KR102533314B1 - 죽종 형성 치료를 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

포유동물에게 TMAO 생성 제제를 투여함에 의해 죽상동맥경화증을 치료 또는 예방하는 방법이 기재되어 있다. 약제학적 유효량의 TMAO 생성 제제의 투여는 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시킨다. 증가된 트리메틸아민 N-옥사이드 수준은 죽종(athero) 병변을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

Description

죽종 형성 치료를 위한 시스템 및 방법

관련 출원

본 출원은 2015년 2월 6일에 출원된 미국 가특허 출원 연속 62/112,945를 기초로 하고, 이에 대한 우선권을 주장하고, 이는 본원에 참조로서 포함된다.

심장 및 심혈관 질환은 지속적으로 남성 및 여성 둘 다에 대해 사망의 주요 원인이 되었다. 하나의 심혈관 질환은 죽상동맥경화증이다. 죽상동맥경화증은 동맥 벽에서 지질 및 다른 혈액 유도체의 침착 또는 플라크로 특성규명된다. 질환으로 인해, 동맥 벽은 주로 지방 충혈(engorged) 백혈구의 축적으로 인해 두꺼워질 수 있다. 죽상동맥경화증은 통상적으로 동맥의 경화와 연관된다. 질환은 체내 모든 동맥, 및 특히 대동맥 및 관상동맥에서 발병할 수 있다.

죽상경화 플라크는 거대 동맥, 예를 들면, 대동맥의 내피를 기반으로 하는 지방 선조로서 시작한다. 지방 선조는 살아있는 세포 및 사멸 세포 둘 다를 포함할 수 있고, 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 포함한다. 다른 시간, 지방 선조 또는 플라크는 석회화되어 칼슘 및 다른 결정화된 물질로 변할 수 있다. 플라크의, 특히 석회화된 형태로의 발달은, 동맥 벽의 탄성을 감소시킬 수 있다. 벽 강직은 결국 혈액 압력을 증가시키고 궁극적으로 혈액 흐름을 감소시킬 수 있다. 플라크가 파열되면, 혈관 폐쇄, 허혈 및 심장 사건을 야기할 수 있다.

죽상동맥경화증의 원인은 완전히 공지되지 않았다. 염증 및 혈액 중 특정 콜레스테롤의 고 수준은 죽상동맥경화증을 야기할 수 있다는 것으로 고려된다. 특히, 콜레스테롤 중심 둘레에 지질단백질의 외부 테(outer rim)로 이루어진 미세 입자인, 저 밀도 지질단백질(LDL)) 콜레스테롤 입자의 높은 혈액 수준은, 죽상동맥경화증이 진행할 가능성을 증가시킨다. 내피 세포 층 기능이 위태롭게 되는 경우 LDL 입자는 동맥의 벽에 침착되는 것으로 고려된다. LDL 입자는 또한 내피 세포를 혈관의 내층을 통해 가로지르고, 염증 인자의 효과하에, LDL은 ox-LDL로 산화될 수 있다. 산화된 형태가 나타난 경우, 더 많은 백혈구가 구역으로 이동하고 동맥 벽 내로 침투한다. 이어서, 이들 백혈구는 마크로파지로 변형될 수 있다.

마크로파지의 형성은 체내 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 더 많은 백혈구가 상기 구역으로 모여들고, 거품 세포를 형성하는 산화된 LDL 입자를 흡수한다. 추가로 거품 세포가 형성되면, 동맥은 수축될 수 있다. 경우에 따라, 거품 세포는 사멸되어 지방 지방 선조 및 플라크를 형성한다. 이들은 결국 파열되어 허혈 및 심장 사건을 야기할 수 있다.

이전에, 다양한 상이한 방법은 죽상동맥경화증 및 죽상동맥경화증과 관련되거나 죽상동맥경화증에 의해 매개된 의학적 상태를 치료 및 예방하기 위해 제안되었다. 예를 들어, 죽상동맥경화증을 예방하는 통상의 방법은 개인의 식이 변화이다. 당해 기술 분야의 숙련가는 LDL-형성 콜레스테롤이 낮은 식이를 제안하였다.

개인의 식이를 변경하는 것 이외에, 다양한 다른 약제학적 제품이 제안되었다. 이들 제품 대부분은 LDL 및 콜레스테롤을 저하시키는 것을 목표로 한다. 예를 들어, 스타틴은 환자에게 LDL 콜레스테롤을 저하시키기 위해 투여되었다. 피브레이트로서 공지된 또다른 그룹의 약물은 트리글리세라이드 수준을 감소시키는데 사용된다. 다른 제안된 약물은 니아신, 제티아, 담즙산 격리제 및 식물 스테롤을 포함한다. 이들 약물 대부분은 혈액 중 콜레스테롤 수준을 낮추는 것을 지시한다.

CETP(콜레스테릴 에스테르 운반 단백질)는 HDL(고 밀도 지질단백질) 또는 "양호한(good) 콜레스테롤"을 종죽형성유발(pro-atherogenic) LDL로 변형시키는 효소이다. 이러한 효소는 또한 신규한 약물 개발을 위한 표적이 되어왔다. 이의 억제는 더 높은 HDL 수준 및 더 낮은 LDL 수준을 야기한다.

그러나, 죽상동맥경화증은 여전히 계속하여 유의하게 건강을 위협한다. 따라서, 죽상동맥경화증 질환 진행을 치료 및 예방 또는 서행을 위한 더 우수하고 더 신뢰성이 있는 수단의 필요성이 인지된다. 특히, 죽종 병변 형성의 치료, 감소, 예방 및/또는 억제에서 콜레스테롤의 감소 이외의 상이한 메카니즘을 갖는 신규한 약제학적 제품의 필요성이 존재한다.

국제공개공보 WO 2007/111992 A2 (2007.10.4.)

Aouatef Bellamine 외, "TMAO an L-carnitine metabolite does not affect foam cell formation or cholesterol efflux in J774 mouse macrophage (249.6)", THE FASEB JOURNAL, vol. 28, no. 1, Suppl. (2014.4.1.)

요지

일반적으로, 본 발명의 개시는 죽상동맥경화증의 치료 방법을 지시한다. 본 발명의 개시는 또한 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 시스템 또는 키트를 지시한다. 본 발명의 개시의 방법, 시스템 또는 키트는 또한 죽상동맥경화증에 관련되거나 죽상동맥경화증에 의해 매개된 다른 장애 또는 죽상동맥경화증의 발병 위험을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명의 개시는 죽상동맥경화증 또는 관련 질환의 결과로서 발병할 수 있는 죽종 병변의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 포유동물, 및 특히 사람 환자에게, TMAO 생성 제제(producing agent)를 투여하는 단계를 포함한다. TMAO 생성 제제는 TMAO를 포함하거나 섭취되거나 주사되는 경우 트리메틸아민 및/또는 트리메틸아민 N-옥사이드로 이어서 TMAO로 화학적으로 전환되는 화합물을 포함한다. TMAO 생성 제제는 포유동물에게 포유동물의 혈액 중 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시키는데 충분한 약제학적 유효량으로 투여된다. 잠재적 TMAO-유사 분자는 또한 직접적으로 섭취되거나 주사될 수 있고, 유사한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 발명자는 체내 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시키는 것이 죽종 병변의 발현을 유의하게 극적으로 감소시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명의 개시에 따라서, TMAO 생성 제제는 D-카르니틴 또는 L-카르니틴을 포함할 수 있다. 대안적인 양태에서, TMAO 생성 제제는 콜린을 포함할 수 있다. 또한 또다른 양태에서, TMAO 생성 제제는 베타인을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 베타인은 베타인 염, 베타인의 카복실산 유도체, 및/또는 베타인/아미노산을 포함한다. 또한 또다른 양태에서, TMAO 생성 제제는 TMAO 생성 제제의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 카르니틴, 콜린, 및 베타인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 TMAO 생성 제제의 혼합물을 포함할 수 있다.

하나의 양태에서, TMAO 생성 제제를 포유동물에게 투여하는 동안, 트리메틸아민 N-옥사이드의 수준은 포유동물의 혈액에서 모니터링된다. 모니터링된 수준을 기초로 하여, 포유동물에게 투여된 TMAO 생성 제제의 양을 증가시킬 수 있다. 단지 예시적인 목적을 위해, 하나의 양태에서 TMAO 생성 제제는, 포유동물 종 및 개별적인 환자에 좌우되어, 혈액 중 TMAO 수준이 약 0.1 ppm 초과, 예를 들면, 약 0.12 ppm 초과, 예를 들면, 약 0.15 ppm 초과가 되도록, 포유동물에게 투여될 수 있다.

TMAO 생성 제제의 용량은 치료될 포유동물 및 환자의 상태를 포함하는 다양한 인자에 좌우되어 가변적일 수 있다. 하나의 양태에서, 각 용량은 약 150 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 200 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 250 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 300 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 350 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 400 mg/kg 초과의 TMAO 생성 제제일 수 있다. 또다른 양태에서, 비교적 소량의 TMAO 생성 제제를 포유동물에게 투여한다. 예를 들어, 각 용량은 7 내지 150 mg/kg, 예를 들면, 40 내지 150 mg/kg, 예를 들면, 약 50 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 70 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 100 mg/kg 초과의 TMAO 생성 제제일 수 있다. 용량은 일반적으로 약 1,000 mg/kg 미만, 예를 들면, 약 900 mg/kg 미만, 예를 들면, 약 800 mg/kg 미만, 예를 들면, 약 700 mg/kg 미만, 예를 들면, 약 600 mg/kg 미만의 TMAO 생성 제제이다. 환자는 연장된 시간 기간에 걸쳐서 주기적으로 화합물의 개발 동안 효능을 나타내는 용량으로 공급받을 수 있다. 하나의 양태에서, 포유동물은 매일 1 내지 2회 용량으로 투여될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명의 개시에 따라 치료되는 포유동물 또는 환자는 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증에 관련되거나 죽상동맥경화증에 의해 매개된 장애에 걸리거나 또는 발병 위험이 있는 환자이다. 예를 들어, 환자는 말초혈관 질환을 가질 수 있다.

본 발명의 개시는 또한 죽상동맥경화증의 치료 또는 예방을 위한 시스템 또는 키트를 지시한다. 시스템 또는 키트는 TMAO 생성 제제를 포유동물 또는 환자로부터 수집된 혈액 샘플 중 트리메틸아민 N-옥사이드 수준의 모니터링을 용이하게 하는 물품과 함께 포함한다. 물품은, 예를 들어, 혈액 중 트리메틸아민 N-옥사이드의 수준을 측정하거나 해석하기 위한 교육 및/또는 정보 자료를 포함할 수 있다. 물품은, 예를 들어, 환자로부터의 혈액 샘플의 수집을 용이하게 하는 임의의 장치를 포함할 수 있다. 또한 또다른 양태에서, 물품은 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 측정하기 위한 검정 장치를 포함할 수 있다.

본 발명의 개시는 또한 혈장 샘플 중 분석물 수준의 측정 방법을 지시하고, 여기서, 분석물은 TMAO, TMAO 전구체, 또는 TMAO 유사체이다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

공지되었지만 가변 농도의 비표지된 분석물 및 공지되고 고정된 농도의 동위원소-표지된 분석물을 포함하는 적어도 2개의 작업용 표준 혼합물을 제조하는 단계;

상기 작업용 표준 혼합물을 고성능 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법(LC-MS)을 다중반응모니터링(MRM)과 함께 사용하여 분석하는 단계;

비-표지된 분석물의 반응 분석의 동위원소-표지된 분석물과의 비교를 기초로 하여, 비-표지된 분석물의 농도를 지시하기 위한 참조 또는 상관관계를 창출하는 단계;

혈장 샘플, 물, 및 공지되고 고정된 농도의 동위원소-표지된 분석물을 포함하는 적어도 하나의 혈장 샘플 용액을 제조하는 단계;

혈장 블랭크, 공지된 가변 농도의 비표지된 분석물, 및 공지되고 고정된 농도의 동위원소-표지된 분석물을 포함하는 적어도 하나의 스파이크된 혈장 샘플을 제조하는 단계;

상기 혈장 용액을 다중반응모니터링과 함께 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 사용하여 분석하는 단계; 및

혈장 샘플 중 비-표지된 분석물의 동위원소-표지된 분석물에 대한 반응을 상기 참조와 비교하여 상기 혈장 샘플 용액 중 상기 분석물의 농도를 측정하는 단계.

예를 들어, 하나의 양태에서, 혈장 샘플 용액 중 분석물의 농도 측정시 사용하기 위한 2개 이상의 작업용 표준 혼합물을 사용하여 표준 곡선을 창출할 수 있다. 또다른 양태에서, 스파이크된 혈장 샘플을 각각의 상응하는 작업용 표준에 대해 제조한다.

본 발명의 개시의 다른 특징 및 측면이 하기 보다 상세하게 논의된다.

본 발명의 완전하고 가능한 개시는 보다 특히 동반한 도면에 대한 참조를 포함하는 명세서에 나머지에서 열거되고, 여기서:
도 1은 하기 실시예와 함께 사용하기 위한 대동맥 기부 및 엔-페이스(en-face) 대동맥의 위치를 예시하는 다이어그램이고;
도 2 내지 7은 하기 실시예에서 수득된 결과의 그래프 도시이고;
도 8은 하기 실시예와 함께 사용하기 위한 죽상동맥경화증 진행의 기를 나타내는 다이어그램이다.

정의

본원에 사용된 바와 같이, 죽상동맥경화증은 동맥 벽 내의 죽종 플라크의 증강에 의해 야기되는 동맥의 경화 및/또는 협소화에 의해 특성규명되는 상태를 언급한다. 죽종 플라크는 3가지 성분으로 나누어진다: (1) 죽종, 동맥의 루멘과 가장 가까운 마크로파지로 구성된 거대 플라크의 중심에서 부드러운 얇게 벗겨지는(flaky) 물질의 결절 축적; (2) 콜레스테롤 결정의 기저 구역; (3) 더 진전된 병변의 외부 기저에서 석회화. 죽상동맥경화증의 지시자는, 예를 들면, 동맥에서 플라크의 발달, 이들의 석회화, Sudan IV 염색으로 측정될 수 있는 범위, 또는 동맥에서 거품 세포의 발달을 포함한다. 동맥의 협소화는 관상동맥 혈관형성술, 초고속 CT, 또는 초음파로 측정할 수 있다. 죽상동맥경화증 질환을 진단하기 위해 죽상동맥경화증 질환 바이오마커를 LDL-c, HDL-c CRP 및 기타와 같은 지시자로서 물색할 수 있다.

약제학적 유효량 또는 치료적 유효량은 특정 상태 또는 장애 또는 상기 상태 또는 장애의 특정 증상을 치료, 약화, 개선, 제거, 또는 예방하는 화합물의 양을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, TMAO 생성 제제는 TMAO 자체, TMAO 유사체, TMAO 전구체, TMAO 유사체, TMAO-유사 분자, TMA 및 소화관 내의 박테리아 단독에 의해 또는 효소, 예를 들면, 간 효소과 함께 트리메틸아민으로 및/또는 트리메틸아민 N-옥사이드로 전환될 수 있는 임의의 화합물을 언급한다.

본원에 사용된 바와 같이, 카르니틴, 콜린, 또는 베타인은 이의 유도체 및 염을 포함한다. 예를 들어, 카르니틴은 D-카르니틴 및/또는 L-카르니틴 및 변형을 포함하고, 여기에는 예를 들면, L-카르니틴 염기, L-카르니틴 HCL, L-카르니틴 L-타르트레이트, L-카르니틴 푸마레이트, 프로프리니알(proprinial) L-카르니틴, GPLC 글리신 프로프리네일(proprinale) L-카르니틴, 다른 카르니틴 유도체 등이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같이, 포유동물은 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증-타입 질환 또는 질병을 경험할 수 있는 임의의 포유동물을 포함하고, 개, 고양이, 말, 양, 사람, 돼지 및 다른 포유동물을 포함한다.

상세한 설명

당해 기술 분야의 일반적 숙련가는 본 발명의 논의가 단지 예시적인 양태의 기술이고, 본 발명의 개시의 광범위한 측면을 제한하려는 의도는 아니라는 것을 이해하여야 한다.

일반적으로, 본 발명의 개시는 죽상동맥경화증의 치료 또는 예방 방법을 지시한다. 본 발명의 개시는 또한 죽상동맥경화증에 의해 매개되거나 죽상동맥경화증과 관련된 장애를 치료 또는 예방하기 위해 지시된다. 하나의 양태에서, 본 발명에 개시된 방법은 죽상동맥경화증으로부터 야기될 수 있는 죽종 병변을 치료하기 위해 지시된다.

본 발명의 개시에 따라서 죽상동맥경화증을 치료 또는 예방하기 위해 및/또는 죽종 병변을 예방하기 위해, TMAO 생성 제제는 포유동물의 혈액 중 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시키는 약제학적 유효량으로 포유동물에게 투여된다. TMAO 생성 제제는 트리메틸아민 N-옥사이드를 포함하거나 체내에서 트리메틸아민 N-옥사이드로 화학적으로 전환되는 화합물이다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 소화 박테리아의 존재로 인해 소화관에서 티메틸아민을 생성시키는 TMAO 생성 제제가 사용된다. 이어서, 티메틸아민은 혈액 내로 흡수되고, 간에서 트리메틸아민 N-옥사이드로 전환된다. 예를 들어, 간에서, 트리메틸아민은 트리메틸아민 N-옥사이드를 생성하는 하나 이상의 효소와 접촉할 수 있다. 효소는, 예를 들어, 플라빈 함유 모노-옥시게나제(FMO)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 다수의 효소 중 하나인, FMO3은, 사람의 간의 소포체에 위치한 간 효소이다.

다양한 상이한 TMAO 생성 제제가 본 발명의 개시에 따라서 사용될 수 있다. 예를 들어, TMAO 생성 제제는 체내 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시킬수 있는 임의의 적합한 화합물을 포함할 수 있다. TMAO 생성 제제의 특정 예는 카르니틴, 베타인, 및/또는 콜린을 포함한다. 하나의 양태에서, 적어도 2개의 TMAO 생성 제제의 혼합물이 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 카르니틴의 예는 L-카르니틴 및/또는 D-카르니틴을 포함한다. L-카르니틴은 리신 및 메티오닌으로부터 생합성될 수 있는 4급 아민이다. L-카르니틴은 미토콘드리아 막을 통한 이동을 용이하게 하여 장쇄 지방산의 베타-산화를 촉진하는 것으로 공지되어 있다. 반면, D-카르니틴은, 동일한 산화 효과를 갖는 것이 공지되어 있지 않다. 그러나, 카르니틴 둘 다는, 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시킬 수 있는 것으로 고려되고, 이에 따라, 카르니틴 둘 다가 본 발명의 개시에 따라서 사용될 수 있다.

이전에, L-카르니틴은 지질-저하제로서 사용하기 위해 다른 화합물과 함께 영양 보충물로서 사용되었다. 예를 들어, 본원에 참조로서 포함된 PCT 공보 WO03/009854는, 카르니틴 및 피토스테롤을 포함하는 지질-저하 조성물을 지시한다. 그러나, 본 발명의 개시에서 사용된 카르니틴은 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시키는데 사용되고, 이에 따라, 상기 공보에 기재된 것과는 상이한 메카니즘하에 작동된다.

카르니틴에 추가하여, TMAO 생성 제제는 또한 베타인을 포함할 수 있다. 베타인은 베타인 염, 베타인의 카복실산 유도체, 및/또는 베타인/아미노산 복합체 또는 화합물을 포함할 수 있다. 포유동물에 의한 소모에 안전하고 포유동물에서 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시키는 임의의 적합한 베타인이 사용될 수 있다. 본 발명의 개시에 따라서 사용될 수 있는 베타인의 예는 트리메틸글리신(표준 베타인), 베타인 하이드로클로라이드, 베타인 디하이드로겐시트레이트(베타인 시트레이트), 베타인 모노하이드레이트, 베타인 나트륨 아스파르테이트, 베타인-글리코시아민, 감마-부티로베타인, 프롤린-베타인, 베타인 글루타메이트, 코카미딜프로필 베타인, 또는 이의 혼합물을 포함한다.

본 발명에 개시된 또다른 양태에서, TMAO 생성 제제는 콜린 화합물을 포함한다. 일반적으로, 포유동물에 의해 소모하기 위해 안전하고 포유동물에서 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시킬 수 있는 임의의 적합한 콜린 화합물이 사용될 수 있다.

도 7은 5기를 통한 죽상동맥경화증의 진행을 나타낸다. I기는 죽상경화 플라크가 없는 정상 동맥을 나타내지만, II기는 조기 죽종을 나타내고, 여기서, 부드러운 얇게 벗겨지는 물질은 동맥의 루멘과 가장 가까운 지질-충혈된 마크로파지로 구성된 거대 플라크의 중심에서 결절 축적을 형성한다. 이러한 기에서, 플라크는 지질-풍부 코어를 갖는다. 이러한 조기 죽종은 '안정화된' 플라크를 발달시킬 수 있는 반면, 더 작은 지질 풀, 두꺼운 섬유상 캡, 및 보존된 루멘을 갖고, 죽종은 또한 '취약한 플라크' 내로 발달시킬 수 있다. III기가 '취약한 플라크'로 나타남에 따라, 지질-풍부 코어는 계속 성장하고, 염증 세포를 축적하고, 세포외 매트릭스는 분해되기 시작하고, 얇은 섬유상 캡의 형성을 야기한다. 이러한 얇은 섬유상 캡이 방해되면, 플라크는 IV기에 나타난 바와 같이 파열되고, 혈액 내로 혈전형성 물질을 방출할 수 있다. 이러한 파열은 잠재적으로 혈전 형성을 야기할 수 있고, 혈관의 연장된 폐쇄를 통해 급성 심근경색을 야기할 수 있다. V기에서, 이러한 파열 후, 부상 회복 반응을 일으키고, 섬유상 맥관내막 및 협소한 루멘을 야기할 수 있다.

TMAO 생성 제제의 사용을 통한 포유동물에서 트리메틸아민 N-옥사이드 수준의 증가에 의해, 죽상동맥경화증 및 다른 관련 질환은 치료 및/또는 예방될 수 있다. 트리메틸아민 N-옥사이드 수준의 증가는 죽종 병변 및 특히 대동맥 병변을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 공지되지 않았지만, 트리메틸아민 N-옥사이드는 죽상동맥경화증 발달에 대해 보호 효과를 갖는 것으로 나타난다. 병변이 발병되기 시작하는 때에, 체내 증가된 수준의 트리메틸아민 N-옥사이드가 보상 메카니즘으로서 작용하는 것으로 나타난다. TMAO 생성 제제의 증가된 소모는 대동맥 조직의 지질 함량 및 혈장 수준에 유의한 영향을 주지 않고 거품 세포 형성에 유의한 영향을 주지 않는 것으로 고려된다. 결과적으로, 공지되지 않았지만, 트리메틸아민 N-옥사이드의 증가된 수준의 결과로서 병변의 감소는 죽상동맥경화증 발달에서 후기(later stage)에 일어나는 것으로 고려된다. 예를 들어, 증가된 트리메틸아민 N-옥사이드 수준은 병변의 회귀에서 제제로서 역할을 할 수 있다.

이러한 발견은 체내 트리메틸아민 N-옥사이드의 존재에 관하여 흔히 있는 오해인 것으로 고려된다는 점에서 특히 놀랍다. 예를 들어, 죽상동맥경화증의 치료 또는 예방 대신에, 당해 기술 분야의 숙련가는 트리메틸아민 N-옥사이드가 실제로 죽상동맥경화증을 발달시킨다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 베넷(Bennett) 등에 의한 "Trimethylamine-N-Oxide, A Metabolite Associated With Atherosclerosis, Exhibits Complex Genetic and Dietary Regulation"라는 제목의 논문은 트리메틸아민 N-옥사이드는 죽상동맥경화증과 강력하게 관련된 대사 물질로서 확인된다는 것을 기재한다. 논문에 따라서, 트리메틸아민 N-옥사이드는, 마크로파지 내에 콜레스테롤 축적을 촉진하여, 아마도 마크로파지에 의한 변형된 지질단백질의 섭취와 관련된 스캐빈저 수용체를 유도하고 거품 세포 형성에 기여하여, 죽상동맥경화증의 발달에 부분적으로 기여하는 것으로 나타난다. 다른 연구에서 또한 이러한 연관성에 기초하여 트리메틸아민 N-옥사이드가 심장 질환의 발달을 촉진하는 것으로 결론내렸다. 따라서, 죽상동맥경화증을 치료 또는 예방하기 위한 환자에게 TMAO 생성 제제의 투여는 예상치 못한 놀라운 발견이다.

본 발명의 개시에 따라서, TMAO 생성 제제는 임의의 포유동물에게 임의의 적합한 형태로 임의의 적합한 투여 경로를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들면, TMAO 생성 제제는 경구 단독으로 또는 식품 조성물과 조합하여 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, TMAO 생성 제제는 식이 보충물, 식품, 음료, 기능식품 조성물의 일부, 또는 약제로서 존재할 수 있다.

TMAO 생성 제제는 임의의 포유동물에게 죽상동맥경화증 또는 관련 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다. TMAO 생성 제제는 또한 죽상동맥경화증 또는 죽상동맥경화증에 관련된 임의의 장애를 이미 앓고 있는 포유동물에게 투여될 수 있다. 특히, TMAO 생성 제제는 죽종 병변 형성이 진행되었거나 죽종 병변 형성을 경험할 수 있는 임의의 포유동물에게 투여될 수 있다. 본 발명에 개시된 방법은 관상동맥 장애, 혈관 장애, 동맥류, 동맥 질환 등을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 개시에 따라서 치료된 환자는 상기 방법으로 이점을 얻을 수 있는 임의의 포유동물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포유동물은 개, 고양이, 또는 말일 수 있다. 환자는 또한 소 또는 돼지일 수 있다. 하나의 양태에서, 환자는 사람이다.

본 발명의 개시에 따라서 포유동물에게 투여된 TMAO 생성 제제의 양은 상이한 인자 및 환경에 좌우되어 가변적일 수 있다. 예를 들어, 양은 환자의 식이 및 대사, 환자의 연령, 환자가 혈관 질환 또는 죽상동맥경화증 등을 현재 앓고 있는지 여부 등에 좌우될 수 있다. 하나의 양태에서, TMAO 생성 제제는 포유동물에게 약 40 mg/kg(1kg 체중당 mg TMAO 생성 제제) 내지 약 1,000 mg/kg의 용량으로 투여된다. 예를 들어, TMAO 생성 제제는 포유동물에게 약 40 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 50 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 60 mg/kg 초과의 용량으로 투여될 수 있다. 다수의 환자에 대해, 더 많은 양은 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 목적하는 수준으로 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 하나의 양태에서, TMAO 생성 제제는 포유동물에게 약 150 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 170 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 200 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 220 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 250 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 300 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 350 mg/kg 초과, 예를 들면, 약 400 mg/kg 초과의 용량으로 투여된다. 일반적으로, TMAO 생성 제제는 약 1,000 mg/kg 미만, 예를 들면, 약 900 mg/kg 미만, 예를 들면, 약 800 mg/kg 미만의 양으로 투여된다.

TMAO 생성 제제는 포유동물에게 주기적인 간격으로, 예를 들면, 일일 1회 또는 2회 투여될 수 있다. 다른 양태에서, TMAO 생성 제제는 포유동물에게 적어도 1 내지 3일에, 예를 들면, 주당 적어도 2 내지 4회 투여될 수 있다. 하나의 특정한 양태에서, TMAO 생성 제제는 환자에게 매일 투여된다. 예를 들어, TMAO 생성 제제가 일일 1회 초과로 투여되는 경우에도, 상기 용량은 1일당 용량을 언급할 수 있다.

하나의 양태에서, 트리메틸아민 N-옥사이드 수준은 TMAO 생성 제제의 주기적인 투여 동안 모니터링된다. 이러한 방식으로, 포유동물에게 투여되는 TMAO 생성 제제의 양은 혈액 중 목적하는 트리메틸아민 N-옥사이드 수준으로의 도달을 기준으로 하여 조정될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, TMAO 생성 제제는 포유동물에게 보충물로서 및/또는 식품 소비과 함께 투여될 수 있다. 하나의 양태에서, TMAO 생성 제제는 포유동물에게 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체는 체내 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시키는 TMAO 생성 제제의 능력을 방해하지 않는 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 담체는 용매, 분산 매질, 코팅 등을 포함할 수 있다. TMAO 생성 제제와 제형화될 수 있는 특정한 물질은 물, 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 등을 포함한다. TMAO 생성 제제와 제형화될 수 있는 다른 성분은 생분해성 중합체, 예를 들면, 락타이드 등을 포함한다.

일반적으로, TMAO 생성 제제는 포유동물에게 경구로 투여된다. 일반적으로, 그러나, TMAO 생성 제제는 포유동물에게 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 증가시킬 수 있는 임의의 적합한 형태로 투여될 수 있다. 예를 들면, TMAO 생성 제제는 또한 다른 경로, 예를 들면, 비내, 위내, 주사 등으로 투여될 수 있다.

하나의 양태에서, TMAO 생성 제제는 키트 또는 시스템의 형태로 환자 또는 간병인에게 제공된다. 예를 들어, TMAO 생성 제제는 포유동물로부터 수집된 혈액 샘플 중 트리메틸아민 N-옥사이드 수준의 모니터링을 용이하게 하는 물품과 함께 제공될 수 있다. 물품은, 예를 들어, 혈액 중 트리메틸아민 N-옥사이드 수준을 측정 또는 해석하는데 사용되는 정보 또는 교육 자료를 포함할 수 있다. 물품은 또한 혈액 수집 장치를 포함할 수 있다. 또한 또다른 양태에서, 물품은 트리메틸아민 N-옥사이드 검정 장치를 포함할 수 있다.

본 발명의 개시는 하기 실시예를 참조하여 보다 잘 이해할 수 있다.

실시예

다음 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공된다. 본 발명의 다른 변형은 당해 기술 분야의 일반적 숙련가에게 용이하게 명백할 것이고, 첨부된 청구범위에 포함된다.

실시예 1

L-카르니틴 및 FMAO 억제제 메티마졸의 치료 효과를 죽상동맥경화증의 마우스 모델에서 혈청 지질 프로파일 및 죽상동맥경화증의 진행을 기초로 하여 관찰하였다. 6 내지 7주령 수컷 ApoE KO 마우스를 AAV-CETP로 생체내 형질감염시켰다. 감염 후 2주째, 혈장 중 CETP 발현은 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 확인하고, 마우스를 웨스턴(Western)(고-지방) 식이로 두었다.

마우스를 초기 총 콜레스테롤 및 확인된 CETP 발현의 매칭을 기초로 하여 수개의 그룹으로 분류하였다: 1 - dH₂O의 용량을 받은 대조군. 2 - 고 용량의 L-카르니틴(35.2 mg/mL dH₂O)을 받은 그룹. 3 - 저 용량의 L-카르니틴(8.7mg/mL dH₂O)을 받은 그룹. 4 - 고 용량의 L-카르니틴(35.2 mg/mL dH₂O) 및 메티마자올(methimazaole)의 용량(1.5 mg/mL dH₂O)을 받은 그룹. 5 - 메티마자올의 용량(1.5 mg/mL dH₂O)을 받은 그룹.

투약은 마우스가 10주령에 도달하였을 때 시작하고, 12주 동안 지속하였다. 약물을 1일 1회 경구 위관영양으로 투여하였다. 동물의 체중을 매주 측정하였다. 어떠한 통계적으로 유의한 체중 변화도 연구 동안 치료 그룹 간에 관찰되지 않았다(도 2).

혈장 중 L-카르니틴 및 TMAO의 농도를 액체 크로마토그래피 - 질량 분광법을 사용하여 측정하였다. 중수소 표지된 L-카르니틴 스톡 표준을 칭량 무게 차이 기법(weigh by difference technique)을 사용하여 제조하였다. Cambridge Isotope Laboratories로부터의 d9-L-카르니틴 약 5 mg을 10 mL 용적 플라스크에 칭량 깔때기 또는 칭량 페이퍼를 통해 첨가하고, 물:메탄올 = 1:1을 사용하여 샘플을 용해시켰다. 중수소 표지된 TMAO 스톡 표준을 25 ± 2 mg의 d9-트리메틸아민 N-옥사이드 참조 표준을 정확하게 칭량하고, 샘플을 25 mL 용적 플라스크로 이동시키고, 약 15 mL의 물 : 메탄올 = 1: 1을 첨가하고, 용해될 때까지 와류하여 제조하였다. 이어서, 플라스크를 물 : 메탄올 = 1:1을 갖는 용적으로 채웠다.

중수소 표지된 L-카르니틴 및 중수소 표지된 TMAO의 스톡 표준을 5 mg/10 mL 물/메탄올의 d9-L-카르니틴 및 25 mg/25 mL 물/메탄올의 d9-TMAO를 사용하여 제조하였다. 이들 스톡 표준을 사용하여 200 μL의 d9-L-카르니틴 스톡 표준 및 10 μL의 d9-TMAO를 50 mL 용적 플라스크에 첨가하고, 아세토니트릴을 용적까지 첨가하고, 잘 혼합하여 내부 표준을 제조하였다.

이어서, 검량 표준을 제조하였다. L-카르니틴 스톡 표준을 제조하기 위해, 25 ± 2 mg의 L-카르니틴 참조 표준을 10 mL 용적 플라스크로 옮기고, 대략 7 mL의 물 : 메탄올 = 1:1을 첨가하였다. 용액을 용해될 때까지 와류시키고, 물 : 메탄올 = 1:1로 용적까지 채웠다. 트리메틸아민 N-옥사이드 스톡 표준을 제조하기 위해, 25 ± 2 mg의 L-카르니틴 참조 표준을 25 mL 용적 플라스크로 옮기고, 15 mL의 물:메탄올 = 1:1을 첨가하였다. 용액을 용해될 때까지 와류시키고, 용적까지 물:메탄올 = 1:1로 채웠다. 이어서, 이들 스톡 표준을 사용하여 480 μL의 L-카르니틴 스톡 표준 및 100 μL의 트리메틸아민 N-옥사이드를 10 mL 플라스크로 피펫팅하고, 물 : 메탄올 = 1:1을 용적까지 첨가하고, 잘 혼합하여 중간체 표준을 제조하였다.

작업용 표준을 표 1에 따라서 물을 희석제로서 사용하여 제조하였다. 각 표준에 대해, 중간체 표준의 지정된 양을 개별적인 10 mL 용적 플라스크로 피펫팅하고, 7 mL의 물을 첨가하였다. 용액을 용해될 때까지 와류시키고, 물로 용적까지 채웠다.

작업용 검량 표준을 2.5 mL의 작업용 표준 용액, 2.5 mL의 물, 및 5 mL의 내부 표준 용액을 플라스크 내로 피펫팅하고 잘 혼합하여 제조하였다.

혈장 샘플 용액을 또한 혈장 샘플 용액에 대해 제조하고, 먼저 50 μL의 마우스 혈장 샘플 및 이어서 50 μL의 물을 2 mL 원심분리관으로 첨가하고, 잘 혼합하였다. 다음에 100 μL의 내부 표준 용액을 원심분리관으로 첨가하고, 캡을 고정하고, 2분 동안 와류하였다. 이어서, 혼합물을 원심분리하였다. 스파이크 복구를 위한 혈장 블랭크 용액 및 스파이크된 혈장 샘플 제제를 유사하게 제조하였다. 혈장 블랭크 용액에 대해, 50 μL의 마우스 혈장 블랭크 및 이어서, 50 μL의 물을 2 mL 원심분리관으로 피펫팅하고, 잘 혼합하고, 이어서, 100 μL의 내부 표준 용액을 피펫팅하였다. 혼합물을 2분 동안 와류하고, 이어서, 원심분리하였다. 스파이크된 혈장 샘플 제조를 위해, 50 μL의 마우스 혈장 블랭크 및 이어서 50 μL의 L-카르니틴 및 트리메틸아민 N-옥사이드 작업용 표준을 2 mL 원심분리 관에 첨가하였다. 용액을 잘 혼합하고, 이어서, 100 μL의 내부 표준 용액을 관에 첨가하였다. 혼합물을 캡을 닫은 후 2분 동안 와류하고, 이어서, 원심분리하였다. 각 샘플에 대해, 상부 상청액을 분석을 위해 수집하였다.

샘플을 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법을 사용하여 하기 표 2 및 3에서 명세에 따라 분석하였다.

표준 검량 곡선을 상응하는 내부 표준에 대한 L-카르니틴/TMAO의 농도 대 반응(피크 면적의 비)을 플롯팅하여 생성하였다. 각 혈장 샘플에 대해, 내부 표준에 대한 샘플 중 L-카르니틴/TAMO의 반응을 표준 검량 곡선과 비교하여 L-카르니틴/TMAO의 농도를 측정하였다. 검량 범위 내에서 성취한 선형 반응은 L-카르니틴에 대해 0.9945 및 트리메틸아민 N-옥사이드에 대해 0.9994의 계산된 상관 계수를 가졌다. 검출 한계 및 정량 한계를 또한 일반 회귀를 사용하여 측정하였다. 계산된 검출 한계 및 정량 한계는 각각 L-카르니틴에 대해 0.3 및 0.11 ㎍/mL 및 트리메틸아민 N-옥사이드에 대해 0.03 및 0.10 ㎍/mL이었다. 방법의 특이성을 또한 L-카르니틴 및 트리메틸아민 N-옥사이드의 분석에 대해 얻었다. L-카르니틴 및 트리메틸아민 N-옥사이드를 3.8 및 4.4 min의 각각의 체류 시간으로 완전히 분해하였다. 방법의 정확성을 2개의 상이한 수준의 L-카르니틴 및 트리메틸아민 N-옥사이드를 포함하는 샘플의 복구 분석으로부터 측정하였다. 수준 1은 1.2 ㎍/mL의 L-카르니틴 및 0.1 ㎍/mL의 트리메틸아민 N-옥사이드를 포함하고, 수준 2는 3 ㎍/mL의 L-카르니틴 및 0.25 ㎍/mL의 트리메틸아민 N-옥사이드를 포함하였다. 스파이크된 샘플로부터 L-카르니틴 및 트리메틸아민 N-옥사이드의 복구는 각각 95.6 ± 0.04% (n=5) 및 96.4 ± 0.03% (n=5)이었다.

고 용량의 L-카르니틴(352 mg/kg) 및 저 용량의 L-카르니틴(87 mg/kg)으로 치료된 마우스는 대조군 비히클과 비교하여 혈장 중 L-카르니틴 농도의 유의한 증가를 나타내었다(도 3). 메티마졸(15 mg/kg)로 치료된 마우스는 대조군 비히클과 비교하여 L-카르니틴 농도의 유의한 감소를 나타내었다(도 3). 고 용량의 L-카르니틴(352 mg/kg) 치료 및 병용물로서 고 용량의 L-카르니틴(352 mg/kg) 및 메티마졸 치료는 둘 다 통계적으로, 대조군 비히클 중 TMAO 농도와 비교하여, TMAO 농도의 유의한 증가를 나타내었다(도 4). 측정된 TMAO 값은 대상자 간의 높은 상호-변동성(inter-variability)을 나타내었다.

죽상동맥경화증 진행에 미치는 L-카르니틴 및/또는 메티마졸을 사용한 치료 효과는 흉부 대동맥 및 대동맥 기부의 동관이행부(sinotubular junction)에 존재하는 병변의 양을 측정하여 결정하였다. 12주 치료 후, 마우스를 희생시키고, 이들의 조직을 분석을 위해 제거하였다. 엔-페이스(En-face) 흉부 대동맥을 단리하고, 분석을 위해 존재하는 지방을 트리밍하고 대동맥을 포르말린 중에 48 내지 72시간 동안 고정하여 제조하였다. 형태적 엔-페이스 분석을 위해, 대동맥을 펼치고, 블랙 매트릭스 위에 핀으로 고정시키고, 지질 결합 염료 Sudan IV로 염색하여 병변이 존재하는 흉부 대동맥의 백분율을 측정하였다. 니콘(Nikon) 컴퓨터화된 영상 분석 시스템을 사용하여 표면 개입(surface involvement)을 위한 혈관을 영상화하였다. 엔-페이스 분석은 L-카르니틴 및/또는 메티마졸의 치료 후 흉부 대동맥에 존재하는 플라크의 양의 유의한 변화가 없음을 나타내었다(도 5). 그러나, 흉부 대동맥의 병변 면적의 퍼센트의 유의한 감소는 0.1 ppm 보다 낮은 TMAO 수준에 비해 0.1 ppm 보다 높은 TMAO 수준에서 관찰되었다(도 6).

대동맥 기부에 존재하는 플라크의 양을 측정하기 위해, 대동맥동을 대략 5mm의 상행 대동맥을 나머지 대동맥으로부터 자르고, 심장의 꼭대기를 제거하고, 남아있는 심장을 OCT 매질에서 부착된 대동맥 세그먼트로 위치시키고, 드라이아이스/2-메틸부탄 욕에서 냉각시켜 분석을 위해 제조하였다. 도 1은 동관이행부(12) 아래에 위치한 대동맥 기부(10)를 나타낸다. 상행 대동맥으로 시작하여, 길이 10 μM의 섹션을 심실에 도달할 때까지 대동맥동으로부터 잘랐다. 이어서, 대동맥동 섹션을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 5 단계 수준에서 니콘 컴퓨터화된 영상 분석 시스템을 사용하여 영상화하였다. L-카르니틴 또는 메티마졸 치료를 받은 모든 마우스는 대동맥 기부에서 플라크의 양의 작지만 유의한 감소를 나타내었다(도 7).

본 발명에 대한 이들 및 다른 개질 및 변형이 당해 기술 분야의 일반적 숙련가에 의해 보다 특히 첨부된 청구범위에 열거되는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 실행될 수 있다. 추가로, 다양한 양태의 측면이 전체로 또는 부분적으로 상호교환될 수 있다. 또한, 당해 기술 분야의 일반적 숙련가는 상기한 기술이 단지 예의 방식으로 존재하고, 이러한 첨부된 청구범위에서 추가로 기술되는 본 발명을 제한하려는 의도는 아님을 인식할 것이다.

Claims (29)

1. 트리메틸아민 N-옥사이드(TMAO) 생성 제제(producing agent)를 포함하는, 흉부 대동맥 병변(thoracic aortic lesions)의 치료 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서,
   상기 TMAO 생성 제제는, 섭취되거나 주사되는 경우, 포유동물의 신체에서 TMAO를 형성하는 화합물을 포함하고, 상기 방법은 TMAO 생성 제제를 포유동물의 혈액 중 TMAO 수준을 0.1 ppm 이상으로 증가시키기에 충분한 양으로 상기 포유동물에게 투여함을 포함하고,
   상기 TMAO 생성 제제는 카르니틴, 콜린, 및 베타인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 상기 카르니틴은 L-카르니틴 또는 D-카르니틴이며; 상기 베타인은 트리메틸글리신, 베타인 하이드로클로라이드, 베타인 디하이드로겐시트레이트, 베타인 모노하이드레이트, 베타인 나트륨 아스파르테이트, 베타인-글리코시아민, 감마-부티로베타인, 프롤린-베타인, 베타인 글루타메이트, 및 코카미딜프로필 베타인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 TMAO 생성 제제의 주기적 투여 동안 상기 포유동물의 혈액 중 TMAO 수준을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 혈액 중 모니터링된 TMAO의 수준을 기초로 하여, 혈액 중 TMAO의 양을 증가시키기 위해 상기 포유동물에게 투여되는 TMAO 생성 제제의 양을 조정하는 단계를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 L-카르니틴 또는 D-카르니틴인, 약제학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 콜린인, 약제학적 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 베타인인, 약제학적 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 카르니틴, 콜린, 및 베타인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2개의 TMAO 생성 제제의 혼합물인, 약제학적 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 상기 포유동물에 의해 섭취되는, 약제학적 조성물.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 상기 포유동물에 주사되는, 약제학적 조성물.
12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 죽상동맥경화증을 앓거나 또는 발병 위험이 있는 포유동물에게 투여되는, 약제학적 조성물.
13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 말초혈관 질환에 걸린 포유동물에게 투여되는, 약제학적 조성물.
14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 상기 포유동물에게 50 mg/kg 초과의 용량으로 투여되는, 약제학적 조성물.
15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TMAO 생성 제제가 상기 포유동물에게 하루 1회 또는 2회 투여되는, 약제학적 조성물.
16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 사람 환자를 포함하는, 약제학적 조성물.
17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 고양이 또는 개를 포함하는, 약제학적 조성물.
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