KR102548891B1 - 전기천공과 전기분해를 이용한 세포사멸 촉진 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포사멸(apoptosis)을 촉진하기 위한 장치로서, 전기천공 펄스 및 전기분해 펄스가 순차적으로 발생되며, 상기 전기천공 펄스는 펄스 폭(pulse width) 및 펄스 인터벌(pulse interval)의 파라미터로 조절되고, 상기 전기분해 펄스는 펄스 폭, 펄스 인터벌, 펄스 꼬리 시간(pulse tail time) 및 릴레이 캐패시터(TEV)의 파라미터로 조절되는 것을 특징으로 하는 장치에 관한 것이다.
통상의 전기천공 펄스를 단독으로 인가했을 때 보다 전기천공 펄스와 전기분해의 펄스를 순차적으로 인가했을 때 유의적으로 높은 세포사멸을 얻을 수 있다. 이는 암 치료에 응용함에 있어 전압을 낮추어 환자의 부담을 경감시키는 효과를 발휘할 수 있다.

Description

전기천공과 전기분해를 이용한 세포사멸 촉진 장치 {Device of accelerating apoptosis by using combination of electroporation and electrolysis}

본 발명은 세포사멸(apoptosis)을 촉진하기 위한 장치로서, 전기천공 펄스 및 전기분해 펄스가 순차적으로 발생되며, 상기 전기천공 펄스는 펄스 폭(pulse width), 펄스 인터벌(pulse interval)의 파라미터로 조절되고, 상기 전기분해 펄스는 펄스 폭, 펄스 인터벌, 펄스 꼬리 시간(pulse tail time) 및 릴레이 캐패시터(TEV)의 파라미터로 조절되는 것을 특징으로 하는 장치에 관한 것이다.

기존 소화기암 치료용 중재형 의료기기는 국소완화 효과는 우수하나 자극이 전달되지 않는 곳에는 효과가 미비하고 치료 프로브 주변의 담관, 혈관, 쓸개, 창자 등을 손상시킬 우려가 있어 암의 전이를 유도하거나 과도한 자극에 따른 화상, 출혈, 궤양, 천공, 간문맥 혈전 및 폐색전증 등 많은 부작용을 초래하기도 한다.

이러한 문제를 해결하기 위하여 비열성 절제 (non-thermal ablation)로 전기자극치료 혹은 전기천공 (electroporation)이 신기술로 각광 받으면서 기초, 임상 연구가 세계적으로 진행되고 있다. 세포를 DNA용액에 현탁하여 직류고전압의 펄스를 통과시키면 세포막에 일시적인 구멍이 생기게 되는데, 이러한 원리를 이용한 유전자 도입법을 전기천공(electroporation)이라고 한다. 이 전기천공이 세포에 지속적으로 유도되면 세포자연사(apotosis)가 유도되기도 한다.

비열성 절제법 중 비가역적 전기천공 (irreversible electroporation, IRE)은 각종 암, 특히 치료가 어려웠던 혈관주위 종양을 포함한 악성 조직을 제거하는 새로운 기술로 고전압 (0~2 kV)을 조직에 인가하여 세포막의 투과성을 변이시켜 되돌릴 수 없는 전기천공을 유도하는 시술이다. 전기천공으로 인하여 항상성이 파괴된 악성 세포 및 암세포가 응고 및 괴사됨으로써 목표한 조직 제거를 수행할 수 있다. 비열성 절제법인 IRE에서도 기존 암 치료용 중재형 의료기기의 문제점 중 하나인 과도한 자극은 부작용을 야기하는 요소이다. 과도한 전기자극은 조직 내에서 열을 발생시키고 타겟 조직의 주변 정상 조직에 손상을 초래할 수 있다. 주변 정상조직의 손상과 부작용을 최소화한 최적의 IRE 시술을 위해서는 타겟 조직의 저항 값, 크기 등의 특성 맞추어 전압, 출력 펄스, 전극 사이의 간격을 조절하여 전기를 인가하여야 한다.

최근에는 높은 전압을 이용한 상대적으로 높은 전압을 이용한 암치료법에까지 전기천공이 광범위하게 사용되고 있다. 특히, 암치료시 방사선의 부작용을 최소화하기 위해 방사선 치료법의 대체 요법으로 널리 사용되고 있다. 하지만, 고전압의 전기천공은 천공의 표적인 암조직뿐만 아니라 암조직 주변의 정상세포에까지 천공이 발생하여 혈관이나 신경 등의 중요 조직을 손상시킬 우려가 높다는 문제점이 있다. 또한 일반적인 비가역적 전기천공의 한계점은 절제 영역이 기존 상대적으로 작다는 것이다. 3 cm 미만의 비교적 작은 종양은 치료가 가능하지만 종양의 크기가 증가할수록 치료될 가능성은 낮아진다.

Hsiao CY, et al., "Irreversible Electroporation: a novel ultrasound-guided modality for non-thermal tumor ablation", Journal of Medical Ultrasound, 25(4), 195-200, 2017

본 발명은 높은 전압을 사용하는 기존 전기천공을 이용한 암치료의 한계점을 극복하고자, 세포사멸에 있어 기존의 비가역적 전기천공보다 효율이 높은, 다양한 펄스 파라미터로 조절되는 장치 및 이를 이용한 방법을 제공하기 위한 것을 그 기술적 과제로 한다.

본 발명의 일 측면에 따라, 세포사멸(apoptosis)을 촉진하기 위해, 전기천공의 펄스 및 전기분해의 펄스를 동시에 발생시키는 장치가 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 장치는

전력을 공급하는 전원부;

사용자 인터페이스를 제공하고 상기 전기천공의 펄스의 진폭, 펄스 폭, 펄스 폭 간격 및 펄스 꼬리 시간의 값과 상기 전기분해의 펄스의 진폭, 펄스 폭, 펄스 폭 간격 및 펄스 꼬리 시간의 값을 설정하는 펄스 설정부; 및

적어도 하나 이상의 캐패시터 및 적어도 하나 이상의 스위칭 소자를 포함하여 구성되고, 상기 전원부의 출력전압을 인가받아 상기 펄스 설정부에 의해 설정된 상기 진폭, 펄스 폭, 펄스 폭 간격 및 펄스 꼬리 시간의 값에 기반하여 상기 적어도 하나 이상의 스위칭 소자를 제어하여 상기 전기천공의 펄스 또는 상기 전기분해의 펄스를 생성하는 펄스 생성부;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 장치는 타깃이 되는 검체에 상기 펄스 생성부에 의해 생성된 펄스를 인가하는 전극부를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 전기천공의 펄스에 있어 펄스 폭(pulse width)이 1~300 μs일 수 있고, 더 바람직하게는 50~200 μs 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 전기천공의 펄스에 있어 펄스 인터벌 (pulse interval)이 1~4 ms 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 전기분해의 펄스에 있어 펄스 꼬리 (pulse tail) 시간이 100 μs 이상 2 ms 미만일 수 있고 더 바람직하게는 400~2000 μs 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 릴레이 캐패시터 (relay capacitor)가 100~400 μF 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 전기분해 펄스 : 전기천공 펄스는 1 : 1 ~ 1 : 10 일 수 있다. 바람직하게는 1: 6 ~1 : 10이다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 장치는 암을 치료하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 전기천공의 펄스 및 전기분해의 펄스를 동시에 인가시켜, 세포사멸(apoptosis)을 촉진하는 방법이 제공된다. 일 실시예에 따라 인간을 제외한 동물을 subject로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 방법은 암을 치료하기 위한 것일 수 있다.

통상의 전기천공 펄스를 단독으로 인가했을 때 보다 전기천공 펄스와 전기분해의 펄스를 순차적으로 인가했을 때 유의적으로 높은 세포사멸을 얻을 수 있다. 이는 암 치료에 응용함에 있어 전압을 낮추어 환자의 부담을 경감시키는 효과를 발휘할 수 있다.

도 1은 슬루율 조절가능한 고전압 펄스의 블록 다이어그램이다.
도 2는 전기천공과 전기분해가 조합된, 하강 에지 시정수 조절 가능한 펄스 (E2) 회로이다.
도 3은 기존의 비가역적 전기천공 (IRE)의 펄스를 나타낸다.
도 4는 전기천공과 전기분해가 조합된, 하강 에지 시정수 조절 가능한 펄스 (E2)를 나타낸다.
도 5는 전기천공과 전기분해가 조합된, 하강 에지 시정수 조절 가능한 펄스 (E2) 시퀀스를 나타낸다.
도 6은 전자 스위치에 연결된 캐패시터 값을 여러 가지로 변화시킨 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 세포사멸 시험에 사용된 기존의 비가역적 전기천공 (IRE)의 펄스를 나타낸다.
도 8은 세포사멸 시험에 사용된 전기 천공 및 전기분해의 조합(E2 )의 펄스를 나타낸다.
도 9는 기존의 비가역적 전기천공의 펄스 (IRE)를 감자에 인가한 후 TTC (triphenyl tetrazorium chloride)로 염색된 단면을 보여준다.
도 10는 펄스 꼬리 시간이 800 μs인 전기천공과 전기분해가 조합된 펄스 (E2 800 μs)를 감자에 인가한 후 TTC로 염색된 단면을 보여준다.
도 11는 기존의 IRE 및 E2 800 μs의 펄스를 감자에 인가한 후 2시간 및 4시간 후 세포사멸된 부분의 면적을 비교한 그래프이다.
도 12는 기존의 IRE 펄스를 인가하는 실험전, 실험후, 실험후 1시간, 3시간, 6시간의 임피던스 그래프이다.
도 13은 E2 800 μs의 펄스를 인가하는 실험전, 실험후, 실험후 1시간, 3시간, 6시간의 임피던스 그래프이다.
도 14는 E2_A의 펄스 그래프 및 이를 감자에 인가한 경우 TTC로 염색된 단면을 보여준다.
도 15는 E2_B의 펄스 그래프 및 이를 감자에 인가한 경우 TTC로 염색된 단면을 보여준다.
도 16는 E2_C의 펄스 그래프 및 이를 감자에 인가한 경우 TTC로 염색된 단면을 보여준다.
도 17는 E2_D의 펄스 그래프 및 이를 감자에 인가한 경우 TTC로 염색된 단면을 보여준다.
도 18는 E2_D2의 펄스 그래프 및 이를 감자에 인가한 경우 TTC로 염색된 단면을 보여준다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

1. 실험 방법

1) E2 고전압 펄스 발생기 구현

기존 구형파 펄스 형태의 파라미터는 진폭, 펄스 폭, 펄스 폭 간격 3가지로 구성된다. 도 1과 같이 하강 에지 시정수 조절이 가능한 펄스는 진폭, 펄스 폭, 펄스 폭 간격, 꼬리 끝 전압(Tail End Voltage; TEV), 펄스 꼬리 시간(Pulse Tail Time; PTT) 5가지 파라미터로 구성된다.

승압 모듈은 UC3845D 소자를 활용한 플라이백 구조로 전압을 승압하여 CAP BANK와 전자 스위치에 연결된 캐패시터를 충전한다. 전자 스위치는 펄스를 출력할 때 사용된다. 펄스 하강 에지의 시정수는 전자 스위치에 연결된 캐패시터 수 조절과 펄스 꼬리 시간 제어를 통해 조절한다. 사용자 인터페이스를 통한 전자 스위치 제어는 캐패시터 값을 변경한다. 전자 스위치에 연결된 캐패시터 수를 조절하면 꼬리 끝 전압을 설정할 수 있다. 이번 연구에 수행되는 부하는 1 kΩ으로 고정하여 실험을 수행했다. 수식 (1)을 참고하여 조절 가능한 캐패시터 값이 0, 1000, 2000, 3000일 경우의 각각의 시정수 값은 0, 1, 2, 3 초이다

수식 (1) τ = RC

사용자 인터페이스는 MCU를 활용한 LCD, 엔코더, 스위치, 부저로 구성된다. 엔코더와 스위치로 진폭, 펄스 폭, 펄스 폭 간격, 펄스 꼬리 시간, 전자 스위치에 연결된 캐패시터 값 변경을 제어할 수 있도록 설계하였으며 LCD는 앞서 설정한 값들을 볼 수 있도록 구성하였다. 부저는 충전이 완료될 경우와 펄스 출력이 나올 때 소리를 내도록 설정하였다. 펄스 구동 시퀀스는 도 2에서와 같이 총 5가지 단계로 구성된다.

i) 사용자 인터페이스를 통해 출력 전압, 펄스 폭, 펄스 폭 간격, 펄스 꼬리 시간, 전자 스위치의 수를 설정한다. 전자 스위치의 총 경우의 수는 4가지다. 0, 1000, 2000, 3000.

ii) 먼저 전자 스위치 1을 구동한 다음 설정된 출력 전압만큼 CAP BANK와 전자 스위치에 연결된 캐패시터를 충전한다.

iii) 전자 스위치2를 구동한다. 전자 스위치 2를 구동하면 출력은 Cap Bank와 전자 스위치에 연결된 캐패시터에서 충전된 전압에서 나간다. 펄스 폭까지 전자 스위치 1과 전자 스위치 2를 구동시킨다.

iv) 펄스 폭이 끝나는 시점에 전자 스위치1의 구동을 멈추면 CAP BANK에 저장된 전압이 출력으로 나가지 못하므로 전자 스위치에 연결된 캐패시터 전압이 출력으로 나온다. 전자 스위치에 연결된 캐패시터는 CAP BANK의 캐패시터값 보다 상대적으로 작기 때문에 출력 전압이 빠르게 떨어진다. 펄스 꼬리 시간까지 전자 스위치 1을 구동하지 않고 전자 스위치2만 구동하면 시정수 모양의 펄스가 나온다.

v) 펄스 꼬리 시간이 끝나면 전자 스위치 2의 구동을 멈춰 출력 전압이 0 Volt가 되도록 한다.

E2를 구현하는 펄스 회로도는 도 2와 같다.

2) 감자를 이용한 세포 사멸 측정

감자를 단면이 생기도록 자르고 기존의 비가역적 전기천공 (IRE) 그리고 전기천공 및 전기분해의 조합 (E2 800 μs)의 펄스를 발생시키는 장치 폭 1 mm 길이 10 cm의 전극을 꽂아 세포사멸의 정도를 측정하였다. TTC (triphenyl tetrazorium chloride) 용액은 TTC 분말 5 g를 정제수 1 L에 녹인 것을 사용하였다. 펄스를 감자에 인가한 후 전극을 뽑고 TTC 용액이 담긴 petri dish에 일정시간 동안 담가 세포사멸을 반영하는 면적을 측정하였다.

2. 결과

1) E2 고전압 펄스 발생

기존의 비가역적 전기천공 (IRE) 그리고 펄스 꼬리 시간이 800 μs인 전기천공 및 전기분해의 조합 (E2 800 μs)의 펄스는 각각 도 3 및 도 4의 형태와 같았다. IRE 및 E2 800 μs의 전자 파라미터는 표 1과 같다.

표 1

도 5는 전기천공 및 전기분해의 조합 (E2 800 μs)의 펄스 회로를 나타낸다. 도 6은 전자 스위치에 연결된 캐패시터 값을 0 μF, 1000 μF, 2000 μF, 3000 μF으로 동작 확인 실험한 경우의 결과 값을 나타낸다. 펄스의 진폭은 500 V, 펄스 폭의 시간은 600 ms, 펄스 꼬리 시간은 400 ms 로 실험을 진행을 수행한 결과, 각각의 꼬리 끝 전압은 0 V, 270 V, 360 V, 380 V으로 펄스 하강 에지 시정수가 캐패시터의 값에 따라 조절되는 것을 알 수 있었다.

도 7은 감자에 인가한 IRE의 펄스를, 도 8은 E2 800 μs의 펄스를 나타낸다.

2) 세포 사멸

도 9 및 도 10을 비교한 결과 전기천공과 전기분해를 결합한 펄스 (E2 800 μs)를 인가한 경우 사멸면적이 증가하는 것을 알 수 있다. 이를 동시에 나타낸 것이 도 11이다. 2시간 동안 E2 800 μs를 감자에 인가한 경우 IRE의 경우보다 1.62배 유의적으로 높았고 4시간 동안 E2 800 μs를 인가한 경우 1.58배 유의적으로 높았다.

기존의 IRE과 전기천공과 전기분해를 결합한 펄스 (E2 800 μs)의 임피던스 결과를 표 2, 표 3, 도 12 및 도 13에 나타내었다. 이는 펄스 인가에 따라 전기천공이 유의적으로 이루어졌음을 시사한다.

표 2

표 3

3) 여러 파라미터에 의한 전기천공 및 전기분해의 조합 펄스

표 4와 같이 파라미터를 다르게 하여 펄스를 발생시키고 이를 감자에 인가하여 세포사멸의 정도를 측정하였다. TTC area는 TTC 염색으로 인해 정상 세포와 구별되는 구획의 면적으로 세포사멸의 정량적인 측정을 반영하는 결과이다. E2_D 및 E2_D2의 경우 감자가 손상되어 생체에 적용할 수 없는 펄스임이 확인되었다. 각각의 펄스 그래프 및 이를 감자에 인가한 경우 TTC로 염색된 단면을 도 14 내지 도 18에 나타냈다. E2_A 내지 E2_D2의 임피던스 결과는 표 5와 같다.

표 4

표 5

Claims (8)

1. 세포사멸(apoptosis)을 촉진하기 위한 장치로서
   세포에 펄스가 인가되고, 상기 펄스는 펄스 폭, 펄스 수, 펄스 꼬리 시간(pulse tail time) 및 릴레이 캐패시터(TEV)의 파라미터로 조절되며,
   상기 펄스 폭은 10 μs 또는 100 μs, 펄스 수는 8 또는 8+1, 펄스 꼬리 시간이 700 μs, 720 μs, 800 μs 또는 1600 μs이고, 릴레이 캐패시터가 200 μF인 것을 특징으로 하는 장치.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 장치는
   전력을 공급하는 전원부;
   사용자 인터페이스를 제공하고 전기천공의 펄스의 진폭, 펄스 폭, 펄스 폭 간격 및 펄스 꼬리 시간의 값과 전기분해의 펄스의 진폭, 펄스 폭, 펄스 폭 간격 및 펄스 꼬리 시간의 값을 설정하는 펄스 설정부; 및
   적어도 하나 이상의 캐패시터 및 적어도 하나 이상의 스위칭 소자를 포함하여 구성되고, 상기 전원부의 출력전압을 인가받아 상기 펄스 설정부에 의해 설정된 상기 진폭, 펄스 폭, 펄스 폭 간격 및 펄스 꼬리 시간의 값에 기반하여 상기 적어도 하나 이상의 스위칭 소자를 제어하여 상기 전기천공의 펄스 또는 상기 전기분해의 펄스를 생성하는 펄스 생성부;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포사멸을 촉진하기 위한 장치.
   
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