KR102554261B1 - 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 lret 시스템 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 LRET 시스템 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 발광 나노입자체가 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하고, 타겟물질의 존재 시 상기 발광 나노입자체에 인접하여 에너지를 전달받는 흡광 나노입자체가 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하도록 하여, 타켓 물질의 검출 시 외부 환경 요인을 배제할 수 있어 타겟 물질 검출의 정확성을 높일 수 있는 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 LRET 시스템 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 LRET 시스템 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 발광 나노입자체가 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하고, 타겟물질의 존재 시 상기 발광 나노입자체에 인접하여 에너지를 전달받는 흡광 나노입자체가 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하도록 하여, 타켓 물질의 검출 시 외부 환경 요인을 배제할 수 있어 타겟 물질 검출의 정확성을 높일 수 있는 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 LRET 시스템 및 이의 제조방법에 대한 것이다.
특정 물질을 검출 또는 정량화하기 위해 생물인식 요소 등을 이용하는 바이오 센서 시스템이 널리 개발되고 있다. 상기 바이오 센서 시스템의 일 예로 샌드위치 면역분석에 이용되는 발광 공명 에너지 전달(Luminescence resonance energy transfer, LRET) 시스템을 들 수 있다. 상기 LRET 시스템은 하기 특허문헌에 기재된 바와 같이, 빛을 흡광하여 빛을 발광하는 도너(Donor)와, 타겟 물질의 존재 시 도너에 인접하여 도너에서 발광하는 빛을 흡수하는 어셉터(Acceptor)로 이루어진다.
<특허문헌>
특허 제10-2042661호(2019. 11. 04. 등록) "타겟 물질 검출용 복합체 및 이을 이용한 타겟 물질 검출방법"
하지만, 종래 LRET 시스템은 하나의 신호만을 사용하여 타켓 물질을 검출하므로, 타겟 물질이 존재하지 않음에도 외부 환경 에러에 의해 감지 신호의 변화가 발생하는 것을 보정할 수 없어, 타겟 물질의 검출 정확성이 떨어지는 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 발광 나노입자체가 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선(감지 신호, 자가교정 신호)을 발광하고, 타겟물질의 존재 시 상기 발광 나노입자체에 인접하여 에너지를 전달받는 흡광 나노입자체가 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선(감지 신호)만을 흡광하도록 하여, 타켓 물질의 검출 시 외부 환경 요인을 배제할 수 있어 타겟 물질 검출의 정확성을 높일 수 있는 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 LRET 시스템 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발병은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템은 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하는 발광 나노입자체와, 상기 발광 나노입자체에서 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하는 흡광 나노입자체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템에 있어서 상기 발광 나노입자체는 적외선을 흡광하여 적외선을 발광하는 자가교정코어와, 상기 자가교정코어의 외측에 위치하여 적외선을 흡광하여 적외선을 발광하는 감지쉘을 가지는 발광 나노입자를 포함하고, 상기 자가교정코어와 감지쉘은 흡광하는 적외선의 파장이 다르고, 발광하는 적외선의 파장이 다른 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템에 있어서 상기 흡광 나노입자체는 상기 자가교정코어에서 발광된 적외선을 흡광하지 않으나, 상기 감지쉘에서 발광된 적외선을 흡광하는 흡광 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템에 있어서 상기 발광 나노입자는 상기 자가교정코어와 감지쉘 사이에 위치하여, 상기 자가교정코어의 표면 결함을 감소시키고, 상기 자가교정코어와 감지쉘 사이의 크로스 릴랙세이션을 줄이며, 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는 제1비활성쉘을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템에 있어서 상기 발광 나노입자는 상기 감지쉘을 에워싸 표면 결함을 감소시켜 표면의 균일성을 향상시키며, 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는 제2비활성쉘을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템에 있어서 상기 흡광 나노입자는 란타나이드가 도핑된 무기 나노입자인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템에 있어서 상기 발광 나노입자체는 상기 발광 나노입자에 결합하여 검체에 포함되어 있는 타겟 물질에 특이적으로 결합하는 제1수용체를 추가로 포함하며, 상기 흡광 나노입자체는 상기 흡광 나노입자에 결합하여 검체에 포함되어 있는 타겟 물질에 특이적으로 결합하며, 상기 제1수용체와 에피토프가 다른 제2수용체를 추가로 포함하여, 검체에 타겟 물질이 존재하는 경우 제1수용체 및 제2수용체는 상기 타겟 물질에 결합하여 발광 나노입자체와 흡광 나노입자체는 인접하게 되어, 상기 감지쉘에 발광된 적외선을 상기 흡광 나노입자가 흡광하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템에 있어서 상기 자가교정코어, 제1비활성쉘, 감지쉘 및 제2비활성쉘은 모두 동일한 격자 호스트 물질을 가지고, 상기 자가교정코어와 감지쉘에 도핑되는 란타나이드의 조성은 차이나는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법은 일 조성의 란타나이드를 포함하는 용액을 가열하여 발광 나노입자를 형성하는 발광나노입자형성단계와, 타 조성의 란타니이드를 포함하는 용액을 가열하여 흡광 나노입자를 형성하는 흡광나노입자형성단계를 포함하며, 상기 발광 나노입자는 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하고, 상기 흡광 나노입자는 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법에 있어서 상기 발광나노입자형성단계는 일 조성의 활성제 및 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제1동질용액을 형성하고, 나트륨 화합물 및 플루오르 화합물을 포함하는 혼합용액과, 냉각된 제1동질용액을 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 나노입자 형태의 자가교정코어를 형성하는 자가교정코어형성단계와, 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제2동질용액을 형성하고, 냉각된 제2동질용액, 상기 혼합용액 및 상기 자가교정코어형성단계에서 형성된 자가교정코어를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 상기 자가교정코어의 외측에 일정 두께로 형성된 제1비활성쉘을 가지는 자가교정코어-제1비활성쉘 복합체를 형성하는 제1비활성쉘형성단계와, 타 조성의 활성제 및 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제3동질용액을 형성하고, 냉각된 제3동질용액, 상기 혼합용액 및 상기 제1비활성쉘형성단계에서 형성된 자가교정코어-제1비활성쉘 복합체를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 상기 제1비활성쉘의 외측에 일정 두께로 형성된 감지쉘을 가지는 자가교정코어-제1비활성쉘-감지쉘 복합체를 형성하는 감지쉘형성단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법에 있어서 상기 자가교정코어와 감지쉘은 흡광하는 적외선의 파장이 다르고, 발광하는 적외선의 파장이 다르며, 상기 제1비활성쉘은 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법에 있어서 상기 흡광 나노입자는 상기 자가교정코어에서 발광된 적외선을 흡광하지 않으나, 상기 감지쉘에서 발광된 적외선을 흡광하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법에 있어서 상기 발광나노입자형성단계는 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제4동질용액을 형성하고, 냉각된 제4동질용액, 상기 혼합용액 및 상기 감지쉘형성단계에서 형성된 자가교정코어-제1비활성쉘-감지쉘 복합체를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 상기 감지쉘의 외측에 일정 두께로 형성된 제2비활성쉘을 가지는 자가교정코어-제1비활성쉘-감지쉘-제2비활성쉘 복합체를 형성하는 제2비활성쉘형성단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법에 있어서 상기 제1동질용액에 포함되는 활성제는 Nd 및 Mn을 포함하고, 상기 제3동질용액에 포함되는 활성제는 Yb 및 Tm을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 발광 나노입자체가 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선(감지 신호, 자가교정 신호)을 발광하고, 타겟물질의 존재 시 상기 발광 나노입자체에 인접하여 에너지를 전달받는 흡광 나노입자체가 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선(감지 신호)만을 흡광하도록 하여, 타켓 물질의 검출 시 외부 환경 요인을 배제할 수 있어 타겟 물질 검출의 정확성을 높일 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 LRET 시스템의 작동 원리를 설명하기 위한 참고도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 LERT 시스템을 구성하는 발광 나노입자와 흡광 나노입자의 TEM 이미지와 DLS 분석 결과를 나타내는 도면.
도 3은 발광 나노입자의 EDS 맵핑 이미지를 나타내는 도면.
도 4는 흡광 나노입자의 EDS 맵핑 이미지를 나타내는 도면.
도 5는 발광 나노입자를 구성하는 자가교정코어의 EDX 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 6은 발광 나노입자의 EDS line profiles을 나타내는 도면.
도 7은 발광 나노입자 및 흡광 나노입자의 XRD 패턴을 나타내는 도면.
도 8은 발광 나노입자의 발광 스펙트럼 및 흡광 나노입자의 흡수 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 9는 SMCC-acceptor의 점진적인 추가에 따른 NH2-donor의 근적외적 발광 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 10은 도 9의 결과를 플롯화한 그래프를 나타내는 도면.
도 11은 SMCC-acceptor의 존재 또는 비존재 시, NH2-donor의 발광 세기를 시간별로 측정한 결과를 나타내는 도면.
도 12는 흡광 나노입자 또는 유기 어셉터의 존재 시, NH2-donor의 발광 세기를 시간별로 측정한 결과를 나타내는 도면.
도 13은 H3N2 nucleoprotein의 농도에 따른 LRET 시스템의 근적외적 발광 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 14는 H3N2 nucleoprotein의 농도에 따른 LRET 시스템의 PL(1070/808) 소광 강도 및 PL(800/980) 강도에 대한 보정 곡선을 나타내는 도면.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 LERT 시스템을 구성하는 발광 나노입자와 흡광 나노입자의 TEM 이미지와 DLS 분석 결과를 나타내는 도면.
도 3은 발광 나노입자의 EDS 맵핑 이미지를 나타내는 도면.
도 4는 흡광 나노입자의 EDS 맵핑 이미지를 나타내는 도면.
도 5는 발광 나노입자를 구성하는 자가교정코어의 EDX 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 6은 발광 나노입자의 EDS line profiles을 나타내는 도면.
도 7은 발광 나노입자 및 흡광 나노입자의 XRD 패턴을 나타내는 도면.
도 8은 발광 나노입자의 발광 스펙트럼 및 흡광 나노입자의 흡수 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 9는 SMCC-acceptor의 점진적인 추가에 따른 NH2-donor의 근적외적 발광 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 10은 도 9의 결과를 플롯화한 그래프를 나타내는 도면.
도 11은 SMCC-acceptor의 존재 또는 비존재 시, NH2-donor의 발광 세기를 시간별로 측정한 결과를 나타내는 도면.
도 12는 흡광 나노입자 또는 유기 어셉터의 존재 시, NH2-donor의 발광 세기를 시간별로 측정한 결과를 나타내는 도면.
도 13은 H3N2 nucleoprotein의 농도에 따른 LRET 시스템의 근적외적 발광 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 14는 H3N2 nucleoprotein의 농도에 따른 LRET 시스템의 PL(1070/808) 소광 강도 및 PL(800/980) 강도에 대한 보정 곡선을 나타내는 도면.
이하에서는 본 발명에 따른 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 LRET 시스템 및 이의 제조방법을 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 샌드위치 면역분석용 적외선 기반 LRET 시스템을 도 1 내지 14를 참조하여 설명하면, 상기 시스템은 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하는 발광 나노입자체(1)와, 상기 발광 나노입자체(1)에서 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하는 흡광 나노입자체(2) 등을 포함한다. 발광 공명 에너지 전달(LRET)에 기반하여 종래의 방식(하나의 신호만 사용)으로 타켓 물질의 검출 시, 타겟 물질이 존재하지 않음에도 외부 환경 에러에 의해 감지 신호의 변화에 영향을 미쳐 타겟 물질의 검출 정확성이 떨어질 수 있는데, 본 발명은 발광 나노입자체가 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선(감지 신호, 자가교정 신호)을 발광하고, 타겟물질의 존재시 상기 발광 나노입자체에 인접하여 에너지를 전달받는 흡광 나노입자체(2)가 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선(감지 신호)만을 흡광하도록 하여, 자가 교정 신호는 흡광 나노입자체에 의해 흡광되지 않아 자가 교정 신호의 감소가 일어난 경우 외부 환경 요인이 타겟 물질의 검출에 영향을 미치고 있다고 판단할 수 있어, 타켓 물질의 검출 시 외부 환경 요인을 배제할 수 있어 타겟 물질 검출의 정확성을 높일 수 있는 특징이 있다. 따라서, 본 발명은 타액, 혈액, 분변, 음료 및 토양과 같은 다양한 검체를 사용하여 사용자가 검출하고자 하는 물질을 현장에서 신속 및 정확하게 진단할 수 있으며, 예컨대 탄저균, 보툴리늄 뉴로톡신 등과 같은 병원균, 구제역, 조류독감과 같은 동물 바이러스, 암, 심혈관 질환 등과 같은 질병 또는 임신진단 바이오 마커 등의 여러 분야에 적용될 수 있다. 본 발명에서 상기 검체는 분석하고자 하는 타겟 물질을 포함하는 것으로 의심되는 물질을 의미하며, 샘플, 시료로도 지칭될 수 있으며, 상기 타겟 물질은 농도 또는 존재 여부를 분석하고자 하는 대상물질을 의미한다.
상기 발광 나노입자체(1)는 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하는 구성으로, 발광 나노입자(11), 제1수용체(12) 등을 포함한다.
상기 발광 나노입자(11)는 란타나이드가 도핑된 무기 나노입자로, hexagonal phase의 결정 구조를 가지며, 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하는 구성으로, 자가교정코어(11a), 제1비활성쉘(11b), 감지쉘(11c), 제2비활성쉘(11d) 등을 포함한다.
상기 자가교정코어(11a)는 제1파장의 적외선을 흡광하여 제2파장의 적외선(자가교정신호)을 발광하는 구성으로, 제1파장과 제2파장이 동일하지 않은 것을 특징으로 하며(예컨대, 단파장의 적외선을 흡광하여 장파장의 적외선을 발광함), 바람직하게는 808nm의 파장을 가지는 적외선을 흡광하여 1070nm의 발광 피크를 가지는 적외선을 발광한다. 상기 자가교정코어(11a)는 무기물질로 이루어지고, 격자 호스트 물질(lattice host material)로 플루오르화물, 산화물, 할로겐화물, 황산화물, 인산염 및 바나듐산염으로 이루어지 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있다. 예를 들면, NaYF4, NaYbF4, NaGdF4, NaLaF4, LaF3, GdF3, GdOF, La2O3, Lu2O3, Y2O3 및 Y2O2S로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 자가교정코어(11a)에 란타나이드 등이 도핑되어 특정 파장의 적외선을 흡광하여 특정 파장의 적외선을 발광하게 되며, 상기 자가교정 코어에 도핑된 란타나이드 등의 종류, 농도 및 상기 자가교정코어의 합성 온도의 조절 등을 통해 상기 자가교정코어가 흡광 및 발광하는 빛의 파장 영역대를 조절할 수 있다. 상기 효과를 얻기 위한 상기 란타나이드의 예로는 Er, Yb, Tm 및 Nd으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 들 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예로서, 상기 자가교정코어는 NaYF4: 3% Nd, 0.3% Mn의 조성을 가질 수 있다.
상기 제1비활성쉘(11b)은 상기 자가교정코어(11a)를 에워싸 상기 자가교정코어(11a)와 감지쉘(11c) 사이에 위치하며, 표면 결함을 감소시키고, 자가교정코어(11a)와 감지쉘(11c) 사이의 cross-relaxation(자가교정코와 감지쉘 간의 에너지 전환으로 인한 효과들)을 줄이는 구성으로, 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는다(비활성을 가짐). 상기 제1비활성쉘(11b)은 3nm 이하의 두께를 가지는 것이 바람직하며, 상기 자가교정코어의 격자 호스트 물질과 동일한 성분(예컨대, NaYF4)으로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 감지쉘(11c)은 상기 비활성쉘(11b)을 에워싸며, 제3파장의 적외선을 흡광하여 제4파장의 적외선(감지신호)을 발광하는 구성으로, 제3파장과 제4파장이 동일하지 않은 것을 특징으로 하며(예컨대, 장파장의 적외선을 흡광하여 단파장의 적외선을 발광함), 바람직하게는 980nm의 파장을 가지는 적외선을 흡광하여 800nm의 발광 피크를 가지는 적외선 발광한다. 상기 자가교정 코어(11a)와 감지쉘(11c)은 동일한 격자 호스트 물질이 사용되며, 상기 감지쉘(11c)에 도핑되는 물질은 상기 자가교정 코어(11a)에 도핑되는 물질과 다르거나 조성이 달라져, 상기 감지쉘(11c)이 흡발광하는 적외선과 상기 자가교정 코어(11a)가 흡발광하는 적외선이 다르게 된다. 구체적인 일 실시예로서, 상기 감지쉘(11c)은 NaYF4: 48% Yb, 2% Tm의 조성을 가질 수 있다.
상기 제2비활성쉘(11d)은 상기 감지쉘(11c)을 에워싸 표면 결함을 감소시켜 표면의 균일성을 향상시키는 구성으로, 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는다(비활성을 가짐). 상기 제2비활성쉘(11d)은 2nm 이하의 두께를 가지는 것이 바람직하며, 상기 자가교정코어(11a)의 격자 호스트 물질과 동일한 성분(예컨대, NaYF4)으로 이루어지는 것이 바람직하다. LRET 효율을 발광 나노입자와 흡광 나노입자 사이의 거리에 반비례하므로, 감지쉘(11c)이 자가교정 코어(11a) 보다 외측에 형성되게 된다. 상기 자가교정코어, 제1비활성쉘, 감지쉘, 제2비활성쉘은 모두 격자 호스트 물질(NaYF4)이 동일하므로 에피택시얼(epitaxial) 성장을 통해 쉘이 형성되게 된다. 상기와 같은 구성을 포함하는 발광 나노입자(11)에서 자가교정코어(11a)와 감지쉘(11c)은 흡광하는 적외선의 파장이 다르고(제1파장과 제3파장이 다름), 발광하는 적외선의 파장이 달라(제2파장과 제4파장이 다름), 상기 발광 나노입자(11)에, 제1파장의 적외선을 조사하면 자가교정코어(11a)가 흡광하여 제2파장의 적외선이 발광되며, 제3파장이 적외선을 조사하면 감지쉘(11c)가 흡광하여 제4파장의 적외선이 발광되게 된다. 하기에서 설명할 흡광 나노입자(2)는 제4파장의 적외선을 흡광하나, 제2파장의 적외선을 흡광하지 않아, 제4파장의 적외선은 타겟 물질의 감지신호로, 제2파장의 적외선은 외부 환경 에러를 찾아내는 자가교정 신호로 사용될 수 있다.
상기 제1수용체(12)는 상기 발광 나노입자에 결합하여 검체에 포함되어 있는 타겟 물질에 특이적으로 결합하는 구성으로, 예컨대 scFv, 모노클로날 항체, 압타머 등이 사용될 수 있으며, 상기 발광 나노입자와 제1수용체의 결합은 이온결합, 공유결합, 금속결합, 배위결합, 수소결합, 및 반데르발스 결합에서 선택된 결합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 흡광 나노입자체(2)는 발광 나노입자체(1)에서 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하는 구성으로, 흡광 나노입자(21), 제2수용체(22) 등을 포함한다.
상기 흡광 나노입자(21)는 란타나이드가 도핑된 무기 나노입자로, cubic phase의 결정 구조를 가지며, 발광 나노입자체(1)에서 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하는 구성이다. 상기 흡광 나노입자(21)는 자가교정코어(11a)에서 발광된 적외선(제2파장의 적외선)을 흡광하지 않으나 감지쉘(11c)에서 발광된 적외선(제4파장의 적외선)을 흡광하게 된다. 상기 흡광 나노입자(21)는 예컨대 네오디듐(Nd)가 도핑된 무기 나노입자인 NaNdF4로 구성될 수 있다.
상기 제2수용체(22)는 상기 흡광 나노입자에 결합하여 검체에 포함되어 있는 타겟 물질에 특이적으로 결합하는 구성으로, 제1수용체(12)와 다른 에피토프(epitope)를 가지는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 구성을 가지는 샌드위치 면역분석용 적외선 기반 LRET 시스템을 이용하여 타겟 물질을 검출하는 원리를 살펴보면, 발광 나노입자체(1)와 흡광 나노입자체(2)가 들어있는 용액에 검체를 투입하고, 상기 감지쉘(11c)이 흡광하는 제3파장의 적외선을 조사 시, 검체에 타겟 물질이 존재하지 않는 경우 발광되는 제4파장의 적외선이 특정 범위 이상의 변화가 발생하지 않는데 반해, 검체에 타겟 물질이 존재하는 경우 제1수용체(12) 및 제2수용체(22)는 상기 타겟 물질에 결합하여 발광 나노입자체(1)와 흡광 나노입자체(2)는 인접하게 되어 상기 감지쉘(11c)이 발광하는 제4파장의 적외선이 흡광 나노입자(21)에 흡광되어, 즉 에너지가 전달되어 발광되는 제4파장의 적외선의 세기 감소하게 되어 상기 샘플 내에 타겟 물질이 존재함을 알 수 있다. 다만, 제4파장의 적외선 세기 감소는 타겟 물질의 존재뿐만 아니라 외부 환경 에러에 의해서도 발생할 수 있고, 자가교정코어(11a)에서 발광하는 제2파장의 적외선은 흡광 나노입자(21)에 의해 흡광되지 않으므로, 외부 환경 에러가 존재하지 않는 경우 상기 자가교정코어(11a)가 흡광하는 제1파장의 적외선 조사 시 발광하는 제2파장의 적외선이 특정 범위 이상의 변화가 발생하지 않을 것이므로, 별도로 상기 자가교정코어(11a)가 흡광하는 제1파장의 적외선을 조사하고 발광되는 제2파장의 적외선을 분석하여 외부 환경 에러가 있는지 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 샌드위치 면역분석용 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법을 도 1 내지 14를 참조하여 설명하면, 상기 시스템의 제조방법은 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하는 발광 나노입자체(1)를 형성하는 발광나노입자체형성단계와, 상기 발광 나노입자체(1)에서 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하는 흡광 나노입자체(2)를 형성하는 흡광나노입자체형성단계 등을 포함한다.
상기 발광나노입자체형성단계는 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하는 발광 나노입자체(1)를 형성하는 단계로, 발광나노입자형상단계와, 제1수용체결합단계 등을 포함한다.
상기 발광나노입자형성단계는 일 조성의 란타나이드를 포함하는 용액을 가열하여, 란타나이드가 도핑된 무기 나노입자이며 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하는 발광 나노입자를 형성하는 단계로, 자가교정코어형성단계, 제1비활성쉘형성단계, 감지쉘형성단계, 제2비활성쉘형성단계 등을 포함한다.
상기 자가교정코어형성단계는 제1파장의 적외선을 흡광하여 제2파장의 적외선(자가교정신호)을 발광하는 자가교정코어를 형성하는 단계로, 예컨대, 일 조성의 활성제(예컨대, Nd 및 Mn을 포함함) 및 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제1동질용액을 형성하고, 나트륨 화합물, 플루오르 화합물을 포함하는 혼합용액을 냉각된 제1동질용액에 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 나노입자 형태의 자가교정코어를 형성할 수 있다. 상기 동질 용액에는 예컨대 96.7mol%의 Y, 3mol%의 Nd 및 0.3mol%의 Mn을 포함할 수 있다.
상기 제1비활성쉘형성단계는 상기 자가교정코어(11a)를 에워싸 상기 자가교정코어(11a)와 감지쉘(11c) 사이에 위치하며, 표면 결함을 감소시키고, 자가교정코어(11a)와 감지쉘(11c) 사이의 cross-relaxation(자가교정코어와 감지쉘 간의 에너지 전환으로 인한 효과들)을 줄이고, 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는 제1비활성쉘을 형성하는 단계로, 예컨대, 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제2동질용액을 형성하고, 냉각된 제2동질용액, 상기 혼합용액 및 상기 자가교정코어형성단계에서 형성된 자가교정코어를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 상기 자가교정코어의 외측에 일정 두께로 형성된 제1비활성쉘을 가지는 자가교정코어-제1비활성쉘 복합체를 형성할 수 있다.
상기 감지쉘형성단계는 상기 비활성쉘(11b)을 에워싸며, 제3파장의 적외선을 흡광하여 제4파장의 적외선(감지신호)을 발광하는 감지쉘을 형성하는 단계로, 예컨대, 타 조성의 활성제(예컨대, Yb 및 Tm을 포함함) 및 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제3동질용액을 형성하고, 냉각된 제3동질용액, 상기 혼합용액 및 상기 제1비활성쉘형성단계에서 형성된 자가교정코어-제1비활성쉘 복합체를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 상기 제1비활성쉘의 외측에 일정 두께로 형성된 감지쉘을 가지는 자가교정코어-제1비활성쉘-감지쉘 복합체를 형성할 수 있다. 상기 동질 용액에는 예컨대 50mol%의 Y, 48mol%의 Yb 및 2mol%의 Tm을 포함할 수 있다.
상기 제2비활성쉘형성단계는 상기 감지쉘(11c)을 에워싸 표면 결함을 감소시키고, 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는 제2비활성쉘을 형성하는 단계로, 예컨대, 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제4동질용액을 형성하고, 냉각된 제4동질용액, 상기 혼합용액 및 상기 감지쉘형성단계에서 형성된 자가교정코어-제1비활성쉘-감지쉘 복합체를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 상기 감지쉘의 외측에 일정 두께로 형성된 제2비활성쉘을 가지는 자가교정코어-제1비활성쉘-감지쉘-제2비활성쉘 복합체 형태의 발광 나노입자를 형성할 수 있다.
상기 제1수용체결합단계는 발광 나노입자 및 제1수용체를 개질하여 화학 반응시켜, 타겟 물질에 특이적으로 결합하는 제1수용체를 발광 나노입자에 결합시키는 단계로, 예컨대 제1수용체를 싸이올레이트화시키고, 발광 나노입자를 말레이마이드화시킨 후, 싸이올레이트된 제1수용체와 말레이마이드화된 발광 나노입자를 반응시켜 수행될 수 있다.
상기 흡광나노입자체형성단계는 상기 발광 나노입자체(1)에서 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하는 흡광 나노입자체(2)를 형성하는 단계로, 흡광나노입자형상단계와, 제2수용체결합단계 등을 포함한다.
상기 흡광나노입자형성단계는 타 조성의 란타니이드를 포함하는 용액을 가열하여, 란타나이드가 도핑된 무기 나노입자이며 발광 나노입자체(1)에서 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하는 흡광 나노입자를 형성하는 단계로, 예컨대, Nd와 oleate를 포함하는 용액을 가열하여 복합체를 형성하고, 나트륨 화합물, 플루오르 화합물을 포함하는 혼합용액을 상기 복합체를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 나노입자 형태의 흡광 나노입자를 형성할 수 있다.
상기 제2수용체결합단계는 흡광 나노입자 및 제2수용체를 개질하여 화학 반응시켜, 검체에 포함되어 있는 타겟 물질에 특이적으로 결합하는 제2수용체를 흡광 나노입자에 결합시키는 단계로, 예컨대 제2수용체를 싸이올레이트화시키고, 흡광 나노입자를 말레이마이드화시킨 후, 싸이올레이트된 제2수용체와 말레이마이드화된 흡광 나노입자를 반응시켜 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> LRET용 나노입자들의 제조
1. 도너 나노입자(LRET Donor)의 제조
(1) 자가교정 코어 형성
올레산(Oleic acid, OA), 1-옥타데켄(1-octadecene, ODE), 이트륨 아세테이트 하이드레이트(yttrium acetate hydrate), 네오디뮴 아세테이트 하이드레이트(neodymium acetate hydrate) 및 망간 아세테이트 테트라하이드레이트(manganese acetate tetrahydrate)를 혼합한 후(구체적으로, 7mL ODE와 3mL OA에 란타나이드와 망간(96.7mol% Y, 3mol% Nd 및 0.3mol% Mn으로 이루어짐) 총 0.4mmol이 혼합됨), 150℃에서 30분 동안 가열하여 동질(homogeneous) 용액을 형성하고 50℃로 냉각하였다. 그리고, 1mmol NaOH 및 1.6mmol NH4F를 함유하고 있는 5mL 메탄올을 상기 동질 용액에 첨가하고, 100℃로 가열하였다. 이후, 용액에 남은 메탄올과 산소를 제거하기 위해, 1시간 동안 아르곤 대기 조성 하에 300℃로 가열한 후, 25℃로 냉각하고, 원심 분리 및 세척을 통해 나노입자 1(C)을 얻었다.
(2) 비활성 셀 형성
올레산, 1-옥타데켄, 이트륨 아세테이트 하이드레이트를 혼합한 후(구체적으로, 7mL ODE와 3mL OA에 0.1mmol의 Y이 혼합됨), 150℃에서 30분 동안 가열하여 동질 용액을 형성하고 50℃로 냉각하였다. 그리고, 1mmol NaOH 및 1.6mmol NH4F를 함유하고 있는 5mL 메탄올, 상기 동질 용액 및 상기 나노입자 1(C)를 혼합하고, 100℃로 가열하였다. 이후, 300℃로 가열한 후, 25℃로 냉각하고, 원심 분리 및 세척을 통해 코어-쉘 구조의 나노입자 2(C@S)를 얻었다.
(3) 감지 쉘 형성
올레산, 1-옥타데켄, 이트륨 아세테이트 하이드레이트, 이터븀 아세테이트 하이드레이트(ytterbium acetate hydrate) 및 튤륨 아세테이트 테트라하이드레이트(thulium acetate tetrahydrate)를 혼합한 후(구체적으로, 7mL ODE와 3mL OA에 란타나이드(50mol% Y, 48mol% Yb 및 2mol% Tm으로 이루어짐) 총 0.2mmol이 혼합됨), 150℃에서 30분 동안 가열하여 동질 용액을 형성하고 50℃로 냉각하였다. 그리고, 1mmol NaOH 및 1.6mmol NH4F를 함유하고 있는 5mL 메탄올, 상기 동질 용액 및 상기 나노입자 2(C@S)를 혼합하고, 100℃로 가열하였다. 이후, 1시간 동안 아르곤 대기 조성 하에 300℃로 가열한 후, 25℃로 냉각하고, 원심 분리 및 세척을 통해 코어-쉘-쉘 구조의 나노입자 3(C@S@S)을 얻었다.
(4) 비활성 쉘 형성
올레산, 1-옥타데켄, 이트륨 아세테이트 하이드레이트를 혼합한 후(구체적으로, 7mL ODE와 3mL OA에 0.1mmol의 Y이 혼합됨), 150℃에서 30분 동안 가열하여 동질 용액을 형성하고 50℃로 냉각하였다. 그리고, 1mmol NaOH 및 1.6mmol NH4F를 함유하고 있는 5mL 메탄올, 상기 동질 용액 및 상기 나노입자 4(C@S@S)를 혼합하고, 100℃로 가열하였다. 이후, 1시간 동안 아르곤 대기 조성 하에 300℃로 가열한 후, 25℃로 냉각하고, 원심 분리 및 세척을 통해 코어-쉘-쉘-쉘 구조의 나노입자 4(C@S@S@S, LRET Donor)를 얻었다.
2. 억셉터 나노입자(LRET Acceptor)의 제조
에탄올 120mL, 물 90mL 및 헥산(hexane) 210mL가 혼합되어 있는 용액에 NdCl3·H2O 60mmol 및 sodium oleate 180mmol을 혼합하고, 60℃에서 14시간 동안 가열하고 증발시켜 Ln-oleate 복합체를 얻었다. 올레산 1.5mL, olelyamine 1.5mL 및 7mL ODE가 혼합되어 있는 용액에 상기 Ln-oleate 복합체 0.4mmol 및 플루오르화나트륨 2.4mmol을 혼합한 후, 100℃에서 60분 동안 가열하고, 이후 1시간 동안 아르곤 대기 조성 하에 280℃로 가열한 후, 25℃로 냉각하고, 원심 분리 및 세척을 통해 나노입자 5(LRET Acceptor)를 얻었다.
<실시예 2> LRET용 나노입자들의 특성 확인
1. 실시예 1에서 제조된 나노입자 1 내지 5에 대하여 투과전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM)으로 측정한 결과 및 동적빛산란(Dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 분석한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 (a)를 보면, 실시예 1의 1에서 제조된 나노입자 1 내지 4 각각은 18.7±2.1(C), 24.5±2.2(C@S), 31.5±1.6(C@S@S), 34±1.6nm(C@S@S@S)의 직경을 가지고, 도 2의 (b)를 보면, 실시예 2의 2에서 제조된 나노입자 5는 5.2±1.5nm의 직경을 가짐을 알 수 있다.
2. 또한, 실시예 1에서 제조된 나노입자 각각에 대하여 energy dispersive X-ray spectrometry(EDS) and X-ray diffraction(XRD)을 이용하여 분석한 결과를 도 3 내지 6에 나타내었다. 도 3은 나노입자 4의 EDS 맵핑 이미지이고, 도 4는 나노입자 5의 EDS 맵핑 이미지이며, 도 5는 나노입자 1의 EDX 스펙트럼이고, 도 6은 나노입자 4의 EDS line profiles이며, 도 7은 나노입자 4 및 5의 XRD 패턴을 나타낸다. 도 3, 5, 6 및 7을 보면, 나노입자 4(LRET donor)는, 주로 Na, Y, F로 구성되고, Yb3+, Tm3+은 외곽 부위에 위치하고, Nd3+는 중앙 부위에 위치하고, energy dispersive X-ray analyis spectra를 통해 Mn2+는 자가 교정 코어에 존재함을 확인할 수 있고, 결정 구조가 hexagonal β-phase NaYF4(JCPDS: 16-0334)와 일치함을 알 수 있다. 또한, 도 4 및 7을 보면, 나노입자 5(LRET acceptor)는, Na, Nd, F로 구성되고, 결정 구조가 cubic α-phase NaYF4(JCPDS: 77-2042)와 일치함을 알 수 있다.
3. 또한, 실시예 1의 1에서 제조된 나노입자 1 내지 4 각각에 대하여 808 및 980nm 레이저로 각각 조사한 후, NIR spectrometer를 이용하여 발광 스펙트럼을 측정하여 그 결과를 도 8의 (a)에 나타내었고, 실시예 1의 2에서 제조된 나노입자 5의 흡수 스펙트럼을 측정하여 그 결과를 도 8의 (b)에 나타내었다. 도 8을 보면, 실시예 1의 1에서 제조된 나노입자 1 내지 4 각각은 808nm의 적외선 조사 시 1070nm의 발광 피크를 가지며(추가적으로 860 및 890nm에서 발광 피크를 가짐), 980nm의 적외선 조사 시 800nm의 발광 피크를 가짐을 알 수 있고, 나노입자 2가 나노입자 1에 비해 발광 세기 1.66배 크고, 나노입자 4가 나노입자 3에 비해 발광 세기가 20배 증가되었음을 알 수 있으며, 실시예 1의 2에서 제조된 나노입자 5는 1000 내지 1100nm의 흡수 스펙트럼은 무시할 수 있으며 800nm 근방에서 폭이 좁은 흡수 피크를 가짐을 알 수 있다.
<실시예 3> LRET donor/acceptor 사이의 정전기 상호작용을 통한 LRET 효율성 평가
1. 나노입자 4 및 5 각각을 테트라하이드로푸란(Tetrahydrofuran, THF)에 분산시켜 나노입자 용액을 준비하고, 50mg 도파민 하이드로클로라이드(Dopamine hydrochloride)를 용해시킨 증류수에 상기 나노입자 용액에 첨가하여 50℃로 가열하고, 염산을 추가로 첨가하여 반응시키고, 여러 번 세척하여, 아민 기능화된 나노입자 4(NH2-donor) 및 아민 기능화된 나노입자 5(NH2-acceptor)를 얻었다.
2. 말레이마이드된 나노입자 5를 얻기 위해, 10mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer 200uL에 NH2-acceptor 2mg을 분산시키고, sulfo-SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)를 추가로 용해시켜 5시간 동안 반응시키고, 세척하여 SMCC 기능화된 나노입자 5(SMCC-acceptor)를 얻었다. NH2-donor와 SMCC-acceptor에 대해 제타전위 분석기(Zetasizer Nano ZS90, Malvern)를 이용하여 표면 전위를 측정한 결과, 각각 +40.7mV(NH2-donor), -19.7mV(SMCC-acceptor)의 값을 가졌다.
3. 양전하를 가지는 NH2-donor와 음전하를 가지는 SMCC-acceptor 사이의 정전기 상호작용을 통해 LRET의 효율성을 확인하기 위해, 10mM HEPES buffer에 24ug의 NH2-donor와 농도를 달리하는 SMCC-acceptor(0-160nM)를 첨가하여 반응시키고, PL(1070/808) 및 PL(800/980)에서 발광 세기를 측정하여 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다. 도 9는 SMCC-acceptor의 점진적인 추가에 따른 NH2-donor의 근적외적 발광 스펙트럼을 나타내며, 도 10은 PL(1070/808) 및 PL(800/980)에서 발광 세기를 플롯화한 결과를 나타낸다. 또한, 10mM HEPES buffer에 24ug의 NH2-donor를 혼합하고, 160nM의 SMCC-acceptor를 추가로 첨가한 경우와, SMCC-acceptor를 첨가하지 않은 경우 각각에 대하여, 980nm의 레이져 조사하에 800nm의 발광 세기를 시간별로 측정하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 또한, 나노입자 5와 유기 어셉터의 안정성을 상대 비교하기 위해, 800nm의 빛을 흡광하며 아민에 반응성을 보이는 공지의 유기 염료인 IRDyeQC-1을 유기 어셉터로 선정하여, 50mM HEPES buffer에 NH2-donor를 혼합하고, SMCC-acceptor를 추가로 첨가한 경우와, IRDyeQC-1를 추가로 첨가한 경우 각각에 대하여, 10일 동안 상온에서 태양 빛을 조사하여 PL(800/980) 강도를 측정하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.
4. 도 9 및 10을 보면, SMCC-acceptor의 농도에 따라 PL(1070/808) 세기는 변화하지 않는 것을 확인할 수 있어, PL(1070/808)이 이상적인 자가교정 신호로 작용할 수 있음을 알 수 있고, SMCC-acceptor의 농도가 증가함에 따라 PL(800/980) 세기가 감소하고 SMCC-acceptor가 160nM에 이를 때 PL(1070/808) 세기가 55% 감소함을 확인할 수 있어, PL(800/980)이 감지 신호로 작용할 수 있음을 알 수 있다. 도 11을 보면, 800nm에서 발광이 소멸하는 시간(luminescence decay time)은, SMCC-acceptor가 존재할 때 SMCC-acceptor의 부존재할 때보다 감소함을 확인할 수 있어, SMCC-acceptor의 존재 시 에너지 전이가 이루어졌음을 알 수 있다. 또한, 도 12를 보면, SMCC-acceptor를 사용한 경우 PL(800/980) 세기가 감소하지 않은데 반해, IRDyeQC-1를 사용한 경우 PL(800/980) 세기가 감소한 것을 확인할 수 있어, 나노입자 5는 유기 어셉터에 비해 안정성이 뛰어남을 알 수 있다.
<실시예 4> LRET용 나노입자들을 이용한 검체의 분석
1. 항체와 나노입자의 결합
(1) 말레이마이드된 나노입자 4를 얻기 위해 NH2-acceptor 대신에 NH2-donor를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 3의 2와 동일하게 하여 SMCC 기능화된 나노입자 4(SMCC-donor)를 얻었다.
(2) 조류 독감 바이러스(H3N2)의 nucleoprotein을 잡는 anti-nucleoprotein scfv(제1항체) 120ug을 SATA(N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate)를 포함하는 HEPES 버퍼에 첨가하여 상온에서 반응시키고, 0.5M 하이드록실아민 하이드로클로라이드 용액 1.75ul를 추가로 첨가하여 반응시키고, 30K centrifugal filter를 사용하여 반응하고 남은 물질들을 제거하여, 싸이올레이트된 제1항체를 준비하였다.
(3) 제1항체 대신에 제2항체(제1항체와 epitope가 다르며, 조류 독감 바이러스(H3N2)의 nucleoprotein을 잡는 anti-nucleoprotein scfv)를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 4의 1의 (2)와 동일하게 하여, 싸이올레이트된 제2항체를 준비하였다.
(4) 싸이올레이트된 제1항체와 SMCC-donor를 HEPES 버퍼에 첨가하여(SMCC-donor 2mg 당 싸이올레이트된 제1항체 120ug 사용), 2시간 동안 반응시켜 제1항체가 고정된 나노입자 4를 얻었다(제1항체-donor). 또한, 싸이올레이트된 제2항체와 SMCC-acceptor를 HEPES 버퍼에 첨가하여(SMCC-acceptor 2mg 당 싸이올레이트된 제2항체 120ug 사용), 2시간 동안 반응시켜 제2항체가 고정된 나노입자 5(제2항체-acceptor)를 얻었다.
(5) 제1항체-donor 및 제2항체-acceptor가 나노입자에 항체가 결합한 형태를 가짐을 확인하기 위해, SMCC-donor, SMCC-acceptor, 제1항체-donor 및 제2항체-acceptor에 대해 제타전위 분석기를 이용하여 표면 전위를 측정한 결과, 각각 -31.7mV(SMCC-donor), -19.7mV(SMCC-acceptor), -1.62mV(제1항체-donor), -4.63mV(제2항체-acceptor)의 값을 가짐을 확인하였다. 이와 같은 표면 전하 변화를 통해 나노입자 각각에 항체가 고정되었음을 알 수 있다.
2. LRET용 나노입자들을 이용한 검체 검출
(1) 제1항체-donor(24ug) 및 제2항체-acceptor(160nM)가 혼합된 HEPES 버퍼에 Sino Biological에서 구매한 농도를 달리하는 H3N2(A/Hong Kong/1/1968) nucleoprotein(0-105pM)를 공급하여 반응시키고, PL(1070/808) 및 PL(800/980)에서 발광 세기를 측정하여, 그 결과를 도 13 및 14에 나타내었다. 도 13은 H3N2 nucleoprotein의 농도에 따른 근적외적 발광 스펙트럼을 나타내며, 도 14는 H3N2 nucleoprotein의 농도의 증가에 따라 PL(800/980) 소광 강도(black, left) 및 PL(1070/808) 강도(blue, right)에 대한 보정 곡선을 나타낸다.
(2) 도 13 및 14를 보면, 감지 신호 PL(800/980) 및 자가교정 신호 PL(1070/808)은 AIV nucleoprotein의 증가함에도 안정적임을 확인할 수 있고, AIV nucleoprotein의 증가와 상관없이 PL(1070/808) 강도는 일정함을 확인할 수 있어 PL(1070/808)이 자가교정 신호로 사용될 수 있음을 알 수 있으며, AIV nucleoprotein의 증가함에 따라 PL(800/980) 강도가 점진적으로 37%가 감소함을 확인할 수 있어 PL(800/980)이 감지 신호로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
1: 발광 나노입자체 2: 흡광 나노입자체 11: 발광 나노입자
12: 제1수용체 21: 흡광 나노입자 22: 제2수용체
11a: 자가교정코어 11b: 제1비활성쉘 11c: 감지쉘
11d: 제2비활성쉘
12: 제1수용체 21: 흡광 나노입자 22: 제2수용체
11a: 자가교정코어 11b: 제1비활성쉘 11c: 감지쉘
11d: 제2비활성쉘
Claims (14)
- 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하는 발광 나노입자체와, 상기 발광 나노입자체에서 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하는 흡광 나노입자체를 포함하되,
상기 발광 나노입자체는 적외선을 흡광하여 적외선을 발광하는 자가교정코어와, 상기 자가교정코어의 외측에 위치하여 적외선을 흡광하여 적외선을 발광하는 감지쉘을 가지는 발광 나노입자를 포함하고,
상기 자가교정코어와 감지쉘은 흡광하는 적외선의 파장이 다르고, 발광하는 적외선의 파장이 다른 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 흡광 나노입자체는 상기 자가교정코어에서 발광된 적외선을 흡광하지 않으나, 상기 감지쉘에서 발광된 적외선을 흡광하는 흡광 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템. - 제3항에 있어서,
상기 발광 나노입자는 상기 자가교정코어와 감지쉘 사이에 위치하여, 상기 자가교정코어의 표면 결함을 감소시키고, 상기 자가교정코어와 감지쉘 사이의 크로스 릴랙세이션을 줄이며, 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는 제1비활성쉘을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템. - 제4항에 있어서,
상기 발광 나노입자는 상기 감지쉘을 에워싸 표면 결함을 감소시켜 표면의 균일성을 향상시키며, 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는 제2비활성쉘을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템. - 제3항에 있어서,
상기 흡광 나노입자는 란타나이드가 도핑된 무기 나노입자인 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템. - 제3항에 있어서,
상기 발광 나노입자체는 상기 발광 나노입자에 결합하여 검체에 포함되어 있는 타겟 물질에 특이적으로 결합하는 제1수용체를 추가로 포함하며,
상기 흡광 나노입자체는 상기 흡광 나노입자에 결합하여 검체에 포함되어 있는 타겟 물질에 특이적으로 결합하며, 상기 제1수용체와 에피토프가 다른 제2수용체를 추가로 포함하여, 검체에 타겟 물질이 존재하는 경우 제1수용체 및 제2수용체는 상기 타겟 물질에 결합하여 발광 나노입자체와 흡광 나노입자체는 인접하게 되어, 상기 감지쉘에 발광된 적외선을 상기 흡광 나노입자가 흡광하는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템. - 제5항에 있어서,
상기 자가교정코어, 제1비활성쉘, 감지쉘 및 제2비활성쉘은 모두 동일한 격자 호스트 물질을 가지고, 상기 자가교정코어와 감지쉘에 도핑되는 란타나이드의 조성은 차이나는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템. - 일 조성의 란타나이드를 포함하는 용액을 가열하여 발광 나노입자를 형성하는 발광나노입자형성단계와, 타 조성의 란타니이드를 포함하는 용액을 가열하여 흡광 나노입자를 형성하는 흡광나노입자형성단계를 포함하며,
상기 발광 나노입자는 조사되는 적외선에 따라 서로 다른 파장의 적외선을 발광하고, 상기 흡광 나노입자는 발광된 적외선들 중 특정 파장의 적외선만을 흡광하되,
상기 발광나노입자형성단계는
일 조성의 활성제 및 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제1동질용액을 형성하고, 나트륨 화합물 및 플루오르 화합물을 포함하는 혼합용액과, 냉각된 제1동질용액을 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 나노입자 형태의 자가교정코어를 형성하는 자가교정코어형성단계와,
이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제2동질용액을 형성하고, 냉각된 제2동질용액, 상기 혼합용액 및 상기 자가교정코어형성단계에서 형성된 자가교정코어를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 상기 자가교정코어의 외측에 일정 두께로 형성된 제1비활성쉘을 가지는 자가교정코어-제1비활성쉘 복합체를 형성하는 제1비활성쉘형성단계와,
타 조성의 활성제 및 이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제3동질용액을 형성하고, 냉각된 제3동질용액, 상기 혼합용액 및 상기 제1비활성쉘형성단계에서 형성된 자가교정코어-제1비활성쉘 복합체를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 상기 제1비활성쉘의 외측에 일정 두께로 형성된 감지쉘을 가지는 자가교정코어-제1비활성쉘-감지쉘 복합체를 형성하는 감지쉘형성단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법. - 삭제
- 제9항에 있어서,
상기 자가교정코어와 감지쉘은 흡광하는 적외선의 파장이 다르고, 발광하는 적외선의 파장이 다르며,
상기 제1비활성쉘은 상기 자가교정코어 및 감지쉘에서 흡발광되는 적외선을 흡발광하지 않는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법. - 제11항에 있어서,
상기 흡광 나노입자는 상기 자가교정코어에서 발광된 적외선을 흡광하지 않으나, 상기 감지쉘에서 발광된 적외선을 흡광하는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법. - 제12항에 있어서,
상기 발광나노입자형성단계는
이트륨을 포함하는 용액을 가열하여 제4동질용액을 형성하고, 냉각된 제4동질용액, 상기 혼합용액 및 상기 감지쉘형성단계에서 형성된 자가교정코어-제1비활성쉘-감지쉘 복합체를 혼합한 후 열을 가해 반응시켜, 상기 감지쉘의 외측에 일정 두께로 형성된 제2비활성쉘을 가지는 자가교정코어-제1비활성쉘-감지쉘-제2비활성쉘 복합체를 형성하는 제2비활성쉘형성단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법. - 제12항에 있어서,
상기 제1동질용액에 포함되는 활성제는 Nd 및 Mn을 포함하고, 상기 제3동질용액에 포함되는 활성제는 Yb 및 Tm을 포함하는 것을 특징으로 하는 적외선 기반 LRET 시스템의 제조방법.
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---|---|---|---|
KR1020210097935A KR102554261B1 (ko) | 2021-07-26 | 2021-07-26 | 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 lret 시스템 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020210097935A KR102554261B1 (ko) | 2021-07-26 | 2021-07-26 | 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 lret 시스템 및 이의 제조방법 |
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KR20230016442A KR20230016442A (ko) | 2023-02-02 |
KR102554261B1 true KR102554261B1 (ko) | 2023-07-11 |
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ID=85225601
Family Applications (1)
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KR1020210097935A KR102554261B1 (ko) | 2021-07-26 | 2021-07-26 | 샌드위치 면역분석용 근적외선 기반 lret 시스템 및 이의 제조방법 |
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Citations (1)
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KR102042661B1 (ko) | 2015-08-06 | 2019-11-08 | 광주과학기술원 | 타겟 물질 검출용 복합체 및 이를 이용한 타겟 물질 검출방법 |
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US7285424B2 (en) * | 2002-08-27 | 2007-10-23 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Membrane-based assay devices |
KR101996815B1 (ko) * | 2017-07-07 | 2019-07-05 | 한국과학기술연구원 | 적외선을 흡광 및 발광하는 진단용 포획제-나노입자 복합체 및 이를 이용하는 현장용 진단키트 |
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2021
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KR102042661B1 (ko) | 2015-08-06 | 2019-11-08 | 광주과학기술원 | 타겟 물질 검출용 복합체 및 이를 이용한 타겟 물질 검출방법 |
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KR20230016442A (ko) | 2023-02-02 |
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