ASXL1	AAAGCCACATGCCTTTGTTGGCAGCGTCAAGAATGAGAAGACTTTTGTGGGGGGTCCTCTTAAGGCAAATGCCGAGAACAGGAAAGCTACTGGGCATAGTCCCCTGGAACTGGTGGGTCA	166
20	31024708	31024828	ASXL1	CTTGGAAGGGATGCCCTTTGTCATGGACTTGCCCTTCTGGAAATTACCCCGAGAGCCAGGGAAGGGGCTCAGTGAGCCTCTGGAGCCTTCTTCTCTCCCCTCCCAACTCAGCATCAAGCA	167
20	31024828	31024948	ASXL1	GGCATTTTATGGGAAGCTTTCTAAACTCCAACTGAGTTCCACCAGCTTTAATTATTCCTCTAGCTCTCCCACCTTTCCCAAAGGCCTTGCTGGAAGTGTGGTGCAGCTGAGCCACAAAGC	168
20	31024948	31025068	ASXL1	AAACTTTGGTGCGAGCCACAGTGCATCACTTTCCTTGCAAATGTTCACTGACAGCAGCACGGTGGAAAGCATCTCGCTCCAGTGTGCGTGCAGCCTGAAAGCCATGATCATGTGCCAAGG	169
20	31025068	31025188	ASXL1	CTGCGGTGCGTTCTGTCACGATGACTGTATTGGACCCTCAAAGCTCTGTGTATTGTGCCTTGTGGTGAGATAATAAATTATGGCCATGGGAAACATTGTATATTTAGTGTGTGTATTTTG	170
20	31022428	31022548	ASXL1	CACTGCCATCGGAGGGGGGGGTGGCCCGGGTGGAGGTGGCGGCGGGGCCACCGATGAGGGAGGTGGCAGAGGCAGCAGCAGTGGTGATGGTGGTGAGGCCTGTGGCCACCCTGAGCCCAG	171
20	31022548	31022668	ASXL1	GGGAGGCCCGAGCACCCCTGGAAAGTGTACGTCAGATCTACAGCGAACACAACTACTGCCGCCTTATCCTCTAAATGGGGAGCATACCCAGGCCGGAACTGCCATGTCCAGAGCTAGGAG	172
20	31022668	31022788	ASXL1	AGAGGACCTGCCTTCTCTGAGAAAGGAGGAAAGCTGCCTACTACAGAGGGCTACAGTTGGACTCACAGATGGGCTAGGAGATGCCTCCCAACTCCCCGTTGCTCCCACTGGGGACCAGCC	173.
20	31022788	31022908	ASXL1	ATGCCAGGCCTTGCCCCTACTGTCCTCCCAAACCTCAGTAGCTGAGAGATTAGTGGAGCAGCCTCAGTTGCATCCGGATGTTAGAACTGAATGTGAGTCTGGCACCACTTCCTGGGAAAG	174
20	31022908	31023028	ASXL1	TGATGATGAGGAGCAAGGACCCACCGTTCCTGCAGACAATGGTCCCATTCTGTCTCTAGTGGGAGATGATACATTAGAGAAAGGAACTGGCCAAGCTCTTGACAGTCATCCCACTATGAA	175
20	31023028	31023148	ASXL1	GGATCCTGTAAATGTGACCCCCAGTTCCACACCTGAATCCTCACCGACTGATTGCCTGCAGAACAGAGCATTTGATGACGAATTAGGGCTTGGTGGCTCATGCCCTCCTATGAGGGAAAG	176
20	31023148	31023268	ASXL1	TGATACTAGACAAGAAAACTTGAAAACCAAGGCTCTCGTTTCTAACAGTTCTTTGCATTGGATACCCATCCCATCGAATGATGAGGTAGTGAAACAGCCCAAACCAGAATCCAGAGAACA	177

Chromosome	Start	Stop	Gene	Probe_Sequence	서열번호
17	58677676	58677796	PPM1D	TCGAAGATAAACAATAGTTGGCCGGCGAGCGCCTAGTGTGTCTCCCGCCGCCGGATTCGGCGGGCTGCGTGGGACCGGCGGGATCCCGGCCAGCCGGCCATGGCGGGGCTGTACTCGCTG	178
17	58677796	58677915	PPM1D	GGAGTGAGCGTCTTCTCCGACCAGGGCGGGAGGAAGTACATGGAGGACGTTACTCAAATCGTTGTGGAGCCCGAACCGACGGCTGAAGAAAAGCCCTCGCCGCGGCGGTCGCTGTCTCA	179
17	58677926	58678046	PPM1D	CGCGGCCGTCGCCGGCCGCCCTTCCCGGCGGCGAAGTCTCGGGGAAAGGCCCAGCGGTGGCAGCCCGAGAGGCTCGCGACCCTCTCCCGGACGCCGGGGCCTCGCCGGCACCTAGCCGCT	180
17	58678046	58678166	PPM1D	GCTGCCGCCGCCGTTCCTCCGTGGCCTTTTTCGCCGTGTGCGACGGGCACGGCGGGCGGGAGGCGGCACAGTTTGCCCGGGAGCACTTGTGGGGTTTCATCAAGAAGCAGAAGGGTTTCA	181
17	58678166	58678286	PPM1D	CCTCGTCCGAGCCGGCTAAGGTTTGCGCTGCCATCCGCAAAGGCTTTCTCGCTTGTCACCTTGCCATGTGGAAGAAACTGGGTAAGTTCCCTGGCTTGTTTGGCGCCCGCCCCTTTTTCA	182
17	58700875	58700995	PPM1D	TTACAGCGGAATGGCCAAAGACTATGACGGGTCTTCCTAGCACATCAGGGACAACTGCCAGTGTGGTCATCATTCGGGGCATGAAGATGTATGTAGCTCACGTAGGTGACTCAGGGGTGG	183
17	58700995	58701115	PPM1D	TTCTTGGAATTCAGGATGACCCGAAGGATGACTTTGTCAGAGCTGTGGAGGTGACACAGGACCATAAGCCAGAACTTCCCAAGGAAAGAGAACGAATCGAAGGACTTGGTGGGAGGTAAC	184
17	58711155	58711275	PPM1D	TATCTTAGTTGTTGTATTTTAATCATTTAGATTATTTATGTGAACTCTTTATTTTTAGTGTAATGAACAAGTCTGGGGTGAATCGTGTAGTTTGGAAACGACCTCGACTCACTCACAATG	185
17	58711275	58711395	PPM1D	GACCTGTTAGAAGGAGCACAGTTATTGACCAGATTCCTTTTCTGGCAGTAGCAAGAGCACTTGGTAAGTAGGACTTAATTTGGTGAAATTATATTGAATTTTCTACAATATATGGTGGCA	186
17	58725228	58725348	PPM1D	GCTTTTTCTGCTCCCTTCCCCCAGGTGATTTGTGGAGCTATGATTTCTTCAGTGGTGAATTTGTGGTGTCACCTGAACCAGACACAAGTGTCCACACTCTTGACCCTCAGAAGCACAAGT	187
17	58725348	58725468	PPM1D	ATATTATATTGGGGAGTGATGGACTTTGGAATATGATTCCACCACAAGATGCCATCTCAATGTGCCAGGACCAAGAGGAGAAAAAATACCTGATGGTGAGATGTGATTGAATAACTTGAT	188
17	58733901	58734021	PPM1D	AGATGTAGTGGCAGCTAAATCTGAGTTACTTTCCTTCTCCTTGTTCTTTTGAATACAGGGTGAGCATGGACAATCTTGTGCCAAAATGCTTGTGAATCGAGCATTGGGCCGCTGGAGGCA	189
17	58734021	58734141	PPM1D	GCGTATGCTCCGAGCAGATAACACTAGTGCCATAGTAATCTGCATCTCTCCAGAAGTGGACAATCAGGGAAACTTTACCAATGAAGATGAGTTATACCTGAACCTGACTGACAGCCCTTC	190
17	58734141	58734261	PPM1D	CTATAATAGTCAAGAAACCTGTGTGATGACTCCTTCCCCATGTTCTACACCACCAGTCAAGGTATATAGTTCCATAGTTTTTAAGTTATGTTTTAATAGACACCAGTTCTTTGGTTAGCG	191
17	58734240	58734360	PPM1D	ACACCAGTTCTTTGGTTAGCGTCACCTGGAAACAATTTTTAAATTCTTACAGGATTTTGGATTTGAACTCGATTCAAGAAAGTGATGTAACTTATTATCAGAGAGCCATCTTTACATCAA	192
17	58734360	58734479	PPM1D	TACTAATCTGAATGCCAGCCATGTGTACAGCACTAATAAAAAGGTGATTGTGGGCCCTTAAGAATATTATTGTTTGCCATCTAATGCTATGAACATTATTTTTAAAGCATTTAGAAGTT	193
17	58740334	58740454	PPM1D	TTTTACCTTCTTATTTTTCAGTCACTGGAGGAGGATCCATGGCCAAGGGTGAATTCTAAGGACCATATACCTGCCCTGGTTCGTAGCAATGCCTTCTCAGAGAATTTTTTAGAGGTTTCA	194
17	58740454	58740574	PPM1D	GCTGAGATAGCTCGAGAGAATGTCCAAGGTGTAGTCATACCCTCAAAAGATCCAGAACCACTTGAAGAAAATTGCGCTAAAGCCCTGACTTTAAGGATACATGATTCTTTGAATAATAGC	195
17	58740574	58740694	PPM1D	CTTCCAATTGGCCTTGTGCCTACTAATTCAACAAACACTGTCATGGACCAAAAAAATTTGAAGATGTCAACTCCTGGCCAAATGAAAGCCCAAGAAATTGAAAGAACCCCTCCAACAAAC	196
17	58740694	58740814	PPM1D	TTTAAAAGGACATTAGAAGAGTCCAATTCTGGCCCCCTGATGAAGAAGCATAGACGAAATGGCTTAAGTCGAAGTAGTGGTGCTCAGCCTGCAAGTCTCCCCACAACCTCACAGCGAAAG	197
17	58740814	58740934	PPM1D	AACTCTGTTAAACTCACCATGCGACGCAGACTTAGGGGCCAGAAGAAAATTGGAAATCCTTTACTTCATCAACACAGGAAAACTGTTTGTGTTTGCTGAAATGCATCTGGGAAATGAGGT	198

이는 DNMT3A, TET2, ASXL1 및 PPM1D 유전자에 대한 NGS 패널의 전체 서열 중 체세포 서열변이가 검출되는 염색체 서열에 대한 프로브 서열정보를 예시적으로 제시한 것이며, 상기 돌연변이 검출 제제는 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 위해 사용될 수 있으며, 상기 유전자 분석은 차세대 유전체 시퀀싱 분석법(Next Generation Sequencing, NGS) 및 PCR-기반 기법, 예를 들어, 실시간 정량적 PCR, blocker PCR, 디지털 액적(droplet) PCR(ddPCR), 클램핑 PCR, ICE-COLD PCR, castPCR, ARMS PCR, BEAMing 등을 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.

또한, 상기 단백질을 검출할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 이들 항체의 단편(scFv), 또는 앱타머(aptamer)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 개체의 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 키트가 제공된다.

구체적으로, 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 예를 들어, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 키트에 포함된 상기 조성물은 패널(panel) 형태일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 유전자 분석용 패널이 제공된다. 상기 유전자 분석용 패널은 차세대 시퀀싱 분석법(NGS)을 기초로 할 수 있으며, 이는 클론성 조혈증과 연관된 유전자 변이를 탐색하는데 이용되거나, 폐암의 치료와 연관되어 예후를 예측하기 위해 활용될 수 있다. 유전자 분석용 패널을 통해 실시자는 염기서열 분석하고자 하는 유전자의 영역, 나아가 유전자의 변이를 탐색하고자 하는 영역에 대한 분석을 수행할 수 있다. 또한, 실시자는 유전자 분석용 패널을 통해 한번의 분석에서 복수 개의 목적 유전자에 대한 동시 분석을 수행할 수 있다. 유전자 분석용 패널은 목적 유전자 각각에 대한 상보적 염기서열을 갖는 프로브(probe)를 포함할 수 있고, 각각의 프로브는 개체로부터 분리한 생물학적 시료 내의 목적 유전자 영역에 대하여 혼성화 반응(hybridization)에 의해 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 클론성 조혈증과 관련된 유전자 변이를 검출하기 위한 유전자 분석용 패널은 APC, ASXL1, ASXL2, ATM, BCL11B, BCOR, BCORL1, BIRC3, BRAF, BRCC3, CARD11, CASP8, CBL, CD58, CD79B, CNOT3, CREBBP, CUX1, DDX3X, DNMT3A, EP300, ETV6, EZH2, FAM46C, FBXW7, FLT3, FOXP1, GNAS, GNB1, GPS2, HIST1H1C, IDH2, IKZF1, IKZF2, JAK1, JAK2, JAK3, JARID2, KDM6A, KIT, KLHL6, KMT2D, KRAS, LUC7L2, MAP3K1, MPL, MYD88, NF1, NFE2L2, NOTCH1, NOTCH2, NRAS, PDS5B, PDSS2, PHF6, PHIP, PIK3CA, PIK3R1, PPM1D, PRDM1, PRPF40B, PTEN, PTPN11, RAD21, RIT1, RPS15, SETD2, SETDB1, SF1, SF3A1, SF3B1, SMC1A, SMC3, SRSF2, STAG1, STAG2, STAT3, SUZ12, TBL1XR1, TET1, TET2, TNFAIP3, TNFRSF14, TP53, U2AF1, VHL, WT1, ZRSR2 및 CHEK2 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프로브를 포함할 수 있다. 이상의 프로브들은 상기 유전자에 대한 염기서열 변이들을 탐색하는 데 이용될 수 있다. 프로브가 부착된 유전자는 PCR을 통해 증폭됨으로써 염기서열 분석을 위한 라이브러리로 제작될 수 있고, 차세대 시퀀싱 분석법을 통해 최종적으로 상기 유전자에 대한 염기서열 변이 유무가 검출될 수 있다.

상기 "클론성 조혈증", "폐암", "개체", "생물학적 시료", "예후", "예측", "변이" 등 동일 구성에 대한 구체적인 설명은 상기를 참조한다.

폐암의 치료를 위한 클론성 조혈증의 진단

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 폐암 치료를 위한 치료제의 투여 전에, 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 통해 상기 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 폐암의 치료 방법 또는 폐암의 치료를 위한 정보의 제공 방법이 제공된다. 상술한 바와 같이, 폐암 환자에서 클론성 조혈증의 존재 유무는 폐암 치료의 예후와 밀접하게 관련이 있으므로, 폐암 치료제의 투여 전에 환자가 클론성 조혈증을 갖고 있는지 여부를 확인하여 치료제의 투여 여부를 결정할 수 있으며, 이로써 폐암 환자의 생존율을 높일 수 있다.

상기 클론성 조혈증과 관련된 체세포 돌연변이가 발생하는 유전자에 대한 구성은 본 명세서의 "폐암 치료의 예후 예측 방법"에서 기술된 내용을 참조한다.

일 구현예에서, 상기 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계는 DNMT3A, ASXL1, TET2, PPM1D, ATM, BCL11B, CARD11, CBL, CD79B, CHEK2, CUX1, ETV6, FOXP1, JAK2, KMT2D, MAP3K1, MPL, NF1, NOTCH1, NOTCH2, PHIP, PRPF40B, RAD21, SETD2, SF3B1, TET1, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하는지를 확인하는 것을 포함할 수 있으며, 이에 기초하여 클론성 조혈증의 존재 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 ASXL1, CBL, CHEK2, CUX1, DNMT3A, FOXP1, JAK2, KMT2D, MPL, NOTCH1, PPM1D, PRPF40B, SF3B1, TET2, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 DNMT3A, ASXL1, TET2, PPM1D, SF3B1, ATM, 및 TNFAIP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 상기 언급된 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자를 포함할 수 있으며, 이 때, 상기 하나 이상의 유전자는 상기 선택된 하나의 유전자를 제외한 나머지 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 유전자에 변이가 존재하는지 여부 및 변이 대립 유전자 빈도(variant allele frequency, VAF)에 기초하여 클론성 조혈증의 존재 여부를 결정할 수 있다. 예컨대, 개체로부터 분리한 생물학적 시료를 이용한 유전자 분석을 통해, 상기 유전자 군의 유전자들 중 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하고 변이 대립 유전자 빈도가 일정 수준 이상, 예를 들어 약 1.8% 이상, 약 1.9% 이상, 또는 약 2% 이상인 경우에, 클론성 조혈증이 존재하는 개체로 분류될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 개체에 클론성 조혈증이 존재하지 않는 것으로 결정된 경우에 폐암 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 개체에 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 결정된 경우에는 폐암 치료제의 투여 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 개체에 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 결정된 경우에 폐암 치료제를 투여하지 않거나, 또는 폐암 치료제를 투여하는 것으로 결정할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 폐암 치료제의 투여 여부를 결정하는 단계는 클론성 조혈증(CH)의 존재 여부와 함께 유의한 혈구 카운트 이상, 높은 VAF(> 10%)에서의 단일 CH 돌연변이, 다중 CH 돌연변이, TP53 및/또는 PPM1D의 변이체, DNMT3A 변이체, IDH1/2의 핫스팟(hotspot) 돌연변이 등을 종합적으로 고려하여 결정할 수 있다. 이 외에도, 폐암의 병기, 환자의 나이, 병력, 현재 동반하고 있는 질환의 종류 및 수 등이 추가적으로 고려될 수 있다.

상술한 여러 가지 변수를 고려하여, 상기 개체에 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 결정된 경우에 폐암 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 폐암 치료의 투여 전에 환자에서 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 결정된 경우, 상대적으로 클론성 조혈증에 영향을 덜 미치거나 클론성 조혈증과 관련된 불리한 결과를 증폭시킬 확률이 더 낮은 폐암 치료제를 선택하여 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 폐암 치료를 위한 치료제는 임상시험을 위한 약물 후보 물질을 포함한다. 예컨대, 본 발명에 따른 폐암의 치료 방법은 폐암 치료제에 대한 임상시험에 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 폐암 치료를 위한 약물 후보 물질을 개체에 투여하기 전에, 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 통해 상기 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 폐암의 치료 방법 또는 폐암 치료용 약물 후보 물질의 임상시험 방법이 제공된다.

일 구체예에서, 상기 방법은 개체에 클론성 조혈증이 존재하지 않는 것으로 결정된 경우에 약물 후보 물질을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 방법은 개체에 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 결정된 경우에 약물 후보 물질을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 폐암 치료 방법을 폐암 치료제에 대한 임상시험에 적용하는 경우, 폐암 치료제에 대한 임상시험에 참여하거나 참여할 예정인 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 통해 상기 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있으며, 이와 같은 확인 단계를 통해 클론성 조혈증이 존재하는 개체군을 선별함으로써 폐암 치료제에 대한 임상시험 성공 확률을 높일 수 있다.

상술한 바와 같이, 폐암 환자에서 클론성 조혈증의 존재가 폐암 치료에 대한 불량한 예후로 이어짐이 입증되었으므로, 본 발명에 따라 클론성 조혈증의 존재 유무를 확인하는 것은 폐암 치료제에 대한 임상시험의 성공 확률을 높이기 위해 이용될 수 있다. 의약품의 임상시험은 임상 1상에서 허가승인까지 평균적으로 10년 이상의 기간이 소요되며, 따라서 장기간 동안 의약품의 안전성 및 유효성이 평가된다. 이때, 시험되는 의약품에 의한 영향 외에도 치료의 예후에 부정적인 영향을 주는 다른 숨은 인자가 있다면 의약품의 안정성, 유효성 등이 실제보다 더 과소평가되거나 환자에 따른 편차가 크게 나타나는 것으로 평가될 가능성이 존재하며, 이에 의해 임상시험의 성공 확률이 저하될 위험이 있다. 따라서 의약품의 임상시험에 있어서 균일한 환자군을 선별하는 것 또한 매우 중요하다. 본 발명은 폐암 치료의 예후에 부정적으로 작용하는 클론성 조혈증의 존재 여부에 따라 임상시험 환자군을 선별함으로써 임상시험의 성공 확률을 높일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 개체에 클론성 조혈증이 존재하는 경우는 클론성 조혈증이 존재하지 않는 경우에 비해 폐암 치료제의 안전성 또는 유효성이 과소평가됨을 나타내는 것일 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 개체는 폐암 치료제에 대한 임상시험을 진행한 적이 있거나 진행하고 있는 개체일 수 있다. 예를 들어, 폐암 치료제에 대한 안전성, 유효성 등의 평가는 개체에서 클론성 조혈증의 유무를 확인하여 클론성 조혈증이 존재하는 개체군을 배제하거나, 또는 클론성 조혈증이 존재하는 개체군과 클론성 조혈증이 존재하지 않는 개체군을 구별하여 진행될 수 있다.

또한, 상기 개체는 폐암 치료제에 대한 임상시험을 진행할 예정인 개체이거나 임상시험 후보로 등록된 폐암 환자일 수 있다. 예를 들어, 폐암 치료제의 임상시험을 위한 환자(개체) 선별 과정에서 클론성 조혈증의 유무를 확인함으로써 클론성 조혈증이 존재하는 개체는 임상시험에서 배제하거나 또는 클론성 조혈증이 존재하는 개체군과 클론성 조혈증이 존재하지 않는 개체군을 따로 선별하여 임상시험을 진행할 수 있다.

한편, 개체에 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 결정된 경우에 약물 후보 물질을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 상기 임상시험 방법에 있어서, 상기 약물 후보 물질로 클론성 조혈증에 대한 영향이 상대적으로 더 작거나 클론성 조혈증과 관련된 불리한 결과를 증폭시킬 확률이 더 낮은 물질을 선택하여 투여할 수 있다. 이때, 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 결정된 개체에 투여되는 상기 약물 후보 물질에 대해 폐암에 대한 치료 효능 및 안전성뿐만 아니라 클론성 조혈증에 대한 영향 또한 평가될 수 있다. 상기 "클론성 조혈증", "폐암", "개체", "생물학적 시료", "변이" 등 동일 구성에 대한 구체적인 설명은 상기를 참조한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예는 외과적 절제술에 이어 보조 요법을 받은 폐암 환자, 특히 비소세포폐암(NSCLC) 환자의 생존 결과에 미치는 수술 전에 존재한 클론성 조혈증의 임상적 영향을 대규모 단일 중심 연속 수술 코호트(large-scale single center consecutive surgical cohort)를 사용하여 평가한 것이다. 보조 요법 및 CH 상태에 따른 선택 편향의 가능성을 배제하기 위해 성향 점수 매칭(propensity score matching; PSM) 기법을 사용하였다.

실시예 1. 환자 그룹

2011년 1월과 2017년 12월 사이에 NSCLC 수술을 받은 환자(1211명)의 모든 임상 기록을 서울아산병원의 폐암 데이터베이스에서 검토하였다. 본 실시예는 병기 IIB기 또는 III기의 NSCLC에 대해 보조 요법(adjuvant therapy)을 받은 환자에 대해 수행되었다(도 1). 구체적으로, NSCLC 수술을 받은 환자 1211명 중 369명의 환자를 제외시켰고, 제외 기준은 다음과 같았다: i) 폐암 이외의 악성종양이 과거에 있었거나 현재 있는 환자; ii) 수술 전 보조요법(neoadjuvant therapy)을 받은 환자; iii) 하엽 절제술(sublobar resection)(쐐기 절제술(wedge resection) 또는 구역절제술(segmentectomy))을 받은 환자; iv) 불완전 절제 환자; 및 v) 수술 후 30일 이내에 사망한 환자.

상기 기준에 따라 제외한 후, 병기 IIB기 또는 III기의 NSCLC에 대해 보조 화학요법(CTx) 또는 화학방사선 요법(CRTx)을 받은 563명의 환자를 식별하였다. 이들 중 수술 전에 수집하여 한국인체자원은행네트워크(Korea Biobank Network)인 서울아산병원 조직세포자원센터(Asan Bio-Resource Center)에 보관된 혈액 샘플이 있는 424명의 환자를 확인할 수 있었다. 이들 샘플 중 9개 샘플은 샘플 분해로 인해 제외하였고, 혈액 샘플이 있는 415명의 환자를 최종 코호트(final cohort)로 등록하였다.

병기 IIB기 환자에서 보조 요법에 따른 CH의 임상적 영향을 확인하기 위해, 병기 IIB기의 NSCLC에 대한 보조 요법이 수행되지 않은 환자의 혈액 샘플을 추가로 분석하였다(도 1).

본 연구는 서울아산병원의 임상연구심의위원회의 승인을 받았다(2020-0906). 모든 참여자로부터 서면 동의서를 받았다.

실시예 2. 샘플 처리 및 시퀀싱

본 연구에 등록된 환자로부터 채취된 혈액 유래 DNA를 사용하여 하기 89개의 유전자를 포함하는 맞춤형 패널과 함께 표적화된 NGS를 수행하였다(표 10).

APC	ASXL1	ASXL2	ATM	BCL11B	BCOR	BCORL1	BIRC3
BRAF	BRCC3	CARD11	CASP8	CBL	CD58	CD79B	CNOT3
CREBBP	CUX1	DDX3X	DNMT3A	EP300	ETV6	EZH2	FAM46C
FBXW7	FLT3	FOXP1	GNAS	GNB1	GPS2	HIST1H1C	IDH2
IKZF1	IKZF2	JAK1	JAK2	JAK3	JARID2	KDM6A	KIT
KLHL6	KRAS	LUC7L2	MAP3K1	KMT2D	MPL	MYD88	NF1
NFE2L2	NOTCH1	NOTCH2	NRAS	PDS5B	PDSS2	PHF6	PHIP
PIK3CA	PIK3R1	PPM1D	PRDM1	PRPF40B	PTEN	PTPN11	RAD21
RIT1	RPS15	SETD2	SETDB1	SF1	SF3A1	SF3B1	SMC1A
SMC3	SRSF2	STAG1	STAG2	STAT3	SUZ12	TBL1XR1	TET1
TET2	TNFAIP3	TNFRSF14	TP53	U2AF1	VHL	WT1	ZRSR2
CHEK2

시퀀싱 라이브러리는 SureSelect XT HS Target Enrichment System(미국 캘리포니아주 산타클라라 소재의 Agilent) 프로토콜에 따라 준비하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 150 bp 페어 엔드(paired-end)를 사용하여 Illumina NovaSeq6000 플랫폼(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 Illumina)에서 라이브러리를 시퀀싱하였다. Analysis ready BAM의 평균 커버리지 깊이는 800배 초과였다.

실시예 3. 환자의 수술 전 및 수술 후 관리

진단, 병기 결정, 및 외과적 절제를 위한 환자 정밀검사를 잘 확립되고 널리 사용되는 프로토콜에 따라 수행하였다(문헌[Yun JK, Bok JS, Lee GD, et al: Long-term outcomes of upfront surgery in patients with resectable pathological N2 non-small-cell lung cancer. Eur J Cardiothorac Surg 58:59-69, 2020] 참조).

컴퓨터 단층 촬영(CT) 또는 양전자 방출 단층 촬영(PET)에서 임상적 N2(cN2) 질환이 의심되는 경우, 의심스러운 결절에 대해 기관지 내시경 초음파(EBUS), 종격동내시경술, 또는 내시경 초음파(EUS)를 사용하여 종격동 LN 생검을 수행하였다. 생검으로 입증된 N2 질환에 대한 치료 계획은 의학 종양 전문의, 방사선 전문의, 흉부 외과의를 포함한 다학제 팀(multidisciplinary team)이 결정하였다. 연구 샘플의 환자에 대해 AJCC(American Joint Committee on Cancer) 8판에 따라 후향적으로 병기를 결정하였다(문헌[Detterbeck FC, Boffa DJ, Kim AW, et al: The Eighth Edition Lung Cancer Stage Classification. Chest 151:193-203, 2017] 참조).

다학제 팀의 판단에 따라, 환자가 75세를 초과하거나 신체 상태가 불량한 경우를 제외한 모든 II기 및 III기 환자에 대해 보조 CTx가 권장되었다. 백금 기반 요법을 사용하는 전신 CTx는 수술 후 4주 내지 6주 동안 총 4회 사이클의 치료로 권장되었다. 2008년부터 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 활성화 돌연변이를 갖는 환자에 대해 표적화된 요법의 사용이 보편화됨에 따라, 1차 보조 CTx 이후 재발했을 때 티로신 키나아제 억제제가 주로 사용되었다. III기에 대한 보조 방사선 요법(RTx)의 경우, 완전 절제술을 받은 환자의 경우 50.4 Gy의 총 용량 또는 양성 절제연(positive resection margin)을 갖는 환자의 경우 55 내지 60 Gy의 총 용량까지 1.8 Gy의 일일 용량을 투여했다. 완전 절제술을 받은 환자들 중에서, 단일 N2 결절 전이가 있는 상당수의 환자의 경우 보조 RTx를 생략하였다.

모든 환자에 대한 추적조사 정보는 수술 후 첫 2년 동안은 6개월마다, 그 이후에는 매년 클리닉 추적조사 기록을 통해 얻었다. 흉부 CT 스캔은 모든 임상 방문 시 또는 질환 재발이 의심될 때 언제라도 수행되었다. 재발 사례에 대한 치료 방식과 화학요법은 담당 의사의 재량에 따라 결정되었다.

실시예 4. 유전자 변이 검출 및 생존 결과 측정

병기 IIB기 또는 III기의 NSCLC에 대해 보조 요법을 받은 환자에서 CH의 존재에 따른 생존 결과를 1차 종말점(primary endpoint)으로 하였고, CH의 존재 여부와 보조 요법의 수행 여부에 따른 병기 IIB기 환자의 생존 결과는 2차 종말점(secondary end point)에 포함시켰다(도 1).

CH에서 자주 검출되는 89개의 유전자를 선택하여 검사하고(유전자 목록은 상기 표 10 참조), 2% 이상의 변이 대립 유전자 빈도(variant allele frequency, VAF)를 보이는 경우 CH 양성으로 정의하였다.

돌연변이 중 잠재적인 운전자(potential driver, PD) 돌연변이를 분류하기 위해 다음 기준을 사용하였다: 1) COSMIC에서 "조혈 및 림프구" 범주의 암종에서 1회 초과로 보고되었거나, 모든 범주의 암종에서 10회 초과로 발생하는 임의의 체세포 변이; 및 2) 기능 상실 효과가 있는 임의의 체세포 변이(프레임시프트(frameshift), 정지 획득(stop gain), 스플라이스 도너/억셉터 부위에서의 돌연변이). 상기 PD 돌연변이의 기준을 충족하지 않는 돌연변이는 비-PD 돌연변이로 분류하였다. 결과적인 PD 돌연변이 목록을 하기 표 11에 나타낸다.

Gene	Position	Variant classification	Protein change	CDS
ASXL1	31022441	FRAME_SHIFT	p.642Gly_643Glyfs	c.1927_1928insG
ASXL1	31022286	STOP_GAINED	p.590Tyr_591GlninsTer???	c.1772_1773insA
ASXL1	31021211	STOP_GAINED	p.Arg404*	c.1210C>T
ASXL1	31022441	FRAME_SHIFT	p.642Gly_643Glyfs	c.1927_1928insG
ASXL1	31023478	FRAME_SHIFT	p.987Asp_994Hisfs	c.2964_2971delCTCTGAAGCACTGAGTC
ASXL1	31024343	FRAME_SHIFT	p.1276Pro_1277Asnfs	c.3829_3830delC
ASXL1	31022402	FRAME_SHIFT	p.629His_637Thrfs	c.1888_1896delCACCACTGCCATAGAGAGGCGGC
ASXL1	31022927	FRAME_SHIFT	p.804Pro_805Thrfs	c.2413_2414insC
ASXL1	31022700	FRAME_SHIFT	p.728Ser_729Cysfs	c.2186_2187delG
ASXL1	31022463	FRAME_SHIFT	p.649Gly_650Glyfs	c.1949_1950delGT
ASXL1	31022441	FRAME_SHIFT	p.642Gly_643Glyfs	c.1927_1928insG
ASXL1	31022288	STOP_GAINED	p.Tyr591*	c.1773C>A
ASXL1	31022936	FRAME_SHIFT	p.807Pro_808Alafs	c.2422_2423delC
ASXL1	31022441	FRAME_SHIFT	p.642Gly_643Glyfs	c.1927_1928insG
CBL	119148973	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.His398Arg	c.1193A>G
CHEK2	29083949	FRAME_SHIFT	p.565Arg_566Glufs	c.1696_1697delC
CUX1	101459346	STOP_GAINED	p.Trp12*	c.36G>A
DNMT3A	25463600	SPLICE_SITE_ACCEPTOR	-	-
DNMT3A	25462077	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Pro777Arg	c.2330C>G
DNMT3A	25468888	SPLICE_SITE_DONOR	-	-
DNMT3A	25468201	SPLICE_SITE_ACCEPTOR	-	-
DNMT3A	25462018	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Asn797Asp	c.2389A>G
DNMT3A	25463286	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Arg736His	c.2207G>A
DNMT3A	25467168	FRAME_SHIFT	p.568Pro_569Glyfs	c.1706_1707delC
DNMT3A	25469079	FRAME_SHIFT	p.459Ser_460Thrfs	c.1378_1379insTA
DNMT3A	25469986	FRAME_SHIFT	p.351Ser_352Alafs	c.1055_1056delG
DNMT3A	25467449	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Gly543Cys	c.1627G>T
DNMT3A	25467071	FRAME_SHIFT	p.600Trp_601Profs	c.1803_1804delG
DNMT3A	25469504	FRAME_SHIFT	p.416Ser_421Leufs	c.1251_1256delCGGGAATCCCGGT
DNMT3A	25457243	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Arg882Cys	c.2644C>T
DNMT3A	25469527	FRAME_SHIFT	p.410Leu_414Glnfs	c.1233_1237delTCGGGGGG
DNMT3A	25462068	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Ile780Thr	c.2339T>C
DNMT3A	25457243	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Arg882Cys	c.2644C>T
DNMT3A	25458595	FRAME_SHIFT	p.858Leu_859Trpfs	c.2577_2578insA
DNMT3A	25470028	SPLICE_SITE_ACCEPTOR	-	-
DNMT3A	25467470	FRAME_SHIFT	p.534Ser_535Tyrfs	c.1605_1606delC
DNMT3A	25457243	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Arg882Cys	c.2644C>T
DNMT3A	25458595	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Trp860Arg	c.2578T>C
DNMT3A	25463172	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Glu774Val	c.2321A>T
DNMT3A	25467208	SPLICE_SITE_ACCEPTOR	-	-
DNMT3A	25470472	FRAME_SHIFT	p.333Gly_334Lysfs	c.1001_1002delG
DNMT3A	25467190	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Cys562Tyr	c.1685G>A
DNMT3A	25467023	SPLICE_SITE_DONOR	-	-
DNMT3A	25457159	FRAME_SHIFT	p.908Phe_909Alafs	c.2727_2728insTT
FOXP1	71026147	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Tyr492Cys	c.1475A>G
FOXP1	71064710	FRAME_SHIFT	p.320Gln_321Serfs	c.963_964insAA
JAK2	5073770	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Val617Phe	c.1849G>T
KMT2D	49434156	STOP_GAINED	p.Leu2466*	c.7397T>A
MPL	43815009	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Trp515Leu	c.1544G>T
NOTCH1	139390743	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Thr2483Met	c.7448C>T
PPM1D	58740438	FRAME_SHIFT	p.447Asn_448Phefs	c.1344_1345delT
PPM1D	58740357	FRAME_SHIFT	p.420Ser_421Leufs	c.1263_1264insA
PPM1D	58740532	FRAME_SHIFT	p.479Lys_480Alafs	c.1438_1439insA
PPM1D	58740505	FRAME_SHIFT	p.470Pro_471Glufs	c.1411_1412insC
PPM1D	58740749	STOP_GAINED	p.Arg552*	c.1654C>T
PPM1D	58740623	FRAME_SHIFT	p.509Gln_510Lysfs	c.1529_1530insA
PPM1D	58740694	FRAME_SHIFT	p.533Phe_534Lysfs	c.1600_1601delT
PRPF40B	50027317	FRAME_SHIFT	p.189Asp_190Aspfs	c.568_569insGATGACCTAGAGGGTGA
PRPF40B	50027317	FRAME_SHIFT	p.189Asp_190Aspfs	c.568_569insGATGACCTAGAGGGTGA
SF3B1	198267359	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Lys666Asn	c.1998G>T
SF3B1	198267360	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Lys666Arg	c.1997A>G
TET2	106157878	FRAME_SHIFT	p.926Val_927Phefs	c.2780_2781delT
TET2	106182979	FRAME_SHIFT	p.1339Leu_1340Alafs	c.4019_4020delT
TET2	106193794	FRAME_SHIFT	p.1418Pro_1420Tyrfs	c.4257_4259delTT
TET2	106196243	STOP_GAINED	p.Gln1526*	c.4576C>T
TET2	106155853	FRAME_SHIFT	p.251Ile_252Asnfs	c.755_756insTT
TET2	106180853	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Tyr1294Cys	c.3881A>G
TET2	106157989	FRAME_SHIFT	p.963Gln_964Thrfs	c.2891_2892insA
TET2	106157969	FRAME_SHIFT	p.956Leu_957Glnfs	c.2871_2872insA
TET2	106155281	FRAME_SHIFT	p.60Tyr_61Glyfs	c.183_184insT
TET2	106157789	FRAME_SHIFT	p.896Gln_897Glyfs	c.2691_2692delG
TET2	106157560	STOP_GAINED	p.Gln821*	c.2461C>T
TNFAIP3	138197265	FRAME_SHIFT	p.255His_256Phefs	c.768_769insT
TNFAIP3	138196885	STOP_GAINED	p.Arg183*	c.547C>T
TNFAIP3	138200309	FRAME_SHIFT	p.575Pro_581Alafs	c.1728_1734delGCATTCTTGCCACA
TP53	7574003	STOP_GAINED	p.Arg342*	c.1024C>T
U2AF1	44524456	NON_SYNONYMOUS_CODING	p.Ser34Tyr	c.101C>A
ZRSR2	15833956	FRAME_SHIFT	p.238Phe_239Tyrfs	c.715_716delT

전체 생존율(OS)은 수술일과 사망일 사이의 시간 간격을 기준으로 계산하였으며, 국민 안전 사망 지수 데이터베이스(Korean National Security Death Index Database)의 기록을 검토하여 결정하였다. 폐암 사망률에는 명백한 종양 진행으로 인한 사망을 포함시켰다. 비-폐암 사망률은 폐암 진행으로 인한 것이 아닌 알려진 원인에 따른 사망률로 정의하였다. 무재발 생존율(RFS)은 수술일과 재발일 사이의 시간을 기준으로 계산하였으며, 재발이 없는 환자는 재발이 없는 것으로 알려진 최신 시점에서 검열하였다.

실시예 5. 통계 분석

연속형 변수는 평균과 표준 편차로, 범주형 변수는 카운트와 퍼센트로 표시하였다. 개별 모수 분포의 정규성은 Shapiro-Wilk 검정으로 평가하였다. 연속형 변수 측면에서 두 그룹을 비교하기 위해 스튜던트 t 검정 또는 Wilcoxon 순위합(rank-sum) 검정을 사용하고, 범주형 변수에 대해서는 카이 제곱 검정 또는 Fisher 정확 검정을 적용하였다. 성향 점수 매칭(PSM) 후, McNemar 검정과 대응표본 t-검정을 사용하여 성향 점수 매칭 쌍을 분석하였다. OS 및 RFS 결과는 Kaplan-Meier 곡선을 사용하여 정의하였다. 생존율의 차이는 로그-순위 검정을 사용하여 분석하였다. 두 가지 원인별 사망은 상호 배타적이므로, 하위 그룹 간의 누적 발생률 함수 값의 유의한 차이는 Gray 검정을 사용하여 평가하였다. 생존 결과에 미치는 CH의 임상적 영향을 확인하기 위한 단변수 및 다변수 분석을 위해 Cox 비례 위험 모델을 사용하였다. 본 발명자들은 두 가지 유형의 다변수 Cox 모델을 개발했다: CH에 대한 민감도 테스트를 조정하기 위해 연령, 성별, 흡연 이력 및 동반질환의 수를 공변량으로 포함시켰고(하기 실시예 6.1의 표 13과 관련됨), 보조 요법을 받은 환자에서 CH의 예후 효과를 확인하기 위해 우도 비 검정(likelihood ratio test)(모델 입력의 경우 p 값 ≤ 0.10 및 모델 유지의 경우 p 값 ≤ 0.05)을 위한 선택 절차로 전진형 단계별 선택을 사용하였다(하기 실시예 6.3의 표 17과 관련됨). Cox 회귀 모델에 대한 비례 위험 가정은 Schoenfeld 잔차(residual)로 테스트하였다.

유사한 특성을 가진 두 그룹(CH-양성 및 CH-음성)을 생성하기 위한 후향적 비무작위 코호트로부터 유래된 가능한 선택 편향을 조정하기 위해 PSM을 적용했다. 총 12개의 변수(하기 실시예 6.2의 표 14와 관련됨)를 사용하여 두 그룹의 임상적 특성의 균형을 맞추었다. PSM의 경우, 최근접-이웃 매칭 및 표준 편차 0.25의 캘리퍼 너비로 동등한 성향 점수를 가진 관찰 쌍을 선택하였다. CH-음성 환자를 2:1 비로 CH-양성 환자와 무작위로 매칭시켰다. 그룹 간의 균형은 표준화된 평균 차이(standardized mean difference, SMD)를 사용하여 평가하였다. 0.1 이하의 절대 표준화된 차이가 이상적인 균형을 나타내는 것으로 간주되었고, 0.2 이하의 절대 표준화된 차이는 허용되는 균형을 나타내는 것으로 간주되었다.

모든 통계 계산은 "Survival", "MatchIt", "cmprsk" "dplyr", "sad", "ggplot2", "GGally", "survminer", 및 "rms" 패키지를 사용하는 R 버전 4.0.2(오스트리아 비엔나 소재의 The R Foundation for Statistical Computing)를 사용하여 수행하였다. 보고된 모든 P 값은 양측이다. 0.05 미만의 P 값이 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 6. 샘플 분석 결과

실시예 6.1. CH의 특성

최종 코호트에서 환자의 평균 연령은 60.2 ± 8.3세였다. 총 415명의 환자 중에서, CH는 86명(20.7%)에서 발견되었다. CH의 유병률은 40대, 50대, 60대, 및 70대 환자에서 각각 10.4%, 14.9%, 23.8%, 및 34.5%였으며, 연령에 따른 지속적인 증가를 나타냈다(도 5a). 돌연변이 수는 단일 돌연변이가 82.6%의 환자에서 가장 흔했고, 2개의 돌연변이가 14.0%, 3개의 돌연변이가 3.5%였다(도 5b). DNMT3A(33.0%)의 돌연변이가 가장 흔했고, ASXL1(13.2%), TET2(11.3%), 및 PPM1D(7.5%)의 돌연변이가 그 뒤를 이었다. 이 4개의 유전자가 검출된 모든 돌연변이의 65.1%를 차지하였고, 그 밖에 SF3B1, ATM, TNFAIP3 등의 돌연변이가 존재하였다(도 5c). 개별 환자에 대해 검출된 CH 돌연변이의 세부 사항은 상기 표 1 내지 표 5에 요약되어 있다.

VAF에 대한 여러 컷오프 값에 기초한 민감도 테스트는 VAF의 컷오프 값이 1.8% 이상일 때 P 값이 OS에 대한 단변수 및 다변수(연령, 성별, 흡연 이력 및 동반질환의 수에 따라 조정됨) Cox 분석에서 각각 0.002 및 0.005로 가장 낮음을 보여주었다(VAF 값에 기초한 CH에 대한 민감도 테스트 결과를 나타내는 하기 표 12를 참조함). 그러나, 2% 이상의 VAF의 컷오프 값은 1.8% 이상의 경우와 비교하여 유사한 결과를 가졌다(단변수 및 다변수 분석의 경우 p 값 = 각각 0.006 및 0.012)(하기 표 12를 참조함).

연구 환자에서 CH-PD 및 CH 비-PD의 유병률은 각각 16.3%(68/415) 및 6.0%(25/415)였으며, CH 돌연변이가 있는 환자에서는 79.1%(68/86) 및 29.1%(25/86)였다. 이들 환자에서 민감도 테스트 또한 수행하였다. 그 결과, 다변수 분석에서 여러 공변량에 의한 조정 후에도 CH-PD는 여전히 유의한 인자로 관찰된 반면(p = 0.006), 다변수 분석에서 CH 비-PD는 유의하지 않았다(p = 0.399)(CH, CH-PD, 및 CH 비-PD에 대한 민감도 테스트 결과를 나타내는 하기 표 13을 참조함).

실시예 6.2. 환자 특성

수술 후 평균 추적조사 기간은 44.6 ± 24.3개월이었다. 환자의 기준선 인구통계학 및 종양 특성을 하기 표 14(클론성 조혈증의 존재에 따른 병기 IIB기 또는 III기에 대한 보조 요법을 받은 환자의 기준선 특성(최종 코호트))에 나타내었다. PSM 전에는, CH가 있는 환자(n = 86)가 CH가 없는 환자(n = 329)보다 연령이 높았다(p < 0.001). 두 그룹 간에 성별(p = 0.367), 흡연 이력(p = 0.785), 동반질환의 수(p = 0.988), EGFR 돌연변이의 비율(p = 0.501), 조직학 분포(p = 0.647) 및 종합적 병기(p = 0.548), 보조 요법 유형(p = 0.146)의 유의한 차이는 없었다.

PSM 후, 연령(p = 0.620)을 비롯한 모든 변수는 두 그룹 간에 유사해졌고, 잘 균형을 이루었다(모든 SMD가 0.2 미만임)(성향 점수 매칭 후 클론성 조혈증의 존재에 따른 병기 IIB기 또는 III기에 대한 보조 요법을 받은 환자의 기준선 특성(최종 코호트)을 나타내는 하기 표 15를 참조함).

실시예 6.3. 생존율 분석

전반적으로, CH가 있는 45명의 환자(n = 86)와 CH가 없는 124명의 환자(n = 329)가 추적조사의 종료 시까지 사망했으며, 이들의 5년 OS 비율은 각각 45.1%와 61.9%였다. 재발 사건이 일어난 환자는 CH가 있는 경우와 CH가 없는 경우 각각 48명과 161명이었으며, 이들의 5년 RFS 비율은 각각 39.1%와 44.2%였다. 사망 원인에 대한 자세한 정보는 하기 표 16(전체 관찰 기간 동안의 사망 원인)에 요약되어 있다.

CH의 존재에 따른 Kaplan-Meier 생존 곡선은 도 2a 내지 도 2c에 플롯팅되어 있다. 두 그룹 간의 RFS에는 유의한 차이가 없었지만(p = 0.251), CH가 있는 환자는 CH가 없는 환자보다 OS가 더 불량했다(p < 0.001)(도 2a 및 도 2b). PSM 후, CH가 있는 환자는 CH가 없는 환자보다 생존율이 훨씬 더 불량했다(p = 0.029)(도 2c).

사망 원인에 따르면, 폐암 사망률은 CH와 관계없이 유사했다(p = 0.568)(도 3a). 그러나, CH가 있는 환자는 CH가 없는 환자에 비해 비-폐암 사망률(p = 0.042) 및 원인 불명의 사망률(p = 0.018)이 통계적으로 더 높았다(도 3b 및 도 3c).

다변수 Cox 분석에서, CH의 존재는 60% 미만의 DLCO, EGFR 돌연변이의 비율, 조직학적 유형 및 종합적 병기와 함께 보조 요법을 받은 진행된 NSCLC 환자의 OS에 대한 중요한 예후 인자였다(위험비[HR] [95% 신뢰 구간] = 1.62 [1.10 내지 2.38], p = 0.014)(전체 환자에서 OS에 대한 단변수 및 다변수 분석 결과를 나타내는 하기 표 17을 참조함). 단변수 분석에서 유의했던 연령과 동반질환의 수는 CH의 존재를 비롯한 여러 공변량에 의한 조정 후 유의하지 않게 되었다.

병기 IIB기에서 보조 요법에 따른 CH의 임상적 영향을 확인하기 위해, 환자를 보조 요법을 받은 환자와 받지 않은 환자로 나누었다. 병기 IIB기의 NSCLC에 대한 보조 요법을 받은 환자의 경우, CH의 존재는 PSM 전(p < 0.001) 및 PSM 후(p = 0.007) 더 불량한 OS와 연관되어 있었다(도 4a 및 도 4b). 보조 요법을 받지 않은 환자의 경우, CH가 있는 환자의 예후는 CH가 없는 환자의 예후보다 유의하게 더 나빴지만(p = 0.045), PSM 후에는 유사해졌다(p = 0.452)(도 4c 및 도 4d). PSM 전과 후 병기 IIB기 환자의 기준선 특성에 대한 세부 사항은 하기 표 18(PSM 전과 후, 클론성 조혈증의 존재에 따른 병기 IIB기 NSCLC에 대한 보조 화학요법을 받은 환자의 기준선 특성) 및 표 19(PSM 전과 후, 클론성 조혈증의 존재에 따른 병기 IIB기 NSCLC에 대한 보조 화학요법을 받지 않은 환자의 기준선 특성)에 나타내었다.

실시예 7. 고찰

위 실시예를 통해, 본 발명자들은 진행된 비소세포폐암(NSCLC) 환자에서 클론성 조혈증(CH)의 유병률과 특성을 조사하였다. 또한, 전체 환자와 PSM 후 환자에서 생존 결과에 미치는 수술 전 존재하는 CH의 임상적 영향을 평가하였다.

그 결과, 환자의 21%는 수술 전 CH를 가지고 있었으며, 이는 나이가 많을수록 증가하는 것으로 확인되었다. CH의 존재와 관련된 유전자의 돌연변이 중 DNMT3A의 돌연변이가 가장 흔했고, ASXL1, TET2, 및 PPM1D가 뒤를 이었다. 또한, CH-PD는 CH의 3/4를 차지했고, CH 자체보다 전체 생존율(OS)에 대한 더 중요한 예후 인자로 작용하였다. 수술 전 CH의 존재는 전체 사망률, 특히 비-폐암 사망률 및 원인 불명의 사망률의 증가와 상당한 관련이 있었다. 다변수 Cox 분석에 따르면 CH의 존재는 진행된 병기의 NSCLC에 대해 수술에 이어 보조 요법을 받은 환자들 사이에서 중요한 예후 인자로 확인되었다. CH의 예후 효과는 두 그룹 간의 기준선 공변량을 적절하게 조정하기 위해 엄격한 위험-조정 방법론을 채택한 후에도 동일했다.

건강한 노인 여성에서의 비-무작위 X 염색체 비활성화의 최초 검출 이래로, CH에 대한 연구와 본 발명자들의 이해는 지난 몇 년에 걸쳐 상당히 성장하였다. 기존의 여러 연구에 따르면, CH는 노화와 관련되어 흔히 발생하는 현상으로서 진행된 고형 종양 환자에서 후속 혈액 악성종양, 심혈관 질환 및 나쁜 예후와 밀접한 관련이 있다. 암 환자는 건강한 사람보다 CH 비율이 더 높으며, CH는 더 짧은 환자 생존과 관련된다. 이는 아마도 악성종양에 대한 높은 유전적 소인, 발암성 환경에 대한 장기간 노출 및 유전독성 요법을 사용하는 암 관련 요법 때문일 것으로 추측된다. 특히 암 관련 요법에서, CH는 CTx 및 RTx와 상당한 관련이 있는 것으로 생각되며, 이는 국소 및 전신 치료가 조혈 줄기 세포(HSC)의 클론 증식(clonal outgrowth)을 촉진할 수 있음을 의미한다. 이러한 관점에서, 본 발명자들은 수술 전 존재하는 CH가 암 관련 치료를 통해 CH와 관련된 불리한 결과를 유발하는 일련의 과정을 증폭시켜 불량한 생존 결과를 가져온다는 가설을 세웠다.

일 실시예에 따른 생존 분석에서, CH의 존재는 불량한 OS(p = 0.001)와 상당한 관련이 있었다(도 2a). 그러나, CH와 연령 사이의 양의 상관 관계를 고려할 때, 이 결과만으로 OS에 대한 CH의 효과를 단정할 수 없었다. 이 문제를 극복하기 위해, 본 발명자들은 두 가지 유형의 통계 조정을 수행하였다. 그 결과, 다변수 분석과 관련된 연령, 성별, 흡연 이력 및 동반질환의 수의 조정 후에도 여전히 CH의 예후 예측 인자로서의 효과는 유의미하였다(p = 0.012)(상기 표 12). 또한, 다변수 분석에서 전진형 단계별 선택을 통해 연령이 아닌 CH가 최종 예후 인자로 포함되었다는 사실은 CH가 연령보다 생존과 더 밀접한 관련이 있음을 시사하는 것이다(상기 표 17). PSM 후, 연령을 비롯한 모든 임상 변수는 CH에 관계없이 유사해졌고, CH가 있는 환자는 CH가 없는 환자에 비해 OS가 여전히 불량하였다(p = 0.029)(도 2c). 따라서, 본 발명자들은 진행된 병기의 NSCLC에 대해 보조 요법을 받은 환자에서 CH의 존재가 OS에 대한 독립적인 예후 인자라는 결론을 내릴 수 있었다.

사망 원인 측면에서, 본 발명자들은 CH의 존재에 따른 유의한 차이가 폐암 사망률(p = 0.568)이 아닌 비-폐암 사망률(p = 0.042)과 원인 불명의 사망률(p = 0.018)에서 나타났음을 발견하였다. 보조 요법을 마친 환자들에서의 수술 후 감시에 대한 양호한 순응도로부터 판단해 볼 때, 원인 불명의 사망은 비교적 느린 암 진행이라기 보다는 급성 사건, 예컨대 심폐 질환, 패혈증, 뇌졸중에 기인한 것으로 추측된다. 따라서, 이러한 발견이 CH가 있는 환자에서 CH와 관련된 다양한 불리한 결과가 CTx 또는 RTx에 의해 증폭되어 결국 생존에 영향을 미친다는 점을 뒷받침한다.

백금 기반 화합물을 포함하는 대부분의 세포독성 화학요법제, 예컨대 시스플라틴 등은 DNA 복제 기관을 표적으로 한다. 기존의 화학요법은 빠르게 분열하는 세포를 죽이도록 설계되었으며, 심각한 DNA 손상을 일으켜 세포를 사멸시킨다. 그러나 TP53, PPM1D 및 CHEK2와 같은 암 연관 유전자의 돌연변이는 DNA의 손상에 의해 정상적으로 활성화되어야 하는 세포 사멸 과정을 훼손시켜 세포독성 약물의 작용에도 불구하고 손상된 DNA를 갖는 조혈 줄기 세포(HSC)가 계속 생존할 수 있도록 한다. 따라서 암과 관련된 치료법은 신흥 CH 클론의 진화 궤적에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 최근 연구는 순차적 샘플링을 통해 암 치료에 대한 CH의 클론 역학을 평가했으며, 암 치료는 DNA 손상 반응(DDR) 유전자에서 돌연변이가 발생된 클론에 대해 우선적으로 선택되고, 이들 클론은 세포독성 또는 방사선 요법이 없는 경우 비-DDR 유전자 돌연변이에 비해 경쟁적 적응도(competitive fitness)가 더 낮았음을 보고하였다.

CH 돌연변이에 초점을 맞춘 최근 연구는 혈액 악성종양에서의 PD, CH-PD 또는 CH 비-PD와의 연관성에 기초하여 CH를 분류한 후 그의 영향을 보고하였다. Coombs 등의 보고서에 따르면, CH 자체가 독립적인 예후 효과를 나타내지는 않았지만, CH-PD의 경우는 연령, 성별, 및 흡연에 관계없이 더 불량한 예후와 관련이 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과와 일부 일치되게, 본 발명자들의 다변수 분석에서는 CH-PD(p = 0.003)에서의 예후 효과가 CH 자체(p = 0.012)보다 더 유의하였다(상기 표 13). 더욱이, CH 자체와 달리, CH-PD의 부정적 예후 효과는 돌연변이 수가 증가함에 따라 점진적으로 증가하였으며, 이는 CH-PD가 CH 자체보다 OS에 대한 더 민감한 예후 인자임을 나타낸다(상기 표 13). 특히, 본 연구에서 CH-PD의 비율(79.1%)은 기존의 다른 연구에서의 비율(52%-67%)보다 높았는데, 이는 아마도 폐암 환자들 중 현재/과거 흡연자의 비율이 더 높았기 때문일 것이다. 본 발명자들은 이것이 본 연구에서 CH-PD뿐만 아니라 CH 자체가 OS에 대한 독립적인 예후 인자로 나타난 주된 이유라고 생각한다(도 2c).

상기를 고려해 볼 때, 의사는 보조 요법이 처방된 CH 돌연변이가 있는 폐암 환자를 다음과 같이 관리해야 한다. 첫 번째로, 불리한 결과가 발생할 위험이 높은 환자와 그렇지 않은 환자를 구별해야 한다. 고위험 CH에 대한 명확한 정의는 없지만, 유의한 혈구 카운트 이상, 높은 VAF(> 10%)에서의 단일 CH 돌연변이, 다중 CH 돌연변이, TP53 및/또는 PPM1D의 변이체, DNMT3A 변이체, 및 IDH1/2의 핫스팟(hotspot) 돌연변이는 환자를 고위험 그룹으로 분류하는 것으로 간주된다. 두 번째로, CH로 인한 생존 손실의 위험에도 불구하고 보조 요법이 예후에 유리한 환자 그룹의 정교화를 진행해야 한다. 이를 고려하여 본 발명자들은 종합적 병기에 따라 보조 요법을 받은 환자들을 계층화한 후 하위 그룹 분석을 수행하였다. 전체 병기에 관계없이, CH 돌연변이가 있는 환자는 CH가 없는 환자에 비해 더 불량한 생존 결과를 가졌지만(도 6a 내지 도 6c), IIB기 환자에서 특히 유의한 차이가 관찰되었으며(5년 비율: 48.5% 대 73.8%, p < 0.001)(도 4a), 이는 PSM 후에도 여전히 유의했다(5년 비율: 48.5% 대 74.3%)(도 4b). 그러나 CH의 존재는 PSM 후 보조 요법을 받지 않은 병기 IIB기 환자에서 OS의 유의한 차이에 영향을 미치지 않았다(5년 비율: 41.6% 대 53.7%)(도 4d). 이러한 결과는 수술 전 CH 돌연변이가 보조 요법을 통해 CH와 관련된 불리한 결과를 증폭시켜 불량한 생존 결과를 초래할 수 있음을 나타낸다. 따라서 보조 요법의 생존 이익이 4% 내지 15% 범위임을 고려할 때, 본 발명자들은 보조 요법이 병기 II기 NSCLC 환자에서 다학제적 접근법으로 더 신중하게 결정되어야 한다고 생각한다. 반면에, 관련된 불리한 결과의 진행을 억제하는 치료는 CH 돌연변이가 있는 폐암 환자를 관리하기 위한 좋은 보충요법이 될 수 있다. 예를 들어, IL-1ß에 대한 인간화 단클론성 항체인 항염증제 카나키누맙은 죽상경화성 질환이 있는 고위험 환자에서의 심혈관 사고와 폐암 발병률을 감소시키는 것으로 보고되었다. 치료를 위해 전신 요법이 필수적인 병기 III기의 환자의 경우, 분자 표적 중재(molecularly targeted intervention)의 공격적인 사용이 고위험 CH 돌연변이가 있는 환자를 위한 대안이 될 수 있다. 마지막으로, 고위험 CH 돌연변이가 있는 환자의 경우 개별화된 추적조사 기간 및 심혈관 질환 또는 2차 악성종양과 같은 CH의 불리한 결과에 대한 철저한 모니터링이 필요하다.

결론적으로, 수술 전 존재하는 CH 돌연변이는 수술에 이어 보조 요법을 받는 NSCLC 환자에게 중요한 임상적 영향을 미치며, 이는 생존 결과를 감소시킨다.

Claims (32)

1. 폐암에 대해 치료받는 개체로부터 분리한 생물학적 시료의 유전자 분석을 통해 개체에 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는
   개체의 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 정보 제공 방법으로서, 상기 폐암은 병기 I기 또는 II기의 비소세포폐암인
   정보 제공 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계는 DNMT3A, ASXL1, TET2, PPM1D, ATM, BCL11B, CARD11, CBL, CD79B, CHEK2, CUX1, ETV6, FOXP1, JAK2, KMT2D, MAP3K1, MPL, NF1, NOTCH1, NOTCH2, PHIP, PRPF40B, RAD21, SETD2, SF3B1, TET1, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하는지를 확인하는 것을 포함하는
   정보 제공 방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 하나 이상의 유전자는 DNMT3A, ASXL1, TET2, PPM1D, SF3B1, ATM 및 TNFAIP3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는
   정보 제공 방법.
4. 제2항에 있어서,
   상기 하나 이상의 유전자는 DNMT3A를 포함하는
   정보 제공 방법.
5. 제2항에 있어서,
   상기 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하는지 여부 및 변이 대립 유전자 빈도(variant allele frequency, VAF)에 기초하여 클론성 조혈증의 존재 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는
   정보 제공 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하고 변이 대립 유전자 빈도(variant allele frequency, VAF)가 1.8% 이상인 경우에 클론성 조혈증이 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는
   정보 제공 방법.
7. 제1항에 있어서,
   개체에 클론성 조혈증이 존재하는 경우, 클론성 조혈증이 존재하지 않는 경우에 비해, 개체의 폐암 치료의 예후가 양호하지 않음을 나타내는 것인
   정보 제공 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 예후는 종양 제거 수술 이후 또는 종양 제거 수술에 이은 보조 요법 적용 이후의 전체 생존율 또는 무재발 생존율을 포함하는
   정보 제공 방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 개체는 종양 제거 수술, 화학요법, 화학방사선 요법, 항암 면역 요법 또는 이들의 조합으로 치료되는
   정보 제공 방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 폐암은 병기 II기의 비소세포폐암인
    정보 제공 방법.
11. 삭제
12. 제1항에 있어서,
    상기 개체는 종양 제거 수술을 받은 폐암 환자인
    정보 제공 방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 클론성 조혈증이 존재하는지 여부를 확인하는 단계는 종양 제거 수술을 받기 전, 종양 제거 수술을 받은 후, 종양 제거 수술 후 보조 요법 적용 전, 또는 종양 제거 수술에 이은 보조 요법 적용 후에 이루어지는
    정보 제공 방법.
14. 제2항에 있어서,
    상기 변이는 미스센스(missense) 변이, 프레임시프트(frameshift mutation) 변이, 넌센스(nonsense) 변이, 스플라이스(splice) 변이, 뉴클레오티드 추가, 결실 또는 치환, 또는 이들의 조합인
    정보 제공 방법.
15. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 분석은 차세대 유전체 시퀀싱 분석법(Next Generation Sequencing, NGS)을 포함하는
    정보 제공 방법.
16. 폐암에 대해 치료받는 개체로부터 분리한 생물학적 시료를 이용하여 클론성 조혈증의 존재를 확인하기 위한 제제를 유효성분으로 포함하는
    개체의 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 조성물로서, 상기 폐암은 병기 I기 또는 II기의 비소세포폐암이고, 상기 제제는 DNMT3A, ASXL1, TET2, PPM1D, ATM, BCL11B, CARD11, CBL, CD79B, CHEK2, CUX1, ETV6, FOXP1, JAK2, KMT2D, MAP3K1, MPL, NF1, NOTCH1, NOTCH2, PHIP, PRPF40B, RAD21, SETD2, SF3B1, TET1, TNFAIP3, TP53, U2AF1 및 ZRSR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 변이가 존재하는지를 검출하기 위한 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산을 포함하는 것인
    조성물.
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 제16항에 따른 조성물을 포함하는
    개체의 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 키트로서, 상기 폐암은 병기 I기 또는 II기의 비소세포폐암인
    키트.
25. 제16항에 따른 조성물을 포함하는 클론성 조혈증의 유전자 변이를 검출하기 위한 유전자 분석용 패널로서,
    상기 패널은 개체의 폐암 치료의 예후를 예측하기 위한 용도로 사용되고, 상기 폐암은 병기 I기 또는 II기의 비소세포폐암인
    패널.
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제