KR102561831B1 - 전사 효율이 개선된 새로운 프로모터 및 이를 이용한 효소 활성 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전사 효율이 개선된 새로운 프로모터 및 이를 이용한 효소 활성 분석 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 전사 효율이 개선된 새로운 프로모터 및 이를 이용한 효소 활성 분석 방법에 관한 것이다.
T7 RNA 중합 효소 (T7 RNAP)는 N-말단 도메인과 중합 효소 도메인으로 구성된 DNA 의존성 RNA 중합 효소이다. 전사 반응을 통해 이중 가닥 (ds) DNA 주형으로부터 RNA 전사 생성물의 생산을 촉매 한다. T7 RNAP의 N-말단 도메인은 ds T7 프로모터에 특이적으로 결합하여 dsDNA를 펼치는 데 중요한 역할을 한다. T7 RNAP의 중합 효소 도메인은 Thumb, Palm 및 Fingers의 세 가지 하위 도메인으로 분류되며, 각각 주형 결합 틈을 형성하고 마그네슘 이온 (뉴클레오티드 추가에 중요)을 도입하며, T7 프로모터와 상호 작용한다. T7 프로모터는 T7 RNAP가 전사 반응을 효과적으로 수행하는 데 필수적이다. 23bp T7 프로모터는 T7 RNAP에 대한 특이적 결합에 필요한 12bp 인식 영역과 전사 반응 시작에 필요한 11bp 시작 영역(initiation region)의 두 부분으로 구성된다.
T7 RNAP 기반 전사 시스템은 체외에서 다량의 RNA 전사 산물을 생성하는 데 사용된다. ds T7 프로모터가 형성 될 때만 전사 반응이 시작된다는 사실과 특정 DNA 주형을 설계하여 어떠한 RNA 전사 산물도 생성할 수 있기 때문에 T7 RNAP 기반 전사 시스템은 다양한 분자 진단 전략을 개발한다. 예를 들어, 등온 핵산 증폭 방법 (예: 롤링 서클 증폭, 지수 등온 증폭 및 닉킹 효소 보조 증폭) 및 라이트 업 RNA 앱타머(예: Malachite green, Spinach 및 Mango) T7 RNAP 기반 전사 시스템은 핵산 및 효소와 같은 표적 생체 분자에 대한 민감한 검출 전략을 개발한다.
T7 RNAP 기반 전사 시스템을 조사하고 전사 효율을 더욱 향상시키기 위해 다양한 연구가 이루어지고 있다. 1987 년에 연구자들은 T7 프로모터의 시작 영역에 있는 마지막 3 개의 염기 쌍이 전사 반응에 필요하지 않다는 것을 발견했으며, 따라서 20bp T7 프로모터가 시험관 내 T7 RNAP 기반 전사 시스템에 널리 사용되고 있다.
T7 RNA 중합 효소 (RNAP) 기반 전사 시스템은 시험관 내에서 수많은 RNA 전사 산물을 생성한다. 프로모터 길이가 전사 효율에 미치는 영향을 조사하고 전사 효율을 크게 증가시키는 새로운 12 bp 프로모터를 확인하였다. 인식 영역과 개시 영역을 모두 가지고있는 표준 20bp 프로모터와 달리, 새로운 프로모터는 인식 영역 만 포함하고 작은 크기로 인해 진단 응용에 더 적합하였다. 상기 프로모터는 또한 전사를 통해 다른 라이트 업 RNA 앱타머를 효과적으로 생산하였다. 프로모터를 사용하여 RNase H 활성을 분석하고 0.009 U/mL의 검출 한계를 달성했으며, 이는 이전 방법을 사용하여 달성된 것보다 훨씬 더 좋았다. 새로운 프로모터가 다양한 진단 응용 프로그램에서 핵심 구성 요소로 작용할 것이다.
이에 본 발명자들은, 프로모터의 길이에 따른 전사 효율을 조사한 결과, 프로모터의 인식 영역인 12bp 프로모터가 기존의 프로모터보다 전사 효율을 크게 증가시키고, 작은 크기로 진단 응용에 더 적합하며, 라이트 업 RNA 앱타머 및 RNase H 와 같은 sensitive biomolecular assays를 이용한 반응에서 뛰어난 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 11번 염기서열의 5' 말단 으로부터 3' 말단 방향으로 12개 내지 15개의 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는, 고효율의 발현 프로모터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 고효율 발현 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 효소 활성을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
(i) 상기 서술한 프로모터 서열을 포함하는 제 1의 프로브 및 제 1의 프로브와 상보적인 제 2 프로브을 결합하여 DNA-RNA duplex를 만드는 단계;
(ii) 상기 DNA-RNA duplex에 RNase H를 첨가하여 효소 반응을 수행하여 제 1 반응물을 생성하는 단계;
(iii) 상기 제 1 반응물에 RNase H inhibitor, T7 RNA polymerase 및 형광단을 첨가한 후에 전사 증폭(Transcription amplification)을 수행하는 단계; 및
(iv) 상기 RNA 증폭 산물의 형광 신호를 측정하는 단계.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 11번의 염기서열 이루어진 염기서열의 5'말단으로부터 3' 말단 방향으로 12개 내지 15개의 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는, 고효율의 발현 프로모터를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 고효율 발현 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 하기의 단계를 포함하는 효소 활성을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
(i) 상기 서술한 프로모터 서열을 포함하는 제 1의 프로브 및 제 1의 프로브와 상보적인 제 2 프로브을 결합하여 DNA-RNA duplex를 만드는 단계;
(ii) 상기 DNA-RNA duplex에 RNase H를 첨가하여 효소 반응을 수행하여 제 1 반응물을 생성하는 단계;
(iii) 상기 제 1 반응물에 RNase H inhibitor, T7 RNA polymerase 및 형광단을 첨가한 후에 전사 증폭(Transcription amplification)을 수행하는 단계; 및
(iv) 상기 RNA 증폭 산물의 형광 신호를 측정하는 단계.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 11번 염기서열의 5' 말단 으로부터 3' 말단 방향으로 12개 내지 15개의 연속된 뉴클레오타이드를 포함하는, 고효율의 발현 프로모터를 제공할 수 있다.
본 발명은 전사 효율이 개선된 신규한 프로모터에 관한 것이다. 기존의 T7 프로모터는 20bp이며, 이는 인식 영역 (recognition regions) 및 개시 영역(initiation regions)로 알려 있다 (도 1A). 이에 본원 발명자들은 T7 프로모터 길이가 전사 효율에 미치는 영향을 확인하기 위해 20pb부터 12bp까지 프로모터의 길이를 하나씩 줄여서 설계하였다 (도 1B). 각 프로모터를 이용하여 전사 반응에 이용한 결과, 인식 영역의 일부가 절단된 10-11 bp 프로모터의 경우 전사 효율이 원래 프로모터와 비슷하거나 낮았다. 17-19 bp의 프로모터의 전사 효율은 원래의 프로모터와 비슷하였으며, 개시 영역의 전사 시작 부위가 전사 효율에 약간의 영향을 미치는 것을 확인하였다. 풀림 영역(unwinding region)과 개시 영역의 전사 시작 부위가 절단된 12-16bp의 프로모터의 전사 효율은 원래의 20bp 프로모터보다 우수하였다. 도 1D에 표시된 기울기에 의해 계산된 전사 효율에서도 12-15 bp 프로모터가 가장 좋았다. 이를 통해 T7 프로모터의 인식 영역이 효과적인 T7 RNAP 기반 전사 반응의 핵심 요소임을 확인하였다 (도 1C 및 도 1D). 새로운 T7 프로모터 (12bp)를 사용하여 템플릿 DNA 서열이 전사 효율에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 2B에 나타난 결과와 같이 template DNA 염기 서열이 변경되거나 제거되었을 때 전사 반응이 현저하게 억제되었음을 보여 주며, 이는 프로모터 길이가 12bp로 단축 되더라도 시작 영역이 template DNA에서 유지되어야 함을 확인하였다.
T7 기반 전사 반응을 통한 라이트 업 RNA 앱타머를 생성하기 위해 다양한 템플릿 DNA를 설계하였다. 형광단 (각각 To1-biotin 및 DFHBI)과 상호 작용할 때 형광 강도를 증가시키는 것으로 알려진 두 가지 라이트 업 RNA 앱타머를 선택하였다. Mango 및 Spinach 앱타머을 이용하여 전사 반응을 수행한 결과, 새로운 T7 프로모터는 원래 프로모터보다 Mango(도 2C) 및 Spinach (도 2D) 앱타머를 더 효과적으로 생산하였다. 이를 통해 신규하고 더 짧은 프로모터가 원래의 프로모터를 대체하고 전사 효율성을 향상 시킬 수 있음을 확인하였다.
상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하고, 본 발명의 프로모터는 목적 유전자의 발현을 유도하여 목적 유전자를 고효율로 발현 시킬 수 있으며, 예를 들어 T7 프로모터, lac 프로모터, ara프로모터, trc 프로모터 및 Phce 프로모터로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 잇으며, 프로모터 바람직하게는 T7 프로모터일 수 있다.
본 발명의 일 양태로, 본 발명의 프로모터는 서열번호 11로 이루어진 염기서열의 5'말단으로부터 3' 말단 방향으로 12개 내지 15개의 연속된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 구체적으로 서열번호 11 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 프로모터 서열은 서열번호 20번으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 서열번호 20 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 서열번호 20번으로 표시되는 염기서열은 15 mer 미만으로 너무 짧아서 주형 DNA에 단단히 결합할 수 없기 때문에 서열번호 3의 염기서열과 같이 시퀀스를 추가하여 DNA 주형에 대한 부적절한 결합 가능성을 줄였다. 서열번호 20번으로 표시되는 염기서열은 실험에 적용될 때에는 서열번호 3의 염기 서열일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 3의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 프로모터 서열은 서열번호 21번으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 서열번호 21의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 서열번호 21번으로 표시되는 염기서열은 15 mer 미만으로 너무 짧아서 주형 DNA에 단단히 결합할 수 없기 때문에 서열번호 4의 염기서열과 같이 시퀀스를 추가하여 DNA 주형에 대한 부적절한 결합 가능성을 줄였다. 서열번호 21번으로 표시되는 염기서열은 실험에 적용될 때에는 서열번호 4의 염기 서열일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 4의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 프로모터 서열은 서열번호 22번으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 서열번호 22의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 서열번호 22번으로 표시되는 염기서열은 15 mer 미만으로 너무 짧아서 주형 DNA에 단단히 결합할 수 없기 때문에 서열번호 5의 염기서열과 같이 시퀀스를 추가하여 DNA 주형에 대한 부적절한 결합 가능성을 줄였다. 서열번호 22번으로 표시되는 염기서열은 실험에 적용될 때에는 서열번호 5의 염기 서열일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 프로모터 서열은 서열번호 6번으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 서열번호 6의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 T7 RNAP 기반 전사 시스템에 사용 될 수 있으며, 예를 들어, 등온 핵산 증폭 방법 (예: 롤링 서클 증폭, 지수 등온 증폭 및 닉킹 효소 보조 증폭) 또는 라이트 업 RNA 앱타머(예: Malachite green, Spinach 및 Mango) T7 RNAP 기반 시스템에 사용 될 수 있다.
본 발명은 상기 서술한 고효율 발현 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다. 상기 재조합 발현 벡터 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공할 수 있다. 상기 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다. 예로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 대장균 등의 곰팡이, 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용 될 수 있으며, 이는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 하기의 단계를 포함하는 효소 활성을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
(i) 상기 서술한 프로모터 서열을 포함하는 제 1의 프로브 및 제 1의 프로브와 상보적인 제 2 프로브을 결합하여 DNA-RNA duplex를 만드는 단계;
(ii) 상기 DNA-RNA duplex에 RNase H를 첨가하여 효소 반응을 수행하여 제 1 반응물을 생성하는 단계;
(iii) 상기 제 1 반응물에 RNase H inhibitor, T7 RNA polymerase 및 형광단을 첨가한 후에 전사 증폭(Transcription amplification)을 수행하는 단계; 및
(iv) 상기 RNA 증폭 산물의 형광 신호를 측정하는 단계.
발명에서 용어 "프로브(probe)"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 일반적으로 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double stranded DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 표지될 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 상기 제 1의 프로브는 서열번호 17의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 상기 제 2의 프로브는 서열번호 18의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 상기 형광단은 SYBR Green Ⅱ, 에티디움 브롬화물, 피코 그린, 아크리딘 오렌지, 티아졸 오렌지, YO-PRO-1, 크로모마이신 A3 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 SYBR Green Ⅱ일 수 있다.
T7 프로모터(12bp)를 포함하는 Pro 1 및 Pro 1을 상보적으로 결합하는 RNA 서열을 포함하는 pro 2를 설계하여 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스를 구성하였다. DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스에서 RNA 절단을 촉매하는 RNase H의 존재로 인해, Pro 1은 DNA에 결합할 수 있는 단일 가닥 (ss) 형태를 취하고 T7 RNAP가 많은 수의 RNA 전사 산물을 생산할 수 있다. SYBR green II의 시간에 따른 형광 반응을 측정하여 검출 가능성을 확인하였다. 도 4A 및 도 4B와 같이, 형광 신호는 주형 DNA가 없는 이중 나선의 DNA 프로브가 있을 때 RNase H의 존재와 관계없이 매우 약하였다. 반대로, 형광 신호는 주형 DNA를 포함하는 이중 나선의 DNA 프로브는 RNase H가 없을 때 약간 증가되었다. 가장 중요한 것은 이중의 DNA 프로브에서 Pro 2를 절단하여 Pro 1을 방출하는 RNase H의 존재가 형광 신호를 크게 증가 시켰다는 것이다. 형광 결과를 확인하기 위해 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 수행하였다. 도 4C에 표시된 결과와 같이 RNase H가 Pro 1 및 Pro 2 (레인 4 및 5)로 구성된 이중 나선의 DNA 프로브에서 RNA 서열의 절단을 촉진하였다. 겔 전기 영동 결과는 형광 결과와 일치하여 RNase H 활성 분석을 위한 새로운 프로모터로 사용할 수 있음을 확인하였다.
상기 전사 증폭(Transcription amplification) 은 등온 증폭 반응일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 상기 pro 1 또는 pro 2의 농도는 1 nM 내지 100nM일 수 있고, 바람직하게는 25 nM 내지 75nM일 수 있으며, 더 바람직하게는 50nM일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 상기 pro 1 및 pro 2 비율은 1:1 내지 1:4일 수 있으며, 바람직하게는 1:1 내지 1:2일 수 있으며, 더 바람직하게는 1:1 일 수 있다.
최적의 반응 조건에서 제안된 RNase H 활성 분석의 분석 성능을 평가하였다. DNA 프로브의 농도 (50 nM)와 DNA 프로브의 비율 (1:1)은 RNase H의 존재 하에서 가장 강한 형광 신호를 생성하였다 (도 5). 도 6A 및 도 6B와 같이, 본 발명은 0.015 U/mL ~ 0.1 U/mL의 농도 범위에서 우수한 선형 관계를 나타내었다. Exo I, Nt.AlwI, Lambda exo, DNase I, T4 PNK, hOGG 1 및 Hind III를 포함한 다양한 효소를 사용하여 본 발명의 시스템의 검출 선택성을 평가하였다. 도 6C 및 6D에 표시된 결과는 이러한 효소가 첨가되지 않은 대조군의 샘플과 유사한 형광 신호를 생성하였다. RNase H의 존재만이 강력한 형광 신호를 생성하여 상기 시스템이 RNase H에 대해 매우 특이적임을 확인하였다.
본 발명은 또한 상기 프로모터 서열을 이용하여 다양한 표적 바이오 마커를 고감도로 검출하는 방법을 제공할 수 있고, 바람직하게는, 상기 프로모터 서열을 이용하는 표적 물질을 고효율로 검출하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 프로모터는 전사 효율을 증가시켜, 표적 물질에 검출에 특이도와 민감도를 증가 시켜, 핵산 및 효소와 같은 표적 생체 분자의 검출 효율을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명의 고효율의 프로모터는 기존의 프로모터와 비교하여 전사 효율을 증가시키는 효과가 있고, 기존의 프로모터와 비교하여 더 짧은 길이를 가져 다양한 분석에 적용할 수 있는 효과가 있으며, 개선된 전사 성능으로 인하여 타겟 검출에 대해 높은 특이도와 민감도를 가지는 효과가 있다.
도 1은 T7 프로모터 길이가 전사 효율에 미치는 영향을 확인한 결과로서, (A)는 기존에 일반적으로 사용하는 T7 프로모터 서열이고, (B)는 본 발명에서 사용한 길이가 다른 T7 RNA 프로모터 (10-20bps) 및 템플릿 DNA 서열이고 (빨간색은 T7 프로모터를 나타냄), (C)는 다른 길이의 7 RNA 프로모터와의 전사 반응 동안 시간에 따른 형광 강도를 확인한 결과이며, (D)는 5분 전사 반응 전(FO) 및 5분 전사 반응 후(F)의 형광 강도를 측정한 후 이의 기울기를 (F-F0)/5분으로 계산한 결과이다. T7 RNA 프로모터와 주형 DNA의 최종 농도는 모두 50 nM이었다.
도 2는 새로운 T7 프로모터의 전사 효율 및 보편적 적용 가능성에 대한 템플릿 DNA 서열의 효과를 확인한 결과로서, (A)는 새로운 T7 프로모터 (12bp) 및 다른 템플릿 DNA 서열이고 (파란색은 주형 DNA에서 변경된 시퀀스를 나타냄), (B)는 5분 전사 반응 전(FO) 및 5분 전사 반응 후(F)의 형광 강도를 측정한 후 이의 기울기를 (F-F0)/5분으로 계산한 결과이며, (C) 전사 반응 후 Mango RNA 앱타머와 상호 작용하는 To1-biotin의 형광 신호의 증가 (△F)를 확인한 결과이며, (D)는 전사 반응 후 Spinach 앱타머와 상호 작용하는 DFHBI의 형광 신호 증가 (△F)를 확인한 결과이다. T7 RNA 프로모터와 주형 DNA의 최종 농도는 모두 50 nM이었다.
도 3은 전사 반응에 기초한 RNase H 활성 분석의 모식도이다.
도 4는 RNase 활성 분석의 가능성을 확인한 결과로서, (A)는 5분 전사 반응 전(FO) 및 5분 전사 반응 후(F)의 형광 강도를 측정한 후 이의 기울기를 (F-F0)/5분으로 계산한 결과이고 (Pro 1 (P1), Pro 2 (P2), 주형 DNA (T) 및 RNase H의 최종 농도는 각각 50 nM, 50 nM, 50 nM 및 1 U/mL임), (B)는 겔 전기 영동 분석 결과이다 (레인 1: Pro 1, 레인 2: Pro 2, 레인 3: 템플릿 DNA, 레인 4: Pro 1 + Pro 2, 레인 5: Pro 1 + Pro 2 + RNase H, 레인 6: Pro 1 + Pro 2 + 템플릿 DNA, 레인 7: Pro 1 + Pro 2 + 템플릿 DNA + RNase H, Pro 1, Pro 2, 주형 DNA 및 RNase H의 최종 농도는 각각 1μM, 1μM, 500nM 및 3 U/mL 이었음).
도 5는 RNase H 활성 분석을 위한 조건 최적화를 실험한 결과로서, (A)는 DNA 올리고 뉴클레오티드 농도의 최적화를 실험한 결과이고 (Pro 1, Pro 2 및 Template DNA의 비율은 1:1:1로 고정되었고, 올리고 뉴클레오티드의 최종 농도는 각각 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM이었고, RNase H의 최종 농도는 3 U/mL임), (B)는 Pro 1과 Pro 2의 비율 최적화를 실험한 결과로서(RNase H의 존재하에 30 분 전사 반응 후 형광 강도 (F RNase H), RNase H가 없을 때 30분 전사 반응 후 형광 강도(F blank) 및 T7 RNA 중합 효소와 RNase H가 모두 없는 상태에서 30 분 전사 반응 후의 형광 강도(F0)를 측정한 후 signal-to-noise(S/N)를 (F RNase H-F0)/(F blank-F0)로 계산하였고, 올리고 뉴클레오티드의 최종 농도는 50 nM이고, RNase H의 최종 농도는 1 U/mL이었음).
도 6은 RNase 활성 분석의 민감도 및 선택성을 확인한 결과로서, (A)는 다양한 농도 (0.015-1 U/mL)에서 RNase H의 존재 하에 시간 의존적 형광 반응을 확인한 결과이고, (B)는 5분 전사 반응 전(FO) 및 5분 전사 반응 후(F)의 형광 강도를 측정한 후 이의 기울기를 (F-F0)/5분으로 계산한 결과이고, (C)는 RNase H 및 기타 효소의 존재 하에서 시간 의존적 형광 강도를 확인한 결과이며, (D)는 5분 전사 반응 전(FO) 및 5분 전사 반응 후(F)의 형광 강도를 측정한 후 이의 기울기를 (F-F0)/5분으로 계산한 결과이다 (Pro 1, Pro 2 및 템플릿 DNA의 최종 농도는 각각 1μM, 1μM 및 500nM이었고, RNase H 및 기타 효소의 최종 농도는 각각 1 U/mL 및 10 U/mL이었음).
도 2는 새로운 T7 프로모터의 전사 효율 및 보편적 적용 가능성에 대한 템플릿 DNA 서열의 효과를 확인한 결과로서, (A)는 새로운 T7 프로모터 (12bp) 및 다른 템플릿 DNA 서열이고 (파란색은 주형 DNA에서 변경된 시퀀스를 나타냄), (B)는 5분 전사 반응 전(FO) 및 5분 전사 반응 후(F)의 형광 강도를 측정한 후 이의 기울기를 (F-F0)/5분으로 계산한 결과이며, (C) 전사 반응 후 Mango RNA 앱타머와 상호 작용하는 To1-biotin의 형광 신호의 증가 (△F)를 확인한 결과이며, (D)는 전사 반응 후 Spinach 앱타머와 상호 작용하는 DFHBI의 형광 신호 증가 (△F)를 확인한 결과이다. T7 RNA 프로모터와 주형 DNA의 최종 농도는 모두 50 nM이었다.
도 3은 전사 반응에 기초한 RNase H 활성 분석의 모식도이다.
도 4는 RNase 활성 분석의 가능성을 확인한 결과로서, (A)는 5분 전사 반응 전(FO) 및 5분 전사 반응 후(F)의 형광 강도를 측정한 후 이의 기울기를 (F-F0)/5분으로 계산한 결과이고 (Pro 1 (P1), Pro 2 (P2), 주형 DNA (T) 및 RNase H의 최종 농도는 각각 50 nM, 50 nM, 50 nM 및 1 U/mL임), (B)는 겔 전기 영동 분석 결과이다 (레인 1: Pro 1, 레인 2: Pro 2, 레인 3: 템플릿 DNA, 레인 4: Pro 1 + Pro 2, 레인 5: Pro 1 + Pro 2 + RNase H, 레인 6: Pro 1 + Pro 2 + 템플릿 DNA, 레인 7: Pro 1 + Pro 2 + 템플릿 DNA + RNase H, Pro 1, Pro 2, 주형 DNA 및 RNase H의 최종 농도는 각각 1μM, 1μM, 500nM 및 3 U/mL 이었음).
도 5는 RNase H 활성 분석을 위한 조건 최적화를 실험한 결과로서, (A)는 DNA 올리고 뉴클레오티드 농도의 최적화를 실험한 결과이고 (Pro 1, Pro 2 및 Template DNA의 비율은 1:1:1로 고정되었고, 올리고 뉴클레오티드의 최종 농도는 각각 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM이었고, RNase H의 최종 농도는 3 U/mL임), (B)는 Pro 1과 Pro 2의 비율 최적화를 실험한 결과로서(RNase H의 존재하에 30 분 전사 반응 후 형광 강도 (F RNase H), RNase H가 없을 때 30분 전사 반응 후 형광 강도(F blank) 및 T7 RNA 중합 효소와 RNase H가 모두 없는 상태에서 30 분 전사 반응 후의 형광 강도(F0)를 측정한 후 signal-to-noise(S/N)를 (F RNase H-F0)/(F blank-F0)로 계산하였고, 올리고 뉴클레오티드의 최종 농도는 50 nM이고, RNase H의 최종 농도는 1 U/mL이었음).
도 6은 RNase 활성 분석의 민감도 및 선택성을 확인한 결과로서, (A)는 다양한 농도 (0.015-1 U/mL)에서 RNase H의 존재 하에 시간 의존적 형광 반응을 확인한 결과이고, (B)는 5분 전사 반응 전(FO) 및 5분 전사 반응 후(F)의 형광 강도를 측정한 후 이의 기울기를 (F-F0)/5분으로 계산한 결과이고, (C)는 RNase H 및 기타 효소의 존재 하에서 시간 의존적 형광 강도를 확인한 결과이며, (D)는 5분 전사 반응 전(FO) 및 5분 전사 반응 후(F)의 형광 강도를 측정한 후 이의 기울기를 (F-F0)/5분으로 계산한 결과이다 (Pro 1, Pro 2 및 템플릿 DNA의 최종 농도는 각각 1μM, 1μM 및 500nM이었고, RNase H 및 기타 효소의 최종 농도는 각각 1 U/mL 및 10 U/mL이었음).
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 실험의 재료
모든 DNA 올리고뉴클레오타이드는 Integrated DNA Technologies (Coralville, USA)를 통해 합성하였다 (표 1). T7 RNA 중합 효소, Lambda Exonuclease (Lambda exo), Uracil-DNA Glycosylase (UDG), DNase I은 Enzynomics (대한민국 대전)에서 구입하였다. Nt. AlwI, Exonuclease I (Exo I), RNase H, T4 polynucleotide kinase (T4 PNK), Hind III 및 hOGG1은 New England Biolabs Inc. (MA, USA)에서 구입하였다. SYBR green II (10000 X)는 Thermo Fisher (MA, USA)에서 구입하였다. To1-biotin (DMF에 0.5mg/mL) 및 DFHBI (DMF에 20mg/mL)는 각각 Applied Biological Materials (Richmond, Canada) 및 Sigma Aldrich (MO, USA)에서 구입하였다. 모든 실험에는 Bioneer(대전)에서 구입한 Ultrapure DNase/RNase-free distilled water를 사용하였다.
실시예 2. T7 프로모터 길이가 전사 효율에 미치는 영향 확인
기존의 T7 프로모터는 20bp이며, 이 중 처음 12개 (-17에서 -6) 및 두 번째 8개 (-5에서 +3) bps는 각각 in vitro T7 RNAP 기반 전사 반응에 대한 인식 영역 (recognition regions) 및 개시 영역(initiation regions)로 알려 있다 (도 1A). T7 프로모터 길이가 전사 효율에 영향을 미친다는 가정을 바탕으로, 길이가 다른 T7 프로모터를 설계하여 전사 반응에 사용하였다. 50nM 템플릿 DNA, 50nM 프로모터 DNA, 1X T7 RNA 중합 효소 버퍼, 0.5mM rNTP, 16U RNase 억제제, 20U T7 RNA 중합 효소 및 1X SYBR green II을 포함하는 반응 샘플(총 20μL)을 제작하였다. RNase 억제제, T7 RNA 중합 효소 및 1X SYBR green II를 제외한 반응 샘플을 95℃에서 5 분 동안 가열하고 25℃ (0.1 ℃/s에서)로 천천히 냉각하고, 25 ℃에서 20 분 동안 배양하였다. RNase 억제제, T7 RNA 중합 효소 및 1X SYBR green II를 추가한 후 CFX connect real-time 시스템 (Bio-Rad, CA, USA)을 이용하여 37℃에서 전사 반응을 수행하였고, 형광 신호는 1 분마다 측정하였다.
도 1B과 같이 각 시퀀스의 이름은 T7 프로모터 길이를 기반으로 하였다. 15 mer 미만의 프로모터 길이는 너무 짧아 주형 DNA에 단단히 결합할 수 없기 때문에 최소 길이는 10-14 mer 프로모터에 추가 시퀀스를 추가하여 15 mer로 설정하여 DNA 주형에 대한 부적절한 결합 가능성을 줄였다. 도 1C 및 도 1D에 각각 표시된 시간에 따른 형광 반응과 이의 기울기를 보여준다. 인식 영역의 일부가 절단된 10-11 bp 프로모터의 전사 효율이 더 나쁘거나 원래 프로모터와 비슷하였다. 17-19 bp의 프로모터의 전사 효율은 원래의 것과 비슷하였으며, 개시 영역의 전사 시작 부위가 전사 효율에 약간의 영향을 미치는 것을 확인하였다. 대조적으로, 풀림 영역(unwinding region)과 개시 영역의 전사 시작 부위가 절단된 12-16bp의 프로모터의 전사 효율은 원래의 20bp 프로모터보다 우수하였다. 도 1D에 표시된 기울기에 의해 계산된 전사 효율은 12-15 bp (p> 0.05, 단방향 분산 분석 (ANOVA))로 일관되었다. 그 결과 더 짧은 길이의 프로모터가 더 적합하기 때문에 추가 조사를 위해 원래 보다 더 전사 효율이 나은 가장 짧은 프로모터 (12bp)를 선택하였다. T7 프로모터의 인식 영역이 효과적인 T7 RNAP 기반 전사 반응의 핵심 요소임을 확인하였다.
실시예 3. 템플릿 DNA 서열이 전사 효율에 미치는 영향
새로운 T7 프로모터 (12bp)를 사용하여 템플릿 DNA 서열이 전사 효율에 미치는 영향을 확인하였다. 도 2A와 같이 새로운 T7 프로모터에 상보적인 주형 DNA 서열은 유지되고 원래 T7 프로모터 (20bp)에 상보적인 DNA 서열은 변경되거나 단축되었다. 변경된 템플릿 1(CT1)은 퓨린 염기 (A 및 G)를 퓨린 염기로, 피리 미딘 염기 (C 및 T)를 피리 미딘 염기로 대체하여 설계하였고, 변경된 템플릿 2 (CT2)는 퓨린 염기를 피리 미딘 염기로 또는 그 반대로 대체하여 설계하였다 (표 1). 도 2B에 나타난 결과와 같이 template DNA 염기 서열이 변경되거나 제거되었을 때 전사 반응이 현저하게 억제되었음을 보여 주며, 이는 프로모터 길이가 12bp로 단축 되더라도 시작 영역이 template DNA에서 유지되어야 함을 확인하였다.
실시예 4. 새로운 T7 프로모터의 보편적인 적용 가능성
T7 기반 전사 반응을 통한 라이트 업 RNA 앱타머를 생성하기 위해 다양한 템플릿 DNA를 설계하였다. 형광단 (각각 To1-biotin 및 DFHBI)과 상호 작용할 때 형광 강도를 증가시키는 것으로 알려진 두 가지 라이트 업 RNA 앱타머를 선택하였다. 50nM 템플릿 DNA, 50nM 프로모터 DNA, 1X T7 RNA 중합 효소 버퍼, 0.5mM rNTP, 16U RNase 억제제 및 20U T7 RNA 중합 효소를 포함하는 반응 샘플(총 50μL)을 제작하였다. 효소를 제외한 반응 시료를 95℃에서 5분 동안 가열하고 25℃(0.1℃/s에서)로 서서히 냉각한 후 25℃에서 20분 동안 배양하였다. Mango 및 Spinach 앱타머 전사 반응을 37℃에서 각각 5분과 30분동안 수행한 후, To1-biotin (100nM)과 DFHBI (10μM)를 Mango 및 Spinach 샘플에 각각 첨가하였다. Spinach 앱타머 이후 Mango 앱타머보다 길어 전사 반응 시간이 5분에서 30분으로 연장되었다. 마지막으로 To1-biotin과 DFHBI의 형광 강도는 Spectra Max iD5 Multi-Mode Microplate Reader (CA, USA)에서 black 384-well HT plate (ref: 33384, Pocheon, Korea)를 사용하여 측정하였다. To1-biotin과 DFHBI의 여기 파장은 각각 507 nm와 454 nm였다. 도 2에서 To1-biotion과 DFHBI의 증가된 형광 강도에서 알 수 있듯이, 새로운 T7 프로모터는 원래 프로모터보다 Mango(도 2C) 및 Spinach (도 2D) 앱타머를 더 효과적으로 생산하였다. 상기의 결과는 새롭고 더 짧은 프로모터가 원래의 프로모터를 대체하고 전사 효율성을 향상 시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 5. 새로운 프로모터를 사용한 민감한 생체 분자 분석
도 3과 같이, Pro 1과 Pro 2로 구성된 이중 DNA 프로브가 설계되었다. Pro 1은 새로운 T7 프로모터(12bp)를 포함하도록 설계하였다. Pro 2는 Pro 1과 상보적으로 결합하며 RNA 서열을 포함하도록 설계하였다. DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스에서 RNA 절단을 촉매하는 RNase H의 존재로 인해, Pro 1은 DNA에 결합할 수 있는 단일 가닥 (ss) 형태를 취하고 T7 RNAP가 많은 수의 RNA 전사 산물을 생성할 수 있도록 하였다. SYBR green II의 시간에 따른 형광 반응을 측정하여 검출 가능성을 확인하였다.
50nM Pro 1 및 Pro 2 (표 S1), 50nM 템플릿 DNA, 1X T7 RNA 중합 효소 버퍼 및 0.5mM rNTP로 구성된 DNA 프로브를 포함하는 반응 샘플(총 20μL)을 제작하였다. 반응 샘플을 90℃에서 5분 동안 가열하고, 천천히 37℃ (0.1℃/s에서)냉각하고, 37℃에서 10분동안 배양하였다. 다른 농도와 다른 효소로 RNase H를 첨가 한 후, 반응 샘플을 37 ℃에서 30분 동안 배양 한 다음 65 ℃에서 20 분 동안 RNase H를 비활성화하였다. 16 U RNase 억제제, 20 U T7 RNA 중합 효소 및 1X SYBR green II를 반응 샘플에 추가하고 전사를 37 ℃에서 30 분 동안 CFX connect real-time 시스템 (Bio-Rad, CA, USA)에서 수행하였다. 형광 신호는 1 분마다 측정되었다. 도 4A 및 도 4B와 같이, 형광 신호는 주형 DNA가 없는 이중 나선의 DNA 프로브가 있을 때 RNase H의 존재와 관계없이 매우 약하였다. 반대로, 형광 신호는 주형 DNA를 포함하는 이중 나선의 DNA 프로브는 RNase H가 없을 때 약간 증가되었다. 가장 중요한 것은 이중의 DNA 프로브에서 Pro 2를 절단하여 Pro 1을 방출하는 RNase H의 존재가 형광 신호를 크게 증가 시켰다는 것이다.
형광 결과를 확인하기 위해 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 수행하였다. 반응 생성물은 20V의 일정한 전압에서 50 분 동안 1X TBE를 실행 완충액으로 사용하여 15 % (w/v) 폴리 아크릴 아미드 겔(polyacrylamide gel)에서 분리되었다. EZstain ?? DNA 로딩 염료 (Enzynomics, Cat. # B006)로 염색 한 후 FAS-Nano gel documentation system (Binsfelder, Germany)을 사용하여 겔 이미지를 얻었다. 도 4C에 표시된 결과는 RNase H가 Pro 1 및 Pro 2 (레인 4 및 5)로 구성된 이중 나선의 DNA 프로브에서 RNA 서열의 절단을 촉진하였음을 보여준다. 이는 이중 나선의 DNA 프로브에 해당하는 겔 밴드가 사라진 것으로 나타난다. Pro 1과 Pro 2는 보이지 않았다 (레인 1과 2). 짧은 ssDNA를 염색하는 데 효과적이지 않은 염색 염료의 특성에 때문이다. 이중 나선의 프로브에서 RNA 서열의 절단은 Pro 1과 주형 DNA로 구성된 고 분자량 생산물의 존재로 확인되었다. 여기서 Pro 1 (RNase H의 존재로 인한 ss 형태)은 주형 DNA (레인 6 및 7)에 결합되었다. 전반적으로 겔 전기 영동 결과는 형광 결과와 일치하여 RNase H 활성 분석을 위한 새로운 프로모터의 실현 가능성을 뒷받침하였다.
실시예 6. 분석적 성능
최적의 반응 조건에서 제안된 RNase H 활성 분석의 분석 성능을 평가하였다. DNA 농도 (50 nM)와 DNA 프로브의 비율 (1:1)은 RNase H의 존재 하에서 가장 강한 형광 신호를 생성하였다 (도 5). 선형 범위와 검출 한계를 찾기 위해 서로 다른 농도에서 RNase H의 존재 하에서 시간 의존적 형광 신호를 측정하였다. 도 6A 및 도 6B와 같이, 본 발명은 0.015 U/mL ~ 0.1 U/mL의 농도 범위에서 우수한 선형 관계를 나타내었다. LOD (3σ/S, 여기서 σ는 블랭크 샘플의 표준 편차이고 S는 선형 방정식의 기울기)는 약 0.009 U/mL로 추정되었으며, 이는 기존에 RNase H 검출 사용된 방법에 대해 보고된 것보다 훨씬 낮았다 (표 2). UDG, Exo I, Nt.AlwI, Lambda exo, DNase I, T4 PNK, hOGG 1 및 Hind III를 포함한 다양한 효소를 사용하여 본 발명의 시스템의 검출 선택성을 평가하였다. 도 6C 및 6D에 표시된 결과, RNase H의 존재만이 강력한 형광 신호를 생성하여 상기 시스템이 RNase H에 대해 매우 특이적임을 보여준다.
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<213> Artificial Sequence
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<223> 10 bp promoter
<400> 1
cttcctaata cgact 15
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 11 bp promoter
<400> 2
ttcctaatac gactc 15
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 12 bp promoter
<400> 3
tcctaatacg actca 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 13 bp promoter
<400> 4
tctaatacga ctcac 15
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<213> Artificial Sequence
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ttaatacgac tcact 15
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<213> Artificial Sequence
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<223> 15 bp promoter
<400> 6
taatacgact cacta 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 8
taatacgact cactata 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18 bp promoter
<400> 9
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 11
taatacgact cactataggg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Template DNA
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gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattagga 60
aggaggg 67
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<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Changed Template 1 (CT1)
<400> 13
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc cgcgatgagt cgtattagga 60
aggaggg 67
<210> 14
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Changed Template 2 (CT2)
<400> 14
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc atatctgagt cgtattagga 60
aggaggg 67
<210> 15
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Shortened Template (ST)
<400> 15
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tgagtcgtat taggaaggag 60
gg 62
<210> 16
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Template DNA for Spinach aptamer
<400> 16
gggagctcac actctactca acagcgcgaa cgctggaccc gtccttctcc cgccctatag 60
tgagtcgtat taggaaggag gg 82
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro 1 for RNase H activity assay
<400> 17
gccctaatac gactca 16
<210> 18
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pro 2 for RNase H activity assay
<400> 18
tgagtrcrgr uraruruagg gc 22
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Template DNA for RNase H activity assay
<400> 19
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtatta 57
<210> 20
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 promoter recognition regions
<400> 20
taatacgact ca 12
<210> 21
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 promoter 13 bp promoter site
<400> 21
taatacgact cac 13
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 promoter 14 bp promoter site
<400> 22
taatacgact cact 14
Claims (12)
- 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 뉴클레오타이드로 이루어진, 고효율의 발현 프로모터.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항의 고효율 발현 프로모터를 포함하는, 재조합 벡터.
- (i) 제 1항의 프로모터 서열을 포함하는 제 1의 프로브 및 제 1의 프로브와 상보적인 제 2의 프로브를 결합하여 DNA-RNA duplex를 만드는 단계;
(ii) 상기 DNA-RNA duplex에 RNase H를 첨가하여 효소 반응을 수행하여 제 1 반응물을 생성하는 단계;
(iii) 상기 제 1 반응물에 RNase H inhibitor, T7 RNA polymerase 및 형광단을 첨가 후에 Transcription amplification (전사 증폭)을 수행하는 단계; 및
(iv) 상기 RNA 증폭 산물의 형광 신호를 측정하는 단계;
를 포함하는 효소 활성을 분석하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 7항에 있어서, 상기 제 1의 프로브 및 제 2의 프로브의 농도는 1 nM 내지 100nM인, 효소 활성을 분석하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 제 1의 프로브 1 및 제 2의 프로브 2의 비율은 1:1 내지 1:4인, 효소 활성을 분석하는 방법.
- 제 1항의 프로모터 서열을 이용하여 다양한 표적 바이오 마커를 고감도로 검출하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200183920A KR102561831B1 (ko) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | 전사 효율이 개선된 새로운 프로모터 및 이를 이용한 효소 활성 분석 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200183920A KR102561831B1 (ko) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | 전사 효율이 개선된 새로운 프로모터 및 이를 이용한 효소 활성 분석 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220092290A KR20220092290A (ko) | 2022-07-01 |
| KR102561831B1 true KR102561831B1 (ko) | 2023-07-28 |
Family
ID=82397169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200183920A KR102561831B1 (ko) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | 전사 효율이 개선된 새로운 프로모터 및 이를 이용한 효소 활성 분석 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102561831B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012174271A2 (en) | 2011-06-16 | 2012-12-20 | The Regents Of The University Of California | Synthetic gene clusters |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020190061A1 (ko) * | 2019-03-19 | 2020-09-24 | 한국생명공학연구원 | 전사 시스템 기반 고감도 센서 |
-
2020
- 2020-12-24 KR KR1020200183920A patent/KR102561831B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012174271A2 (en) | 2011-06-16 | 2012-12-20 | The Regents Of The University Of California | Synthetic gene clusters |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIORXIV PREPRINT DOI: HTTPS://DOI.ORG/10.1101/619395(2019.04.29.) 1부.* |
| JOURNAL OF MOLECULAR EVOLUTION,제88권,179-193면(2019.12.21) 1부.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220092290A (ko) | 2022-07-01 |
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
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| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
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