KR102517470B1 - Novel Bacterial Strain of Dermacoccus Genus Having Skin Whitening, Collagenesis, Anti-oxidation and/or Anti-bacterial Activity - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소정의 피부 상재 균주를 포함하는 피부 미백, 콜라겐 생성, 항산화 및/또는 항균용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신규 균주 및/또는 이의 용해물, 그리고 이를 포함하는 조성물을 이용하는 경우, 효과적으로 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화 또는 항균 효능을 달성할 수 있다. The present invention relates to a composition for skin whitening, collagen production, antioxidant and/or antibacterial use comprising a certain skin-resident strain. When using the novel strain and/or lysate thereof of the present invention, and a composition containing the same, it is possible to effectively achieve skin whitening, intradermal collagen production, antioxidant or antibacterial efficacy.
Description
본 발명은 소정의 피부 상재 균주를 포함하는 피부 미백, 콜라겐 생성, 기미 개선, 잡티 개선, 주름 개선, 탄력 개선, 항산화 및/또는 항균용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for skin whitening, collagen production, blemish improvement, blemish improvement, wrinkle improvement, elasticity improvement, antioxidant and/or antibacterial composition comprising a predetermined skin resident strain.
피부는 외부 노출 장기의 특성상 표면적이 넓고 세균, 곰팡이, 바이러스 등과 같이 다양한 미생물들이 서식하고 있다. 다양한 연구 문헌들을 통해 피부 상재 미생물의 대사물질 등이 피부세포에 영향을 미치며, 피부 외부 장벽 기능 및 노화방지와 항염증에 긍정적인 영향을 미친다고 밝혀졌으나, 어떠한 특정 미생물이 피부 세포 노화 및 장벽형성에 효과가 있는지 명확하게 밝혀져 있지 않은 실정이다. 특히 최근 장내 마이크로바이옴 연구와 유사하게 피부 마이크로바이옴 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 피부는 적용 부위가 다양해서 부위별 미생물 균총 분포에 대한 연구내용들이 발표되어 있다. 그리고 이러한 피부 표면에서 분리된 피부 상재균을 활용한 화장품들이 국내외에서 시판되고 있다. 그러나 대부분의 제품들이 피부 마이크로바이옴, 즉 피부 상재균의 새로운 기능성과 그 역할에 주목하기보다 기존의 유산균 화장품의 카테고리에서 벗어나지 못하는 제품이 대다수이다. Due to the characteristics of externally exposed organs, the skin has a large surface area and is inhabited by various microorganisms such as bacteria, fungi, and viruses. Through various research literature, it has been found that metabolites of skin-resident microorganisms affect skin cells and have a positive effect on skin external barrier function and anti-aging and anti-inflammatory effects. It is not clear whether or not it is effective. In particular, skin microbiome research has been actively carried out similarly to the recent intestinal microbiome research, and since the skin is applied to various sites, studies on the distribution of microbial flora by site have been published. In addition, cosmetics using skin flora isolated from the skin surface are commercially available at home and abroad. However, most of the products do not break away from the category of existing lactobacillus cosmetics rather than paying attention to the new functionality and role of the skin microbiome, that is, skin flora.
미생물을 활용하여 피부에 적용하고자 하는 시도와 관련한 다음과 같은 종래 기술들이 있다. 국내 등록특허 제10-1911349호는 항균, 항산화, 피부 미백 및 피부 주름개선 효과를 갖는 신규 엑티노키네오스포라 속 R434 균주에 관해 보고하고 있다. 또한, 국내 등록특허 제10-1503979호는 락토바실러스 펜토서스 균주 배양액을 포함하는 피부 미백용 조성물 및 그 제조 방법에 관해 보고하고 있다. 또한, 국내 등록특허 제10-1869275호는 항균, 항산화, 피부 미백 및 피부 주름개선 효과를 갖는 신규 칼리디폰티박터 속 R161 균주에 관해 보고하고 있다. 다만, 선행기술들을 통해 보고된 균주들의 경우, 피부상재균에 속하는 균주로서 보고된 바 없다. There are the following prior arts related to attempts to apply microorganisms to the skin. Korean Registered Patent No. 10-1911349 reports on a new strain R434 of the genus Actinokineospora having antibacterial, antioxidant, skin whitening and skin wrinkle improvement effects. In addition, Korean Patent Registration No. 10-1503979 reports a composition for skin whitening containing a Lactobacillus pentosus strain culture solution and a manufacturing method thereof. In addition, Korean Patent Registration No. 10-1869275 reports on a novel Calidipontibacter genus R161 strain having antibacterial, antioxidant, skin whitening and skin wrinkle improvement effects. However, strains reported through prior art have not been reported as strains belonging to dermatophytes.
본 연구에서는 신규 피부 유래 미생물(상재균)의 효능과 기능성을 규명하고 신규 미생물 자원 확보를 통해 독자적인 영역을 구축하고자 하였다.In this study, the efficacy and functionality of new skin-derived microorganisms (common flora) were identified and an independent area was established by securing new microorganism resources.
본 발명자들은 피부상재균 중 소정의 균주를 포함하는 피부 미백, 주름 개선, 항산화 및/또는 항균 효과가 우수한 균주를 확보하고, 이를 포함하는 기능성 화장료 및 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 용혈 활성을 보이지 않고, 단백질 분해 효소를 생성하지 않으며, 피부 병원성 미생물 및 여드름 생성균을 억제하고, 라디칼 제거를 통한 항산화 효과를 가지며, 특별히 멜라닌 생성을 유도하는 타이로시나아제(tyrosinase)를 억제하고, 피부 세포에서 콜라겐 합성을 유도하는 신규 균주를 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have made intensive research efforts to secure strains with excellent skin whitening, wrinkle improvement, antioxidant and/or antibacterial effects, including predetermined strains, among skin flora, and to develop functional cosmetics and pharmaceutical compositions containing them. As a result, it does not show hemolytic activity, does not produce proteolytic enzymes, inhibits skin pathogenic microorganisms and acne-producing bacteria, has an antioxidant effect through radical removal, and specifically inhibits tyrosinase that induces melanin production. And, the present invention was completed by identifying a new strain that induces collagen synthesis in skin cells.
따라서, 본 발명의 목적은 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화 또는 항균 활성을 갖는, 신규 균주를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel strain having skin whitening, intradermal collagen production, antioxidant or antibacterial activities.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 균주 및/또는 이의 용해물을 포함하는 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화 또는 항균용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for skin whitening, intradermal collagen production, antioxidation or antibacterial use comprising the novel strain and/or a lysate thereof.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 피내 콜라겐 생성용 조성물을 포함하는 주름 개선용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for improving wrinkles comprising the composition for intradermal collagen production.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균용 조성물을 포함하는 여드름 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving or treating acne containing the antibacterial composition.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 기탁번호 KCTC18883P로 기탁된, 더마코커스 프로펀디 (Dermacoccus profundi) BS35F-3 균주를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention deposited with Accession No. KCTC18883P, provides Dermacoccus profundi BS35F-3 strain.
본 발명자들은 피부상재균 중 소정의 균주를 포함하는 피부 미백, 주름 개선, 항산화 및/또는 항균 효과가 우수한 균주를 확보하고, 이를 포함하는 기능성 화장료 및 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 용혈 활성을 보이지 않고, 단백질 분해 효소를 생성하지 않으며, 피부 병원성 미생물 및 여드름 생성균을 억제하고, 라디칼 제거를 통한 항산화 효과를 가지며, 특별히 멜라닌 생성을 유도하는 타이로시나아제(tyrosinase)를 억제하고, 피부 세포에서 콜라겐 합성을 유도하는 신규 균주를 규명하였다. The present inventors have made intensive research efforts to secure strains with excellent skin whitening, wrinkle improvement, antioxidant and/or antibacterial effects, including predetermined strains, among skin flora, and to develop functional cosmetics and pharmaceutical compositions containing them. As a result, it does not show hemolytic activity, does not produce proteolytic enzymes, inhibits skin pathogenic microorganisms and acne-producing bacteria, has an antioxidant effect through radical removal, and specifically inhibits tyrosinase that induces melanin production. and identified a new strain that induces collagen synthesis in skin cells.
본 발명의 균주는 피부상재균들로부터 동정한 균주로서 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화 또는 항균 활성을 갖는 더마코커스 프로펀디 (Dermacoccus profundi) BS35F-3 균주이고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC18883P로 기탁된 균주에 해당한다. The strain of the present invention is Dermacoccus profundi BS35F-3 strain, which is identified from skin flora and has skin whitening, intradermal collagen production, antioxidant or antibacterial activity, and is consigned to the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center Corresponds to the strain deposited under the number KCTC18883P.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화 또는 항균용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for skin whitening, intradermal collagen production, antioxidant or antibacterial composition containing the strain.
본 발명의 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화 또는 항균용 조성물에 포함되는 “균주”는 균주 자체, 이의 배양물, 이의 현탁액, 이의 파쇄 추출물 및/또는 균주 용해물 모두를 의미하는 것으로 이해될 수 있다. The "strain" included in the composition for skin whitening, intradermal collagen production, antioxidant or antibacterial use of the present invention can be understood to mean all of the strain itself, its culture, its suspension, its lysate extract and/or its lysate. .
본 발명의 피부 미백용 조성물의 “미백” 활성은 피부의 색소 침착을 예방, 개선 또는 치료하는 모든 활성을 포함하며, 구체적으로 예를 들면, 기미, 주근깨, 검버섯 및/또는 피부의 멜라닌 색소 침착에 의한 모든 잡티에 대한 예방, 개선 또는 치료 활성을 포함한다. The "whitening" activity of the composition for skin whitening of the present invention includes all activities for preventing, improving or treating pigmentation of the skin, specifically, for example, for melasma, freckles, age spots and/or melanin pigmentation of the skin. It includes preventive, ameliorative or therapeutic activity for all blemishes caused by
본 발명의 피내 콜라겐 생성용 조성물은 콜라겐 생성을 촉진하는 활성을 갖는 조성물을 의미하고, 보다 구체적으로 피부에 적용하여 피부에 포함된 콜라겐의 생성을 촉진하는 활성을 나타낼 수 있는 조성물을 의미한다. The composition for intradermal collagen production of the present invention means a composition having an activity to promote collagen production, and more specifically, a composition that can exhibit an activity to promote the production of collagen contained in the skin when applied to the skin.
본 발명의 “콜라겐(collagen)”은 체내 결합 조직의 주성분이며 뼈와 피부에 주로 분포하지만, 관절, 각 장기의 막, 머리카락 등 우리 몸 전체에 분포되어 있다. 콜라겐은 피부 노화와 관련된 주요 피부 조직 성분으로서, 피부의 강도, 탄력성, 유연성을 유지할 수 있도록 한다. 따라서 콜라겐의 합성증진 및 분해억제는 피부 주름 예방 및/또는 개선, 그리고 피부 노화억제와 관련된다. 본 발명의 조성물은 피부 주름 예방 및/또는 개선용, 피부 노화 억제용 조성물로 이용될 수 있다. "Collagen" of the present invention is the main component of connective tissue in the body and is mainly distributed in bones and skin, but is distributed throughout our body, such as joints, membranes of each organ, and hair. Collagen is a major skin tissue component associated with skin aging, and helps maintain the strength, elasticity, and flexibility of the skin. Therefore, the promotion of collagen synthesis and inhibition of degradation are related to the prevention and/or improvement of skin wrinkles and the inhibition of skin aging. The composition of the present invention can be used as a composition for preventing and/or improving skin wrinkles and inhibiting skin aging.
본 발명의 항산화용 조성물은 활성산소종에 의한 산화적 스트레스로 인해 피부 조직이 손상되는 것을 방지할 수 있는 자유라디칼 소거 활성을 갖는 조성물을 의미한다. The antioxidant composition of the present invention refers to a composition having free radical scavenging activity capable of preventing skin tissue from being damaged due to oxidative stress caused by reactive oxygen species.
본 발명의 항균용 조성물은 박테리아 활성 억제, 생장 억제 또는 사멸능을 갖는 조성물을 의미하고, 구체적인 일 실시예에서, 피부 병원성 균에 대한 활성 억제, 생장 억제 또는 사멸능을 갖는 조성물을 의미한다. The antibacterial composition of the present invention means a composition having a bacterial activity inhibition, growth inhibition or killing ability, and in a specific embodiment, refers to a composition having activity inhibition, growth inhibition or killing ability for skin pathogenic bacteria.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 균주는 균주 용해물의 형태로 제공된다. 본 명세서 상의 용어 “균주 용해물”은 균주를 균질기로 파쇄한 상태의 용액을 의미할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 파쇄된 균주를 포함하는 용액을 원심분리한 뒤 분리한 상등액(supernatent)을 의미한다. 구체적으로 예를 들면, 5000내지 15000 rpm, 3 내지 10 min, 0 내지 10℃ 조건에서 원심분리를 수행하여 균주 용해물을 얻을 수 있다. 상기 원심분리 조건에 있어서, 다른 구체예들에 따르면, 8000 내지 15000 rpm, 10000 내지 15000 rpm, 12000 내지 15000 rpm 조건에서 원심분리를 수행할 수 있다. 또한, 상기 원심분리 조건에 있어서, 구체적으로 예를 들면, 3 내지 7 min, 4 내지 6 min 조건으로 원심분리를 수행할 수 있다. 또한, 상기 원심분리 조건에 있어서, 구체적으로 예를 들면, 0 내지 8℃, 1 내지 7℃, 2 내지 6℃, 3 내지 5℃ 조건에서 원심분리를 수행할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the strain of the present invention is provided in the form of a strain lysate. The term “strain lysate” in the present specification may refer to a solution in which a strain is disrupted with a homogenizer, and more specifically, refers to a supernatant obtained by centrifuging a solution containing the disrupted strain and then separating the supernatant. . Specifically, for example, a strain lysate may be obtained by performing centrifugation at 5000 to 15000 rpm, 3 to 10 min, and 0 to 10 ° C. conditions. As for the centrifugation conditions, according to other embodiments, centrifugation may be performed under conditions of 8000 to 15000 rpm, 10000 to 15000 rpm, and 12000 to 15000 rpm. In addition, in the centrifugation conditions, specifically, for example, centrifugation may be performed under conditions of 3 to 7 min and 4 to 6 min. Further, in the centrifugation conditions, specifically, for example, centrifugation may be performed at 0 to 8°C, 1 to 7°C, 2 to 6°C, and 3 to 5°C.
본 발명의 일 구체예에서는 균체 농축액을 Beadbeater (MiniBeadBeater-16, BioSpec Products)를 사용하여 파쇄한 뒤, 4℃ 온도조건에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상등액을 채취함으로써 최종 균체용해물을 수득하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 균체 농축액은 균체 배양 배지를 원심분리하여 상등액을 제거 후 균체를 회수하고, 멸균된 1×PBS (Phosphate buffered saline)에 희석하여 세척하는 과정을 1회 또는 2회 이상 거칠 수 있으며, 최종적으로 원심분리하여 균체를 얻고, 1×PBS를 이용하여 원하는 정도로 농축된 균체 농축액을 얻을 수 있다. 구체적인 일 실시예에서, 3-10배 농축된 균체 농축액을 얻은 후 균주 용해물 제조에 이용할 수 있으며, 다른 구체예에서, 4-9배 농축된 균체 농축액을 이용할 수 있으며, 또 다른 구체예에서, 5-8배 농축된 균체 농축액을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In one embodiment of the present invention, the cell concentrate was disrupted using a Beadbeater (MiniBeadBeater-16, BioSpec Products), and then centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant was collected to obtain the final cell lysate. , but is not limited thereto. The microbial cell concentrate may be subjected to a process of centrifuging the microbial cell culture medium to remove the supernatant, recovering the microbial cells, diluting in sterilized 1 × PBS (Phosphate buffered saline) and washing once or twice or more, and finally centrifuging Cells can be obtained by separation, and a cell concentrate concentrated to a desired degree can be obtained using 1×PBS. In a specific embodiment, a 3-10-fold concentrated bacterial cell concentrate can be obtained and then used for preparing a strain lysate. In another embodiment, a 4-9-fold concentrated bacterial cell concentrate can be used. In another embodiment, A 5-8 times concentrated bacterial cell concentrate may be used, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 더마코커스 프로펀디 (Dermacoccus profundi) BS35F-3 (수탁번호: KCTC18883P) 균주는 동일 유사 활성이 있는 제3의 균주들과 혼합하여 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 상기 혼합물에 포함되는 균주 혼합물은 “균주 용해물”의 혼합물일 수 있다. 상술한 “균주 용해물”의 혼합물은 각 균주에 대한 균주 용해물을 준비한 뒤 당업계의 통상의 지식을 가진 자의 필요에 따라 소정의 함량비율로 혼합한 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, Dermacoccus profundi BS35F-3 (accession number: KCTC18883P) strain of the present invention may be mixed with third strains having the same similar activity. More specifically, the strain mixture included in the mixture may be a mixture of “strain lysate”. The mixture of the above-described “strain lysates” may be prepared by preparing strain lysates for each strain and then mixing them in a predetermined content ratio according to the needs of those skilled in the art.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 피내 콜라겐 생성용 조성물을 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for preventing or improving skin wrinkles comprising the above-described composition for intradermal collagen production.
본 명세서 상의 용어 “피내 콜라겐 생성용 조성물”은 피부 조직, 보다 구체적으로 피부 진피 내의 콜라겐 단백질의 생성을 촉진하는 활성을 갖는 조성물을 의미한다. 콜라겐의 합성증진 및 분해억제가 피부 주름 예방 및/또는 개선, 그리고 피부 노화억제와 관련된다는 것은 상술한 바 있다. 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 피부 조직 내의 콜라겐 생성을 촉진할 수 있으며, 피부 노화를 예방하고, 피부 주름이 발생하는 것을 효과적으로 예방할 수 있으며, 피부의 탄력을 향상시켜 이미 발생된 피부 주름을 개선하는데 효과를 보일 수 있다. The term "composition for intradermal collagen production" used herein refers to a composition having an activity of promoting the production of collagen protein in skin tissue, more specifically, in the skin dermis. It has been described above that the promotion of collagen synthesis and inhibition of degradation are related to the prevention and/or improvement of skin wrinkles and the inhibition of skin aging. In the case of using the composition of the present invention, it is possible to promote collagen production in skin tissue, prevent skin aging, effectively prevent skin wrinkles from occurring, and improve skin elasticity to improve skin wrinkles that have already occurred. effect can be seen.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 항균용 조성물은 피부 병원성 세균에 대한 항균능을 갖는 것이다.In one embodiment of the present invention, the antibacterial composition of the present invention has antibacterial activity against skin pathogenic bacteria.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 피부 병원성 세균은 스타필로코커스 속, 큐티박테리움 속 및 바실러스 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 속(genus)에 속하는 균주이다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 항균용 조성물은 스타필로코커스 아루레우스(Staphylococcus aureus), 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에 대한 항균 활성을 갖는 것으로 확인되었다.In one embodiment of the present invention, the skin pathogenic bacteria of the present invention is a strain belonging to at least one genus selected from the group consisting of the genus Staphylococcus, the genus Cutibacterium, and the genus Bacillus. Specifically, for example, the antibacterial composition of the present invention is Staphylococcus aureus, Cutibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis , Bacillus subtilis ( It was confirmed to have antibacterial activity against Bacillus subtilis ).
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항균용 조성물을 포함하는 여드름 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for preventing, improving or treating acne comprising the above-described antibacterial composition.
본 발명에서의 '여드름'은 피부의 모낭 피지선에서 발생하는 염증성 질환으로, 피지가 모낭에 쌓여 그 내부에서 여드름을 유발하는 피부 병원성 세균이 생육하게 됨에 따라 초래된 염증 반응을 의미한다.'Acne' in the present invention is an inflammatory disease occurring in the sebaceous glands of hair follicles of the skin, and means an inflammatory reaction caused by the growth of skin pathogenic bacteria causing acne inside the hair follicles due to the accumulation of sebum in the hair follicles.
상기 여드름은 여드름으로 통칭되는 모든 피부 질환 또는 여드름과 유사한 기전을 통해 발병되는 모든 피부 질환을 포함하며, 예를 들어 집합성 여드름, 브롬화물에 의한 여드름, 일반적 여드름, 응괴 여드름(congoblate acne), 화장품 사용에 의한 여드름, 디터지칸 여드름(acne dtergicans), 청춘기 여드름, 섬광모양의 여드름(acne fulminans), 절성 여드름(acne furunculoid), 할로겐에 의한 여드름, 경결성 여드 름, 켈로이드성 여드름, 물리적 자극에 의한 여드름(mechanical acne), 약물성 여드름, 괴사성 여드름, 속립성 여드름, 신생아 여드름(acne neonatorum), 지성 여드름(acne oil), 구진성 여드름, 적창(pomade acne), 월경전 여드름, 주사 여드름(acne rosacea), 모창성 여드름, 열대성 여드름(tropical acne), 중독성 여드름(acne venenata), 및 심상성 여드름 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The acne includes all skin diseases commonly referred to as acne or all skin diseases developed through a mechanism similar to acne, such as collective acne, bromide-induced acne, general acne, congoblate acne, and cosmetic use. Acne caused by acne, acne dtergicans, adolescent acne, acne fulminans, acne furunculoid, acne caused by halogen, induration acne, keloid acne, acne caused by physical stimulation Acne (mechanical acne), drug acne, necrotic acne, miliary acne, neonatal acne (acne neonatorum), oily acne (acne oil), papular acne, pomade acne, premenstrual acne, rosacea acne rosacea), acne, tropical acne, acne venenata, and acne vulgaris, but are not limited thereto.
본 발명에서 용어 '예방'이란 본 발명에 따른 조성물의 사용에 의해 소정의 질병의 발병을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term 'prevention' means any action that inhibits or delays the onset of a given disease by using the composition according to the present invention.
본 발명에서 용어 '개선'이란 본 발명에 따른 조성물의 사용에 의해 소정의 질병 또는 질병에 의한 일 증상을 감소시키는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term 'improvement' refers to any action that reduces a certain disease or symptom caused by a disease by using the composition according to the present invention.
본 발명에서 용어 '치료'란 본 발명에 따른 조성물의 사용에 의해 소정의 질병 또는 질병에 의한 일 증상을 호전시키거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term 'treatment' means any action that improves or beneficially changes a given disease or a symptom caused by a disease by using the composition according to the present invention.
본 발명의 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화, 항균용 조성물 및 여드름 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다. The composition for skin whitening, intradermal collagen production, antioxidation, antibacterial and acne prevention, improvement or treatment of the present invention may be provided as a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로서 제공되는 경우, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.When the composition of the present invention is provided as a cosmetic composition, the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream , lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, etc., but may be formulated, but are not limited thereto. More specifically, it may be formulated into a softening lotion, nourishing lotion, lotion, nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 것으로 공지되어 사용되며, 유효 성분의 주된 효능을 유의하게 감쇄시키거나, 인체에 대한 부작용을 나타내지 않으면서, 유효 성분의 피부에 대한 적용, 사용자의 사용 편의성 및 선호도를 개선시킬 수 있는 부가 성분을 의미한다. The cosmetic composition of the present invention may include carriers acceptable in cosmetic formulations in addition to active ingredients. The term "acceptable carrier in cosmetic preparations" is known and used as being capable of being included in cosmetic preparations, and does not significantly attenuate the main efficacy of active ingredients or exhibit side effects on the human body. It refers to an additional component that can improve application, user convenience and preference.
상기 담체는 본 발명의 조성물의 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 조성물 전체 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량%로 포함될 수 있다. 그러나 상기 담체의 함량은 화장료의 제형, 구체적인 적용 부위 및 바람직한 적용량 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. The carrier may be included in about 1 wt % to about 99.99 wt %, preferably about 50 wt % to about 99 wt %, based on the total weight of the composition of the present invention. However, the content of the carrier may be appropriately adjusted depending on the formulation of the cosmetic, specific application site and desired application amount, and the like, and is not particularly limited.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림, 로션, 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream, lotion, or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide, etc. this can be used
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the present invention is a powder or spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, and in particular, in the case of a spray, additional chlorofluorohydrocarbon, propane / May contain a propellant such as butane or dimethyl ether.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 ,3-butyl glycol oil, fatty acid esters of glycerol, polyethylene glycol or sorbitan.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a suspension, as a carrier component, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals Star cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth and the like may be used.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleanser, as carrier components, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.Ingredients included in the cosmetic composition of the present invention include ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to active ingredients and carrier ingredients, for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and conventional adjuvants such as fragrances. can include
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제공되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 상기 부형제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.When the composition of the present invention is provided as a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared using a pharmaceutically acceptable carrier and / Or by formulating using an excipient, it can be prepared in unit dose form or prepared by putting it in a multi-dose container. Specifically, for example, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like may be further included as the excipients.
본 발명의 약제학적 조성물은 멜라닌 과잉 생성으로 인한 피부 과색소성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다. 상기 멜라닌 과잉 생성으로 인한 피부 과색소성 질환은 기미, 주근깨, 검버섯 및 과색소 침착으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 의미한다. The pharmaceutical composition of the present invention may be provided as a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating skin hyperpigmentation diseases caused by excessive melanin production. The skin hyperpigmentation disease caused by excessive melanin production refers to a disease selected from the group consisting of melasma, freckles, age spots, and hyperpigmentation.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 콜라겐 생성 촉진에 의한 피부 손상의 예방 또는 치료, 또는 상처 치료용 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may also be provided as a pharmaceutical composition for preventing or treating skin damage by promoting collagen production or treating wounds.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 피부 병원성 세균의 감염을 예방하거나, 감염 증상 및 세균 감염에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다. 상기 피부 병원성 세균은 상술한 바와 같이 스타필로코커스 속, 큐티박테리움 속 및 바실러스 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 속(genus)에 속하는 균주일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. The pharmaceutical composition of the present invention may also be provided as a pharmaceutical composition for preventing infection of skin pathogenic bacteria or preventing or treating infection symptoms and diseases caused by bacterial infection. As described above, the skin pathogenic bacteria may be strains belonging to at least one genus selected from the group consisting of genus Staphylococcus, genus Cutibacterium, and genus Bacillus, but are not limited thereto.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형 형태를 갖는다. 상기 피부 외용 제형은 특별히 한정되지 않으나, 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이 바람직하다.According to a preferred embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention has a dosage form for external application to the skin. The formulation for external application to the skin is not particularly limited, but powder, gel, ointment, cream, liquid or aerosol formulations are preferred.
본 발명에서 피부외용제형의 겔 기재로는 카보폴(Carbopol), 카르보머(Carbomer), 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜(Polypropylene glycol), 폴리아크릴산(Polyacrylic acid), 카르복시메틸셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose), 히드록시메틸셀룰로오스(Hydroxymethylcellulose), 폴리비닐피롤리돈 (Polyvinylpyrrolidone), 젤라틴(Gelatine), 알지네이트염(Alginate Salt), 키틴(Chitin) 또는 키토산(Chitosan) 유도체, 하이알우론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the gel base of the external skin formulation includes Carbopol, Carbomer, Polyethyleneglycol, Polypropylene glycol, Polyacrylic acid, Carboxymethyl cellulose ), hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gelatin, alginate salt, chitin or chitosan derivatives, hyaluronic acid, One or two or more selected from collagen may be used, but is not limited thereto.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 유효 성분의 함량, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이고, 상술한 투여량의 약제학적 조성물을 적용을 원하는 부위에 대해, 적용 목적에 따라 국소적으로 또는 광범위하게 피부외용 제형의 형태로 적용할 수 있다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as the content of the active ingredient, administration method, patient's age, weight, sex, morbid condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity. may be prescribed. On the other hand, the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-1000 mg/kg (body weight) per day, and the above-described dose of the pharmaceutical composition is applied to the desired site, depending on the purpose of application. It can be applied in the form of a formulation for external use on the skin or widely.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화 또는 항균 활성을 갖는, 신규 균주를 제공한다.(a) The present invention provides a novel strain having skin whitening, intradermal collagen production, antioxidant or antibacterial activity.
(b) 본 발명은 상기 신규 균주 및/또는 이의 용해물을 포함하는 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화 또는 항균용 조성물을 제공한다. (b) The present invention provides a composition for skin whitening, intradermal collagen production, antioxidation or antibacterial use comprising the novel strain and/or a lysate thereof.
(c) 본 발명은 상기 피내 콜라겐 생성용 조성물을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다. (c) The present invention provides a cosmetic composition for improving wrinkles comprising the composition for generating intradermal collagen.
(d) 본 발명의 신규 균주 및/또는 이의 용해물, 그리고 이를 포함하는 조성물을 이용하는 경우, 효과적으로 피부 미백, 피내 콜라겐 생성, 항산화 또는 항균 효능을 달성할 수 있다. (d) When using the novel strain and/or lysate thereof of the present invention, and a composition containing the same, skin whitening, intradermal collagen production, antioxidant or antibacterial efficacy can be effectively achieved.
도 1은 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주에 대한 각각의 효소 활성 패턴을 나타낸다.
도 2는 더마코커스 프로펀디 BS35F-3의 여드름 유발균 억제능 평가 결과를 나타낸다. 여드름 유발 균종인 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes) KCTC 3314 균체 배양액을 사용하였으며, 비교평가를 위해, 락토바실러스 플란타럼 (Lactobaillus plantarum) KCTC3108 균주를 사용하였다. 클리어 존 유무 및 형성된 클리어 존의 크기를 확인 가능하다.
도 3은 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주의 라디칼 소거능 확인 결과를 나타낸다.
도 4는 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주의 타이로시나아제(tyrosinase) 억제능 확인 결과를 나타낸다.
도 5는 인체 유래 케라티노사이트에 과산화수소 처리 시, 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주용해물에 의한 세포 생존율 시험 결과를 나타낸다.
도 6은 MTT 어세이를 통한 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주의 세포 보호 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주의 멜라닌 저해 효과를 확인한 결과를 나타낸다.Figure 1 shows each enzyme activity pattern for Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain.
Figure 2 shows the results of evaluating the acne-causing bacteria inhibition ability of Dermacoccus Profundi BS35F-3. Cutibacterium acnes , an acne-causing strain, KCTC 3314 cell culture medium was used, and for comparative evaluation, Lactobaillus plantarum KCTC3108 strain was used. It is possible to check the presence or absence of a clear zone and the size of the formed clear zone.
Figure 3 shows the results of confirming the radical scavenging ability of Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain.
Figure 4 shows the results of confirming the tyrosinase inhibitory ability of Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain.
Figure 5 shows the results of the cell viability test by the lysate of Dermacoccus profundi BS35F-3 strain when human-derived keratinocytes were treated with hydrogen peroxide.
Figure 6 shows the results of confirming the cytoprotective effect of the Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain through the MTT assay.
Figure 7 shows the results of confirming the melanin inhibitory effect of Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example
Ⅰ. 신규한 피I. new blood 부 상재균의 분리 및 동정Isolation and identification of parasites
실시예 1: 피부 상재균의 동정 및 특성 확인Example 1: Identification and characterization of skin flora
<1-1> 신규 미생물 분리<1-1> Isolation of novel microorganisms
본 발명에 사용된 더마코커스 프로펀디(Dermacoccus profundi) BS35F-3,균주는 건강한 성인의 피부 각질 시료를 채취하여 혐기성(anaerobic) 희석(dilution) 용액 (참조: 표1)에 현탁하고 희석 후 BHI (Brain Heart Infusion) 고체배지에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 호기배양 또는 5% CO2, 10% H2, 85% N2의 대기 조성으로 혐기 배양한 다음 순수 분리하였다. 분리된 균주는 형태학적 관찰 및 분자생물학적 동정을 실시하였다.Dermacoccus profundi BS35F-3 strain used in the present invention was obtained by taking skin samples from healthy adults, suspending them in an anaerobic dilution solution (see Table 1), and diluting them with BHI ( Brain Heart Infusion) plated on a solid medium and aerobically cultured at 37°C for 48 hours or anaerobically cultured in an atmospheric composition of 5% CO 2 , 10% H 2 , and 85% N 2 , and then purified. The isolated strain was subjected to morphological observation and molecular biological identification.
<1-2> 형태학적 관찰 및 특성 평가<1-2> Morphological observation and characterization
상기 분리된 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주에 대한 형태학적 관찰을 실시하였다. BHI 배지에서 자란 집락(colony)의 형태를 관찰하고 그람염색을 통해 분리균주에 대한 현미경관찰을 실시하였다. BHI에서 자란 집락의 형태 및 현미경 관찰결과는 하기의 표2의 내용과 같다. 또한 BS35F-3 균주의 안전성 확인의 목적으로 병원성 균이 생성하는 카탈라아제(catalase), 젤라틴나아제(gelatinase) 효소 활성을 확인하고, 용혈 활성(hemolysis)을 확인하였다.Morphological observation was performed on the isolated Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain. The morphology of the colonies grown in the BHI medium was observed and microscopic observation was performed on the isolates through Gram staining. The morphology and microscopic observation results of colonies grown in BHI are shown in Table 2 below. In addition, for the purpose of confirming the safety of strain BS35F-3, enzyme activities of catalase and gelatinase produced by pathogenic bacteria were confirmed, and hemolysis was confirmed.
<1-3> 이화학적 특성 조사 : 효소 활성 확인<1-3> Investigation of physicochemical properties: confirmation of enzyme activity
상기 분리된 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주의 효소 활성은 API ZYM 키트를 이용하여 조사하였다. 18시간 37℃에서 배양한 균주를 원심분리하여 균체를 회수하고 1×PBS로 2회 세척한 뒤, 0.85% NaCl 용액을 이용하여 흡광도 (600nm) 약 1.0으로 희석하였다. API ZYM strip 각 큐플에 균액을 접종한 후, 37℃ 호기 배양하였다. 4시간 뒤 각 큐플에 ZYM A, B 시약을 차례대로 한 방울씩 떨어뜨리고, 5분 후에 나타나는 색의 강도에 따라 0∼5로 점수를 기록하였다. BS35F-3 균주에 대한 각각의 효소 활성 패턴은 도 1의 내용과 같다. The enzyme activity of the isolated Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain was investigated using the API ZYM kit. The strain cultured at 37 ° C for 18 hours was centrifuged to recover the cells, washed twice with 1 × PBS, and then diluted to an absorbance (600 nm) of about 1.0 using a 0.85% NaCl solution. After inoculating the bacterial solution on each cuple of the API ZYM strip, it was incubated at 37 ° C aerobically. After 4 hours, ZYM A and B reagents were sequentially dropped one drop at each cuple, and a score of 0 to 5 was recorded according to the intensity of the color that appeared after 5 minutes. Each enzyme activity pattern for the BS35F-3 strain is the same as the contents of FIG.
<1-4> 미생물 동정(16S rRNA 동정)<1-4> Identification of microorganisms (identification of 16S rRNA)
더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주를 BHI 배지에서 배양하여 수득한 집락(colony)에 대해 이중가닥 DNA 시퀀싱(Solgent, Korea)을 실시하였다. 얻어진 서열은 BLAST로 검색하여 스트레인을 동정하였다. 그 결과 99.86%의 상동성으로 Dermacoccus profundi 종으로 동정되어, 본 발명의 신규한 미생물이 더마코커스 프로펀디 종에 속하는 균주임을 확인하였다 (서열번호 1). 16S rRNA 동정으로 확인된 더마코커스 프로펀디 BS35F-3는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 특허 기탁하여, 수탁번호 KCTC18883P를 부여받았다.Double-stranded DNA sequencing (Solgent, Korea) was performed on colonies obtained by culturing Dermacoccus profundi BS35F-3 strain in BHI medium. The obtained sequence was searched by BLAST to identify the strain. As a result, it was identified as Dermacoccus profundi species with 99.86% homology, confirming that the novel microorganism of the present invention is a strain belonging to Dermacoccus profundi species (SEQ ID NO: 1). Dermacoccus profundi BS35F-3, confirmed by 16S rRNA identification, was patented at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC, Korean Collection for Type Cultures) and received accession number KCTC18883P.
Ⅱ. 신규한 피부상재균의 균주용해물 제조II. Preparation of strain lysates of novel skin flora
실시예 2: 균주용해물의 제조Example 2: Preparation of strain lysate
24시간 37℃에서 배양한 균주 배양액을 원심분리 (10,000rpm, 5 min, 4℃)하고 균체를 회수하여 1×PBS로 2회 세척하였다. 균주 배양액은 흡광도 (600nm) 2.5~3.0로 맞춘 후, 다시 원심분리하여 펠릿(pellet)을 회수하였고 1ml의 1×PBS에 재현탁하였다. 이후 지름 0.1 mm인 지르코니아/실리카 비드 (Zirconia/Silica bead) (BioSpec Products) 0.3 g이 들어있는 튜브에 넣고, 비드비터(Beadbeater) (MiniBeadBeater-16, BioSpec Products)에서 약 4분간 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 원심분리 한 후, 상등액만을 수거하여 실험에 사용하였다. The strain culture solution cultured at 37° C. for 24 hours was centrifuged (10,000 rpm, 5 min, 4° C.), and the cells were recovered and washed twice with 1×PBS. The strain culture solution was adjusted to absorbance (600 nm) of 2.5 to 3.0, centrifuged again to collect pellets, and resuspended in 1 ml of 1 × PBS. Then, it was placed in a tube containing 0.3 g of zirconia/silica beads (BioSpec Products) with a diameter of 0.1 mm, and the cells were disrupted for about 4 minutes in a Beadbeater (MiniBeadBeater-16, BioSpec Products). After centrifuging the cell lysate, only the supernatant was collected and used in the experiment.
Ⅲ. 신규한 피부상재균 균주용해물의 in vitro 기능성 평가 III. In vitro functional evaluation of lysates of novel dermatophyte strains
실시예 3: 항균력Example 3: Antibacterial activity
더마코커스 프로펀디 BS35F-3의 여드름 유발균 억제능을 평가하였다. 한국생명공학연구원(KCTC)로부터 여드름 유발 균종인 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes) KCTC 3314를 분양받아 실험에 사용하였다. 항균력 실험은 균주용해물이 아닌 균체 배양액을 사용하였으며, 비교평가를 위해, 락토바실러스 플란타럼 (Lactobaillus plantarum) KCTC3108 균주를 한국생명공학연구원으로부터 분양받아 사용하였다.The ability of Dermacoccus Profundi BS35F-3 to inhibit acne-causing bacteria was evaluated. Cutibacterium acnes ( Cutibacterium acnes ) KCTC 3314, an acne-causing bacteria, was purchased from the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) and used in the experiment. In the antibacterial activity test, cell culture medium was used, not strain lysate. For comparative evaluation, Lactobaillus plantarum KCTC3108 strain was purchased from the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology and used.
큐티박테리움 아크네스 KCTC 3314 균주는 BHI+0.1% L-cystein(Sigma-Aldrich, MO, USA)에 1% 접종하여 24시간 배양한 후, 흡광도 OD 1.0으로 1XPBS에 현탁하여 사용하였다.Cutibacterium acnes KCTC 3314 strain was inoculated with 1% BHI + 0.1% L-cystein (Sigma-Aldrich, MO, USA), cultured for 24 hours, and suspended in 1XPBS with an absorbance OD of 1.0.
큐티박테리움 아크네스 KCTC 3314 균주 현탁액을 BHI agar 배지에 도말한 후 그 위에 0.8 mm 페이퍼 디스크(paper disk)를 올리고 BS35F-3 균주를 도포하여 37℃에서 12시간 배양하여 페이퍼 디스크(paper disk) 주변에 클리어 존(clear zone) 형성 유무를 확인하였다. 클리어 존(Clear zone)의 크기는 ImageJ software(NIH, USA)를 사용하여 측정하였다.Cutibacterium acnes KCTC 3314 strain suspension was smeared on a BHI agar medium, then a 0.8 mm paper disk was placed on it, and the BS35F-3 strain was applied and incubated at 37 ° C for 12 hours, around the paper disk The formation of a clear zone was confirmed. The size of the clear zone was measured using ImageJ software (NIH, USA).
항균력 결과는 하기의 표 3 및 도 2에 나타내었다.Antimicrobial activity results are shown in Table 3 and Figure 2 below.
도 2에서 확인되는 바와 같이, BS35F-3의 경우, 상기 실시 조건에서 직경 2.030 cm 이상의 클리어 존이 형성되었고, 효과적으로 여드름 유발균을 억제하는 것을 확인하였다. As confirmed in FIG. 2, in the case of BS35F-3, a clear zone having a diameter of 2.030 cm or more was formed under the above experimental conditions, and it was confirmed that acne-causing bacteria were effectively suppressed.
실시예 2: 항산화능Example 2: Antioxidant activity
본 발명의 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주용해물의 항산화능을 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 분석(assay)을 통해 자유라디칼 소거능을 확인함으로써 검증하였다. 양성대조군으로는 피부 미백원료로 사용되는 화합물인 아스코르브산(Ascorbic acid, VitaminC) 1mM과 음성대조군으로는 1XPBS를 사용하여 비교평가 하였다. The antioxidant activity of the lysate of Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain of the present invention was verified by confirming the free radical scavenging activity through DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) assay. As a positive control group, 1 mM ascorbic acid (VitaminC), a compound used as a skin whitening raw material, and 1XPBS as a negative control group were used for comparative evaluation.
상세하게는 세균의 항산화능을 기준 물질과 유사한 수준으로 측정하기 위해 균체 배양액을 농축하여 용해시킨 후 확인하였다. DPPH 시약은 0.2 mM의 농도가 되도록 메탄올에 용해시킨 후 517 nm 파장에서의 흡광도가 1.0이 되도록 메탄올에 희석하였다. In detail, in order to measure the antioxidant capacity of bacteria at a level similar to that of the reference material, the cell culture medium was concentrated and dissolved, and then confirmed. The DPPH reagent was dissolved in methanol to a concentration of 0.2 mM, and then diluted in methanol to obtain an absorbance of 1.0 at a wavelength of 517 nm.
100㎕의 실험 시료들과 동량의 DPPH 용액과 혼합한 후 암조건에서 30분 동안 반응시킨 후, 반응액은 제균을 위해, 포어(pore) 사이즈 0.2 μm의 나일론 필터 (Corning, New York, USA)로 필터링한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라티칼 소거 활성 (scavenging activity)(%)은 아래와 같은 식으로 계산하였다. After mixing 100 μl of the experimental samples with the same amount of DPPH solution and reacting for 30 minutes in the dark, the reaction solution was filtered using a nylon filter with a pore size of 0.2 μm (Corning, New York, USA) for sterilization. After filtering with , the absorbance was measured at 517 nm. Free radical scavenging activity (scavenging activity) (%) was calculated by the following formula.
[식 1][Equation 1]
Scavenging activity(%)=(OD 517 control-OD 517 sample)/(OD 517 control)×100Scavenging activity (%) = ( OD 517 control - OD 517 sample ) / ( OD 517 control ) × 100
본 발명의 더마코커스 프로펀디 BS35F-3의 라디칼 소거능은 도 3의 결과와 같이 약 81%로 확인되었다. 이는 화학물질인 1 mM Ascorbic acid (약 81%)와 유사한 수준의 항산화능으로 확인되었다.The radical scavenging ability of Dermacoccus Profundi BS35F-3 of the present invention was confirmed to be about 81% as shown in FIG. 3 . It was confirmed that the antioxidant activity was similar to that of 1 mM Ascorbic acid (about 81%), which is a chemical substance.
실시예 4: 타이로시나아제(Tyrosinase) 억제능 (in vitro 미백 효능)Example 4: Tyrosinase inhibition (in vitro whitening efficacy)
더마코커스 프로펀디 BS35F-3의 in vitro 피부 미백 효능을 확인하기 위해 타이로시나아제(tyrosinase) 억제능을 수행하였다. 양성대조군으로는 피부 미백원료로 사용되는 화합물인 아스코르브산(Ascorbic acid, VitaminC) 1 mM과 음성대조군으로는 1XPBS를 사용하여 비교평가 하였다. In order to confirm the in vitro skin whitening efficacy of Dermacoccus Profundi BS35F-3, tyrosinase inhibitory activity was performed. As a positive control group, 1 mM of ascorbic acid (VitaminC), a compound used as a raw material for skin whitening, and 1XPBS as a negative control group were used for comparative evaluation.
피부 노화과정에 있어서 멜라닌 색소의 생성은 피부를 검게하고, 피부 스팟의 원인이 된다. 이러한 멜라닌 합성의 전구체는 도파(DOPA), 도파 퀴논(DOPA quinone)으로 생체 내에서 분해되어 아미노산의 형태인 도파 크롬(DOPA chrome)에서 붉은 계열의 유멜라닌(eumelanine)과 갈색 계열의 페오멜라닌(pheomelanin)으로 합성되어 최종적으로 인체 내에서 멜라닌 색소 생성을 유도한다. 이러한 도파(DOPA) 및 도파 퀴논(DOPA quinone)은 방향족 아미노산인 타이로신(tyrosine)이 생체 내 효소인 타이로시나아제(tyrosinase)에 의해 가수분해 되어 생성된다. 본 실험에서는 타이로시나아제(tyrosinase)의 활성을 억제시켜 in vitro 상에서 미백 효능을 가지는 균주를 확인하고자 진행하였다. 이러한 in vitro 실험법은 화장품 미백제 개발 관련 연구에서 많이 수행되는 효능 확인 방법이며, 이러한 타이로시나아제(tyrosinase) 저해제로 많이 알려진 화장품 원료는 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 아스코르브산(ascorbic acid) 등이 있으며, 본 실험에서는 아스코르브산(ascorbic acid)과의 효능을 비교 선별하였다. In the skin aging process, the production of melanin pigment darkens the skin and causes skin spots. These precursors of melanin synthesis are DOPA and DOPA quinone, which are decomposed in vivo to form DOPA chrome, a form of amino acid, to red eumelanine and brown pheomelanin. ) and finally induces the production of melanin pigment in the human body. DOPA and DOPA quinone are produced by hydrolysis of tyrosine, an aromatic amino acid, by tyrosinase, an enzyme in vivo. In this experiment, the activity of tyrosinase was inhibited to confirm strains having whitening efficacy in vitro. This in vitro test method is a method for confirming efficacy that is often performed in studies related to the development of cosmetic whitening agents, and cosmetic ingredients known as tyrosinase inhibitors are kojic acid, arbutin, and ascorbic acid ), etc., and in this experiment, the efficacy with ascorbic acid was compared and selected.
효소 반응은 먼저 미리 제조한 0.1 M 인산 나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer) 80 μl에 기질인 1.5 mM L-타이로신(L-tyrosine)을 40 μl 첨가한 후 37℃에서 20분간 전-인큐베이션(pre-incubation)하였다. 배양 후 250 U/ml 머쉬룸 타이로시나아제(mushroom tyrosinase) 40 μl와 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주용해물을 40 μl를 첨가하여 다시 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 얼음에 넣어 반응을 종료시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하여 아래와 같은 수식으로 타이로시나아제(tyrosinase) 억제율을 산출하였다. 본 실험의 양성대조구는 앞서 언급한 아스코르브산(ascorbic acid)을 50 μg/mL로 희석하여 사용하였다.The enzyme reaction was first performed by adding 40 μl of 1.5 mM L-tyrosine as a substrate to 80 μl of 0.1 M sodium phosphate buffer prepared in advance, followed by pre-incubation at 37 ° C. for 20 minutes. ) was done. After incubation, 40 μl of 250 U/ml mushroom tyrosinase and 40 μl of Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain lysate were added and reacted again at 37° C. for 20 minutes. After completion of the reaction, after the reaction was terminated by putting it on ice, the absorbance was measured at 475 nm, and the tyrosinase inhibition rate was calculated by the following formula. The positive control of this experiment was used by diluting the aforementioned ascorbic acid to 50 μg/mL.
[식 2] [Equation 2]
Tyrosinase inhibition activity(%)=(1-OD 475 sample)/(OD 475 control)×100Tyrosinase inhibition activity (%) = (1- OD 475 sample ) / ( OD 475 control ) × 100
타이로시나아제(tyrosinase) 억제 효능 확인 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 더마코커스 프로펀디 BS35F-3의 타이로시나아제(tyrosinase) 억제능이 약 39.3%로 확인되었다.The results of confirming the tyrosinase inhibitory effect are shown in FIG. 4 . As can be seen in Figure 4, the tyrosinase (tyrosinase) inhibitory ability of the Dermacoccus Profundi BS35F-3 of the present invention was confirmed to be about 39.3%.
IV. 신규한 피부상재균 균주용해물의 세포 내 독성 평가 IV. Intracellular toxicity evaluation of lysates of novel dermatophyte strains
실시예 5: 피부 세포 내 독성 확인Example 5: Confirmation of toxicity in skin cells
본 연구에서는 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주용해물 처리 시, keratinocyte에 스트레스 요인으로 작용할 수 있는 과산화수소(H2O2)에 의한 세포 독성을 억제 또는 감소시킬 수 있는지 확인하고자 하였다. 세포생존율(cell viability)은 WST-1 assay를 적용하여 확인하였다. 이는 세포 내의 미토콘드리아 탈수소효소(dehydrogenase)와 수용성의 테트라졸륨 염(tetrazolium salt)이 반응하여 형성되는 발색물질인 포르마잔(formazan)을 이용하여 세포생존율을 측정하는 방법이다. 96-웰 플레이트(well plate)에 인체 유래 케라티노사이트(keratinocyte) (1×104 cells/well)를 100 μL씩 접종하여 24시간 배양한 후, 피부 균주 발효용해물을 처리하여 24시간 동안 추가 배양하여, 양이 완료된 96-웰 플레이트에 EZ-Cytox cell viability assay kit reagent 10 μL를 첨가하여 1 h 동안 배양한 다음 microplate reader (Bio-Rad Laboratories, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 도출하여 선별 균주용해물 자체의 세포독성을 먼저 평가하였다. 이후, 과산화수소에 의한 산화 반응 유도를 위해 동일한 방법으로 케라티노사이트(keratinocyte) (1×104 cells/well)를 96-웰 플레이트에 24시간 배양하고, 선별균주 발효용해물을 처리하여 2시간 동안 추가 배양하였다. 이후 100uM의 H2O2을 처리하여 18시간 동안 재배양하였다. 배양이 완료된 96-웰 플레이트는 상기와 동일한 방법으로 WST assay를 적용하여 세포생존율을 도출하였다. In this study, when the lysate of Dermacoccus profundi BS35F-3 strain was treated, it was intended to confirm whether the cytotoxicity caused by hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), which may act as a stress factor for keratinocytes, could be suppressed or reduced. Cell viability was confirmed by applying the WST-1 assay. This is a method of measuring cell viability using formazan, a color developing material formed by reacting mitochondrial dehydrogenase in cells with water-soluble tetrazolium salt. After inoculating 100 μL of human-derived keratinocytes (1×10 4 cells/well) in a 96-well plate and incubating for 24 hours, the skin strain fermentation lysate is treated and added for 24 hours After culturing, 10 μL of EZ-Cytox cell viability assay kit reagent was added to the 96-well plate where the amount was completed and incubated for 1 h, and then the absorbance was measured at 490 nm using a microplate reader (Bio-Rad Laboratories, USA). Cell viability was derived and the cytotoxicity of the selected strain lysate itself was first evaluated. Thereafter, keratinocytes (1×10 4 cells/well) were cultured in a 96-well plate for 24 hours in the same way to induce an oxidation reaction by hydrogen peroxide, and the selected strain fermentation lysate was treated for 2 hours. further cultured. Then, 100uM of H 2 O 2 was treated and re-cultivated for 18 hours. The cultured 96-well plate was subjected to WST assay in the same manner as above to derive cell viability.
미리 제조한 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주용해물과 양성대조군인 알부틴 70 ppm과 비타민C 50 ppm를 적용하여 비교 평가하였다. Comparative evaluation was performed by applying the previously prepared Dermacoccus Profundi BS35F-3 strain lysate and the positive control group arbutin 70 ppm and
실험 결과, 과산화수소 처리 시, 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주용해물에 의한 세포생존율은 대조군인 PBS 처리구보다 우수한 수준으로 확인되었으며, 비교처리군인 알부틴과 유사한 수준의 세포생존율을 확인하였다 (도 5).As a result of the experiment, when treated with hydrogen peroxide, the cell viability by the lysate of Dermacoccus profundi BS35F-3 strain was found to be superior to that of the control group, the PBS treatment group, and a similar level of cell viability to that of the comparison treatment group, arbutin, was confirmed (FIG. 5) .
V. 신규한 피부상재균 피부 3D모델 내 기능성 평가 V. Evaluation of functionality in 3D skin models of new skin flora
본 연구에서는 상용화된 3D 피부 모델인 Neoderm®-ME를 활용하여 in vitro 상에서 피부 개선 효과가 확인된 본 발명의 더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주용해물에 대한 in vivo 대체 효능 평가를 진행하였다. Neoderm®-ME 모델은 한국인 인체 진피세포와 각질세포 그리고 멜라닌 세포가 co-culture된 모델로 인체피부와 생리적, 형태적으로 매우 유사한 모델이다. UV조사 및 약물, 화장품 원료에 의한 독성 및 멜라닌 생성량 변화를 다양한 방법으로 측정이 가능하여 본 연구에 적용되었다. In this study, the in vivo replacement efficacy of the lysate of Dermacoccus profundi BS35F-3 strain, whose skin improvement effect was confirmed in vitro, was evaluated using Neoderm®-ME, a commercialized 3D skin model. The Neoderm®-ME model is a model in which Korean human dermal cells, keratinocytes, and melanocytes are co-cultured, and is physiologically and morphologically very similar to human skin. Toxicity and changes in melanin production caused by UV irradiation and raw materials for drugs and cosmetics can be measured in various ways and applied to this study.
실시예 6: 피부 3D모델 내 세포독성 및 피부 장벽 강화 효능 평가Example 6: Evaluation of cytotoxicity and skin barrier strengthening efficacy in skin 3D model
더마코커스 프로펀디 BS35F-3 균주용해물의 3D 피부모델 내 독성평가는 식약처 가이드라인에 준수하여 평가를 진행하였고, 시험물질의 독성 여부는 MTT assay를 통해 확인하였다. 3D 피부 모델 내 독성을 확인하기 위해 피부에 계면활성 성분인 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 대조군으로 사용하여 평가를 수행하였다.The toxicity evaluation in the 3D skin model of the Dermacoccus profundi BS35F-3 strain lysate was evaluated in compliance with the Ministry of Food and Drug Safety guidelines, and the toxicity of the test substance was confirmed through the MTT assay. In order to confirm toxicity in the 3D skin model, evaluation was performed using SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), a surface active ingredient on the skin, as a control.
MTT assay는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용하여 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 노란색의 테트라졸륨(tetrazolium)의 링(ring) 구조가 끊어진 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포르마잔(formazan)으로 환원되는 원리를 이용하는 방법이다. MTT 용액의 제조는 MTT 1 g을 PBS 40 ml에 혼합하여 0.22 μm 필터링(filtering) 후, 25 mg/ml MTT 스톡 용액(stock solution)을 준비한 후, 49.4 ml의 유지 배지(Maintenance medium) (with serum)와 0.6 ml의 25 mg/ml MTT 스톡 용액(stock solution)을 혼합하여 최종 50 ml의 0.3 mg/ml MTT 작동 용액(working solution)을 제조하였다. 먼저 준비한 BS35F-3 균주용해물과 양성대조군인 5% SDS와 비교처리군인 알부틴(Arbutin) 70 ㎍/㎖을 Neoderm® 모델에 각각 70 ㎕ 처리하여, 7일간 배양 후 세포 독성을 측정하였다. 측정 방법은 배양이 완료된 피부 모델에 유지 배지(Maintenance medium)로 1-2회 세척하여 Neoderm® 내 잔여 물질을 제거하였다. 12 웰 컬쳐 플레이트(well culture plate)에 웰(well)당 2 ml의 0.3 mg/ml MTT 용액(solution)을 첨가한 후, Neoderm®을 상기 준비한 웰(well)로 옮겨 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에서 3시간 배양하였다. 미리 준비한 0.04 N HCl-isopropanol을 1.5 ml 브라운 마이크로튜브(brown microtube)에 500 μl씩 미리 분주해 놓은 후, 배양이 완료된 Neoderm®을 흡수지 위에 올려 여분의 MTT 용액(solution)을 제거하고 8 mm 생검 펀치(biopsy punch)로 Neoderm® 조직을 분리하였다. 분리한 Neoderm® 조직을 0.04N HCl-isopropanol이 분주 된 튜브(tube)에 넣고 교반하여 4시간 동안 탈색시켰다. 이후, 6 웰 플레이트(well plate)에 200 μl씩 옮겨 570±30 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, blank는 0.04 N HCl-isopropanol을 사용하였다. Blank의 흡광도 평균값을 구한 후, 음성대조군 및 비교처리군, 균주처리군의 흡광도 값을 blank 흡광도 평균값으로 빼서 보정된 흡광도 값을 구하였다. 세포생존율(%)은 상기 보정한 음성대조군 흡광도 값에 대한 시험물질 흡광도 값을 백분율로 계산하였다 (식 3). The MTT assay uses 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reagent to generate yellow rings of tetrazolium (tetrazolium) by dehydrogenase in the mitochondria of living cells. It is a method using the principle that the ring) structure is reduced to water-insoluble MTT formazan with a bluish-violet color. To prepare the MTT solution, 1 g of MTT was mixed in 40 ml of PBS, filtered with 0.22 μm, and a 25 mg/ml MTT stock solution was prepared, followed by 49.4 ml of Maintenance medium (with serum). ) and 0.6 ml of 25 mg/ml MTT stock solution to prepare a final 50 ml of 0.3 mg/ml MTT working solution. 70 μl of the previously prepared BS35F-3 strain lysate, 5% SDS as a positive control group, and 70 μg/ml of Arbutin as a comparative treatment group were treated with Neoderm® model, respectively, and cytotoxicity was measured after culturing for 7 days. The measurement method was to wash the cultured skin model 1-2 times with maintenance medium to remove residual substances in Neoderm®. After adding 2 ml of 0.3 mg/ml MTT solution per well to a 12-well culture plate, Neoderm® was transferred to the prepared well at 37°C, 5% CO 2 Incubated for 3 hours in an incubator. After dispensing 500 μl of 0.04 N HCl-isopropanol prepared in advance into a 1.5 ml brown microtube in advance, place the cultured Neoderm® on absorbent paper to remove excess MTT solution and use an 8 mm biopsy punch (biopsy punch) to separate Neoderm® tissue. The separated Neoderm® tissue was placed in a tube dispensed with 0.04N HCl-isopropanol and agitated to decolorize for 4 hours. Thereafter, the absorbance was measured at a wavelength of 570 ± 30 nm by transferring 200 μl to a 6-well plate, and 0.04 N HCl-isopropanol was used as a blank. After obtaining the average value of the absorbance of the blank, the corrected absorbance value was obtained by subtracting the absorbance values of the negative control group, comparative treatment group, and strain treatment group by the average absorbance value of the blank. Cell viability (%) was calculated as a percentage of the absorbance value of the test substance relative to the absorbance value of the corrected negative control group (Equation 3).
[식 3] [Equation 3]
실험 결과, 대조군인 5% SDS 처리구는 대부분의 피부 세포가 사멸하는 것으로 확인되었다. 음성대조군인 PBS 처리구 대비 모든 처리구에서 세포생존율이 유의적으로 감소하였으나, Dermacoccus profundi BS35F-3는 식약처 미백 고시물질인 알부틴과 유사한 수준의 세포생존율을 보였다 (도 6). As a result of the experiment, it was confirmed that most of the skin cells in the control group treated with 5% SDS died. Cell viability was significantly decreased in all treatment groups compared to the negative control PBS treatment group, but Dermacoccus profundi BS35F-3 showed a similar level of cell viability to arbutin, a whitening notice material from the Ministry of Food and Drug Safety (FIG. 6).
실시예 7: 피부 3D모델 내 멜라닌 저해 효과 (정성)Example 7: melanin inhibition effect in skin 3D model (qualitative)
인체의 피부색은 표피와 진피의 경계 부위에 위치한 멜라닌 생성 세포가 합성해내는 멜라닌의 양과 종류에 따라 결정되는 것으로 알려져 있다. 노화나 멜라닌의 과생산에 따라 피부의 생리적 기능이 떨어지게 되면 피부표면에 멜라닌 색소가 침착되면서 일광흑색점 등과 같은 다양한 형태의 과색소침착이 발생한다. 본 발명의 BS35F-3 균주용해물 처리 시, 피부 내 멜라닌 세포 내 멜라닌 색소에 의한 흑색점 생성을 직접적으로 관찰하기 위해 3D 피부 모델상에서 정성적인 평가를 실시하였다.It is known that the skin color of the human body is determined by the amount and type of melanin synthesized by melanin-producing cells located at the boundary between the epidermis and the dermis. When the physiological function of the skin deteriorates due to aging or overproduction of melanin, various types of hyperpigmentation such as solar lentigo occur as melanin pigment is deposited on the skin surface. When the lysate of the BS35F-3 strain of the present invention was treated, a qualitative evaluation was performed on a 3D skin model in order to directly observe the production of black dots by melanin pigment in melanocytes in the skin.
BS35F-3 균주용해물은 독성 평가와 동일한 방법으로 제조하여 동일 농도로 3D 피부모델에 적용하여 실험을 수행하였다. 3D 피부모델 내 인서트(insert)에 붙어있는 피부 조직을 블레이드(blade)로 채취하여 10% 포름알데하이드(formaldehyde)가 담겨있는 e-튜브(e-tube)에 옮겨 담고, 파라핀 섹션(paraffin section)하여 유리 슬라이드에 조직을 부착시켰다. Neoderm® 조직이 붙어있는 슬라이드를 60℃ 건조 오븐(dry oven)에서 1시간 동안 파라핀(paraffin)을 녹인 후, 자일렌(xylene)에 약 15분 동안 3회 담궈 파라핀(paraffin)을 제거하였다. 이후, 95% 에탄올에 2회, 100% 에탄올에 2회 담궈 함수과정을 수행하고, 증류수 챔버에 담궈 잔여물을 세척하였다. Fontana-Masson 염색은 염색 kit 내 프로토콜을 기반으로 수행하였다. 먼저, 조직 내 멜라닌 색소를 탈색시킨 대조군 염색을 진행하였다. 자일렌(xylene)이 담겨있는 챔버에 2분씩 3회 조직이 부착된 슬라이드를 딥핑(dipping) 하였다. 슬라이드를 100% 에탄올이 담겨있는 챔버에 3~5분간 2회 딥핑(dipping)한 후, 95% 에탄올이 담겨있는 챔버에 2분간 딥핑(dipping) 하였다. 증류수에 다시 2분간 담궈 함수하고, 과망간산칼륨(potassium permanganate) 0.5% 용액(solution)을 슬라이드에 소량 떨어뜨려 30분 정도 탈색을 진행하였다. 탈색 후, 증류수로 세척하고, 1% 옥살산(oxalic acid)을 소량 첨가하여 5분간 처리하였다. 조직이 슬라이드에서 떨어지지 않게 증류수로 다시 세척한 후, 은 암모니아(silver ammonia) 용액을 소량 첨가하여 56℃에서 40분간 배양(incubation) 하였다. 증류수로 다시 세척하고, 5% 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 용액으로 2분간 처리한 후, 다시 증류수 세척을 진행하였다. 뉴클리어패스트레드(Nuclear fast red) 용액으로 5분간 세포질을 염색하고, 증류수 세척 후 70% 에탄올로 5회 탈수 과정을 진행하였다. 염색을 마친 슬라이드를 다시 95% 에탄올로 5회 탈수 진행 후, 100% 에탄올로 2분간 1회 탈수하고, 마지막으로 자일렌(xylene)에 2분씩 2회 세척하였다. 조직 슬라이드 위에 자일렌(xylene)과 혼합된 조직관찰 용액을 분주 후 커버 글라스(cover glass)를 씌워 현미경 관찰을 진행하였다. 멜라닌 색소 염색 처리구는 옥살산(oxalic aicd) 처리까지 대조군과 동일하게 실시한 후, 자일렌(xylene)에 10분간 3회 딥핑(dipping)하여 탈파라핀 과정을 수행하였고, 100% 에탄올로 3~5분간 2회 딥핑(dipping) 하고, 다시 95% 에탄올로 2분간 처리, 증류수로 2분간 함수 처리하였다. 이후, 은 암모니아(silver ammonia) 용액 처리부터 대조군과 동일하게 염색을 진행하고, 조직 슬라이드를 관찰하여 대조군과 대비하여 멜라닌 색소가 염색된 결과를 비교 평가하였다. The lysate of the BS35F-3 strain was prepared in the same way as in the toxicity evaluation and applied to the 3D skin model at the same concentration to perform the experiment. The skin tissue attached to the insert in the 3D skin model is collected with a blade, transferred to an e-tube containing 10% formaldehyde, and paraffin sectioned. Tissues were adhered to glass slides. The slides with Neoderm® tissue were melted in a dry oven at 60° C. for 1 hour, and then immersed in xylene three times for about 15 minutes to remove paraffin. Thereafter, soaking in 95% ethanol twice and twice in 100% ethanol was performed to perform a water-retaining process, and the residue was washed by immersing in a distilled water chamber. Fontana-Masson staining was performed based on the protocol in the staining kit. First, control staining was performed to decolorize the melanin pigment in the tissue. The tissue-attached slide was dipped three times for 2 minutes in a chamber containing xylene. The slide was dipped twice for 3 to 5 minutes in a chamber containing 100% ethanol, and then dipped in a chamber containing 95% ethanol for 2 minutes. It was immersed in distilled water for 2 minutes to hydrate, and a small amount of a 0.5% solution of potassium permanganate was dropped on the slide to decolorize for about 30 minutes. After decolorization, it was washed with distilled water and treated for 5 minutes by adding a small amount of 1% oxalic acid. After washing again with distilled water so that the tissue does not fall off the slide, a small amount of silver ammonia solution was added and incubated at 56° C. for 40 minutes. It was washed again with distilled water, treated with a 5% sodium thiosulfate solution for 2 minutes, and then washed with distilled water again. The cytoplasm was stained with Nuclear fast red solution for 5 minutes, washed with distilled water, and dehydrated 5 times with 70% ethanol. The stained slides were dehydrated again with 95
실험 결과, 음성대조군인 PBS 처리구 대비 BS35F-3 균주용해물 처리 시, 멜라닌 색소가 저감되는 것을 육안으로 확인할 수 있다. 특히, 미백 고시 화장품 원료인 알부틴 처리구 대비 선별균주 처리구에서 멜라닌 색소가 우수하게 저감되는 양상을 보였다 (도 7).As a result of the experiment, it can be confirmed with the naked eye that melanin pigment is reduced when the BS35F-3 strain lysate is treated compared to the negative control PBS treatment group. In particular, the melanin pigment was excellently reduced in the selected strain treatment group compared to the arbutin treatment group, which is a raw material for whitening notices (FIG. 7).
실시예 8: 피부 3D모델 내 멜라닌 저해 효과 (정량)Example 8: melanin inhibition effect in skin 3D model (quantitative)
정성평가를 통해 확인된 선별균주 용해물의 멜라닌 저해효과를 정성적으로 확인하기 위한 피부 3D모델 내 평가를 수행하였다. In order to qualitatively confirm the melanin-inhibiting effect of the selected strain lysate confirmed through qualitative evaluation, evaluation was performed in the skin 3D model.
BS35F-3 균주용해물은 독성 평가와 동일한 방법으로 제조하여 동일 농도로 3D 피부모델에 적용하여 실험을 수행하였다. 양성대조군인 알부틴은 독성 평가와 동일하게 70 ㎍/㎖을 처리하였고, 비교군으로 비타민C (Vitamin C) 100 ppm을 처리하여 선별균주 용해물과의 차이를 확인하였다. 멜라닌 색소 정량 방법은 시험물질을 처리한 Neoderm® 조직을 PBS로 2회 세척한 후, Blade를 이용하여 Neoderm®을 인서트(insert)의 가장자리로부터 도려내듯이 분리하였다. 분리한 피부 조직을 1.5 ml e-튜브(e-tube)에 담고 PBS를 완전히 제거하고, e-튜브(e-tube)에 용해 버퍼(lysis buffer)(Solvable™)를 360 μl씩 첨가하였다. 상온에서 5~10분간 반응시킨 후, 인서트 멤브레인(insert membrane)이 피부 조직으로부터 분리되면 포셉(forcep)으로 멤브레인(membrane)을 제거하였다. 이후 95℃의 힛 블록(heat block)에서 45분 배양(incubation)하고, 13,000 rpm, RT, 10분동안 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후 상층액을 1.5 ml e-튜브(e-tube)에 옮겨 준비하였다. 20 mg/ml NH4OH를 이용하여 100 μg/ml 멜라닌(Melanin) 용액을 제조하여 100 μg/ml 멜라닌(Melanin) 용액을 용해 버퍼(lysis buffer)를 이용하여 단계 별 희석하여 표준용액을 준비하였다. 이후, 96 웰 플레이트에 스텐다드(standard) 용액, blank 및 시험물질을 200 μl씩 옮겨 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(405 nm)에서 흡광도를 측정하여, 멜라닌(melanin) 표준곡선을 이용하여 정량하였다. 멜라닌(Melanin) 정량 표준 곡선을 그린 후 시험물질의 흡광도 값을 대입하여 산출하였다.The lysate of the BS35F-3 strain was prepared in the same way as in the toxicity evaluation and applied to the 3D skin model at the same concentration to perform the experiment. Arbutin, a positive control group, was treated with 70 μg/ml in the same manner as in toxicity evaluation, and 100 ppm of vitamin C was treated as a control group to confirm the difference from the lysate of the selected strain. In the melanin pigment quantification method, the Neoderm® tissue treated with the test substance was washed twice with PBS, and then Neoderm® was separated using a blade as if cut out from the edge of the insert. The separated skin tissue was placed in a 1.5 ml e-tube, PBS was completely removed, and 360 μl of lysis buffer (Solvable™) was added to the e-tube. After reacting at room temperature for 5 to 10 minutes, when the insert membrane was separated from the skin tissue, the membrane was removed with forceps. Thereafter, incubation was performed on a heat block at 95° C. for 45 minutes, and centrifugation was performed at 13,000 rpm, RT, and 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was transferred to a 1.5 ml e-tube and prepared. A standard solution was prepared by preparing a 100 μg/ml melanin solution using 20 mg/ml NH 4 OH and diluting the 100 μg/ml melanin solution step by step using a lysis buffer. . Thereafter, 200 μl of the standard solution, the blank, and the test material were transferred to a 96-well plate, and the absorbance was measured in a microplate reader (405 nm), and quantified using a melanin standard curve. After drawing a standard curve for quantification of melanin, it was calculated by substituting the absorbance value of the test substance.
실험 결과, 음성대조군인 PBS 처리구 대비 Dermacoccus profundi BS35F-3의 용해물 처리 시, 대조구 대비 유의적으로 멜라닌 색소량이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 양성대조군인 알부틴의 멜라닌 농도인 5.93 ㎍/㎖보다 더 낮은 농도인 4.28 ㎍/㎖로 확인되어 우수한 미백효능을 확인하였다 (표 4). As a result of the experiment, it was confirmed that the amount of melanin pigment decreased significantly compared to the control group when treated with the lysate of Dermacoccus profundi BS35F-3 compared to the negative control PBS treatment group. In addition, it was confirmed that the melanin concentration of arbutin, which is a positive control, was 4.28 μg / ml, which is lower than the concentration of 5.93 μg / ml, and excellent whitening efficacy was confirmed (Table 4).
<110> CKD Bio Corporation Seoul National University R&DB Foundation <120> Novel Bacterial Strain of Dermacoccus Genus Having Skin Whitening, Collagenesis, Anti-oxidation and/or Anti-bacterial Activity <130> PN200452P <150> KR 10-2021-0020770 <151> 2021-02-16 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1397 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Dermacoccus profundi <400> 1 ccatgcagtc gaacgatgaa gcgccagctt gctggtgtgg attagtggcg aacgggtgag 60 taacacgtga gtaacctgcc ccctactctg ggataagcct gggaaactgg gtctaatact 120 ggatatgacc aatcactgca tggtgtgttg gtggaaagat tttttggtgg gggatggact 180 cgcggcctat cagcttgttg gtggggtaat ggcctaccaa ggcgacgacg ggtagccggc 240 ctgagagggc gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300 cagtggggaa tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga 360 cggccttcgg gttgtaaacc tctttcacca gggacgaagc taacgtgacg gtacctggag 420 aagaagcacc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg cgagcgttgt 480 ccggaattat tgggcgtaaa gagctgtagg cggtttgtcg cgtctgctgt gaaagaccgg 540 ggcttaactc cggttctgca gtgggtacgg gcagactaga gtatggtagg ggagactgga 600 attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccgatgg cgaaggcagg 660 tctctgggcc attactgacg ctgagaagcg aaagcatggg gagcgaacag gattagatac 720 cctggtagtc catgccgtaa acgttgggcg ctaggtgtgg ggctcattcc acgagttccg 780 tgccgcagct aacgcattaa gcgccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca 840 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg 900 aagaacctta ccaaggcttg acatacaccg gaatcatgca gagatgtgtg cgtcttcgga 960 ctggtgtaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1020 ccgcaacgag cgcaaccctc gttccatgtt gccagcacgt catggtgggg actcatggga 1080 gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1140 tcttgggctt cacgcatgct acaatggccg gtacagaggg ttgcgaaact gtgaggtgga 1200 gctaatccca aaaaaccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt 1260 cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac gctgcggtga atacgttccc gggccttgta 1320 cacaccgccc gtcaagtcac gaaagttggt aacacccgaa gccggtggcc taacccttgt 1380 ggggggagcc gtcgaag 1397 <110> CKD Bio Corporation Seoul National University R&DB Foundation <120> Novel Bacterial Strain of Dermacoccus Genus Having Skin Whitening, Collagenesis, Anti-oxidation and/or Anti-bacterial Activity <130> PN200452P <150> KR 10-2021-0020770 <151> 2021-02-16 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1397 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Dermacoccus profundi <400> 1 ccatgcagtc gaacgatgaa gcgccagctt gctggtgtgg attagtggcg aacgggtgag 60 taacacgtga gtaacctgcc ccctactctg ggataagcct gggaaactgg gtctaatact 120 ggatatgacc aatcactgca tggtgtgttg gtggaaagat tttttggtgg gggatggact 180 cgcggcctat cagcttgttg gtggggtaat ggcctaccaa ggcgacgacg ggtagccggc 240 ctgagagggc gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300 cagtgggggaa tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga 360 cggccttcgg gttgtaaacc tctttcacca gggacgaagc taacgtgacg gtacctggag 420 aagaagcacc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg cgagcgttgt 480 ccggaattat tgggcgtaaa gagctgtagg cggtttgtcg cgtctgctgt gaaagaccgg 540 ggcttaactc cggttctgca gtgggtacgg gcagactaga gtatggtagg ggagactgga 600 attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccgatgg cgaaggcagg 660 tctctgggcc attactgacg ctgagaagcg aaagcatggg gagcgaacag gattagatac 720 cctggtagtc catgccgtaa acgttgggcg ctaggtgtgg ggctcattcc acgagttccg 780 tgccgcagct aacgcattaa gcgccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca 840 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg 900 aagaacctta ccaaggcttg acatacaccg gaatcatgca gagatgtgg cgtcttcgga 960 ctggtgtaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1020 ccgcaacgag cgcaaccctc gttccatgtt gccagcacgt catggtgggg actcatggga 1080 gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1140 tcttgggctt cacgcatgct acaatggccg gtacagaggg ttgcgaaact gtgaggtgga 1200 gctaatccca aaaaaccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt 1260 cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac gctgcggtga atacgttccc gggccttgta 1320 cacaccgccc gtcaagtcac gaaagttggt aacacccgaa gccggtggcc taacccttgt 1380 ggggggagcc gtcgaag 1397
Claims (10)
Deposited with accession number KCTC18883P, Dermacoccus profundi ( Dermacoccus profundi ) BS35F-3 strain.
The strain according to claim 1, characterized in that it has skin whitening, intradermal collagen production, antioxidant or anti-Cutibacterium acnes activity.
A cosmetic composition for skin whitening comprising the strain according to claim 1.
A cosmetic composition for intradermal collagen production comprising the strain according to claim 1.
Antioxidant cosmetic composition comprising the strain according to claim 1.
An antibacterial cosmetic composition against Cutibacterium acnes comprising the strain according to claim 1.
A cosmetic composition for preventing or improving skin wrinkles comprising the composition according to claim 4.
A cosmetic composition for preventing or improving acne comprising the composition according to claim 6.
An antibacterial pharmaceutical composition for Cutibacterium acnes comprising the strain according to claim 1.
A pharmaceutical composition for preventing or treating acne caused by Cutibacterium acnes, comprising the composition according to claim 9.
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