KR102561563B1 - 암 환자 시료로부터 cd45 양성 및 cd45 음성 발현 세포의 분리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD45 양성 및 CD45 음성 발현 세포의 분리 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리법을 이용하는 경우, CD45-양성 및 CD45-음성 세포를 효과적으로 분리해 낼 수 있고, 분리된 세포를 배양시 생존율이 매우 높아, 질병 진행 기전과 치료 효과 연구, 항암제, 또는 면역세포치료제 스크리닝에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

암 환자 시료로부터 CD45 양성 및 CD45 음성 발현 세포의 분리 방법 {Method for isolating CD45 positive and CD45 negative expressing cells from cancer patient sample}

본 발명은 암 환자 시료로부터 CD45 양성 및 CD45 음성 발현 세포의 분리 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 퍼콜 농도구배 원심분리법을 개량하여 CD45 양성 및 CD45 음성 발현 세포 분리 효과가 개선된 CD45 양성 및 CD45 음성 발현 세포의 분리 방법에 관한 것이다.

종양조직 생검에서 분리될 수 있는 소량의 세포로부터 여러 악성 선암종을 연구하는데에는 어려움이 있다.

선암종에 대한 모델로는 2차원(2D)과 3차원(3D) 세포 배양 시스템뿐만 아니라, 환자 유래 암 조직을 마우스에 이종 이식하는 이종 이종 이식 모델(PDX)이 포함된다(Sci Rep 2016; 6:28951). 환자에서 유래한 종양 세포는 원래 종양과 가장 가까운 물질의 근원으로 여겨진다. 따라서 종양 생검에서 분리된 환자 유래 세포는 체외종양 모델에서 질병 진행을 추적하고 항암 치료를 위한 스크리닝에 사용될 수 있으며, 정밀 의학 응용을 위한 이상적인 플랫폼으로 사용될 수 있다. 특히 PDX 모델은 치료용 화합물이 임상적으로 관련 용량(CRD)으로 테스트 될 때 기존의 세포주 유래 이종 이식(CDX) 모델과 비교하여 임상 결과를 더 잘 예측하는 것으로 나타났다 (Clin Cancer Res 2012; 18:5160-2; Cancer Res 2014; 74:6980-90; Nat Rev Clin Oncol 2012; 9:338-50). 그러나, 생착(engraftment)과 종양 성장률은 적절한 치료방법을 결정하기 위한 환자의 화학 감수성을 적시에 평가하는데 장애 요소가 된다. 또한 PDX 종양은 대개 생검 또는 절제된 1차 종양에서 획득되지만, 이 물질은 종종 가용성이 제한되거나 세포 활력이 적절하게 보존되지 않아 생착률이 낮은 한계가 있다. 화학 감수성 연구를 위해서는 종양 세포의 대체 공급원이 매우 필요하다.

악성 흉수(MPE)는 흉강에 악성 세포나 면역 세포를 포함하는 삼출물(exudate)이 상당히 축적된 것으로 정의된다. 악성흉수는 호흡곤란, 통증, 악액질(cachexia) 및 신체활동 감소를 유발할 수 있는 심각한 의학적 질환이다. 악성 흉수는 대부분 말기 상피암에서 흔히 발생한다. 폐암과 유방암 환자에서 주로 발생하지만, 악성 흉수는 췌장암, 난소암, 위, 식도암 환자에서도 발생한다. 악성 흉수는 암 세포뿐만 아니라 다양한 림프구와 골수 하위 집합으로 대표되는 많은 수의 면역 세포를 포함한다. 흉막의 직접적인 관여는 투과성이 높아진 흉막 전이, 흉막 림프관의 폐색에 의한 흉막 전이, 중흉막 림프절 관여, 흉관 폐쇄, 기관지 폐색, 심막 관여 등과 같은 여러 메커니즘에 의한 것이다. 악성 종양의 간접 흉막 침범으로 저단백혈증, 폐쇄성 폐렴 또는 폐색전증에서 이차적으로 발생할 수 있다.

이러한 악성 흉수는 폐 선암종의 예후에 대한 정보를 제공하는 액체 생검의 역할을 할 수 있다. 악성 흉수 샘플은 폐 선암종에 존재하는 이질성을 나타내는 많은 유형의 세포를 포함하고 있다. 따라서 악성흉수 샘플은 질병 진행을 감시하고, 치료 효과를 연구하며, 미래의 정밀 의학에 응용하기 위한 더 나은 폐암 모델을 제공할 수 있는 플랫폼으로 활용될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 폐 선암종 환자들의 악성 흉수 액상 시료에서 퍼콜 농도구배 원심분리법을 개량하여 기존 방법보다 고순도의 CD45-양성(CD45^pos) 및 CD45-음성(CD45^neg) 세포를 효과적으로 분리해 낼 수 있었으며, 이를 3D 모델 시스템(오가노이드)으로 배양한 결과, 분리된 CD45^neg 세포가 높은 생존율을 나타내어, 본 발명이 질병 진행 기전과 치료 효과 연구 및 항암제 스크리닝에 적합한 모델 시스템을 제공할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 목적은 암 환자로부터 분리된 조직 및 액상 시료에서 고순도의 CD45-양성(CD45^pos) 및 CD45-음성(CD45^neg) 세포를 효과적으로 분리하는 방법을 제공하고, 이와 같은 방법으로 분리된 세포를 배양하여 질병 진행 기전과 치료 효과 연구 및 항암제 스크리닝에 적합한 모델 시스템을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퍼콜 상부 용액과 퍼콜 하부 용액을 포함하는 퍼콜 농도구배 용액을 이용하여 생체 시료로부터 CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 방법으로서,

상기 퍼콜 상부 용액은 38 내지 42% (w/v) 퍼콜 용액이고, 상기 퍼콜 하부 용액은 70 내지 80% (w/v) 퍼콜 용액인 것을 특징으로 하는, CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 퍼콜 용액은 퍼콜을 행크 평형염액(Hank's balanced salt solution)과 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 퍼콜 용액은 퍼콜을 행크 평형염액과 혼합한 후, 우태아 혈청 및 EDTA를 포함하는 PBS를 이용하여 각각 퍼콜 상부 용액과 퍼콜 하부 용액을 제조하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 생체 시료는 암 환자로부터 분리된 시료인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 암 환자로부터 분리된 시료는

(i) 세포 또는 조직 시료 또는

(ii) 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 흉수 및 복수로 구성된 군으로부터 선택되는 액체 시료인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 분리된 시료는 상기 퍼콜 하부 용액에 단일세포로 현탁시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 세포가 현탁된 퍼콜 하부 용액에 상기 퍼콜 상부 용액을 첨가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 세포가 현탁된 퍼콜 하부 용액에 상기 퍼콜 상부 용액이 첨가되어 있는 퍼콜 농도구배 용액을 원심분리하여 CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 퍼콜 농도구배 용액은 상온에서 600 내지 1000g로 5 내지 40분간 원심 분리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 퍼콜 상부 용액과 퍼콜 하부 용액 사이에서 CD45^pos 세포의 분리 및/또는 상기 퍼콜 상부 용액 상단에서 CD45^neg 세포를 분리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 38 내지 42% (w/v) 퍼콜 용액 (퍼콜 상부 용액); 및

70 내지 80% (w/v) 퍼콜 용액 (퍼콜 하부 용액);을 포함하는, CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포 분리용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 분리된 CD45^neg 세포가 배양된 CD45^neg 세포 배양물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 CD45^neg 세포 배양물은 항암제 감수성 스크리닝용인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 항암제는 개인 맞춤형 항암제인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 분리된 CD45^pos 세포가 배양된 CD45^pos 세포 배양물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 CD45^pos 세포 배양물은 면역관문억제제 및/또는 면역세포치료제의 효능 검사용인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 CD45^neg 또는 CD45^pos 배양물은 2D 또는 3D 세포 배양물인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 분리된 CD45^neg 세포 및/또는 CD45^pos 세포가 이식되어 있는 환자 파생 이식물(Patient Derived Xenograft, PDX)을 제공한다.

본 발명에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리법을 이용하는 경우, 고순도의 CD45-양성 및 CD45-음성 세포를 효과적으로 분리해 낼 수 있고, 분리된 세포를 배양시 생존율이 매우 높아, 질병 진행 기전과 치료 효과 연구 및 항암제 스크리닝에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 악성흉수로부터 각각 종래 퍼콜 농도구배 원심분리법(A)과 본 발명에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리법(B)에 의해 세포를 분리하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 각각 종래 퍼콜 농도구배 원심분리법(A)과 본 발명에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리법(B)에 의해 얻어진 CD45^pos 및 CD45^neg 세포 분획을 보여준다.
도 3은 유세포 분석을 통하여 악성흉수에서의 CD45^pos 및 CD45^neg 세포의 분포 정도(A), 종래 퍼콜 농도구배 원심분리법(B) 및 본 발명에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리법(C)에 의해 상층 퍼콜의 상부(Top layer)에서 분리된 샘플 및 두 퍼콜 층 사이(Middle layer)에서 분리된 샘플 내 CD45^pos 및 CD45^neg 세포의 분포를 보여준다.
도 4는 종래 퍼콜 농도구배 원심분리법에 의해 분리된 CD45^neg 세포(A)와 본 발명에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리법에 의해 분리된 CD45^neg 세포(B)의 생존력을 비교한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

악성흉수(MPE)는 비소세포 폐암(NSCLC)의 합병증으로, 악성흉수가 발생하면 삶의 질을 심각하게 제한하고 예후가 좋지 않다. 이는 염증, 혈관신생 촉진, 혈관 누수 등 다양한 과정이 복합적으로 작용해 발생하는 질병 전이의 징후이다.

악성흉수가 발생하는 질병은 상대적으로 높은 종양 부담과 약물 내성 때문에 보통 치료 반응이 좋지 않아, 이러한 공격적인 질병들에 대한 개별화된 접근법에 기초한 새로운 치료 전략을 필요로 한다. 따라서 환자 맞춤형 화학 감응도 분석을 수행하기 위해서는 환자 유래 암세포의 초기 모집단의 확대가 필요하다.

본 발명에서는 이와 같이 환자 맞춤형 약물 스크리닝 등에 적합하도록 악성 흉수로부터 CD45^pos 및 CD45^neg 세포의 분리 효율을 향상시키고, 분리된 CD45^pos 및 CD45^neg 세포의 우수한 생존력을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 고순도의 CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 퍼콜 상부 용액과 퍼콜 하부 용액을 포함하는 퍼콜 농도구배 용액을 이용하여 생체 시료로부터 CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 방법으로서, 상기 퍼콜 상부 용액은 38 내지 42% (w/v) 퍼콜 용액이고, 상기 퍼콜 하부 용액은 70 내지 80% (w/v) 퍼콜 용액인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 퍼콜 용액은 퍼콜을 행크 평형염액(Hank's balanced salt solution)과 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 다른 양태로서, 0.9%의 식염(NaCl)이 포함된 식염수 및 인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline, PBS) 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 퍼콜 용액은 퍼콜을 행크 평형염액과 혼합한 후, 우태아혈청 및 EDTA를 포함하는 PBS를 이용하여 각각 퍼콜 상부 용액과 퍼콜 하부 용액을 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생체 시료는 암 환자로부터 분리된 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 암 환자로부터 분리된 시료는

(i) 세포 또는 조직 시료 또는

(ii) 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 흉수 및 복수로 구성된 군으로부터 선택되는 액체 시료인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 생체 시료는 일 양태로서 바람직하게는 악성 흉수일 수 있으며, 바람직한 다른 양태로서, 악성 흉수로부터 분리된 세포일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 악성 흉수는 10 내지 100㎛ 세포 스트레이너로 스트레인 후 원심분리하는 것이 바람직하다.

상기 원심분리는 상온에서 300 내지 600 g로 5 내지 20분간 원심분리하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 400 내지 500g로 약 10분간 원심분리하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 분리된 시료는 상기 퍼콜 하부 용액에 단일 세포로 현탁시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이후 상기 세포가 현탁된 퍼콜 하부 용액에 상기 퍼콜 상부 용액을 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포가 현탁된 퍼콜 하부 용액에 상기 퍼콜 상부 용액이 첨가되어 있는 퍼콜 농도구배 용액은 이후 원심분리하여 CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이 경우, 상기 퍼콜 농도구배 용액은 상온에서 600 내지 1000g, 바람직하게는 700 내지 900g, 더 바람직하게는 750 내지 800g, 가장 바람직하게는 약 780g로, 5 내지 40분간, 바람직하게는 10 내지 30분간, 더 바람직하게는 15 내지 25분간, 가장 바람직하게는 약 20분간 원심분리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 상온은 20 내지 30℃일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 퍼콜 상부 용액과 퍼콜 하부 용액 사이에서 CD45^pos 세포를 분리 및/또는 상기 퍼콜 상부 용액 상단에서 CD45^neg 세포를 분리하는 것을 특징으로 할 수 있다.

바람직한 하나의 양태로서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 방법으로 제공될 수 있다:

(a) 퍼콜(d=1.130 g/㎖)과 행크 평형염액(Hank's balanced salt solution)을 혼합하여 90% 퍼콜 용액을 제조하는 단계;

(b) 상기 90% 퍼콜 용액에 버퍼 1 (10% Tarea bovine serum + 100 uM EDTA in PBS)을 혼합하여 각각 40% 및 75% 퍼콜 용액을 제조하는 단계;

(c) 악성 흉수로부터 분리된 세포를 상기 75% 퍼콜 용액에 현탁시키는 단계;

(d) 상기 세포가 현탁된 75% 퍼콜 용액 상단에 40% 퍼콜 용액을 첨가하는 단계; 및

(e) 상기 40% 퍼콜 용액이 상단에 첨가되고 상기 세포가 현탁된 75% 퍼콜 용액이 하단에 위치하는 퍼콜 농도구배 용액을 원심분리하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 (f) 40% 퍼콜 용액과 75% 퍼콜 용액 사이에서 CD45^pos 세포를 분리 및/또는 상기 40% 퍼콜 용액 상단에서 CD45^neg 세포를 분리하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 양태로서, 38 내지 42% (w/v) 퍼콜 용액 (퍼콜 상부 용액); 및 70 내지 80% (w/v) 퍼콜 용액 (퍼콜 하부 용액);을 포함하는, CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포 분리용 키트를 제공할 수 있다.

상기 키트는 상기 퍼콜 상부 용액 및 퍼콜 하부 용액을 제조하기 위한, 행크 평형염액, 우태아혈청, EDTA 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 시약을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 퍼콜 용액을 희석하기 위한 PBS에는 FBS 및/또는 EDTA를 첨가할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 FBS는 PBS에 1 내지 20%, 바람직하게는 5 내지 15%, 더 바람직하게는 약 10%로 첨가될 수 있으며, 이는 세포 분리시 PBS를 단독으로 사용하는 것에 비해 세포 생존률을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 EDTA는 10 내지 1000 μM, 바람직하게는 50 내지 500 μM, 가장 바람직하게는 약 100 μM로 첨가될 수 있으며, 이는 세포를 단일세포로 분리하는데 유용하다.

상기 키트는 또한, 상기 퍼콜 상부 용액 및 퍼콜 하부 용액에 적절히 샘플을 첨가하여 원심분리하기에 적절한 용기, 예컨대, 1.5 ml 에펜도르프 튜브, 15ml 코니칼 튜브 또는 50ml 코니칼 튜브 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 키트는 또한, 본 발명에 따른 CD45^pos 및 CD45^neg 세포의 분리를 위하여 적합한 실험 방법을 기재한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.

한편, 환자 유래 오가노이드(PDO)는 최근 폐 선암종 분야에서 잠재적으로 가장 강력한 연구 도구로 예견되고 있다. 그러나, 환자 유래 오가노이드는 배양 과정에서 종양 세포 생존율이 저조한 문제점이 있었는데, 본 발명에서는 CD45^pos 세포에 의해 종양 세포의 사멸이 증가한다는 것을 확인하고, 환자에서 유래한 종양세포를 보존하고 증식하기 위해 CD45^pos 세포를 분리한 CD45^neg 세포만 배양하는 경우 CD45^neg 세포 생존율이 현저히 증가되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기 방법에 의해 분리된 CD45^neg 세포가 배양된 CD45^neg 세포 배양물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 CD45^neg 세포 배양물은 항암제 감수성 스크리닝용인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 CD45^neg 세포 배양물은 선암종 항암제 스크리닝용인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 그 밖에도 다양한 질환 연구 및 약물의 치료 효과 연구, 기타 상기 CD45^neg 세포가 분리된 개체가 가지는 질환에 적합한 약물을 스크리닝 하는 등에도 활용이 가능할 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 구강암, 간암,　위암, 결장암, 유방암,　폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부암, 자궁경부암,　난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease),　식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 CD45^neg 세포 배양물은 특히, 상기 CD45^neg 세포가 분리된 개체가 가지는 암에 효과적인 항암제를 스크리닝하는데 적합할 수 있으며, 따라서 상기 항암제는 개인 맞춤형 항암제인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 분리된 CD45^pos 세포가 배양된 CD45^pos 세포 배양물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 CD45^pos 세포 배양물은 면역관문억제제 및/또는 면역세포치료제의 효능 검사용인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 ㅇ낳는다.

본 발명에 있어서, 상기 CD45^neg 또는 CD45^pos 배양물은 2D 또는 3D 세포 배양물인 것을 특징으로 할 수 있다.

일 양태로서, 상기 배양물은 오가노이드 일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "오가노이드"은 원상태 기관 내에 존재하는 세포성 자가-구조화, 구조 및 신호전달 상호작용의 측면의 개요를 말하는 세포의 이종성 3D 응집을 의미한다. 용어 "오가노이드"는 서스펜션 세포 배양물로부터 형성된 오가노이드 또는 세포 클러스터를 포함한다.

본 발명은 다른 양태로서, 상기 방법에 의해 분리된 CD45^neg 세포 및/또는 CD45^pos 세포가 이식되어 있는 환자 파생 이식물(Patient Derived Xenograft, PDX)의 형태로 제공될 수 있다.

예컨대, 상기 방법에 의해 분리된 CD45^neg 및/또는 CD45^pos 세포는 마우스에 이식되어 질환의 발병 기전, 약물의 치료 효과 연구, 기타 상기 CD45^neg 및/또는 CD45^pos 세포가 분리된 개체가 가지는 질환에 적합한 약물을 스크리닝하는데 활용될 수 있다.

본 발명은 악성흉수에서 CD45^pos와 CD45^neg 세포를 분리하는데 종래 44% 및 67% 퍼콜 농도구배 원심분리법이 가지는 문제점을 해결하기 위하여 개발된 것으로, 40% 및 75% 퍼콜 농도구배 원심분리법은 종래 퍼콜 농도구배 원심분리법의 낮은 CD45^pos와 CD45^neg 세포 분리 효율을 현저히 개선한다. 더욱이 분리 후 CD45^pos 세포는 액체 일산화질소에 새로이 저장될 수 있으며, 향후 CD45^neg 세포와 공동 배양하여 면역 검사 억제제를 포함한 화학 민감도 검사나 면역 요법에 사용될 수 있다. 요약하면, 악성흉수에서 유래한 세포의 분리를 위한 본 발명은 클론 확장이나 TCR 엔지니어링 없이 화학 민감도 측정 또는 면역 요법에 유용한 방법일 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1. 세포 분리 및 배양

악성흉수 샘플은 서울 성모병원(가톨릭대)에서 폐 선암종 진단을 받은 환자의 동의를 얻어 수득하였으며, 각각 1×10⁷ 개의 세포를 수득할 수 있는 40 ~ 60㎖의 체액을 이용하였다. 샘플을 50㎖ 원심분리 튜브에 담아 실온에서 10분간 440g로 원심분리한 후 advanced dulbecco's modified eagle medium: nutrient mixture F-12 medium로 2회 세척하였다. 세포는 하기에 서술되는 퍼콜 농도구배(Percoll-gradient) 원심분리 절차에 따라 세척되었다.

실험예 2. 악성흉수 유래 CD45 ^pos 와 CD45 ^neg 세포의 분리 효과가 개선된 퍼콜 농도구배 원심분리법의 개발

흉수는 암 환자에게 효과적인 항암제를 선택하는데 유용한 재료로 활용될 수 있으나, 흉수에는 면역세포와 암세포가 섞여 있어 암 환자에 대한 보다 효과적인 항암제를 예측하는데 장애 요소 또한 가지고 있다. 따라서 폐암 환자의 흉수로부터 종양세포와 면역세포를 효과적으로 분리하기 위하여 이전에 보고된 암 조직으로부터 종양세포와 면역세포를 분리하는 퍼콜 농도구배 원심분리 방법을 개선하고자 본 발명을 개발하였으며, 이하 두 방법의 효과를 비교하였다.

2-1. 퍼콜 농도구배 (44%/67%) 원심분리법 (비교예)

종래 알려진 퍼콜 농도구배 원심분리는 종양 조직으로부터 림프구 및 기타 세포를 분리하는 데 유용한 방법으로 알려져 있다 (Oncol Rep 2013, 30:1143-1148; Methods Mol Biol 2014, 1169:175-179; Methods Mol Biol 2019, 1884:189-202).

선행 문헌(Methods Mol Biol 2014, 1169:175-179)에서는 44%와 67% 퍼콜(Percoll) 용액이 종양 조직에서 종양 내 백혈구(intratumoral leukocyte)를 보다 효과적으로 분리한다고 제안하고 있다. 상기 방법이 악성흉수로부터 종양 세포를 포함하는 CD45^neg 세포와, 백혈구를 포함하는 CD45^pos의 분리에 유용한지 여부를 시험하고자, 퍼콜 농도구배 원심분리를 위하여 적절한 양의 퍼콜(d=1.130 g/㎖, GE healthcare)을 PBS에 혼합하여 각각 44% 및 67% 퍼콜 용액을 제조하였다. 44% 퍼콜 용액 9㎖을 50㎖ 원심분리 튜브에 넣고 67% 퍼콜 용액 6㎖으로 언더링하였다. 마지막으로 암조직에서 얻은 세포를 5㎖의 PBS에서 단일세포로 재현탁시킨 후, 단일 세포 현탁액을 상층부에 추가하여 4℃에서 30분간 800 g로 원심분리하였다(도 1a). 원심분리 결과, 두 퍼콜 층의 사이에서 세포층이 발견되었다 (도 2a).

2-2. 퍼콜 농도구배 (40%/75%) 원심분리법 (실시예 1)

이와 같은 문제를 해결하기 위하여, 적정량의 퍼콜(d=1.130 g/㎖)과 Hank's balanced salt solution (HBSS; 페놀 레드) 을 혼합하여 90% 퍼콜 용액을 준비하였다. 퍼콜 농도구배 원심분리의 경우, 퍼콜 90% (d=1.130 g/㎖)와 버퍼 1 (10% Fetal bovine serum (FBS) + 100 uM EDTA in PBS)을 적절히 혼합하여 40% 및 75% 퍼콜 용액을 제조하였다. 악성흉수는 70㎛ 세포 스트레이너(cell strainer)로 스트레인 후, 실온에서 10분 동안 440g로 원심분리하고, 세포 펠릿을 RPMI 배지로 세척하였다. 스핀 다운 후 세포 펠릿을 단일 세포로 75% 퍼콜 용액 5㎖에 재현탁하여 15㎖ 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 40% 퍼콜 용액 5㎖을 75% 퍼콜 용액 위에 부드럽게 첨가한 후 상온에서 20분간 780g로 원심분리하였다(도 1b).

이와 같은 방법으로 두 퍼콜 층 사이에서와 40% 퍼콜 용액 상층에서 세포층을 확인할 수 있었다. 그러나, 퍼콜 상층 및 퍼콜 하층에서는 어떠한 세포도 확인되지 않았다 (도 2b).

실험예 3. 종래 퍼콜 농도구배 원심분리 방법과 본 발명 퍼콜 농도구배 원심분리 방법에 따른 CD45 ^pos 와 CD45 ^neg 세포의 분리 효과 비교

실험예 2에서 제조된 실시예 1과 유사한 방법으로, 퍼콜 농도구배를 각각 38%/70%(실시예 2), 38%/80%(실시예 3), 42%/70%(실시예 4), 42%/80%(실시예 5)로 달리하여 추가 실시예 샘플을 제작하였다.

유세포 분석을 통하여 종래 퍼콜 농도구배 원심분리 방법과 본 발명에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리 방법에 의해 분리된 세포를 식별하고자 하였다.

이를 위하여 세포는 1% FBS를 포함하는 PBS에서 APC 결합된 anti-CD3 항체 및 FITC 결합된 anti-CD45 항체로 30분간 4℃에서 인큐베이션하였다. 세척후, BD FACS Canto Ⅱ를 이용하여 유세포 분석하고 데이터 분석을 수행하였다.

그 결과, 종래 퍼콜 농도구배 원심분리 방법에서는 상층 퍼콜의 상부(Top layer)와 퍼콜 층 사이(Middle layer)에서 세포층이 확인되었으나, 각 세포층에서 CD45^pos 및 CD45^neg 세포가 명확하게 분리되지 않는 것으로 나타났다(도 3b). 반면, 본 발명에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리 방법을 이용하는 경우, 두 퍼콜 층(퍼콜 상부 용액 및 퍼콜 하부 용액) 사이에서 CD45^pos가, 퍼콜 상부 용액(38~42% 퍼콜)의 상부에서 CD45^neg가 명확하게 분리되는 것을 확인할 수 있었다 (도 3c).

실시예 4. 종래 퍼콜 농도구배 원심분리 방법과 본 발명 퍼콜 농도구배 원심분리 방법에 따라 분리된 CD45 ^neg 세포의 생존력 비교

종래 퍼콜 농도구배 원심분리 방법과 본 발명(실시예 1)에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리 방법에 의해 분리된 CD45^neg 세포의 생존력을 비교하였다.

이를 위하여 상기 두 방법에 따른 각각 44% 또는 40% 퍼콜 층 상부에서 회수된 세포를 RPMI 배지로 세척하고, 70% 마트리겔 (미국 Corning 사, 354230)에서 3.3 × 10⁷ cell/㎖로 재현탁시켜 3D 배양하였다. 세포를 4-웰 TCP 플레이트(미국 Thermo 사)의 각 웰에 30 ㎕의 젤로 분주하였다. 세포 분주 후 4-웰 플레이트를 뒤집어 4℃ 냉장고에 15분간 두어 마트리겔 상단의 셀 밀도를 높여 주었다. 15분 후 뒤집어진 플레이트를 CO₂ 함유 가습 인큐베이터에서 37℃로 40분간 배양하여 70% 마트리겔을 겔화하였다.

5일 경과 후, 종래 퍼콜 농도구배 원심분리 방법을 이용하여 분리한 CD45^neg 세포는 그 수가 유의미하게 감소하였으나(도 4a), 이와 대조적으로 본 발명에 따른 퍼콜 농도구배 원심분리 방법에 의해 분리된 CD45^neg 세포는 세포사멸 없이 우수한 유기체 형성을 보여주었다 (도 4b).

이는 종래 퍼콜 농도구배 원심분리 방법에서 CD45^pos 세포와 CD45^neg 세포가 명확히 분리되지 않아, 세포독성을 증가시켜 CD45^neg 세포의 세포사멸을 유도하는 결과인 것으로 해석되며, 따라서 본 발명은 종래 방법에 비해 현저히 우수한 CD45^pos 세포와 CD45^neg 세포의 분리 효과를 발휘함을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

1. 퍼콜 상부 용액과 퍼콜 하부 용액을 포함하는 퍼콜 농도구배 용액을 이용하여 생체 시료로부터 CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 방법으로서,
   상기 퍼콜 상부 용액은 38 내지 42% (w/v) 퍼콜 용액이고, 상기 퍼콜 하부 용액은 70 내지 80% (w/v) 퍼콜 용액인 것을 특징으로 하는, CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 퍼콜 용액은 퍼콜을 행크 평형염액(Hank's balanced salt solution)과 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 퍼콜 용액은 퍼콜을 행크 평형염액과 혼합한 후, 우태아 혈청 및 EDTA를 포함하는 PBS를 이용하여 각각 퍼콜 상부 용액과 퍼콜 하부 용액을 제조하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 생체 시료는 암 환자로부터 분리된 시료인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 암 환자로부터 분리된 시료는
   (i) 세포 또는 조직 시료; 또는
   (ii) 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 흉수 및 복수로 구성된 군으로부터 선택되는 액체 시료인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 분리된 시료는 상기 퍼콜 하부 용액에 단일 세포로 현탁시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 세포가 현탁된 퍼콜 하부 용액에 상기 퍼콜 상부 용액을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 세포가 현탁된 퍼콜 하부 용액에 상기 퍼콜 상부 용액이 첨가되어 있는 퍼콜 농도구배 용액을 원심분리하여 CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포를 분리하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 퍼콜 농도구배 용액은 상온에서 600 내지 1000g로 5 내지 40분간 원심분리하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 퍼콜 상부 용액과 퍼콜 하부 용액 사이에서 CD45^pos 세포를 분리 및/또는 상기 퍼콜 상부 용액 상단에서 CD45^neg 세포를 분리하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
11. 38 내지 42% (w/v) 퍼콜 용액 (퍼콜 상부 용액); 및
    70 내지 80% (w/v) 퍼콜 용액 (퍼콜 하부 용액);을 포함하는, CD45^pos 및/또는 CD45^neg 세포 분리용 키트.
    
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