KR102553227B1

KR102553227B1 - 신규한, 중 비타민 b12 유도체

Info

Publication number: KR102553227B1
Application number: KR1020227031423A
Authority: KR
Inventors: 피터 앤더슨
Original assignee: 찰스 스튜어트 유니버시티
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2023-07-10
Also published as: KR20220127391A; AU2021201778B2; KR20170132144A; US20180009838A1; AU2022224834A1; US11597747B2; US20210107935A1; AU2021201778A1; AU2020217355A1; US11884695B2; AU2015380290B2; AU2022224834B2; CA2975274A1; WO2016119004A1; US20230183287A1; US10899789B2; CA2975274C; US20240101591A1; AU2020217355B2; AU2015380290A1

Abstract

본 발명은 정량적 표준물질로서 유용한, 특히 비타민 B12 결핍의 평가를 위한 비타민 B12-기반 화합물에 관한 것이다.

Description

신규한, 중 비타민 B12 유도체{Novel, Heavy vitamine B12 Derivatives}

본 발명은 정량적 표준물질(quantitative standard)로서 유용한 비타민 B12-기반 화합물(vitamin B12-based compound)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 화합물을 포함하는 조성물 및 상기 화합물을 사용하여 비타민 B12가 결핍된 환자를 평가하는 방법에 관한 것이다.

비타민 B12(코발라민(cobalamin)으로도 알려져 있음)는 인체 내에서의 수많은 생리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 필수 비타민이다. 그러나, 그것은 균류, 식물 또는 동물에서 내생적으로(endogenously) 생산되지 않고, 사실상 박테리아와 같은 원핵생물에 의해서만 합성될 수 있다. 따라서, 인간(및 다른 동물들)은 비타민 B12를 음식 또는 보충제(supplement)로부터 얻는다. 또한, 그것의 화학적 복잡성 때문에 비타민 B12를 신규로(de novo) 합성하는 것은 매우 어려우므로, 상업적으로 그것은 미생물 발효에 의해 제조된다.

비타민 B12 결핍(vitamin B12 deficiency)은 중대한 건강 문제이며, 이는 거대적아구성 빈혈(megaloblastic anaemia) 및 다양한 신경학적 결손(말초 신경병증(peripheral neuropathy)에서 우울증(depression), 인지 장애(cognitive disturbance) 및 치매(dementia)까지)으로 이어질 수 있다. 증거는 또한 비타민 B12 결핍이 혈관질환, 암(특히, 유방암), 및 신경관 결손(neural tube defect)(척추 갈림증(spina bifida)), 무뇌증(anencephaly)의 위험에 영향을 끼침을 보여준다. 비타민 B12 결핍은 또한 HIV 감염으로 발생한 임상적 AIDS의 발병률에 중요한 역할을 할 수 있다.

비타민 B12의 흡수를 간접적으로 측정하기 위하여 1950년부터 실링 뇨중 배설(schilling urinary excretion) 검사가 사용되어 왔으며, 비타민 B12 부족이 확인되고 흡수 불량(malabsorption)이 의심되는 원인인 경우에 사용될 수 있다. 상기 검사는 (⁶⁰Co 또는 ⁵⁷Co와 같은) 방사성(감마선-방출) 코발트로 표지된 생리학적 양의 비타민 B12의 섭취 후 방사능의 뇨중 배설을 위해 비표지된 비타민 B12의 약리학적 비경구 관류 투여량(parenteral flushing dose)을 투여하는 것을 포함한다. 24시간에 걸쳐 소변을 채취하고, 그 후 소변 중의 방사능을 측정하였다. 실링 검사는 수년간 비타민 B12 흡수에 대한 표준 평가법이었지만, (환자 및 의료인들을 작지만 정량화할 수 있는 수준의 감마선에 노출시키며, 방사성 폐기물의 생성을 야기하는) 방사성 동위원소(radioactive isotope)의 사용과 긴 대기 기간(첫 단계를 위해 24시간, 이는 환자 순응도 문제를 야기하며 근본적인 상태 치료를 지연시킴)을 포함하는 많은 단점을 겪고 있다.

US 2012/0264174는 결핍 테스트를 위한 표지된 형태의 비타민 B12를 제조하는 방법뿐만 아니라, 비타민 B12 결핍의 원인을 알아내기 위한 방법을 기술하고 있다. 그러나, 이 방법을 사용하여 제조된 표지된 생성물 또한 방사성 동위원소인 ¹⁴C의 사용(상기에서 논의된 바와 같이, 방사성 동위원소는 건강 및 안정성이 염려됨) 및 복잡한 검출 시스템(특히, 가속기 질량 분석법(accelerator mass spectrometry, AMS)을 포함하는 많은 문제점을 가진다.

AMS는 그것의 크기, 복잡성, 초기 비용 및 운전 비용으로 인해 널리 이용할 수 없는 매우 전문적인 기기이다. 또한, AMS를 위한 샘플의 준비는 (그것이 검출되고 측정되는, 생성된 CO₂에서의 탄소 동위원소이기 때문에) 샘플이 열분해 될(pyrolyzed) 필요가 있다는 사실로 인해 복잡해졌다. 샘플의 준비 방법은 또한 AMS가 동위원소의 공급원에 상관없이 샘플에서 모든 탄소 동위원소의 비를 알아낸다는 것을 의미한다. 예를 들어, ¹³C의 경우, 자연 존재비(natural abundance)는 약 1%이며, 이는 (비타민 B12를 포함하는) 모든 탄소 함유 화합물에서 ¹³C의 랜덤 결합(random incorporation)으로 구성된다. AMS는 본질적으로 표지된 비타민 B12와 백그라운드를 하나의 신호로서 간주하여, 이러한 랜덤하게 결합된 ¹³C의 신호와 ¹³C로 표지된 소량의 비타민 B12 간의 차이점을 알려주지 못한다.

따라서 분석 결과의 정확성은 상반되게 영향 받을 수 있으며 분석을 위한 환자에게 표지된 비타민 B 12 투여의 양에 오로지 의존적이다.

Reference

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따라서, 여러 가지의 매트릭스들(특히 생물학적 매트릭스들)에서 비타민 B12의 정량적 측정을 위한 간단하고, 안전하며 정확한 수단이 요구된다.

본 명세서에서의 임의의 선행 기술에 대한 언급은 이 선행 기술이 임의의 관할권에서의 주지 관용 기술(common general knowledge)의 일부를 형성하거나 이 선행 기술이 관련 기술로서 이해되고 간주되고/되거나 당업자에 의해 선행 기술의 다른 일부와 결합될 것으로 합리적으로 기대될 수 있음에 대한 인정이나 암시가 아니다.

본 발명은 하나 또는 그 이상의 상기 언급된 문제들을 해결하도록 하고/하거나, 비타민 B12 검출 및 측정에서의 현저한 개선을 제공하며, 첫 번째 양상에서 비표지된 비타민 B12에 대하여 적어도 +7의 질량 변화(mass shift)를 가지는 중(heavy) 비타민 B12 유도체를 제공한다. 일 실시예에서, 중 비타민 B12 유도체는 7개의 ¹³C 원자를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 7개의 ¹³C 원자는 비타민의 디메틸벤즈이미다졸 모이어티(dimethylbenzimidazole moiety)에 위치한다.

일 실시예에서, 중 비타민 B12 유도체는 식 (I)의 화합물 또는 그것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물(hydrate), 용매화물(solvate) 또는 프로드러그(prodrug)이다:

여기에서,

R은 5'-데옥시아데노실(5'-deoxyadenosyl), OH, H₂O, CH₃ 또는 CN으로부터 선택되고,

디메틸벤즈이미다졸 모이어티 중 7개의 탄소 원자는 ¹³C 원자이다. 일 실시예에서, 상기 ¹³C 원자는 디메틸벤즈이미다졸 모이어티에만 위치한다.

일 실시예에서, 상기 7개의 ¹³C 원자는 하기와 같이 디메틸벤즈이미다졸 모이어티에 위치한다:

일 실시예에서, 중 비타민 B12 유도체는 하나 또는 그 이상의 듀테륨(deuterium)(즉, ²H) 원자(예를 들어, 2개 또는 3개의 ²H 원자)를 더 포함한다.

두 번째 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 중 비타민 B12 유도체를 제조하기 위한 공정에 관한 것이며, 상기 공정은

- 7개의 ¹³C 원자를 가지는 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 제공하는 단계,

- 코빈아미드 디시아나이드(cobinamide dicyanide)를 제공하는 단계,

- 박테리아의 존재하에 코빈아미드 디시아나이드와 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 접촉시키는 단계,

를 포함하며, 그렇게 함으로써 중 비타민 B12 유도체를 생산한다.

일 실시예에서, ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 9개의 ¹³C 원자이다. 일 실시예에서, ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 또한 하나 또는 그 이상의 ²H 원자를 포함한다.

일 실시예에서, 상기 박테리아는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enteria(S. enterica))이다. 일 실시예에서, 상기 공정은 호기적 조건(aerobic condition) 하에서 수행된다. 상기 공정은 탄소 공급원으로서 에탄올아민(ethanolamine)의 존재하에 수행될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 공정은 7개의 ¹³C 원자를 가지는 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 제조하는 초기 단계(initial step)를 포함한다. 일 실시예에서, 이것은

- ¹³C-표지된 포름산(formic acid)을 제공하는 단계,

- 6개의 ¹³C 원자를 가지는 ¹³C-표지된 디메틸페닐렌디아민(dimethylphenylenediamine)을 제공하는 단계,

- ¹³C-표지된 디메틸페닐렌디아민과 ¹³C-표지된 포름산을 접촉시키는 단계,

를 포함하며, 그렇게 함으로써 7개의 ¹³C 원자를 가지는 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 생산한다.

일 실시예에서, 상기 공정은 필립스(Phillips (1928))에 의해 기술된 것과 같은 가열된(예를 들어, 끓이는 것(boilling)에 의해) 염산(heated hydrochloric acid)의 존재하에 수행된다. ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸의 정제는 예를 들어, Carkeet 등(Carkeet et al., (2006))에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

세 번째 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 것과 같은 중 비타민 B12 유도체, 및 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 물질, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

네 번째 양상에서, 본 발명은 비타민 B12 결핍에 대해 환자를 평가하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

- 유효량의 본원에 기술된 것과 같은 중 비타민 B12 유도체를 환자에게 투여하는 단계,

- 상기 환자로부터 생물학적 유체(fluid) 샘플을 수득하는 단계,

- 상기 샘플에서 중 비타민 B12의 양을 결정하기 위해 샘플을 분석하는 단계

를 포함한다.

다섯 번째 양상에서, 본 발명은 비타민 B12 결핍에 대한 환자를 평가하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

- 유효량의 본원에 기술된 것과 같은 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계,

를 포함한다.

본 발명의 추가 양상들 및 이전 단락들에서 기술된 양상들의 추가 실시예들은 예시의 제시를 통해 그리고 첨부된 도면을 참조로 하기 설명으로부터 명확해질 것이다.

본 발명자들은 비표지된 비타민 B12에 대해 적어도 +7의 질량 이동을 가지는 중 비타민 B12 유도체가 비타민 B12의 더 나은 정량을 가능하게 하며, 거의 모든 생물학적 매트릭스에서의 정량화도 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 이는 적어도 어느 정도는 본 발명의 중 비타민 B12 유도체로부터 얻어진 질량 스펙트럼 신호가 표준(즉, 비표지된) 비타민 B12의 질량-측정의 흔적 밖에 있다는 사실 때문이다. 이는 샘플에서 표지 및 비표지된 비타민 B12 양쪽 모두의 정량화를 가능하게 하며, 또한 표준 질량 분석기를 분석에 사용할 수 있게 한다. 상기 언급한 바와 같이, 현재 방사성 동위원소를 사용하는 분석 방법은 긴 테스트 시간으로 인해 환자에게 불편함을 주고/주거나 분석을 수행하기 위하여 비싸고 복잡한 기기(예를 들어, AMS)의 사용을 필요로 한다.

게다가, 정확한 양의 중 비타민 B12 유도체가 투여될 수 있으며 분석될 샘플에서 비표지된 비타민 B12에 대해 동일한 처리를 거칠 수 있기 때문에, 샘플 처리 동안 임의의 비타민 B12의 손실이 발생하는 경우, 상기 손실은 중 비타민 B12 유도체에 대해 관찰된 손실에 의해 확인될 수 있다. 따라서, 샘플 처리 전 샘플에서의 초기에 비표지된 비타민 B12의 양의 정량화는 중 비타민 B12 유도체가 바로 측정 포인트에서 사용된 경우보다 더 큰 정확도로 계산될 수 있다. 이는 AMS-기반 기술을 사용해서는 가능하지 않다.

또한, 예기치 못하게 본 발명의 중 비타민 B12 유도체는 표준 비타민 B12처럼 동일한 박테리아에 의해 제조될 수 있다. 이는 세균성 효소가 동위원소 변화에 민감할 수 있고, 결합을 위해 선택된 기질에 대한 (+7 질량 단위와 같은) 질량의 큰 변화가 최종 비타민 B12 생성물 내로의 임의의 기질의 혼입을 초래함을 기대할 수 없었기 때문에 예상할 수 없었다.

비타민 B12는 실제로 일종의 화학적으로 관련된(chemically-related) 화합물들(비타머(vitamer))로 이루어지며, 그것들 모두 비타민 활성을 가진다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 인간의 세포에서 효소적 반응에 참여하는 두 개의 비타민은 메틸코발라민(methylcobalamin)과 데옥시아데노실코발라민(deoxyadenosylcobalamin)이고, 그것들은 하기 식 (I)에 나타낸 바와 같이 β-축 리간드의 동일성(identity)에 있어서 서로 다르다:

여기에서, R은 메틸코발라민에 대해서는 CH₃이고, 데옥시아데노실코발라민에 대해서는 5'-데옥시아데노실이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 비타머는 하이드록시코발라민(hydroxycobalamin)(여기에서, R은 OH)과 아쿠아코발라민(aquacobalamin)(여기에서, R은 H₂O)이다.

시아노코발라민(cyanocobalamin) 비타머(여기에서, R은 CN)도 존재하는데, 이는 자연 발생적이지는 않지만 특히 안정한 형태이기 때문에 멀티비타민과 같은 식이 보충제에 통상적으로 사용되는 비타민의 형태이다.

본원에 개시된 화합물의 "약제학적으로 허용 가능한 염(pharmaceutically acceptable salt)"은 일반적으로 해당 기술 분야에서 과도한 독성 또는 발암성(carcinogenicity) 없이, 그리고 바람직하게는 자극, 알러지성 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 인간 또는 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 것으로 간주되는 산 또는 염기 염이다. 이러한 염은 미네랄 및 아민과 같은 염기성 잔기의 유기산 염뿐만 아니라, 알칼리 또는 카르복시산과 같은 산성 잔기의 유기염을 포함한다.

적절한 약제학적으로 허용 가능한 염은 염산(hydrochloric acid), 인산(phosphoric acid), 브롬화수소산(hydrobromic acid), 말산(malic acid), 글리콜산(glycolic acid), 푸마르산(fumaric acid), 황산(sulfuric acid), 술팜산(sulfamic acid), 술파닐산(sulfanilic acid), 포름산(formic acid), 톨루엔술폰산(toluenesulfonic acid), 메탄술폰산(methanesulfonic acid), 벤젠술폰산(benzenesulfonic acid), 에탄디술폰산(ethanedisulfonic acid), 2-하이드록시에틸술폰산(2-hydroxyethylsulfonic acid), 질산(nitric acid), 벤조산(benzoic acid), 2-아세톡시벤조산(2-acetoxybenzoic acid), 시트르산(citric acid), 타르타르산(tartaric acid), 젖산(lactic acid), 스테아르산(stearic acid), 살리실산(salicylic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 팜산(pamoic acid), 숙신산(succinic acid), 푸마르산(fumaric acid), 말레산(maleic acid), 프로피온산(propionic acid), 하이드록시말레산(hydroxymaleic acid), 요오드화 수소산(hydroiodic acid), 페닐아세트산(phenylacetic acid), 알칸산(alkanoic acid) (예컨대 아세틱(acetic) 산, H0OC-(CH₂)_n-COOH, 여기에서 n은 0 내지 6에서의 임의의 정수, 즉 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6임) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유사하게는, 약제학적으로 허용 가능한 양이온은 소디움(sodium), 포타슘(potassium), 칼슘(calcium), 알루미늄(aluminum), 리튬(lithium) 및 암모늄(ammonium)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 통상의 기술자는 본원에 제공된 화합물에 대한 추가의 약제학적으로 허용 가능한 염을 알 수 있을 것이다. 일반적으로, 약제학적으로 허용 가능한 산성 또는 염기 염은 임의의 기존의 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 포함하는 모 화합물(parent compound)로부터 합성될 수 있다. 간단하게는, 이와 같은 염은 물에 녹인, 또는 (에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은) 유기 용매에 녹인, 또는 그 두 개의 혼합물에 녹인 화학량론적(soichiometric) 양의 적절한 염기 또는 산과 함께 유리산 또는 유리 염기 형태의 이들 화합물을 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물은 수화물 또는 용매화물로서 존재할 수 있으나, 존재할 필요는 없다. 게다가, 다양한 결정형 및 다형체(polymorph)가 본 발명의 범위 내에 있으며, 이러한 것들은 본원에 제공된 화합물의 프로드러그임을 알 수 있을 것이다.

"프로드러그(prodrug)"는 본원에 제공된 화합물의 구조적 요구조건을 모두 만족시킬 수는 없으나, 대상체 또는 환자에게 투여된 후 생체 내(in vivo)에서 변형되어 본원에 제공되는 것과 같은 중 비타민 B12 유도체를 생성하는 화합물이다. 예를 들어, 프로드러그는 중 비타민 B12 유도체의 아실화된 유도체일 수 있다. 프로드러그는 포유동물 대상체에 투여되었을 때 유리 하이드록실 또는 아민 그룹 각각을 형성하도록 절단되는 임의의 그룹에 하이드록실 또는 아민 그룹이 결합된 화합물을 포함한다. 프로드러그의 예는 중 비타민 B12 유도체 내의 아민 작용기의 아세테이트, 포메이트, 포스페이트 및 벤조에이트 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 프로드러그는 변형(modification)이 모 화합물을 생성하도록 생체 내(in vivo)에서 절단되는 것과 같은 방법으로 화합물에 존재하는 작용기를 변경함으로써 제조될 수 있다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "중 비타민 B12 유도체(heavy vitamin B12 derivative)"는 그것의 구조에 표준 비타민 B12의 질량보다 큰 질량을 가지는 비타머가 만들어지게 하는 하나 또는 그 이상의 동위원소를 포함하는 비타민 B12 비타머를 말한다. 본 발명에 따르면, 상기 중 비타민 B12 유도체는 비표지된(또는 "표준") 비타민 B12에 대해 적어도 +7의 질량 변화를 가진다. 이는 7개의 ¹³C 원자의 존재로 인한 것일 수 있다. 일 실시예에서, 중 비타민 B12 유도체는 비표지된(또는 "표준") 비타민 B12에 대해 적어도 +9의 질량 변화를 가진다. 이는 7개의 ¹³C 원자와 2개의 ²H 원자로 인한 것이거나, 9개의 ¹³C 원자로 인한 것일 수 있다. 일 실시예에서, ¹³C 원자는 단지 디메틸벤즈이미다졸 모이어티에만 위치한다. 일 실시예에서, ²H 원자 또한 디메틸벤즈이미다졸 모이어티에만 위치한다.

통상의 기술자는 표준 비타민 B12가 그것의 구조의 일부로서 하나 또는 그 이상의 추가적인 동위원소를 포함할 수 있으며 - 특히, ¹³C이 낮은 존재비(약 99%의 존재비를 가지는 ¹²C에 비하여 약 1%)로 발견되는 탄소의 자연 발생적이며 안정한(즉, 비방사성(non-radioactive)) 동위원소임을 이해할 것이다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 ¹³C 동위원소의 자연 결합(natural incorporation)에 의한 비타민 B12의 표준 질량 또한 다양하며, 질량 분석기로 분석하였을 때 "주(main)" 피크뿐만 아니라 비타민의 다양한 동위원소-함유 형태에 대한 다중(multiple) 피크를 포함하는 스펙트럼을 생성할 것이다. 이들 추가 피크는 "섀도(shadow)" 또는 "트레이스(trace)"라 불리며, 이들 유도체들 중 대다수가 이 "섀도"에 포함되는 질량을 가지기 때문에 공지의 비타민 B12 유도체의 분석 및 정량화를 어렵게 만든다. 본 발명은 (m/z 1355의 질량 이온을 가지는) 비표지된 비타민 B12에 대해 적어도 +7의 질량 변화를 가지는 중 비타민 B12 유도체를 사용함으로써, 유도체에 대한 피크가 섀도 또는 트레이스 바깥에 잘 나타나서 표준 비타민 B12와 중 비타민 B12 유도체 양쪽 모두의 간단하고 정확한 정량화가 가능해진다는 발견에 기초하고 있다.

이러한 증가된 분해능(resolution)을 가능하게 하기 위해서는, 중 비타민 B12 유도체가 다중 동위원소 질량 변이체(multiple isotope mass variant)보다는 대개 단일 질량을 가지는 단일 동위원소 종으로서 존재하는 것이 바람직하다. "대개(predominantly)"는 중 비타민 B12 유도체의 적어도 90%가 단일 질량을 가지는 것을 의미한다. 예를 들어, 중 비타민 B12 유도체의 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%가 단일 질량(예를 들어, 비표지된 비타민 B12에 대해 +7)을 가진다.

적어도 비표지된 비타민 B12의 비율이 주된(primary) 피크에 관하여 더 높은 질량을 가질 수 있음을 의미하는 비타민 B12에서의 ¹³C의 자연 존재비에 따라, 비표지된 비타민 B12로부터 질량 변화는 표지된 비타민 B12의 샘플 전체에 걸쳐 가능한 일관되는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 형태로, 중 비타민 B12의 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%가 ¹³C 및/또는 ²H를 이용한 표지로 인해 단일 질량 변화를 가진다.

중 비타민 B12 유도체는 비표지된 비타민 B12에 대해 7 원자 질량 단위 미만으로 질량이 변화된 현저한 양의 비타민 B12를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 즉, 중 비타민 B12 유도체는 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의, 비표지된 비타민 B12에 대해 7 원자 질량 단위 미만으로 변화된 질량을 가지는 비타민 B12를 가진다.

일 실시예에서, 본 발명의 중 비타민 B12 유도체는 적어도 m/z 1362의 1차 질량 이온을 가진다. 추가 동위원소가 중 비타민 B12 유도체의 구조 내로 혼입되면, 질량이 변할 것이다(1차 질량 이온의 m/z도 그럴 것이다). 예를 들어, 다른 ¹³C 원자가 중 비타민 B12 유도체의 구조 내로 혼입되면, 1차 질량 이온은 1363의 m/z를 가질 것이다(이는 +8의 질량 변화에 해당함). 수소 원자가 예를 들어, 듀테륨 원자 (²H)로 치환된다면, 질량에서의 동일한 변화가 일어날 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 중 비타민 B12 유도체는 하나 또는 그 이상의 ²H 원자(예를 들어, 2개 또는 3개의 ²H 원자)를 더 포함한다. 일 실시예에서, 중 비타민 B12 유도체는 3개의 ²H 원자를 더 포함한다. 중 비타민 B12 유도체가 이미 7개의 ¹³C 원자를 포함한다면, 총 질량 변화는 비표지된 비타민 B12에 대해 +10이 될 것이다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 중 비타민 B12 유도체는 비표지된 비타민 B12에 대해 +7 내지 +10(즉, +7, +8, +9 또는 +10)의 질량 변화를 가진다. 이는 논의된 바와 같이, 단지 한 형태의 동위원소(예를 들어, 단지 ¹³C) 또는 동위원소들의 조합(예를 들어, ¹³C와 ²H)을 사용함으로써 달성될 수 있다.

동위원소는 비타민 B12 구조의 어디에든 위치할 수 있다. 일 실시예에서, 동위원소(예를 들어, 7개의 ¹³C 원자)는 비타민의 디메틸벤즈이미다졸 모이어티에 위치한다. 일 실시예에서, 동위원소는 비타민의 디메틸벤즈이미다졸 모이어티에만 위치한다. 일 실시예에서, 추가 동위원소(예를 들어, ²H)는 또한 비타민의 디메틸벤즈이미다졸 모이어티에 위치한다.

본 발명은 또한 본 발명의 중 비타민 B12 유도체를 제조하기 위한 공정에 관한 것이며, 상기 공정은

- 코빈아미드 디시아나이드를 제공하는 단계,

- 박테리아의 존재하에 코빈아미드 디시아나이드와 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 접촉시키는 단계

일 실시예에서, ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 8개의 ¹³C 원자를 가진다. 일 실시예에서, ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 9개의 ¹³C 원자를 가진다. 일 실시예에서, ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 또한 하나 또는 그 이상의 ²H 원자를 포함한다. 예를 들어, ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 7개의 ¹³C 원자와 2개의 ²H 원자를 가질 수 있다.

(7개, 또는 그 이상의 ¹³C 원자 및 선택적으로 하나 또는 그 이상의 ²H 원자를 가지는) 정제된 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 통상 예를 들어, 아이소사이언시스 엘엘씨(Isosciences LLC)(PA, USA)로부터 cat#13422로 구입할 수 있다.

일 실시예에서, 박테리아는 살모넬라 엔테리카(S. enteria)이다. 예를 들어, 살모넬라 엔테리카 혈청형(serovar) 장티푸스균(S. typhimurium)이 적합한 종이다. 특히 적합한 균주는 PA09이며, 이것은 박테리아가 성장 중에 혐기성이 되면 자체(즉, 비표지된) 비타민 B12를 합성하는 것을 막는 돌연변이를 가진다. 일 실시예에서, 상기 공정은 호기성 조건하에서 수행된다. 공정은 탄소 공급원으로서 에탄올아민의 존재하에 수행될 수 있다.

본 발명에 적합한 공정의 예는 Carkeet 등에 기술되어 있는 것이다(Carkeet et al., (2006)[5]) (도 1 참조). 요약하면, 박테리아는 단독 탄소 공급원으로서 제공된 에탄올아민을 갖는 최소 성장 배지에서 호기적으로 성장한다. 에탄올아민에서의 박테리아의 성장은 비타민 B12의 존재에 의존한다. 기질 ¹³C₇-5,6-디메틸벤즈이미다졸과 코빈아미드 디시아나이드가 성장 배지로서 제공된다. 박테리아 세포에서 효소 CobA, T, U, S 및 EutT는 합성을 가능하게 하며, 생성물은 ¹³C₇-5'-데옥시아데노실코발라민이다.

일 실시예에서, 공정은 7개의 ¹³C 원자를 가지는 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 제조하는 초기 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 이는

- ¹³C-표지된 포름산을 제공하는 단계,

- 6개의 ¹³C 원자를 가지는 ¹³C-표지된 디메틸페닐렌디아민을 제공하는 단계,

- ¹³C-표지된 디메틸페닐렌디아민과 ¹³C-표지된 포름산을 접촉시키는 단계

¹³C-표지된 포름산과 6개의 ¹³C 원자를 가지는 ¹³C-표지된 디메틸페닐렌디아민은 통상 예를 들어, 캠브리지 아이소토프 래보래토리즈(Cambridge Isotope Laboratories, Inc.)(Tewksbury, MA, USA)로부터 입수할 수 있다. 6개 초과의 ¹³C 원자(예를 들어, 8개의 ¹³C 원자), 및 선택적으로 하나 또는 그 이상의 ²H 원자를 가지는 ¹³C-표지된 디메틸페닐렌디아민 또한 캠브리지 아이소토프 래보래토리즈(Cambridge Isotope Laboratories, Inc.)(Tewksbury, MA, USA)와 같은 통상의 공급원으로부터 구입할 수 있다.

일 실시예에서, 공정은 가열된(예를 들어, 끓이는 것에 의해) 염산의 존재하에 수행된다. ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸의 제조를 위한 본 발명에 적합한 공정의 예는 Phillips에 기술되어 있는 것이다(Phillips (1928))[4].

본원에 기술된 공정은 본 발명의 비타민 B12 유도체를 제공하는 간단하고 효율적인 수단을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이, 세균성 효소가 동위원소 변화에 민감할 수 있고, 결합을 위해 선택된 기질에 대한 (+7 질량 단위와 같은) 질량의 큰 변화가 최종 비타민 B12 생성물 내로의 기질의 혼입을 초래함을 기대할 수 없었기 때문에, 본 발명의 중 비타민 B12 유도체가 이러한 방식으로 제조될 수 있다는 것은 발명자가 예상할 수 없었다.

본 발명은 또한 본 발명의 중 비타민 B12 유도체, 및 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 물질, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

"약제학적 담체(carrier), 희석제(diluent) 또는 부형제(excipient)"는 적절한 수용성 담체(water soluble carrier), 기존의 용매(conventional solvent), 분산 매질(dispersion media), 필러(filler), 고체 담체(solid carrier), 코팅제(coating), 항세균제(antibacterial agent)와 항진균제(antifungal agent), 등장화제(isotonic agent) 및 흡수 지연제(absorption delaying agent)를 포함하는 임의의 생리학적으로 완충된(즉, 약 pH 7.0 내지 7.4) 배지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적절한 수용성 담체는 물, 염용액(saline), 덱스트로스(dextrose), 옥수수유(corn oil), 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide) 및 젤라틴 캡슐(gelatin capsule)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 기존의 첨가제는 락토오스(lactose), 만니톨(mannitol), 옥수수 전분(corn starch), 감자 전분(potato starch); 미세결정 셀룰로오스(crystalline cellulose), 셀룰로오스 유도체(cellulose derivative), 아카시아(acacia), 젤라틴과 같은 결합제(binder); 소디움 카르복시메틸-셀룰로오스와 같은 붕괴제(disintegrator) 및 탈크(talc) 또는 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)와 같은 윤활제(lubricant)를 포함한다.

약제학적 조성물은 예를 들어, 국소(예를 들어, 경피(transdermal) 또는 안구(ocular)), 경구(oral), 구강(buccal), 경비(nasal), 질(vaginal), 직장(rectal) 또는 비경구(parenteral) 투여를 포함하는 임의의 적절한 투여 방법을 위해 제형화될 수 있다. 특정 실시예에서, 경구용 또는 비경구용에 적합한 형태인 조성물이 바람직하다.

적절한 경구 형태는 예를 들어, 수용액(aqueous solution), 정제(tablet), 트로키(troche), 로젠지(lozenge), 수성 또는 유성 현탁액(suspension), 현탁용(dispersible) 분말 또는 과립, 에멀전(emulsion), 경질(hard) 또는 연질(soft) 캡슐, 또는 시럽(syrup) 또는 엘릭시르(elixir)를 포함한다. 정맥 내(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous) 또는 복강내(intraperitoneal) 투여를 위하여, 하나 또는 그 이상의 화합물은 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 멸균 수용액과 혼합될 수 있다. 성분들의 예는 문헌[Martindale - The Extra Pharmacopoeia (Pharmaceutical Press, London 1993)]에 기술되어 있다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "비경구(parenteral)"는 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 혈관내(intravascular)(예를 들어, 정맥내), 근육내, 척추(spinal), 두개내(intracranial), 척추강내(intrathecal), 안구내(intraocular), 안구주위(periocular), 안와내(intraorbital), 활액내(intrasynovial) 및 복강내 주사(injection)뿐만 아니라, 임의의 유사한 주사 또는 주입(infusion) 기술을 포함한다. 정맥내 투여가 바람직하다.

비경구 제형의 적절한 성분과 그러한 제형을 제조하는 방법은 (상기와 같은) 문헌[Martindale] 및 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences"]을 포함하는 다양한 교재들에 기술되어 있다. 약제학적 조성물은 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 물, 버퍼(예를 들어, 중성 완충 식염수, 인산 완충 식염수, 시트레이트 및 아세테이트), 에탄올, 오일, 탄수화물(예를 들어, 글루코오스, 프룩토스, 만노오스, 수크로오스 및 만니톨), 단백질, 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산, 항산화제(예를 들어, 소디움 바이설파이트(sodium bisulfite)), (포타슘 및 칼슘 클로라이드와 같은) 긴장 조정제(tonicity adjusting agent), EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이팅제(chelating agent), 비타민 및/또는 방부제(preservative)를 포함할 수 있다. 이와 같은 제형은 소디움 클로라이드 또는 글리신과 같은 생리학적으로 적합한(physiologically compatible) 물질을 포함하고, 수용액을 만들기 위해 생리학적 조건에 적합한 완충된 pH를 가지는 물에 고체 활성 성분을 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 제형은 밀봉된 앰풀(ampoule) 또는 바이알(vial)과 같은 단위 용량(unit dose) 또는 다중 용량(multi-dose) 용기에 존재할 수 있다.

본 발명은 또한 비타민 B12 결핍에 대하여 환자를 평가하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

- 유효량의 본 발명에 따른 중 비타민 B12 유도체 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계,

- 환자로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계, 및

- 상기 샘플에서 중 비타민 B12 유도체의 양을 결정하기 위해 샘플을 분석하는 단계

를 포함한다.

상기 용어 "유효량(effective amount)"은 환자로부터 수득된 샘플에서 검출 가능한 양의 유도체를 생성시키는 본 발명의 중 비타민 B12 유도체의 양을 말한다. 본 발명의 유도체 또는 약제학적 조성물의 투여 형태 및 양은 공지의 분석법을 참고함으로써 쉽게 달성될 수 있다.

임의의 특정한 환자에 대한 특정 투여 수준 및 유도체가 환자의 관련 생물학적 유체에 존재하는데 걸리는 시간의 길이는 연령, 체중, 일반 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 방법 및 흡수율을 포함하는 다양한 인자들에 좌우될 수 있다는 것 또한 이해할 수 있을 것이다.

통상의 기술자들은 독성의 관점에서 문제를 일으키지 않고 최적의 평가 능력을 달성하기 위하여 어느 정도의 중 비타민 B12 유도체를 환자에게 투여하여야 하는지 알 것이다. 본 발명의 중 비타민 B12 유도체의 적절한 단일 용량(single dose)은 예를 들어, 지방이 적은 표준의 간단한 아침식사 전에 수용액으로 경구 투여된 1.5 마이크로그램이다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 중 비타민 B12 유도체는 약 1.5 마이크로그램의 양으로 투여된다. 일 실시예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 약 1.5 마이크로그램의 양의 본 발명의 중 비타민 B12 유도체와 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 물질, 희석제 또는 부형제를 포함한다.

본 발명의 중 비타민 B12 유도체는 환자가 비타민 B12 결핍을 갖는지 여부를 임상의가 알아낼 수 있도록 돕는 데 특정 용도를 가진다. 본 발명의 중 비타민 B12 유도체는 또한 대상체에서 비타민 B12의 흡수를 연구하는데 사용될 수 있고, 그렇게 함으로써 환자가 비타민 B12 흡수불량(malabsorption)으로 고통받고 있는지 여부를 임상의가 알아낼 수 있도록 돕는다.

환자는 본원에 기술된 것과 같은 복용량을 가지는, 영장류, 특히 인간, 개, 고양이, 말과 같은 가축화된 반려동물, 및 소, 돼지 및 양과 같은 가축을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

환자로부터 수득한 생물학적 샘플의 분석은 일반적으로 질량 분석기에 연결된 출력부(output)를 갖춘 고속액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 사용하여 수행될 것이다. 분리에 적합한 HPLC의 예는 역상(reversed-phase) C18:0 컬럼에 연결된 워터스 얼라이언스 HPLC 시스템(Waters Alliance HPLC system)(Waters, Rydalmere, NSW, Australia)일 수 있다. 분리에 적합한 이동상(mobile phase)은 예를 들어, Carkeet 등(Carkeet et al., (2006))에 기술된 것과 같은 메탄올 및 물일 수 있다. 분석에 적합한 질량 분석기의 예는 2,000까지의 m/z 범위를 가지는 아비온 익스프레션 L(advion Expression L)(Advion, Inc. Ithaca ,NY, USA)과 같은 단일 사중극자(single quadrupole) 질량 분석기일 수 있다.

본 발명의 중 비타민 B12 유도체의 분석을 위한 이러한 기기를 사용하여, 환자로부터 얻은 10 mL의 혈액 샘플을 3개의 동일한 부피의 부샘플(subsample)로 나눌 수 있다: 부샘플 1, 부샘플 2 및 부샘플 3. 부샘플 1에 ¹³C₇-시아노코발라민이 10 ng과 같은 정확한 양으로 첨가될 수 있다. 부샘플 2에 ¹³C₇-메틸코발라민이 10 ng과 같은 정확한 양으로 첨가될 수 있다. 부샘플 3에 ¹³C₇-아데노실코발라민이 10 ng과 같은 정확한 양으로 첨가될 수 있다. 적혈구는 예를 들어, 2500 × g에서 20분간 원심분리에 의해 혈청으로부터 분리될 수 있다. 그 후, 혈청은 제조자의 설명서에 따라 제조 후에 예를 들어, C18:0 컬럼(Waters)과 같은 고체-상(solid-phase) 추출 카트리지에 적용될 수 있다. 컬럼은 3배의 충전 부피(three bed volume)의 멸균수로 세척되고, 1배 컬럼 부피(one column volume)의 100% 메탄올로 용출될 수 있다. 부샘플은 그 후 45℃ 진공하에서 건조되고, 50 마이크로리터의 물에 용해되며, 각 샘플은 각각 HPLC/MS에 사용된다.

본 명세서에 개시되고 정의된 발명은 본문 또는 도면에 언급되거나 분명하게 드러난 두 개 이상의 각각의 특징들의 모든 대안적인 조합들까지 확장된다. 이 모든 서로 다른 조합들은 발명의 다양한 대안적인 양상을 이루고 있다.

도 1은 살모넬라 엔테리카의 세포에 의해 매개된 본 발명의 정제된 중 비타민 B12 유도체(¹³C₇-비타민 B12)의 효소적 합성의 개요를 나타낸 것이다.
도 2는 도 1에 개략적으로 나타낸 합성에 의해 생산된, 매우 높은(>98%) 특이 활성도(specific activity)의 본 발명의 정제된 중 비타민 B12 유도체(¹³C₇-비타민 B12)의 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다. (a) 살모넬라 엔테리카 생합성을 통해 생산된 ¹³C₇-비타민 B12의 질량 스펙트럼은 중 비타민 B12 유도체의 디메틸벤즈이미다졸 모이어티에의 7개의 ¹³C 원자의 결합으로 인해 비표지된 비타민 B12에 대해 예상된 +7의 질량 이동과 일치하는, 1차 이온(primary ion) m/z 1362를 나타내었다. (b) 비교를 위한 비표지된 비타민 B12의 질량 스펙트럼은 예상된 1355의 1차 이온 m/z를 나타내었다. 도면에서 양쪽 스펙트럼 모두 예를 들어, 자연 발생적인(naturally occurring) ¹³C의 결합으로 인해 2차 m/z 피크를 가짐에 유의한다.

실시예

합성

¹³ C ₇ -시아노코발라민( ¹³ C ₇ -B12)의 합성

이 실시예에서 사용된 박테리아 성장 배지에 관한 상세한 사항은 하기를 더 참조하라.

단일 콜로니(single colony)를 얻기 위해 살모넬라 엔테리카 균주 PA09(Charles Sturt University, Orange, NSW, Australia)를 LB 플레이트 상에 스트리킹하고, 15시간 동안 37℃에서 호기적으로 배양하였다. 그 후, 무균 조작법을 사용하여 PA09의 단일 콜로니를 10 mL의 멸균 LB 배지(LB broth) 내로 접종하고, 세포가 정지상(stationary phase)에 이를 때까지 통상적으로 200 RPM에서 진탕하면서 37℃에서 8 - 12시간 동안 호기적으로 성장시켰다. 그 후, 1 mL의 이 LB 배지를 1% 멸균 글리세롤이 첨가된 100 mL의 멸균 NCE 배지에 접종한 후, 200 RPM에서 진탕하면서 24시간 동안 호기적으로 성장시켰다. 그 후, 단독 탄소 공급원으로서 멸균 에탄올아민 40 mM, 멸균된 0.5 마이크로몰의 디시아노코빈아미드 및 멸균된 2 마이크로몰의 ¹³C₇-디메틸벤즈이미다졸을 최종 농도로 첨가한 1% vol/vol 4 리터의 멸균 NCE 성장 배지에 접종하기 위해 100 mL의 NCE/글리세롤 배지를 사용하였다. 그 후, 4 L의 NCE 배양물을 예를 들어, 세포가 분광 광도계의 600 nm에서 측정되는 것으로서 적어도 1.0 그리고 전형적으로 1.50의 광학 밀도(optical density)로 성장할 때까지, 48시간 동안 37℃에서 배양기에서 진탕하며 1 L의 쇼트 보틀(schott bottle)에서 호기적으로 성장시켰다. 20분간 20,000 × g에서 원심분리하여 박테리아 세포를 회수하고, 상층액은 제거하여 버렸다(또는 포함되지 않은 기질 또한 원한다면 회수될 수 있다).

박테리아 세포로부터 ¹³ C ₇ -B12의 추출

세포 펠릿을 동일한 부피의 NCE 배지에 재현탁한 후, 9배의 추가 부피의 에탄올을 세포에 첨가하였다. 흄 후드(fume hood) 아래에서, 2 - 5 mg 사이의 소디움 시아나이드를 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물에 뚜껑을 덮은 후, 진탕하면서 45℃에서 60 - 120분간 가열하였다. 그 결과 생성된 혼합물을 20분간 20,000 × g에서 원심분리하고, ¹³C₇-B12를 포함하는 핑크색 상층액을 제거하고, 55℃에서 진공하에 건조시키고, 2 mL의 밀리-큐(Milli-Q)(탈이온화된) 물에 재현탁하였다. 핑크색 혼합물을 제조사의 설명서에 따라 미리 제조된 C18:0 고체 상 추출 카트리지(Waters)에 적용하였다. ¹³C₇-B12 및 다른 관련 화합물은 C18:0 고체 상 카트리지에 결합한다. 그 후, 양극성 오염물질(polar contaminant)을 제거하기 위해 상기 컬럼을 10배 부피의 밀리-큐 물로 세척하였다. 부분적으로 정제된 ¹³C₇-B12를 2배 충전 부피의 에탄올로 컬럼으로부터 용리시킨 후, 60℃에서 진공하에 건조시켰다.

¹³ C ₇ -B12의 HPLC 정제

하기 작동 조건을 사용하여 Eclipse XBD C18 컬럼 4.6 mm × 150 mm, 3.5 마이크로 상에서 역상(reversed-phase) HPLC에 의해 ¹³C₇-B12를 정제하였다: 이동상 A: 0.1% 포름산을 포함하는 H₂O, 이동상 B: 아세토니트릴, 10분에 걸쳐 펌프 5 - 35% B, 10분에 걸쳐 35 - 95% B, 361 nm에서 UV, 흐름 속도(flow rate) 1 mL/분.

0.24분의 폭을 가지는 6.162분에서 용리되는 피크는 ¹³C₇-B12이다. 그것은 약 96%의 순도에서 수집하였다. 모든 ¹³C₇-B12가 정제될 때까지, 오토인젝터(autoinjector)를 이용하여 상기 공정을 이 구성(setup)으로 반복하였다.

¹³ C ₇ -B12의 합성을 위한 박테리아 성장 배지

LB 플레이트 (1 리터)

800 mL의 H₂O에 하기의 것들을 첨가

10 g의 박토-트립톤(Bacto-tryptone)

5 g의 효모 추출물

10 g의 NaCl

15 g의 박테리아 등급의 아가(bacterial grade agar)

필요하다면, NaOH를 이용하여 pH 7.5로 조정

H₂O(밀리큐)로 부피를 1L로 조정

오토클레이브 121℃/15분의 습윤 사이클(wet cycle)

LB 배지 (1 리터)

800 mL의 H₂O에 하기의 것들을 첨가함

10 g의 박토-트립톤

5 g의 효모 추출물

10 g의 NaCl

필요하다면, NaOH를 이용하여 pH 7.5로 조정

H₂O(밀리큐)로 부피를 1L로 조정

오토클레이브 121℃/15분의 웨트 사이클(wet cycle)

NCE-에탄올아민 성장 배지 (500 mL 부피)

10 mL의 50× NCE 염 용액

50 mL의 에탄올아민 스톡 용액

500 mL까지의 밀리큐 물

50X NCE 염 (1 리터 부피)

젠틀 사이클로 오토클레이크 - 121℃, 30분간

교반 블록에서 330 mL의 dH₂O를 가열(끓이지 않음)

아래 열거된 순서대로 화학물질을 하나씩 용해시키고, 다음 첨가 전에 각각을 완전하게 용해시킴

197 g의 KH₂PO₄

323 g의 KH₂PO₄·3H₂O (무수물에 대하여 246.6 g)

175 g의 NaNH₄HPO₄·4H₂O

dH₂O를 이용하여 1000 mL의 최종 부피가 되도록 만듬

리퀴드 사이클, 121℃에서 오토클레이브

암모니아로서 암모늄 이온의 손실을 제한하기 위해 4℃에 저장

1 M MgSO ₄ (50× 스톡, 100 mL 부피)

24.65 g의 MgSO₄ (246.5 g/mol)

100 mL의 dH₂O

필터 멸균 또는 오토클레이브. 상온에 저장.

에탄올아민 (10× 스톡, 500 mL 부피)

16 g의 에탄올아민 HCL (Sigma)

500 mL의 H₂O

리퀴드 사이클, 121℃에서 오토클레이브

Claims

비표지된(unlabelled) 비타민 B12에 대하여 +7 내지 +10의 질량 변화(mass shift)를 가지는 중 비타민 B12 (heavy vitamin B12)로서, 중 비타민 B12는 7 내지 9개의 ¹³C 원자를 포함하고, 그리고 7 내지 9개의 ¹³C 원자는 중 비타민 B12의 디메틸벤즈이미다졸 모이어티(dimethylbenzimidazole moiety)에 위치하며, 중 비타민 B12는 비타민의 디메틸벤즈이미다졸 모이어티 내에서 선택적으로 하나 또는 그 이상의 ²H 원자를 더 포함하며, 그리고
중 비타민 B12는 식 (I)의 화합물, 또는 그것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물 또는 용매화물인 것인, 중 비타민 B12:

여기에서,
R은 5'-데옥시아데노실(5'-deoxyadenosyl), OH, CH₃ 또는 CN으로부터 선택되는 것임.
제1항에 있어서,
중 비타민 B12는 7개의 ¹³C 원자를 포함하는 것인, 중 비타민 B12.
제1항에 있어서,
중 비타민 B12는 비표지된 비타민 B12에 대하여 +7의 질량 변화를 가지는 것인, 중 비타민 B12.
제1항에 있어서,
중 비타민 B12는 비표지된 비타민 B12에 대하여 +9의 질량 변화를 가지는 것인, 중 비타민 B12.
제1항에 있어서,
약제학적으로 허용 가능한 염은 염산(hydrochloric), 인산(phosphoric), 브롬화수소산(hydrobromic), 말산(malic), 글리콜산(glycolic), 푸마르산(fumaric), 황산(sulfuric), 술팜산(sulfamic), 술파닐산(sulfanilic), 포름산(formic), 톨루엔술폰산(toluenesulfonic), 메탄술폰산(methanesulfonic), 벤젠술폰산(benzenesulfonic), 에탄디술폰산(ethanedisulfonic), 2-하이드록시에틸술폰산(2-hydroxyethylsulfonic), 질산(nitric), 벤조산(benzoic), 2-아세톡시벤조산(2-acetoxybenzoic), 시트르산(citric), 타르타르산(tartaric), 젖산(lactic), 스테아르산(stearic), 살리실산(salicylic), 글루탐산(glutamic), 아스코르브산(ascorbic), 파모산(pamoic), 숙신산(succinic), 말레산(maleic), 프로피온산(propionic), 하이드록시말레산(hydroxymaleic), 요오드화 수소산(hydroiodic), 페닐아세트산(phenylacetic), 알칸산(alkanoic), 소디움(sodium), 포타슘(potassium), 칼슘(calcium), 알루미늄(aluminum), 리튬(lithium) 및 암모늄(ammonium)염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 중 비타민 B12.
제2항에 있어서,
7개의 ¹³C 원자는 하기와 같이 디메틸벤즈이미다졸 모이어티에 위치하는 것인, 중 비타민 B12.
제1항에 있어서,
중 비타민 B12는 하나 또는 그 이상의 ²H 원자를 더 포함하는 것인, 중 비타민 B12.
제7항에 있어서,
중 비타민 B12는 2개의 ²H 원자를 더 포함하는 것인, 중 비타민 B12.
비표지된(unlabelled) 비타민 B12에 대하여 +7 내지 +10의 질량 변화(mass shift)를 가지는 중 비타민 B12 (heavy vitamin B12)로서, 중 비타민 B12는 7 내지 9개의 ¹³C 원자를 포함하고, 그리고 7 내지 9개의 ¹³C 원자는 중 비타민 B12의 디메틸벤즈이미다졸 모이어티(dimethylbenzimidazole moiety)에 위치하며, 중 비타민 B12는 비타민의 디메틸벤즈이미다졸 모이어티 내에서 선택적으로 하나 또는 그 이상의 ²H 원자를 더 포함하며, 그리고
중 비타민 B12는 아쿠아코발라민(aquacobalamin), 또는 그것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 또는 용매화물인 것인, 중 비타민 B12.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 중 비타민 B12, 및 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 물질, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 비타민 B12 결핍에 대하여 환자를 평가하는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
7 내지 9개의 ¹³C 원자를 가지는 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 제공하는 단계,
코빈아미드 디시아나이드(cobinamide dicyanide)를 제공하는 단계,
박테리아의 존재하에 코빈아미드 디시아나이드와 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 접촉시키는 단계
를 포함하며, 그렇게 함으로써 중 비타민 B12를 제조하는, 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 중 비타민 B12를 제조하기 위한 공정.
제11항에 있어서,
¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 7개의 ¹³C 원자를 갖는 것인, 공정.
제11항에 있어서,
¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 8개의 ¹³C 원자를 갖는 것인, 공정.
제11항에 있어서,
¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 9개의 ¹³C 원자를 가지는 것인, 공정.
제11항에 있어서,
¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 하나 또는 그 이상의 ²H 원자를 더 포함하는 것인, 공정.
제15항에 있어서,
¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 2개의 ²H 원자를 더 포함하는 것인, 공정.
제11항에 있어서,
박테리아는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica, S. enterica)인 것인, 공정.
제11항에 있어서,
공정은 호기적 조건하에서 수행되는 것인, 공정.
제11항에 있어서,
공정은 탄소 공급원으로서 에탄올아민의 존재하에 수행되는 것인, 공정.
제11항에 있어서,
공정은 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 제조하는 초기 단계를 포함하는 것인, 공정.
제20항에 있어서,
초기 단계는
¹³C-표지된 포름산(formic acid)을 제공하는 단계,
6개의 ¹³C 원자를 가지는 ¹³C-표지된 디메틸페닐렌디아민(dimethylphenylenediamine)을 제공하는 단계,
¹³C-표지된 디메틸페닐렌디아민과 ¹³C-표지된 포름산을 접촉시키는 단계,
를 포함하며, 그렇게 함으로써 ¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸을 생산하는 것인, 공정.
제21항에 있어서,
가열된 염산의 존재하에 수행되는 것인, 공정.
환자로부터의 생물학적 유체(fluid) 샘플에서 비표지된 비타민 B12에 대하여 +7 내지 +10의 질량 변화(mass shift)를 가지는 중 비타민 B12(heavy vitamin B12)의 양을 결정하기 위하여, 상기 샘플을 분석하는 단계
를 포함하는, 비타민 B12 결핍에 대하여 환자를 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
상기 환자는 상기 생물학적 유체 샘플이 비표지된 비타민 B12에 대하여 +7 내지 +10의 질량 변화를 가지는 중 비타민 B12의 유효량을 포함하도록, 제1항 내지제9항 중 어느 한 항에 따른 중 비타민 B12의 양을 투여받았던 것인, 방법.
제23항에 있어서,
¹³C-표지된 5,6-디메틸벤즈이미다졸은 8개의 ¹³C 원자를 갖는 것인, 방법
환자로부터의 생물학적 유체(fluid) 샘플에서 비표지된 비타민 B12에 대하여 +7 내지 +10의 질량 변화(mass shift)를 가지는 중 비타민 B12(heavy vitamin B12)의 양을 결정하기 위하여, 상기 샘플을 분석하는 단계
를 포함하는, 비타민 B12 결핍에 대하여 환자를 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
상기 환자는 상기 생물학적 유체 샘플이 비표지된 비타민 B12에 대하여 +7 내지 +10의 질량 변화를 가지는 중 비타민 B12의 유효량을 포함하도록, 중 비타민 B12를 포함하는 약제학적 조성물을 투여받았던 환자이며,
중 비타민 B12를 포함하는 약제학적 조성물은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 중 비타민 B12, 및 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 물질, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 방법.
제23항에 있어서,
생물학적 유체(fluid) 샘플은 혈액 샘플인 것인, 방법.
제23항에 있어서, 분석은 환자가 비타민 B12 결핍을 갖는지 또는 비타민 B12 흡수불량(malabsorption)을 갖는지 여부를 나타내는 것인, 방법.
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