KR102563324B1

KR102563324B1 - 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법

Info

Publication number: KR102563324B1
Application number: KR1020200125173A
Authority: KR
Inventors: 장규필
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2023-08-02
Also published as: KR20220041641A

Abstract

본 발명은 식물 뿌리 내피 세포에 옥신 반응을 유도하는 단계를 포함하는 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법 및 이를 포함하는 식물 생장 촉진 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식물 뿌리 내피 세포에서의 옥신 반응 유도제를 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법 또는 조성물을 이용하면, 지상부 조직의 발달과 생리를 조절하는 핵심 조직인 뿌리 내피 세포의 분열을 촉진할 수 있다.

Description

식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법{METHOD FOR PROMOTING DIVISION OF PLANT ROOT ENDODERMAL CELLS}

본 발명은 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법과 이를 포함하는 식물 생장 촉진 방법 및 식물 생장 촉진용 조성물에 관한 것이다.

식물 뿌리는 식물의 발달과 생리조절에 필요한 물과 무기 염류를 토양으로부터 흡수하는 기능을 수행하고 있다. 따라서 뿌리 발달은 식물의 발달과 생리조절을 결정하는 매우 중요한 요소이다. 유관속 식물 뿌리는 고도로 복잡한 구조로 형성되어 있으며, 크게 식물이 물과 영양분을 흡수하고, 식물을 고정하고, 성장과 생산성을 지원하는 능력을 결정한다. 유관속 식물의 뿌리는 표피(epidermis), 내피조직 (endodermis)와 피질조질 (cortex)를 포함하는 기본 조직 (ground tissue), 그리고 및 관다발 조직으로 구성되어 있다.

뿌리 기본조직을 구성하고 있는 내피 조직 (endodermis)는 내피세포 (endodermal cells)의 분열로 형성된다. 뿌리를 통해 토양으로부터 흡수된 물과 무기염류는 식물의 지상부로 전달되어 식물의 발달과 생리작용조절에 활용된다. 토양으로부터 흡수된 물과 무기염류의 이동은 지상부 필요에 따라 매우 선택적으로 수송되며, 이에 관여하는 핵심 뿌리 조직이 내피조직이다. 내피세포는 흡수한 물과 무기염류가 세포벽공간을 통해 비선택적으로 수송되는 것을 막으며, 반대로 높은 선택적 수송이 가능한 세포질 수송을 강화함으로써, 흡수한 물과 무기염류의 선택적 수송을 이루어 낸다. 따라서 뿌리 내피세포 분열로 형성되는 뿌리 내피조직은 식물의 발달과 성장에 중요한 요소로 예측되어왔다.

식물 호르몬은 식물의 발달과 생리작용을 결정하는 신호 전달물질이며, 식물 호르몬 중의 하나인 옥신(Auxin)은 식물의 뿌리 발달에 매우 중요한 호르몬으로, 뿌리의 발달과 성장을 제어하며, 뿌리 관다발 조직의 패턴화, 뿌리 털의 연장 및 RAM 활동 유지에 영향을 준다. 또한 염분 및 산화 스트레스와 같은 환경 스트레스는 옥신 의존성 조직 발달 및 뿌리 성장에 영향을 미친다는 사실은 친다. 옥신이 환경스트레스에 의한 뿌리 발달을 조절 현상에 깊이 관여함을 시사한다. 실제로 환경 스트레스는 옥신 신호 및 반응을 담당하는 유전자의 발현을 조절한다.

식물에서 옥신 반응은 옥신 신호 전달체계에 의해 조절된다. 식물 세포에서 합성된 옥신은 옥신 특이적인 신호전달체계를 통해 옥신 반응을 야기한다. 옥신 신호전달체계에 있어서 ARF 전사조절인자의 활성화가 핵심이다. 옥신이 없는 조건에서는 ARF 전사조절 단백질이 AUX/IAA 단백질에 결합되어 활성을 보이지 않는다. 반면, 식물세포 내 옥신이 합성되면, AUX/IAA 단백질이 제거되어 ARF 단백질이 활성화 되어 옥신반응을 유도하게 된다. 이러한 사실은 ARF 전사조절 단백질이 옥신반응 유동의 핵심적인 조절인자임을 제시한다.

한국공개특허 제2012-0078950호

본 발명은 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 식물 생장 촉진 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 식물 생장 촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 식물 뿌리 내피 세포에 옥신 반응을 유도하는 단계를 포함하는 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.

2. 위 1에 있어서, 상기 옥신 반응을 유도하는 단계는 식물 뿌리 내피 세포에 옥신 반응을 유도하는 유전자를 발현시켜 수행되는, 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.

3. 위 1에 있어서, 상기 옥신 반응을 유도하는 단계는 식물 뿌리 내피 세포에 ARF5(AUXIN RESPONSE FACTOR 5) 유전자를 발현시켜 수행되는, 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.

4. 위 3에 있어서, 상기 ARF5 유전자는 AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid) 단백질 결합 도메인의 기능이 저하 또는 상실되도록 상기 도메인의 서열 중 적어도 일부를 포함하지 않는, 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.

5. 위 1에 있어서, 상기 옥신 반응을 유도하는 단계는, 식물체를 SCR(SCARECROW) 프로모터 또는 EN7(ENDODERMIS7) 프로모터; 및 이에 작동 가능하도록 연결된 ARF5 유전자;를 포함하는 벡터로 형질전환시켜 수행되는, 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.

6. 위 1 내지 5 중 어느 한 항의 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법을 포함하는 식물 생장 촉진 방법.

7. 식물 뿌리 내피 세포에서의 옥신 반응 유도제를 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물.

8. 위 7에 있어서, 상기 옥신 반응 유도제는 옥신 반응을 유도하는 유전자가 도입된 벡터인, 식물 생장 촉진용 조성물.

9. 위 8에 있어서, 상기 유전자는 ARF5(AUXIN RESPONSE FACTOR 5) 유전자인, 식물 생장 촉진용 조성물.

10. 위 9에 있어서, 상기 ARF5 유전자는 AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid) 단백질 결합 도메인의 기능이 저하 또는 상실되도록 상기 도메인의 서열 중 적어도 일부를 포함하지 않는, 식물 생장 촉진용 조성물.

11. 위 7에 있어서, 상기 옥신 반응 유도제는 SCR(SCARECROW) 프로모터 또는 EN7(ENDODERMIS7) 프로모터; 및 이에 작동 가능하도록 연결된 ARF5 유전자;를 포함하는 벡터인, 식물 생장 촉진용 조성물.

본 발명은 식물 뿌리 내피세포에 옥신 반응을 유도하여 뿌리 내피세포의 분열을 촉진하는 효과가 있다.

도 1은 식물 뿌리의 내피조직(Endodermis)은 식물의 뿌리 정단 분열 조직(RAM; the root apical meristem)에서 분열하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 2는 EN7 또는 SCR 프로모터를 이용하여 뿌리 내피 세포 특이적으로 ΔARF5 유전자의 발현이 유도된 형질전환 식물에서, 내피 세포가 분열하여 내피 세포의 수가 증가하는 것을 나타낸다.
도 3은 EN7 프로모터를 이용하여 뿌리 내피 세포 특이적으로 ΔARF5 유전자의 발현이 유도된 형질전환 식물에서, 내피 세포에 옥신 반응이 유도된다는 것을 DR5::VENUS 식물을 통해 시각적으로 확인한 결과이다.
도 4는 EN7 프로모터를 이용하여 뿌리 내피 세포 특이적으로 ΔARF5 유전자의 발현이 유도된 형질전환 식물이 향상된 성장(dry weight)과 종자 생산량(total seed weight)를 가지는 것을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 식물 뿌리 내피 세포에 옥신 반응을 유도하는 단계를 포함하는 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법에 관한 것이다.

식물 뿌리는 식물의 성장과 생리작용에 필요한 무기염류를 흡수하고 이동하는 매우 중요한 식물기관이다. 뿌리에서 흡수한 무기염류는 선택적으로 수송되어 지상부 조직의 발달과 생리를 조절하는데, 이에 핵심적인 뿌리조직이 내피 조직이다. 하지만 내피 조직 세포의 분열을 조절할 수 있는 방법이 알려져 있지 않다. 본 발명은 식물 뿌리 내피세포의 분열을 유도해 낼 수 있는 방법을 포함하고 있으며 내피조직 발달이 촉진된 형질전환 식물은 식물발달과 생산성도 향상된다.

"식물"의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 방법의 적용 대상인 '식물'은 특별히 한정되지 않으며, 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있으며, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용될 수 있다. 예를 들면 대상 식물이 십자화과 식물일 수 있고, 구체적으로는 애기장대, 무, 브로콜리, 콜리플라워, 케일, 상추, 배추, 적양배추, 양배추, 방울양배추, 콜라비 및 복초이(bok choy) 등일 수 있다.

"내피"는 식물의 뿌리와 일부 줄기의 피질(cortex)에 있는 세포의 내부 층으로 관다발(vascular bundle)을 둘러싸고 있으며, "뿌리 내피"는 뿌리에서 물과 함께 흡수된 물질을 선별하여 중심의 물관부(xylem)로 투과시키는 역할을 하는 조직으로, 식물 지상부의 발달 및 생리를 조절하는 데에 핵심적인 역할을 하는 조직을 의미한다.

"옥신"은 주요 식물 성장 호르몬으로, 배 형성, 뿌리 및 어린 싹 형성, 기관 형성, 굴중성, 굴광성, 보화 등에 이르기까지 거의 모든 측면의 성장과 발생을 조절하는 식물 호르몬을 의미한다.

"옥신 반응"은 옥신(auxin)에 의해 유발된 식물 또는 식물의 기관에서 관찰 가능한 특성을 의미하며, 예를 들면, 뿌리 성장(중력 반응), 꽃 패턴화와 발달, 과일 숙성, 관다발 조직 형성, 굴광성 성장(phototropic growth)과 그늘 회피, 정점 고리(apical hook) 형성, 해충 저항성 및 생식력을 포함한다. 또한, 옥신 반응은 실제 옥신의 존재 하에 유발된 반응뿐만 아니라 옥신 신호 전달 경로 조절에 의한, 옥신 반응 유전자의 전사로 유발된 반응을 포함한다.

본 발명의 식물 뿌리 내피 세포에 옥신 반응을 유도하는 단계는, 식물 뿌리 내피 세포에 옥신 반응을 유도하는 유전자를 발현시켜 수행되는 것일 수 있다.

상기 옥신 반응을 유도하는 유전자는 ARF5(AUXIN RESPONSE FACTOR 5) 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 ARF5 유전자는 AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid) 단백질 결합 도메인의 기능이 저하 또는 상실되도록 상기 도메인의 서열 중 적어도 일부를 포함하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"ARF"는 옥신 신호 전달 경로에서 AuxRE(auxin response elemnt)라는 DNA 서열에 결합하는 전사 인자로, 하부의 옥신 반응 유전자들의 발현을 조절하는 이펙터(effector)를 의미한다.

"AUX/IAA 단백질"은 ARF와 결합하거나 유비퀴틴화되어 분해되는 단백질로, ARF와 상호작용하여 옥신 반응 유전자들의 발현을 조절하는 단백질을 의미하며, 옥신 함량이 낮을 때 AUX/IAA 단백질이 ARF에 결합하여 옥신 반응 유전자의 전사를 억제한다.

"AUX/IAA 단백질 결합 도메인"은 ARF5 유전자의 PB1(Phox and Bem1) 도메인(도메인 Ⅲ/Ⅳ)을 의미하고, 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

AUX/IAA 단백질 결합 도메인의 기능이 저하 또는 상실되면 ARF5와 AUX/IAA 단백질의 결합 정도가 저하되거나 결합이 결손되기 때문에, 이 경우 상기 도메인의 기능이 저하 또는 상실되지 않은 경우에 비해 옥신 반응 유전자의 전사가 촉진될 수 있다.

AUX/IAA 단백질 결합 도메인의 기능의 저하 또는 상실은 해당 도메인의 적어도 일부 서열을 포함하지 않는 ARF5 유전자를 사용하여 달성될 수 있다. 상기 저하 또는 상실은 상기 도메인의 motif 부분 서열을 포함하지 않거나, 상기 도메인 전부를 포함하지 않거나, 그 외에 도메인의 부분 중 적어도 일부가 없어 그 구조가 달라져 기능을 저하 또는 상실하게 함으로써 달성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적인 예를 들자면 서열번호 1로 이루어진 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

식물 뿌리 내피 세포에 옥신 반응을 유도하는 유전자를 발현하는 것은 예를 들면 식물체를 SCR(SCARECROW) 프로모터 또는 EN7(ENDODERMIS7) 프로모터; 및 이에 작동 가능하도록 연결된 ARF5 유전자;를 포함하는 벡터로 형질전환시켜 수행되는 것일 수 있다.

SCR(SCARECROW) 프로모터(서열번호 2) 또는 EN7(ENDODERMIS7) 프로모터를(서열번호 3) 사용하여 유전자가 식물 뿌리 내피 세포에 발현되도록 할 수 있다.

벡터에 포함된 ARF5 유전자는 AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid) 단백질 결합 도메인의 기능이 저하 또는 상실되도록 상기 도메인의 서열 중 적어도 일부를 포함하지 않는 것일 수 있고, 예를 들어 서열번호 1의 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭한다. 상기 "벡터"는 재조합 식물 발현 벡터일 수 있다. "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나; 상기 핵산을 발현하거나; 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 것;을 지칭하는 것이다. 상기 벡터로 형질전환된 재조합 식물체는 상기 식물체의 자연 형태에서는 발현되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 식물체는 자연 상태의 세포에서 발현되는 유전자 또는 변형된 유전자를 발현할 수 있다.

벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "전달체"는 벡터와 호환하여 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

벡터는, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 식물세포를 형질전환시키기 위하여 가장 많이 쓰이는 벡터는 이원체 벡터(binary vector)이며, 당업계에 공지된 다양한 이원체 벡터가 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 벡터는 HindIII/KpnI-digested pMDC plant binary vector일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및/또는 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.

형질전환에 이용되는 식물체는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물세포, 식물조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명은 전술한 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법을 포함하는 식물 생장 촉진 방법에 관한 것이다.

"생장 촉진"이란 식물의 건조 질량이 증가하고 종자 생산량이 증가하는 것을 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 식물 뿌리 내피 세포에서의 옥신 반응 유도제를 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물에 관한 것이다.

옥신 반응 유도제는 옥신 반응을 유도하는 유전자가 도입된 벡터일 수 있고, 구체적으로 옥신 반응을 유도하는 유전자는 ARF5(AUXIN RESPONSE FACTOR 5)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

옥신 반응을 유도하는 유전자는 AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid) 단백질 결합 도메인의 기능이 저하 또는 상실되도록 상기 도메인의 서열 중 적어도 일부를 포함하지 않는 것일 수 있고, 예를 들어 서열번호 1로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 옥신 반응 유도제는 SCR(SCARECROW) 프로모터 또는 EN7(ENDODERMIS7) 프로모터; 및 이에 작동 가능하도록 연결된 ARF5 유전자;를 포함하는 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

벡터에 포함된 ARF5 유전자는 AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid) 단백질 결합 도메인의 기능이 저하 또는 상실되도록 상기 도메인의 서열 중 적어도 일부를 포함하지 않는 것일 수 있고, 예를 들어 서열번호 1로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

프로모터 및 벡터는 전술한 범위 내의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 식물 재료, 성장 조건 및 처리

35S::DII-VENUS 및 DR5::VENUS는 후술하였다. 씨앗은 Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC)에서 얻거나 Dr. Spalding, Dr. Friml 및 Dr. Helariutta의 기부로 얻었다. 씨앗을 표면 살균하고 절반 강도의 Murashige 및 Skoog (½MS) 고체 배지에 플레이팅했다. 빛이 없는 조건에서 4 ℃에서 3일 동안 vernalization(춘화처리) 후, 식물은 23 ℃에서 16/8(빛 있는 조건/빛 없는 조건)시간 동안의 밝은 영역으로 수직으로 재배되었다. 호르몬 및 스트레스 처리를 위해 식물을 10 μM methyl jasmonate(MeJA), 200 nM IAA, 200 nM BAP 및 5 μM NPA가 보충 된 ½MS 배지에서 재배했다.

2. 플라스미드 구성 및 변형

SCR::ㅿARF5 또는 EN7::ㅿARF5 구축물을 생성하기 위해, Gibson Assembly Cloning system(New England BioLabs)을 사용하여 SCR 프로모터 또는 EN7 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 HindIII/KpnI- digested pMDC plant binary vector에 삽입하였다. ㅿARF5 cDNA의 DNA 단편은 GATEWAY 시스템(Invitrogen)을 사용하여 벡터에 도입되었다. SCR::DII-VENUS의 경우, 35S::DII-VENUS 식물에서 추출한 게놈 DNA에서 PCR로 DII-VENUS의 DNA 단편을 증폭한 다음 pDONR221 (pENTRY-DII- VENUS)에 삽입하였다. LR reaction을 통해 DII-VENUS를 SCR 프로모터를 운반하는 pMDC 벡터에 도입하였다.

3. embedding, 절편화 및 염색

Technovit 임베딩 및 절편화를 약간 수정하여 수행하였다. 애기 장대 뿌리를 4% 파라 포름 알데히드 용액에 1.5시간 동안 고정시킨 다음, 이중 증류된 증류수(ddH₂O)로 4회 매회 1시간 동안 세척하였다. 고정된 샘플은 에탄올 series(25, 50, 75 및 100% [v/v] in ddH₂O)로 탈수하였다. 탈수된 샘플은 a series of Technovit 7100 cold-polymerizing resin solutions (25, 50, 75 및 100% [v/v] in ethyl alcohol)에서 각각 6시간 동안 순차적으로 배양되었다. 샘플을 100% Technovit 수지에서 1일 동안 추가로 배양하고, Technovit과 경화제 용액 II의 15:1 (v/v) 혼합물로 실온에서 1일 동안 몰드에서 고형화했다. 절편(3-4 μm)은 RM 2145 마이크로톰(Leica)을 사용하여 응고된 샘플에서 가져왔다. 탈수된 부분은 0.05% toluidine blue 용액(pH 4.5)으로 염색되었다.

4. 현미경 사용

DR5::VENUS에서 형광 신호를 시각화하기 위해, ½MS에서 7일 동안 자란 표지된 식물의 전체 뿌리를 요오드화 프로피듐 (PI; propidium iodide) 용액(10 μg/ml)에 3분 동안 담갔다. 염색 후, 뿌리는 ddH₂O의 유리 슬라이드에 장착되었다. 형광은 PI의 경우 591-635 nm의 파장에서, 녹색 형광 단백질(GFP)의 경우 505-530 nm의 파장에서 시각화되었다. 물리적 단면 사진은 Olympus BX41 광학 현미경으로 촬영했다.

5. 수탁번호

염기 서열 데이터는 Arabidopsis Genome Initiative 또는 GenBank/EMBL databases에서 ARF5(At1G19850, 서열번호 4) 및 IAA2(At3G23030, 서열번호 5)의 수탁 번호로 찾을 수 있다.

결과

1. 내피 세포는 뿌리 정단 분열 조직(RAM; the root apical meristem)을 따라 분열하지 않는다.

RAM의 세포는 특수 기능을 가진 분화된 세포를 생성하는 딸세포를 분할하고 생성한다. 내피의 발달을 이해하기 위해 RAM과 함께 관다발, 표피, 피질 및 내피 세포 수의 변화를 추적했다(도 1). 관다발 조직의 세포 수는 RAM 성장과 함께 크게 증가하여 관다발 전형성층 세포(vascular procambial cells)가 RAM과 나란히 분열됨을 나타낸다. 표피 세포의 수는 증가하는 경향이 있지만 크게 증가하지는 않았다. 기본 조직 세포의 수에는 변화가 없었다. 내피 및 피질 세포의 수는 RAM의 근위 영역(the proximal regions)에서 정확히 8개였다. 내피 세포의 수는 RAM의 다른 세로 위치(longitudinal positions)에서 발견된 수와 거의 항상 같았으며 변화는 거의 없었다. 이것은 내피 및 피질 세포가 RAM과 함께 분열하지 않음을 나타낸다.

2. 옥신 반응(auxin response)의 내피 세포 분열 활성화 효과

옥신이 실제로 내피 세포 분열의 양성 조절자라면, 내피 세포에서 옥신 반응의 활성화가 내피 세포 분열을 촉진할 것으로 예상된다. 이를 확인하기 위해, 본 발명자는 결절된(truncated) ARF5/MP 유전자(ㅿARF5, 서열번호 1)가 SCR 프로모터의 제어 하에 뿌리 내피 세포에서 특이적으로 발현되는 형질 전환 식물을 생성했다. 결절된 ARF5 단백질(ㅿARF5)은 Aux/IAA 억제자(repressor)와 상호 작용하는 역할을 하는 Ⅲ 및 Ⅳ 도메인이 부족하므로, 온전한 ARF5보다 옥신 반응을 유발하는 능력이 더 크다. 물리적인 절편(physical sectioning)에 의한 뿌리 내피 조직의 발달을 시각화함으로써, 본 발명자는 SCR::ㅿARF5 뿌리에서 내피 세포의 수가 현저하게 증가했음을 확인했다. 또한, 이러한 증가는 내피 세포의 수직 분열(anticlinal division)뿐만 아니라 내피 세포의 병층 분열(periclinal division)에 의해서도 발생했다(도 2).

이를 확인하기 위해, 본 발명자는 ㅿARF5가 내피 특이적 프로모터 EN7의 제어 하에 발현된 또 다른 형질 전환 식물 라인인 EN7::ㅿARF5를 생성했다. SCR::ㅿARF5 식물과 마찬가지로, EN7::ㅿARF5 식물(n=17)의 뿌리는 수직 및 병층 분열로 인해 증가된 내피 세포 수(약 12개)를 가졌다(도 2). 이러한 결과는 내피 옥신 반응이 내피 세포의 분열을 촉진하기에 충분하다는 것을 나타내며, 옥신이 내피 뿌리 세포의 분열을 결정하는 핵심 조절자임을 시사한다. 이러한 결과는 DR5::VENUS 시스템을 사용하여 EN7::ㅿARF5 뿌리에서 옥신 반응을 시각화함으로써 더욱 뒷받침되었다(도 3). 이전의 보고들과 일치하게, 야생형 백그라운드에서 DR5::VENUS의 발현은 표피 세포 및 관다발의 가운데에 있는 물관부 세포(xylem cells)에서 형광 신호를 나타냈으나, 내피 세포에서는 형광 신호를 나타내지 않았다. 이것은 내피에서 옥신 반응이 없음을 나타낸다. 그러나 EN7::ㅿARF5 백그라운드(DR5::VENUS/EN7::ㅿARF5)에서 DR5::VENUS의 발현은 표피 세포, 물관부 뿐만 아니라 야생형과 달리 내피 세포에서 형광 신호를 나타냈다. 이는 EN7::ㅿARF5 형질전환 식물이 내피세포에 옥신반응을 유도한다는 사실을 명확히 제시하고 있다. 더욱이, 이 발현의 시각화는 내피의 이중층을 드러냈는데, 이는 DR5::VENUS/EN7::ㅿARF5 뿌리에서 내피 세포의 분열을 촉진한다는 것을 나타낸다. 종합적으로, 이러한 발견은 내피 특이적인 옥신 반응이 내피 세포의 분열을 촉진하기에 충분하고 옥신이 내피 뿌리 세포의 분열을 결정하는 핵심 조절자임을 시사한다.

또한, EN7::ㅿARF5 식물을 야생형 식물과 동일한 환경에서 11주 동안 재배한 후, 건조 질량(dry weight)과 종자 생산량(seed weight)을 비교하였다(도 4). 야생형 식물에 비해 EN7::ㅿARF5 식물의 경우 건조 질량(도 4B)과 종자 생산량(도 4C)(n>20) 모두 높은 값을 나타냈다. 이는 뿌리 내피 세포 분열이 촉진된 EN7::ㅿARF5 식물의 경우 야생형 식물에 비해 향상된 성장과 종자 생산량을 갖는 것을 나타낸다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> METHOD FOR PROMOTING DIVISION OF PLANT ROOT ENDODERMAL CELLS <130> 20P08028 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2442 <212> RNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgatggctt cattgtcttg tgttgaagac aagatgaaaa caagttgttt ggttaatggt 60 ggaggaacta taacaacaac aacatctcaa tctaccttgc ttgaagagat gaagctgttg 120 aaagaccagt caggtacaag aaagccggta ataaactcgg agctatggca cgcttgtgca 180 ggccctttgg tgtgtctccc tcaagttggg agcttagtgt attacttctc acaaggtcat 240 agcgagcagg ttgctgtttc aaccagaaga tcagcaacaa cacaagttcc taattatccg 300 aaccttccat ctcagttgat gtgtcaagtc cataatgtta ctcttcatgc tgacaaagac 360 agtgacgaaa tctatgctca gatgagtctt caacctgttc actctgagag agatgtgttc 420 cctgtaccag actttggaat gctgagagga agtaagcacc cgactgagtt tttctgcaaa 480 acacttactg caagtgacac aagcacacat ggaggtttct cagtgccacg tagagctgca 540 gagaagctat ttccaccatt ggactactca gcacagccgc caacgcaaga gcttgtagtt 600 cgagatcttc atgagaatac ttggacattt cgccatatct accgagggca accaaagaga 660 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Claims

식물 뿌리 내피 세포에 옥신 반응을 유도하는 단계를 포함하는 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 옥신 반응을 유도하는 단계는 식물 뿌리 내피 세포에 옥신 반응을 유도하는 유전자를 발현시켜 수행되는, 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 옥신 반응을 유도하는 단계는 식물 뿌리 내피 세포에 ARF5(AUXIN RESPONSE FACTOR 5) 유전자를 발현시켜 수행되는, 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 ARF5 유전자는 AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid) 단백질 결합 도메인의 기능이 저하 또는 상실되도록 상기 도메인의 서열 중 적어도 일부를 포함하지 않는, 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 옥신 반응을 유도하는 단계는, 식물체를 SCR(SCARECROW) 프로모터 또는 EN7(ENDODERMIS7) 프로모터; 및 이에 작동 가능하도록 연결된 ARF5 유전자;를 포함하는 벡터로 형질전환시켜 수행되는, 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 식물 뿌리 내피 세포 분열 촉진 방법을 포함하는 식물 생장 촉진 방법.
식물 뿌리 내피 세포에서의 옥신 반응 유도제를 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 옥신 반응 유도제는 옥신 반응을 유도하는 유전자가 도입된 벡터인, 식물 생장 촉진용 조성물.
청구항 8에 있어서,
상기 유전자는 ARF5(AUXIN RESPONSE FACTOR 5) 유전자인, 식물 생장 촉진용 조성물.
청구항 9에 있어서,
상기 ARF5 유전자는 AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid) 단백질 결합 도메인의 기능이 저하 또는 상실되도록 상기 도메인의 서열 중 적어도 일부를 포함하지 않는, 식물 생장 촉진용 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 옥신 반응 유도제는 SCR(SCARECROW) 프로모터 또는 EN7(ENDODERMIS7) 프로모터; 및 이에 작동 가능하도록 연결된 ARF5 유전자;를 포함하는 벡터인, 식물 생장 촉진용 조성물.