KR102516254B1 - Screening method of microorganisms producing lactobionic acid - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토비온산 (lactobionic acid) 생산능을 갖는 미생물을 고속 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 락토비온산 생산능을 갖는 미생물의 고속 스크리닝 방법을 이용하게 되면, 대량 라이브러리로부터 락토비온산 생산능 보유 미생물 및 락토오스 옥시데이즈 (lactose oxidizing enzyme) 활성 효소를 고속으로 탐색할 수 있게 되어, 이를 활용한 락토비온산 대량 생산에 따른 산업적으로 활용이 가능하다. The present invention relates to a method for high-speed screening of microorganisms having lactobionic acid-producing ability. When the high-speed screening method of microorganisms having lactobionic acid-producing ability of the present invention is used, it is possible to quickly search for microorganisms having lactobionic acid-producing ability and lactose oxidizing enzyme active enzymes from a large library, It can be used industrially according to mass production of lactobionic acid using this.
Description
본 발명은 락토비온산 생산 미생물 동정용 평판배지 및 이를 이용한 락토비온산 생산 미생물의 동정 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a plate medium for identifying lactobionic acid-producing microorganisms and a method for identifying lactobionic acid-producing microorganisms using the same.
차세대 피부미백 소재로서의 폴리하이드록시 비온산(polyhydroxy bionic acid)의 한 종류인 락토비온산(lactobionic acid)은 α-하이드록시산이 가지고 있는 각질제거, 주름개선, 피부미백 효과 외에 생분해성, 생체친화성, 항노화성, 항산화성, 보습성, 킬레이트성 등의 다양한 특성을 가지고 있으며, 피부에 대한 자극이 적어 글리콜릭산, 젖산을 대체할 수 있는 차세대 화장품 소재로서 매우 주목 받고 있으며, 락토비온산이 함유된 화장품이 상용화되어 현재 판매되고 있다.Lactobionic acid, which is a type of polyhydroxy bionic acid as a next-generation skin whitening material, is biodegradable and biocompatible, in addition to the dead skin removal, wrinkle improvement, and skin whitening effects of α-hydroxy acid. , anti-aging, anti-oxidation, moisturizing, chelating, etc., and has less irritation to the skin, attracting attention as a next-generation cosmetic material that can replace glycolic acid and lactic acid. Cosmetics containing lactobionic acid It has been commercialized and is currently being sold.
락토비온산은 갈락토오스(galactose)와 글루콘산(gluconic acid)이 β-1,4 결합으로 형성된 물질로서, 분자량은 358.3이고, 수용성 백색 결정질 화합물이다. 락토비온산은 젖당 중의 유리 알데히드기의 산화반응에 의해 합성될 수 있는데, 이에 현재 화학적, 전기화학적, 촉매반응 또는 생물학적 산화에 의한 생산 연구가 많이 되고 있다. [문헌 Satory et al., Biotechnology letters 19(12) 1205-08, 1997]. Lactobionic acid is a substance formed by a β-1,4 bond between galactose and gluconic acid, and has a molecular weight of 358.3 and is a water-soluble white crystalline compound. Lactobionic acid can be synthesized by an oxidation reaction of a free aldehyde group in lactose, and thus, many studies on its production by chemical, electrochemical, catalytic or biological oxidation are being conducted. Satory et al., Biotechnology letters 19(12) 1205-08, 1997.
이중 식품과 화장품 원료로 락토비온산의 관심과 쓰임에 대응하기 위하여 환경친화적인 미생물 배양법을 통한 생물학적 락토비온산 생산 연구가 집중적으로 진행되고 있으며, 현재까지 대표적인 락토비온산 생산 미생물 균주로 Pseudomonas taetrolens, Buckholderia cepacia, 및 Zymomonas mobilis 등이 보고되고 있다. 하지만 지금까지 보고된 락토비오산 생산성이 가장 높은 균주는 Buckholderia cepacia으로 이는 병원성 균주로 분류되어 있는 균주로써 산업적인 활용이 불가능하다는 문제점을 가지고있다.Among them, in order to respond to the interest and use of lactobionic acid as a raw material for food and cosmetics, research on biological lactobionic acid production through an environmentally friendly microbial culture method is being intensively conducted. Buckholderia cepacia, and Zymomonas mobilis have been reported. However, Buckholderia cepacia is the strain with the highest lactobioic acid productivity reported so far, which is classified as a pathogenic strain and has a problem that industrial utilization is impossible.
이에 따라, 본 발명자들의 선행 출원인, 대한민국 공개특허 제 10-2018-0047470호는 비병원성 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens) 균주의 배양 방법 최적화 연구를 통해 젖당으로부터 락토비온산 산화반응을 촉진시킴으로써 락토비온산 생산성을 증가시키는 방법을 개시한 바가 있으나, 슈도모나스 테트로렌스 균주 만의 연구에 한계가 있다. Accordingly, Korean Patent Laid-open Publication No. 10-2018-0047470, a prior application of the present inventors, promotes lactobionic acid oxidation from lactose through a study on optimizing the cultivation method of a non-pathogenic Pseudomonas taetrolens strain, resulting in lactobionic acid productivity. However, there are limitations to research on only Pseudomonas tetrorens strains.
스크리닝과 유전공학은 신규 균주의 탐색에 중요한 기여를 하기 위해 이용되고 있다[문헌 Rowlands, Enzyme and Microbial Technology 6(7), 290-300, 1984]. 본 발명은 슈도모나스 테트로렌스와 같은 비병원성 균주에 속하고, 락토비온산 생산능이 우수한 신규 균주를 고속 스크리닝하는 방법을 개발하여, 락토비온산 생산 연구의 어려움인 균주 확보 문제를 해결하고 산업 균주로서의 활용가치를 높이기 위해서 활성 높은 균주의 고속 탐색 방법에 중점을 두었다. Screening and genetic engineering are being used to make important contributions to the search for new strains (Rowlands, Enzyme and Microbial Technology 6(7), 290-300, 1984). The present invention solves the problem of securing strains, which is a difficulty in lactobionic acid production research, by developing a method for high-speed screening of new strains belonging to non-pathogenic strains such as Pseudomonas tetrorens and having excellent lactobionic acid-producing ability, and using them as industrial strains. In order to increase the activity, we focused on a high-speed search method for highly active strains.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. A number of documents are referenced throughout this specification and citations are indicated. The disclosure contents of the cited documents are incorporated herein by reference in their entirety to more clearly describe the content of the present invention and the level of the technical field to which the present invention belongs.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 락토비온산 생산능을 갖는 한정된 균주의 활용의 한계를 해결하고자, 락토비온산 생산능을 갖는 신규 균주 고속 탐색 방법을 제공하는 것이다. The present invention was made to solve the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to solve the limitation of utilization of limited strains having lactobionic acid-producing ability, and to provide a high-speed search method for new strains having lactobionic acid-producing ability. is to do
본 발명의 다른 목적은 젖당이 포함된 평판배지에 CaCO3를 혼탁시켜 락토비온산이 생산되면서 낮아지는 pH변화에 의해 생기는 CaCO3의 용해 여부에 따른 활성대를 확인함으로써, 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 동정하는데 사용할 수 있는 평판배지를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to turbidize CaCO 3 in a plate medium containing lactose to produce lactobionic acid, thereby confirming the active zone according to the dissolution of CaCO 3 caused by the lowering pH change, thereby having the ability to produce lactobionic acid. It is to provide a plate medium that can be used to identify microorganisms.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토비온산 생산 미생물(lactobionic acid-producing microorganisms) 동정용 평판배지의 제조방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a plate medium for identifying the lactobionic acid-producing microorganisms.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 평판배지를 사용하여 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 분리하는 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for isolating microorganisms capable of producing lactobionic acid using the plate medium.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. Further objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description, claims and drawings.
본 발명의 하나의 관점은 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 동정하는 방법으로서, (a) 희석한 시료를 증류수, 젖당 및 탄산칼슘(CaCO3)이 포함된 평판배지 상에 도말 및 배양하는 단계; 및 (b) 상기 평판배지 상에서 활성대(clear zone) 영역을 형성하는 적어도 하나의 단일 콜로니 미생물을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 동정하는 방법을 제공하는 것이다.One aspect of the present invention is a method for identifying microorganisms having the ability to produce lactobionic acid, comprising the steps of: (a) smearing and culturing a diluted sample on a plate medium containing distilled water, lactose and calcium carbonate (CaCO 3 ); ; And (b) obtaining at least one single colony microorganism forming a clear zone region on the plate medium. is to do
상기 방법은 단계 (b)에서 획득한 미생물의 락토비온산 생산 능력을 젖당 포함 배지 상에서 모니터링하는 단계를 더 포함할 수 있다.The method may further include monitoring the ability of the microorganism obtained in step (b) to produce lactobionic acid on a lactose-containing medium.
본 발명의 방법은 상기 평판배지에 탄산칼슘이 포화되어 있어 락토비온산 생산 시 탄산칼슘의 용해여부를 확인하여 활성대를 선별 가능하게 하는 데, 구체적으로 젖당이 포함된 평판배지에 CaCO3를 과포화가 되도록 혼탁시켜 락토비온산이 생산되면서 낮아지는 pH변화에 의해 생기는 CaCO3의 용해 여부에 따른 활성대(clear zone) 영역을 확인함으로써, 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 동정할 수 있다.In the method of the present invention, since the plate medium is saturated with calcium carbonate, it is possible to select an active zone by checking the dissolution of calcium carbonate during production of lactobionic acid. Specifically, the plate medium containing lactose is supersaturated with CaCO 3 Microorganisms having the ability to produce lactobionic acid can be identified by confirming the clear zone region according to the dissolution of CaCO 3 caused by the pH change that is lowered while lactobionic acid is produced.
아세트산 박테리아 및 젖산 박테리아 동정 시에는, 클리어링 존 형성을 돕기 위해 탄산 칼슘을 소량(약 0.5 중량% 정도) 배지에 첨가할 수 있지만, 본 발명자들은 이러한 종전의 배지로는 락토비온산 생산이 육안으로 뚜렷하게 식별되지 않는 문제점이 있음을 밝혀내었다. When identifying acetic acid bacteria and lactic acid bacteria, a small amount (about 0.5% by weight) of calcium carbonate can be added to the medium to help form a clearing zone, but the present inventors found that lactobionic acid production was not clearly visible with the naked eye with such a conventional medium. It turned out that there was an unidentified problem.
아세트산 및 젖산 등과는 달리, 락토비온산 생산에 의한 활성대(clear zone) 영역이 육안으로 뚜렷하게 식별되기 위해서는, 상기 평판배지에 탄산칼슘이 과포화되어 있어야 하는데, 상기 평판배지에 포함되는 탄산칼슘은 증류수 1 L를 기준으로 0.1 g 초과 내지 20 g 미만의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 증류수 1 L를 기준으로 0.5~15 g, 또는 1~10 g, 더 바람직하게는 증류수 1 L를 기준으로 3~8 g의 함량으로 포함될 수 있다.Unlike acetic acid and lactic acid, in order for the clear zone region produced by lactobionic acid production to be clearly identified with the naked eye, the plate medium must be supersaturated with calcium carbonate. The calcium carbonate contained in the plate medium is distilled water It may be included in an amount of more than 0.1 g and less than 20 g based on 1 L, preferably 0.5 to 15 g, or 1 to 10 g based on 1 L of distilled water, more preferably 3 g based on 1 L of distilled water It can be included in an amount of ~8 g.
평판배지에 포함되는 탄산칼슘의 함량이 증류수 1 L를 기준으로 0.1 g 이하거나, 20 g 이상인 경우, 락토비온산 생산이 육안으로 뚜렷하게 식별되지 아니하며, 그러한 평판배지에서 활성대를 형성하는 콜로니는 아세트산 박테리아, 젖산균과 같은 다른 산 생성 균주의 것일 수 있어서, 이러한 평판배지를 사용해서는 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 고속으로 동정할 수 없다. 이는 락토비온산이 폴리하이드록시 산으로서 수용해성이 높고, 아세트산 등 다른 종류의 산보다 약산이어서 평판배지에 포함되는 탄산칼슘의 함량이 락토비온산에 의해 육안으로 식별가능할 정도로 명확한 클리어링 존을 형성할 수 있는지 여부에 결정적인 영향을 주는 것으로 평가된다.When the content of calcium carbonate contained in the plate medium is 0.1 g or less or 20 g or more based on 1 L of distilled water, lactobionic acid production is not clearly identified with the naked eye, and colonies forming active zones in such plate medium are acetic acid It may be from other acid-producing strains such as bacteria and lactic acid bacteria, so microorganisms having lactobionic acid-producing ability cannot be rapidly identified using such a plate medium. This is because lactobionic acid is a polyhydroxy acid that has high water solubility and is weaker than other acids such as acetic acid, so that the content of calcium carbonate contained in the plate medium can be visually identified by lactobionic acid. Can form clearing zones. It is evaluated as having a decisive influence on whether or not there is a
바람직한 구현예에서, 상기 평판배지는 영양배지(nutrient broth), 젖당(lactose), 한천(agar), 탄산칼슘(CaCO3) 및 증류수를 포함하고, 증류수 1 L를 기준으로 탄산칼슘을 0.1 g 초과 내지 20 g 미만으로 포함하는 것일 수 있다.In a preferred embodiment, the plate medium includes nutrient broth, lactose, agar, calcium carbonate (CaCO 3 ) and distilled water, and contains more than 0.1 g of calcium carbonate based on 1 L of distilled water. to less than 20 g.
또한, 본 발명은 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 동정하는 방법으로서, (a) 상기 방법은 미생물의 적어도 하나의 콜로니가 배치되는 평판배지 상의 영역을 나타내는 샘플 취득 단계; (b) 상기 미생물의 적어도 하나의 콜로니가 CaCO3 및 젖당 포함 평판배지 상에서 활성대 (clear zone) 영역을 나타내어 동정하는 단계 및 (c) 상기 미생물이 젖당 포함 액상배지 상에서 락토비온산 생산의 능력을 모니터링하는 단계를 포함하는 락토비온산 생산이 가능한 균주 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for identifying microorganisms having lactobionic acid-producing ability, comprising: (a) acquiring a sample representing a region on a plate medium in which at least one colony of the microorganism is disposed; (b) identifying at least one colony of the microorganism by showing a clear zone region on a plate medium containing CaCO 3 and lactose; and (c) measuring the ability of the microorganism to produce lactobionic acid on a liquid medium containing lactose. It provides a method for screening strains capable of producing lactobionic acid comprising the step of monitoring.
본 발명에 있어서, 상기 미생물 샘플링이라 함은 산업적으로 유용한 효소인 락토오스 옥시데이즈 활성을 가지는 미생물을 스크리닝 하기 위해 준비된 토양, 슬러지, 하폐수, 음폐수, 생활하수, 산업 폐수, 농축산 폐수, 분뇨, 퇴비 등에서 시료를 채취하는 것일 수 있다.In the present invention, the microbial sampling refers to soil, sludge, wastewater, food wastewater, domestic sewage, industrial wastewater, agricultural and livestock wastewater, manure, compost, etc. prepared to screen microorganisms having lactose oxidase activity, which is an industrially useful enzyme. It may be taking a sample.
본 발명의 다른 관점은 락토비온산 생산 미생물(lactobionic acid-producing microorganisms) 동정용 평판배지를 제공하는 것이다.Another aspect of the present invention is to provide a plate medium for identifying lactobionic acid-producing microorganisms.
상기 평판배지는 영양배지(nutrient broth), 젖당(lactose), 한천(agar), 탄산칼슘(CaCO3) 및 증류수를 포함하는 것으로서, 평판배지에 탄산칼슘이 포화되어 있어 락토비온산 생산 시 탄산칼슘의 용해여부를 확인하여 활성대를 선별 가능하게 할 수 있다.The plate medium includes a nutrient broth, lactose, agar, calcium carbonate (CaCO 3 ) and distilled water, and calcium carbonate is saturated in the plate medium to produce calcium carbonate when lactobionic acid is produced. It is possible to select an active zone by checking whether the is dissolved.
상기 평판배지는 증류수 1 L를 기준으로 탄산칼슘을 0.1 g 초과 내지 20 g 미만의 함량으로 포함할 수 있으며, 증류수 1 L를 기준으로 영양배지 0.1~5 g, 젖당(lactose) 0.1~300 g, 효모 추출물(yeast extract) 0.5~5 g, 펩톤(peptone) 1~10 g, 염화나트륨(NaCl) 1~10 g 및 아가(agar) 파우더 5 ~30g을 포함하는 것일 수 있다.The plate medium may contain calcium carbonate in an amount greater than 0.1 g and less than 20 g based on 1 L of distilled water, 0.1 to 5 g of nutrient medium, 0.1 to 300 g of lactose, It may include 0.5-5 g of yeast extract, 1-10 g of peptone, 1-10 g of sodium chloride (NaCl), and 5-30 g of agar powder.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 락토비온산 생산 미생물(lactobionic acid-producing microorganisms) 동정용 평판배지의 제조방법을 제공하는 것이다.Another aspect of the present invention is to provide a method for preparing a plate medium for identifying the lactobionic acid-producing microorganisms.
상기 제조방법은 증류수 1 L에 영양배지 0.1~5 g, 젖당(lactose) 0.1~300 g, 효모 추출물(yeast extract) 0.5~5 g, 펩톤(peptone) 1~10 g, 염화나트륨(NaCl) 1~10 g 및 아가(agar) 파우더 5~30g을 첨가하여 용해시키는 단계; 상기 용해된 용액을 멸균시키는 단계; 상기 멸균된 용액에 멸균된 탄산칼슘 파우더 0.1 g 초과 내지 20 g 미만을 첨가하여 혼탁시키는 단계; 및 상기 혼탁시킨 배지를 평판에 담아 응고시키는 단계를 포함할 수 있다. The above production method is distilled water 1 L nutrient medium 0.1 ~ 5 g, lactose (lactose) 0.1 ~ 300 g, yeast extract (yeast extract) 0.5 ~ 5 g, peptone (peptone) 1 ~ 10 g, sodium chloride (NaCl) 1 ~ Dissolving by adding 10 g and 5 to 30 g of agar powder; sterilizing the dissolved solution; turbidity by adding more than 0.1 g to less than 20 g of sterilized calcium carbonate powder to the sterilized solution; and coagulating the turbid medium by putting it on a flat plate.
더욱 상세하게는 증류수 1 L를 기준으로, 영양배지로서 비프추출물 (Beef extract) 1 g, 효모추출물 (yeast extract) 2 g, 펩톤 5 g, 염화나트륨 (NaCl) 5 g 및 아가 (agar) 파우더 15 g 비율로 첨가하여 용해시켜 autoclave 에서 121℃로 15분간 가압 멸균 후 따로 멸균된 5 g의 탄산칼슘 파우더를 혼합하여 평판배지를 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.More specifically, based on 1 L of distilled water, 1 g of beef extract, 2 g of yeast extract, 5 g of peptone, 5 g of sodium chloride (NaCl) and 15 g of agar powder as a nutrient medium After adding and dissolving in an autoclave at 121 ° C. for 15 minutes, a plate medium can be prepared by mixing 5 g of separately sterilized calcium carbonate powder, but is not limited thereto.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 락토비온산 생산 미생물(lactobionic acid-producing microorganisms) 동정용 평판배지를 사용하여 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect of the present invention is to provide a method for isolating microorganisms having lactobionic acid-producing ability by using a plate medium for identifying the lactobionic acid-producing microorganisms.
상기 분리 방법은 락토비온산 생산능이 없는 대장균을 음성 대조군(negative control)으로, 락토비온산 생산능을 갖는 균주로서 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens sp.) 균주를 양성 대조군 (positive control)으로 사용하여, 락토비온산 생산 시 탄산칼슘의 용해 여부에 따른 활성대를 상기 평판배지에서 확인함으로써, 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 분리할 수 있다.The separation method uses E. coli without lactobionic acid-producing ability as a negative control and Pseudomonas taetrolens sp. as a strain having lactobionic acid-producing ability as a positive control, When producing lactobionic acid, microorganisms having lactobionic acid-producing ability can be isolated by confirming the active zone according to the dissolution of calcium carbonate in the plate medium.
본 발명의 일 구현예에 있어서 락토비온산 생산능을 갖는 균주를 배양하는 단계에서는 1내지 20 부피% 농도의 젖당을 포함하고, 0.2 부피% 효모추출물과 0.5 부피% 펩톤 그리고 0.1 부피% 소고기추출물을 포함하고, 0.5 부피% NaCl을 포함한다. 상기 배양하는 단계는 NB 배지 50 mL 내지 2.0 L, 20 ℃ 내지 37 ℃에서 48 내지 120시간 동안 배양시키는 것일 수 있다. 필요에 따라, 배양은 젖당 농도에 따라 배양할 수 있고, pH 보정물질인 CaCO3 존재 하의 배양 배지에서, 예를 들면 배지에 젖당 농도를 10 g/L 에서 300 g/L까지 다양하게 사용할 수 있고, CaCO3 첨가 또는 미첨가 상태로 수행될 수 있다.In one embodiment of the present invention, in the step of culturing a strain having lactobionic acid-producing ability, lactose is included at a concentration of 1 to 20% by volume, 0.2% by volume yeast extract, 0.5% by volume peptone and 0.1% by volume beef extract and contains 0.5% NaCl by volume. The culturing step may be culturing for 48 to 120 hours in 50 mL to 2.0 L of NB medium at 20 °C to 37 °C. If necessary, the culture can be cultured according to the lactose concentration, and in the culture medium in the presence of CaCO 3 as a pH corrector, for example, the lactose concentration in the medium can be varied from 10 g / L to 300 g / L, , CaCO 3 may be added or not added.
바람직한 구현 예에서, 본 발명의 배양은 회분식 배양 (batch culture) 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한 된 것은 아니다. In a preferred embodiment, the culturing of the present invention may be performed by a batch culture method, but is not limited thereto.
또한, 본 발명의 구현 예에 있어서, 상기 슈도모나스 테트로렌스 균주의 배양을 통한 생산성 향상 방법은 대한민국 공개특허공보 제10-2018-0047470호에 개시된 내용과 같이 개발 될 수 있으며, 대한민국 공개특허공보 제10-2018-0047470호에 개시된 내용 전체는 본원 명세서에 참고로서 포함된다. In addition, in an embodiment of the present invention, the productivity improvement method through the cultivation of the Pseudomonas tetrorens strain may be developed as disclosed in Korean Patent Publication No. 10-2018-0047470, and Korean Patent Publication No. 10 The entire content disclosed in -2018-0047470 is incorporated herein by reference.
본 발명의 락토비온산 생산능을 갖는 미생물의 고속 스크리닝 방법을 이용하게 되면, 대량 라이브러리로부터 락토비온산 생산능 신규 미생물 및 락토오스 옥시데이즈 효소 활성을 고속으로 탐색할 수 있게 되어, 이를 활용한 락토비온산 대량생산 공정에서 생산속도를 향상시킴으로써 다양한 산업분야에 효율적으로 이용될 수 있다. When the method for high-speed screening of microorganisms capable of producing lactobionic acid of the present invention is used, novel microorganisms capable of producing lactobionic acid and lactose oxidase enzyme activity can be rapidly screened from a large-scale library. It can be efficiently used in various industrial fields by improving the production speed in the acid mass production process.
도 1은 젖당 포함 한천 배지에 탄산칼슘을 섞어 혼탁 평판배지 만드는 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 혼탁 평판배지에 양성대조군인 야생형 슈도모나스 테트로렌스 균주를 배양하여 나타난 활성대를 날짜에 따른 변화를 나타낸 결과이다.
도 3은 평판배지에서 활성대의 생성 여부에 따른 락토비온산 생산능을 갖는 균주를 선별하는 결과이다. M10번, M12번, O5번 콜로니에서 활성대를 형성하여 이를 락토비온산 생산능이 있는 후보 균주로 분리하였다.
도 4는 평판배지에서 활성대를 갖지 않는 균주(A, negative control), 기존 락토비온산 생산능을 갖는다고 알려진 슈도모나스 테트로렌스(B, positive control) 및 평판배지에서 활성대를 갖는 균주(C)의 젖당 발효 결과를 나타낸 HPLC 피크 그래프이다.
도 5는 호기 발효조건에서 활성대를 갖는 선별된 여러 균주들의 성장 (A), 젖당 대사 (B)와 락토비온산 생산 (C) 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 1 shows a schematic diagram of a method for making a turbid plate medium by mixing calcium carbonate with lactose-containing agar medium.
Figure 2 is a result showing the change according to the date of the active zone shown by culturing the wild-type Pseudomonas tetrorens strain, which is a positive control, on a turbid plate medium.
3 is a result of screening strains having lactobionic acid-producing ability according to whether or not an active zone is generated in a plate medium. Active zones were formed in colonies M10, M12, and O5, and they were isolated as candidate strains capable of producing lactobionic acid.
Figure 4 is a strain (A, negative control) that does not have an active zone in the plate medium, Pseudomonas tetrorens (B, positive control) known to have an existing lactobionic acid-producing ability, and a strain (C) that has an active zone in the plate medium It is an HPLC peak graph showing the results of lactose fermentation.
Figure 5 is a graph showing the growth (A), lactose metabolism (B) and lactobionic acid production (C) results of several selected strains having active zones under aerobic fermentation conditions.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예Example
실시예 1. 탄산칼슘 및 젖당 포함 혼탁 평판 배지 제조Example 1. Preparation of turbid plate medium containing calcium carbonate and lactose
도 1은 본 발명의 탄산칼슘 및 젖당 포함 혼탁 평판 배지 제조방법에 모식도를 나타낸다. 평판 배지의 성분으로 영양배지(nutrient broth), 젖당(lactose), 한천(agar) 및 증류수를 포함시키고, 여기에 락토비온산 생산시 CaCO3의 용해 여부를 확인하여 균주의 활성대 형성으로 활성을 선별가능하게 하도록 탄산칼슘(CaCO3)을 추가한 평판 배지를 사용하였다. 구체적으로, 증류수 1 L를 기준으로, 영양배지로서 비프추출물 (beef extract) 1 g, 효모추출물(yeast extract) 2 g, 펩톤 5 g, 염화나트륨 (NaCl) 5 g 및 한천(agar) 파우더 15 g, 젖당 (lactose) 200 g 비율로 첨가하여 용해시켜 autoclave 에서 121 ℃로 15분간 가압 멸균 후, 따로 멸균된 탄산칼슘 파우더를 0.1 g(평판배지 1), 5 g(평판배지 2), 또는 20 g(평판배지 3) 비율로 혼합하여 제조하였다. 상기 혼탁된 배지를 각각 페트리디쉬에 20 mL 분량으로 담아 응고시키는 과정으로 탄산칼슘 및 젖당 포함 혼탁 평판배지 1 내지 3을 제조하였다. 1 shows a schematic diagram of a method for preparing a turbid plate medium containing calcium carbonate and lactose according to the present invention. Nutrient broth, lactose, agar, and distilled water are included as components of the plate medium, and the dissolution of CaCO 3 during lactobionic acid production is checked to determine the activity by forming the active zone of the strain. A plate medium to which calcium carbonate (CaCO 3 ) was added was used to enable selection. Specifically, based on 1 L of distilled water, 1 g of beef extract, 2 g of yeast extract, 5 g of peptone, 5 g of sodium chloride (NaCl) and 15 g of agar powder as a nutrient medium, After adding and dissolving lactose at a rate of 200 g and autoclaving at 121 ° C for 15 minutes, separately sterilized calcium carbonate powder was added with 0.1 g (plate medium 1), 5 g (plate medium 2), or 20 g ( It was prepared by mixing in the ratio of plate medium 3).
실시예 2. 탄산칼슘 및 젖당 포함 혼탁 평판배지의 활성대 형성 확인Example 2. Confirmation of active zone formation of turbid plate medium containing calcium carbonate and lactose
락토비온산 생산 균주로 알려진 슈도모나스 테트로렌스(한국생명공학연구원 생물자원센터에서 P. taetrolens KCTC 12501 균주를 분양받음)를 사용하여, 락토비온산의 CaCO3 용해에 따른 활성대를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하였다. 평판배지 2를 사용하여 실험한 결과, 도 2에서 보여지는 것과 같이 약 8일 이후 획선도말(streaking)된 부분 모두 CaCO3 용해에 따른 활성대를 나타내지는 것을 확인함으로써, 락토오스 옥시다이징 효소를 갖는 균주는 락토비온산 생산 시 pH변화에 따른 CaCO3의 용해 여부에 의해 활성대를 형성하는 것으로 락토비온산 생산능을 보유한 균주 분리 방법을 확립하였다. 반면에 평판배지 1 및 3을 사용한 경우는 CaCO3 용해에 따른 활성대가 육안으로 뚜렷하게 확인되지는 않았다. Using Pseudomonas tetrorens known as a lactobionic acid-producing strain (received P. taetrolens KCTC 12501 strain from the Biological Resource Center of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology), it was investigated whether an active zone according to CaCO 3 dissolution of lactobionic acid could be displayed. Confirmed. As a result of the experiment using
실시예 3. 락토비온산 생산능 보유 균주 분리 과정Example 3. Isolation process of strains possessing lactobionic acid production ability
플레이트 상의 영역에서 활성대를 보이지 않는 락토비온산 생산능이 없는 대장균을 음성 대조군 (negative control)으로, 락토비온산 생산능을 갖는 균주로서 슈도모나스 테트로렌스를 양성 대조군으로(positive control) 사용하였다. Escherichia coli without lactobionic acid-producing ability showing no active zone in the region on the plate was used as a negative control, and Pseudomonas tetrorens as a strain having lactobionic acid-producing ability was used as a positive control.
신규 균주를 분리하기 위한 샘플은 울산광역시 용산 하수처리장과 용연 하수처리장 및 울주군 문수산 토양으로부터 획득하였고, 각 시료 1 g을 멸균한 생리식염수 10 mL에 첨가하고 이를 10 -1, 10 -2 배로 희석한 샘플을 볼텍스(vortex)로 충분히 혼합한 후, 각 시료를 LB-agar 평판 배지 1 내지 4에 100 μL씩 도말하고 30℃에서 2일간 배양하며 단일 콜로니를 순수 분리하였다. Samples for isolating new strains were obtained from Yongsan sewage treatment plant and Yongyeon sewage treatment plant in Ulsan Metropolitan City and Munsusan soil in Ulju - gun. After thoroughly mixing the samples with a vortex, 100 μL of each sample was spread on LB-
분리된 각 콜로니들은 상기 탄산칼슘 및 젖당 포함 혼탁 평판배지에서 분리되어 30℃에서 7일간 배양되었고, CaCO3가 용해되어 생성된 활성대를 띄는 균주를 락토비온산 생산능이 있을 것으로 예상되는 후보군으로 선별하였다(도 3). Each of the isolated colonies was separated from the calcium carbonate and lactose-containing turbid plate medium and incubated at 30 ° C for 7 days, and strains with active zones generated by dissolving CaCO 3 were selected as candidates expected to have lactobionic acid-producing ability (FIG. 3).
실시예 4. 신규 동정 균주의 락토비온산 생산여부 확인 Example 4. Confirmation of Lactobionic Acid Production of Newly Identified Strains
상기 활성대를 형성하여 락토비온산 생산능을 보유한 것으로 추측되는 균주 및 음성 대조군(negative control)과 락토비온산 생산능을 갖는 균주로서 양성 대조군(positive control)인 슈도모나스 테트로렌스를 NB plate에 streaking 하고 25 ℃에서 48 시간 배양 후 형성된 colony를 5 mL NB 배지에 접종하여 25 ℃에서 200 rpm으로 24 시간 진탕 배양 하였다. 배양된 seed culture를 100 mL NB 배지에 lactose 20 g/L를 포함하여 초기 OD600nm는 0.2가 되도록 발효 배지에 접종하여 25 ℃에서 200 rpm으로 약 2일간 진탕 배양하여 젖당 대사 능력과 락토비온산 생산능을 확인하였다. A strain presumed to have the ability to produce lactobionic acid by forming the active zone, a negative control, and a positive control, Pseudomonas tetorens, as a strain having the ability to produce lactobionic acid, streaking on an NB plate The colony formed after 48 hours of culture at 25 °C was inoculated into 5 mL NB medium and cultured at 25 °C for 24 hours with shaking at 200 rpm. The cultured seed culture was inoculated into a fermentation medium with 20 g/L of lactose in 100 mL NB medium so that the initial OD 600nm was 0.2, and cultured with shaking at 200 rpm at 25 ° C for about 2 days to produce lactose metabolism and lactobionic acid ability was confirmed.
젖당과 락토비온산의 분석은 Refractive Index Detector (RID)가 장착된 Agilent사의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC 1260 모델)을 이용하였다. 컬럼은 Coregel ION 300 column을 사용하였고, 컬럼 온도는 70 ℃를 유지하였다. 이동상은 0.5 mM H2SO4를 이용하였고, flow는 0.3 ml/min이었다. 상기 조건에서 젖당과 락토비온산은 retention time은 도 4에서 나타나는 것처럼 각각 19.3분, 20.2분으로 분리되어 확인되었다. 실험결과 음성 대조군인 대장균은 락토비온산 전환이 일어나지 않았고, 활성대를 보이던 양성대조군인 슈도모나스 테트로렌스 균과, 평판배지 2에서 활성대를 형성하여 분리해낸 균주에서는 락토비온산 피크가 나타나는 것으로 확인 되었고, 이에 평판배지 2의 영역 상에서 활성대를 보이는 균주는 락토비온산 전환 능력이 있음을 확인하였다. For the analysis of lactose and lactobionic acid, Agilent's high-performance liquid chromatography (HPLC 1260 model) equipped with a Refractive Index Detector (RID) was used. A Coregel ION 300 column was used as the column, and the column temperature was maintained at 70 °C. The mobile phase was 0.5 mM H 2 SO 4 and the flow was 0.3 ml/min. Under the above conditions, the retention time of lactose and lactobionic acid was confirmed to be 19.3 minutes and 20.2 minutes, respectively, as shown in FIG. As a result of the experiment, E. coli, the negative control group, did not convert lactobionic acid, and the positive control group, Pseudomonas tetrorens bacteria, which showed an active band, and the strain isolated from the
양성대조군과 평판배지 2에서 분리된 균주의 젖당 20 g/L 발효를 통해 락토비온산 생산성을 비교한 결과(도 5), 야생형은 1.66 g/L/h의 생산성을, 평판배지 2에서 분리된 균주 M10의 경우 0.59 g/L/h의 생산성을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 상기 제시된 방법을 통해 추후 우수한 신규 균주를 동정 및 개발이 가능함을 확인하였다.As a result of comparing the productivity of lactobionic acid through lactose 20 g/L fermentation of the strain isolated from the positive control and plate medium 2 (FIG. 5), the wild type had a productivity of 1.66 g/L/h, and the separated from
반면에, 평판배지 1 및 3에서 활성대를 형성하여 분리된 균에서는 락토비온산 피크가 관찰되지 아니하여, 이들 균주로부터 DNA를 추출하고 증폭한 후 16s rRNA 서열을 분석하여 미생물의 종을 확정한 결과, 평판배지 1로부터 분리된 균은 아세트산 박테리아(Acetobacter)로 확인되었고, 배지 3으로부터 분리된 균주는 Agrobacterium 균주로 확인되었다. On the other hand, the lactobionic acid peak was not observed in the bacteria isolated by forming the active zone in the
Claims (10)
(a) 희석한 시료를 증류수, 젖당 및 탄산칼슘(CaCO3)이 포함된 평판배지 상에 도말 및 배양하는 단계; 및
(b) 상기 평판배지 상에서 활성대(clear zone) 영역을 형성하는 적어도 하나의 단일 콜로니 미생물을 획득하는 단계;
를 포함하는 것이고,
상기 평판배지는 증류수 1L에 영양배지(nutrient broth) 0.1~5 g, 젖당(lactose) 0.1~300 g, 효모 추출물(yeast extract) 0.5~5 g, 펩톤(peptone) 1~10 g, 염화나트륨(NaCl) 1~10 g 및 아가(agar) 파우더 5~30g을 첨가하여 용해시키고, 여기에 탄산칼슘을 3~8g 첨가하여 혼탁시킨 것을 평판에 담아 응고시킨 것을 특징으로 하는, 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 동정하는 방법.As a method for identifying microorganisms having lactobionic acid-producing ability,
(a) smearing and culturing the diluted sample on a plate medium containing distilled water, lactose and calcium carbonate (CaCO 3 ); and
(b) obtaining at least one single-colony microorganism forming a clear zone region on the plate medium;
that includes,
The plate medium contains 0.1-5 g of nutrient broth, 0.1-300 g of lactose, 0.5-5 g of yeast extract, 1-10 g of peptone, and sodium chloride (NaCl) in 1 L of distilled water. ) 1 to 10 g and 5 to 30 g of agar powder are added and dissolved, and 3 to 8 g of calcium carbonate is added to turbid, which is put on a flat plate and solidified, characterized by lactobionic acid production ability How to identify microorganisms.
상기 평판배지는 증류수 1L에 영양배지(nutrient broth) 0.1~5 g, 젖당(lactose) 0.1~300 g, 효모 추출물(yeast extract) 0.5~5 g, 펩톤(peptone) 1~10 g, 염화나트륨(NaCl) 1~10 g 및 아가(agar) 파우더 5~30g을 첨가하여 용해시키고, 여기에 탄산칼슘을 3~8g 첨가하여 혼탁시킨 것을 평판에 담아 응고시킨 것이고,
상기 평판배지에 탄산칼슘이 포화되어 있어 락토비온산 생산 시 탄산칼슘의 용해여부를 확인하여 활성대를 선별 가능하게 하는 것을 특징으로 하는, 평판배지.A plate medium for the identification of lactobionic acid-producing microorganisms, including nutrient broth, lactose, agar, calcium carbonate (CaCO 3 ) and distilled water,
The plate medium contains 0.1-5 g of nutrient broth, 0.1-300 g of lactose, 0.5-5 g of yeast extract, 1-10 g of peptone, and sodium chloride (NaCl) in 1 L of distilled water. ) 1 to 10 g and 5 to 30 g of agar powder were added and dissolved, and 3 to 8 g of calcium carbonate was added to turbidity, which was put on a flat plate and solidified,
The flat plate medium is saturated with calcium carbonate, so that the active zone can be selected by checking the dissolution of calcium carbonate during the production of lactobionic acid.
상기 용해된 용액을 멸균시키는 단계;
상기 멸균된 용액에 멸균된 탄산칼슘 파우더 3~8g을 첨가하여 혼탁시키는 단계; 및
상기 혼탁시킨 배지를 평판에 담아 응고시키는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 락토비온산 생산능을 갖는 미생물을 동정하는데 사용하기 위한 평판배지의 제조방법.In 1 L of distilled water, 0.1-5 g of nutrient medium, 0.1-300 g of lactose, 0.5-5 g of yeast extract, 1-10 g of peptone, 1-10 g of sodium chloride (NaCl) and agar Dissolving by adding 5 to 30 g of (agar) powder;
sterilizing the dissolved solution;
turbidity by adding 3 to 8 g of sterilized calcium carbonate powder to the sterilized solution; and
Coagulating the turbid medium by putting it on a flat plate
A method for producing a plate medium for use in identifying microorganisms having lactobionic acid-producing ability, characterized in that it comprises a.
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|---|
| Antonie Van Leeuwenhoek,17(1):1-14.(1951)* |
| Bioprocess Biosyst Eng;45(3):599-604.(2022) |
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