KR102550712B1

KR102550712B1 - 갈롤 유도체가 수식된 펙틴 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102550712B1
Application number: KR1020220038786A
Authority: KR
Inventors: 조승우; 최수정; 황용순; 전지훈
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 주식회사 세라트젠
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2023-07-04
Also published as: KR20220136219A

Abstract

본원에서는 자연에 존재하는 물질인 펙틴을 활용하여 동일하거나 그 이상의 효과를 보이는 하이드로젤을 제공하고자 한다. 구체적으로 안정적이며, 접착력이 강하며, 약물전달에 유리하며, 지속적인 치료가 가능하며, 세포 독성이 월등히 적으며, 면역반응 유발 가능성이 낮아 여러 신체부위, 특히 구강에 사용할 수 있는 하이드로젤 또는 패치를 제공하고자 한다. 또한 가교 전 동결방식으로 차용하여 가교 후 동결방식에 비해 우수한 접착력을 보이는 하이드로젤 패치를 제공하고자 한다.

Description

갈롤 유도체가 수식된 펙틴 및 그의 용도{GALLOL DERIVATIVE-CONJUGATED PECTIN AND USE THEREOF}

본 발명은 갈롤 유도체가 수식된 펙틴 및 그의 용도에 관한 발명이다.

전 세계적으로 약물 전달, 세포 이식 및 지혈, 봉합 등 의료적 처치를 위한 기능성 의료용 소재 기술과 관련된 시장은 매우 가파르게 성장하고 있다. 통계자료를 보면, 조절 방출 약물 전달 시장의 경우 연구개발 증가 추세와 더불어 노인과 소아 환자군에서의 필요성으로 인해 2025년까지 연간 평균 13.8%씩 성장할 전망이다. 그리고 글로벌 줄기세포 시장은 2017년 628억달러 규모 수준에서 향후 빠르게 성장하여 2025년에는 3,944억달러 규모로 급성장할 전망이다.

이런 전망에 따라 약물 전달 및 세포 이식용 소재에 대한 수요는 급증할 것으로 예상된다. 또한, 지혈 및 봉합 소재 시장 규모는 2024년까지 4.5조원 수준으로 성장할 것으로 추정되며 향후 더욱 커질 것으로 기대된다.

생체 내로의 안정적인 약물 전달 및 세포의 이식 그리고 출혈 부위의 지혈 및 상처 조직의 봉합에 있어 다양한 재료의 표면 또는 생체 조직에 대한 접착성을 갖는 생체재료의 필요성이 요구되면서 다양한 종류의 접착성 하이드로젤 기술이 개발되고 있고 일부는 임상에도 적용되고 있다.

삭제

구강이란 일반적으로 입술부터 인두 시작 부위까지를 의미하며, 점막(mucous membrane)으로 구성되어 있다. 이러한 구강 내 점막은 인체 항상성 유지, 외부감염으로부터 일차 방어 역할을 수행하며, 영양소, 약물 등이 흡수되는 통로 역할을 한다. 점막에 결손이 생기면 세균 감염 및 점막 하부조직의 건조에 의한 장기 기능 상실이 유발된다. 구강 내에 발생하는 질병으로는 구강암, 구내염, 백반증, 수족구병, 구강결핵, 구강 칸디다증, 치주염 등이 있으며, 최근에는 구강 점막염이 암 환자 치료 중 가장 심각한 부작용으로 대두되고 있다. 또한, 구강 점막염과 관련되어 발생하는 감염은 항암 치료로 인하여 면역이 저하된 상태에서 전신 패혈증을 유발하여 사망의 원인이 되기도 한다. 이러한 난치성 구강 궤양은 통증 유발 및 이로 인한 영양섭취 감소, 정맥 영양공급의 필요성 증가 등으로 환자의 삶을 저하시킨다. 특별히, 호중구 감소증이 동반된 암환자에서는 패혈증의 고위험 인자로 작용하며, 이로 인하여 중증 점막염 환자의 10 %는 사망에까지 이른다. 또한, 계획된 항암 치료 및 방사선 치료의 용량 감소, 또는 치료 중단 유발 등으로 인하여 암 재발률이 증가되고 있다. 뿐만 아니라, 구강 점막염이 발병하면 통증 조절을 위한 마약성 진통제 처방, 감염 예방을 위한 항생제 처방, 정맥 영양 공급 등의 추가 치료 및 시술이 필요하기 때문에, 항암 치료 도중 구강 궤양 발병 시 총 의료비용이 약 두 배 이상 증가되게 된다. 최근 6 년간 국내 구강 점막염 환자는 30 % 이상 증가하였으며, 진료비 지급은 약 70 % 상승하였다.

이렇듯 구내염을 포함하여 구강 내에 발생될 수 있는 질환은 매우 다양하며, 그 발생률 또한 높아지고 있는 추세이나, 구강 내에는 타액의 흐름으로 인하여 약물이 장기간 유지되지 못할 뿐만 아니라, 굴곡이 많기 때문에 패치 등을 이용한 약물의 도입이 어려운 실정이다. 따라서, 광범위한 구강 내 질환의 치료 효율을 높이기 위해서는, 굴곡진 구강 내 점막의 표면에 효과적으로 접착될 수 있으며, 장기간 지속적으로 약물을 방출할 수 있는 점막 접착성 패치의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

이러한 문제를 해결하기 위해 등록특허 제10-1942220호는 카테콜기가 도입된 키토산 멤브레인 및 이의 제조방법을 제공하였다. 해당 발명은 굴곡진 구강 내 점막의 표면에 효과적으로 접착될 수 있고 다양한 약물을 포집하여 장기간 지속적으로 약물을 방출할 수 있는 특징이 있다.

이와 별개로 공개특허 제10-2018-0127634호 등 많은 선행문헌에서 하이드로젤 제작 시 가교 후 동결건조 방식을 차용해왔는데, 이는 접착력이 떨어지는 문제점이 있었다.

본원에서는 등록특허 제10-1942220호 및 공개특허 제10-2018-0127634호와 비교했을 때, 자연에 존재하는 물질인 펙틴을 활용하여 동일하거나 그 이상의 효과를 보이는 하이드로젤을 제공하고자 한다. 구체적으로 안정적이며, 접착력이 강하며, 약물전달에 유리하며, 지속적인 치료가 가능하며, 세포 독성이 월등히 적으며, 면역반응 유발 가능성이 낮아 여러 신체부위, 특히 구강에 사용할 수 있는 하이드로젤 또는 패치를 제공하고자 한다. 또한 가교 전 동결방식으로 차용하여 가교 후 동결방식에 비해 우수한 접착력을 보이는 하이드로젤 패치를 제공하고자 한다.

그러나 본원의 과제는 상기한 바에 제한되지 않으며, 통상의 기술자가 이해할 수 있는 범위의 과제는 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

상기 과제를 해결하기 위해 본원의 제1측면은 갈롤기 유도체가 수식된 펙틴 유도체(Pec-PG)를 제공한다.

본원의 제2측면은 상기 펙틴 유도체를 산화시켜 제조된, 하이드로젤을 제공한다.

본원의 제3측면은 상기 펙틴 유도체를 포함하는 패치를 제공한다.

본원의 제4측면은 갈롤기 유도체가 수식된 펙틴 제조방법에 있어서 Pectin, EDC, NHS, 갈롤기 유도체를 사전 결정한 비율로 반응하는 단계를 포함하는, 제조방법을 제공한다.

이는 과제의 해결 수단의 일 예시에 불과하며, 통상의 기술자가 이해할 수 있는 범위의 해결 수단은 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

본원 발명에 따른 갈롤 유도체가 수식된 펙틴은 팽윤도 및 분해정도를 조절할 수 있으며, 점막 조직과 갈롤기 간 결합이 강하게 일어나며, 탑재된 약물전달 속도를 조절할 수 있으며, 세포 독성이 적어 우수한 생체 적합성을 보이며, 생체 내 면역반응의 유발 가능성이 적어 하이드로젤로서 안정적이므로 다양한 신체부위, 특히 접착이 어려운 구강 부위에도 적용이 가능하다.

도 1a는 갈롤기 수식 펙틴을 제조하는 과정의 예시를, 1b는 농도 별 Pec-PG의 하이드로젤 형성 여부를 확인한 실험 결과를, 도 1c는 분사(spray) 제형에 적합한 농도를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a 및 2b는 실시예 2에 따라 펙틴의 유래에 따른 가교 시 하이드로젤 형성 kinetics를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a 및 3b는 실시예 3에 따라 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 물리적 특성 중 팽윤도(a)와 분해도(b)를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a 및 4b는 실시예 4에 따라 주사전자현미경 (SEM) 분석, Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색법, Toluidine blue (TB) 염색법을 통해 하이드로젤의 내부구조를 확인한 결과(a)와 Porosimeter 분석을 통해 하이드로젤 내 pore size를 확인한 결과(b)를 나타낸 도면이다.
도 5a 및 5b는 실시예 5에 따라 Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) 분석결과(a)와 UV-vis spectrophotometry 분석결과(b)를 나타낸 도면이다.
도 6a 및 6b는 실시예 6에 따라 유변학 분석 장비를 이용하여 frequency sweep mode에서 하이드로젤의 탄성계수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7a 내지 7d는 실시예 7에 따라 Atomic force microscopy (AFM) 분석을 실시하여 Pec-PG와 점막층 표면에 있는 뮤신(mucin)과 반응하는 양태를 분석한 결과(a, b), UV-vis spectrophotometry 분석결과(c), Pec-PG와 뮤신 혼합액의 제타전위를 분석한 결과(d)를 나타낸 도면이다.
도 8은 실시예 8에 따라 단백질인 BSA(bovine serum albumin)의 방출 양상을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a 및 9b는 실시예 9에 따라 라이브/데드 (Live/Dead) 염색 방법을 통해 세포의 생존률을(a), MTT 분석법을 통해 Pec-PG 하이드로젤 내에서 배양되는 줄기세포의 증식률을(b) 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a 내지 10c는 실시예 10에 따라 본원의 Pec-PG 하이드로젤과 대조군 간 TNF-α 분비량을 비교한 결과(a), 마우스를 이용하여 면역반응을 H&E 염색(b)과 TB 염색(c)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11a 및 11b는 실시예 11에 따라, 본원의 하이드로젤 안전성 평가를 경구 투여 실험으로 진행하여 래트의 주요 장기의 무게를 대조군과 비교한 결과(a), H&E 염색을 통해 조직학 분석한 결과(b)를 나타낸 도면이다.
도 12a 내지 12c는 실시예 12에 따라 본원에 따른 하이드로젤의 조직 접착력을 돼지 혀 조직에서 확인한 결과(a), 살아있는 래트 혀 조직에서 확인한 결과(b), 형광 물질을 혼합한 하이드로젤을 래트 혀조직에 도포하여 확인한 결과(c)를 나타낸 도면이다.
도 13a 내지 13d는 실시예 13에 따라 패트리 디쉬(a), 스펀지(b), 살아있는 래트 혀 조직(c 및 d)에 대한 수분 증발 속도 및 보습 기능을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 14a 내지 14c는 실시예 14에 따라 본원에 따른 패치(a)의 팽윤도(b)와 분해도(c)를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15a 및 15b는 실시예 15에 따라 Porosimeter 분석으로 패치의 포어 크기를 확인한 결과(a)와, 하이드로젤-패치 간 포어 크기를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16a 및 16b은 실시예 16에 따라 유변학 분석 장비를 이용하여 하이드로젤 패치의 탄성계수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17a 및 17b는 실시예 17에 따라 Tack test 분석을 통해 하이드로젤 패치의 조직 접착력을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 실시예 18에 따라 HPLC 분석을 통해 약물 방출 양상을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19a 내지 19c는 실시예 19에 따라 항산화 기능을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20a 내지 20g는 실시예 20에 따라 래트의 잇몸 재생 및 염증 치료 효과를 확인한 결과(a), 손상 부위의 면적과 조직 재생 효과를 확인한 결과 (b, c), H&E 염색과 상피 조직 마커(cytokeratin 5; CK5, cytokeratin 13; CK13) 면역 염색 및 염색된 이미지 기반 정량분석을 실시한 결과(d 내지 f), 백혈구 (leukocyte) 마커인 CD11b에 대한 면역 염색을 통해 염증세포 수를 확인한 결과(g)를 나타낸 도면이다.
도 21a 및 21b는 비교예 1에 따라 Mucin 단백질과 각 유도체의 반응성 및 상호작용을 atomic force microscopy (AFM)를 통해 분석한 결과를, 21c는 21a 및 21b의 바탕으로 실제 Tack test 분석을 통하여 Pec-PG 하이드로젤 패치, HA-PG 하이드로젤 패치, Chi-CA 하이드로젤 패치의 돼지 잇몸 점막 조직에서의 점막 접착력을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 22는 비교예 2에 따라 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤 패치와 선행기술의 제조방식 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용하는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용하는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합(들)"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는 "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 물질 등의 대한 예시는 모두 예시에 불과할 뿐, 해당 물질이 특정 예시에 한정된다는 것을 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, "펙틴(Pectin)"이란 셀룰로스-헤미셀룰로스 네트워크를 둘러싸는 수화된 겔로 갈락토스의 산화물인 갈락투론산이 주성분인 다당류이다. 네트워크의 집적과 붕괴를 막는 친수성 충전재로 작용하며 세포벽의 고분자에 대한 다공성을 결정하는 역할을 담당한다. 주요 부분은 D-갈락투론산 단위의 α-1, 4 결합으로 구성되어 있다.

본원 명세서 전체에서, "갈롤기 유도체"란 C₆H₃(OH)₃로 표현되는 파이로갈롤기(pyrogallol) 또는 화학식 1의 구조를 가진 화합물을 의미한다.

[화학식 1]

본원 명세서 전체에서, "구내염"이란 입 속에서 나타나는 염증으로 일반적으로 구강 내의 점막(혀, 잇몸, 입술과 뺨 안쪽 등)에 생긴 염증성 질환을 통틀어 말한다. 그 원인으로는 세균, 바이러스, 곰팡이의 감염 등이 있으며, 염증이 심할 경우에는 수포, 궤양 등을 가져오게 된다. 구강 점막염, 구강암, 구내염, 백반증, 수족구병, 구강결핵, 구강 칸디다증, 점막의 상처, 치주염, 아프타성 궤양, 베체트병(Behcet's syndrome), 편평태선, 헤르페스성 구내염 등이 있으나 구강 내 발생하는 염증은 모두 포함하는 것으로 해석된다.

본원 명세서 전체에서 "패치(patch)"란 구강 내 점막 표면에 부착시킬 수 있는 멤브레인(membrane)으로서, 치료용 약물을 추가로 포함하여, 장기간에 걸쳐 약물을 방출할 수 있기 때문에 질환 치료 용도로 사용할 수도 있고, 추가 약물의 구성 없이도 조직 내 상처의 표면에 부착하여 상처 부위의 추가 감염 등을 억제하여 치료에 사용할 수도 있다.

본원 명세서 전체에서 "접착"은 주로 점막 조직과 페놀기 유도체 간 결합에 의한 것일 수 있다. 가능한 결합은 공유결합과 수소결합, 소수성 상호작용, 파이-파이 상호작용 등 다양한 물리적 비공유 결합이 있다.

본원의 제1측면은 갈롤기 유도체가 수식된 펙틴 유도체(Pec-PG)를 제공한다. Pec-PG 유도체는 갈롤기의 뛰어난 조직 접착능으로 인해 다양한 의생명공학 분야에 적용이 가능할 것으로 기대되며 특히 점막과의 부착성이 중요한 인공 타액이나 구강질환 약물 전달체로서 효용성이 크다. 또한 갈롤기의 자연산화능으로 용액 상태의 Pec-PG를 구강에 스프레이 방식으로 분사하거나 도포하여 닿기 힘든 구강 질환 부위까지 코팅하거나 부착시키는 방식으로 적용할 수 있다.

여기서 갈롤기 유도체는 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine), 타닌산 (tannic acid), 갈산(gallic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데 하이드(2,3,4-trihydroxybenzaldehyde), 2,3,4-트리하이드록시벤조산(2,3,4-Trihydroxybenzoic acid), 3,4,5-트리하이드록시벤즈알데하이드(3,4,5-Trihydroxybenzaldehyde), 3,4,5-트리하이드록시벤즈아마이드(3,4,5-Trihydroxybenzamide), 5-tert-부틸파이로갈롤(5-tert-Butylpyrogallol) 및 5-메틸파이로갈롤(5-Methylpyrogallol)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본원의 제2측면은 본원에 따른 펙틴 유도체를 산화시켜 제조된 하이드로젤을 제공한다. 본원에 따른 하이드로젤은 제1측면의 특징을 모두 가지며, 특히 산화된 갈롤기의 다양한 친핵성 작용기와의 뛰어난 반응성을 통해 탑재한 약물의 서방형 방출이 가능하므로 하이드로젤 제형에 따라서 다양한 질환 및 부위에 적용이 가능하다.

하이드로젤의 산화는 산화제, 효소 또는 pH 조절제의 첨가에 의한 것일 수 있다. 상기 산화제는 과요오드산염(Periodate salt) 또는 과산화수소(Hydrogen peroxide)일 수 있고, 상기 효소는 과산화효소(Peroxidase), 겨자무과산화효소(Horseradish peroxidase) 및 타이로시네이스(Tyrosinase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 pH 조절제는 수산화나트륨(Sodium hydroxide), 수산화리튬(Lithium hydroxide), 수산화칼륨(Potassium hydroxide), 수산화루비듐(Rubidium hydroxide), 수산화세슘(Cesium hydroxide), 수산화마그네슘(Magnesium hydroxide), 수산화칼슘(Calcium hydroxide), 수산화스트론튬(Strontium hydroxide) 및 수산화바륨(Barium hydroxide)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한 하이드로젤의 산화는 자연산화에 의해서도 가능하다. 이에 따라 용액 상태의 Pec-PG를 구강에 스프레이 방식으로 분사하거나 도포하여 닿기 힘든 구강 질환 부위까지 코팅하거나 부착시키는 방식으로 적용할 수 있다.

본원에 따른 하이드로젤의 적용부위는 구강 점막, 코점막, 안점막, 위점막, 장점막, 기관지점막, 심장, 허파 또는 비뇨기를 포함할 수 있으며, 그에 따라 점막 조직 질환 치료에 사용할 수 있다. 특히 구강 점막염, 구강암, 구내염, 백반증, 수족구병, 구강결핵, 구강 칸디다증, 점막의 상처, 치주염, 아프타성 궤양, 베체트병(Behcet's syndrome), 편평태선 또는 헤르페스성 구내염을 포함하는 점막 조직 질환 치료에 효과적일 수 있다.

또 본원에 따른 하이드로젤은 생체 내 약물을 조절하여 전달하는 용도로 사용할 수 있다. 여기서 약물은 하이드로젤 내에 봉입 또는 담지되는 것일 수 있고, 상기 약물은 DNA, mRNA, siRNA, miRNA, antisense oligonucleotide, 항히스타민제, 단백질류(growth factor), 코르티코스테로이드계(corticosteroid-based)스테로이드 계열, 면역세포 활성화제, 항암제, 치료용 항체, 항생제, 항박테리아제, 항바이러스제, 항염증제, 단백질 의약품, 성장인자, 사이토카인, 펩티드 약물 및 마취제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 항암제는 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 아이다루비신 등의 안트라사이클린계 (anthracycline), 파클리탁셀, 도세탁셀, 카바지탁셀, 테세탁셀 등의 탁산계 (taxane), 커큐민, 캄포테신, 베르베린, 에보디아민, 마트린, 피페린, 상귀나린, 테트란드린, 탈리카르핀, 엘립티신 등의 알칼로이드계 (Alkaloid), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈 등의 빈카 알칼로이드계 (vinca alkaloids), 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴 등의 플라티넘계 (platinum), 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트, 젬시타빈 등의 대사길항제(antimetabolites), 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 테니포사이드, 에토포사이드, 암사크린 등의 토포아이소머라아제 저해제 (topoisomerase inhibitor), 블레오마이신, 악티노마이신, 미토마이신, 미톡산트론 등의 항종양 항생제 (antitumor antibiotics), 시클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 니트로소우레아 등의 알킬화제 (alkylating agent), 아자시티딘, 아자티오프린, 사이타라빈 및 독시플루리딘으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본원의 제3측면은 본원에 따른 펙틴 유도체를 포함하는 패치를 제공한다. 본원에 따른 패치는 Pec-PG 용액을 얇게 얼린 뒤 동결건조하여 패치로 제작이 가능하며 하이드로젤이나 패치에 원하는 약물을 미리 탑재하여 약물 전달이 가능하다. 특히 공개특허 제10-2018-0127634호 등 기존 선행문헌들은 주로 가교 후 동결건조 방식으로 패치를 제조하였으나, 본원은 가교 전 동결건조방식을 채택하였다. 이러한 방식의 차이로 인해 본원의 패치는 기존 패치에 비해 월등히 우수한 접착력을 지닐 수 있다.

또한 약물이 미리 탑재된 Pec-PG 하이드로젤 패치는 사용자 편의성이 매우 높아 생체 내 적용이 쉽다.

본원의 제4측면은 갈롤기 유도체가 수식된 펙틴 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은 Pectin, EDC, NHS, 갈롤기 유도체를 사전 결정한 비율로 반응하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 비율은 Pectin:EDC:NHS:PG = 1:2:2:2일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본원의 제1 내지 제4측면에서, 각 측면에 공통된 부분은 모두 공히 적용된다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.

실시예 1. 갈롤기 수식 펙틴 유도체 합성, 하이드로젤 제작 및 적합한 농도 확인

식품 첨가제나 식품 보충제로 많이 쓰이고 있는 펙틴(Pec)에 갈롤기(PG)를 수식하여 펙틴 유도체를 합성하고 이를 기반으로 Pec-PG 하이드로젤을 제작했다.

갈롤기는 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine)을 이용했으며, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) / N-Hydroxysuccinimide (NHS) 화학반응을 이용하여 molar ratio Pectin:EDC:NHS:PG = 1:2:2:2 비율로 펙틴 유도체(Pec-PG)를 합성했다.(도 1a 참조)

Pec-PG의 농도의 경우, 1% (w/v) 미만 농도의 Pec-PG는 4.5 mg/ml NaIO₄ 산화제를 처리했을 때 하이드로젤이 되지 않았고, 1% 농도에서는 조금의 떨림에도 쉽게 구조가 무너지는 등 매우 약한 물성을 가진 하이드로젤이 형성되었다. 2% (w/v) 농도의 Pec-PG부터 안정적으로 하이드로젤이 형성되었으므로 본원의 실시예에서는 2% (w/v) 이상 농도의 Pec-PG를 사용했다.(도 1b 참조) 그러나 이는 본원의 Pec-PG의 농도를 제한한다는 것을 의미하지 않는다.

또한 분사(spray)를 위한 제형에 적합한 농도를 확인하기 위해 다양한 농도의 Pec-PG 용액을 분사기(spray) 노즐을 통해 분사하는 실험을 진행했다. Pec-PG의 농도가 높아질수록 분사(spray)하는데 더 많은 힘이 요구되었다. (도 1c 참조; 왼쪽)

Pec-PG의 농도가 높아질수록 분사(spray)할 때마다 분사되는 양에 차이가 있었다. 특히, 4% Pec-PG의 경우 3번 이상 분사를 반복하게 되면 분사되는 양이 크게 감소했다. 이는 곧 Pec-PG 농도가 높아질수록 분사 용이성이 점점 낮아짐 시사한다. (도 1c 참조; 오른쪽)

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실시예 2. 펙틴의 유래에 따른 가교 시 하이드로젤 형성 kinetics 분석

펙틴의 유래에 따른 가교 시 하이드로젤 형성 kinetics 분석을 진행했다. Citrus peel 유래 펙틴과 apple 유래 펙틴에 갈롤기(PG)를 EDC/NHS 반응을 통해 수식한 후 합성된 펙틴 유도체를 가교 유도하여 하이드로젤을 형성할 때 gelation kinetics를 비교했다.

2% (w/v) citrus Pec-PG pre-gel 용액과 2% (w/v) apple Pec-PG pre-gel 용액에 4.5 mg/ml NaIO₄ 산화제를 혼합하여 가교를 유도했을 때 하이드로젤이 형성되는 과정을 분석했다.

2% (w/v) citrus Pec-PG pre-gel solution 상태에서는 손실 탄성률 (loss modulus; G″) 수치가 저장 탄성률 (storage modulus; G′) 수치보다 높다가 가교를 위해 산화제를 혼합했을 때, G′ 수치가 G″ 수치보다 높아진 것을 확인했다. 이는 곧 citrus peel 유래 Pec-PG는 안정적으로 하이드로젤이 형성될 수 있음을 의미한다.(도 2a 참조)

2% (w/v) apple Pec-PG pre-gel 용액 상태에서는 손실 탄성률 (loss modulus; G″) 수치가 저장 탄성률 (storage modulus; G′) 수치보다 높게 유지되는데 가교를 위해 산화제를 혼합했을 때에도 수치상 변화가 나타나지 않았다. 이는 apple 유래 Pec-PG는 하이드로젤이 형성되기 어려움을 의미한다.(도 2b 참조)

즉, 유래에 따라 펙틴의 구조가 다르기 때문에 갈롤기를 수식해도 하이드로젤이 형성할 수 없는 경우가 있음을 확인했다. 추가적으로, 펙틴의 에스터화(esterification) 정도와 수식할 수 있는 작용기(COOH 그룹)가 있는 갈락투론산(galacturonic acid) 양이 Pec-PG 유도체 합성에 영향을 미칠 수 있음을 확인했다. 실제로 citrus peel 유래 펙틴은 galacturonic acid가 70% 이상 존재하므로 갈롤기 수식을 위한 충분한 작용기가 있어 Pec-PG 유도체 합성 및 하이드로젤 형성에 문제가 없다. 반면, apple 유래 펙틴은 상대적으로 galacturonic acid의 비율이 낮고 에스터화가 많이 되어 있어서 Pec-PG 유도체 합성 및 하이드로젤 형성이 어려운 것으로 보인다.

실시예 3. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 물리적 특성 분석

일반적으로 사용되는 두 가지 농도 (2% (w/v), 4% (w/v)) 조건의 Pec-PG pre-gel 용액에 4.5 mg/ml NaIO₄ 산화제를 혼합하여 가교를 유도해 하이드로젤을 제작한 후 각 하이드로젤의 팽윤도(swelling ratio)를 측정했다.

7일간 생리학적 조건 (37 ℃ in PBS 버퍼) 하에서 유지되었을 때 4일까지는 2% (w/v) 하이드로젤이 4% (w/v) 하이드로젤에 비해 조금 더 높은 팽윤도를 보였다.(도 3a 참조) 이는 농도가 낮을수록 고분자 가교 정도가 낮기 때문에 팽윤도가 높아짐을 시사한다.

Pec-PG 하이드로젤의 분해 양상을 비교하기 위하여 펙틴 분해 효소 처리를 하였으며, 같은 농도의 펙틴 분해 효소 (1 U/sample)를 처리 시 4% (w/v) 하이드로젤에서의 갈롤기의 가교 결합하는 비율이 높기 때문에 높은 농도 조건에서 하이드로젤 분해가 늦게 일어남을 확인했다.(도 3b 참조)

즉, Pec-PG 농도 조절을 통해 Pec-PG 하이드로젤의 팽윤도 및 분해거동과 같은 물리적 특성을 조절할 수 있음을 확인했다.

실시예 4. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 내부구조 분석

2% (w/v) Pec-PG pre-gel 용액에 4.5 mg/ml NaIO₄ 산화제를 혼합하여 하이드로젤을 제작했다.

주사전자현미경 (SEM) 분석, Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색법, Toluidine blue (TB) 염색법을 통해 하이드로젤의 내부구조를 확인한 결과, 마이크로 수준의 조밀한 다공성 구조를 가지고 있는 것을 확인했다.(도 4a 참조)

Porosimeter 분석을 통해 하이드로젤 내 pore size를 확인한 결과, 약 100 ㎛ 크기를 가지는 포어(pore)가 많이 분포되어 있는 것을 확인했다.(도 4b 참조)

본원에 따른 하이드로젤은 이러한 다공성 구조를 지니므로 세포의 부착 및 증식에 유리한 환경을 제공해주며, 약물 탑재 및 방출에도 효과적일 수 있다.

실시예 5. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 화학적 특성 분석

Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) 분석을 통하여 산화 전(Pec-PG)과 후(Pec-PG + NaIO₄)의 Pec-PG (1 mg/ml) 화학적 구조를 분석했다.(도 5a 참조)

O-H 그룹을 나타내는 ~3435 cm^-1 peak가 모두 관찰되었다.

C-H stretching 그룹을 나타내는 ~2925 cm^-1 peak가 모두 관찰되었다.

Ester carbonyl stretching 그룹을 나타내는 ~1743 cm^-1 peak가 모두 관찰되었다.

Carboxylate ion stretching 그룹을 나타내는 ~1620 cm^-1 peak와 ~1440 cm^-1 peak가 모두 관찰되었다.

Galacturonan backbone을 나타내는 ~1100 cm^-1 peak와 ~1020 cm^-1 peak가 모두 관찰되었다.

Biphenol과 biphenyl ether의 형성을 나타내는 784 cm^-1 peak가 산화된 Pec-PG에서만 관찰되었다.

이를 통해 산화제를 처리한 Pec-PG에서만 산화된 갈롤기(PG) 사이의 가교 결합을 확인했다.

UV-vis spectrophotometry 분석을 통하여 Pec-PG 용액에 산화제(NaIO₄)를 추가하여 산화 후 일어나는 화학 반응을 분석했다.(도 5b 참조)

산화제를 추가한 후, 280 nm 및 350 nm peak가 증가했다. 이를 통해 갈롤기(PG)가 산화되면서 세미-퀴논(semi-quinone)과 페녹시 라디칼(phenoxyl radical)이 형성되며 이를 통한 가교 결합이 일어나는 것을 확인했다.

실시예 6. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 기계적 물성 분석

두 가지 다른 농도(2% (w/v), 4% (w/v))의 Pec-PG pre-gel 용액에 4.5 mg/ml NaIO₄ 산화제를 혼합하여 하이드로젤을 제작했다.

유변학 분석 장비를 이용하여 frequency sweep mode에서 하이드로젤의 탄성계수를 측정했다.(도 6a 참조)

2% (w/v), 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤에서 모두 storage modulus (G′) 수치가 loss modulus (G″) 수치보다 항상 높게 측정된 것을 확인함으로써 하이드로젤 내부의 안정적인 고분자 네트워크 구조 형성을 확인했다.

2% (w/v) Pec-PG 하이드로젤의 평균 탄성계수는 약 1.7 kPa인데 비하여 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤은 약 4.9 kPa의 평균 탄성계수를 가져 Pec-PG 농도와 비례하여 탄성계수가 증가함을 확인했다.(도 6b 참조)

즉, Pec-PG 농도를 조절하여 Pec-PG 하이드로젤의 기계적 물성을 조절할 수 있음을 확인했다.

실시예 7. 갈롤기 수식 펙틴의 점막 표면 접착 분석

Atomic force microscopy (AFM) 분석을 실시하여 Pec-PG와 점막층 표면에 있는 뮤신(mucin)과 반응하는 양태를 분석했다.

뮤신 자체 또는 뮤신과 펙틴(2 mg/ml Pectin)을 혼합했을 때에는 표면에 작은 응집체 형성이 관찰되었고, 뮤신과 2 mg/ml Pec-PG를 혼합했을 때 표면에 유의미하게 큰 응집체가 층을 이루면서 형성되는 것을 확인했다.(도 7a 및 7b 참조) 이는 Pec-PG의 갈롤기와 점막 조직에 존재하는 뮤신의 친핵성 작용기들 간의 강한 결합 반응과 상호작용을 통해 접착이 이루어 지는 것으로 보인다.

Pec-PG 용액에 점막층 표면에 존재하는 뮤신을 혼합하고 UV-vis spectrophotometry 분석을 통하여 뮤신과 갈롤기(PG) 간에 일어나는 화학 반응을 분석했다. 0.5 mg/ml Pec-PG를 0.5 mg/ml mucin과 혼합하였을 때 ~280 nm와 ~350 nm peak가 증가했다. 이를 통해 갈롤기와 점막 조직에 존재하는 뮤신의 친핵성 작용기들 간의 강한 공유 결합이 일어나는 것을 확인했다.(도 7c 참조)

Zeta potential 분석을 실시하여 Pec-PG와 점막층 표면에 있는 뮤신(mucin)과의 반응을 시간 별로 분석했다. 뮤신과 2% (w/v) Pec-PG를 혼합하고 시간이 지날수록 Pec-PG의 갈롤기와 뮤신의 친핵성 작용기들 간의 강한 결합 반응과 상호작용으로 인해 반응물의 zeta potential이 점점 더 음전하를 띄는 것을 확인했다. 이는 Pec-PG의 갈롤기와 뮤신의 친핵성 작용기들 간 강력한 공유 결합을 이룬다는 것을 의미한다.(도 7d 참조)

따라서 본원에 따른 Pec-PG는 점막 조직에 안정적으로 접착될 수 있다.

실시예 8. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 약물 방출 양상 분석

Pec-PG 하이드로젤의 서방형 약물전달 기능을 검증하기 위해, 아래의 2개 그룹에 대해 생리학적 조건(37 ℃in PBS 버퍼)에서 단백질인 BSA(bovine serum albumin)의 방출 양상을 비교했다.(도 8 참조)

1) 2% (w/v) Pec-PG 하이드로젤에 BSA 탑재 (Pec-PG 2%)

2) 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤에 BSA 탑재 (Pec-PG 4%)

BCA assay 분석을 통해 약물 방출 양상을 확인한 결과, 갈롤기와 단백질의 다양한 친핵성 작용기들의 강한 결합으로 인해 Pec-PG 하이드로젤의 서방형 약물 방출 거동이 관찰되었다.

농도가 낮은 Pec-PG 2% 하이드로젤의 분해 속도가 조금 더 높아 BSA가 더 빠르게 방출되었다. Pec-PG 4% 하이드로젤의 경우 2% 하이드로젤보다 더 긴 시간에 걸쳐 BSA가 방출되었다.

따라서 구강 질환이 있는 부위와 같이 효과적인 전달이 어려운 부위에 약물이 탑재된 Pec-PG 하이드로젤을 이용하여 효과적인 약물전달이 가능하며 필요에 따라 농도를 조절하여 조직 별 지속적인 치료를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 9. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 세포 독성 평가

Pec-PG pre-gel 용액 내에 인간 지방유래 줄기세포(hADSC)를 봉입(encapsulation)하고 4.5 mg/ml NaIO₄ 산화제를 첨가하여 가교를 유도한 후 Pec-PG 하이드로젤 내에서 줄기세포를 삼차원 배양했다.

7일간 배양하면서 라이브/데드 (Live/Dead) 염색 방법을 통해 세포의 생존률을 확인했다. 배양 기간 내내 94% 이상의 높은 세포 생존률을 관찰함으로써 Pec-PG 하이드로젤이 세포 독성이 없으며 우수한 생체적합성을 가지는 것을 확인했다.(도 9a 참조)

MTT 분석법을 통해 Pec-PG 하이드로젤 내에서 배양되는 줄기세포의 증식률을 확인했다. 7일 간 배양하는 동안 줄기세포가 정상적으로 증식하는 것을 확인했다.(도 9b 참조)

따라서 Pec-PG 하이드로젤은 세포 독성을 나타내지 않아 우수한 생체 적합성을 지닌다.

실시예 10. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 면역반응 평가

대식세포(macrophage)와 Pec-PG 하이드로젤의 공배양을 통해, 대식세포에서 분비되는 전염증성 사이토카인 TNF-α (tumor necrosis factor-α)를 ELISA 분석 방법으로 측정하여 면역반응 유발 정도를 확인했다.

대식세포를 웰-플레이트(well-plate) 바닥에 배양하고 트랜스웰(trans-well)을 얹은 뒤 2% (w/v) Pec-PG 하이드로젤을 트랜스웰 위에 놓고 세포와는 직접적인 접촉 없이 하이드로젤로부터 용출되는 성분에 의한 영향만을 받을 수 있는 상태로 공배양을 진행했다. 대조군은 LPS(lipopolysaccharide)를 사용했다.

그 결과 Pec-PG 하이드로젤과 공배양 시 대식세포의 TNF-α 분비량은 어떤 처리도 하지 않은 no treatment 그룹과 유사한 수준을 보였으며 대조군과는 확연히 다른 차이를 보였다.(도 10a참조)

또 다른 실험으로 마우스 피하에 2% (w/v) Pec-PG pre-gel 용액을 산화제 처리 없이 주입하고 체내 존재하는 산화 환경에 의한 자연 산화를 통해 가교를 유도하고 3, 7 및 14일차에 하이드로젤이 주입된 조직을 수거하여 조직학 분석을 진행했다.

그 결과 H&E 염색을 통해 하이드로젤이 주입된 조직은 정상 조직과 크게 차이가 없었으며 심각한 면역 반응은 일어나지 않음을 확인하였고, 하이드로젤 내부로 주변 세포가 유입된 것을 확인했다.(도 10b 참조)

TB 염색을 통하여 하이드로젤이 주입된 조직은 정상 조직과 유사하게 비만 세포 (mast cell)가 거의 관찰되지 않음을 확인함으로써 외부 물질에 대한 면역 반응이 일어나지 않았음을 확인했다.(도 10c 참조)

따라서 Pec-PG 하이드로젤은 조직 내에서 면역반응 유발 가능성이 매우 낮다.

실시예 11. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤 섭취 후 안전성 평가

구강에 적용하는 제품의 특성상 섭취된 Pec-PG 하이드로젤 안전성 평가를 위해 2% (w/v) Pec-PG pre-gel 용액 또는 PBS 버퍼를 각각 28일 간 매일 래트(rat)에게 경구 투여한 후 사육 기간 동안 래트의 몸무게와 섭취한 사료의 양을 주기적으로 측정하고 비교했다.(도 11a 참조)

그 결과, PBS 버퍼를 섭취한 그룹과 Pec-PG 용액을 섭취한 그룹 간 몸무게 및 섭취한 사료의 무게에 있어 유의미한 차이가 나지 않았다.

또한 Pec-PG 하이드로젤 섭취 후 28일 차에 래트의 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐, 신장)들을 적출하여 무게를 측정하고 H&E 염색을 통해 조직학 분석을 진행했다.(도 11b 참조)

그 결과, PBS를 섭취한 그룹과 Pec-PG 하이드로젤을 섭취한 그룹 간 장기 무게에 있어 유의미한 차이가 나지 않았고(위), 조직학 분석 결과도 조직 손상이나 면역반응이 일어나지 않았음을 나타냈다(아래).

따라서 Pec-PG 하이드로젤을 사람에 적용했을 때 안전성에 큰 문제 없이 적용이 가능할 것으로 기대된다.

실시예 12. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 조직 접착력 측정

돼지 혀 조직에서의 Tack test를 통하여 2% (w/v)와 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤과 상용화된 인공 타액 제품인 Control 1(제품명 Xerova; Kolmar 사)과 Control 2(제품명 Biotene; GSK 사)의 조직 접착력을 비교했다.(도 12a 참조)

돼지 혀 조직을 유변학 분석 장비의 플레이트(plate)와 프로브(probe)에 부착시킨 뒤 조직 사이에 자연 산화를 통해 가교된 Pec-PG 하이드로젤 또는 기존 인공 타액 제품을 도포하여 이를 매개로 하여 조직을 서로 접착한 후 조직을 당기면서 조직이 탈착되는 힘을 측정했다.

Control 1과 Control 2는 약 0.2~0.5 kPa 수준의 부착력이 측정되어 조직 접착력이 매우 낮음을 확인하였고, 이에 비해 Pec-PG 하이드로젤은 약 6~6.5 kPa 수준의 우수한 조직 접착력을 가지는 것을 확인하였다.

살아있는 래트 혀 조직에서 2% (w/v) 및 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤과 상용화된 인공 타액 제품인 Control 1(제품명 Xerova; Kolmar 사)과 Control 2(제품명 Biotene; GSK 사)의 접착력을 비교했다.

래트 혀 조직에 액체 상태의 Pec-PG 용액을 스프레이로 분사하고 추가적인 산화제 처리 없는 체내 자연 산화 방식으로 가교를 유도하여 부착시킨 후 30분 뒤에 조직을 수거하여 조직학 분석을 진행했다.(도 12b 참조)

Control 1 제품과 Control 2 제품의 경우 혀 조직에 전혀 남아있지 않았고, 2% (w/v) Pec-PG 하이드로젤은 얇게 코팅이 되어 남아 있었고(화살표), 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤은 더 두껍게 코팅이 되어 남아 있는 것을 확인했다(화살표).

형광 물질을 혼합한 하이드로젤을 래트 혀조직에 도포하고, PBS 버퍼로 세척하여 타액이 존재하는 실제 구강 내 환경을 모사한 조건에서 접착력을 확인했다.(도 12c 참조)

Control 1, Control 2 그룹은 PBS 세척 반복 횟수가 늘어날수록 형광 신호가 사라지는 것을 확인하였고, 2% (w/v) 및 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤은 3번의 PBS 세척을 실시했을 때에도 형광 신호가 잘 유지되어 관찰되는 것을 확인했다.

따라서 Pec-PG 하이드로젤의 뛰어난 접착력을 통해 점막 조직, 특히 음식물 섭취 및 저작 운동 등 움직임과 자극이 많은 구강 환경에서 보다 오랫동안 하이드로젤이 부착 및 유지됨으로써 기존 소재와 비교하여 구강 내 수분 유지 및 약물전달 효과가 장기간 지속될 것으로 기대된다.

실시예 13. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤의 보습력 분석

Pec-PG 하이드로젤의 보습력 평가를 위해 Pec-PG 하이드로젤과 상용화된 인공 타액 제품인 Control 1(제품명 Xerova; Kolmar 사)과 Control 2(제품명 Biotene; GSK 사)의 수분 증발량을 비교했다.(도 13a 참조) Pec-PG 하이드로젤과 기존 인공 타액 제품을 페트리 디쉬에 도포한 뒤 시간에 따른 무게를 측정하며 수분 증발량을 관찰했다.

총 100분의 관찰시간 동안 Control 1 제품의 수분이 빠르게 증발하여 무게가 가장 빠르게 감소하였고, 2% (w/v) Pec-PG, 4% (w/v) Pec-PG, Control 2 제품은 비슷한 속도로 수분량이 감소하는 것을 확인했다.

또한 Pec-PG 하이드로젤의 보습 유지력 분석을 위해 물을 흡수한 스펀지를 Pec-PG 하이드로젤 및 기존 인공 타액 제품으로 도포한 뒤 스펀지의 수분 증발량을 비교했다.(도 13b 참조)

그 결과, Control 1 제품으로 처리된 그룹에서 수분이 가장 빠르게 증발하였고, Control 2 제품, 2% (w/v) Pec-PG, 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤이 처리된 그룹들은 비슷한 속도로 수분이 증발하는 것을 확인했다.

따라서, Pec-PG 하이드로젤이 기존 인공 타액 제품들과 비교하여 동등하거나 우수한 보습력을 가지는 것을 확인했다.

앞선 실시예에서 확인되었듯이 기존 인공 타액 제품의 조직 부착력이 매우 낮은 것을 고려하면 뛰어난 조직 접착력과 우수한 보습력을 동시에 보유한 Pec-PG 하이드로젤은 기존 제품의 한계를 뛰어 넘는 구강건조증 치료를 위한 새로운 인공 타액 제품으로의 개발 가능성이 매우 높을 것으로 기대된다.

실제 구강 조직에서의 보습력 비교를 위해 상용화된 인공 타액 제품인 Control 1(제품명 Xerova; Kolmar 사)과 Control 2(제품명 Biotene; GSK 사)과 Pec-PG 하이드로젤을 살아있는 래트 혀 조직에 스프레이 방식으로 분사하고 Pec-PG의 경우 자연 산화를 통해 가교를 유도하여 부착시킨 후 수분측정기(corneometer)를 이용하여 래트 혀 조직의 수분도를 비교했다.(도 13c 참조) 분석의 정확성을 위해 래트의 혀를 동일하게 건조시킨 후, 2% (w/v) Pectin, 2% (w/v) Pec-PG 하이드로젤, 기존 인공 타액을 처리하고 수분도를 측정했다.

분석 결과, Pec-PG 하이드로젤로 도포된 혀 조직이 수분도를 가장 잘 유지하는 것을 확인했다.(도 13d 참조)

따라서 실제 구강 조직에 적용되었을 때도 Pec-PG 하이드로젤이 기존 인공 타액 제품들과 비교했을 때 보다 뛰어난 보습력을 가지는 것과 인공 타액으로서 기능성 또한 우수함을 확인했다.

실시예 14. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤 패치의 물리적 특성 분석

Pec-PG 용액을 원하는 모양 및 크기를 가진 몰드(실시예: 8mm 직경의 disc)에 부은 뒤 -80 ℃ 조건에서 얼리고 동결건조 하여 Pec-PG 패치를 제작했다.(도 14a 참조; Before) 제작된 Pec-PG 패치에 4.5 mg/ml NaIO₄ 산화제를 분사하여 가교를 유도했다.(도 14a 참조; After)

두 가지 농도 (2% (w/v), 4% (w/v)) 조건으로 제작된 Pec-PG 패치에 4.5 mg/ml NaIO₄ 산화제를 분사하여 가교를 유도한 후 Pec-PG 하이드로젤 패치의 팽윤도(swelling ratio)를 측정했다.

7일간 생리학적 조건 (37 ℃ in PBS 버퍼) 하에서 유지되었을 때 2% (w/v) Pec-PG 하이드로젤 패치가 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤 패치에 비해 더 높은 팽윤도를 보였다.(도 14b 참조)

Pec-PG 하이드로젤 패치의 분해 양상을 비교하기 위하여 펙틴 분해 효소 처리를 하였으며, 같은 농도의 펙틴 분해 효소(2 U/sample)를 처리 시 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤 패치가, 더욱 증가된 갈롤기 간의 가교 결합으로 인해 더 늦게 분해되었다.(도 14c 참조)

즉, Pec-PG 농도 조절을 통해 Pec-PG 하이드로젤 패치의 팽윤도 및 분해거동과 같은 물리적 특성을 조절할 수 있음을 확인했다.

실시예 15. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤 패치의 다공성 구조 분석

Porosimeter 분석을 통해 2% (w/v) Pec-PG 하이드로젤 패치 내 포어(pore) 크기를 확인한 결과, 대부분 10 ㎛ 크기를 가지는 것을 확인했다.(도 15a 참조)

Pec-PG 하이드로젤의 포어(pore) 크기와 비교했을 때, Pec-PG 하이드로젤 패치가 더 작은 다공성 구조를 가지고 있는 것을 확인했다.(도 15b 참조)

즉, 동결건조된 패치 형태의 Pec-PG 하이드로젤이 용액 상태에서 가교된 Pec-PG 하이드로젤 보다 더욱 조밀한 내부 다공성 구조를 가지고 있는 것으로 보이며 따라서 접착성 표면적이 증가함으로써 더욱 향상된 기계적 물성과 접착성을 가질 것으로 기대된다.

실시예 16. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤 패치의 기계적 물성 분석

유변학 분석 장비를 이용하여 frequency sweep mode에서 두가지 다른 농도(2% (w/v), 4% (w/v))의 Pec-PG 하이드로젤 패치의 탄성계수를 측정했다.(도 16a 참조) 2% (w/v), 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤 패치에서 storage modulus (G′) 수치가 loss modulus (G″) 수치보다 항상 높게 측정된 것을 확인함으로써 하이드로젤 패치 내부의 안정적인 고분자 네트워크 구조 형성을 확인했다.

2% (w/v) Pec-PG 하이드로젤 패치의 평균 탄성계수는 약 10 kPa인데 비하여 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤 패치는 약 40 kPa의 평균 탄성계수를 가짐을 확인함으로써 Pec-PG 농도와 비례하여 탄성계수가 증가함을 확인했다.(도 16b 참조)

즉, Pec-PG 농도 조절을 통해 Pec-PG 하이드로젤 패치의 기계적 물성을 조절할 수 있음을 확인했다.

패치 제형의 Pec-PG 하이드로젤과 같은 농도의 Pec-PG 용액에서 가교된 하이드로젤을 비교하였을 때 Pec-PG 하이드로젤 패치의 탄성계수가 크게 증가된 것을 확인함으로써 (2% (w/v), 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤의 탄성계수가 각각 1.7 kPa, 4.9 kPa이고 2% (w/v), 4% (w/v) Pec-PG 패치의 탄성계수가 각각 10 kPa, 40 kPa 임) 유동성이 높고 물리적 변형이 큰 구강 조직과 같은 체내 환경에서도 Pec-PG 하이드로젤 패치가 안정적으로 잘 유지될 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 17. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤 패치의 조직 접착력 측정

Tack test 분석을 통하여 2% (w/v) 및 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤 패치의 조직 접착력을 비교했다. 돼지 잇몸 조직에의 접착력을 평가했다.

돼지 잇몸 조직을 유변학 분석 장비의 플레이트(plate)와 프로브(probe)에 부착시킨 뒤 조직 사이에 자연 산화를 통해 가교된 Pec-PG 하이드로젤 패치를 도포하여 조직을 서로 접착한 후 조직을 당기면서 조직이 탈착되는 힘을 측정했다.(도 17a 참조)

2% (w/v) 및 4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤 패치 모두 약 10~12 kPa 수준의 우수한 조직 접착력을 가지는 것을 확인하였다.(도 17b 참조)

Pec-PG 하이드로젤 패치의 뛰어난 조직 접착력을 통해 음식물 섭취 및 저작 운동 등 움직임과 자극이 많은 구강 환경에서 보다 오랫동안 하이드로젤 패치가 부착 및 유지됨으로써 기존 소재와 비교하여 구강 내 약물전달 효과가 장기간 지속될 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 18. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤 패치의 약물 방출 양상 분석

Pec-PG 하이드로젤 패치의 서방형 약물전달 기능을 검증하기 위해, 구내염 치료약물인 TA(triamcinolone acetonide)의 방출 양상을 분석했다.

생리학적 조건(37 ℃ in PBS 버퍼)에서 펙틴 분해 효소(pectinase; 0.1 U/sample)를 처리하면서 TA 약물 방출 양상을 관찰했다.(도 18 참조)

HPLC 분석을 통해 약물 방출 양상을 확인한 결과, Pec-PG 하이드로젤 패치로부터 TA 약물의 서방형 방출 거동이 확인된다.

따라서, 약물이 탑재된 Pec-PG 하이드로젤 패치를 이용하여 구내염에 효과적인 약물전달이 가능하고, 지속적인 치료 효과를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 19. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤과 패치 제형의 항산화 기능 분석

Pec-PG 하이드로젤과 패치는 수식된 갈롤기의 산화된 유도체로 인해 활성산소족 (reactive oxygen species; ROS) 및 각종 유해 라디칼을 제거(scavenging)할 수 있는 능력을 가지고 있는지 확인하는 실험을 진행했다.

Pec-PG 하이드로젤과 패치의 항산화 기능을 검증하기 위해, ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) radical과 hydroxyl radical을 소거하는 능력(scavenging effect)을 분석했다.

항산화 시험엔 항산화 기능이 높은 샘플과 반응하면 청록색에서 투명하게 변하는 ABTS 용액을 사용했다. (도 19a 참조; 위) 음성 대조군으로는 buffer인 ABTS 용액을, 양성 대조군으로는 항산화능이 높은 비타민 C로서 알려진 ascorbic acid를 사용했다.

또 H₂O₂와 Fe²⁺ 이온이 반응하여 Fe³⁺ 이온과 DNA 손상 및 세포 사멸을 유도하는 활성산소족(hydroxyl radical)이 생성되는 Fenton reaction 시약을 이용해서 Pec-PG 하이드로젤 및 패치가 존재할 때 해당 reaction이 방지되는지 확인했다.(도 19a 참조; 아래) 음성 대조군은 buffer만, 양성 대조군은 ascorbic acid를 사용했다.

4% (w/v) Pec-PG 하이드로젤과 패치를 ABTS 용액과 Fenton reaction을 이용하여 만들어진 용액에 넣고 30분간 incubation 후에 하이드로젤과 패치는 꺼내고 남은 용액의 색을 UV-vis spectroscopy로 측정하여 각각 ABTS radical과 hydroxyl radical이 소거되었는지 확인했다.(도 19b 및 19c 참조) 그 결과 Pec-PG 하이드로젤과 패치 모두 양성 대조군인 ascorbic acid 만큼의 항산화 기능을 가지는 것을 확인했다.

따라서 Pec-PG 하이드로젤 및 패치는 서방형 약물 전달체로서 기능 외에도 뛰어난 항산화 기능을 통해서도 조직 손상을 감소시키는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 20. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤 패치의 래트 당뇨성 구내염 치료 효능 평가

래트를 24시간 금식시킨 후, Streptozotocin (65 mg/kg)을 복강 주사하여 당뇨를 유발했다. 48시간 후 공복 혈당이 200 mg/dL 이상인 것을 확인했다.

당뇨 래트 잇몸에 80% 아세트산을 처리하여 지름 약 4mm 크기의 조직 손상을 유발함으로써 구내염 모델을 제작했다. 구내염 약물인 triamcinolone acetonide (TA)가 탑재된 Pec-PG 하이드로젤 패치를 산화제 없이 자연산화 방식으로 조직 손상 유발 당일과 4일 차에 구내염 유발 부위에 적용하여 잇몸 재생 및 염증 치료 효과를 확인했다.(도 20a 참조)

실험엔 아래 6개 그룹을 사용했다.

1) 어떤 치료도 하지 않은 경우 (No treatment)

2) TA 약물만 적용 (TA only)

3) Pec-PG 패치만 적용 (Patch only)

4) TA 25 ㎍ 탑재된 상용화된 약품 적용 (Control: 제품명 Aftach; 동화약품 사)

5) TA 12.5 ㎍ 탑재된 Pec-PG 패치 (Patch+TA(1x))

6) TA 25 ㎍ 탑재된 Pec-PG 패치 (Patch+TA(2x))

TA 약물을 탑재한 Pec-PG 패치를 부착시키고 4, 7일 차에 염증 부위를 육안적으로 관찰했을 때 TA가 탑재된 Pec-PG 패치(Patch+TA(1x), Patch+TA(2x))를 적용한 경우에 손상된 부위의 면적이 가장 크게 줄어들었으며 조직 재생 효과도 가장 증진되었음을 확인했다.(도 20b 및 20c 참조)

구내염이 유발된 손상 부위에서의 조직 재생 정도를 평가하기 위해 치료 후 7일차에 H&E 염색과 상피 조직 마커(cytokeratin 5; CK5, cytokeratin 13; CK13) 면역 염색 및 염색된 이미지 기반 정량분석을 실시했다. 이를 통해 Pec-PG 패치를 이용하여 TA를 전달한 그룹(Patch + TA(1x), Patch + TA(2x))에서 상피 조직의 재생이 크게 증진된 것을 확인했다.(도 20d 내지 20f 참조)

백혈구 (leukocyte) 마커인 CD11b에 대한 면역 염색을 통하여 어떠한 처리도 하지 않은 No treatment 그룹, Pec-PG 패치 또는 TA 약물만 처리한 그룹과 기존 제품을 적용한 그룹에서는 조직 손상 부위에 많은 염증세포가 관찰되었지만 Pec-PG 패치를 이용하여 TA 약물을 전달한 그룹(Patch+TA(1x), Patch+TA(2x))에서는 현저히 적은 수의 염증세포가 관찰되었다.(도 20d 및 20g 참조)

결론적으로 Pec-PG 패치가 염증 부위에 잘 고정되어 외부 자극으로부터 손상된 조직을 보호하며 항산화 효과 및 효과적인 약물 전달 기능을 통해 상피 조직 재생을 촉진할 수 있음을 확인했다.

비교예 1. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤과 선행기술의 점막 접착력 비교

본 발명에서 개발된 Pec-PG 하이드로젤이 선행문헌에서 개발된 HA-PG 및 Chi-CA 하이드로젤(등록특허 제10-1942220호)보다 점막 접착력이 더 우수하다는 것을 검증하는 분석을 진행했다. HA-PG 및 Chi-CA는 Pec-PG와 마찬가지로 기존 연구에서 자연산화를 통해 가교를 유도하는 방식으로 적용하는 소재들이다.

Mucin 단백질과 각 유도체의 반응성 및 상호작용을 atomic force microscopy (AFM)를 통해 분석했다. (도 21a 참조) Mucin 단백질 용액을 Pec-PG 용액과 혼합했을 때 HA-PG 용액 또는 Chi-CA 용액과 혼합했을 때보다 표면에 더 큰 응집체가 형성됨을 확인했다. (도 21b 참조)

이 결과를 바탕으로 실제 Tack test 분석을 통하여 Pec-PG 하이드로젤 패치, HA-PG 하이드로젤 패치, Chi-CA 하이드로젤 패치의 돼지 잇몸 점막 조직에서의 점막 접착력을 비교했다. (도 21c 참조) Pec-PG 하이드로젤 패치가 약 8.3 kPa 수준의 점막 접착력을 가지는데 비하여, HA-PG 하이드로젤 패치와 Chi-CA 패치가 각각 약 2.3 kPa, 3.5 kPa 수준의 점막 접착력을 가지는 것을 확인했다. 따라서 Pec-PG 하이드로젤 패치가 점막 접착력이 가장 뛰어난 것을 확인했다.

비교예 2. 갈롤기 수식 펙틴 하이드로젤 패치와 선행기술의 제조방식 비교

선행문헌(공개특허 제10-2018-0127634호 등)의 패치 제조 기술에 따라, Pec-PG 패치 제작 시 Pec-PG를 산화제 4.5 mg/ml NaIO₄로 가교를 유도한 후 동결건조 하여 패치를 제작했다.(가교 후 동결건조 패치)

본원에 따른 Pec-PG 패치는 Pec-PG 용액을 몰드에 붓고 가교 없이 바로 동결건조 하여 제작했다.(가교 전 동결건조 패치)

산화제 4.5 mg/ml NaIO₄를 이용하여 가교를 유도한 후, rheometer 장치에서 plate(플레이트)와 probe(프로브)에 패치를 붙이고 Tack test 분석을 통해 각 Pec-PG 패치의 조직 접착력을 비교했다. 그 결과 가교 전 동결건조 패치(우리 특허 제조 방법으로 제작한 패치)가 가교 후 동결건조 패치(기존 선행문헌에서의 일반적인 제조 방법으로 제작한 패치) 보다 접착력이 월등히 우수함을 확인했다. (도 22 참조)

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Claims

갈롤기 유도체가 수식된 펙틴 유도체(Pec-PG)를 포함하며,
상기 펙틴 유도체를 가교시키기 전 동결건조 방식으로 제조하는, 패치.
제1항에 있어서,
상기 갈롤기 유도체는 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine), 타닌산 (tannic acid), 갈산(gallic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데 하이드(2,3,4-trihydroxybenzaldehyde), 2,3,4-트리하이드록시벤조산(2,3,4-Trihydroxybenzoic acid), 3,4,5-트리하이드록시벤즈알데하이드(3,4,5-Trihydroxybenzaldehyde), 3,4,5-트리하이드록시벤즈아마이드(3,4,5-Trihydroxybenzamide), 5-tert-부틸파이로갈롤(5-tert-Butylpyrogallol) 및 5-메틸파이로갈롤(5-Methylpyrogallol)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 패치.
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제1항에 있어서,
상기 패치의 적용 부위는 구강 점막, 코점막, 안점막, 위점막, 장점막, 기관지점막, 심장, 허파 또는 비뇨기를 포함하는 것인, 패치.
제1항에 있어서,
상기 패치는 점막 조직 질환 치료에 사용하는, 패치.
제10항에 있어서,
상기 점막 조직 질환은 구강 점막염, 구강암, 구내염, 백반증, 수족구병, 구강결핵, 구강 칸디다증, 점막의 상처, 치주염, 아프타성 궤양, 베체트병(Behcet's syndrome), 편평태선 또는 헤르페스성 구내염을 포함하는 것인, 패치.
제1항에 있어서,
상기 패치는 약물을 조절하여 전달하는 용도로 사용되는 것인, 패치.
제12항에 있어서,
상기 약물은 DNA, mRNA, siRNA, miRNA, antisense oligonucleotide, 항히스타민제, 단백질류(growth factor), 코르티코스테로이드계(corticosteroid-based)스테로이드 계열, 면역세포 활성화제, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 안트라사이클린계 (anthracycline), 파클리탁셀, 도세탁셀, 카바지탁셀, 탁산계 (taxane), 커큐민, 캄포테신, 베르베린, 에보디아민, 마트린, 피페린, 상귀나린, 테트란드린, 탈리카르핀, 알칼로이드계 (Alkaloid), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈카 알칼로이드계 (vinca alkaloids), 시스플라틴, 카보플라틴, 플라티넘계 (platinum), 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트, 대사길항제(antimetabolites), 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 테니포사이드, 에토포사이드, 토포아이소머라아제 저해제 (topoisomerase inhibitor), 블레오마이신, 악티노마이신, 미토마이신, 항종양 항생제 (antitumor antibiotics), 시클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 알킬화제 (alkylating agent), 아자시티딘, 아자티오프린, 사이타라빈, 독시플루리딘, 치료용 항체, 항생제, 항박테리아제, 항바이러스제, 항염증제, 단백질 의약품, 성장인자, 사이토카인, 펩티드 약물 및 마취제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 패치.
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