KR102540121B1 - 활막염의 중증도 진단용 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 류마티스 관절염에 의한 활막염의 진단 및 중증도 진단을 위한 지질 바이오마커들에 관한 것으로, 본 발명에서 지질체(lipidomics) 분석을 통해 선발한 지질 바이오마커들은 류마티스 관절염에 의한 활막염에 특이적이며, 이의 중증도를 구분할 수 있으므로, 이를 류마티스 관절염의 진단 용도 및 류마티스 관절염 발병 예측 용도로 유용하게 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

활막염의 중증도 진단용 바이오마커{BIOMARKERS FOR DIAGNOSIS OF SYNOVITIS SEVERITY}

본 발명은 류마티스 관절염에 의한 활막염의 진단 및 중증도 진단을 위한 지질 바이오마커들에 관한 것이다.

지질체학(Lipidomics)은 생체 내에서 발생하는 여러 지질체군(lipidome)들의 대사과정에서 생기는 총체적인 현상 및 변화를 정성 및 정량하여 그 생물학적, 생화학적 중요성을 알아내는 것에 초점을 맞춘 학문 분야로써, 각 종 질환관련 표지물질(biomarker)을 찾는 연구에도 그 목적을 두고 있다. 특히, 최근 전자분무이온화-탠덤질량 분석법(ESI-MS-MS)의 비약적인 발전으로, 지질 분자들의 구조적 분석이 가능하게 되었고, 샷건 지질학(shotgun lipidomics) 분야가 생물학적 조직의 분석에도 활용될 수 있다.

한편, 활막염은 활막(synovial membrane)의 염증에 대한 의학 용어이다. 이 막은 활막 관절(synovial joint)로 알려져 있는, 공간(cavity)을 보유하는 관절을 막처럼 싸고 있다. 이 질환은 보통 고통스러우며, 특히 관절이 움직일 때 고통스럽다. 관절은 보통 활액 집적(synovial fluid collection)으로 인해 붓는다. 원칙적으로, 활막의 변화는 염증성 또는 비염증성일 수 있다. 후자 그룹에는 건활막 거대 세포 종양(tenosynovial giant cell tumor), 지방종(lipoma) 또는 활막 연골종증(synovial chondromatosis)과 같은 일부 양성 종양이 속한다. 희귀한 비염증성 변화는 축적 질병(storage disease)의 그룹이다. 염증성 활막 질병은 통풍(gout) 및 거짓통풍(pseudogout)과 같은 결정 유발성 관절병증(crystal-induced arthropathy), 폐결핵 (tuberculosis), 사르코이드증(sarcoidosis) 및 이물 반응(foreign body reaction)과 같은 육아종병 (granulomatous diseases)으로, 그리고 비-육아종 활막염의 큰 그룹으로 구별될 수 있다. 이 마지막 그룹은 지금까지 가장 흔한 것으로, 종종 조직병리학적 발견을 명확한 진단으로 귀착시키는데 어려움을 야기한다. 활막염은 다른 형태의 관절염에서보다 류마티스 관절염에서 더욱 두드러지며, 류마티스 관절염의 관절에 대한 구조적 손상은 만성 활막염에 의한 결과이다.

류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, 이하 RA)은 대표적인 자가면역질환으로, 관절 주위를 둘러싸고 있는 활막이라는 조직의 염증 때문에 일어나며, 전체 인구의 약 1~2% 가량에서 발병하는 것으로 알려진 질환이다 (Alamanosa and Drosos, Autoimmun. Rev., 4:130-136 (2005)). 류마티스 관절염의 발병은 유전적-환경적 인자가 작용하며, 유전적인 요인이 대략 60% 정도 기여하는 것으로 알려져 있다. 초기 류마티스 관절염은 처음에 더 작은 관절, 예컨대 손목, 손, 발목 및 발의 관절에 영향을 미치며 질환이 진행됨에 따라, 어깨, 팔꿈치, 무릎, 둔부, 턱 및 목의 관절들에도 영향을 나타낼 수 있으며, 질병활성도(disease activity)가 조절되지 않으면 시간 경과에 따라 비가역적 관절변형과 장애가 발생한다. 또한, 관절 내 부위 또는 관절 주변 부위에만 영향을 미치는 다른 관절염 상태들과는 달리, 류마티스 관절염은 피부, 혈관, 심장, 폐 및 근육을 포함하는 신체에 걸쳐 관절 외 조직에서 염증을 야기할 수 있는 전신성 질환이다.

류마티스 관절염의 활막염은 꾸준히 악화되고 심각한 수준으로 발전하나, 아직까지 류마티스 관절염의 활막염 중증도를 진단하는 기술이 미흡하여 이에 대한 연구 및 개발이 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 활막염(synovitis) 중증도 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 활막염 중증도 진단용 키트를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 활막염 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 아실 카르니틴, 리소포스파티딜콜린, 에테르-가교 LPC, 에테르-가교 PC, 세라마이드 스핑고신 및 에테르-가교 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는, 활막염 중증도 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 활막염 중증도 진단용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 활막염 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 지질체(lipidomics) 분석을 통해 선발한 지질 바이오마커들은 류마티스 관절염에 의한 활막염에 특이적이며, 관절초음파 진단 없이 이의 중증도를 구분할 수 있으므로, 이를 류마티스 관절염의 진단 용도 및 류마티스 관절염 발병 예측 용도로 유용하게 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 초음파로 측정한 활막염 점수에 따라 유의미하게 다른 지질의 Heatmap을 나타낸 도이다.
도 2는 초음파로 측정한 활막염 점수에 따라 현저히 다른 지질의 Heatmap을 나타낸 도이다.
도 3은 지질과 실험적 및 임상적 매개 변수의 Pearson's 상관관계 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 활막염 중증도를 예측하는 MCCV을 이용한 다변량 탐색 ROC 분석 결과를 나타낸 도이다:
A: 활막염 중증도 (중증도 활막염 vs. 경증의 활막염)를 예측하기 위한 중요성;
B: Random Forests 분류를 기반으로 한 ROC의 AUC; 및
C: 각 모델의 검증 및 예측 정확도 평가 결과.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

본 발명에서 지질 표기는 지질체학(Lipidomics)에서 세계 응용화학, 생화학, 분자생물학 표준에 따른 시스템 이름 및 공통 이름(IUPAC-IUBMB)에 따라 표기하였다.

일 측면에서, 본 발명은 아실 카르니틴(acyl carnitine, CAR), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC), 에테르-가교 LPC(ether-linked LPC, LPC O), 에테르-가교 PC(ether-linked phosphatidylcholine, PC O), 세라마이드 스핑고신(Ceramide sphingosine, Cer-NS) 및 에테르-가교 포스파티딜에탄올아민(ether-linked phosphatidylethanolamine, PE P)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는, 활막염(synovitis) 중증도 진단용 바이오 마커 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 아실 카르니틴은 22:1이고, 리소포스파티딜콜린은 16:1, 10:0, 22:6, 18:2, 20:3 또는 16:0이며, 에테르-가교 LPC는 24:0이고, 에테르-가교 PC는 40:2, 40:8, 42:3 (1), 42:3 (2) 또는 42:4이며, 세라마이드 스핑고신은 42:2이고, 에테르-가교 포스파티딜에탄올아민은 36:1일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 바이오마커는 골관절염에 의한 활막염과 구별하여 류마티스성 활막염을 진단할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 중증도는 관절 초음파에 의해 진단되는 중증도에 준할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "바이오마커(biomarker)"는 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하고, 바이오마커를 활용하면 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다. 암을 비롯해 뇌졸증, 치매 등 각종 난치병을 진단하는데 바이오마커가 활용되고 있으며, 본 발명에 있어서는 류마티스 관절염에서 활막염의 중증도를 진단하는데 이용될 수 있다. 또한, 신약개발과정에서 바이오마커를 활용할 수 있고, 이를 통해서 신약의 안전성을 확보할 수 있고 신약 개발 과정에서 소요되는 비용을 절감할 수 있는 효과도 얻을 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 활막염 중증도 진단용 키트에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 키트는 대상체 또는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 지질을 분리하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "활막염 진단용 키트"는 본 발명의 활막염 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "키트"는 "조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다. 본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에서 용어 "진단용 바이오 마커, 진단하기 위한 바이오 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 활막염 발병 여부를 정상 조직과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 조직에 비하여 류마티스 관절염에 의해 발생한 활막염이 발병한 활막 또는 활막액에서 발현이 증가 또는 감소하는 양상을 보이는 지질과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 활막염 진단 바이오 마커는 CAR 22:1, PC O-42:3 (2), LPC 16:1, LPC 10:0, LPC 22:6, LPC 18:2, LPC 20:3, LPC O-24:0, PC O-40:2, PC O-42:4, Cer-NS 42:2, PE P-36:1, LPC 16:0, PC O-42:3 (1) 및 PC O-40:8으로서, 류마티스 관절염에 의한 활막염에서 특이적으로 발현 정도가 변화하는 지질이다. 이러한 마커들은 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커인 것이 바람직하다.

일 측면에서, 본 발명은 (a) 검사 대상체로부터 분리한 생물학적 시료에서 아실 카르니틴, 리소포스파티딜콜린, 에테르-가교 LPC, 에테르-가교 PC, 세라마이드 스핑고신 및 에테르-가교 포스파티딜에탄올아민로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 활막염의 중증도를 판단하는 단계를 포함하는, 활막염 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 대상체의 시료에서 CAR 22:1, LPC 16:1, LPC 10:0, LPC 22:6, LPC 18:2, LPC 20:3 및 LPC 16:0의 농도가 대조군 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 하향 조절되고, PC O-42:3 (2), LPC O-24:0, PC O-40:2, PC O-42:4, Cer-NS 42:2, PE P-36:1, PC O-42:3 (1) 및 PC O-40:8의 농도가 대조군 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 상향 조절되면 대상체의 활막염은 경도인 것으로 판단할 수 있으며, 경도의 활막염은 활막염 점수가 0 내지 1(Synovitis score 0-1)인 것일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 대조군 대상체는 중고도의 활막염에 걸린 대상체일 수 있다.

일 구현예에서, 대상체의 시료에서 CAR 22:1, LPC 16:1, LPC 10:0, LPC 22:6, LPC 18:2, LPC 20:3 및 LPC 16:0의 농도가 대조군 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 하향 조절되고, PC O-42:3 (2), LPC O-24:0, PC O-40:2, PC O-42:4, Cer-NS 42:2, PE P-36:1, PC O-42:3 (1) 및 PC O-40:8의 농도가 대조군 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 상향 조절되면 대상체의 활막염은 중고도인 것으로 판단할 수 있으며, 중고도의 활막염은 활막염 점수가 2 내지 3(Synovitis score 2-3)인 것일 수 있다.

일 구현예에서, 대상체의 시료에서 CAR 22:1, LPC 16:1, LPC 10:0, LPC 22:6, LPC 18:2, LPC 20:3 및 LPC 16:0의 농도가 중고도의 활막염에 걸린 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 하향 조절되고, PC O-42:3 (2), LPC O-24:0, PC O-40:2, PC O-42:4, Cer-NS 42:2, PE P-36:1, PC O-42:3 (1) 및 PC O-40:8의 농도가 중고도의 활막염에 걸린 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 상향 조절되면 대상체의 활막염은 경도인 것일 수 있으며, 대상체의 시료에서 CAR 22:1, LPC 16:1, LPC 10:0, LPC 22:6, LPC 18:2, LPC 20:3 및 LPC 16:0의 농도가 정상인 대상체 또는 골관절염 환자의 시료에서의 발현 수준 대비 하향 조절되고, PC O-42:3 (2), LPC O-24:0, PC O-40:2, PC O-42:4, Cer-NS 42:2, PE P-36:1, PC O-42:3 (1) 및 PC O-40:8의 농도가 정상인 대상체 또는 골관절염 환자의 시료에서의 발현 수준 대비 상향 조절되면 대상체의 활막염은 중고도인 것일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 대조군 대상체는 정상인 대상체 또는 골관절염 환자일 수 있다.

일 구현예에서, 활막염 점수는 관절 초음파에 의해 진단되는 중증도 점수일 수 있다.

일 구현예에서, 활막염은 류마티스성 활막염, 즉, 류마티스 관절염 발병에 의한 활막염일 수 있다.

일 구현예에서, 생물학적 시료는 활막액일 수 있다.

일 구현예에서, 지질 바이오마커의 시료 내 발현 수준 (농도)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 지질을 측정하는 방법은 질량분석법(mass spectrometry), 질량 분광측정법에 대한 연성 이온화 기술, 예컨대 전기분무 이온화 (ESI) 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI)를 포함한 분광측정 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미하며, 측정하는 것" 또는 "측정"은 시료 내에서 주어진 물질의 정성적 또는 정성적 농도 수준의 도출을 포함하여, 이러한 물질의 존재, 부재, 수량 또는 양 (유효량일 수 있음)을 평가하는 것, 또는 달리 대상체의 임상 파라미터의 값 또는 카테고리화를 평가하는 것을 의미한다.

본 발명에서, 바이오마커의 수준을 결정하는 것은 전처리되지 않거나 또는 미분획된 시료 상에서 수행할 수 있으며, 대상체로부터 수득된 전처리하지 않거나 미분획된 시료 중에서의 지질 바이오마커의 수준을 결정할 수 있다.

본 발명에서, 바이오마커의 수준을 결정하는 것은 정량적 또는 반정량적일 수 있다. 일부 실시예에서, 정량적 결정은 하나 이상의 지질 대사물의 절대적 양 또는 농도 (발현 수준)를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 정량적 결정은 하나 이상의 다른 대사물을 기준으로 하여 하나 이상의 지질 대사물의 상대적 양 또는 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "대상체" 또는 "환자"는 인간, 유인원, 원숭이, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 아울러, 본 발명에서는 포유동물, 바람직하게는 인간을 지칭한다.

본 발명에서 용어, "생물학적 시료(샘플)"는 대상 또는 환자로부터 얻은 생물학적 시료를 의미하며, 진단 또는 모니터링 검정에 사용될 수 있는 유기체로부터 수득된 각종 시료 유형을 포괄한다. 상기 용어는 생물학적 기원의 혈액 및 기타 액상 시료, 고형 조직 시료, 예컨대 생검 표본, 또는 그로부터 및 그의 자손으로부터 유래된 조직 배양물 또는 세포를 포괄한다. 상기 용어는 구체적으로, 임상 시료를 포괄하고, 세포 배양 중인 세포, 세포 상등액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 뇨, 양수, 생물학적 유체 및 조직 시료를 추가로 포함한다. 상기 용어는 또한, 시약으로의 처리와 같은 조달, 가용화, 또는 특정 성분에 대한 강화 후 어떠한 방식으로든 조작된 시료를 포괄한다. 본 발명의 일 실시예에서는 활막액을 시료로 하였다.

생물학적 시료는 대상체의 체액 또는 신체 조직의 시료일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시료는 대상체로부터의 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 담즙, 뇨, 대변 또는 뇌척수액의 시료, 또는 대상체로부터의 세포, 조직 또는 기관으로부터 유래된 시료일 수 있다. 많은 실시예에서, 활막액을 생물학적 시료로서 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 생물학적 시료를 수득하기 위한 각종 기술이 이용 가능하다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 류마티스관절염 환자 활막액 수집 및 지질체 분석

UPLC-Q-ToF MS(ultra-performance liquid chromatography-to-quadrupole time-of-flight mass spectrometry)을 이용하여 류마티스관절염 (RA) 환자 71 명 및 골관절염 (OA) 환자 31 명의 활막액(synovial fluid, SF) (표 1)에서 지질체 분석을 수행하였다. 연구 참여자들은 CIRAD (Center for Integrative Rheumatoid Transcriptomics and Dynamics) 코호트에 등록되었으며 (2015 년), RA 환자는 2010 ACR / EULAR RA 분류 기준 (6)을 충족하는 것으로 정의되었다. 이 환자들은 2021년 3월까지 확실히 RA가 발생했는지 추적 관찰되었다. 활막액은 흡인되었을 때 수집되었고 원심분리한 뒤 상층액을 -80℃에서 보관하였다. 또한, SF의 WBC 수 (/μL) 및 초음파 검사로 측정한 활막염 점수는 SF 흡인시 결정되었다. 염증에 의한 지질체 프로파일 변화를 확인하기 위해, RA 환자의 활막액 (RA-SF)를 백혈구(WBC) 수 <3,000/μL인 군 (백혈구-부족 RA-SF) 및 백혈구(WBC) 수 ≥3,000/μL인 군 (백혈구-풍부 RA-SF)으로 나누어서도 분석하였다.

	Leukocyte-rich RA-SF (n = 55)	Leukocyte-poor RA-SF (n = 16)	OA-SF (n = 31)	p-value
Age, year	63 (48-70)	65 (61-71)	64 (56-71)	0.357
Female, n (%)	49 (87.5)	14 (82.4)	26 (83.9)	0.825
DM, n (%)	3 (5.4)	2 (11.8)	0	0.183
Hypertension, n (%)	15 (26.8)	3 (17.7)	5 (16.1)	0.460
Disease duration, year	1 (1-3)	1 (1-3.5)	-	0.924
RF positive, n (%)	41/52 (78.9)	13/17 (76.5)	-	0.837
ACPA positive, n (%)	36/44 (81.8)	11/12 (91.7)	-	0.410
Laboratory finding
ESR, mm/hour	25 (10-42)	9 (5-17)	-	0.003
CRP, mg/dL	1.1 (0.4-3.1)	0.1 (0.1-0.2)	-	<0.001
WBC counts, /μL	11,000(6,750-17,500)	500 (140-1,600)	-	<0.001

(ACPA: denotes anti-citrullinated protein antibody; CRP: C-reactive protein; ESR: erythrocyte sedimentation rate; DM: diabetes mellitus; OA-SF: synovial fluid of osteoarthritis patients; RA-SF: synovial fluid of rheumatoid arthritis patients; RF: rheumatoid factor; 및 WBC: white blood cell.)

그 결과, 13 개의 지질 서브 클래스에 해당하는 205 개의 활막액 지질체를 확인하였다.

실시예 2. 염증성 류마티스관절염 특이적 지질 바이오마커 중 활막염의 중증도에 특이적인 바이오마커 선발 및 검증

모든 지질 특징은 각 시료의 중앙 강도에 따라 정규화되었으며, FDR을 획득하기 위해 t-test를 수행하고 치료 전 후 군을 비교하기 위해, paired t-test를 이용하였다. 세 개 이상의 군을 비교하기 위해서 Tukey's HSD와 one-way ANOVA를 이용하여 유의한 차이를 식별하였다. heatmap, PCA 및 Random Forest 알고리즘을 이용한 종합 해석을 바탕으로 의심되는 이상치를 제외하였으며, R의 Hmisc package를 이용하여 상관 분석을 수행하고, rcorr 함수를 이용하여 Pearson's 상관 관계를 결정하였다. 또한, 바이오마커로서 활막액 지질체의 가용성을 추정하고 지질 발현에 따른 군 간의 차이를 시각화하기 위해, PCA(principal component analysis) 및 PLS-DA(partial least squares-discriminant analysis)를 수행하였다. PLS-DA 모델은 LOOCV(leave-one-out cross validation)을 이용하여 교차 검증하였고, Q2 값은 모텔의 overfitting 값을 추정하는데 사용되었다. 또한, 환자 군 간의 세부적인 차이를 더 확인하기 위해, OPLS-DA(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis) 분석을 수행하였다. 또한, 바이오마커 후보는 OPLS-DA 모델에서 |r| <0.5인 경우 및 t-검정에서 FDR 값이 <0.25인 경우 선발하였다. 다변량 탐색 ROC 분석은 MCCV(Monte-Carlo cross validation)로 수행하였으며, ROC 커브의 AUG는 Random Forests 알고리즘으로 계산되었다.

(CAR: carnitine; Cer: ceramide; CRP: C-reactive protein; DG: diacyl glycerol; ESR: erythrocyte sedimentation rate; LPC: lysophosphatidylcholine; LPC-O: ether-linked lysophosphatidylcholine; PC: phosphatidylcholine; PC-O: ether-linked phosphatidylcholine; PE: phosphatidylethanolamine; PE-P: ether-linked phosphatidylethanolamine; SM: sphingomyelin; SF: synovial fluid; TG: triacyl glycerol; 및 WBC: white blood cell counts)

그 결과, 상기 군 사이에 144 개의 활막액 지질이 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다 (백혈구-부족 RA-SF 및 OA-SF 간에 14개, 백혈구-풍부 RA-SF 및 백혈구-부족 RA-SF 간에 124개, 및 백혈구-풍부 RA-SF 및 OA-SF 간에 143개). 또한, 주요 지질 서브클래스인 LPC(lysophosphatidylcholine)가 현저히 감소한 반면, PC(phosphatidylcholine), EtherPC(ether-linked PC), TG(triacylglycerol) 및 SM(sphingomyelin)은 현저히 증가하는 것으로 나타났다 (도 1).

또한, 135개의 지질이 염증성 류마티스관절염 활막액과 골관절염을 구분하는 지질로 나타났고, 이 중 특정 지질이 초음파 검사로 결정된 활막염 중증도를 가장 잘 나타내는지, 즉, 조직학적 활막염을 정확하게 반영하는지 확인하기 위해, 실험적 매개 변수와 초음파(sonographic) 매개 변수를 지질체 프로파일과 상관관계 분석을 통해 비교한 결과, 염증성 류마티스관절염 활막액과 골관절염을 구분하는 135개의 활막액 지질 중 83개가 경증의 활막염 (Synovitis score 0-1)과 중증의 활막염 (Synovitis score 2-3)을 나타내는 하위 그룹간에 유의하게 다른 것으로 나타났다 (도 2). 또한, 이들은 혈액 ESR, CRP 수준 및 활막염(synovitis) 점수와 잘 연관되어 있는 것으로 나타났고 (상관 계수 (|r|) >0.3), 특히, 활막액 LPC 16:0 및 LPE는 ESR, CRP 수준, 활막액 내 WBC 및 활막염 점수와 음의 상관관계를 나타냈으며, EtherPC 및 Ether PE를 포함한 ether-linked phospholipids 및 TG는 활막염 점수 및 ESR과 양의 상관관계를 나타냈다. SM은 활막염 점수와 양의 상관관계를 나타냈다 (표 2 내지 5 및 도 3).

Lipid biomarker for	Sample	Method of identification	Lipid biomarkers	AUC
Synovitis score 2 or 3 (vs. synovitis score 0 or 1)	Synovial fluid	t-test plus MCCV	CAR 22:1, PC O-42:3 (2), LPC 16:1, LPC 10:0, LPC 22:6, LPC 18:2, LPC 20:3, LPC O-24:0, PC O-40:2, PC O-42:4, Cer-NS 42:2, PE P-36:1, LPC 16:0, PC O-42:3 (1), PC O-40:8	0.643

아울러, 상기 활막염의 중증도 (Synovitis score 0-1 및 Synovitis score 2-3)을 구분할 수 있는 67개의 지질들 중 바이오마커를 발굴하기 위하여 MCCV(multivariate exploratory ROC analysis by Monte-Carlo cross validation)를 시행한 결과, 50개의 지질이 중고도의 활막염 (Synovitis score 2-3)과 경도의 활막염 (Synovitis 0-1)을 가장 유의미하게 구별할 수 있는 것을 확인하였다 (도 4). 이 중, 임상적인 활용도를 고려하여 가장 유의한 예측 정확도를 보이는 15개의 지질 CAR 22:1, PC O-42:3 (2), LPC 16:1, LPC 10:0, LPC 22:6, LPC 18:2, LPC 20:3, LPC O-24:0, PC O-40:2, PC O-42:4, Cer-NS 42:2, PE P-36:1, LPC 16:0, PC O-42:3 (1) 및 PC O-40:8)을 류마티스관절염의 활막염 중증도를 구분하는 활막액의 지질 바이오마커로 선정하였다 (표 6).

이를 통해, 활막액 내 지질체가 RA 관절에서 현저하게 달라지고, 이 지질들이 활막염의 병리학적 중증도뿐만 아니라 국소 및 전신적 염증 활동도 반영하는 것을 알 수 있다.

Claims (11)

1. 아실 카르니틴(acyl carnitine, CAR), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC), 에테르-가교 LPC(ether-linked LPC, LPC O), 에테르-가교 PC(ether-linked phosphatidylcholine, PC O), 세라마이드 스핑고신(Ceramide sphingosine, Cer-NS) 및 에테르-가교 포스파티딜에탄올아민(ether-linked phosphatidylethanolamine, PE P)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는, 류마티스성 활막염(synovitis) 중증도 진단용 바이오 마커 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 아실 카르니틴은 22:1이고, 리소포스파티딜콜린은 16:1, 10:0, 22:6, 18:2, 20:3 또는 16:0이며, 에테르-가교 LPC는 24:0이고, 에테르-가교 PC는 40:2, 40:8, 42:3 (1), 42:3 (2) 또는 42:4이며, 세라마이드 스핑고신은 42:2이고, 에테르-가교 포스파티딜에탄올아민은 36:1인, 류마티스성 활막염 중증도 진단용 바이오 마커 조성물.
3. 삭제
4. 제 1항의 조성물을 포함하는, 류마티스성 활막염 중증도 진단용 키트.
5. (a) 검사 대상체로부터 분리한 생물학적 시료에서 아실 카르니틴, 리소포스파티딜콜린, 에테르-가교 LPC, 에테르-가교 PC, 세라마이드 스핑고신 및 에테르-가교 포스파티딜에탄올아민로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   (b) 활막염의 중증도를 판단하는 단계를 포함하는, 류마티스성 활막염 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 대상체의 시료에서 CAR 22:1, LPC 16:1, LPC 10:0, LPC 22:6, LPC 18:2, LPC 20:3 및 LPC 16:0의 농도가 대조군 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 하향 조절되고, PC O-42:3 (2), LPC O-24:0, PC O-40:2, PC O-42:4, Cer-NS 42:2, PE P-36:1, PC O-42:3 (1) 및 PC O-40:8의 농도가 대조군 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 상향 조절되면 대상체의 활막염 중증도가 경도인 것으로 판단하는, 류마티스성 활막염 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 경도의 활막염은 활막염 점수가 0 내지 1(Synovitis score 0-1)인 것인, 류마티스성 활막염 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
8. 제 5항에 있어서, 대상체의 시료에서 CAR 22:1, LPC 16:1, LPC 10:0, LPC 22:6, LPC 18:2, LPC 20:3 및 LPC 16:0의 농도가 대조군 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 하향 조절되고, PC O-42:3 (2), LPC O-24:0, PC O-40:2, PC O-42:4, Cer-NS 42:2, PE P-36:1, PC O-42:3 (1) 및 PC O-40:8의 농도가 대조군 대상체의 시료에서의 발현 수준 대비 상향 조절되면 대상체의 활막염 중증도가 중고도인 것으로 판단하는, 류마티스성 활막염 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 중고도의 활막염은 활막염 점수가 2 내지 3(Synovitis score 2-3)인 것인, 류마티스성 활막염 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
10. 삭제
11. 제 5항에 있어서, 생물학적 시료는 활막액인, 류마티스성 활막염 중증도 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.

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