KR102546059B1 - 유전자 편집 효율 조절용 화합물 및 이의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자 편집 특이성을 향상시키는 화합물 및 이의 응용을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 유전자 편집을 억제하고/거나 유전자 편집 특이성을 향상시키는 억제제, 조성물 또는 제제를 제조하는데 사용되는 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공하며, 화학식 I의 구조는 명세서에서 설명된 바와 같다. 본 발명의 화합물은 CRISPR 유전자 편집의 정확도를 현저하게 향상시킬 수 있어, 정확한 유전자 편집에 간단하고 효과적인 전략을 제공한다.

Description

유전자 편집 효율 조절용 화합물 및 이의 응용
본 발명은 생물학 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로 유전자 편집 효율 조절용 화합물 및 이의 응용에 관한 것이다.
유전자 편집 기술의 출현으로, 상이한 세포에 대한 효과적인 유전자 편집 및 개조가 가능해졌다. 뉴클레아제의 부위 특이성 식별은 유전체 특정 위치에서 DNA 이중 가닥의 파손을 초래하고, 또한 내인성 DNA 복구 메커니즘을 유발할 수 있다. 비상동성 말단봉합(non-homologous end joining, NHEJ) 경로로 DNA 이중 가닥의 파손을 복구하는 방식을 사용하면, 작은 조각의 삽입 또는 결실을 초래하며, 상기 복구 방식은 녹아웃 돌연변이체를 생성할 수 있다. 상동직접수선(HDR)은 녹인 돌연변이체 또는 리포터 세포계를 구축하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 특이적 부위를 갖는 뉴클레아제의 도움 하에서도, 상동직접수선을 통해 정확한 유전체 편집을 진행하는 것은 여전히 매우 어렵다.
Cas9 등 뉴클레아제의 발견으로, CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집과 같은 CRISPR 기술 기반의 일부 유전자 편집 기술이 개발되었다. CRISPR/Cas9는 세균과 고세균의 장기적인 진화 과정에서 형성되는 적응형 면역 방어로, 침입된 바이러스 및 외인성 DNA를 저항하는데 사용될 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템은 침입 박테리오파지 및 플라스미드 DNA의 조각을 CRISPR에 통합하고, 또한 대응되는 CRISPR RNAs(crRNAs)를 사용하여 상동 서열의 분해를 유도함으로써, 면역성을 제공한다.
CRISPR-Cas9 기술은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease) 및 TALEN 등 기술에 이어 유전자 녹아웃 세포 및 동물의 부위 별 구축에 사용될 수 있는 제4 방법이고, 효율이 높고 속도가 빠르며 생식계 전이 능력이 강하고 간단하고 경제적인 특징을 가지며, 세포 모델 구축, 동물 모델 구축, 약물 표적 감정, 질환 치료 등 분야에서의 응용 전망이 매우 광범위하다. ZFN/TALEN에 비해, CRISPR/Cas는 조작이 더 쉽고, 효율이 더 높으며, 동형 접합 돌연변이체를 더 쉽게 얻고, 상이한 부위에서 동시에 다수의 돌연변이를 도입할 수 있다.
그러나, CRISPR-Cas9의 유전자 편집 정확도는 여전히 만족스럽지 못하다.
따라서, 본 기술분야는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템 효율을 조절할 수 있으며, 특히 이의 특이성을 향상시키는 새로운 화합물을 개발하는 것이 시급하다.
본 발명의 목적은 유전자 편집 특이성을 향상시키는 화합물 및 이의 응용을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에서는, 유전자 편집을 억제하고/거나 유전자 편집 특이성을 향상시키는 억제제, 조성물 또는 제제를 제조하기 위한, 하기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물의 용도를 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112021002434707-pct00001
상기 식에서,
Z1은 H 또는 -L1-W이고, L1은 없거나 2가 연결기이며, 상기 2가 연결기는, 치환 또는 비치환된 -C1-C3 알킬렌기(alkylene), 치환 또는 비치환된 -NH-, 치환 또는 비치환된 -NH-NH-, -O-, -S-, 치환 또는 비치환된 -C3-C6 시클로알킬렌기(cycloalkylene), 치환 또는 비치환된 3 내지 6원 헤테로시클릴렌기(heterocyclylene), 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴렌기(arylene), 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로아릴렌기(heteroarylene), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 연결 단위를 가지고; 상기 헤테로아릴렌기(heteroarylene) 또는 헤테로시클릴렌기는 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자를 함유하며;
W는 할로겐, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기(alkyl), 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐기(alkenyl), 치환 또는 비치환된 C2-C10 알케닐옥시기(alkenyloxy), 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐기(alkynyl), 치환 또는 비치환된 C2-C10 알키닐옥시기(alkynyloxy), 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기(cycloalkyl), 치환 또는 비치환된 C1-C10 알콕시기(alkoxy), 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기(aryl), 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로아릴기(heteroaryl), 치환 또는 비치환된 5 내지 10원 헤테로 고리, 또는 치환 또는 비치환된 3 내지 10원의 탄소 고리(1 내지 3개의 불포화 결합을 함유함)이고; 상기 헤테로아릴기 또는 헤테로 고리는 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자를 함유하며;
상기 치환은 기 중 H가 할로겐, 옥소(oxo)(＝O), C1-C4 알킬기, C1-C4 할로알킬기(haloalkyl), -ORa, -NRaRb, 페닐기(phenyl), 벤질기(benzyl), C1-C4 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 치환되는 것을 의미하고; 상기 페닐기 및 벤질기는 비치환되거나, 할로겐, C1-C4 알킬기, C1-C4 할로알킬기, -OH, -NH2로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 치환기를 가지며;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 H, C1-C4 알킬기, 또는 C1-C4 할로알킬기이고;
Z2는 H 또는 -L1-W이고, L1 및 W는 상기 정의된 바와 같고,
Z3은 H 또는 -L1-W이고, L1 및 W는 상기 정의된 바와 같고,
Z4는 H 또는 -L1-W이고, L1 및 W는 상기 정의된 바와 같고,
A는 -(C=O)- 또는 -SO2-이고/거나,
Z4, A 및 Z2는 연결된 탄소 원자와 함께 치환 또는 비치환된 5 내지 8원 고리를 구성하며, 상기 치환의 정의는 상기 정의된 바와 같고/거나,
Z3 및 Z1은 연결된 탄소 원자와 함께 치환 또는 비치환된 5 내지 8원 고리를 구성하며, 상기 치환의 정의는 상기 정의된 바와 같다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 치환 또는 비치환된 5 내지 8원 고리는 6원 또는 7원 탄소 고리이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 치환 또는 비치환된 5 내지 8원 고리는 0, 1, 또는 2개의 헤테로 원자를 함유하고, 상기 헤테로 원자는 N, O 및 S로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 치환 또는 비치환된 5 내지 8원 고리는 "-CO-CRc＝CRc-CO-"를 함유한 구조이고, 상기 식에서, Rc는 H, C1-C10 알킬기, C1-C10 할로알킬-OH, 할로겐, C3-C8 시클로알킬기, 벤질기이다.
다른 일 바람직한 예에서, 화학식 I에서 A, Z1, Z2, Z3 및 Z4 기는 표 1에서 각 구체적인 화합물의 대응되는 기이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 A의 화합물이다:
[화학식 A]
Figure 112021002434707-pct00002
상기 식에서,
X는
Figure 112021002434707-pct00003
이거나 없으며;
R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬기, 할로겐화 C1-C6 알킬기, C1-C6 알콕시기, 할로겐화 C1-C6 알콕시기로부터 선택되고;
R4는 H, 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 6원 방향족 헤테로 고리로부터 선택되며;
R5는 아미노기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알콕시기, 치환 또는 비치환된 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 6원 방향족 헤테로 고리-NH-NH-, 치환 또는 비치환된 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 4 내지 6원 불포화 헤테로 고리로부터 선택되고; 상기 치환은 할로겐, 옥소로부터 선택된 기에 의해 치환되는 것을 의미한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 "유전자 편집 특이성을 향상시키는 것"은 유전자 편집의 비표적 비율의 감소, 유전자 편집의 표적/비표적 비율의 증가를 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 "유전자 편집 억제"는 비상동성 말단봉합(NHEJ) 기반의 DNA 복구의 억제를 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 "유전자 편집 억제"는 상동직접수선(HDR) 기반의 DNA 복구의 억제를 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 "유전자 편집 특이성을 향상시키는 것"은 A2/A1≥1.5, 바람직하게는, A2/A1≥2, 보다 바람직하게는, A2/A1≥3을 의미하고, 이때, A1은 화합 중에 화합물이 첨가되지 않을 때 특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수와 비특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수(즉, 비표적이 발생한 수)의 비율이고, A2는 화합물이 첨가될 때 특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수와 비특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수의 비율이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 조성물은 약학 조성물을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 6원 방향족 헤테로 고리는
Figure 112021002434707-pct00004
이다.
다른 일 바람직한 예에서, 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 4 내지 6원 불포화 헤테로 고리는
Figure 112021002434707-pct00005
,
Figure 112021002434707-pct00006
이다.
다른 일 바람직한 예에서, 화학식 A에서 X, R1, R2, R3, R4 및 R5 기는 표 1에서 각 구체적인 화합물의 대응되는 기이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화합물은
Figure 112021002434707-pct00007
이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화합물은
Figure 112021002434707-pct00008
이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화합물은
Figure 112021002434707-pct00009
이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화합물은
Figure 112021002434707-pct00010
이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화합물은
Figure 112021002434707-pct00011
이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화합물은
Figure 112021002434707-pct00012
이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집은 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease), 유전자조작된 징크 핑거 단백질(engineered zinc finger protein), TALE 시스템, CRISPR 시스템(Cas9, c2c2 또는 cpf1)에 기반한 유전자 편집을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집은 염기 편집에 기반한 유전자 편집을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집은 핵산 절단, 염기 대체(또는 염기 편집), 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 염기 대체는 핵산 절단이 발생하지 않을 경우, C→T 전환, C→G 전환, A→G 전환 또는 이들의 조합으로부터 선택된 단일 염기 전환이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 염기 편집에 사용되는 효소는 APOBEC1, APOBEC3A, hAPOBEC3A 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집은 유전체 DNA의 돌연변이, 유전자 발현의 활성화 또는 억제, RNA 편집, 유전체 DNA의 후성 유전학적 편집을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집은 CRISPR-Cas9에 기반한 유전자 편집을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 Cas9는 야생형 및 돌연변이형의 Cas9 단백질을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 Cas9는 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpyCas9), 황색포도상구균(staphylococcus aureus) Cas9(SaCas9), Cpf1 패밀리로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집은 체내 유전자 편집, 체외 유전자 편집, 또는 이들의 조합을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집을 위해 표적화된 샘플은 세포, 조직, 기관, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집을 위해 표적화된 샘플은 세포, 조직, 기관, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 샘플은 동물, 식물, 미생물(세균, 바이러스를 포함함)로부터 유래된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 샘플은 인간 및 비인간 포유 동물로부터 유래된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 세포는 일차 세포 및 계대 세포를 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 세포는 체세포, 생식 세포, 줄기세포를 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 줄기세포는 전능 줄기세포, 다능 줄기세포, 단능 줄기세포를 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 줄기세포는 유도된 다능 줄기세포(hiPSC)이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 세포는 배아 줄기세포, 지방 줄기세포, 조혈 줄기세포, 면역세포(T 세포, NK 세포)를 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 제제는 약학 조성물을 포함한다.
본 발명의 제2 양태에서는, 체외에서 세포 내 유전자 편집을 억제하고/거나 유전자 편집 특이성을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
유전자 편집 억제제의 존재 하에, 세포에 대해 유전자 편집을 진행하여, 상기 세포 내 유전자 편집을 억제하는 단계를 포함하되,
상기 유전자 편집 억제제는 화학식 A의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물이며; 화학식 A는 상기 정의된 바와 같다.
다른 일 바람직한 예에서, 단계에서, 유전자 편집을 진행하기 이전, 진행 중 및/또는 진행한 이후에, 상기 유전자 편집 억제제를 상기 유전자 편집을 진행하는 세포와 접촉시키고;
다른 일 바람직한 예에서, 상기 체외의 유전자 편집은 일 체외 반응 시스템에서 진행하며;
다른 일 바람직한 예에서, 상기 체외 반응 시스템에서, 상기 유전자 편집 억제제의 농도는 0.01 내지 100 μM이고;
다른 일 바람직한 예에서, 상기 방법은 비진단적 및 비치료적이다.
본 발명의 제3 양태에서는, 제1 시약 및 제2 시약을 포함하는 시약 제품(또는 시약 조합)을 제공하며,
(i) 상기 제1 시약은 유전자 편집 억제제이고, 상기 유전자 편집 억제제는 화학식 A의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물이며(화학식 I은 상기 정의된 바와 같음);
(ii) 상기 제2 시약은 CRISPR 유전자 편집을 진행하는 시약이고;
다른 일 바람직한 예에서, 상기 제2 시약은
(c1) Cas9 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제의 코딩 서열, 또는 Cas9 뉴클레아제를 발현하는 벡터, 또는 이들의 조합;
(c2) gRNA, crRNA, 또는 gRNA 또는 crRNA를 생성하는 벡터;
(c3) 상동직접수선(homologous targeted repair)을 위한 주형(단일 가닥 뉴클레오티드 서열 또는 플라스미드 벡터)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시약을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 유전자 편집을 억제하고/거나 유전자 편집 특이성을 향상시키는 키트를 제조한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 키트는 설명서를 더 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 설명서는 본 발명의 유전자 편집을 억제하는 방법을 기재하였다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집은 체세포, 줄기세포를 표적으로 하는 유전자 편집이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집은 CRISPR-Cas9에 기반한 유전자 편집이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 세포는 배아 줄기세포, 유도 다능 줄기세포, 인간 배아 신장 293 T 세포로부터 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집은 병원성 유전자, 종양 관련 유전자(예를 들어, 발암 유전자), 면역 관련 유전자(예를 들어, 자가 면역 관련 유전자), 시각 관련 유전자, 청각 관련 유전자, 대사 관련 유전자, 바이러스 감염 관련 유전자, 유전적 질환 관련 유전자를 표적으로 한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자는 OCT4, ALBUMIN, ALKBH1, CCR5, CXCR4, PCSK9, Dystrophin, AAVS1, Tmc1 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 제4 양태에서는 제1 용기 및 상기 제1 용기 내에 위치한 제1 시약과, 제2 용기 및 제2 용기 내에 위치한 제2 시약을 포함하는 키트를 제공한다:
(i) 상기 제1 시약은 유전자 편집 억제제이고, 상기 유전자 편집 억제제는 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물이며:
[화학식 I]
Figure 112021002434707-pct00013
[상기 식에서,
치환기의 정의는 상기 정의된 바와 같다];
(ii) 상기 제2 시약은 CRISPR 유전자 편집을 진행하는 시약이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 화학식 A의 화합물이다.
본 발명의 제5 양태에서는, 유전자 편집을 억제하고/거나 유전자 편집 특이성을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유전자 편집 억제제 및 유전자 편집을 진행하는 유전자 편집 시약을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 유전자 편집 억제제는 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물이고; 화학식 I은 상기 정의된 바와 같다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 대상은 인간 및 비인간 포유 동물을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집 시약은 CRISPR-Cpf1에 기반한 유전자 편집 시약을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 유전자 편집 억제제를 적용하기 이전, 적용 중, 및/또는 적용 이후에, 상기 대상에게 유전자 편집을 진행하는 유전자 편집 시약을 적용한다.
이해해야 할 것은, 본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술특징과 아래(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술특징 사이는 모두 상호 조합될 수 있음으로써, 새롭거나 바람직한 기술적 해결수단을 구성한다. 편폭의 제한으로, 여기서 더이상 일일이 설명하지 않는다.
도 1은 EGFP 리포터 세포에서, CRISPR/Cas9 유전자 편집을 통해, 형광을 다시 활성화하는 모식도를 도시한다. 도면에서, NHEJ는 비상동성 말단봉합을 나타낸다. CRISPR/Cas9 편집 후, 세포는 NHEJ의 DNA 복구 경로를 시작하며, 단백질 코딩의 원칙에 따라 거의 1/3의 확률로 형광 단백질의 판독 프레임을 복구하며, 이로써 형광 단백질을 활성화한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서, 일부 화합물은 플라스미드에 의해 발현된 SpyCas9의 유전자 편집에 대해 억제 활성을 갖는다. 도 2에서, 레인 1과 2는 복제(replicate)이고, Ladder는 분자량 표준이며, 여기서 테스트 화합물의 농도는 10 μM이고, 화합물 115, 48 및 49의 구조는 표 1에 표시된 바와 같다. 이 실험은 인간 유전체의 2개의 유전자에서 검증되었으므로, 화합물이 유전자 편집에 대해 억제하는 광범위한 스펙트럼을 증명한다. 이 실험은 T7E1의 테스트 결과를 보여준다(문헌: Guschin, D.Y. et al. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010)).
도 3은 T7E1 검출 결과이며, 화합물 49가 SpyCas9 기반 유전자 편집의 특이성을 향상시킬 수 있음을 도시한다. 표적 편집과 비표적 편집의 비율을 비교해보면, 억제제를 추가한 경우, 표적 편집/비표적 편집(즉, 유전자 편집 특이성)은 증가되었다. 실험은 2개의 세포계(HEK293 및 K562) 및 2개의 유전자(EMX1 및 AAVS1) 및 관련 비표적 부위의 결과를 도시하며, 결론의 광범위한 스펙트럼을 증명한다.
도 4는 T7E1 검출 결과이며, 화합물 49가 SaCas9 유전자 편집에 대해 억제 활성을 갖고 있음을 도시한다. 이 실험은 본 출원에 관련된 화합물이 CRISPR 시스템에 대해 억제 활성을 갖는 광범위한 스펙트럼을 증명한다.
도 5는 T7E1 검출 결과이며, 화합물 49에 따라 개조된 일련의 화합물이 유전자 편집에 대해 억제 활성을 갖고 있음을 도시하며, 화합물의 확장 가단성을 증명한다.
도 6은 화합물 49가 상이한 sgRNA의 on-target 절단을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 염기 편집 시스템을 조절하기 위한 "off-switch"로 사용될 수 있음을 도시한다.
도 7은 화합물 49가 out-of-window에 대해 더 높은 억제 활성을 갖고 있고, 즉 염기 편집의 특이성을 향상시키는 것을 도시한다.
도 8은 화합물 49가 염기 편집의 indel에 대해 억제하며, 즉 염기 편집의 특이성을 향상시키는 것을 도시한다.
본 발명자는 광범위하고 심층적 연구를 통해, 화학식 I과 같은 구조를 갖는 화합물이 Cas9 단백질의 기능을 효과적으로 억제함으로써, CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집 특이성을 현저하게 향상시킬 수 있는 것을 최초로 예기치 않게 발견하였다. 실험 결과, 상기 화학식 I의 화합물(특히 화학식 A의 화합물)은 CRISPR/Cas9 매개의 유전자 편집을 현저하게 억제할 수 있으며, 예를 들어, HEK293 세포 및 K562 세포에서 유전자 편집을 진행하여 Cas9의 특이성을 향상시킬 수 있다. 이를 기반으로, 발명자는 본 발명을 완성하였다.
용어
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 편집 특이성을 향상시키는 것"은 유전자 편집의 비표적 비율을 감소시키거나 유전자 편집의 N1/N0 비율을 증가시키는 것을 의미하며, 이때, N1은 특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생된 수(즉, on)이고; N0은 비특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생된 수(즉, 비표적 발생 수, off)이다.
용어 "C1-C3 알킬렌기(alkylene)"는 메틸렌(methylene), 에틸렌(ethylene), 프로필렌(propylene), 부틸렌(butylene), 또는 유사한 기와 같은 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬렌기(alkylene)를 의미한다.
용어 "C3-C6 시클로알킬렌기"는 시클로프로필렌(cyclopropylene), 시클로부틸렌(cyclobutylene), 시클로펜틸렌(cyclopentylene), 시클로헥실렌(cyclohexylene)과 같은 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 2가 시클로알킬기를 의미한다.
용어 "3 내지 6원 헤테로시클릴렌기(heterocyclylene)"는 3 내지 6개의 고리 원자를 가지며, 또한 하나 이상의 고리 원자가 헤테로 원자(N, O 및 S로부터 선택됨)인 2가 고리 기을 의미한다.
용어 "C6-C10 아릴렌기(arylene)"는 2가 페닐기 또는 2가 나프틸기(naphthyl)와 같은 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 2가 아릴기를 의미한다.
용어 "C3-C10 헤테로아릴렌기(heteroarylene)"는 3 내지 10개의 고리 원자를 가지며, 또한 하나 이상의 고리 원자가 헤테로 원자인 2가 헤테로아릴기를 의미한다.
용어 "C1-C10 알킬기"는 메틸기(methyl), 에틸기(ethyl), 프로필기(propyl), 이소프로필기(isopropyl), 부틸기(butyl), 이소부틸기(isobutyl), 또는 유사한 기와 같은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬기를 의미한다.
용어 "C2-C10 알케닐기"는 비닐기(vinyl), 프로페닐기(propenyl), 이소프로페닐기(isopropenyl), 부테닐기(butenyl), 이소부테닐기(isobutenyl), 또는 유사한 기와 같은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알케닐기를 의미한다.
용어 "C2-C10 알케닐옥시기"는 에틸렌옥시기(ethyleneoxy), 프로필렌옥시기(propyleneoxy), 이소프로펜옥시기(isopropenoxy), 부텐옥시기(butenoxy), 이소부텐옥시기(isobutenoxy), 또는 유사한 기와 같은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알케닐옥시기를 의미한다.
용어 "C2-C10 알키닐옥시기"는 에티닐옥시기(ethynyloxy), 프로피닐옥시기(propynyloxy), 이소프로피닐옥시기(isopropynyloxy), 부티닐옥시기(butynyloxy), 이소부티닐옥시기(isobutynyloxy), 또는 유사한 기와 같은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알키닐옥시기를 의미한다.
용어 "C2-C10 알키닐기"는 에티닐기(ethynyl), 프로피닐기(propynyl), 이소프로피닐기(isopropynyl), 부티닐기(butynyl), 이소부티닐기(isobutynyl), 또는 유사한 기와 같은 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알키닐기를 의미한다.
용어 "C1-C10 알콕시기"는 메톡시기(methoxy), 에톡시기(ethoxy), 프로폭시기(propoxy), 이소프로폭시기(isopropoxy), 부톡시기(butoxy), 이소부톡시기(isobutoxy), 또는 유사한 기와 같은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬옥시기를 의미한다.
용어 "C3-C10 시클로알킬기"는 시클로프로필기(cyclopropyl), 시클로부틸기(cyclobutyl), 시클로펜틸기(cyclopentyl), 또는 유사한 기와 같은 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 시클로알킬기를 의미한다.
용어 "5 내지 10원 헤테로 고리"는 5 내지 10개의 고리 원자를 가지며, 또한 하나 이상의 고리 원자가 헤테로 원자인 2가 고리 기을 의미한다.
용어 "3 내지 10원의 탄소 고리(1 내지 3개의 불포화 결합을 함유함)"는 3 내지 10개의 탄소 원자를 가지며, 또한 1 내지 3개의 불포화 결합(예를 들어 알케닐기 결합 또는 알키닐기 결합)을 갖는 2가 시클로알킬기를 의미한다.
용어 "5 내지 8원 고리"는
Figure 112021002434707-pct00014
와 같은 5 내지 8개의 고리 원자를 갖는 고리를 의미한다.
용어 "할로겐"은 F, Cl, Br 및 I를 의미한다. "할로겐화"는 플루오로화(fluoro), 클로로화(chloro), 브로모화(bromo), 요오드화(iodo)를 의미한다.
화학식 I의 화합물에서, 각 부분의 기는 표 1에 표시된 화합물에서 대응되는 위치에 있는 다양한 구체적인 기일 수 있다.
유전자 편집 억제제
본원에 사용된 바와 같이, "본 발명의 화합물", "화학식 A의 화합물", "본 발명의 유전자 편집 억제제"는 상호 교환하여 사용될 수 있고, 화학식 A로 표시된 구조의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물을 의미한다. 이해해야 할 것은, 상기 용어는 상기 성분의 혼합물을 더 포함한다:
[화학식 A]
Figure 112021002434707-pct00015
상기 식에서,
치환기의 정의는 상기 정의된 바와 같다.
다른 일 바람직한 예에서, 바람직한 화합물은 표 1에 표시된 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물을 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 표 1에 표시된 화합물이다.
본 발명에서, 화학식 A의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 더 포함한다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 화합물과 산 또는 염기로 형성된 약물로서 적절한 염을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 무기염 및 유기염을 포함한다. 바람직한 유형의 염은 본 발명의 화합물과 산으로 형성된 염이다. 염을 형성하기에 적절한 산은 염산, 브롬화수소산, 불화수소산, 황산, 질산, 인산과 같은 무기산, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 젖산, 말산, 타르타르산, 구연산, 피크르산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 벤젠설폰산과 같은 유기산; 및 아스파르트산, 글루탐산과 같은 산성 아미노산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화학식 A의 화합물은 종래의 기술에서 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 숙지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 각각의 단계의 반응 파라미터에 대해 특별히 한정하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 화학식 A의 화합물에서, 키랄 탄소 원자가 존재하면, 키랄 탄소 원자는 R 배열, 또는 S 배열, 또는 양자의 혼합물일 수 있다.
유전자 편집
본 발명의 화합물은 유전자 편집의 특이성을 현저하게 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 대표적인 유전자 편집은, CRISPR에 기반한 유전자 편집을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전형적으로, CRISPR에 기반한 유전자 편집은 CRISPR-Cas에 기반한 유전자 편집을 포함한다. 여기서, 상기 Cas는 Cas9 등을 포함한다.
염기 편집
염기 편집(base editing, BEs)은 CRISPR-Cas9를 기반으로 개발된 4세대 유전자 편집 기술로, DNA를 절단하지 않고 이중 가닥 DNA 파열(double-stranded breaks, DSBs)을 형성하는 경우에 염기 대체를 구현할 수 있으므로, 보다 높은 안전성을 가질 수 있다.
현재, BE시스템의 주요 한계는 다음과 같다. 1) 생체 내(세포 내)에서 순시적 조절을 구현할 수 없다. 2) 예상되는 "in-window"(BE 시스템이 상이함에 따라, 4 내지 8개의 염기가 될 수 있음) 절단 외에, "out-of-window" 절단이 발생할 수 있다. 염기 편집에 사용되는 효소는 APOBEC1, APOBEC3A 및 hAPOBEC3A를 포함한다.
용도
본 발명의 화학식 A의 화합물 및 유전자 편집 시약의 조합은, 유전자 편집의 특이성을 현저하게 향상시킬 수 있으므로, 치료 응용 등 상이한 분야에서 혁신적인 잠재력을 갖는다.
본 발명의 상기 화학식 A의 화합물은 CRISPR 매개의 유전자 편집의 특이성을 향상시키는데 사용될 수 있고, 따라서 병원성 유전자와 관련된 질환을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 CRISPR 매개의 유전자 편집을 억제하는 체외 비치료적 소분자 선별 방법을 제공하며, CRISPR 매개의 유전자 녹인 및 약물 선별 시스템을 포함한다.
본 발명은 소분자를 이용한 CRISPR 매개의 유전자 편집 억제 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 치료적 또는 비치료적일 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은, 본 발명의 화학식 A의 화합물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 대상은 인간 및 비인간 포유 동물(설치동물, 토끼, 원숭이, 가축, 개, 고양이 등)을 포함한다.
조성물 및 적용 방법
본 발명은 CRISPR 매개의 유전자 편집 특이성을 촉진하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학 조성물, 과학연구용 시약 조성물 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 상기 조성물은 유전자 편집을 억제하고/거나 유전자 편집 특이성을 향상시키는데 직접 사용될 수 있고, 예를 들어 단일 유전자 녹인, 이중 유전자 녹인, 점 돌연변이 등이다.
본 발명은 안전하고 유효한 양의 본 발명의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 조성물을 더 제공한다. 이러한 담체는 식염수, 완충액, 글루코오스, 물, 글리세롤, 에탄올, 분말 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약물 제제는 투여 방식과 일치해야 한다.
약학 조성물을 예로, 본 발명의 조성물은 주사 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 생리 식염수 또는 글루코오스 및 기타 보조제를 함유하는 수용액을 통상적인 방법으로 제조한다. 정제 및 캡슐과 같은 약학 조성물은 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 주사제, 용액, 정제 및 캡슐과 같은 약학 조성물은 무균 조건에서 제조되어야 한다. 본 발명의 약물 조합은 또한 분무화 흡입용 분말로 제조될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 경우, 통상적인 방식으로 필요로 하는 대상(예를 들어 인간 및 비인간 포유 동물)에게 적용할 수 있다. 대표적인 적용 방식은 경구 투여, 주사, 부분적 적용 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 주요 장점은 다음을 포함한다.
(a) 유전자 편집을 현저하게 억제하고/거나 유전자 편집 특이성을 향상시킬 수 있는 소분자 화합물을 최초로 제공하며, 상기 화합물은 CRISPRCas9 매개의 hPSC 유전자 녹인 편집에 특히 효과적이다.
(b) 본 발명은 화학식 A의 화합물과 CRISPR-Cas9의 조합을 기반으로 하며 정확한 유전자 편집을 위해 간단하고 효과적인 전략을 제공한다.
(c) 본 발명의 화합물은 세포와 직접 인큐베이션하여 세포에 들어갈 수 있어 유전자 편집 효율에 영향을 미친다.
(d) 본 발명에 일부 보고된 화합물에서, 49 등과 같은 화합물은 임상에서 테스트를 거쳐 인체에 안전한 것으로 입증되었다.
아래에 구체적인 실시예를 결부하여 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 아래 실시예에서 구체적 조건으로 설명되지 않은 실험 방법은, 일반적으로 Sambrook 등, 분자 클론: 실험실 수첩(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 따른 조건을 따르거나, 제조업체에서 제안된 조건을 따른다. 달리 설명되지 않는 한, 백분율과 부는 중량 백분율과 중량 부이다.
실시예 1. EGFP 리포터에 기반한 소분자 억제제 선별
EGFP 리포터 세포계는 도 1에 도시된 바와 같이 구성되었다. CRISPR/Cas9 식별 부위를 EGFP 코딩 서열에 삽입하여, CRISPR/Cas9 식별 부위 하류의 서열이 프레임 외부에 있지 않도록 한다. Cas9를 통해 EGFP 서열을 절단하여 이중 가닥 파열(DSBs)을 생성하며, 이는 세포 내 2가지 DNA 복구 메커니즘인 비상동성 말단봉합(NHEJ) 또는 상동직접수선(HDR) 중 하나를 복구한다. NHEJ에 의한 삽입 또는 결실은 EGFP의 개방열독틀을 회복하여 EGFP 형광을 활성화할 수 있다(도 1).
억제제 없이, 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)(SpyCas9)의 CRISPR/Cas9로 EGFP 리포터를 처리하면, 일반적으로 11 %의 형광 세포가 생성된다. 소분자 억제제가 있는 경우, SpyCas9에 의해 활성화된 형광 세포의 백분율은 감소될 것이다. 각각의 화합물의 50 % 억제 농도(IC50)는 상기 측정에 의해 결정될 수 있다.
결과는 표 1에 표시된 바와 같다.
[표 1]
Figure 112021002434707-pct00016
Figure 112021002434707-pct00017
Figure 112021002434707-pct00018
Figure 112021002434707-pct00019
Figure 112021002434707-pct00020
Figure 112021002434707-pct00021
Figure 112021002434707-pct00022
Figure 112021002434707-pct00023
Figure 112021002434707-pct00024
Figure 112021002434707-pct00025
Figure 112021002434707-pct00026
주의: +는 IC50＞100의 화합물을 나타내고, ++는 10＜IC50＜100의 화합물을 나타내며, +++는 1＜IC50＜10의 화합물을 나타내고, ++++는 IC50＜1의 화합물을 나타낸다.
실시예 2. 화합물이 내인성 유전자에 대한 Cas9의 활성을 억제
2.1 방법
HEK293 세포(105개의 세포/웰)를 24웰 플레이트에 접종한다. 접종 24시간 후, Opti-MEM 배지에서, 200 ng AAVS1-AS2 및 200 ng pST-Cas9 플라스미드 또는 200 ng EMX1 및 200 ng pST-Cas9 플라스미드로 세포를 형질 감염시킨다. 형질 감염 6시간 후, 10 % FBS 및 10 μM 약물(화합물 49)이 보충된 DMEM으로 Opti-MEM을 대체한다. Cas9 활성의 양성 대조군은 200 ng AAVS1-AS2 및 200 ng pST-Cas9 플라스미드 또는 200 ng EMX1 및 200 ng의 약물을 함유하지 않은 pST-Cas9 플라스미드이다. 유전자 편집이 완료된 후, 세포 유전체 DNA를 추출하고, T7E1 방법(문헌：Guschin, D.Y. et al. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010))으로 유전 편집 효율을 검출한다.
2.2 결과
도 2에 도시된 바와 같다. AAVS1-AS2 및 pST-Cas9 플라스미드로 세포를 형질 감염시키는 실험에서, 블랭크 대조군에 비해, 약물을 함유하지 않은 기의 유전자 변화율은 22.4 % 및 35.1 %이고, 화합물 115 및 48을 첨가한 기의 유전자 변화율은 0 %이며, 화합물 49를 첨가한 기의 유전자 변화율＜1 %이다.
EMX1 및 pST-Cas9 플라스미드로 세포를 형질 감염시키는 실험에서, 블랭크 대조군에 비해, 약물을 함유하지 않은 기의 유전자 변화율은 26.5 % 및 27.9 %이고, 화합물 48을 첨가한 기의 유전자 변화율은 0 %이며, 화합물 115를 첨가한 기의 유전자 변화율≤1.5 %이고, 화합물 49를 첨가한 기의 유전자 변화율은 5.6 % 및 3.8 %이다.
따라서, 화합물 49, 115 및 48은 다수의 유전자에서 플라스미드에 의해 발현되는 SpyCas9의 유전자 편집 활성을 억제할 수 있다.
실시예 3. 화합물 49가 SpyCas9 기반의 유전자 편집의 특이성을 강화
3.1 방법
SpyCas9는 화합물 49가 상이한 유전자에 대한 다중 세포계에서 SpyCas9의 특이성에 미치는 영향을 결정하기 위해, HEK293 세포로 지질 형질 감염되거나 K562 세포로 핵 형질 감염된다. 형질 감염 6시간 후, 억제제를 배양물에 첨가한다. 검출 방법은 실시예 2와 동일하다.
3.2 결과
도 3에 도시된 바와 같이, HEK293 세포에서, 화합물을 첨가하지 않았을 경우, 특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수와 비특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수의 비율은 2.4이고, 화합물 49를 첨가한 후, 특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수와 비특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수의 비율은 7이며, 2.9배 증가되었다. 이는 화합물 49가 SpyCas9의 특이성을 향상시킬 수 있다는 것을 설명한다.
실시예 4. 화합물 49의 황색포도상구균 Cas9(SaCas9)의 활성 억제
4.1 방법
이 부분의 방법은 2.1과 유사하며, 구별되는 점은 pST-Cas9를 SaCas9 함유 플라스미드로 대체하는 것이다. 검출 방법은 실시예 2와 동일하다.
4.2 결과
도 4에 도시된 바와 같이, 블랭크 대조군에 비해, 약물을 함유하지 않은 기의 유전자 변화율은 14 %이고, 화합물 49를 첨가한 기의 유전자 변화율＜0.5 %이다. 이는 화합물 49가 세포 배양 실험에서 플라스미드에 의해 발현되는 SaCas9의 활성을 억제할 수 있다는 것을 설명한다.
실시예 5. 화합물 49를 기반으로 개조된 화합물의 유전자 편집에 대한 억제 활성
5.1 방법
화합물의 가연성을 더 입증하기 위해, 본 발명자는 화합물 49의 유사물질(901-905)을 테스트하여, 이들이 유전자 편집에 미치는 영향을 검사하였다. 이 부분의 방법은 실시예 2와 동일하다.
5.2 결과
도 5에 도시된 바와 같다. 약물을 첨가하지 않은 기(편집 효율이 4.8 %)에 비해, 화합물 901 내지 905 및 화합물 49는 유전자 편집 효율을 현저하게 감소시킬 수 있다. 이는 이러한 테스트 화합물이 SpyCas9에 대한 유전자 편집 활성을 억제할 수 있다는 것을 설명한다.
실시예 6. 화합물 49의 염기 편집 시스템에 대한 조절
6.1 방법
HEK293T 세포(105개의 세포/웰)를 24웰 플레이트에 접종한다. 접종 24시간 후, Opti-MEM 배지에서, 250 ng sgRNA 발현 플라스미드 및 500 ng dCas9-DNMT3a-DNMT3l 플라스미드 시스템으로 세포를 형질 감염시킨다. 형질 감염 6시간 후, 10 % FBS 및 500 nM 약물(화합물 49)이 보충된 DMEM으로 Opti-MEM을 대체하고, 양성 대조군은 동일한 부피의 DMSO 용매를 첨가하여 대조된 10 % FBS 함유 DMEM으로 Opti-MEM을 대체한다. 형질 감염 48시간 후, 세포 유전체 DNA를 추출하고, sgRNA 표적 서열에 대한 PCR 증폭 후, 딥 시퀀싱을 수행한다.
6.2 결과
도 6에 도시된 바와 같다. 딥 시퀀싱 결과, KRT약물(화합물 49)은 상이한 sgRNA의 on-target 절단을 효과적으로 감소시킬 수 있고, "off-switch"로서, 염기 편집 시스템에 대해 조절할 수 있다.
구체적으로, 5위의 C에 대해, sg47을 사용할 경우, C→T 전환 빈도는 18 %에서 9 %로 감소되고, 감소 폭은 50 %이다.
실시예 7. 화합물 49의 염기 편집 특이성 개선
7.1 방법
실시예 6.1과 동일하다.
7.2 결과
도 7에 도시된 바와 같다. 딥 시퀀싱 결과, KRT약물(화합물 49)은 out-of-window 활성에 대해 더 크게 억제하며, 즉 염기 편집의 특이성을 개선한다.
구체적으로, sgMSSK1-5를 사용할 경우, window의 5위의 C에 대해, C→T 전환 억제 효율은 30 %이고; out-of-window의 11위의 C에 대해, C→T 전환 억제 효율은 50 %이며, 11위에 대한 억제는 5위에 비해 크다.
실시예 8. 화합물 49의 염기 편집 Indel
8.1 방법
실시예 6.1과 동일하다.
8.2 결과
도 8에 도시된 바와 같다. 딥 시퀀싱 결과, KRT약물(화합물 49)은 염기 편집의 indel에 대해 억제하며, 즉 염기 편집의 특이성을 개선한다.
구체적으로, sg48을 사용할 경우, sg48이 표적화된 20 bp 돌연변이 패턴을 변경하지 않고 indel 빈도가 전체적으로 감소된다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각각의 문헌이 독립적으로 참조로서 인용되는 바와 같이, 모두 본 발명에 참조로서 인용된다. 또한 이해해야 할 것은, 본 발명의 상기 교시 내용을 열독한 후, 본 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 진행할 수 있으며, 이러한 등가 형태는 마찬가지로 본 발명의 청구범위에 의해 한정된 범위에 포함되어야 한다.

Claims (22)

  1. 하기 화학식 A의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물을 포함하는, 유전자 편집을 억제하고/거나 유전자 편집 특이성을 향상시키기 위한 약학 조성물:
    [화학식 A]
    Figure 112022123650544-pct00043

    상기 식에서,
    X는
    Figure 112022123650544-pct00044
    이거나 없고;
    R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬기, 할로겐화 C1-C6 알킬기, C1-C6 알콕시기 및 할로겐화 C1-C6 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 H, 및 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 6원 방향족 헤테로 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R5는 아미노기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알콕시기, -NH-NH-의 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 6원 방향족 헤테로 고리, 및 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 4 내지 6원 불포화 헤테로 고리로부터 선택되되, 상기 치환은 할로겐 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택된 기에 의해 치환되는 것을 의미한다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 6원 방향족 헤테로 고리가
    Figure 112022123650544-pct00045
    또는
    Figure 112022123650544-pct00046
    이고,
    상기 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 4 내지 6원 불포화 헤테로 고리가
    Figure 112022123650544-pct00047
    인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화합물이
    Figure 112022123650544-pct00048
    ,
    Figure 112022123650544-pct00049
    ,
    Figure 112022123650544-pct00050
    ,
    Figure 112022123650544-pct00051
    또는
    Figure 112022123650544-pct00052
    인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    유전자 편집 특이성을 향상시키는 것은 유전자 편집의 비표적 비율의 감소 또는 유전자 편집의 표적/비표적 비율의 증가를 포함하는, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    유전자 편집 특이성을 향상시키는 것이 A2/A1≥1.5을 의미하고, 이때, A1은 화합 중에 화합물이 첨가되지 않을 때 특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수와 비특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수의 비율이고, A2는 화합물이 첨가될 때 특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수와 비특이적 부위에서 예정된 유전자 편집이 발생한 수의 비율인, 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    유전자 편집 특이성을 향상시키는 것이 A2/A1≥2을 의미하는, 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    유전자 편집 특이성을 향상시키는 것이 A2/A1≥3을 의미하는, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    유전자 편집은 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease), 유전자조작된 징크 핑거 단백질(engineered zinc finger protein), TALE 시스템 또는 CRISPR 시스템에 기반한 유전자 편집을 포함하는, 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    CRISPR 시스템이 Cas9, c2c2 또는 cpf1인, 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    Cas9이 야생형 또는 돌연변이형의 Cas9 단백질을 포함하는, 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    Cas9이 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) Cas9, 황색포도상구균(staphylococcus aureus) Cas9 및 Cpf1 패밀리로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    유전자 편집이 체내 유전자 편집, 체외 유전자 편집 또는 이들의 조합을 포함하는, 약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    유전자 편집이 세포, 조직, 기관 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 샘플에 대한 것이되, 상기 샘플이 인간을 제외한 동물, 식물 또는 미생물로부터 유래한 것인, 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 세포가 일차 세포 또는 계대 세포인, 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 세포가 체세포, 생식세포 또는 줄기세포를 포함하는, 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 줄기세포가 전능 줄기세포, 다능 줄기세포 또는 단능 줄기세포를 포함하는, 약학 조성물.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 세포가 배아 줄기세포, 지방 줄기세포, 조혈 줄기세포 또는 면역세포를 포함하는, 약학 조성물.
  18. 유전자 편집 억제제의 존재 하에, 세포에 대해 유전자 편집을 진행하여, 상기 세포 내 유전자 편집을 억제하는 단계를 포함하는, 체외에서 세포 내 유전자 편집을 억제하고/거나 유전자 편집 특이성을 향상시키는 방법으로서,
    상기 유전자 편집 억제제는 하기 화학식 A의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물인, 방법:
    [화학식 A]
    Figure 112022123650544-pct00053

    상기 식에서,
    X는
    Figure 112022123650544-pct00054
    이거나 없고;
    R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬기, 할로겐화 C1-C6 알킬기, C1-C6 알콕시기 및 할로겐화 C1-C6 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 H, 및 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 6원 방향족 헤테로 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R5는 아미노기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알콕시기, -NH-NH-의 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 6원 방향족 헤테로 고리, 및 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 4 내지 6원 불포화 헤테로 고리로부터 선택되되, 상기 치환은 할로겐 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택된 기에 의해 치환되는 것을 의미한다.
  19. (i) 하기 화학식 A의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물인 유전자 편집 억제제인 제1 시약; 및
    (ii) CRISPR 유전자 편집을 진행하는 시약인 제2 시약
    을 포함하는 시약 제품:
    [화학식 A]
    Figure 112022123650544-pct00055

    상기 식에서,
    X는
    Figure 112022123650544-pct00056
    이거나 없고;
    R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬기, 할로겐화 C1-C6 알킬기, C1-C6 알콕시기 및 할로겐화 C1-C6 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 H, 및 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 6원 방향족 헤테로 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R5는 아미노기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알콕시기, -NH-NH-의 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 6원 방향족 헤테로 고리, 및 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 4 내지 6원 불포화 헤테로 고리로부터 선택되되, 상기 치환은 할로겐 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택된 기에 의해 치환되는 것을 의미한다.
  20. 제19항에 있어서,
    제2 시약은 (c1) Cas9 뉴클레아제, Cas9 뉴클레아제의 코딩 서열, Cas9 뉴클레아제를 발현하는 벡터, 또는 이들의 조합; (c2) gRNA, crRNA, 또는 gRNA 또는 crRNA를 생성하는 벡터; 및 (c3) 단일 가닥 뉴클레오티드 서열 또는 플라스미드 벡터인 상동직접수선(homologous targeted repair)을 위한 주형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시약을 포함하는, 제품.
  21. 제19항에 있어서,
    유전자 편집은 병원성 유전자, 종양 관련 유전자, 면역 관련 유전자, 시각 관련 유전자, 청각 관련 유전자, 대사 관련 유전자, 바이러스 감염 관련 유전자 또는 유전적 질환 관련 유전자를 표적으로 하는, 제품.
  22. (i) 제1 용기, 및 상기 제1 용기 내에 위치한 제1 시약으로서, 하기 화학식 A의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 광학 이성질체, 이의 라세미체 또는 이의 용매화물인 유전자 편집 억제제인 제1 시약; 및
    (ii) 제2 용기, 및 상기 제2 용기 내에 위치한 제2 시약으로서, CRISPR 유전자 편집을 진행하는 시약인 제2 시약
    을 포함하는 키트:
    [화학식 A]
    Figure 112022123650544-pct00057

    상기 식에서,
    X는
    Figure 112022123650544-pct00058
    이거나 없고;
    R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬기, 할로겐화 C1-C6 알킬기, C1-C6 알콕시기 및 할로겐화 C1-C6 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4는 H, 및 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 6원 방향족 헤테로 고리로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R5는 아미노기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알콕시기, -NH-NH-의 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 6원 방향족 헤테로 고리, 및 1 또는 2개의 질소 원자를 함유하는 치환 또는 비치환된 4 내지 6원 불포화 헤테로 고리로부터 선택되되, 상기 치환은 할로겐 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택된 기에 의해 치환되는 것을 의미한다.
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