KR102543735B1 - 유전자변형 옥수수를 검정하기 위한 양성대조군 플라스미드 및 이를 이용한 유전자변형 옥수수의 검정방법 - Google Patents

유전자변형 옥수수를 검정하기 위한 양성대조군 플라스미드 및 이를 이용한 유전자변형 옥수수의 검정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자변형 옥수수를 검정하기 위한 양성대조군 플라스미드 및 이를 이용한 유전자변형 옥수수의 검정방법에 관한 것으로, 본 발명의 양성대조군 플라스미드는 기존의 PCR 방법을 바탕으로 하여 유전자변형 옥수수 검출의 효율성을 높일 수 있으므로, 시중에서 유통 중이거나 수입되는 농산물 및 식품 등에서 다양한 형태의 유전자변형 옥수수 시료를 검출하는데 소용되는 시간, 비용 및 노동력을 절감할 수 있을 것이다.

Description

유전자변형 옥수수를 검정하기 위한 양성대조군 플라스미드 및 이를 이용한 유전자변형 옥수수의 검정방법{Positive control plasmid for screening genetically modified corn and method for screening genetically modified corn using the same}
본 발명은 유전자변형 옥수수를 검정하기 위한 양성대조군 플라스미드 및 이를 이용한 유전자변형 옥수수의 검정방법에 관한 것이다.
유전자변형 생물체(Living Modified Organism, LMO)는 인류가 직면한 식량부족, 환경변화, 대체에너지 개발 등 각종 문제점의 해결방안으로, 고부가가치 창출이 가능하여 다양한 작물에 대하여 연구 개발이 진행되어 왔다. 유전자변형 토마토가 처음으로 개발되어 상업화된 이후 다양한 작물에 대한 LMO가 개발되어 왔으며 현재는 의약품, 기능성 등의 가치를 지니는 LMO 개발로 확대되고 있다. 2008년 '유전자변형생물체의 국가간 이동에 관한 법률(LMO법)'이 시행됨에 따라 LMO 수입의 용도별 수입 승인이 소관부처별로 의무화되고 국가차원에서 사후관리 등의 조치를 취하고 있다. 또한, LMO 원료 및 생산물의 안전성 확보와 소비자의 알권리 제공의 일환으로 환경위해성 및 인체안전성 평가를 의무화하고 있다.
최근들어 미승인 LMO의 불법생산, 불법유통 또는 환경방출(environmental release)이 국가적인 이슈가 되고 있는 상황에서, LMO 작물의 재배 및 유통 관리와 소비자의 안전성 확보를 위하여 신속하고 효율적인 LMO 검출 기법에 대한 개발이 요구되고 있다. 특히 최근 개발되는 대부분의 LMO는 후대 교배종으로, 이에 대한 신속한 검출방법의 필요성이 증가되고 있다. 현재 LMO를 검출할 수 있는 방법으로는 단백질의 항원항체반응을 이용한 스트립(strip) 및 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 분석법이 있으며, 보다 정확하고 안정적으로 검출할 수 있는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 분석법이 있다.
LMO의 모니터링을 위해서는 다양한 이벤트(계통)에 대한 검출 여부를 확인해야 한다. 이때 각 도입 유전자별 분석을 수행하여야 하나, 후대교배종 LMO의 경우 2~5개의 유전자가 집적되어 있어, 이들 유전자의 개별적 분석을 해야 하는 불편함이 있다. 또한, 비의도적 환경방출이 우려되는 상황에서 알려져 있지 않는 수많은 LMO 이벤트들을 모두 검출하기에는 많은 시간과 비용이 소모된다. 또한, 양성 시료는 구매가 어렵거나 고가이며, 반복 사용으로 인한 오염 문제가 우려되고 있으므로, 클론 형태의 양성대조군 확보가 요구된다.
한편, 한국등록특허 제1820048호에 옥수수 MON863 품종을 검정하기 위한 '유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 이를 이용한 분석 방법 및 검정용 키트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1278208호에 TC1507, DAS59122, NK603, MON810, MON86, NK603, MON810, M88017, GA21, Bt11, MIR604 및 GA21 이벤트를 검정할 수 있는 '유전자변형 옥수수의 검정을 위한 멀티플렉스-PCR 방법 및 이에 사용되는 검출용 프라이머'가 개시되어 있으나, 본 발명의 Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038, Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG, Bt10-4, NK603, TC1507, CBH351, MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162, MON87429, MON88017, DAS59122-7, Bt11, GA21, Event32, MIR604, 3272 또는 MZHG0JG 이벤트를 검정할 수 있는 '유전자변형 옥수수를 검정하기 위한 양성대조군 플라스미드 및 이를 이용한 유전자변형 옥수수의 검정방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 LMO 옥수수 계통과 옥수수 내재 유전자(SSIIb)에 특이적인 프라이머 세트 44개의 염기서열을 이용하여 Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038(3), Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG 및 Bt10-4의 LMO 옥수수와 내재 유전자에 특이적인 프라이머 염기서열을 포함하는 양성대조군 클론 서열 1; NK603, TC1507, CBH351(1), CBH351(2), MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162 및 MON87429의 LMO 옥수수에 특이적인 프라이머 염기서열을 포함하는 양성대조군 클론 서열 2; LY038(1), LY038(2), MON88017(1), DAS59122-7(1), DAS59122-7(2), Bt11, GA21, Event32, MIR604(1), MIR604(2), MON88017(2), 3272(1), MIR604(2) 및 MZHG0JG의 LMO 옥수수에 특이적인 프라이머 염기서열을 포함하는 양성대조군 클론 서열 3;을 제작하였다. 또한, 상기 양성대조군 서열을 주형으로 이용하여 PCR을 수행한 결과, 양성대조군 서열의 제작에 사용된 프라이머 세트(표 1 내지 3 참고)가 비특이적 반응없이 예상되는 크기의 PCR 산물을 증폭하는 것을 확인하였고, 이를 통해 본 발명의 양성대조구 클론 서열 3개가 기존 PCR 검사법을 이용하여 LMO 옥수수 검정 시 양성대조군으로 효과적으로 기능할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 양성대조군 플라스미드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드를 포함하는 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 플라스미드 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드를 포함하는 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 유전자변형 옥수수 식물체의 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드를 양성대조군으로 이용하여 상기 유전자변형 옥수수 식물체의 특이적 염기서열을 증폭하는 PCR 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 양성대조군 플라스미드는 기존의 PCR 방법을 바탕으로 하여 유전자변형 옥수수 검출의 효율성을 높일 수 있으므로, 시중에서 유통 중이거나 수입되는 농산물 및 식품 등에서 다양한 형태의 유전자변형 옥수수 시료를 검출하는데 소요되는 시간, 비용 및 노동력을 절감할 수 있을 것이다.
도 1 내지 4는 8개 농도(10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078125 ng)의 양성대조군 서열 #1(서열번호 1)을 주형으로 이용하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 5 내지 8은 8개 농도(10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078125 ng)의 양성대조군 서열 #2(서열번호 2)를 주형으로 이용하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 9 내지 도 12는 8개 농도(10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078125 ng)의 양성대조군 서열 #3(서열번호 3)을 주형으로 이용하여 PCR을 수행한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 양성대조군 플라스미드를 제공한다.
본 발명에서 용어 '유전자변형 옥수수'는 자연상태의 생리적 증식·재조합 또는 전통적인 교배·선발에서 사용되지 않는 현대생명공학기술을 이용하여 생물종의 유전물질을 인위적으로 변형시킨 LMO(Living modified organisms) 옥수수를 의미한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드를 포함하는 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 플라스미드 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 내지 3의 양성대조군 플라스미드는 다양한 유전자변형(Living Modified Organism, LMO) 옥수수 계통과 옥수수 내재 유전자에 특이적인 프라이머 세트의 염기서열(표 1 내지 3 참고)을 포함하여 인공적으로 합성한 것으로, 비특이적 반응없이 각 프라이머 세트의 예측되는 증폭 산물 크기와 동일한 크기의 증폭 산물을 생산할 수 있도록 합성되었다.
구체적으로, 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038(3), Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG 및 Bt10-4의 유전자변형 옥수수 계통과 옥수수 내재 유전자(SSIIb)에 특이적인 프라이머 세트 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 인공적으로 합성한 염기서열로, 서열번호 1의 양성대조군 플라스미드를 표 1에 개시된 총 15개의 프라이머 세트에 대한 양성대조군으로 기능할 수 있다.
상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 NK603, TC1507, CBH351(1), CBH351(2), MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162 및 MON87429의 유전자변형 옥수수 계통에 특이적인 프라이머 세트 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 인공적으로 합성한 염기서열로, 서열번호 2의 양성대조군 플라스미드를 표 2에 개시된 총 15개의 프라이머 세트에 대한 양성대조군으로 기능할 수 있다.
상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 LY038(1), LY038(2), MON88017(1), DAS59122-7(1), DAS59122-7(2), Bt11, GA21, Event32, MIR604(1), MIR604(2), MON88017(2), 3272(1), 3272(2) 및 MZHG0JG의 유전자변형 옥수수 계통에 특이적인 프라이머 세트 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 인공적으로 합성한 염기서열로, 서열번호 3의 양성대조군 플라스미드를 표 3에 개시된 총 14개의 프라이머 세트에 대한 양성대조군으로 기능할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드를 포함하는 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 키트를 제공한다.
상기 키트는 구체적으로, 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드; 유전자변형 옥수수 특이적 프라이머 세트; 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약;을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에서, 상기 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 양성대조군 플라스미드는 전술한 것과 같다.
또한, 본 발명의 키트는 유전자변형 옥수수를 검정할 수 있는 프라이머 세트를 포함한다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 프라이머 세트는 표 1 내지 3에 개시된 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, 유전자변형 옥수수 식물체의 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드를 양성대조군으로 이용하여 상기 유전자변형 옥수수 식물체의 특이적 염기서열을 증폭하는 PCR 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 방법을 제공한다.
상기 시료는 유전자변형 옥수수와 관련된 식물, 식물 종자, 식물 세포, 후대 식물, 농업 생산물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 양성대조군 플라스미드는 PCR 방법을 이용하여 유전자변형 옥수수를 검정하는 과정에서 Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038(3), Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG, Bt10-4, NK603, TC1507, CBH351(1), CBH351(2), MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162, MON87429, LY038(1), LY038(2), MON88017(1), DAS59122-7(1), DAS59122-7(2), Bt11, GA21, Event32, MIR604(1), MIR604(2), MON88017(2), 3272(1), 3272(2) 및 MZHG0JG를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트에 대한 양성대조군으로 이용 가능하다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 방법은 유전자변형 옥수수 식물체의 핵산을 주형으로 하고, 각 유전자변형 옥수수의 특이적 염기서열을 증폭하는 단계를 통해 이루어질 수 있다. 상기 염기서열의 증폭은 당업계에 공지된 방법을 통해 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 양성대조군 클론을 제작하기 위한 염기서열 설계 및 검증
본 발명자는 유전자변형(LMO) 옥수수 계통별 프라이머 세트들의 PCR 검사 시 양성대조구로 사용될 수 있는 양성대조군 서열(이하, 양성대조군 클론)을 제작하였다. 상기 양성대조구 클론은, 본 발명의 LMO 옥수수 44계통 및 옥수수 내재 유전자(SSIIb)에 특이적인 프라이머 세트 44개(표 1 내지 표 3)가 각각 비특이적 반응 없이 각 프라이머 세트의 예측되는 증폭 산물 크기와 동일한 크기의 증폭산물을 생산할 수 있도록 프라이머 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 설계한 염기서열(서열번호 1 내지 3; 도 1)이다. 본 발명자는 양성대조구 염기서열을 설계한 후, pUC57 벡터(GENEWIZ, 중국)에 클로닝된 형태로 준비하였다.
구체적으로, 양성대조군 클론 #1(서열번호 1)은 13개의 LMO 옥수수 계통(Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038(3), Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG 또는 Bt10-4)과 내재 유전자에 특이적인 프라이머 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 합성한 염기서열이고, 양성대조군 클론 #2(서열번호 2)는 15개의 LMO 옥수수 계통(NK603, TC1507, CBH351(1), CBH351(2), MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162 또는 MON87429)에 특이적인 프라이머 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 합성한 염기서열이며, 양성대조군 클론 #3(서열번호 3)은 14개의 LMO 옥수수 계통(LY038(1), LY038(2), MON88017(1), DAS59122-7(1), DAS59122-7(2), Bt11, GA21, Event32, MIR604(1), MIR604(2), MON88017(2), 3272(1), 3272(2) 및 MZHG0JG)에 특이적인 프라이머 염기서열과 인위적인 염기서열을 추가하여 합성한 염기서열이다.
Figure 112021048336461-pat00001
Figure 112021048336461-pat00002
Figure 112021048336461-pat00003
2. 형질전환
상기 합성된 3개의 양성대조군 클론 #1~3을 대장균 세포(compentent E-coli cell; enzynomics, 한국)에 열충격법(heat shock)을 이용하여 형질전환하였다. 구체적으로, 대장균 세포를 얼음에 녹이고 10 ㎕의 양성대조군 클론을 넣고 섞어주었다. 30분간 얼음에서 보관한 후 42℃에서 30초간 열충격을 주고, 2분간 얼음에 두었다. 400 ㎕의 SOC 배지를 첨가하여 37℃의 진탕 배양기에서 1시간 동안 배양하고, 8,000 rpm에서 원심분리한 후 상층액 약 400 ㎕를 버리고 남은 용액을 세포와 부드럽게 섞어서 90 ㎕와 20 ㎕를 LB 배지(ampicillin 100 ㎍/㎕)에 분주하였다. 이후 LB 배지에서 37℃ 조건으로 밤새 배양하였고, 25% 글리세롤 상태에서 -70℃의 초저온 냉동고에서 균주를 보관하였다.
3. 플라스미드 준비
플라스미드는 Plasmid 키트(NucleoGen, 한국)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 준비하였다. 구체적으로 상기에서 준비한 E. coli 세포를 재부유시킨 후 RNase A 250 ㎕가 함유된 Cell Resuspension Solution을 첨가하여 혼합하였다. 이후 250 ㎕ Cell Lysis Solution을 첨가하여 인버팅(inverting) 5번을 하였고, 350 ㎕ Neutralization Solution을 첨가하여 인버팅 5번을 실시하였다. 상온에서 12000 rpm 조건으로 10분간 원심분리하여 상층액을 Mini-column에 옮긴 후 다시 1분간 원심분리하여 통과액(flow through)를 버렸다. 이후 700 ㎕의 Wash A Solution을 첨가하여 30초간 원심분리하여 통과액을 버렸고, 다시 200 ㎕ Wash A Solution 첨가하여 3분간 원심분리하여 세척액을 제거하였다. 최종 산물이 담긴 Mini-column을 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 장착한 후 50 ㎕의 증류수를 넣고 녹여서 플라스미드 DNA를 용출하였다.
4. PCR(Polymerase Chain Reaction)
양성대조구 클론 #1~3의 초기 농도를 10 ng으로 하여, 2배씩 희석하는 방식으로 8개의 농도(10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078125 ng)를 만들었다. PCR에 사용한 프라이머 세트 44개는 LMO 옥수수 계통별 특이적 프라이머 세트와 내재 참조 유전자(SSIIb) 증폭용 프라이머 세트로 구성되었으며, 코스모진텍에 의뢰하여 합성하였다. PCR은 GoTaq Green Master Mix(Promega)의 합성효소를 이용하였고, 전체 반응량은 20 ㎕이 되도록 혼합하였다.
PCR은 BIORAD사의 기기를 이용하여 진행하였으며, PCR 과정은 전변성 95℃ 15분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 각 프라이머별 특정 온도(표 1 내지 3 참고)에서 30초, 신장(extension) 72℃ 30초의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 5분의 조건으로 수행하였으며, PCR 증폭 산물은 5300 Fragment analyzer (agilent)로 전기영동하여 확인하였고, 결과 데이터 수집은 Prosize 3.0으로 하였다.
실시예 1. LMO 옥수수 계통 검정용 양성대조군 클론의 검증
본 발명의 양성대조군 클론 #1은 Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038(3), Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG 및 Bt10-4를 포함한 13개의 계통 검사용 및 내재 유전자 확인용으로 구성되어 있고, 양성대조군 #2는 NK603, TC1507, CBH351(1), CBH351(2), MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162 및 MON87429를 포함한 15개의 계통 검사용으로 구성되어 있으며. 양성대조구 클론 #3는 LY038(1), LY038(2), MON88017(1), DAS59122-7(1), DAS59122-7(2), Bt11, GA21, Event32, MIR604(1), MIR604(2), MON88017(2), 3272(1), 3272(2) 및 MZHG0JG를 포함한 14개의 계통 검사용으로 구성되어 있다.
상기 양성대조군 클론의 효율성을 확인하기 위해서 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078125 ng 농도의 양성대조군 클론을 주형으로 이용하여 PCR을 수행한 결과, 양성대조군 클론 #1(도 1 내지 도 4), #2(도 5 내지 도 8) 또는 #3(도 9 내지 도 12) 제작에 사용된 프라이머 세트들이 8개 농도에서 모두 예상되는 크기의 PCR 산물을 증폭하는 것을 확인하였다. 다만, 도 1에서 Bt10-3(117bp)의 경우, 비특이적 반응으로 인해 약 800 bp의 산물이 검출되었지만 증폭산물 크기에 간섭이 되지 않았다. 이를 통해, 본 발명의 양성대조군 클론 #1~3은 0.07 ng에서 10 ng까지 높은 검출 효율성을 보이고, ng 당 높은 카피수를 가지는 특징이 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 양성대조군 클론 #1은 표 1에 개시된 LMO 옥수수 계통별 및 내재 유전자 특이적 프라이머 세트에 대한 양성대조군으로, 양성대조군 클론 #2는 표 2에 개시된 LMO 옥수수 계통별 특이적 프라이머 세트에 대한 양성대조군으로, 양성대조군 클론 #3은 표 3에 개시된 LMO 옥수수 계통별 특이적 프라이머 세트에 대한 양성대조군으로 사용할 수 있으므로, 본 발명의 양성대조군 클론은 기존 PCR 검사법을 이용하여 다양한 유전자변형 옥수수를 검정하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상되었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Positive control plasmid for screening genetically modified corn and method for screening genetically modified corn using the same <130> PN21048 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 989 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> positive control plasmid 1 <400> 1 aacaagaagg caggtgagca gtgaaacaca caggagatta ttatagggtt actcaaccat 60 ggacctcgct ccgctcagac atctccctct ccctcacgca gttcctgctc agcgaagagt 120 atgagtattc aacatttccg tgtggcccag tacattaaaa acgtccgcaa tttggcccct 180 cccagtaaat ccctcgagta gcggccgaag agcagctaat cgccttgcag cacatcgagt 240 tcgccaggaa ccaggccatc agccgcctgg agggcctcag caacctctac caaatctacg 300 ctgagagctt ccgcgagtgg gaggctcttt agaattggca caggaacagg ctcggatcca 360 ctagtaacgt caacgacatg aacagcgccc tgaccaccgc catcccactc ttcaattggc 420 ccgaattccc tatgtaagct cagaccgcca tttaacccca acatcaacga gtgcaaaggc 480 cttaataccc tgagtgtgca ttgcgacggc aaatcatttg gagaggacag ggtacgcgaa 540 atttcttgga tacatgccag tgcggtgaag ccactccata ttgaccatca tactcattgc 600 atccccggaa atctcccaat cctttgacat ctgcctaagg ctgatgcagc tccgtttttg 660 agtattggaa atttcatttc aacccaacgc tgcggacatc tacatttttg aatggtcgct 720 gccaggtatt gatgtgtttc cctgtcacca agagagaaat cgaactcatt agctaacggc 780 caggatcgca tggtggccac aacaccctca acctcacgga gtataatctt gtcttgtgtt 840 gccacctatt tatcacttga gcaatttccg gctataacgg tcctaaggta gcgaatcggt 900 tttgctaagc atgtcacggt gaaatgttct tcagagcaac gacttcaaag cgaccctgtt 960 attaaaatga ggctttggga tacacagaa 989 <210> 2 <211> 928 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> positive control plasmid 2 <400> 2 aacctcctga tggtatctag tatctaccaa ctgctgcctt catacgctat ttatttgccg 60 ggttctcggg tgataagaat gaactgtgcc ttcgcaagac ccttcctcta taagcgttag 120 acggctgtct ttgaggtact acatcgaccg catcgagatc caggagcaac catgcttcca 180 aagaaacgcc ccccatctgg tgtgcagaac ccatctctta tctccaatct ctcttacgag 240 gactacaccg acagctacag tttcctgttg tctgagtttg ttccaaatcc cagataaggg 300 aattaggccc taatcggcta atcgccaaca gaaaccagca gagcctggct actctaatcg 360 aacctgcaac ctatttgcag agggaattca cttaagagga tcccctgaac ctctctaagc 420 ggcccaaact aacgcgcggt gtcatctatg ttactagatc tgctagccct gcaggatgga 480 tcagcaatga gtatgatggt cctctctttg cttggtcttt ctctatcgag acgatttaca 540 gcaaagccag aatcaccaca atataccctc ttccctgggc caatagagcg gccgcgttta 600 aactatcagt gtttagagaa tcacaaagga caagccgttt tacgtttggc tagaactagt 660 tcacttttgt gtgcatactt ttctattgaa ctggtaagga ccctgttcac aacacagggc 720 tctgcgaacg atctcagaca ccaaacgcgc gcgcaaacta ggataaatta tcgagctgtg 780 gactgaaagg agactttgtt tatctcttca actggaagcg cggttacccg gaccgaagct 840 tcggccaatt gagcggagaa ttaagggagt caaccggaca tgcaagttgc aacgcggcag 900 aaaactgaag gcgggaaacg acaatcaa 928 <210> 3 <211> 910 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> positive control plasmid 3 <400> 3 aagcactggc acttggtcta ataggtgggt tcagtctgcg aatgtttggg ggtgggggcc 60 aatccctgcg cagagaagcc tcggcaacgt caagtttatg ggtcgacggt atcgataagc 120 ttgatatcga attcctaaga gcaggacctg cagaagctag ccaggtagta atgcacagat 180 atgcaccaag tcgctttcca accggattcg ggtttggatg gtcaactccg gcaaagcgct 240 caattcgccc tatagtgagt cgtattacaa tcgtacgcac ggacatacat taaaaacgtc 300 cgcaccataa ttattgccca gtctttcatc aatttttccc ttccgtatta caatcgtacg 360 caattcagaa ttatataatc cagcttaaat aagttaagag acaaacaaac aacacagatt 420 aacttctatg gtcccgtttg tttatccaag catacatctg gggtatcttt ggtccaaata 480 gcgcgcaaac taggataaat tggctaagcc cagacaaaca actagctaga ttaattaacg 540 caatctgaga atttcagcat ctgctagccc tgcagaactc ccacaccttg caaacaaatt 600 aacgccgcaa tgtgttatta agttgtctaa gcccataagc aaagcagcgc acgcaattca 660 acagacacac ggcgacattc accaaacgga taacggagaa ttaagggagt cacgttatga 720 ccaagcggat aaaccagagc gctaagcagc agaatttcat cagaccagat tctcttttat 780 ggaaccagtt tcaagcggga atacctgttc gatcgatgga tgtatgtgcc taaactgaag 840 gcgggaaacg aacgggagat tggaaatcta catggatcag caatgcatgg agaaatggtg 900 ttgcgagtaa 910

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 양성대조군 플라스미드로서,
    상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038, Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG 또는 Bt10-4의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하고,
    상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 NK603, TC1507, CBH351, MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162 또는 MON87429의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하며,
    상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 LY038, MON88017, DAS59122-7, Bt11, GA21, Event32, MIR604, 3272 또는 MZHG0JG의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하는, 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 양성대조군 플라스미드.
  2. 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드를 포함하는 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 플라스미드 조성물로서,
    상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038, Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG 또는 Bt10-4의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하고,
    상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 NK603, TC1507, CBH351, MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162 또는 MON87429의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하며,
    상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 LY038, MON88017, DAS59122-7, Bt11, GA21, Event32, MIR604, 3272 또는 MZHG0JG의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하는, 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 플라스미드 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드를 포함하는 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 키트로서,
    상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038, Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG 또는 Bt10-4의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하고,
    상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 NK603, TC1507, CBH351, MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162 또는 MON87429의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하며,
    상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 LY038, MON88017, DAS59122-7, Bt11, GA21, Event32, MIR604, 3272 또는 MZHG0JG의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하는, 유전자변형 옥수수 식물체 검정용 키트.
  7. 유전자변형 옥수수 식물체의 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양성대조군 플라스미드를 양성대조군으로 이용하여 상기 유전자변형 옥수수 식물체의 특이적 염기서열을 증폭하는 PCR 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 방법으로서,
    상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 Mon810, Bt176, Bt10-3, Event32, VCO-ф1981-5, BVLA430101, LY038, Mon89034, T25, MON87403, MON87419, MZHG0JG 또는 Bt10-4의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하고,
    상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 NK603, TC1507, CBH351, MON863, Mon87460, Event 5307, MON87411, DP-004114-3, MZIR098, DAS-40278-9, MON87427, DP-098140-6, MIR162 또는 MON87429의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하며,
    상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 양성대조군 플라스미드는 LY038, MON88017, DAS59122-7, Bt11, GA21, Event32, MIR604, 3272 또는 MZHG0JG의 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 것을 특징으로 하는, 유전자변형 옥수수 식물체를 검정하는 방법.
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