KR102549907B1 - 단일염기확장방법을 이용한 미토콘드리아 dna 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 해석 방법 - Google Patents

단일염기확장방법을 이용한 미토콘드리아 dna 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 해석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 해석을 위한 염기서열 분석 방법에 관한 것으로, 상세하게는 C-스트레치 부위의 서열 또는 그의 상보적인 서열에 특이적으로 결합할 수 있되, 사이토신 또는 구아닌이 연속적으로 배열되는 제 1 프라이머; 상기 제 1 프라이머보다 1개 더 많은 사이토신 또는 구아닌을 포함하는 제 2 프라이머; 및 상기 제 2 프라이머보다 1개 더 많은 사이토신 또는 구아닌을 포함하는 제 3 프라이머;를 포함하는 프라이머 혼합물을 이용하여 단일염기확장방법을 수행함으로써, mtDNA 길이 다형성 헤테로플라스미를 우수한 정확성으로 해석할 수 있는 분석 방법에 관한 것이다.

Description

단일염기확장방법을 이용한 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 해석 방법{METHOD FOR ANALYZING LENGTH POLYMORPHISM HETEROPLASMY OF MITOCHONDRIAL DNA VARIATION SITE USING SINGLE BASE EXTENSION}
본 발명은 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 해석을 위한 염기서열 분석 방법에 관한 것이다.
미토콘드리아는 세포질에 존재하는 소기관으로, 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 재조합(recombination) 과정 없이 모계 유전되는 특징을 가지고 있다. 이에 DNA를 이용한 신원확인 감정에서 동일모계 여부 분석이 필요한 경우 일반적으로 mtDNA 염기서열의 변이를 분석하게 된다. 예를 들면, 형제나 조부모 등 2촌 관계 분석이나, 친자 감정에서 편모 시료가 의뢰된 경우 친자감정의 정확성을 높이기 위해 보조적인 기법으로서 mtDNA 분석이 활용될 수 있다. 신원을 알 수 없는 불상의 유해 등이 발견될 경우, 법과학 감정실에서는 유해 등으로부터 DNA를 분리한 후 상염색체 STR, 성염색체 STR(주로 Y-STR) 및 mtDNA 염기서열 분석을 수행하며, 이 정보들은 향후 의뢰되는 가족시료와의 생물학적 가족관계 감정에 활용된다. 모발의 모간 부위나 부패 및 분해된 시료에서 핵 DNA가 파괴되어 STR 분석이 어려운 경우에는, 비교적 복제수(copy number)가 많은 mtDNA 분석을 수행할 수 있다.
미토콘드리아 게놈은 16,569 bp 로 구성되어 있다. 통상 한 종류의 DNA 서열로 존재하나, 경우에 따라서는 한 개체 내에서도 2 이상의 길이 이형체(length variants)가 존재할 수 있으며, 동일 세포나 조직 내에 정상 및 돌연변이 미토콘드리아 유전체가 혼재된 헤테로플라스미(heteroplasmy)로 존재할 수도 있다. mtDNA의 D-loop 에는 염기 C(사이토신)의 삽입이나 특정 염기의 결손에 의해 C가 연속적으로 나타나는 부위가 있는데, 이를 C-스트레치(C-stretch) 혹은 폴리사이토신 스트레치(poly-cytosine stretch)라고 부른다. mtDNA의 D-loop에 존재하는 C-스트레치 부위는 16183, 303, 568 이 보고되어 있다.
사람의 유전자 중에는 각각의 개체에 따라 그 염기서열 구조가 매우 다른 부위가 존재한다. 이를 과변이영역(hypervariable region)이라 부르는데, 이러한 과변이영역의 많은 부위는 단순한 염기서열이 반복적으로 존재하는 경우가 많다. 미토콘드리아 조절 영역(control region)에서 각각 400bp 길이의 두 과변이영역 HV1 과 HV2 부위에 변이가 집중되어 있기 때문에, 미토콘드리아 염기서열의 변이관찰 부위로 HV1 과 HV2 두 부위가 가장 널리 사용된다. 여기에서, mtDNA의 HV2 부위 중 303-309 부위 부근에 나타나는 C-스트레치에 C가 8개 이상 존재할 경우, 도 1에 도시된 바와 같이 C의 정확한 개수 분석이나 이후의 염기서열 분석이 어려워지는 경우가 있다.
미토콘드리아의 헤테로플라스미 분석을 위한 다양한 연구가 수행되어 왔으나, 현재로서는 결과의 정확성에 여전히 한계가 있다. 형광프라이머를 이용한 mtDNA 길이 헤테로플라스미 분석방법(Lee et al, Electrophoresis. 2004;25(1):28-34)은 PCR을 이용하는 방법으로, 신속하다는 장점은 있으나 mtDNA의 HV2 프라이머를 제작하는 서열 부위에 변이가 있을 경우 결과의 정확성이 현저히 저하되고, 새로운 증폭 단계가 필요하기 때문에 시료의 소모가 크다는 한계가 있다. 호모폴리머릭 스트레치(homopolymeric stretch)와 호모폴리머릭(homopolymeric) 영역의 첫 2-4 염기(base)에 결합하는 ‘정션 프라이머(junction primer)’를 이용한 mtDNA의 HV1 및 HV2 영역의 C-스트레치를 읽는 새로운 방법(Lee et al, J Formos Med Assoc. 2016;115(4):284-7)도 제안되었으나, 이 방법 또한 호모폴리머릭 영역(homopolymeuric region)의 끝 염기 2-4는 정션 프라이머의 3’ 끝에 해당하기 때문에 이 부분의 확인이 어려워 정확성에 한계가 있다. 따라서, 보다 우수한 정확도로 mtDNA를 해석하기 위한 분석방법이 필요한 실정이다.
Quantitative and qualitative profiling of mitochondrial DNA length heteroplasmy., Lee HY, Chung U, Yoo JE, Park MJ, Shin KJ., Electrophoresis. 2004;25(1):28-34. Investigation into length heteroplasmy in the mitochondrial DNA control region after treatment with bisulfite., Lee JC, Tsai LC, Yu YJ, Lin CY, Linacre A, Hsieh HM., J Formos Med Assoc. 2016;115(4):284-7.
본 발명은 mtDNA의 길이 다형성 해석을 위한 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 단일염기확장방법을 이용한 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석 방법에 있어서, 상기 단일염기확장방법이 미토콘드리아 DNA의 C-스트레치 부위(C-stretch site)에서 5' 방향으로 인접한 3 내지 115개의 염기를 포함하는 서열 및 적어도 2개의 사이토신(cytosine)이 연속적으로 배열되는 서열을 포함하되, 최대 120개의 염기를 포함하는 제 1 프라이머; 상기 C-스트레치 부위에서 5' 방향으로 인접한 3 내지 115개의 염기를 포함하는 서열 및 상기 제 1 프라이머보다 1개 더 많은 수의 사이토신이 연속적으로 배열되는 서열을 포함하되, 최대 120개의 염기를 포함하는 제 2 프라이머; 및 상기 C-스트레치 부위에서 5' 방향으로 인접한 3 내지 115 개의 염기를 포함하는 서열 및 상기 제 2 프라이머보다 1개 더 많은 수의 사이토신이 연속적으로 배열되는 서열을 포함하되, 최대 120개의 염기를 포함하는 제 3 프라이머; 를 포함하는 프라이머 혼합 조성물을 이용하여 수행되는, 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석 방법이 제공된다.
또한, 상기 제 1 프라이머, 상기 제 2 프라이머 및 상기 제 3 프라이머는 서로 상이한 길이를 가질 수 있다.
또한, 상기 제 1 프라이머는 15 내지 20개의 염기를 포함하고, 상기 제 2 프라이머는 상기 제 1 프라이머보다 5 내지 10개 더 많은 염기를 포함하고, 상기 제 3 프라이머는 상기 제 2 프라이머보다 5 내지 10개 더 많은 염기를 포함할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 혼합 조성물은 상기 제 3 프라이머 1 중량부를 기준으로 상기 제 1 프라이머 1.5 내지 2 중량부 및 상기 제 2 프라이머 1.8 내지 2.2 중량부로 혼합될 수 있다.
또한, 상기 C-스트레치 부위는 미토콘드리아 DNA의 D-loop에 존재하는 것일 수 있다.
또한, 상기 C-스트레치 부위는 HV2의 303 부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 4 내지 서열번호 6의 염기서열을 포함하는, 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석을 위한 단일염기확장방법용 프라이머 혼합 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, mtDNA의 C-스트레치의 사이토신 개수를 정확히 판단할 수 있는 시스템이 구축될 수 있다. 이를 통하여, mtDNA 길이 다형성(length polymorphism)이 헤테로플라스미(heteroplasmy)로 존재하여도 우수한 정확성으로 분석할 수 있어, mtDNA 해석시의 정확도를 향상시킬 수 있다.
또한, mtDNA 해석시 길이 다형성 헤테로플라스미를 갖고 있는 시료에서만 나타나는 특이적 피크를 이용할 수 있어, 종래 정션 프라이머를 이용한 기술보다 높은 정확도를 나타낼 수 있다.
또한, 시퀀싱 분석을 위해 기 증폭 및 정제된 PCR 산물을 미량으로 이용하며, 결합되는 프라이머가 1개이므로 변이에 의한 영향을 적게 받을 수 있으므로, 분석 신뢰도를 향상시킬 수 있다.
또한, 생물학적 가족관계 감정 또는 개체 식별을 위한 정보제공에 적용될 수 있다.
도 1은 mtDNA HV2 301-309 C-스트레치 부위에서 염기서열 해석이 어려운 사례를 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 SNaPshot분석방법의 원리를 도시한 것이고,
도 3은 mtDNA HV C-스트레치의 사이토신이 각각 7개, 8개 및 9개 포함된 시료들에서 SBE 프라이머를 다중증폭 SNaPshot 수행한 결과, 염기 T 패널에서 SBE 프라이머가 각 시료에 특이적으로 결합하여 티민 염기가 검출되는 것을 확인한 결과이고,
도 4는 C-스트레치 C 수를 달리하도록 합성된 주형 DNA의 일부의 모식도이고,
도 5는 합성 DNA를 대상으로 프라이머 3종의 혼합비율을 달리하여 SNaPshot을 수행한 분석결과를 도시한 것이고,
도 6은 합성 DNA를 대상으로 SBE 프라이머의 혼합 비율에 따른 인위적인 길이 다형성 헤테로플라스미를 분석한 결과를 도시한 것이고,
도 7은 변사자 시료 10개에 대한 시퀀싱 분석 결과 및 본 발명의 일 실시예에 따른 SNaPshot분석방법의 결과를 함께 나타낸 것이다.
본 발명은 미토콘드리아 DNA 길이 다형성 헤테로플라스미 해석을 위한 단일염기확장법을 이용한 분석 방법 및 그 수행을 위한 프라이머 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
이 명세서에서 사용된 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 의미로 해석될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 길이 다형성(length polymorphism)은 다형성의 한 종류로, 각 개체별로 차이가 나는 DNA 길이를 의미하며, 구체적으로는 DNA 서열에서 반복되는 서열 횟수가 상이한 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 길이 다형성 헤테로플라스미(heteroplasmy)는 동일한 세포 또는 조직 내에서 길이 다형성을 갖는 DNA들이 혼재된 것을 의미한다.
본 발명에서 길이 다형성 헤테로플라스미는 뉴클레오티드의 확인을 통해 수행될 수 있다. 여기에서, 뉴클레오티드를 확인한다는 것은 해당 뉴클레오티드의 염기(base) 종류를 확인하는 것을 의미한다. 염기 또는 염기서열의 확인은 염기 또는 염기서열의 결정과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석 방법이 제공된다. 본 발명의 일 측면에 따른 분석 방법은 단일염기확장방법(single base extension; SBE)을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 단일염기확장방법은 SNaPshot 방법으로도 불리며 DNA 서열의 특정 위치(position)의 염기를 알고자 할 때, 특정 위치 바로 앞 염기까지의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 부착시키고, 형광을 달리 부탁한 아데닌(adenine; A), 티민(thymine; T), 사이토신(cytosine; C) 및 구아닌(guanine; G) 염기를 신장(extension)시켜 염기를 특정지을 수 있는 방법이다.
본 발명에 있어서, 상기 단일염기확장방법은 길이 및 서열이 다른 적어도 3종의 프라이머를 포함하는 프라이머 혼합 조성물을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 3종의 프라이머는 mtDNA의 C-스트레치를 구성하는 염기인 사이토신이 연속적으로 배열되는 서열을 포함하되, 포함된 사이토신의 수 및 전체 프라이머 길이는 서로 상이한 염기서열일 수 있다.
상기 프라이머 혼합 조성물은 하나의 C-스트레치의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석을 위한 프라이머 세트로 제 1 프라이머, 제 2 프라이머 및 제 3 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 제 1, 제 2 및 제 3 프라이머는 상기 C-스트레치 부위에서 5' 방향으로 인접한 3 내지 115개, 바람직하게는 5 내지 50개의 염기를 포함하는 서열을 가질 수 있다. 한편, 상기 mtDNA의 C-스트레치 부위의 염기는 길이 다형성에 따라 그에 포함되는 사이토신의 수가 달라질 수 있는데, 이러한 C-스트레치의 길이 다형성을 커버할 수 있도록, 본 발명에서 상기 제 1, 제 2 및 제 3 프라이머는 서로 다른 개수의 사이토신을 연속적으로 포함하는 서열을 가질 수 있다. 상기 제 1 프라이머는 적어도 2개, 바람직하게는 5 내지 15개의 사이토신(cytosine)이 연속적으로 배열되는 서열을 포함할 수 있고, 상기 제 2 프라이머는 상기 제 1 프라이머보다 1개 더 많은 사이토신이 연속적으로 배열되는 서열을 포함할 수 있고, 상기 제 3 프라이머는 상기 제 2 프라이머보다 1개 더 많은 사이토신이 연속적으로 배열되는 서열을 포함할 수 있다. 상기 제 1, 제 2 및 제 3 프라이머에 각각 포함되는 사이토신의 수는 분석 대상인 C-스트레치에 포함되는 사이토신 길이 다형성에 따라 달라질 수 있으며, 일예로 mtDNA HV2의 303-309 부위에서는 7 내지 9개 중 어느 하나의 사이토신을 포함하는데, 이 부위가 분석 대상인 경우에는 상기 제 1 프라이머는 7개, 상기 제 2 프라이머는 8개, 상기 제 3 프라이머는 9개의 사이토신이 각각 연속적으로 배열되는 서열을 포함할 수 있다.
상기 제 1, 제 2 및 제 3 프라이머는 단일염기확장방법에 적용하기 적합한 길이를 가지도록 5 내지 120개의 염기를 포함하는 길이로 형성될 수 있다. 각 프라이머의 총 길이가 5개 염기 미만인 경우에는 목적하는 서열에 특이적으로 바인딩하기 어려워 단일염기확장방법에 적용하기 어려운 문제가 발생할 수 있고, 120개 염기 초과인 경우에는 그를 통해 수행되는 단일염기확장방법 신뢰성이 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 상기 제 1, 제 2 및 제 3 프라이머에 포함되는 서열 중 C-스트레치 부위에서 5' 방향으로 인접한 염기를 포함하는 서열은 C-스트레치의 사이토신 수와 전술한 적정 프라이머 길이를 고려하여 염기 수가 조절될 수 있다. 예를 들어, 제 1 프라이머가 C-스트레치 부위에서 5' 방향으로 인접한 염기 115개를 포함하고 그 뒤로 사이토신 5개가 연속적으로 포함되어 총 120개 염기를 갖는 길이로 형성되는 경우, 제 2 프라이머는 C-스트레치 부위에서 5' 방향으로 인접한 염기 114개를 포함하고 그 뒤로 사이토신 6개가 연속적으로 포함되는 총 120개 염기를 포함하도록 형성되고, 제 3 프라이머는 C-스트레치 부위에서 5' 방향으로 인접한 염기 113개를 포함하고 그 뒤로 사이토신 7개가 연속적으로 포함되는 총 120개 염기를 포함하도록 형성될 수 있다.
또한, 상기 제 1, 제 2 및 제 3 프라이머는 증폭 산출물이 서로 구분될 수 있도록 상이한 길이를 가질 수 있으며, 이 때, 서로 용이하게 구분되기 위해 각 프라이머는 서로 5 내지 10개 염기차를 가지는 길이로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1, 제 2 및 제 3 프라이머 중 하나는 15 내지 20 개의 염기를 포함하고, 다른 하나는 그보다 5 내지 10개 더 많은 염기를 포함하고, 또 다른 하나는 상기 다른 하나보다 5 내지 10개 더 많은 염기를 포함하는 길이인 것이 좋다. 예를 들어, 상기 제 1 프라이머는 15 내지 20개의 염기를 포함하고, 상기 제 2 프라이머는 상기 제 1 프라이머보다 5 내지 10개 더 많은 염기를 포함하고, 상기 제 3 프라이머는 상기 제 2 프라이머보다 5 내지 10개 더 많은 염기를 포함하는 길이를 각각 가질 수 있으며, 또는, 반대로 상기 제 1 프라이머가 가장 긴 길이를 가질 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 제 1, 제 2 및 제 3 프라이머는 특정 혼합비를 갖도록 혼합될 수 있다. 구체적으로, 상기 제 3 프라이머 1 중량부를 기준으로 상기 제 1 프라이머 1.5 내지 2 중량부 및 상기 제 2 프라이머 1.8 내지 2.2 중량부로 혼합될 수 있다. 상기 제 1, 제 2 및 제 3 프라이머가 전술한 혼합비로 혼합되는 경우, mtDNA 길이 다형성 헤테로플라스미 분석의 정확성이 향상되는 이점이 있다.
도 2에 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머를 이용한 단일염기확장방법의 기본 원리를 도시하여 본 발명의 원리를 보다 상세하게 설명하기로 한다. 검사 대상인 시료가 HV2 C-스트레치 부위에 7개 사이토신을 연속적으로 포함하는 시료 A인 경우라면, 이 시료에는 7개 사이토신이 연속된 서열의 프라이머가 결합하여야 310 위치의 티민 염기를 읽을 수 있으며, 이 티민 염기는 모세관 전기영동도(electropherogram) 결과상에서는 결합된 SBE 프라이머 길이인 17bp 위치에서 관찰될 수 있다. 해당 시료 A에 8개 또는 9개 사이토신이 연속되는 서열의 프라이머가 결합하는 경우에는 염기에 차이가 발생하므로 티민 염기가 검출될 수 없게 된다. 다른 예로, 검사 대상인 시료가 HV2 C-스트레치 부위에 8개 사이토신을 연속적으로 포함하는 시료 B인 경우라면, 7개 사이토신이 연속되는 서열의 프라이머가 결합하면 다음 염기로 티민이 아닌 사이토신이 검출되게 된다. 이 경우에는 8개 사이토신이 연속되는 서열의 프라이머가 결합하여야 원하는 전기영동도 상 위치인 24 bp 부근에서 티민이 검출될 수 있다. 9개 사이토신이 연속되는 서열의 프라이머의 경우에도 끝 부위의 서열이 달라지게 되므로 티민은 검출될 수 없다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 모세관 전기영동을 통해 시료가 가진 HV2 C-스트레치의 사이토신 염기 개수에 따라 SBE 프라이머가 특이적 결합하여 분석된 결과를 도 3에 도시하였다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, mtDNA HV2의 303-309 부위에 해당되는 염기가 포함되도록 SBE 프라이머를 제조하되, 연속적으로 배열되는 사이토신의 개수를 각각 7개, 8개 및 9개로 달리하는 동시에 각 프라이머의 길이를 17 염기, 24 염기 및 31 염기로 구성되도록 디자인함으로써, SNaPshot 다중증폭분석을 통해 시료가 가진 C 염기 개수에 맞는 SBE 프라이머가 결합되고 각각 디자인된 프라이머 크기로 피크가 산출되도록 할 수 있으며, C-스트레치 부위에서 3' 방향으로 인접한 염기인 티민을 확인할 수 있는 패널 관찰을 통해 C-스트레치 부위에 포함된 사이토신 개수에 따른 시료 결과 차이를 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, C-스트레치에 포함되는 사이토신 개수에 맞는 SBE 프라이머가 결합됨으로써 티민 염기가 검출되는 크기가 SBE 프라이머 길이에 맞추어 달라지게 된다. 이를 통하여, 시료가 어떤 SBE 프라이머와 결합하였는지 추론할 수 있으며, 추론을 통해 시료가 가진 C-스트레치의 사이토신 염기 개수를 확인할 수 있다. 후술할 구체적인 실시예에서는 이러한 본 발명에 따른 분석 방법을 SBE-Cs tool로 명명하여 설명하기로 한다.
본 발명의 일 측면에 따른 미토콘드리아 DNA 분석 방법은 일 염기가 연속적으로 포함되는 C-스트레치 부위를 갖는 다양한 서열의 분석에 적용될 수 있다. 상기 C-스트레치 부위는 미토콘드리아 DNA의 D-loop에 존재하는 것일 수 있다. 상기 미토콘드리아는 동물 또는 식물 유래일 수 있으며, 바람직하게는 포유류 유래, 보다 바람직하게는 사람 유래일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예
<주형 DNA 합성>
인간 HV2의 염기 서열 중 303 위치의 C-스트레치 부위의 C가 각각 7개, 8개 및 9개로 포함되도록 염기 50mer의 길이에 해당하는 염기서열로 구성된 DNA를 합성하고 각각 synDNA-Cs7, synDNA-Cs8 및 synDNA-Cs9으로 명명하였다. 합성 DNA는 C-스트레치가 포함되는 50mer 길이이면서, SBE 프라이머가 결합할 수 있도록 상보적인 서열에 해당하는 부위를 도 4 및 표 1과 같이 제작하였다.
구분 염기서열 (5'→3') 길이(mer)
synDNA-Cs7 서열번호 1 50
synDNA-Cs8 서열번호 2 50
synDNA-Cs9 서열번호 3 50
표 1과 같이 합성된 DNA를 주형으로 이용하는 이유는, 첫째로는 실제 C-스트레치 부위의 C의 개수가 정확히 7개, 8개 및 9개로 단일(homo)로 존재하는 시료를 제작함으로써, 합성된 DNA를 주형으로 SBE primer 3가지를 다중증폭(multiplex)으로 반응시켰을 때, 의도대로 각각의 시료에 맞는 결과를 도출하는 지와, SBE 프라이머 서열의 유사도가 높음으로 인해 발생하는 비특이적인 결합의 가능성을 관찰하기 위해서이고, 둘째로는, 길이 다형성 헤테로플라스미(Length-heteroplasmy)를 의도적으로 제작하고 의도된 비율대로 헤테로플라스미가 검출되도록 실험 조건을 구축하여, 실제시료에서도 길이 다형성 헤테로플라스미 비율을 정확하게 추정함으로써 해석의 정확성을 높이기 위해서이다.
<SBE 프라이머 제작>
단일염기확장방법을 위하여 하기 표 2와 같이 프라이머를 디자인하였다. mtDNA HV2의 303-309 부위에 해당하는 염기가 포함되도록 SBE 프라이머를 제작하되, C 개수가 7개, 8개 및 9개를 포함하면서 프라이머 길이를 17bp, 24bp 및 31bp 로 다르게 제작함으로써, SNaPshot 반응을 시켰을 때 실제시료에 존재하는 C-스트레치 부위의 C 염기 개수에 맞게 SBE 프라이머가 결합됨으로써 310 부위의 T 염기를 읽도록 고안되었다. 이러한 디자인은 C의 개수 해석의 정확성을 높일 뿐 아니라, 하나의 시료 내에 길이 다형성이 존재할 경우 그 비율을 정량적으로도 계산 할 수 있다는 장점이 있다. 이에 따라 C의 개수가 7개 포함된 프라이머인 310 T Cs7는 길이가 17 bp가 되도록 디자인하였고, C의 개수가 8개 포함된 프라이머인 310 T Cs8는 24bp가 되도록, C의 개수가 9개 포함된 프라이머 310 T Cs9는 31bp가 되도록 디자인하였다. 이로써 크기에 따라 분석이 가능한 모세관 전기영동으로 분석하였을 때, 결합된 SBE 프라이머의 종류에 따라 적정 위치에 피크가 관찰되도록 하였다.
구분 염기서열 길이(mer) TM (melting temperature) (℃)
310 T Cs7 서열번호 4 17 57.2
310 T Cs8 서열번호 5 24 65.3
310 T Cs9 서열번호 6 31 69.7
<단일염기확장방법 조건 결정>
일반적으로 시료의 분석은 HV2의 PCR 증폭단계부터 시작되고, PCR 산물의 정제 단계가 요구된다. 실제 시료에 적용하기에 앞서, HV2 염기 단편을 인위적으로 합성한 합성 DNA를 주형으로 하여 SNaPshot Multiplex PCR Assay 가 수행되었다. 표 2에 명시된 SBE 프라이머를 혼합하여 다중증폭 분석이 수행되었으며, 이에 적정 혼합 비율을 결정하고자 하였다. 310 T Cs7, 310 T Cs8 및 310 T Cs9 의 3가지 프라이머를 각각 10pmol/ul 로 제조 후 1:1:1 로 혼합하여 1ul 를 취한 그룹과 1.7:2:1로 혼합하여 1ul 취한 그룹을 비교하였다. 합성 DNA(0.1pmol/ul) 1 ul와 프라이머 혼합물 1ul와 ABI PRISM® SNaPshot™ Multiplex Kit (Thermo Fisher Scientific)의 버퍼 1ul를 혼합하여 사용자 매뉴얼에 따라 수행하였다. 반응 조건은, 96℃에서 10초, 50℃에서 8초, 60℃에서 25초, 27사이클로 ABI 9700 system (Thermo Fisher Scientific)에서 수행하였다.
SNaPshot 반응 산물에 대한 정제는 10μL의 반응 산물에 1μL의 shrimp alkaline phosphatase (Thermo Fisher Scientific), 10X SAP buffer 1ul 를 첨가하고 37℃에서 45분간 반응시킨 후 80℃에서 15분간 반응시켜 수행되었다. 모세관 전기영동은 1μL의 정제된 증폭 산물에 대해 0.2μL의 GeneScan™ 120 LIZ® Size Standard(Thermo Fisher Scientific) 및 10μL의 Hi-Di™ Formamide(Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고 Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer(Thermo Fisher Scientific)를 통해 수행되었다. 그 결과는 GeneMapper™ ID-X software Version 1.4 (Thermo Fisher Scientific)를 통해 확인되었으며, 그를 도 5에 도시하였다. 본 실험은 5회 반복하여 수행되었다.
도 5를 참조하면, 두 가지 그룹의 프라이머 혼합비율 모두 C의 개수가 다르게 포함된 3개의 시료를 성공적으로 분석할 수 있는 것으로 나타났다. 각 프라이머가 1.7:2:1의 비율로 혼합된 경우 310 T Cs8 구간에서 비특이적인 부(minor) 피크가 관찰되었으나, 이는 주(major) 피크에 대한 높이를 기준으로 계산하였을 때 평균 8.5%의 비율로, 무시할 수 있는 수준으로 판단되었다.
다음으로 길이 다형성 헤테로플라스미(heteroplasmy)를 인위적으로 제조하여 상기의 프라이머 혼합 그룹 두가지를 이용해 분석하여 비교하였다. 합성 DNA synDNA-Cs7와 synDNA-Cs8를 각각 5:5, 7:3, 3:7, 9:1 및 1:9의 비율로 혼합하였고, synDNA-Cs8와 synDNA-Cs9를 혼합하여 다중증폭 SNaPshot 분석 후 혼합 비율대로 피크의 높이가 검출되는지 관찰하였다. 이때, 다중증폭 SNaPshot 분석에 사용된 SBE 프라이머 혼합 비율은 단일 피크를 분석한 조건과 동일하게 1:1:1 혼합 그룹과 1.7:2:1로 혼합 그룹 두 가지를 이용하였다. 분석 결과는 도 6에 나타냈다. 또한, SBE 프라이머 혼합비율 1.7:2:1 조건에서, 인위적인 길이 다형성 헤테로플라스미에 대한 합성 DNA의 주(major) 피크와 부(minor) 피크 크기, 높이 및 비율을 하기 표 3에 나타냈다. 하기 표 3에서, 피크 크기(peak size)는 모세관 전기영동상의 분석 크기로 실제 기대 크기와는 이동도(mobility) 차이가 있을 수 있다.
인위적 헤테로플라스미
혼합비율
(Artificial heteroplasmy mix ratio)		 피크 크기(Peak size) 피크 높이(Peak height)
Major Minor Major Minor Minor/Major
Cs7:Cs8 5:5 23.34 25.23 1384 1280 0.92
7:3 23.34 25.17 1724 744 0.43
3:7 25.15 23.29 1847 923 0.50
9:1 23.28 25.13 2612 345 0.13
1:9 25.13 23.31 1980 321 0.16
Cs8:Cs9 5:5 25.13 32.02 1126 1115 0.99
7:3 25.09 32.04 1394 659 0.47
3:7 32.02 25.09 1422 697 0.49
9:1 25.08 32.02 2459 365 0.15
1:9 32.05 25.11 1912 378 0.20
도 6 및 표 3을 참조하면, 분석 결과 합성 DNA synDNA-Cs7와 synDNA-Cs8의 인위적인 길이 다형성 헤테로플라스미 시료는 SBE 프라이머 혼합 비율에 거의 영향을 받지 않았으나, 합성 DNA synDNA-Cs8와 synDNA-Cs9의 혼합은 SBE 프라이머의 혼합 비율이 1.7:2:1 일때 의도한 혼합 비율과 가까운 결과를 보였다.
이에 따라, SBE 프라이머 혼합비율을 1.7:2:1로 하는 것이 실제 시료 분석에서 길이 다형성 헤테로플라스미의 비율을 예측하는데 정확성을 높일 수 있는 조건으로 판단되어, 후술할 실제 시료의 실험 조건에서 SBE 프라이머 혼합비율을 1.7:2:1로 결정하였다.
<변사자 시료를 이용한 유효성 검증>
SBE-Cs tool의 SNaPshot 실험 조건을 상기와 같이 결정하였으며, 실제 변사자 시료를 분석함으로써 유효성을 검증하기 위한 실험을 수행하였다. 변사자 시료 중 일반 시퀀싱 결과에서 HV2 C-stretch 부위의 C 개수가 각각 7개, 8개, 9개 및 해석이 어려운(ambiguous) 시료가 포함되도록 10개의 시료를 선별하였다. 10개의 시료는 구강(buccal swab), 늑연골(costal cartilage) 및 유골(skeletal remain)이 포함되었으며, Quantifiler TM Trio DNA Quantification Kit를 이용하여 DNA 농도와 분해지수를 3회 반복실험을 통해 산출하였으며, 산출된 시료의 정보를 하기 표 4에 기재하였다. 하기 표 4에서, C 길이(LengthC sequencing)는 일반적 시퀀싱으로 분석된 HV2 310C의 C-스트레치 길이를 의미하고, DNA 농도 및 분해정도는 평균값(average) 및 표준편차(standard deviation)로 나타냈다.
시료 C 길이
(Lengthc)
(direct)		 시료 유형
(Sample type)		 DNA 농도
(DNA Concentration)		 분해지수
(Degradation Index)
Average Std Average Std
1 7 costal cartilage 0.110 0.015 0.728 0.042
2 7 skeletal remain 0.001 0.000 0.599 0.225
3 8 buccal swab 0.060 0.005 0.827 0.007
4 8 costal cartilage 0.160 0.011 0.782 0.054
5 8 skeletal remain 0.069 0.006 0.763 0.018
6 8 skeletal remain 0.007 0.002 1.541 0.783
7 9 skeletal remain 0.088 0.004 1.003 0.054
8 9 skeletal remain 0.038 0.002 1.048 0.108
9 ambiguous buccal swab 0.159 0.012 0.802 0.092
10 ambiguous costal cartilage 0.365 0.030 1.052 0.063
변사자 시료에서 추출된 DNA의 PCR은 AmpliTaq Gold DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 2.5유닛, Gold ST*R 10X buffer (Promega, Madison, WI, USA) 2.5μL, F15, R489 프라이머 (10pmol/ul) 1ul 및 주형 DNA 5ul를 혼합하여, 증류수로 최종 25μL로 볼륨을 맞추었다.
PCR 처리 조건은, 10분간 96℃에서 pre-denaturation 시킨 후 94℃에서 20초간 denaturation, 56℃에서 30초간 annealing 및 72℃에서 45초간 extension 하는 조건으로 35사이클을 수행하고 72℃에서 7분간 final extension시키는 것으로 하였고, ABI 9700 system (Thermo Fisher Scientific)에서 수행하였다. PCR 증폭 산물에 대한 정제는 PCR 증폭 산물 5μL에 2μL의 ExoSAPIT® (Thermo Fisher Scientific)를 첨가하고 37℃에서 20분간 반응시킨 후 80℃에 서 15분간 반응시켜 수행되었다.
정제된 DNA는 시퀀싱 및 SNaPshot 분석에 사용되었다. 시퀀싱은 정제된 DNA 7ul를 Big dye terminator cycle sequencing ready reaction kit v3.1 (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 반응시킨 후, Dye-EX (Qiagen) 로 과량의 dye를 제거하여 수행되었다. 전기영동은 3500xL Genetic Analyze를 이용하였고 서열은 Seqscape v5.2 (Applied Biosystems)를 이용하여 rCRS (Revised Cambridge reference sequence)와 비교하여 분석하였다. SNaPshot 분석은 위 합성 DNA 분석과정과 동일하게 진행되었으며, SBE 프라이머 혼합 비율을 1.7:2:1로 결정하여 진행되었다. 이후 시퀀싱 및 SNaPshot 분석(SBE-Cs tool) 결과를 비교하고 그 결과를 도 7에 나타냈다.
도 7을 참조하면, 시퀀싱 결과 및 본 발명에 따른 SNaPshot 분석(SBE-Cs tool) 결과는 주(major) mtDNA 서열에 대하여는 모두 일치하는 것으로 나타났으며, 본 발명에 따른 SNaPshot 분석(SBE-Cs tool) 결과에서 헤테로플라스미의 비율을 보다 정확히 관찰할 수 있었다. 도 7의 결과에서 시료 3, 4 및 5의 경우, 시퀀싱 결과로는 어떤 헤테로플라스미가 어떤 비율로 존재하는지 예측하기 어려우며, 모두 C가 8개 존재하는 것으로 주 피크의 mtDNA를 헤테로플라스미로 판단하기 쉽다. 그러나 이들 시료에 대한 SNaPshot 분석(SBE-Cs tool) 결과를 보면, 시료 4는 C가 7개인 mtDNA가 14% 헤테로플라스미로 존재하고, 시료 5는 C가 9개인 mtDNA가 18% 존재하는 것을 확인할 수 있다. 이렇게 작게(minor) 검출된 헤테로플라스미가 다른 형제 또는 남매관계에서는 주요한(major) 것으로 유전될 수 있으므로, 헤테로플라스미의 양상을 정확하게 분석하는 것은 가족관계에 대한 감정 결과의 신뢰성을 높이기 위해 중요하다. 또한, 도 7의 시료 9 및 10을 참조하면, 시퀀싱 결과로는 헤테로플라스미의 정량적 분석이 어려웠으나 SNaPshot 분석(SBE-Cs tool) 결과를 통해서는 분석이 가능한 것으로 나타났다.
일반적인 시퀀싱 기법으로는 C 염기가 연달아 나타나는 C-스트레치 부위의 C개수가 정확히 판단하기 어려운 경우가 있고, 시퀀싱 결과에서 분석되는 염기 높이가 헤테로플라스미를 측정하는데 대해 정확성 측면에서도 한계가 있다. 그러나 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 디자인된 SNaPshot 분석을 이용하는 경우에는 C-스트레치 부위의 보다 정확한 해석이 가능하였으며, 헤테로플라스미의 비율을 정량적으로 계산할 수 있었다.
<110> Republic of Korea(National Forensic Service Director Ministry of Interior and Safety) <120> METHOD FOR ANALYZING LENGTH POLYMORPHISM HETEROPLASMY OF MITOCHONDRIAL DNA VARIATION SITE USING SINGLE BASE EXTENSION <130> NP-20021-0138 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synDNA-Cs7 <400> 1 taagtgctgt ggccagaagc ggggggaggg ggggtttggt ggaaattttt 50 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synDNA-Cs8 <400> 2 aagtgctgtg gccagaagcg gggggagggg ggggtttggt ggaaattttt 50 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synDNA-Cs9 <400> 3 agtgctgtgg ccagaagcgg ggggaggggg ggggtttggt ggaaattttt 50 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 310 T Cs7 <400> 4 ttccaccaaa ccccccc 17 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 310 T Cs8 <400> 5 ttttttttcc accaaacccc cccc 24 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 310 T Cs9 <400> 6 tttttttttt ttttccacca aacccccccc c 31

Claims (7)

  1. 단일염기확장방법을 이용한 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석 방법에 있어서,
    상기 미토콘드리아 DNA 변이부위는 D-loop의 C-스트레치 부위(C-stretch site)이고,
    상기 단일염기확장방법이
    미토콘드리아 DNA의 상기 C-스트레치 부위(C-stretch site)에서 5' 방향으로 인접한 5 내지 115개의 염기 및 그 뒤로 5 내지 15개의 사이토신(cytosine)이 연속적으로 배열되는 서열을 포함하되, 최대 120개의 염기를 포함하는 제 1 프라이머;
    상기 C-스트레치 부위에서 5' 방향으로 인접한 5 내지 115 개의 염기 및 그 뒤로 상기 제 1 프라이머보다 1개 더 많은 수의 사이토신이 연속적으로 배열되는 서열을 포함하되, 최대 120개의 염기를 포함하는 제 2 프라이머; 및
    상기 C-스트레치 부위에서 5' 방향으로 인접한 5 내지 115 개의 염기 및 그 뒤로 상기 제 2 프라이머보다 1개 더 많은 수의 사이토신이 연속적으로 배열되는 서열을 포함하되, 최대 120개의 염기를 포함하는 제 3 프라이머; 를 포함하는 프라이머 혼합 조성물을 이용하여 수행되는, 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머, 상기 제 2 프라이머 및 상기 제 3 프라이머는 서로 상이한 길이를 갖는, 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 15 내지 20개의 염기를 포함하고, 상기 제 2 프라이머는 상기 제 1 프라이머보다 5 내지 10개 더 많은 염기를 포함하고, 상기 제 3 프라이머는 상기 제 2 프라이머보다 5 내지 10개 더 많은 염기를 포함하는, 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머 혼합 조성물은 상기 제 3 프라이머 1 중량부를 기준으로 상기 제 1 프라이머 1.5 내지 2 중량부 및 상기 제 2 프라이머 1.8 내지 2.2 중량부로 혼합되는, 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 C-스트레치 부위는 HV2의 303 부위를 포함하는, 미토콘드리아 DNA 변이부위의 길이 다형성 헤테로플라스미 분석 방법.
  7. 서열번호 4 내지 서열번호 6의 염기서열을 포함하는, 미토콘드리아 DNA D-loop HV2의 C-스트레치 부위(C-stretch site) 길이 다형성 헤테로플라스미 분석을 위한 단일염기확장방법용 프라이머 혼합 조성물.
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