KR102566709B1 - 프로그램 된 세포사멸을 유도하는 cd47의 효능제 및 이의 프로그램 된 세포사멸 결함과 관련된 질병 치료에의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TSP-1 의 C-말단 결합 도메인의 환형 펩티드 모사체들과 관계 있는 것이다. 본 발명은 또한 이들 환형 펩티드들을 CD47의 촉진제의 용도로 사용하는 것 및 프로그램 된 세포 사멸 (PCD)을 촉발하는 능력과 관계된다. 본 발명은 추가로 암 및 면역적인 장애와 같은 (만성 염증 포함) PCD의 결함과 관련된 질병들의 치료의 용도로 적어도 하나의 본 발명에 따른 환형 펩티드를 포함하는 약학적 조성과 관계 있다.

Description

프로그램 된 세포사멸을 유도하는 CD47의 효능제 및 이의 프로그램 된 세포사멸 결함과 관련된 질병 치료에의 용도
본 발명은 TSC-1 의 C-말단 결합 도메인의 환형 변형 펩티드와 관련이 있다.
본 발명은 또한 이러한 환형 펩티드들의 CD47의 효능제로의 사용 및 이들이 프로그램 된 세포사멸 (PCD)을 촉발하는 능력과 관련이 있다.
본 발명은 또한 암 및 면역성 장애 (만성 염증 포함)와 같은 PCD 결함과 관련된 질병 치료에 사용하는 약학적 조성 및 본 발명에 따른 적어도 하나의 환형 펩티드를 포함하는 것과 관련이 있다.
1. PCD의 질병에서의 역할
프로그램 된 세포사멸 (PCD)은, 구조의 조각 및 형태형성 유도와 같은 조직 항상성의 발달 및 조절에 근본적인 역할을 하여, 세포수의 조절, 불필요하고 잠재적으로 위험한 세포를 제거한다.i
이 과정이 비정상적으로 조절 되면 (예, PCD가 과도하거나 또는 결함 되면) 발생 및 면역 장애, 신경-퇴화 및 암과 같은 여러 다양한 종류의 인간 질병과 연관된다.
분자 수준에서, 비정상적인 세포들의 PCD를 회피할 수 있는 기전을 해결하려고 한지 20년 동안 현저한 발전이 이루어졌다. 정상 세포에서 두 가지 경로로, 즉 내부적 및 외부적 경로로, PCD를 촉발시킬 수 있다. 두 경로는 모두 단백질-단백질 상호 작용 (protein-protein interactions, PPIs) 및 활성화의 케 스케이드 (cascade)와 관련 되어 아주 다양한 프로그램 된 세포 사멸 타입이 되게 한다 (도 1 및 2 참조). 항- 및 친-세포사멸 (anti- and pro-cell death) 단백질 상호 작용의 불균형은 세포 사멸의 항상성을 깨뜨리게 하고, 이는 적어도 암 및 면역성 장애와 같은 PCD의 과도 또는 부족을 지닌 여러 질병을 야기 시키는 결과를 가져오게 할 것이다.ii
2. 암 및 PCD 결함
암은 세포 분열과 세포 사멸 사이의 불균형이 특징인 질병이다.iii
암 세포에서, PCD 차단은 주로 세포유전학적 기형이 원인이 되어 항-세포사멸 단백질을 과도하게 발현 시키거나 또는 친-세포 사멸 단백질 조절-저하를 가져오게 한다. 지금까지 50,000 개 이상의 염색체 기형 (획득 또는 손실, gain or loss) 이 보고 되었다. iv 케스페이즈-의존적인 (caspase-dependent) 세포사멸적 죽음 경로가 초점이 되어 오긴 했으나, 비-세포사멸적인 PCD도 역시 종양 개시 및 진전에 대한 중요한 장벽을 형성하는 것으로 알려졌다.v p53, c-Myc, 및 Bcl-2와 같은 암-관련 주 단백질들이 자동적 및 치료-유도적인 세포사멸의 조정자라고 밝히게 된 앞선 기념비적 발견과 비슷하게, 종양 억제자 및 종양 단백질 성질을 가진 많은 단백질들이 다른 세포 사멸 프로그램의 주된 조절자라고 동정 되어 왔다. 비-세포사멸성 PCD를 조절하는 분자적인 기전에 대한 최근의 데이터는 강력한 치료적 결과를 가져올 것이다.vi.
발암은 또한 조직 상처에 대한 방어적 과정인 염증과도 관련이 있다 (Zenaida Lopez-Dee, Kenneth Pidcock, and Linda S. Gutierrez in "Thrombospondin- 1: Multiple Path to inflammation, Mediators of Inflammation, Volume 201 1, Article ID 296069, 10 pages doi:l 0.3 155/201 1/296069). 일단 이 자기-방어적인 전략이 시작되면, 주된 불필요한 조직 상해를 피하기 위하여 효과적인 해결 과정이 절대적으로 필요하다. 만약 염증을 유도하는 근원적인 과정이 잘 밝혀지지 않고 항상성이 회복되지 않으면, 염증 과정은 만성적이 되고 혈관생성, 발암, 및 예를 들어 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 크론씨병 (Chron disease), 건선 (psoriasis), 궤양성 대장염, 관절염, 및 천식과 같은 만성 염증과 연관된 질병 즉, 자가면역 질병을 초래하게 된다.vii
3. PCD 에서 면역성 장애, 자가면역 질환 및 결함
자가면역 질환의 공통적인 특징은 자가-항원 (self-antigen)에 대한 내성이 변화되어 자가항체 (autoantibody)가 생산되는 것이다. 면역 항상성 및 면역 내성의 유지는 세포사멸에 깊이 의존한다. 면역세포의 세포사멸 결함이 자가면역 질병을 유도한다는 아이디어가 여러 가지 증거로 지지되고 있다. Fas 신호전달 경로가 결함 된 Lpr 및 gld 생쥐는 림프비대 (lympho adnopathy) 및 비장비대 (splenomegaly)를 보이며, 많은 수의 자가항체들을 생산하며 사람의 전신 홍반성 루프스 (systemic lupus erythematosus, SLE)와 비슷한 질병으로 전개되게 되어, 이는 자가-활성 T 및 B 세포를 조절하는데 있어 외부적 세포사멸 경로가 필수적인 역할을 분명히 하고 있음을 보여 주고 있으며, 세포사멸의 변경은 자가면역 질병의 발병에 크게 기여할 수 있다는 사실을 보여주고 있다.viii 사람에서 Fas 신호 전달 경로의 결함은 비-악성 림프구증식 및 자가면역의 성질을 갖는 자가면역 림프구증식 증상 (autoimmune lymphoproliferative syndrome, ALPS)을 초래하며, 악성으로 되는 율을 증가시킨다. 이러한 환자들의 70%는 생식-라인 이종 접합 (germ-line heterozygous) FAS 변이를 지니고 있으며, 반면에 나머지는 체-세포 변이를 가지거나, 또는 FAS 리간드, 케스페이즈 10 (caspase 10) 및 케스페이즈 8 (caspase 8) 에 변이를 가진다. 대부분의 경우, 변이는 야생 단백질의 기능 또한 억제 하면서 우월하게 음성적 (dominant-negative)으로 기능한다.ix
외부적 경로의 결손이 면역 시스템에 주된 영향을 줄 것이긴 하나, 내부 경로도 또한 관여하며 이의 변경은 자가면역 질병 발생에 기여한다는 것이 점점 더 확실해지고 있다.x 한 예로 Bim Ko 생쥐는 림파상세포 (lymphoid) 및 골수성 세포 (myeloid)를 축적하고 자가면역질병을 나타내는 것으로 알려졌다.xi 자가면역질환을 가진 환자에서 BH3 만의 단백질에 대한 변이는 없는 것으로 서술되고 있지만, ALPS를 가진 환자에서는 Bim의 수준이 감소 된 것으로 보고 되었으며 SLE 에서는 bcl2 계의 친-생존 멤버 (pro-survival member)들의 과발현이 보고 되었다xii.
이러한 요소들의 관점에서, 좀 더 특이적으로 PCD의 결함과 연관되고 원하지 않는 세포의 증식과 연관된 질병에서 프로그램 된 세포 사멸을 촉발시킬 수 있는 매우 효율적인 성분들을 동정하는 것은 아주 중요하다.
4. 기술 동향 (state of art)
PCD 조절에 관여하는 단백질들의 결정구조에 대한 X-레이 분석 결과 덕분에, 단백질-단백질 상호작용 (protein-protein interaction, PPI)을 타겟으로 하여 PCD를 회복시키려는 여러 작은 분자들이 디자인 되었다. 몇 몇의 주요 예들에는 p53-MDM2 복합체 (complex)를 타겟으로 하는 넛트린 (Nutlines),xiii BCl-2 계 항-세포사멸 단백질을 타겟으로 하는 BH3 모방체인 나비토크락스 (Navitoclax)xiv, 또는 SMAC/XIAP 상호작용의 억제제들이 있다. p53-MDM2 복합체인 경우, MDM2와 상호 작용할 수 있는 p53 3D구조의 여러 펩티드 및 펩티드 모방체들이 PPI 방해자로서 실험관 내 (in vitro)에서 아주 성공적으로 디자인 되었다. 그러나 펩티드 및 모방체는 세포 투과성이 대체로 낮아서, 이러한 펩티드들이 생체 내에서 (in vivo) 비슷한 p53-MDM2 방해 활성을 보여주는지 여부를 아는 것은 매우 흥미 있을 것이다. xvi 중요한 것은, 흔히 좋지 않은 예후와 연관되는 세포유전학적인 변형인 TP53 삭제인 경우에는 작은 분자 및 펩티드로의 접근 방법은 둘 다 PCD를 촉발시키는 데는 비효율적이다. xvii 무엇보다도 먼저, 최근 몇 년 동안의 인간 단백질-단백질 상호작용 네트워크 (protein-protein interactom network) 해독으로 인해 한가지 경로와만 상호 작용하는 것으로 디자인한 치료제는 불가피하게 보상적인 기전을 활성화시켜 PCD 회피를 하게하고 질병 진행을 복원시키는 결과를 가져오게 하여 그 한계가 있음이 들어났다.xviii 그러하듯, 세포막 투과성 문제를 해결하기 위해 펩티드 접근 방법은 세포 밖의 타겟을 대상으로 하는 것이 더 타당하다. 더욱이, 보상적인 기전을 극복하기 위하여, 신호 전달 경로의 위의 단계에 위치 해 있고 비가역적으로 PCD를 촉발시킬 수 있는 타겟을 대상으로 하는 것이 더 효율적이다.
위에서 언급 했듯이, PCD의 결함과 특히 더 연관된 질병 및 원하지 않는 세포 증식에서 프로그램 된 세포사멸을 촉발시킬 수 있는 아주 효율적인 성분을 동정하는 것은 매우 중요하다. 이러한 목적은 본 발명자들이 놀랍게도 TSP-1 환형 효능제 펩티드가 (cyclic agonist peptide) 암세포에서 PCD 촉발을 아주 효율적으로 함을 보여준 본 발명으로 달성 되었다.
5. 트롬보스폰딘 (thrombospondins) 및 TSP-1
TSP-1은 450kD의 모세포단백질(matricellular)로서 활성화된 혈소판에서 처음 분리 되었으며 라우러 등에(Lawer and al) 의해 1978년 당단백질로 알려졌다.xix 1994년 및 1996년에 가오(Gao) 및 그 동료들은 TSP-1를 CD47 의 내생 리간드 (endogeneous ligand) 라고 서술 하였다.xx, xxi TSP-1 은 5개의 서로 다른 멤버로 구성된 다중-도메인을 가진 칼슘-결합 당단백질 계에 속한다.
TSP-1은 서로 다른 세포막 수용체 또는 세포외기질 (extracellular matrix) 에 결합하는 몇 개의 도메인을 가지고 있으며, 이는 세포-세포 및 세포-세포외기질 상호작용을 중개한다. 이는 N-말단 구형 (globular)의 도메인, 세 개의 이황화-연결 된 체인 (disulfide-linked chains) ((제1형 (프로페리딘-유사 반복서열, properidin-like repeat)), 제2형 (외피성장인자-유사 epidomal growth factor-like), 및 제3형(칼슘-결합)반복서열, calcium-binding repeat)) 및 C-말단 구형 도메인을 지니고 있다. N-말단 도메인은 저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질, 헤파린 및 몇몇의 인테그린 (integrins)들과 상호 작용한다. 제1형 반복서열 또는 트롬보스펀딘 구조 동종 반복서열 (thrombospondin structural homology repeats, TSRs)은, CD36, 콜라겐 제 5형(collagen type V), 휘브로넥틴(fibronectin) 및 헤파린 설파이트 프로테오글라이칸(heparin sulfate proteoglycan)에 결합한다. 제 3형 반복서열은 TSP-1 411 의 RGD 모티브를 통해 β3 인테그린에 결합하는 칼슘-결합 도메인들이다. 마지막으로, TSP-1의 C-말단 도메인은 CD47에 결합한다 (Gao 및 Frazier 참조).
TSP-1의 C-말단 세포-결합 도메인 (C-terminal cell-binding domain, CBD)으로 부터 합성된 중첩되는 펩티드들을 사용하여 가오와 프레이저는 (Gao & Frazier) VVM 모티브를 포함하는 두 개의 동종의 세포-결합 서열을 발견 하였으며, 이들은 이 부위가 TSP-1/CD47 결합에 필수적임을 발견하였다.xxii 이 발견은 펩티드 7N3 (1102- FIR WMYEGKK- 11 12) 및 4N1 (1016-RFYVVMW -1024)에 포함되는 VVM 모티브를 가진 TSP-1의 서열에 해당하는 짧은 펩티드들을 개발하는 결과를 가져왔다. 4N1K 펩티드 (K-RFYVVMWK-K)는 CD47의 결합에 영향을 주지 않고 4N1의 용해성을 개선 시키기 위해 나중에 개발 되었다.
6. TSP-1/CD47 상호작용
TSP-1의 CD47에의 결합은 세포 이동 및 부착, 세포 증식 또는 세포사멸을 포함하는 몇 가지 기본적인 세포 기능에 영향을 끼치며, 혈관신생과 염증의 조절 역할을 한다. xxiii
오늘날까지 TSP-1/CD47 복합체의 X-선 구조는 해결되지 않았다. 분자 모델링 연구는 플로쿠에이트 등 (Floquet et al)에 의해 실현 되었다 (Floquet et al 의 그림에 따라 그린 도표3 참조).xxiv 이 연구에서, 4N1 서열은 TSP-1의 소수성 주머니 (hydrophobic pocket) 안에 숨겨져 있어 CD47과의 어떤 상호작용도 막는 것으로 서술되어 있다. 그러나 이것이 CD47 및 인지질 이중 층에 가깝게 있을 때는, 소수성 틈이 열려 4N1 인식을 하게 한다.
CD47/TSP-1 결찰(ligation)의 생물학적인 결과는 매우 방대하며 세포 타입, 다른 분자들과의 연관성, 구조, 세포 표면에서의 분포, 관여되어 있는 방법 및 이들의 일어나는 특별한 경우 등에 따른다.
이들의 역할들은 개체의 항상성을 조절하는 열쇠이며 TSP-1/CD47의 상호 작용은 여러 범위의 기능을 한다. 이들 중에는, 잠재적 치료적 관심이 있는 것 중에 하나는 세포 사멸을 유도하는 능력이며 여기서는 암세포를 예로 들었다.
CD47-매개하는 프로그램 된 세포 사멸.
지난 몇 년 동안에 심도 있게 진행된 연구로 몇몇의 CD47 단일클론 항체 (mAbs), 및 TSP-1의 C-말단 도메인이 서로 다른 세포 타입에서 CD47-매개한
PCD를 유도 할 수 있다는 것이 알려 졌다. 중요하게는, SIRP-알파 용해성 Fc-융합 단백질 (SIRP-alpha soluble Fc fusion protein)은 CD47-의존 세포 사멸을 유도하지 않더라도,xxv 한 보고에서는 비드 (beads)의 표면에 결합된 SIRP-알파 및 감마는 (SIRP-a 및 γ )두 개의 종양 세포 주에서 CD47-매개한 PCD를 유도할 수 있다고 서술하고 있다.xxvi 주목 할 만한 것은, CD47이 또한 이의 세포외 IgV 도메인을 통해 Fas와 연관되어 있어 Fas-매개한 세포사멸을 증강시키게 함이 발견되었다.xxviii
CD47-매개한 PCD를 서술한 첫 번째 연구는 1999년에 이루어졌으며, 이때 CD47가 관여하여 원시 만성 림파구성 백혈병 세포 (primary chronic lymphocyte leukemia cells),xxviii 급성 T-세포 백혈병-유래 세포 주 ((acute T-cell leukemia-derived cell line (Jurkat)), 및 활성화된 T-세포 xxix에서 세포 사멸을 유도 할 수 있음이 발견 되었다. 그러나 이러한 과정은 매우 복잡한 것으로 밝혀졌다, 왜냐하면 두 그룹이 다 다른 유도제 (inductor)를 사용했지만 CD47 자극으로 PCD-유도를 발견했기 때문이다. 마테오 및 이의 공동연구자는 (Mateo & collaborators) PCD를 유도하기 위해 코딩된 B6H12mAb, TSP-1 및 4N1K 펩티드를 사용한 반면, 페터슨 및 이의 공동연구자들 (Pettersen & coworkers)은 단지 용해성 항-CD47 mAbs 만을 사용하였으며, 이들은 Ad22 및 1F7 (B6H12 또는 2D3가 아닌) mAb가 저켓 세포 (Jurkat cell) 에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 발견했다. 그래도, 두 그룹은 다 용해성 B6H12는 세포 사멸을 유도 할 수 없다는 것을 발견 했다. 이러한 데이터는 CD47이 관여하는 방법과 세포 사멸 유도 사이에 복잡한 조절의 중요성을 내포하고 있다. 이러한 결과들 이후 다른 세포 타입들에서 CD47-매개한 PCD의 유도를 검증하게 하였다. 이 검증들에는 다른 항47mAbs TSP1, TSP1 C-말단-유래 펩티드들 (4N1 및 4N1K) 및 재조합 단백질들 (T3C1)이 포함되며, 용해성 또는 코팅된 형태로 사용되었다.
암세포에서 CD47-매개하는 PCD
CD47-매개하는 세포 사멸 유도는 급성 림포모구 백혈병 세포(acute lymphoblastic leukemia cell) (CCRF-CEM 세포주),xxx 유방 종양 세포 (MCF-7 세포주), xxxi 여러 골수종 세포 (KPMM2 세포주), xxxii 급성 전골수구 백혈병 세포 (acute promyelocyte leukemia cell) (NB4 및 ATRA-저항성 NB4-LR1 세포주)xxxiii 및 조직구성 림프종 세포 (histiocytic lymphoma cell) (U937 세포주) xxxiv 와 같은 여러 종양세포에서 관찰 되었다. 더욱이, 급성 T-세포 백혈병 세포 (저켓) xxxv, xxxvi, xxxvii 및 원시 CLL 세포에서 수행된 연구들이 강조 되었다.xxxviii, xxxix, xl, xli
CD47-매개하는 세포 사멸에 대한 대부분의 정보는 암세포, 주로 저켓 및 CLL 세포, 에서부터 온다. 암 세포에서의 CD47-매개하는 세포 사멸의 주 특징은: 1) 빠른 진행; 2) 케스페이즈-무관; 3) 친세포사멸 단백질 ((사이토크롬 C (cytochrome C), AIF, Smac/Diablo, Orai/Htra2, 엔도뉴클레이즈 G (endonuclease G) (EndoG)) 방출 없이 미토콘드리아 막 탈분극화; 4) 활성 산소 종 (ROS) 생산; 5) 포스파디딜세린(phosphatidylserine) 노출; 6) 플라즈마 막 투과화; 7) DNA 분절 부재 및 크로마틴 응축 부재.
종양세포 제거를 위한 타겟으로서의 CD47
CD47은 여러 타입의 암에서 과발현 되는 것으로 보여졌다. 더욱이, 이는 면역 시스템 회피, 이주, 부착, 증식, 및 세포 사멸에서 여러 역할을 한다, 그래서 CD47 은 도 4에서 제시된 대로 다양한 형태로서 암 치료의 주요 타켓으로서 이용 될 수 있다:식균작용 (phagocytosis), 항종양 적응성 면역 반응 (antitumor adaptive immune response) 의 자극, 항체 의존성 세포의 세포독성 (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC), CD47-의존성 세포 기능 억제 및 CD47-매개 PCD 유도.
7. TSP-1 CBD 모방체 및 이들의 PCD유도에의 사용 및 PCD 결함과 연관 된 질병치료를 위한 사용
WO2013/182650에서, TSP-1의 C-말단을 모방한 용해성 데카펩티드 (decapeptide)인 4N1K 가 B-만성 림프구성 백혈병 원시 세포(B-chronic lymphocytic leckemia (CLL) primary cell) 에서 CD47과 결합 함으로서 케스페이즈-비의존성 PCD를 유도함이 밝혀졌다. 이는 더 나아가, PCD를 유도하기 위해 고정시켜야 될 필요가 있는 항-CD47mAb와는 반대로, 용해성 4N1K 펩티드는 케스페이즈-비의존성 PCD를 유도하기 위해 플라스틱에 코팅되어야 될 필요는 없다는 것을 보여 주었다. 음성 대조군 (negative control) 인 펩티드 4NGG (두 개 아미노산이 변이된 4N1)는 PCD를 유도할 수 없음이 밝혀져 4N1K 가 PCD 유도에 특이성이 있음을 알려 주었다. 더욱이, 4N1 및 이의 유도체 PKHB1에 의한 CD47에의 결합은 CLL 환자들에서 특이적으로 백혈병 B-세포를 제거하며, 건강한 B-림프구 또는 휴지상태의 정상 B-세포는 제거 하지 않은 것으로 발견 되었으며, 이로서 케스페이즈-의존 PCD 보다 세포 사멸을 유도하는 더 나은 방법으로 나타났다 (이 형태의 사멸은 17p13이 삭제되거나 또는 IIq22-q23:ATM/TP53 불활성화를 포함하고 있는 약물 저항성 환자의 CLL 세포에서도 효과적이다). 생체 내 쥐 연구들로, 백혈병 세포에서 PCD를 유도하는데 이 펩티드 전략이 특이적임이 전적으로 확인 되었다. 그러므로, 본 발명은 아미노산 서열, RFYVVMWK로 구성된 용해성 펩티드 또는 이의 기능적으로 보존된 변이체를 암 치료에 사용하는 것과 관련이 있다.
그러나, 및 WO2013/182650에서 암 치료에 사용 하기 위한 펩티드 서열을 특이적으로 동정 할 수 있었음에도, WO2013/182650 에서 서술된 펩티드들은 치료 목적으로 사용 될 수 가 없다, 왜냐하면 이들의 효능이 매우 느리며 PCD를 촉발 시키기 위해서는 높은 농도가 필요하기 때문이다 (WO2013/182650 에서 서술된 가장 강력한 펩티드에서 약 200μM). 그러므로, 특히 암 및 만성 염증을 포함하는 면역성질병과 같은 PCD 결함과 연관된 질병들을 위해, 아직도 PCD를 촉발시키는데 있어 높은 친화력과 높은 강도를 지닌 CD47 결합성질을 보이는 좀더 강력한 화합물을 동정하는 것이 필요하다.
본 발명은 PCD를 촉발시키는데 높은 친화력 (나노몰 범위, nanomlar range) 과 강도 (potency) (마이크로몰 범위, microM)를 지닌 TSP-1 C-말단 결합 도메인의 환형 모방체를 (cyclic minetics) 디자인해서 이러한 첫 번째 필요에 대한 답을 얻었다. 놀랍게도 본 발명자들은 이러한 환형 펩티드들이 WO2013/182650 에 서술된 것들보다 100내지 1000배 더 강력하다는 것을 관찰하였다.
(도 6 및 7 참조)
도 1 및 2. PCD가 복잡하고 매우 잘 조절되는 과정임을 보여 주는 다른 타입의 PCD를 유도하는 밀접하게 연결된 두 경로.
도 3. a. TSP-1은 다중도메인 단백질이며, 각 도메인은 생물학적 기능에 관여 한다: 헤파린 결합도메인 (HBD), 본 윌레브랜드 C 도메인
(von Willebrand C domain, vWCD) 도메인, 3개의 제 1형 프로페리딘 반복 (type 1 properidin repeats), 3 개의 제 2형 EGE -유사 반복 (EGF-like repeats), 7개의 제 3형 킬슘-결합 반복 및 C-말단 CBD. 이 도메인들 중 몇 개는 세포외 기질 (extracellular matrix) 성분 또는 세포막 수용체들 (화살표)과 상호 작용한다. TSP-1이 인테그린 (integrins, RGS) 및 CD47 (RFYVVMWK)에 결찰 (ligtion)하도록 하는데 관여하는 주요 아미노산 서열이 제시되었다. 3b. 이 그림은 CD47 과 4N1의 상호 작용을 보여준다. CD47 수용체의 세포외 부분의 동종 모델 (homology model)에 대비하여 TSP-1 C-말단 도메인 (MRMS=2)의 열린 구조는 단백질-단백질 도킹(docking) 실험에 사용 되었다. 두 개의 잠정적인 TSP-1:CD47 상호작용 부위[각각 (1) 및 (2)]가 분자모델링으로 제안 되었다 (Fluoquet et al, 2008 참조).x1ii
도 4. CD47이 암세포를 제거하기 위한 타겟으로 사용되었다. 단일클론 항체 (mAb)를 사용하여 CD47을 치료 타겟으로 하여 여러 기전을 통해 암 세포 제거를 유도 할 수 있다. 1) 대식세포 (macrophage)에 의한 종양세포의 식세포적 흡수 (phagosytic uptake): 차단적인 항-CD47 mAb, 차단적인 항-SIRP mAb, 또는 재조합 SIRP (2 가의 Fc-융합 단백질로 나타냄)로 CD47-SIRP 상호작용을 억제함으로서. 2) 항-CD47 항체들은 항-종양 적응성 면역반응을 자극할 수 있어 DC에 의한 종양세포의 식세포적 흡수를 유도하고 이어서 CD4 및 CD8 T-세포에 항원 제시를 한다. 3) NK 세포-매개한 ADCC 및 CDC 유도 및 종양 세포 제거: 항-CD47 항체는 항체 Fc-의존 기전을 통해 종양 세포를 제거 할 수 있다. 4) CD47의 기능 차단으로 또한 종양세포에서의 이의 몇 가지 활성을 차단함으로써 종양 감소를 촉진시키게 할 수도 있다. 5) 마지막으로, CD47 자극은 직접적 세포 사멸 유도를 유도 할 수 있다. xliii으로부터 수정.
도 5 및 6. MST 로 측정한 결합 곡선. 측정 방법은 분자들의 온도 구배에 따른 방향성 있는 움직임, “열이동 (thermophoresis)”이라는 효과, 에 근거 한다. 국부적인 온도 차이 ΔT는 국부적인 분자 농도 변화 (고갈 또는 농축)를 초래하며, 소렛계수 (Soret coefficient) ST: chot/ccold=exp(-STΔT)로 정량 한다. 저켓(Jurkat) 또는 Mec-1 세포막 제조물질은 다른 곳에서xliv 서술된 대로 나노템포 (Nanotemper) NT-647 라벨링 키트를 사용하여 라벨(label)시킨다. 라벨 된 제조물질은 PBS로 용출 시키고 4oC 에서 보관한다. 각 펩티드의 저장 용액 (stock solution)은 DMSO (5mM)에 제조하고 그 후 PBS로 희석시킨다. MST로 평가 되는 펩티드를 위해, NT.115-라벨된 막의 농도는 일정하게 유지시켰으며, 반면에 리간드 (펩티드)의 농도는 변화시켰다. 잠시 배양시킨 후 샘플은 MST 프리미엄 유리 모세관에 넣고 모노리스 NT.115-피코 (Monolith NT.115-pico)를 사용하여 MST 분석을 수행 하였다. 도 5: TSP-1의 C-말단 결합 도메인으로부터 유래된 직선 펩티드 PKT16[(D) Lys-(N-Me)Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Nle-Trp-Lys-(D)Lys] 에서 관찰된 MST 곡선. Kd=1600 nM. 도 6a 내지 6h: TSP-1의 C-말단 결합 도메인의 환형 펩티드 유사체 PKTD1, PKTD10, PKTD10-1, PKTD10-3, PKTD10-4, PKTD10-5, PKTD10-8 [표1의 구조 및 서열 참조]에서 관찰된 MST 곡선. Kd (각각 1, 9 및 49nM ). 예를 들어 PKT16 와 PKTD1 또는 PKTD10 사이의 Kd 비율은 이들 환형 유사체들이 (즉, PKTD1 또는, PKTD10) CD47과의 결합에 훨씬 더 효율적이라는 사실을 강조한다. 오늘날까지 개발된 선형 펩티드 유사체들은 이런 친화력에 도달한 적이 없다.
도 7a 내지 7f. 이 그림들은 5가지 세포주 (MCF-7, 인간 유방암세포; HCT -116, 인간 대장암세포; BxPC3, 인간 췌장 암세포; A549 및 인간 폐암세포)에서 세포독성 에세이 및 직접 세포 수를 세는 에세이로 평가한 종양세포의 생존력에 대하여 본 발명의 몇 가지 환형 펩티드들 (PKTD1, PKTD7, PKTD10, PKTD11, PKTD16, PKTD10 및 PKTD10-FF) 이 선형은 유사체 (linear analog)(PKT16)과 비교했을 때 그 효과의 결과를 보여준다. 주목 할 만하게도, 선형은 유사체, PKT16, 는 이들 세포주에서 100 마이크로몰(microM) 에서 효과적이지 않는 반면에, TSP-1의 C-말단 결합 도메인의 베타 줄기 (beta strand) 6 및 7, 또는 7 및 8이 관여 하는 헤파린을 모방하도록 디자인 된 환형 유사체들 (cyclic analog) (다른 것들 중에 예를 들어, PKTD1, PKTD7, PKTD9, PKTD10, PKTD10-X-NMe, PKTD11, PKTD11-NMe, PKTD18, PKD8 및 PKD10 과 같은 것)은 이들 세포주에서 세포 사멸을 유도하는데 효과적이다. 중요한 것은, 4N1 서열의 환형화(펩티드 PKC1)는 세포 사멸을 유도하는 효능이 없는 환형 유사체를 만들게 하므로 단지 베타줄기 7 (TSP-1의 4N1 결합 에피톱)의 환형화 (cyclization) 만으로는 펩티드 효율을 증강시키기는 충분하지 않다.
주요 요약
본 발명자들은 베타-쉬트 (beta-sheet) No7 또는 베타-쉬트 No7 및 8 또는 베타-쉬트 No6 및 7 ((베타-쉬트 번호 매김은 EMBO 저널에 (2004) 23, 1223-1233 따른다))에 관여되는 서열을 포함하는 TSP-1 C-말단 도메인으로부터 유래 된 새로운 환형 펩티드들 (cyclic peptides)을 지금 제조 하였다.
놀랍게도, 이들 환형 펩티드들은 암 세포주 들에서 높은 효율로 세포사멸을 유도 할 수 있다.
CD47을 타겟으로 하는 알려진 선형 펩티드들과는 반대로, 이들 환형펩티드들은 높은 결합 친화력을 가졌으며 (오늘날까지 서술된 선형 펩티드 중 가장 좋은 PKT16 의 마이크로몰 범위의 친화력에 비해 나노몰 범위의 친화력, 예시 3 파트 참조), 세포사멸을 유도하는데 낮은 농도 (가장 좋은 선형 유도체, PKT16의 100 마이크로몰에 비해, 1마이크로몰, 예시의 2 파트 참조) 에서도 효율적이다.
본 발명은 그러므로 TSP-1 C-말단 도메인으로부터 유래된 분리된 환형 펩티드 또는 생물학적으로 활성이 있는 이들의 유도체를 제공한다; 본 발명은 또한 언급된 환형 펩티드들을 암 및 면역성 장애와 같은 PCD 결함과 관련된 질병을 치료하는데 CD47의 효능제로 사용하는 것과 관련이 있다.
분리된 환형 펩티드들 (cyclic peptide)
본 발명은 일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드와 관계된다;
또는 이들의 약학적으로 허용 될 만 한 염 또는 생물학적으로 활성이 있는 유도체로, 상기:
-Bi 는 아무것도 없거나 또는 서열 YAGFVF (SEQ.ID No1)의 TSP-1의 베타-줄기 No6 로부터 유래된 아미노산 6개 및 10개를 포함하는 펩티드 서열이다.
-Zi 는 아무것도 없거나 또는 헤테로카이랄 (heterochiral) 서열 D-Pro-L-Pro (또한 p-P로도 표시되며, p는 D-proline, P는 L-proline) 또는 어떤 두 개의 아미노산 서열 또는 상기 헤테로카이랄 서열 또는 베타 턴 (beta turn)을 모방할 수 있는 아미노산 모방체들, 아미노산 또는 상기 서열의 아미노산 유사체의 예시에는 니페코틱 산 (nipecotic acid), 아이소니페코틱 산 (isonipecotic acid), 피페리딘 카복실산 (piperidine carboxylic acid), 시라프로린 (silaproline), 치오프로린(thioproline) 및 이들의 다른 치환 유도체들 ((불소(fluoro), 메틸(methyl), 브롬(bromo) 등)) 중 어느 것, 슈도 프로린(pseudo proline), 치환된 프로린 (substituted proline), N-메틸 아미노산, 사이클로프로필 아미노산 (cyclopropyl amino acid) ( Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004 and Karoyan et al. ChemBioChem (201 1), 12(7), 1039-1042 and Larregola et al. Journal of Peptide Science (201 1 ), 1 (9), 632-643) 참조) 또는 바이아릴 (biaryl) 아미노산 템플레이트 (templates); 단서조건으로 만약 Bj가 아무것도 없으면 Zi는 아무것도 없다;선호하는 구체적 예시에서는, Zi는 D-Pro-L-Pro;
-B 2 는 펩티드 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 -X10 (SEQ. ID. N°2) 를 대표하며 TSP-1의 베타-줄기 No7 (서열 RFYVVMWK, SEQ.ID N°3) 로 부터 유래되었다
상기:
X 1 는 아무것도 없거나 또는 세린 또는 글라이신, 알라닌, 또는 트레오닌과 같은 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다;
X 2 는 아무것도 없거나 또는 아르기닌 또는 호모아르기닌, 라이신, 오르니틴, 페닐알라닌, 나프틸알라닌, N-메틸 아르기닌, 또는 호모페닐알라닌과 같은 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 오르토 (ortho), 메타 (meta) 또는 파라(para) 위치에 다른 링 치환 된 유사체를 의미한다; 예를 들어 아르기닌에서, 유도체는 구아니도 (guanido) 기능 및/또는 하나 또는 그 이상의 아민 기능과 관련된 어느 다른 측쇄를 포함한다.
X 3 는 페닐알라닌 또는 나프틸알라닌, 호모페닐알라닌 또는 파라-플루오로-페닐알라닌 파라-아미노-페닐알라닌 파라-니트로-페닐알라닌과 같은 오르토 (ortho), 메타 (meta) 또는 파라(para) 위치에 링 치환 된 그 외 다른 유사체를 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다; 타이로신 또는 방향성 측쇄를 가진 어느 아미노산을 의미한다;
X 4 는 타이로신 또는 방향족 측쇄를 가진 어느 아미노산, 페닐알라닌 또는 나프틸알라닌, 호모페닐알라닌 또는 파라-플루오로-페닐알라닌 파라-아미노-페닐알라닌 파라-니트로-페닐알라닌과 같은 오르토 (ortho), 메타 (meta) 또는 파라(para) 위치에 링 치환 된 어느 다른 유사체를 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다.
X 5 는 발린 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신 (terleucine), 메티오닌을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다;
X 6 는 발린 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신 (terleucine), 메티오닌을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다;
X 7 는 메티오닌 또는 라이신 또는 발린, 메티오닌, 노르루이신(norleucine), 루이신 또는 이소루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 터르루이신을 의미한다;
X 8 은 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 나프틸-알라닌, 파라-플루오로-페닐알라닌, 파라-아미노-페닐알라닌, 파라-니트로-페닐알라닌, D-프로린-트립토판 또는 D-프로린-호모트립토판를 의미한다;
X 9 은 아무것도 없거나 또는 라이신 또는 아르기닌, 호모아르기닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 나프틸알라닌, N-메틸 아르기닌, 또는 호모페닐알라닌을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 오르토 (ortho), 메타 (meta) 또는 파라(para) 위치에 어느 다른 링 치환 된 유사체 또는 히스티딘;
X 10 은 아무것도 없거나 또는 글루타민 또는 알라닌 또는 아스파라긴을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다;
-Z2 는 아무것도 없거나 헤테로카이랄 (heterochiral) 서열 D-Pro-L-Pro (또한 p-P로도 표시되며) 또는 어느 두 개의 아미노산 서열 또는 상기 헤테로카이랄 서열을 모사 할 수 있거나 또는 베타 턴을 모사할 수 있는 아미노산 유사체, 상기 서열의 아미노산 또는 아미노산 유사체의 예는 니페코틱 산 (nipecotic acid), 이소니페코틱 산 (isonipecotic acid), 피페리딘 카복실릭 산, 실라프로린 (silaproline), 티오프로린 (thioproline) 및 이들의 (어느 다른 치환 유도체 (플루로오, 메틸, 브롬 등), 슈도프로린(pseudo proline), 치환된 프로린, N-메틸 아미노산, 사이클로프로필 아미노산 (Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004 and Karoyan at al ChemBioChem (201 1), 12(7), 1039-1042 and Larregola et al Journal of Peptide Science (201 1), 17(9), 632-643) 또는 바이아릴 아미노산 템플레이트(biaryl amino acid template); 단서조건은 만약 B3 가 아무것도 없으면 Z2 는 아무것도 없다; 선호적인 구체 예시에서는, Z2 는 D-Pro-L-Pro 이다.
-Bn 은 B2 또는 B3를 대표한다;
- B 3 는 아무것도 없거나 또는 TSP-1 의 베타-줄기 No8 (서열 GLSVVVNS, SEQ.ID.No4)로부터 유래된 아미노산 6개 내지 10개로 구성된 펩티드 서열,
단서 조건으로, 만약 B1가 TSP-1 의 베타-줄기 No6로부터 유래 된 아미노산 잔기 6 개 내지 10 개로 구성된 펩티드 서열이면 그때는 Bn 은 아무것도 없고, 만약 Bn 이 B2 또는 B3 (즉 펩티드 서열) 이면, 그때는 B1 은 아무것도 없고;
및 상기 언급된 분리된 환형 팹티드는 8개 내지 26 개 아미노산으로 구성 되며, 선호적으로는 14 개 내지 22 개 아미노산; 다른 구체적 예시에 따르면, 분리된 환형 팹티드는 18 개 내지 22 개아미노산으로 구성 된다.
명백히 언급 될 때를 제외하고는, 모든 아미노산은 별차이 없이 (D) 또는 (L) 구조 배열이다.
본 발명은 그러므로 구조 B1-Z1-B2, B1-B2, B2-Z2-B3, B2-B3, B2-B2 (각 B2 는 같거나 또는 다르다), B2-Z2-B2 (각 B2 는 같거나 또는 다르다) 및 B2 의 환형 펩티드들을 포함한다.
일 구체예에서, B1 는 다음의 서열을 포함한다:YAGFVFG (SEQ.ID No5).
다른 구체예에서, B1 는 다음의 서열을 포함한다: -X11-Y-A-G-F-V-F-G-X12-X13- (SEQ. ID. N°6) 상기:
X 11 은 아무것도 없거나 또는 아스파르틱 산 또는 글루타민산을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 12 는 아무것도 없거나 또는 타이로신 또는 방향족 측쇄를 가진 어느 아미노산 및
X 13 는 아무것도 없거나 세린 또는 글라이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산.
일 구체예에서, B3는 다음의 서열을 포함한다: -X19-X14-X15-X20-X21-X16- X22-X23-X17 -X18-(SEQ. ID. N°36); 선호적으로, B3 다음 서열을 포함한다 -X19-X14-X15-S-V-X16-V-V-X17-X18-, 상기:
X 14 는 아무것도 없거나 또는 글라이신 또는 알라닌 또는 세린을 포함하는 비슷한 성질은 가진 어느 아미노산 이다;
X 15 는 이소루이신 또는 루이신 또는 터루이신, 발린, 메티오닌을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산이다;
X 16 는 라이신 또는 알라닌 또는 아르기닌, 호모아르기닌, 라이신, 오르니틴, 페닐알라닌, 나프틸알라닌, N-메틸아르기닌, 또는 호모페닐알라닌과 같은 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 어느 다른 링 치환된 유사체 (오르토, 메타, 파라), 히스티딘, 또는 메티오닌 또는 발린, 루이신, 이소루이신, 터루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 17 은 아무것도 없거나 또는 아스파르긴 또는 알라닌 또는 글루타민 또는 라이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 아르기닌, 호모아르기닌, 라이신, 오르니틴, 페닐알라닌, 나프틸알라닌, N-메틸아르기닌, 또는 호모페닐알라닌과 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 어느 다른 링 치환된 된 유사체 (오르토, 메타, 파라), 히스티딘; Xi8 은 아무것도 없고, 세린 또는 글라이신 또는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 18 는 아무것도 없거나, 또는 세린 또는 글라이신, 또는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 19 는 아무것도 없거나, 또는 세린 또는 알라닌 또는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 20 는 세린 또는 알라닌 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 21 은 발린 또는 알라닌 또는 루이신, 이소루이신, 터루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 22 는 발린 또는 알라닌 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산; 및
X 23 는 발린 또는 알라닌 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산,
본 발명의 일반 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드는 그래도 적어도 TSP-1의 C-말단 도메인의 베타-쉬트 (beta-sheet) No7, 베타-쉬트 (beta-sheet) No7 및 8의 일부 또는 베타-쉬트 (beta-sheet) No6 및7 일부를 포함하지만 TSP-1의 C-말단 도메인의 서열 전부 일 수는 없다 (Kosfeld D, Frazier WA (1993) Identification of a new cell adhesion motif in two homologous peptides from the COOH-terminal cell binding domain of human thrombospondin. J Biol Chem 268: 8806-8814 에서 서술된 대로), 왜냐하면 이 도메인은 본 발명의 환형 펩티드와 똑 같은 생물학적 활성을 갖고 있지 않기 때문이다.
일 특별한 구체예에 따라, 본 발명은 일반 구조 (Ia)의 분리된 환형 펩티드들에 관한 것이다:
또는 약학적으로 허용 될 만 한 염 또는 생물학적으로 활성이 있는 이들의 유도체, 상기;
-Z1 는 아무것도 없거나 또는 헤테로카이랄 (heterochiral) 서열 D-Pro-L-Pro (또한 p-P로도 표시되며, p는 D-proline 및 P는 L-proline) 또는 어떤 두 개의 아미노산 서열 또는 상기 헤테로카이랄 서열 또는 베타 턴 (beta turn)을 모방할 수 있는 아미노산 모방체들, 아미노산 또는 상기 서열의 아미노산 유사체의 예시에는 니페코틱 산 (nipecotic acid), 아이소니페코틱 산 (isonipecotic acid), 피페리딘 카복실산 (piperidine carboxylic acid), 시라프로린 (silaproline), 치오프로린(thioproline) 및 이들의 다른 치환 유도체들 ((불소(fluoro), 메틸(methyl), 브롬(bromo) 등)) 중 어느 것, 슈도 프로린(pseudo proline), 치환된 프로린 (substituted proline), N-메틸 아미노산, 사이클로프로필 아미노산 (cyclopropyl amino acid) ( Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004 and Karoyan et al. ChemBioChem (201 1), 12(7), 1039-1042 and Larregola et al. Journal of Peptide Science (201 1 ), 1 (9), 632-643) 참조) 또는 바이아릴 (biaryl) 아미노산 템플레이트 (templates);선호하는 일 구체예에서는, Z1는 D-Pro-L-Pro;
-B 2 는 TSP-1의 베타-줄기 No7으로부터 유래된 (SEQ.ID. No2) (서열 RFYVVMWK, SEQ.ID. No3) 펩티드 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ. ID. N°2)을 대표하며 아미노산 6개 내지 10개로 구성된다, 상기:
X 1 는 아무것도 없거나 또는 세린 또는 글라이신, 알라닌, 또는 트레오닌과 같은 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다;
X 2 는 아무것도 없거나 또는 아르기닌 또는 호모아르기닌, 라이신, 오르니틴, 페닐알라닌, 나프틸알라닌, N-메틸아르기닌 또는 호모페닐알라닌과 같은 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 오르토 (ortho), 메타 (meta) 또는 파라(para) 위치에 다른 링 대체가 된 유사체를 의미한다; 예를 들어 아르기닌에서, 유도체는 구아니도 (guanido) 기능 및/또는 하나 또는 그 이상의 아민 기능과 관련된 어느 다른 측쇄를 포함한다.
X 3 는 페닐알라닌 또는 나프틸 알라닌, 호모페닐알라닌 또는 파라-플루오로-페닐알라닌 파라-아미노-페닐알라닌 파라-니트로-페닐알라닌과 같은 오르토 (ortho), 메타 (meta) 또는 파라(para) 위치에 링 치환된 그 외 다른 유사체를 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다; 타이로신 또는 방향성 측쇄를 가진 어느 아미노산을 의미한다;
X 4 는 타이로신 또는 방향족 측쇄를 가진 어느 아미노산, 페닐알라닌 또는 나프틸 알라닌, 호모페닐알라닌 또는 파라-플루오로-페닐알라닌 파라-아미노-페닐알라닌 파라-니트로-페닐알라닌과 같은 오르토 (ortho), 메타 (meta) 또는 파라(para) 위치에 링 대체가 된 어느 다른 유사체를 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다.
X 5 는 발린 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신, 메티오닌을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다;
X 6 는 발린 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신, 메티오닌을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다;
X 7 는 메티오닌 또는 라이신 또는 발린, 메티오닌, 노르루이신(norleucine), 루이신 또는 이소루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 터르루이신;
X 8 은 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌, 나프틸-알라닌, 파라-플루오로-페닐알라닌, 파라-아미노-페닐알라닌, 파라-니트로-페닐알라닌, D-프로린-트립토판 또는 D-프로린-호모트립토판를 의미한다;
X 9 은 아무것도 없거나 또는 라이신 또는 아르기닌, 호모아르기닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 나프틸알라닌, N-메틸 아르기닌, 또는 호모페닐알라닌을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 오르토 (ortho), 메타 (meta) 또는 파라(para) 위치에 어느 다른 링 치환된 유사체 또는 히스티딘;
X 10 은 아무것도 없거나 또는 글루타민 또는 알라닌 또는 아스파라긴을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산을 의미한다; X10 는 또한 알라닌을 의미할 수도 있다.
선호적으로, 만약 X2 가 아무 것도 없으면 그때는 X1 은; 아무것도 없고 및/또는 만약 X9 가 아무것도 없으면 그 때는 X10 는 아무것도 없다;
선호적으로, B2 적어도 6개 아미노산 X3-X4-X5-X6-X7-X8-를 포함하고 더 선호적으로는, B2 적어도 펩티드 조각 -F-Y-V-V-M-W-(SEQ.ID. No37)를 포함한다;
- Z 2 는 아무것도 없거나 헤테로카이랄 (heterochiral) 서열 D-Pro-L-Pro (또한 p~P 로도 표시되며, p 는 D-proline 이고 P는 L-proline) 또는 어느 두 개의 아미노산 서열 또는 상기 헤테로카이랄 서열을 모사 할 수 있거나 또는 베타 턴을 모사할 수 있는 아미노산 유사체, 상기 서열의 아미노산 또는 아미노산 유사체의 예는 니페코틱 산 (nipecotic acid), 이소니페코틱 산 (isonipecotic acid), 피페리딘 카복실릭 산, 실라프로린 (silaproline), 티오프로린 (thioproline) 및 이들의 (어느 다른 치환 유도체 (플루로오, 메틸, 브롬 등), 슈도프로린(pseudo proline), 치환된 프로린, N-메틸 아미노산, 사이클로프로필 아미노산 (Karoyan et al. Target in heterocyclic system, 2004 and Karoyan at al ChemBioChem (2011), 12(7), 1039-1042 and Larregola et al Journal of Peptide Science (2011), 17(9), 632-643) 또는 바이아릴 아미노산 템플레이트(biaryl amino acid template); 선호적인 구체적 실시예에서는, Z1는 D-Pro-L-Pro 이다.
-Bn 는 B2 또는 B3를 대표한다;
-B 3 는 TSP-1 의 베타-줄기 No8 (GLSVKVVNS, SEQ.ID.No4 의 서열) 로부터 유래한 아미노산 6개 내지 10개로 구성되는 펩티드 서열이다; B3 는 다음의 서열을 포함한다: X19-X14-X15-X20-X21-X16-X22-X23-X17-X18- (SEQ. ID. N°36); 선호적으로, B3는 다음의 서열을 포함한다: -X19-X14-X15-S-V-X16-V-V-X17-X18-
상기:
X 14 는 아무것도 없거나 또는 글라이신 또는 알라닌 또는 세린을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 15 는 이소루이신 또는 루이신 또는 알라닌 또는 터르루이신, 발린 메티오닌 을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 이다;
X 16 는 라이신 또는 알라닌 또는 아르기닌, 호모아르기닌, 호모라이신, 오르니틴, 페닐알라닌, 나프틸 알라닌, N-메틸 아르기닌 (RNMe) 또는 호모페닐알라닌과 같은 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 어느 다른 링 치환 된 유사체 (오르토, 메타, 파라), 히스티딘, 또는 메티오닌 또는 발린, 루이신, 이소루이신, 터르루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 17 은 아무것도 없거나, 아스파르긴 또는 알라닌 또는 글루타민 또는 라이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 아르기닌, 호모아르기닌, 호모라이신, 오르니틴, 페닐알라닌, 나프틸알라닌, N-메틸 아르기닌 (RNMe) 또는 호모페닐알라닌과 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산 또는 어느 다른 링 치환된 유사체 (오르토, 메타, 파라), 히스티딘;
X 18 은 아무것도 없고, 세린 또는 글라이신 또는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 19 은 아무것도 없고, 세린 또는 알라닌 또는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 20 는 세린 또는 알라닌 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 21 은 발린 또는 알라닌 또는 루이신, 이소루이신, 또는 터르루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
X 22 는 발린 또는 알라닌 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산; 및
X 23 는 발린 또는 알라닌 또는 루이신, 이소루이신, 터르루이신을 포함하는 비슷한 성질을 가진 어느 아미노산;
선호적으로, 만약 X14가 아무것도 없으면 X19 는 아무것도 없고 및/또는 만약 X17이 아무것도 없으면 그때는 X18 아무것도 없고;
선호적으로 B3는 적어도 6개 아미노산 -X15-S-V-X16-V-V-을 포함한다; .더 선호적으로는, B3는 적어도 펩티드적 절편 -L-S-V―K-V-V- (SEQ.ID.No38)를 포함한다;
상기 언급된 분리된 환형 펩티드는 짝수 아미노산 (즉 B2 및 Bn 는 같은 수의 아미노산을 가지며 둘 다 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 아미노산 조각으로 구성된다) 을 포함하며 상기 언급된 분리된 환형 펩티드는 8 개 내지 26 개 아미노산으로 포함되며, 선호적으로는 12 내지 22 개 아미노산; 더 선호적으로는, 이 발명의 분리된 환형 펩티드는12, 14, 16, 18, 20 또는 22 개 아미노산으로 구성된다.
본 발명은 그러므로 구조 B2-B3, Z1-B2-B3, B2-Z2-B3, B2-B2 (각 B2 는 동일하거나 또는 다르다) 및B2-Z2-B2 (각 B2 동일하거나 또는 다르다)의 환형 펩티드를 포함한다.
선호하는 일 구체예에서, 아래에 보여 주는 대로 B2의 X5가B3의 X16를 마주보게 되고 B2 의 X8는B3의 X15를 마주보게 되도록 B2 및 B3는 정해져 있다:
한 특별한 구체예에 따르면, Z1 및 Z2 모두 아무것도 없을 수 있다; 만약 Z1 가 두 개의 아미노산으로 구성 되면 그 때는 Z2는 아무것도 없고 만약 Z2가 두 개의 아미노산으로 구성되면 그때는 Z1은 아무것도 없다.
본 발명의 환형 펩티드들의 용액들은 유리 베이스 (free base)로 또는 약리적으로 허용 될 만한 염으로 제조 될 수 있다.
본 발명에 따른 이들의 펩티드들은 중성 또는 염 형태의 성분으로 제제화 될 수 있다. 약물학적으로 수용 될 만한 염에는 산 첨가 염 ((펩티드의 유리 아미노 free amino group) 그룹으로 구성))을 포함하며 및 이는 예를 들어, 염산 또는 인산 과 같은 무기 산 및 초산, 옥살산, 타르탈산 (tartaric), 만델릭산 (mandelic) 또는 이와 비슷한 그러한 유기산으로 형성된다. 유리 카복실 크룹 (free carboxylic group) 으로 형성된 염은, 예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 훼릭 하이드록사이드 (ferric hydroxide) 와 같은 무기 베이스 (inorganic base) 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로캐인 (procaine) 및 이와 유사한 그러한 유기 베이스(organic base)로부터 유래 될 수 있다.
본 발명에 따른 분리된 환형 펩티드의 예들은 표 1에 서술된 대로이다.
펩타이드 구조/아미노산 서열 (선상 표현) 구조 및 분자량
PKPH12(SEQ. ID. N°39)

PKPH12
(서열 번호 N°39 )

-F-Y-V-V-M-W-L-S-V-K-V-V-
PKPH12P(SEQ. ID. N°40)

PKPH12P
(서열 번호 N°40)

F-Y-V-V-M-- L-S-V-K-V-V-

being D-prolino-homo-tryptophane
(see Karoyan and Chassaing, Tetrahedron Letters, 1997, p84)

는 D-프로린-호모-트립토판 이다
(Karoyan 및 Chassaing, Tetrahedron Letters, 1997, p84 참조)
PKD8(SEQ. ID. N°41)

PKD8
(서열 번호 N°41)

화학구조:C86 H124F3N16O17S
분자량:1743,09



-F-Y-V-V-M-W-p-P-L-S-V-K-V-V-
PKD8FF(SEQ. ID. N°42)

PKD8FF
(서열 번호 N°42)
화학구조:C86 H124F3N16O16S
분자량:1727,09


-F-F-V-V-M-W-p-P-L-S-V-K-V-V-
PKD9(SEQ. ID. N°43)

PKD9
(서열 번호 N°43)

화학구조:C87 H126F3N16O17
분자량:1725,06


-F-Y-V-V-X-W-p-P-L-S-V-K-V-V-
X = NLe
PKD10(SEQ. ID. N°44)

PKD10
(서열 번호 N°44)
화학구조:C89 H127F6N17O18
분자량:1837,09

-F-Y-V-V-K-W-p-P-L-S-V-K-V-V-
PKD10FF(SEQ. ID. N°45)

PKD10FF
(서열 번호 N°45)
화학구조:C89 H127F6N17O17
분자량:1821,09


-F-F-V-V-K-W-p-P-L-S-V-K-V-V-
PKTDi4(SEQ. ID. N°46)

PKTDi4
(서열 번호 N°46)
화학구조:C86H124F3N16O17 S
정확한 질량:1741,90
분자량:1743,09

-p-P-F-Y-V-V-M-W-L-S-V-K-V-V-
PKD11(SEQ. ID. N°47)

PKD11
(서열 번호 N°47)
화학구조:C98H142F6N22O21S
정확한 질량:2109,03
분자량:2110,40

-R-F-Y-V-V-M-W-p-P-L-S-V-K-V-V-N-
PKD11RNMe(SEQ. ID. N°48)

PKD11RNMe
(서열 번호 N°48)
화학구조:C99H144F6N22O21S
정확한 질량:2123,05
분자량:2124,42


-R*-F-Y-V-V-M-W-p-P-L-S-V-K-V-V-N-
R* = NMethylarginine (N메틸아르기닌)
PKD12(SEQ. ID. N°49)

PKD1012
(서열 번호 N°49)
화학구조:C102H148F9N22O21S
정확한 질량:2220,08
분자량:2221,48

-R-F-Y-V-V-M-W-p-P-I-S-V-K-V-V-K-
PKD12RNMe(SEQ. ID. N°50)

PKD12RNMe
(서열 번호 N°50)
화학구조:C103H150F9N22O21S
정확한 질량:2234,09
분자량:2235,51


-R*-F-Y-V-V-M-W-p-P-I-S-V-K-V-V-K-
R* = NMethylarginine (N메틸아르기닌)
PKTDi3(SEQ. ID. N°51)

PKTDi3
(서열 번호 N°51)


화학구조:C96H139F6N19O20S
정확한 질량:2024,01
분자량:2025,33

-p-P-F-Y-V-V-M-W-K-G-L-S-V-K-V-V-
PKTDi5(SEQ. ID. N°52)

PKTDi5
(서열 번호 N°52)
화학구조:C96H142F6N22O21S
정확한 질량:2109,03
분자량:2110,40

-p-P-R-F-Y-V-V-M-W-L-S-V-K-V-V-N-
PKTD7(SEQ. ID. N°14)

PKTD7
(서열 번호 N°14)


-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-I-S-V-K-V-V-N-
 Chemical Formula: C102H160N25O21S3+
Molecular Weight: 2104,61

화학구조:
C102H160N25O21S3+
분자량: 2104,61
PKTD14(SEQ. ID. N°31)

PKTD14
(서열 번호 N°31)

화학구조:C105H154F6N24O23S2
정확한 질량:2297,10
분자량:2298,64

-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-M-V-V-N-
PKTD15(SEQ. ID. N°32)

PKTD15
(서열 번호 N°32)

화학구조:C108H157F9N25O24S
정확한 질량:2391,14
분자량:2392,64


-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-K-V-V-N-
PKTD17(SEQ. ID. N°34)

PKT17
(서열 번호 N°34)

화학구조:C130H172F12N28O24S2
정확한 질량:2801,23
분자량:2803,08

-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-R-F-Y-V-V-M-W-K-
PKTDi2(SEQ. ID. N°53)

PKTDi2
(서열 번호 N°53)

화학구조:C108H157F9N25O24S
정확한 질량:2391,14
분자량:2392,64

-p-P-R-F-Y-V-V-M-W-K-G-L-S-V-K-V-V-N-
PKTD1(SEQ. ID. N°9)

PKTD1
(서열 번호 N°9)
화학구조:C118H173F12N27O24S
정확한 질량:2676,25
분자량:2677,88


-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-I-S-V-K-V-V-K-S-
PKTD3(SEQ. ID. N°10)

PKTD3
(서열 번호 N°10)

화학구조:C116H169F12N27O25S
정확한 질량:2648,22
분자량:2649,83

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-I-S-A-K-V-V-K-S-
PKTD4(SEQ. ID. N°11)

PKTD4
(서열 번호 N°11)
-D-Y-A-G-F-V-F-G-Y-p-P-R-F-Y-V-V-M-W-K-Q-
PKTD5(SEQ. ID. N°12)
PKTD5
(서열 번호 N°12)
-Y-A-G-F-V-F-G-Y-p-P-R-F-Y-V-V-M-W-K-
PKTD6(SEQ. ID. N°13)

PKTD6
(서열 번호 N°13)

화학구조:C114H167F9N27O28S
정확한 질량:2565,21
분자량:2366,80

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-I-S-V-K-V-V-N-S-
PKTD8(SEQ. ID. N°15)

PKTD8
(서열 번호 N°15)
-D-Y-A-G-F-V-F-G-Y-Q-p-P-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-Q-
PKTD9(SEQ. ID. N°16)

PKTD9
(서열 번호 N°16)

화학구조:C126H162F6N26O27S
분자량:2618,89

-Y-A-G-F-V-F-G-Y-Q-p-P-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-
PKTD10(SEQ. ID. N°17)

PKTD10
(서열 번호 N°17)

화학구조:C114H167F9N27O28S
분자량:2566,80

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-K-V-V-N-S-
PKTD10-1(SEQ. ID. N°18)

PKTD10-1
(서열 번호 N°18)


-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-A-L-S-V-K-V-V-N-S-
 Chemical Formula: C111H179N27O24S4+
Molecular Weight: 2307,88

화학구조:
C111H179N27O24S4+
분자량:
2307,88
PKTD10-2(SEQ. ID. N°19)

PKTD10-2
(서열 번호 N°19)

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-A-S-V-K-V-V-N-S-
 Chemical Formula: C107H171N27O24S4+
Molecular Weight: 2251,77

화학구조:
C107H171N27O24S4+
분자량:
2251,77
PKTD10-3(SEQ. ID. N°20)

PKTD10-3
(서열 번호 N°20)

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-A-V-K-V-V-N-S-
 Chemical Formula: C110H177N27O23S4+
Molecular Weight: 2277,85

화학구조:
C110H177N27O23S4+
분자량:
2277,85
PKTD10-4(SEQ. ID. N°21)

PKTD10-4
(서열 번호 N°21)

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-A-K-V-V-N-S-
 Chemical Formula: C108H173N27O24S4+
Molecular Weight: 2265,79

화학구조:
C108H173N27O24S4+
분자량:
2265,79
PKTD10-5(SEQ. ID. N°22)

PKTD10-5
(서열 번호 N°22)

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-A-V-V-N-S-
 Chemical Formula: C107H169N26O24S3+
Molecular Weight: 2235,75

화학구조:
C107H169N26O24S3+
분자량:
2235,75
PKTD10-6(SEQ. ID. N°23)

PKTD10-6
(서열 번호 N°23)

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-K-A-V-N-S-
 Chemical Formula: C108H173N27O24S4+
Molecular Weight: 2265,79

화학구조:
C108H173N27O24S4+
분자량:
2265,79
PKTD10-7(SEQ. ID. N°24)

PKTD10-7
(서열 번호 N°24)

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-K-V-A-N-S-
 Chemical Formula: C108H173N27O24S4+
Molecular Weight: 2265,79

화학구조:
C108H173N27O24S4+
분자량:
2265,79
PKTD10-8(SEQ. ID. N°25)

PKTD10-8
(서열 번호 N°25)

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-K-V-V-A-S-
 Chemical Formula: C107H169N26O24S3+
Molecular Weight: 2235,75

화학구조:
C107H169N26O24S3+
분자량:
2235,75
PKTD10-9(SEQ. ID. N°26)

PKT10-9
(서열 번호 N°26)

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-K-V-V-N-A-
 Chemical Formula: C110H177N27O23S4+
Molecular Weight: 2277,85

화학구조:
C110H177N27O23S4+
분자량:
2277,85
PKTD10-RNMe(SEQ. ID. N°54)

PKTD10- RNMe
(서열 번호 N°54)

화학구조:C115H169F9N27O28S
분자량: 2580,82

-S-R*-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-K-V-V-N-S-
R* = RNMe
PKTD10-X-RNMe(SEQ. ID. N°55)

PKTD10- X-RNMe
(서열 번호 N°55)

화학구조:C116H171F9N27O28
분자량: 2562,79

-S-R*-F-Y-V-V-X-W-K-p-P-G-L-S-V-K-V-V-N-S-
R* = RNMe 및 X　=　NLe
PKTD10-3-X-RNMe(SEQ. ID. N°56)

PKTD10-3-X-RNMe
(서열 번호 N°56)

화학구조:C116H171F9N27O27
분자량: 2546,79

-S-R*-F-Y-V-V-X-W-K-p-P-G-L-A-V-K-V-V-N-S-
R* = RNMe 및 X　=N　Le
PKTD12(SEQ. ID. N°29)
PKTD12
(서열 번호 N°29)

-R-F-Y-V-V-M-W-K-Q-p-P-S-G-L-S-V-K-V-V-N-
 Chemical Formula: C110H177N27O24S4+
Molecular Weight: 2293,85


화학구조:
C110H177N27O24S4+
분자량:
2293,85
PKTD16(SEQ. ID. N°33)

PKTD16
(서열 번호 N°33)
-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-
PKTD18(SEQ. ID. N°35)

PKTD16
(서열 번호 N°35)

화학구조:C113H165F9N27O27S
분자량: 2536,77

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-p-P-G-L-S-V-K-V-V-N-G-
PKTDi1(SEQ. ID. N°57)

PKTDi1
(서열 번호 N°57)

화학구조:C109H158F9N26O27S
정확한 질량:2466,14
분자량:2467,66

-p-P-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-G-L-S-V-K-V-V-N-S-
PKTD11(SEQ. ID. N°28)

PKTD11
(서열 번호 N°28)

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-Q-p-P-S-G-L-S-V-K-V-V-N-S-
 Chemical Formula: C115H180N29O30S3+
Molecular Weight: 2480,94


화학구조:
C115H180N29O30S3+
분자량:
2480,94
PKTD11Q(SEQ. ID. N°58)

PKTD11Q
(서열 번호 N°58)

화학구조:C120H177F9N29O31S
분자량: 2724,95

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-A-p-P-S-G-L-S-V-K-V-V-N-S-
PKTD11S(SEQ. ID. N°59)

PKTD11S
(서열 번호 N°59)

화학구조:C122H179F9N29O32S
분자량: 2766,99

-S-R-F-Y-V-V-M-W-K-Q-p-P-A-G-L-S-V-K-V-V-N-S-
PKTD11-RNMe(SEQ. ID. N°60)

PKTD11- RNMe
(서열 번호 N°60)

화학구조:C123H181F9N29O33S
분자량: 2797,02

-S-R*-F-Y-V-V-M-W-K-Q-p-P-S-G-L-S-V-K-V-V-N-S-
R* = RNMe
PKTD11-X-RNMe(SEQ. ID. N°61)

PKTD11-X-RNMe
(서열 번호 N°61)

화학구조:C124H183F9N29O33
분자량: 2778,98

-S-R*-F-Y-V-V-X-W-K-Q-p-P-S-G-L-S-V-K-V-V-N-S-
R* = RNMe 및 X　=　NLe
본 발명의 환형 펩티드 합성
본 발명의 환형 펩티드는 실험 파트에서 서술된 대로 제조되었다.
간단히, 본 발명의 환형 펩티드는 고체/액체 상 (phase) 혼합된 공정을 사용하여 합성되어 선상의 펩티드로 만들어지고 이는 이어서 환형으로 되게 하였다. 환형화는 S-S 부리지 (S-S bridges), 티오에테르 브리지 (thioether bridges), C-C 결합 (C-C bonds), C-N, 에스터 결합 (ester bonds), 탄소-헤테로아톰 결합 (carbon-heteroatom bonds), 스케폴드 (scaffold)를 사용한 O-O, N-N, 환형화를 포함한다.
본 발명의 환형 펩티드의 생물학적으로 활성이 있는 유도체
여기서 사용된 대로, "생물학적으로 활성이 있는 유도체" 라는 용어는 언급된 이 펩티드의 기능적 변이체를 포함한다. 더 특별히, 본 발명의 관점에서, 유도체란 "일반적인 구조 (I)의 환형 펩티드의 생물학적으로 활성이 있는 유도체" 는 모 펩티드 (parent peptide)의 생물학적 활성 및 특이성을 유지하고 있는 변이체이다 라는 것을 표시한다. 그러므로, 본 발명의 관점에서, 언급 된 "생물학적으로 활성이 있는 유도체" 는 CD47의 효능제이고 PCD를 촉발시킬 수 있고 암 및 면역적 장애와 같은 PCD결함과 관련 된 질병을 치료 할 수 있다.
선호적으로는, 일반적인 구조 (I)의 한 환형 펩티드의 한 생물학적으로 활성이 있는 유도체는 PCD를 촉발 할 수 있는 능력 및 항 증식 (antiproliforative)효과는 적어도 약 70%, 선호적으로는 80 내지90%, 더 선호적으로 90 내지 99% 및 좀 더 선호적으로는 100%의 항 증식 효과, 전통적인 증식 기술로 실험관 내 (in vitro) 에세이 했을 때 일반적인 구조 (I)의 언급된 한 환형 펩티드는, 특히 세포 증식을 억제 하는 효과를 가져야 한다.
또한, 생물학적으로 활성이 있는 유도체는 선호적으로 전통적인 세포적 실험으로 실험관 내 (in vitro) 에세이 했을 때 일반적인 구조 (I)의 환형 펩티드와 똑같은 특이성을 가져야 한다.
언급된 생물학적으로 활성이 있는 유도체는 펩티드의 대립형질 변이체 (allelic variant), 또는 펩티드의 펩티드모사체 (peptidomimetic) 일 수 있다.
"펩티드의 대립형질 변이체" 는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 억제된 것을 제외하고는 일반적인 구조 (I)의 환형 펩티드와 같은 아미노산 서열을 가졌으며 이 최종 펩티드는 일반적인 구조 (I)의 모 환형 펩티드 (parent cyclic peptide) 의 생물학적 활성 및 특이성을 유지한다. 선호적으로, 그러한 대립 형질 변이체는 일반적인 구조 (I)의 모 환형 펩티드와 비교 했을 때, 적어도 50%, 선호적으로 70%, 선호적으로 80%, 더 선호적으로 90%, 및 좀 더 선호적으로 90%, 및 더욱 좀 더 선호적으로 95%의 동일성을 가진다.
여기서 사용된 대로, 두 아미노산 사이의 "동일성 퍼센트" 는 비교 할 두 서열을 가장 잘 나란히 맞춘 (최적의 맞춤) 후 얻은 이들 사이에 동일한 아미노산 잔기의 퍼센트를 의미한다, 이 퍼센트는 순수이 통계적이며 두 서열 사이의 차이는 무작위로 및 전체 길이에서 나타난다. 두 아미노산 서열 사이의 서열 비교는 예를 들어 웹싸이트 http://www.ncbi,nlm.nih.govgorf/bl2.html 에서 얻기 가능한 BLAST 프로그램으로 수행될 수 있으며, 사용된 파라미터 (parameter)는 디폴트(default)로 주어진 것이다 ((특히 계수 " 열린 갭 페널티 (open gap penalty)":5 및 확장 갭 페널티 (extension gap penalty):2, 선택된 마트릭스 (matrix)는 예를 들어 프로그램에서 제안된 대로 "BLOSUM 62 matrix"이고, 비교 할 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 프로그램으로 직접 계산되었다)).
보수적인 치환의 예들에는 이소루이신, 발린, 루이신, 또는 메티오닌과 같은 하나의 비-극성 (소수성) 잔기를 다른 것으로 치환하는 것을 포함하고, 아르기닌과 라이신 사이, 글루타민과 아스파르긴 사이, 글라이신과 세린 사이와 같이 하나의 극성 (친수성) 잔기를 다른 것으로 치환, 라이신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기를 다른 것으로 치환, 또는 아스파르틴산 또는 글루타민산을 다른 것으로 치환하는 것을 포함한다.
일반적인 구조 (I)의 한 환형 펩티드의 생물학적으로 활성이 있는 유도체는 펩티드모사성 변이체 (peptidomimetic variant)도 될 수 있다, 이는 적어도 선호적으로는 이의 생물학적 활성인 하나 또는 그 이상의 관심 있는 성질을 포함하는 모펩티드의 어떤 성질을 모사하는 유기성 분자이다.
선호적인 펩티드모사체(peptidomimetics)는 본 발명에 따른 환형 펩티드의 구조적 수정으로 얻을 수 있다, 선호적으로는 비자연적인 아미노산, L 아미노산 대신 D 아미노산, 구조적 제한, 등전자교체 (isosteric replacement) 또는 다른 수정을 사용한다.
다른 선호적인 수정에는, 제한 없이, 하나 또는 그 이상의 아마이드가 비-아마이드 결합으로 치환되는 것들, 및/또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 측쇄가 다른 화학적 잔기로 치환, 또는 하나 또는 그 이상의 측쇄가 한 보호그룹으로 보호되고, 및/또는 경직성 및/또는 결합 친화력을 증가시키기 위해 아미노 체인 (amino chain)에 이중 결합 및/또는 환형화 및/또는 입체 특이성 도입이 포함된다.
또 다른 선호적인 수정에는 일반적 구조 (I)의 모체 환형 펩티드와 비교하여 효소적 분해에 저항성을 증강시키고, 생체효율 개선, 및 더 일반적으로는 약물동력학적 성질 개선을 의도하는 것이 포함된다.
그러한 펩티드모사체의 예들에는 유리 아미노 (free amino) 그룹들이 아민 하이드클로라이드, p-톨루엔 설포닐 그룹, 카보벤족시 그룹, t-부틸옥시카보닐 그룹, 클로로아세틸 그룹, 또는 포밀 (formyl) 그룹을 형성하도록 유도된 분자들을 포함한다. 유리 카복실 그룹들은 염, 메틸 및 에틸 에스터들 또는 다른 타입의 에스터 또는 하이드라자이들를 형성하도록 유도 될 수 있다. 유리 하이드록실 그룹은 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성하도록 유도 될 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소는 N-임-벤질히스티딘 (N-im-benzylhistidine)을 형성하도록 유도 될 수 있다. 화학적 유도체들은 또한 20개의 표준 아미노산들의 하나 또는 그 이상의 자연적으로 존재하는 아미노산을 함유하는 펩티드를 포함한다. 예를 들어: 4-하이드록시프로린은 프로린 대신 치환 될 수 있고; 5-하이드록시라이신은 라이신 대신 치환 될 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘 대신 치환 될 수 있고; 호모세린은 세린 대신 치환 될 수 있고; 오르니틴은 라이신 대신 치환 될 수 있다. "보수적인 치환 (conservative substitution)" 이란 또한 펩티드나 단백질의 2차 구조를 조정하고 안정화시킬 목적의 비-자연적인 아미노산 사용을 포함한다. 이러한 비-자연적인 아미노산들은 아래에 서술된 대로 프로리노아미노산(prolinoamino acids), 베타-아미노산(beta-amino acids), N-메틸아미노산 (N-methylamino acids), 사이클로프로필아미노산 (cyclopropylamino acids), 알파, 알파-치환 아미노산 (alpha, alpha-substituted amino acids)과 같은 화학적으로 수정된 아미노산이다. 이러한 비-자연적인 아미노산들은 불소화, 염소화, 브롬화- 또는 요드화 된 수정된 아미노산들을 또한 포함한다.
수정된 다른 예들에는 예를 들어 지방 또는 탄수화물과의 접합도 포함된다.
이러한 변이들은 모두 이 분야에서는 잘 알려졌다. 그러므로, 일반적인 구조 (I)의 환형 펩티드의 펩티드 서열이 주어지면, 이 분야 전문가는 그러한 펩티드와 비슷하거나 또는 더 좋은 생물학적 성질을 가진 펩티드모사체를 디자인하고 생산할 수 있다.
일반적인 구조 (I)의 환형 펩티드의 선호적인 펩티드모사체 변이체들은 적어도 언급된 일반적인 구조 (I)의 환형 펩티드의 생물학적 성질과 특이성을 유지하고 있다.
일반적인 구조 (I) 의 환형 펩티드의 생물학적으로 활성 있는 유도체는 이 분야에서 인정된 기술을 사용하여 편리하게 합성될 수 있다.
본 발명의 환형 펩티드 및/또는 생물학적으로 활성 있는 유도체의 치료적 사용.
본 발명은 일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 있는 유도체의 의료적 사용을 제공한다.
본 발명은 또한 일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 있는 유도체의 프로그램 된 세포 사멸(programed cell death, PCD)을 촉발하는 효능제로서, CD47를 활성화시키는 제제로서 및 CD47의 효능제로서의 사용을 제공한다. 좀더 구체적으로는, 하나의 일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 있는 유도체는 TSP1 및 CD47의 상호작용과 관계된 질병, 특히 PCD의 결함과 관련된 질병의 치료를 치료하는데 유용하다; 세포 사멸과 관련된 질병의 예는 화보로로 등 (Favoloro et al) (Role of apoptosis in disease, AGING, May 2012, vol.4, N°5, pp.330-349)에 의해 서술되어 있다, 잘병에서의 세포 사멸의 중요성이 또한 RA 나이트와 G 멜리노( RA Knight and G Melino (Cell death in disease: from 2010 onwards, Cell Death and Disease (2011) 2, e202; doi:10.1038/cddis.2011.89) 에 의해 서술되고 있다; 발암 과정은 또한 조직 손상에 대항하는 방어적인 과정인 염증과도 연관되며, 염증 과정 조정 및 이의 해결에서의 TSP-1의 역할의 예시가 지나이다 로페츠-디 등에서 (Zenaida Lopez-Dee et al.) ("Thrombospondin-1 : Multiple Path to inflammation, Mediators of Inflammation, Volume 201 1 , Article ID 296069, 10 pages doi:10.1155/201 1/296069) 보여준다. 일단 이 자체-방어적인 전략이 시작되면, 주된 불필요한 조직 손상을 피하기 위해 이 과정을 효과적으로 해결하는 것은 대단히 중요하다. 만약 염증을 유도 하는 하부의 과정이 해결되지 않으면, 항상성은 회복되지 않으며, 염증 과정은 만성으로 되어가고, 발암과정 및 예를 들어 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 크론씨병(Chron disease), 건선 (psoriasis), 궤양성 장염 (ulcerative colitis), 관절염 및 천식과 같은 만성 염증 (로페즈-디 참조)을 포함하는 면역적인 장애 (화보로로 등 참조)와 연관된 질병을 초래한다.
한 특별한 구체적인 예시에서, 일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 있는 유도체는 다음의 그룹에서 선택 된 한 암의 치료에 유용할 수 있다; 부신피질암 (adrenal cortical cancer), 항문암, 담관암, 다발성 골수종 (multiple myeloma), 방광암, 골암 (bone cancer), 뇌 및 중추신경계 암, 유방암, 카스텔만 병 (Castelman disese), 자궁경부암, 직장암, 자궁내막암, 식도암, 담낭암, 위장관내 암양종 (gastrointestinal carcinoid tumor), 호치킨스 질병 (Hodgkin's disease), 비-호치킨스 림포마 (non-Hodgkin's lymphoma), 카포시 사르코마 (Kaposi's sarcoma), 신장암, 후두 및 하인두 암(laryngeal and hypopharyngeal cancer), 백혈병, 간암, 폐암, 중피종(mesothelioma), 형질세포종 (plasmacytoma), 비강 및 부비동 암(nasal and paranasal sinus cancer), 비인두암 (nasopharyngeal cancer), 신경아세포종(neuroblastoma), 구강 및 구강인두 암 (oral cavity and oropharyngeal cancer), 난소암, 췌장암, 음경암 (penil cancer), 뇌하수체 암, 전립선암, 망막아종 (retinoblastoma), 횡문근육종 (rhabdomyosarcoma), 침샘 암(salivary gland cancer), 피부암, 흑생종( melanoma), 위암, 고환암 (testicular cancer), 흉선암 (thymus cancer), 갑상선암, 질암( vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer), 및 자궁암 (uterine cancer).
다른 특별한 구체예에서, 일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 있는 유도체는 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 크론씨병(Chron disease), 건선 (psoriasis), 궤양성 장염 (ulcerative colitis), 관절염 및 천식으로 구성된 그룹으로부터 선택된 면역적인 질병을 포함하는 만성적인 염증과 관계된 질병을 치료하는데 사용할 수 있다.
다른 특별한 구체예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에게 적어도 일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 있는 유도체로 구성된 약학적 조성물을 유효한 양으로 투여하여 암 및 만성적인 염증과 관계된 질병을 치료적으로 치료하는 한 방법과 관계된다.
본 발명의 환형 펩티드 및/또는 이의 생물학적으로 활성 있는 유도체로 구성된 약학적 조성물.
본 발명은 또한 일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성 있는 유도체 및 약학적으로 허용 될 만한 케리어 (carrier) 로 구성된 약학적 조성물과 관련이 있다.
본 발명의 특별한 구체적인 예시에서, 본 발명의 약학적 조성물에 병합될 일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드는 다음으로 구성된 그룹, PKTD1 (SEQ. ID. N°9), PKTD3 (SEQ. ID. N°10), PKTD4 (SEQ. ID. N° l l), PKTD5 (SEQ. ID. N°12), PKTD6 (SEQ. ID. N°13), PKTD7 (SEQ. ID. N°14), PKTD8 (SEQ. ID. N°15), PKTD9 (SEQ. ID. N°16), PKTD10 (SEQ. ID. N°17), PKTDl0-1 (SEQ. ID. N°18), PKTD10-2 (SEQ. ID. N°19), PKTD10-3 (SEQ. ID. N°20), PKTD10-4 (SEQ. ID. N°21), PKTD10-5 (SEQ. ID. N°22), PKTD 10-6 (SEQ. ID. N°23), PKTD10-7 (SEQ. ID. N°24), PKTD10-8 (SEQ. ID. N°25), PKTD10-9 (SEQ. ID. N°26), PKTD l l (SEQ. ID. N°28), PKTD12 (SEQ. ID. N°29), PKTD14 (SEQ. ID. N°31), PKTD15 (SEQ. ID. N°32), PKTD16 (SEQ. ID. N°33), PKTD17 (SEQ. ID. N°34) and PKTD18 (SEQ. ID. N°35), PKPHI2 (SEQ. ID. N°39), PKPH12P (SEQ. ID. N°40), PKD8 (SEQ. ID. N°41), PKD8FF (SEQ. ID. N°42), PKD9 (SEQ. ID. N°43), PKD10 (SEQ. ID. N°44), PKD10FF (SEQ. ID. N°45), PKTDi4 (SEQ. ID. N°46), PKD1 1 (SEQ. ID. N°47), PKDl lRNMe (SEQ. ID. N°48), PKD12 (SEQ. ID. N°49), PKD12RNMe (SEQ. ID. N°50), PKTDi3 (SEQ. ID. N°51), PKTDi5 (SEQ. ID. N°52), PKTDi2 (SEQ. ID. N°53), PKTD 10-RNMe (SEQ. ID. N°54), PKTD 10-X-RNMe (SEQ. ID. N°55), PKTD10-3-X-RNMe (SEQ. ID. N°56), PKTDil (SEQ. ID. N°57), PKTD11Q (SEQ. ID. N°58), PKTD11S (SEQ. ID. N°59), PKTD11-RNMe (SEQ. ID. N°60), PKTD11-X-RNMe (SEQ. ID. N°61) 에서, 또는 이들의 약학적으로 허용될 만한 염 또는 이들의 생물학적으로 활성이 있는 유도체에서 선택된다.
본 발명의 목적을 위해, 적절한 약학적으로 허용될 만한 케리어가 포함된다, 그러나 이것에만 국한하지는 않다: 물, 염 용액 (salt solution, 예 NaCl), 알코올, 아라빅껌 (gum arbic), 식물성 오일, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글라이콜, 젤라틴, 락토즈, 아밀로즈 또는 전분과 같은 탄수화물, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 탈크(talc), 시리식 산 (silicic acid), 점액성 파라핀(viscous paraffin), 향수성 오일(perfume oil), 지방산 에스터, 하이드록시메틸셀루로즈(hydroxymethylcellulose), 및 폴리비닐 피로리돈, 이것에만 국한 되지는 않지만 인지질 (phospholipids), 스핑고지질 (sphingolipids), 글리세롤-지방산 에스터와 같은 지질??
본 발명의 약학적 조성물은 멸균될 수 있으며 만약 원하면, 활성 화합물과는 유해하지 않게 작용하는 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압 조절을 위한 소금, 버퍼, 착색제, 착향제 및/또는 방향성 물질 및 이와 비슷한 것들 등의 보조제들과 혼합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성은, 만약 원하면, 또한 최소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완층제를 함유 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 멸균 동결건조 된 제제를 포함하는 테블렛 (tablet), 환 (pill), 캡슐, 지효성 제제 (sustained-release formulation), 또는 가루 일수 있다. 경구용 제제에는 약학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐피로리돈 (polyvinylpyrolidone), 소듐 사카린(sodium saccharine), 셀루로즈, 마그네슘 카보네이트, 등과 같은 표준 케리어를 포함할 수 있다. 몇몇의 정확한 제제들이, 예를 들어, 레밍톤 (Remington), The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Mark 출판사에 서술되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개인에게 정맥주사 투여에 적합하도록 한 조성으로 관례적인 과정에 맞추어 제제화 될 수 있다. 전형적으로, 정맥주사 투여를 위한 조성들은 멸균된 등장 수용성 버퍼 또는주사 되기 전에 재 구성되는 멸균 동결건조 제제이며, 그런 주사는 정맥주사, 근육주사, 피하주사, 척수관 주사가 될 수 있으며, 그러한 약학적 조성물은 비강 및/또는 폐 전달을 통해 흡입 될 수도 있다. 일 선호적인 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성은 주사로, 및 예를 들어 종양내 주사 전용으로 투여 되도록 하는 액체 조성물 이다. 언급된 종양내 주사는 예를 들어 입체 신경수술을 사용하여 얻을 수 있다. 이 투여는 종양 제거를 하려고 의도하는 외과적 수술 전 또는 후에 수행될 수 있다. 첫 번째 경우, 조성물은 종양의 성장을 억제할 수 있으며 종양의 전파 및 개체에서 갑작스런 증상이 나타나는 것을 피하게 할 수 있다; 두 번째의 경우, 조성물은 외과적 수술하는 동안에 제거되지 않은 모든 종양 세포를 파괴하는데 사용될 수 있다.
일반적인 구조 (I)의 분리된 환형 펩티드의 효과적인 용량은 예를 들어 선택된 투여 방법, 몸무게, 나이, 성별, 및 치료하고자 하는 개인의 민감도 등과 같은 수많은 파라메터 (parameter)의 기능에 따라 변화된다. 따라서, 최적 용량은 의학 전문가에 의해 상응하는 파라메터의 기능에서 개별적으로 정해져야 한다. 여기서 보여준 동물연구로부터 사람에서 기대되는 활성 용량을 예측하기 위해, 로체티 등 (Rocchetti et al) (2007)에 의해 서술된 대로 fc2 및CT 값을 또한 사용할 수 있다.
다음의 예시들은 일반적인 구조 (I)의 환형 펩티드들의 높은 특이성 및 치료 효율성을 서술한다. 이들은 그러나, 특히 본 발명의 아미노산의 성질에 관한 것 및 사용한 실험적 조건들이 제한적인 것은 아니다.
실시예
1. 본 발명의 환형 펩티드들의 합성 및 성질 규명
일반적인 방법들 ;
모든 상업적인 화학약품들 및 용매들은 시약 등급이며 특별이 규정되지 않으면 더 이상의 정제 없이 그대로 사용되었다. 수용성 배지에서의 반응을 제외하고는 습기 제외를 위하여 모든 반응은 표준 기술을 사용하여 수행되었다. 모든 반응은 오븐에서 건조된 유리용기에서 아르곤 (argon) 또는 질소 하에서 무수용매와 표준 시린지 (syringe) 기술을 사용하여 진행되었다. 보호된 아미노산 유도체들 HATU, HBTU, HFIP, 슈도프로린 디펩티드 (pseudoproline dipeptides) 및 2-CTC 수지(resin) 는 아이리스 바이오텍 (( Iris Biotech (Marktredwitz, Germany))에서 구입 했다. DIPEA, NMP, 피페린딘(piperidine)용액, DMF, IPA, TFA, PyBOP는 시그마 알드리치 (Sigma-Aldrich)에서 구입 했다. 미리 장착 된 2-TCT 수지 (Preloaded 2-CTC resin), Dmb-아미노산, PyOxim, 및 Oxyma Pure는 머크 노바바이오캠 (Merck Novabiochem)에서 구입 했다.
고체상 (solid phase) 펩티드 합성은 바닥에 폴리에틸렌 구멍이 있는 디스크가 끼워 있고 적절한 피스톤으로 닫힌 폴리프로피렌 토비크 주사기 (Torviq syringes) 에서 수행 되었다. 용매와 용해성 시약들은 앞 뒤 움직임을 통해 제거 되었다. Fmoc 그룹의 제거는 피페리딘/DMF(20%,v/v) (1 x 1 min, 1 x 10 min) 으로 수행되었다. 디프로택숀 (deprotection), 커플링(coupling) 및 최종 디프로택숀 단계 사이의 세척은 NMP (3 x 1 min), IPA (3 x 1 min) 및 NMP (3 x 1 min) 로 수행 되었다. 펩티드 합성 전환 및 세척은 20 °C에서 수행되었다. 지지적인 커플링 반응은 고전적인 카이져 테스트 (Kasier test)로 모니터 되었다 (시그마-알드리치로부터 직접적으로 제조된 용액 키트). 화합물의 분자량은 ChemBioDraw® Ultra 12를 사용하여 계산 되었다. 달리 표시되지 않는 한 모든 최종 생산물은 >95% 순수하다 (분석용 역상 LCMS로 측정). 분석 데이터는 표 II 에 있다.
LC-MS 분석에 5가지 방법들이 수행 되었다.
방법 A: 분석용 HPLC는 X-Select CSH CI 8 XP 컬럼 (2.5μm 30 x 4.6 mm id) 에서 0.1 % 포르믹산 수용액 (0.1% formic acid in water) (용매 A) 및 0.1 % 포르믹산 아세토니트릴 용액 (0.1% formic acid in acetonitrile) (용매 B)으로, 다음의 용출 구배 (elution gradient) 0-3.20 분 (minutes)를 사용하여 용출 시켰다: 5%에서100% B, 3.20-4 분 100% B, 흐름속도 1.8 ml/분, 40°C. 질량 스팩트라 (mass spectra, MS)는 전기분무 양성이온화(electrospray positive ionization) [MH+ 분자 이온을 주기 위해 ES+로] 또는 전기분무 음성 이온화 (electrospray negative ionization) [(M-H)- 분자 이온을 주기 위해 ES-] 모드를 사용하여 Waters ZQ 메스 스팩트로메터 (mass spectrometer) 에 기록 되었다. 콘 (cone)의 전압은 20V 였다.
방법 B: 분석용 HPLC는 X-Select CSH CI 8 XP 컬럼 (2.5μm 30 x 4.6 mm id) 에서 0.1 % 포르믹산 수용액 (0.1% formic acid in water) (용매 A) 및 0.1 % 포르믹산 아세토니트릴 용액 (0.1% formic acid in acetonitrile) (용매 B)으로, 다음의 용출 구배 (elution gradient) 0-10 분 (minutes)를 사용하여 용출 시켰다: 40%에서100% B, 10-11 분 100% B, 흐름속도 1.8 ml/분, 40°C. 질량 스팩트라는 (mass spectra, MS) 는 전기분무 양성 이온화 (electrospray positive ionization) [MH+ 분자 이온을 주기 위해 ES+로] 또는 전기분무 음성 이온화 (electrospray negative ionization) [(M-H)_ 분자 이온을 주기 위해 ES-] 모드를 사용하여 Waters ZQ 메스 스팩트로메터 (mass spectrometer) 에 기록 되었다. 콘 (cone)의 전압은 20V 였다.
방법 C: 분석용 HPLC는 X-Select CSH CI 8 XP 컬럼 (2.5μm 30 x 4.6 mm id) 에서 0.1 % 포르믹산 수용액 (0.1% formic acid in water) (용매 A) 및 0.1 % 포르믹산 아세토니트릴 용액 (0.1% formic acid in acetonitrile) (용매 B)으로, 다음의 용출 구배 (elution gradient) 0-3.20 분 (minutes)를 사용하여 용출 시켰다: 0%에서 50% B, 3.20-4 분 100% B, 흐름속도 1.8 ml/분, 40°C. 질량 스팩트라는 (mass spectra, MS) 는 전기분무 양성 이온화 (electrospray positive ionization) [MH+ 분자 이온을 주기 위해 ES+로] 또는 전기분무 음성 이온화 (electrospray negative ionization) [(M-H)_분자 이온을 주기 위해 ES-] 모드를 사용하여 Waters ZQ 메스 스팩트로메터 (mass spectrometer) 에 기록 되었다. 콘 (cone)의 전압은 20V 였다.
방법 D: 분석용 HPLC는 X-Select CSH CI 8 XP 컬럼 (2.5μm 30 x 4.6 mm id ) 에서 0.1 % 포르믹산 수용액 (0.1% formic acid in water) (용매 A) 및 0.1 % 포르믹산 아세토니트릴 용액 (0.1% formic acid in acetonitrile) (용매 B)으로, 다음의 용출 구배 (elution gradient) 0-6 분 (minutes)를 사용하여 용출 시켰다: 0%에서 50% B, 6-7 분 100% B, 흐름속도 1.8 ml/분, 40°C. 질량 스팩트라는 (mass spectra, MS) 는 전기분무 양성 이온화 (electrospray positive ionization) [MH+ 분자 이온을 주기 위해 ES+로] 또는 전기분무 음성 이온화 (electrospray negative ionization) [(M-H)_분자 이온을 주기 위해 ES-] 모드를 사용하여 Waters ZQ 메스 스팩트로메터 (mass spectrometer) 에 기록 되었다. 콘 (cone)의 전압은 20V 였다.
방법 E: 분석용 HPLC는 X-Select CSH CI 8 XP 컬럼 (2.5μm 30 x 4.6 mm id ) 에서 0.1 % 포르믹산 수용액 (0.1% formic acid in water) (용매 A) 및 0.1 % 포르믹산 아세토니트릴 용액 (0.1% formic acid in acetonitrile) (용매 B)으로, 다음의 용출 구배 (elution gradient) 0-3 분 (minutes)를 사용하여 용출 시켰다: 5%에서 100% B, 3-4 분 100% B, 흐름속도 1.8 ml/분, 40°C. 고해상도 질량 스팩트라는 (mass spectra, MS) 는 전기분무 양성 이온화(electrospray positive ionization) [MH+ 분자 이온을 주기 위해 ES+ve로] 또는 전기분무 음성 이온화 (electrospray negative ionization) [(M-H)_분자 이온을 주기 위해 ES_ve] 모드를 사용하여 Waters ZQ 메스 스팩트로메터 (mass spectrometer) 에 기록 되었다.
정제는 역상 HPLC로 브리즈 소프트웨어 (Breeze software) 에 연결되어 있는 Waters semi-preparative HPLC-시스템 또는 크로멜론 소프트웨어 (Chromeleon software) 연결되어 있는 Dionex semi-preparative HPLC-시스템에서 수행되었으며, AIT 로부터의 CI 8 semi-preparative 컬럼을 사용하였고, 용출 용액 A 로서 0.1% TFA를 함유하는 물 및 용출 용액 B 로서 0.1% TFA 함유하는 CH3CN를 사용하였으며, 흐름 속도는 5 mL/분이었다. UV 검출은 220nm 및 280nm에서 되었다. 정제 구배는 (purification gradient) 관심 있는 부분에 분당 약 1% 용액 B의 경사가 되도록 선택되었다.
환형 펩티드 합성
환형 펩티드들은 혼합된 고체/액체상 과정을 사용하여 합성되었다. 전형적인 지지적인 합성은 일찍이 서술된 대로 보고 되었다 (Peptidomimetic Antibiotics Target Outer-Membrane Biogenesis in Pseudomonas aeruginosa, Nityakalyani Srinivas et al. published 19 February 2010, Science 327, 1010 (2010) 참조)). 2-클로로트리티닐 클로라이드 수지 (2-Chlorotrityl chloride resin)는 먼저 무수 CH2CI2에 2 시간 동안 불렸다. Fmoc-Aa-OH (0.32 mmol) 는 CH2C12 (4 mL)에 있는 디이소프로필에틸아민 (diisopropyethylamine) (DIPEA, 4 eq.) 존재 하에서 2-CTC 수지(400 mg, loading = 1.6 mmol/g) 에 연결 (coupled)시켰다. 수지상에 반응하지 않은 부위들은 CH2Cl2/MeOH/DIPEA (7:2: 1)의 혼합물 및 이어서 MEOH로 세척하여 캡핑 (caping)하였다. N, N-디메틸포름 아마이드 (DMF) 에 있는 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc -그룹을 제거한 후, 체인 연장 (chain elongation)은 표준 Fmoc-보호된 아미노산(Bachem, Switzerland) 으로 수행 되었으며, 이때 Fmoc 디프로텍숀에 20% 피페린딘/DMF (piperidine/DMF), 활성화에 2-(1H-벤조트리아졸-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 핵사플루오로포스페이트 /1-하이드록시벤조트리아졸 (HBTU/HOBt) ((2-(l H-benzotriazole- 1 -yl)- 1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate/l -hydroxybenzotriazole (HBTU/HOBt))가 사용되었으며, DIPEA은 염으로 및 N-메틸-2-피롤리디논(N-methyl-2-pyrrolidinone) (NMP)은 용매로 사용되었다. 선상 펩티드 체인 (linear peptide chain) 의 조립이 완료 되었을 때, 수지를 줄어들게 하기 위해 마지막 세척 단계에서 추가로 MeOH 세척 (1x 1 min, 1 x 15 min) 이 수행되었다.
선상 펩티드들은 HFIP/CH2CI2 칵테일로 (1 : 4, v/v) 각 15 분 동안 두 번 처리하여 수지로부터 쪼개지게 하였다. 반응 혼합물은 여과되고 수지는 CH2C12 및 MeOH 로 차례로 씻겨졌다. 여과액은 모아지고 이어서 용매는 감압 하에서 증발시켰다. 마지막에, 원래 그대로의 선상 펩티드 (crude linear peptide)는 드라이-아이스로 차게 한 EtO2 를 사용하여 3 번 침전 시켰으며 원심분리 (3 x 5 min, 7800 rpm) 및 건조 시켜 (질소 흐름 하에서) 회수하였다. 후자의 시스템은 특히 완전히 보호된 조각을 쪼개어 용액에서 환형화 시키는데 적절하다, 왜냐하면 쪼개는 단계에서 카복실릭산의 사용을 제외 하기 때문이다.
환형화를 위해, 결과로 얻어진 선상의 펩티드 (1 eq)를 DMF (1 mg/mL 농도)에 용해시키고, PyBOP (2 eq.), 및 HOBt (2 eq.) 를 용액에 첨가하였다. pH는 DIPEA (1 % v/v)를 첨가하여 8로 조정하고 혼합물은 LC-MS 분석이 반응이 종결 되었음을 제시할 때까지 교반 시켰다 (2 내지 20시간). 용매는 감압 하에서 제거되었다. 과량의 연결제 (coupling agent)를 제거하기 위해, 원래의 펩티드(crude peptide) 는 CH2C12 또는 Me-THF (50 mL)에 다시 용해시키고 유기물 층은 포화 NaHCO3 (2 x 20 mL) 및 브라인 (brine) (2 x 20 mL)으로 추출하고, Na2SO4 로 건조시키고 그리고 진공 하에서 증발시켰다. 증발시킨 후, TFA H2O/TIS 최종 디프로텍숀 칵테일 (final deprotection cocktail) (95/2.5/2.5, 20 mL)을 고르게 첨가하였다. 결과적으로 얻어진 혼합물은 3 시간 동안 교반 시켰으며 그후 드라이-아이스로 차게 한 EtO2 (3 x 30 mL) 를 사용하여 3 번 침전 시켰으며 원심분리 (3 x 5 min, 7800 rpm) 및 건조 시켜 (질소 흐름 하에서) 회수하였다.
결과적으로 얻어진 원래의 환형 펩티드 (crude cyclic peptide)는 수용성 0.1% (v/v) TFA에 용해시켰다. 정제는 역상 HPLC Prep Cl8 컬럼에서 수행되었으며, 0.1% TFA 수용액(용매 A) 및 0.1% TFA 아세토니트릴 용액 (용매 B)으로 용출 시켰으며, 다음의 용출구배, 15%에서 35% B 30 분, 흐름속도는 20 °C에서 14 ml/min를 사용하였다. 정제로부터 얻은 펩티드 분획은 분석용 LC-MS (방법 C 또는 D) 로 분석 되었으며, 이들의 순도에 따라 모으고 바이오블럭 사이언티픽사 (Bioblock Scientific)의 알파2/4 동결 건조기(Alpha 2/4 freeze dryer) 에서 동결건조 시켜 예상되는 마크로사이클릭 펩티드 (macrocyclic peptide) (mg, μmol)의 백색가루로 얻었으며 전체적인 수율은 7%이다.
펩타이드 Mw (g.mol-1)
분자량		 m/z (ESI)
 tR (방법)
PKTD1 2289.8 764.2 [M+3H]3+
573.5 [M+4H]4+ 		2.33 (C)
PKTD3 2261.7 1131.8 [M+2H]2+
754.9 [M+3H]3+
566.4 [M+4H]4+ 		2.25 (C)
PKTD6 2275.7 1138.7 [M+2H]2+
749.4 [M+3H]3+ 		2.50 (C)
PKTD7 2101.6 701.5 [M+3H]3+ 2.94 (D)
PKTD9 2424.8 809.3 [M+3H]3+ 4.69 (D)
PKTD10 2275.8 1138.7 [M+2H]2+
759.4 [M+3H]3+ 		2.35
PKTD10-NMe 2289.8 1145.6 [M+2H]2+
764.0 [M+3H]3+ 		2.52
PKTD10-X-NMe 2271.7 1136.6 [M+2H]2+
758.0 [M+3H]3+ 		2.62
PKTD11 2491.0 1246.3 [M+2H]2+
831.1 [M+3H]3+ 		2.45
PKTD11-NMe 2505.0 1253.1 [M+2H]2+
838.5 [M+3H]3+ 		2.40
PKTD11-Q 2433.9 1217.7 [M+2H]2+
812.1 [M+3H]3+ 		2.59
PKTD11-S 2475.0 1238.4 [M+2H]2+
825.9 [M+3H]3+ 		2.46
PKTD12 2316.8 1159.3 [M+2H]2+
773.1 [M+3H]3+ 		2.40
PKTD16 2589.2 1295.3 [M+2H]2+
863.9 [M+3H]3+
648.1 [M+4H]4+ 		2.38
PKTD18 2245.7 1123.6 [M+2H]2+ 749.3 [M+3H]3+ 2.51
PKTDi1 2275.8 1138.7 [M+2H]2+
759.4 [M+3H]3+ 		2.37
PKTDi2 2101.6 1151.6 [M+2H]2+
701.3 [M+3H]3+ 		2.28
PKTDi3 1831.3 1831.9 [M+2H]2+
916.4 [M+3H]3+ 		2.85
PKTDi4 1646.1 1646.7 [M+2H]2+
823.8 [M+3H]3+ 		3.26
PKD8 1646.1 1646.7 [M+2H]2+ 823.8 [M+3H]3+ 3.57
PKD9 1628.0 1628.7 [M+2H]2+
814.7 [M+3H]3+ 		3.64
PKD10 1643.1 1643.8 [M+2H]2+
822.3 [M+3H]3+ 		3.12
L-PKD10 1661.1 1661.7 [M+2H]2+
831.1 [M+3H]3+ 		2.65
PKD10-FF 1627.1 1627.8 [M+2H]2+
814.3 [M+3H]3+ 		3.33
유리 암모늄으로 주어진 펩티드 분자량
1. 본 발명에 따른 환형펩티드의 실험관 내 활성
본 발명의 몇몇 환형 펩티드들의 종양세포 증식에서의 효과는 세포독성 에세이 및 직접 세포 수 세기로 5개 세포 주 (MCF-7, 인간 유방암 세포; HCT-116, 인간 대장암 세포; BxPC3, 인간 췌장 암 세포 및 A549, 인간 폐암 세포) 에서 평가되었다.
2, 1. 재료
일반적인 구조 (I)의 환형 펩티드들, PKTD1, PKTD7, PKTD9, PKTD10, PKTD10-3, PKTDl0-RNMe, PKTD10-X-RNMe, PKTD10-4, PKTD11, PKTDl lRNMe, PKTD12, PKTD 16, PKTD18, PKD8, PKDI0 및 PKD10-FF는 실험 부분에서 서술된 대로 합성되었다.
그러한 환형 펩티드들은 다음의 농도로 DMSO 에 용해시켰다: 0, 5, 10, 25, 50 및 100 μM.
PKC1은 TSP-1의 베타-줄기 N°7 (beta-strand N°7) (SEQ. ID. N°8) 조각으로 만 구성된 환형 펩티드이다: 이의 구조는 다음과 같다:
선형 PKT16 펩티드 [(D)Lys-(N-Me)Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Nle-Trp- Lys-(D)Lys]는 양성 대조군으로 사용되었다.
화합물 CTGG (4NGG라고도 불린다, 선형 펩티드 서열 KRFYGGMWK)는 음성 대조군으로 사용되었다.
이런 에세이를 위해 사용된 배양 배지는: MCF-7 및 Wi38는 EMEM = 10% SVF 에서; HCT-1 16 및 BxPC3는 RPMI 1640 = 10% SVF 에서; 및 A549 는 F-12K = 10% SVF 에서이다.
2.2 방법들
2.2.1. 세포 생존력 및 증식 에세이
500 세포를 96웰 플레이트 (96well plate)에 심고, 37°C에서 24 시간 동안 배양하고, 여러가지 다른 농도의 환형 펩티드로 및 대조군으로 2 시간 동안 처리했다.
2.2.2. 플로사이토메터 (flow cytometer)에 의한 세포 사멸 (죽음) 에세이
가능한 세포사멸 과정을 검출 위해, 세포들은 35mm 접시에 심고 각 테스트할 환형 펩티드를 포함하는 배지에서 2 시간 동안 다음의 과정 A 또는 B로 배양하였다.
과정 A : 에토피사이드 (Etopaiside) (40 nM)를 세포사멸을 유도하는 양성 대조군으로 사용 하였다. 세포는 트립신화시키고, 차거운 PBS로 세척시킨 후 에넥신 버퍼 (Annexin buffer) 에서 에넥신 V-FrrC (Annexin V-FrrC) (BD Pharmingen) 로 15 분간 상온에서 염색 시켰다. 마지막으로, 50 μg /mL 프로피디움 아이오다이드 (propidium iodide) (시그마,Sigma)로 대조 염색 시키고 FACSCalibur 플루오 사이토메터로 분석하였다. 각 세포 타입에 대한 실험은 3번 반복되었다. 각 실험에서 샘플 당 20,000 건이 분석되었다.
과정 B: 펩티드는 HCT-116 세포에서 2시간동안 배양되었다. 수퍼킬러 트레일 (Superkiller Trail)(ALX-201-1 15-C0l0) 는 양성 친-세포사멸(pro apoptosis) 대조군으로 사용되었다. 세포는 바이오레전드사 (BIOLEGEND) 로부터온 7-AAD 와 함께 FITC Annexin V 세포사멸 검출 키트 (BLE640922) 를 사용하여 사이토 플루오메트리로 분석하였다
2.3. 결과들
이들 에세이의 결과들은 아래의 도7a 내지 7f 및 표 III 내지 IV 에 나타나 있다.
평균 (%)
Late apoptosis
후기 사멸 		Early Apoptosis
전기사멸 		Viable
생존율
Superkiller
(수퍼킬러)
 100 ng/mL 1.79 52.55 45.59
PKTD10-3 0 2.04 2.83 94.96
　 12.5 4.35 8.17 86.83
　 25 7.06 13.16 79.30
　 50 6.85 13.13 79.67
PKTD10-4 0 2.04 2.83 94.96
　 12.5 4.39 9.27 85.90
　 25 5.54 11.91 82.41
　 50 7.53 15.68 76.52
PKTD10-RNMe 0 2.04 2.83 94.96
　 12.5 2.17 5.97 91.72
　 25 2.77 6.04 91.10
　 50 8.10 14.95 76.73
PKTD12 0 2.04 2.83 94.96
　 12.5 3.11 5.78 90.87
　 25 3.26 7.15 89.42
　 50 6.80 19.16 73.78
Mean (%)
평균 (%)
Late apoptosis
후기 사멸 		Early Apoptosis
전기사멸 		Viable
생존율
Superkiller
(수퍼킬러)		 100 ng/mL 2.06 41.42 56.39
DMSO 0 7.41 5.72 86.35
PKD10 12.5 15.76 18.30 65.66
　 25 24.58 43.67 31.50
　 50 39.02 32.70 27.55
PKTD1 0 7.41 5.72 86.35
　 12.5 11.60 11.42 76.44
　 25 18.77 17.24 63.51
　 50 36.99 24.68 37.56
PKTD9 0 7.41 5.72 86.35
　 12.5 7.83 9.78 82.19
　 25 8.58 11.40 79.38
　 50 14.94 13.32 70.52
모든 테스트된 환형 펩티드 PKTD1, PKTD7, PKTD9, PKTD10, PKTD10- 3, PKTDlO-RNMe, PKTD 10-X-RNMe, PKTD10-4, PKTD11, PKTD1l RNMe, PKTD12, PKTD 16, PKTD18, PKD10 및PKD10-FF는 모든 세포주에서 용량-의존적 생존력 감소를 보여 준다 (10 내지 50 μΜ 의 펩티드 농도로 2 시간에 20내지 80% PCD 유도). 이 활성은 여기서 테스트한 농도에서 효과적이지 않은 양성 대조군(PKT16)보다 의미 있게 더 높다 (100 μΜ에서 PCD를 유도하기 위한 효능이 관찰되지 않았다).
환형 펩티드 PKC1은 사용된 어느 농도에서도 PCD 촉발에 효능을 보이지 않는다 (12,5 에서 50 μΜ 까지, 같은 결과가 관찰됨); 이 결과는 TSP-1의 베타-줄기 6 및7 또는 7 및 8이 관여하는 환형 헤파린 구조가 중요함을 보여주며, TSP-1의 4N1 CD47-결합 에피톱의 단지 환형화만으로는 역가를 증강시키는데 충분하지 않다는 사실을 강조한다.
환형 펩티드 PKD10은 2시간 배양 후에 낮은 용량 (25 μΜ) 에서도 아주 의미 있게 세포 생존력 감소를 유도한다 (도7f).
이 결과들은 그러므로 본 발명의 환형 펩티드가 동물 또는 사람에서 암 및 면역성 질병 (만성 염증과 관련된 질병 포함)과 같은 PCD 결함과 관련된 질병을 치료하는데 아주 전망이 좋은 도구로 고려하도록 하게 한다. 종양의 크기를 감소시키는 치료적 효율 이외에, 그러한 환형 펩티드들은 일반적인 세포독성 약물과 관련된 강한 독성을 보이지 않는다. 그러므로 이는 종양으로 고통을 받는 환자를 치료하는 미래의 치료제로 상징 된다.
3. 결합 시험
결합 친화력 측정. 펩티드들, 여기 PKDT16, PKTD1, PKTD10, PKTD10-1, PKTD10-3, PKTD10-5, PKDT10-7 및 PKTD10-8 의 저켓세포 (Jurkat cell) 및/또는 MEC-1 세포의 막 제조물에 대한 결합 친화력은 모노리스 NT115-피코 시스템 (Monolith NT115-pico system) 에서 마이크로스케일 열이동 xlv (Microscale Thermophoresis xlv ) ( (나노템퍼 테크놀로지, 뮨헨, 독일 (Nanotemper Technologies, Munich, Germany))으로 측정되었다.
MST 로 측정한 결합 곡선. 측정방법은 분자들의 온도 구배, 효과적인 용어로 '열이동 (thermophoresis)"에, 따른 직접 움직임에 근거한다. 국부적인 온도 차이 ΔΤ는 국부적으로 분자 농도 (고갈 또는 농축)를 변화 시키며, 소렛 계수 (Soret coefficient) ST: chot/ccold=exp(-STΔT)로 정량 한다. MEC-1 또는 저켓 (Jurkat ) 막 제조물은 다른 곳에서 서술된 대로xlvi 나노템퍼 NT-647 라벨링 키트 (Nanotemper NT-647 labeling kit)를 사용하여 라벨 시켰다. 라벨된 제조물은 PBS로 용출 시키고 4°C 에 보관하였다. 각 펩티드의 저장 용액 (stock solution)은 DMSO (5mM) 에 제조하고 PBS로 희석 시켰다. MST에 의해 평가 되는 펩티드를 위해 NT. 115 -라벨 된 막의 농도를 일정하게 유지했으며, 반면에 리간드 (펩티드)의 농도는 변화시켰다. 잠시 배양한 후 샘플은 MST 프리미엄 유리 캐필러리에 올려 놓고 모노리스 NT115-피코 (Monolith NT1 15-pico) 를 사용하여 MST 분석을 수행 하였다. 도 5 : TSP-1 의 C-말단 결합 도메인으로부터 유래된 선상 펩티드 PKT16 [(D)Lys-(N-Me)Arg-PheTyr-Val-Val-Nle-Trp-Lys-(D)Lys]에서 관찰된 MST 곡선. Kd=1600 nM. 도 6a 에서 6h. TSP-1 의 C-말단 결합 도메인의 환형 유사체들 (cyclic peptide anlalogues) 모두 PKTD1, PKTD10, PKTD10-1, PKTD10-3, PKTD10-4, PKTD10-5, PKTD10-7, P TD 0-8 [표 II 참조]에서 관찰된 MST 곡선. Kd (0, 1 에서 505 nM까지). Kd 비율은 이들 환형 유사체들이 CD47 결합에서 베타-줄기 7으로부터 디자인 된 선형 유사체보다 모두 훨씬 더 효율적이라는 사실을 강조한다. 이들 환형 유사체들의 Kd는 2,8 내지 50 nM로 구성된다; 이 값은 종양 세포들 및 이들의 제조에 따라 매우 변화 가능하다.
4. 안정성 에세이
단백질 가수분해 안정성 조사는 펩티드들을 프로테아제 ((트립신 (Trypsin), 카아모트립신 (Chymotrypsin) 및 프로테아제 K ( Proteinase K)dhkrkxdfms) 와 같은))로 배양하거나 또는 먼저 서술된 대로 인간 혈청 (Karoyan et al. J. Med. Chem. 2016 참조)에서 수행되었다. 이러한 조건들에서, PKD8, PKD9 또는 PKD10와 같은 펩티드들은 프로테아제에 대해 전적으로 안정한 것으로 나타났으며 반면에 PKC1은 선상 유사체 PKD10, 즉 L-PKD10처럼 트립신에 의해 2 시간 이내에 분해 된다:
환형화는 대사적인 안정성을 개선하는데 충분하지 못하며 (PKC1) 약리학적인 프로파일 (PKC1)을 개선하는 대도 충분하지 못하다, 그러나 TSP-1의 C-말단 결합 도메인의 안정한 하핀 (harpin) 모사체들을 개발하는 것은 개선된 약리적 성질 가지고 (적어도 PKD8, PKD9 및 PKD10) 및 프로그램 된 세포 죽음을 유도하는 능력을 가진 (적어도 PKD8, PKD10, PKD10-FF) 안정한 유사체들을 만들게 한다.
-참조-
<110> UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS6) CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> AGONIST AGENTS OF CD47 INDUCING PROGRAMMED CELL DEATH AND THEIR USE IN THE TREATMENTS OF DISEASES ASSOCIATED WITH DEFECTS IN PROGRAMMED CELL DEATH <130> CLBEclhfF2478 14WO <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Ala Gly Phe Val Phe 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: nothing or glycine or alanine or threonine or amino acid with similar properties <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> replace: nothing or homoarginine, lysine, ornithine, phenylalanine, naphtylalanine, N-methyl arginine or homophenylalanine or other ring substituted analogues in ortho, meta or para position <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> replace: naphtylalanine, homophenylalanine or other ring substituted analogues in ortho, meta or para position such as para-fluoro-phenylalanine, para-amino-phenylalanine or para-nitro-phenylalanine; tyrosine or amino acid with aromatic <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> replace: amino acid with aromatic side chains or phenylalanine or amino acid with similar properties including naphtylalanine, homophenylalanine or other ring substituted analogues in ortho, meta or para position <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> replace: leucine or isoleucine or terleucine or methionine or amino acid with similar properties <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> replace: leucine or isoleucine or terleucine or methionine or amino acid with similar properties <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> replace: valine or methionine or norleucine or leucine or isoleucine or lysine or terleucine or amino acid with similar properties <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> replace: tyrosine or phenylalanine or naphthyl-alanine or para-fluoro-phenylalanine or para-amino-phenylalanine or para-nitro-phenylalanine or D-prolino-tryptophane <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> replace: nothing or arginine or homoarginine or ornithine or phenylalanine or naphtylalanine or N-methyl arginine or homophenylalanine or other ring substituted analogues in ortho, meta or para position or histidine <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> replace: nothing or asparagine or or alanine or amino acid with similar properties <400> 2 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Gln 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Leu Ser Val Lys Val Val Asn Ser 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> homo sapiens <400> 5 Tyr Ala Gly Phe Val Phe Gly 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: nothing or glutamic acid or amino acid with similar properties <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> replace: nothing or amino acid with aromatic side chains <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> replace: nothing or glycine or amino acid with similar properties <400> 6 Asp Tyr Ala Gly Phe Val Phe Gly Tyr Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: nothing or serine or amino acid with similar properties <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> replace: leucine, terleucine, valine, methionine or any amino acid with similar properties <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> replace: arginine, homoarginine, lysine, ornithine, phenylalanine, naphtylalanine, N-methyl arginine or homophenylalanine or other ring substituted analogues (ortho, meta, para), histidine, methionine, valine, leucine, isoleucine, <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> replace: glutamine, lysine arginine, homoarginine, lysine, ornithine, phenylalanine, naphtylalanine, N-methyl arginine, homophenylalanine or any other ring substituted analogues (ortho, meta, para), histidine <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> replace: nothing or glycine <400> 7 Gly Ile Ser Val Lys Val Val Asn Ser 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(8) <223> cyclic peptide <400> 8 Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys 1 5 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 9 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Ile Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Lys Ser 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 10 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Ile Ser Ala Lys 1 5 10 15 Val Val Lys Ser 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 11 Asp Tyr Ala Gly Phe Val Phe Gly Tyr Pro Pro Arg Phe Tyr Val Val 1 5 10 15 Met Trp Lys Gln 20 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(18) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> D-proline <400> 12 Tyr Ala Gly Phe Val Phe Gly Tyr Pro Pro Arg Phe Tyr Val Val Met 1 5 10 15 Trp Lys <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 13 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Ile Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(18) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> D-proline <400> 14 Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Ile Ser Val Lys Val 1 5 10 15 Val Asn <210> 15 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> D-proline <400> 15 Asp Tyr Ala Gly Phe Val Phe Gly Tyr Gln Pro Pro Ser Arg Phe Tyr 1 5 10 15 Val Val Met Trp Lys Gln 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 16 Tyr Ala Gly Phe Val Phe Gly Tyr Gln Pro Pro Ser Arg Phe Tyr Val 1 5 10 15 Val Met Trp Lys 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 17 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 18 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Ala Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 19 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Ala Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 20 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ala Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 21 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Ala Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 22 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Val Ala 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 23 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Ala Val Asn Ser 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 24 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Ala Asn Ser 20 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 25 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Ala Ser 20 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 26 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ala 20 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 27 Ser Arg Phe Ala Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 28 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(21) <223> cyclic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> D-proline <400> 28 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Gln Pro Pro Ser Gly Leu Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Val Asn Ser 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> D-proline <400> 29 Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Gln Pro Pro Ser Gly Leu Ser Val 1 5 10 15 Lys Val Val Asn 20 <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(18) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> D-proline <400> 30 Tyr Ala Gly Phe Val Phe Gly Pro Pro Arg Phe Tyr Val Val Met Trp 1 5 10 15 Lys Gln <210> 31 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(18) <223> 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similar properties <220> <221> VARIANT <222> (9) <223> replace: alanine or amino acid with similar properties <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> replace: nothing or glycine or amino acid with similar properties <400> 36 Ser Gly Ile Ser Val Lys Val Val Asn Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Phe Tyr Val Val Met Trp 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 38 Leu Ser Val Lys Val Val 1 5 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> cyclic peptide <400> 39 Phe Tyr Val Val Met Trp Leu Ser Val Lys Val Val 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> replace: D-prolino-tryptophane <400> 40 Phe Tyr Val Val Met Xaa Leu Ser Val Lys Val Val 1 5 10 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> 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replace: D-proline <400> 45 Phe Phe Val Val Lys Trp Pro Pro Leu Ser Val Lys Val Val 1 5 10 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: D-proline <400> 46 Pro Pro Phe Tyr Val Val Met Trp Leu Ser Val Lys Val Val 1 5 10 <210> 47 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> replace: D-proline <400> 47 Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Pro Pro Leu Ser Val Lys Val Val Asn 1 5 10 15 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: N-Methyl arginine <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> replace: D-proline <400> 48 Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Pro Pro Leu Ser Val Lys Val Val Asn 1 5 10 15 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> replace: D-proline <400> 49 Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Pro Pro Ile Ser Val Lys Val Val Lys 1 5 10 15 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: N-methyl-arginine <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> replace: D-proline <400> 50 Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Pro Pro Ile Ser Val Lys Val Val Lys 1 5 10 15 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: D-proline <400> 51 Pro Pro Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Gly Leu Ser Val Lys Val Val 1 5 10 15 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(16) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: D-proline <400> 52 Pro Pro Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Leu Ser Val Lys Val Val Asn 1 5 10 15 <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(18) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: D-proline <400> 53 Pro Pro Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Gly Leu Ser Val Lys Val 1 5 10 15 Val Asn <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> replace: N-methyl-arginine <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> replace: D-proline <400> 54 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 55 <211> 20 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> replace: N-methyl-arginine <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> replace: norleucine <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> replace: D-proline <400> 55 Ser Arg Phe Tyr Val Val Xaa Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> replace: N-methyl-arginine <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> replace: norleucine <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> replace: D-proline <400> 56 Ser Arg Phe Tyr Val Val Xaa Trp Lys Pro Pro Gly Leu Ala Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> replace: D-proline <400> 57 Pro Pro Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Gly Leu Ser Val Lys 1 5 10 15 Val Val Asn Ser 20 <210> 58 <211> 22 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> cyclic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> replace: D-proline <400> 58 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Ala Pro Pro Ser Gly Leu Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Val Asn Ser 20 <210> 59 <211> 22 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> replace: D-proline <400> 59 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Gln Pro Pro Ala Gly Leu Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Val Asn Ser 20 <210> 60 <211> 22 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> replace: N-methyl-arginine <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> replace: D-proline <400> 60 Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Gln Pro Pro Ser Gly Leu Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Val Asn Ser 20 <210> 61 <211> 22 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(22) <223> cyclic peptide <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> replace: N-methyl-arginine <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> replace: norleucine <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> replace: D-proline <400> 61 Ser Arg Phe Tyr Val Val Xaa Trp Lys Gln Pro Pro Ser Gly Leu Ser 1 5 10 15 Val Lys Val Val Asn Ser 20

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 일반적인 구조 (1a)의 분리된 환형 펩티드:

    또는 약리학적으로 수용 할만 한 염 또는 생물학적으로 활성이 있는 이들의 유도체이되, 여기서 상기:
    -Z1 은 아무것도 없고;
    -B2 는 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 인 6 내지 10개 아미노산으로 구성 된 것을 특징으로 하는 펩티드 서열이되, 상기:
    X1는 아무것도 없는 것을 의미하거나;
    X2는 아무것도 없거나 아르기닌 (arginine) 또는N-메틸아르기닌(N-methyl arginine) 을 의미하고;
    X3 는 페닐알라닌 (phenylalanine) 을 의미하고;
    X4 는 타이로신 (tyrosine) 또는 페닐알라닌(phenylalanine)을 의미하고;
    X5 는 발린(valine)을 의미하고;
    X6 는 발린(valine) 을 의미하고;
    X7 는 메티오닌 (methionine) 또는 라이신 (lysine) 또는 노르루이신(norleucine)을 의미하고;
    X8 은 트립토판 (tryptophan) 을 의미하고;
    X9 은 아무것도 없거나 또는 라이신 (lysine) 인 것을 의미하고;
    X10 는 아무것도 없거나 또는 글루타민 (glutamine) 을 의미하고;
    -Z2 는 헤테로카이랄 (heterochiral) 서열 D-Pro-L-Pro 이고,
    B3 는 다음의 서열: -X19-X14-X15-X20-X21-X16-X22-X23-X17-X18- 을 포함하는 6개 내지 10개의 아미노산을 가진 펩티드 서열이되, 상기:
    X14는 아무것도 없거나 글라이신 (glycine) 또는 알라닌(alanine) 이고;
    X15는 이소루이신(isoleucine) 또는 루이신(leucine) 이고;
    X16 는 라이신(lysine) 이고;
    X17 은 아무것도 없거나 아스파르긴(asparagine) 또는 라이신(lysine)이고;
    X18 은 아무것도 없거나, 세린(serine) 또는 글라이신 (glycine) 이고;
    X19는 아무것도 없거나, 또는 세린(serine) 이고;
    X20 는 세린(serine) 또는 알라닌(alanine) 이고;
    X21 은 발린(valine) 또는 알라닌(alanine) 이고;
    X22 는 발린(valine) 이고; 및
    X23는 발린(valine) 이고;
    상기 언급된 분리된 환형 펩티드는 짝수 아미노산을 포함하며 상기 언급된 분리된 환형 펩티드는 14개 내지 22개 아미노산으로 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 환형 펩티드.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제2항에 있어서,
    상기 펩티드는 서열번호 9의 PKTD1, 서열번호 10의 PKTD3, 서열번호 13의 PKTD6, 서열번호 14의 PKTD7, 서열번호 17의 PKTD10, 서열번호 18의 PKTDl0-1, 서열번호 20의 PKTD 10-3, 서열번호 21의 PKTD10-4, 서열번호 28의 PKTDll, 서열번호 29의 PKTD12, 서열번호 32의 PKTD 15, 서열번호 35의 PKTD18, 서열번호 41의 PKD8, 서열번호 42의 PKD8FF, 서열번호 43의 PKD9, 서열번호 44의 PKD10, 서열번호 45의 PKD10FF, 서열번호 47의 PKD11, 서열번호 48의 PKDllRNMe, 서열번호 49의 PKD12, 서열번호 50의 PKD12RNMe, 서열번호 54의 PKTD10-RNMe, 서열번호 55의 PKTD10-X-RNMe, 서열번호 56의 PKTD10-3-X-RNMe, 서열번호 60의 PKTD11-RNMe, 서열번호 61의 PKTD11-X-RNMe로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 환형 펩티드.
  6. 삭제
  7. CD47 효능제로서의 사용을 위한 제2항에 따른 분리된 환형 펩티드를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
  8. 삭제
  9. CD47 효능제로서의 사용을 위한 제2항에 따른 분리된 환형 펩티드를 포함하는 다발성경화증 (multiple sclerosis), 크론씨병(Chron disease), 건선 (psoriasis), 궤양성 장염 (ulcerative colitis), 관절염 또는 천식 치료용, 약학적 조성물.
  10. 삭제
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