KR102508215B1

KR102508215B1 - 고상의 포토닉 콜레스테릭 액정 액적 및 수화겔을 포함하는 다중 탐지용 센서

Info

Publication number: KR102508215B1
Application number: KR1020200138124A
Authority: KR
Inventors: 박수영; 김예지
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-10-23
Filing date: 2020-10-23
Publication date: 2023-03-08
Also published as: KR20220053872A

Abstract

본 발명은 고상의 포토닉 콜레스테릭 액정 액적 및 수화겔을 포함하는 다중 탐지용 센서에 관한 것으로, 상세하게는 효소, 비효소, 이온결합으로 기능화된 액적을 포함하여 동시에 다양한 물질의 감지가 가능한 다중 탐지용 바이오센서에 관한 것이다. 본 발명의 고상의 포토닉 콜레스테릭 액정 액적 및 수화겔을 포함하는 다중 탐지용 센서는 감지물질에 대응한 기능화에 따라 선택성이 우수하고, 하나의 어레이에 구획화된 영역으로 동시에 다양한 물질을 감지 및 검출하며, 완전한 고상으로 안전성이 우수한 효과가 있다.

Description

고상의 포토닉 콜레스테릭 액정 액적 및 수화겔을 포함하는 다중 탐지용 센서 {Multi detecting sensors with interwined solid-state photonic cholesteric liquid crystal droplets and poly(acrylic acid) networks and method of manufacturing the same}

본 발명은 고상의 포토닉 콜레스테릭 액정 액적 및 수화겔을 포함하는 다중 탐지용 센서에 관한 것으로, 상세하게는 효소, 비효소, 이온결합으로 기능화된 액적을 포함하여 동시에 다양한 물질의 감지가 가능한 다중 탐지용 바이오센서에 관한 것이다.

인공 광결정은 광 밴드 갭(PBG)을 통해 빛을 제어할 수 있는 능력 때문에 연구의 관심사이다. 유전체 재료의 이러한 주기적 배열은 다층 리소그래피, 다중 빔 홀로 그래픽 리소그래피, 광학 간섭 방법, 콜로이드 자기 조립, 콜레스테릭 액정(CLC)를 사용한 나선형 자기 조립 등 여러 방법을 통해 생성할 수 있다. 포토닉 CLC_solid 필름의 구조는 외부 자극에 반응하여 나선형 피치가 조정될 때 반사된 색상 변화를 촉진하기 때문에 센서로 사용하기에 이상적이다. 나선형 구조로 형성된 층이 필름 표면과 완벽하게 평행할 때 평면 필름에서 뚜렷하고 생생하며 균일한 반사 색상을 볼 수 있다.

대한민국 등록특허 제10-1825597호와 같이 필름형태로 광결정 구조체를 제조하는 등 관련 연구가 진행되고 있다. 그러나 평평한 필름을 민감한 육안 감지 광학 센서로 사용할 경우 브래그의 법칙에 따라 입사 광선의 방향에 따라서 반사된 색상이 변할 수 있다. 이에 나선형 축이 반경 방향을 따르도록 평면 고정 조건을 나타내는 작은(직경 수십 mm) 포토닉 구형 액적을 제조할 필요가 있다. 차례로 접선 반사 평면이 입사 빔의 방향에 관계없이 입사 빔에 수직으로 정렬된 포토닉 액적은 외부 자극에 반응하여 나선의 피치가 변할 때 광학 센서로 사용할 수 있다.

한편, 이러한 스마트 특성은 반응성 그룹이 화학적 변형을 통해 CLC_solid의 구조에 통합되거나, 반응성 그룹이 장착된 반응성 메소겐을 포함할 때만 유발될 수 있다. 그러나 복잡하고 노동 집약적이며 시간이 많이 소요되는 것 외에도 이러한 CLC_solid 액적의 화학적 변형이 해당 반응성 메소겐의 부족으로 인해 원하는 반응 그룹의 성공적인 결합으로 이어지지는 않는다.

이에 스마트 상호 침투 고분자 네트워크(IPN)가 결합된 CLC_solid 구조 연구가 진행되고 있다. 균일한 크기의 CLC_solid 액적 바이크로 유체 방법은 추출된 도펀트에 의해 생성된 공간에 가교제와 함께 하이드로겔 단량체의 침투를 통해 IPN 구조로 결합함으로써 기능화될 수 있다. 후속 자외선(UV) 또는 열 경화는 얽힌 구조를 생성한다. 서로 연결된 PPA 네트워크(CLC_solid-PPA 액적의 약칭)가 있는 포토닉 IPN CLC_solid 액적은 서로 연결된 PAA가 pH 의존적 부피 변화를 겪는 약한 음이온성 고분자 전해질이기 때문에 pH 반응센서로 사용할 수 있다. 대부분의 생물학적 시스템이 일반적인 pH 조건의 변화에 영향을 받기 때문에 이러한 반응성은 바이오 센서 응용 분야에서 특히 중요하다. 나아가 선택적으로 민감하게 대상물질을 감지하면서 안정적으로 사용이 가능한 구조체, 바이오센서에 대한 필요성이 있다.

대한민국 등록특허 제10-1825597호

본 발명은 상기와 같은 필요를 해결하기 위하여, 고상의 포토닉 콜레스테릭 액정 액적 및 수화겔을 포함하는 다중 탐지용 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

요소 분해효소가 고정된 IPN 구조의 액적, PBA(Phenylboronic acid)가 고정된 IPN 구조의 액적, 및 1가 양이온으로 기능화된 IPN 구조의 액적으로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 액적을 포함하고, 상기 선택된 액적은 각각 구획화된 영역에 분리하여 배치된 다중 탐지용 센서를 제공한다.

상기 다중 탐지용 센서에서 반침투 구조의 액적은 비반응성 키랄 도판트를 제거한 CLC 액적 및 상기 CLC 액적의 내부 공간에 침투된 수화겔을 포함하고, 완전한 고상이며, IPN 구조는 full-IPN 구조 또는 semi-IPN 구조이고, 1가 양이온은 K⁺또는 Na⁺이다.

본 발명의 고상의 포토닉 콜레스테릭 액정 액적 및 수화겔을 포함하는 다중 탐지용 센서는 감지물질에 대응한 기능화에 따라 선택성이 우수하고, 하나의 어레이에 구획화된 영역으로 동시에 다양한 물질을 감지 및 검출하며, 완전한 고상으로 안전성이 우수한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 포토닉 CLCsolid 액적 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 탐지용 패턴 어레이 필름 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 IPN CLC 액적이 포함된 PDMS 몰드의 광학 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 단면 표면의 SEM 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 서로 다른 pH 값에서의 광학 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 xy 색도 다이어그램이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 pH 함수로서의 λ_dominant이다.
도 8은 본 발명의 일 제조예에 따른 어레이 패턴 필름의 광학 현미경 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 제조예에 따라 요소 분해효소 고정화된 액적의 형광 현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 제조예에 따른 요소 바이오 센서의 액적에 다양한 농도(C_urea)의 요소 수용액 처리 후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 제조예에 따른 요소 바이오 센서의 액적에 다양한 농도(C_urea)의 요소 수용액 처리 후 색상에 대해 얻은 해당 XY 색도 다이어그램과 C_urea의 함수로서 λ_dominant 플롯이다.
도 12는 본 발명의 일 제조예에 따른 요소 바이오 센서의 액적에 다양한 종류의 수용액 처리후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 제조예에 따른 포도당 바이오 센서의 액적에 다양한 농도(C_g)의 포도당 수용액 처리 후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 제조예에 따른 포도당 바이오 센서의 액적에 다양한 농도(C_g)의 포도당 수용액 처리 후 색상에 대해 얻은 해당 XY 색도 다이어그램과 C_g의 함수로서 λ_dominant 플롯이다.
도 15는 본 발명의 일 제조예에 따른 포도당 바이오 센서의 액적에 다양한 종류의 수용액 처리후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 다양한 농도(C_Ca)의 칼슘 수용액 처리 후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다.
도 17은 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 다양한 농도(C_Ca)의 칼슘 수용액 처리 후 색상에 대해 얻은 해당 XY 색도 다이어그램과 C_Ca의 함수로서 λ_dominant 플롯이다.
도 18은 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 다양한 종류의 수용액 처리후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다.
도 19는 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 다양한 종류의 금속 수용액 처리 후 색상에 대해 얻은 해당 XY 색도 다이어그램과 2가 금속 이온 종류의 함수로서 λ_dominant 플롯이다.
도 20은 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 대한 4주기에 걸친 수용액 처리 후 광학 현미경 사진이다.
도 21은 본 발명의 일 제조예에 따라 구획화된 다중 탐지용 바이오 센서의 액적의 광학 현미경 사진이다.
도 22는 본 발명의 일 제조예에 따른 따라 구획화된 다중 탐지용 바이오 센서에 인간 혈청을 첨가한 액적의 광학 현미경 사진이다.
도 23은 본 발명의 일 제조예에 따른 따라 구획화된 다중 탐지용 바이오 센서에 혼합 용액을 첨가한 후 나타난 액적의 광학 현미경 사진이다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일측면에 따르면 요소 분해효소가 고정된 IPN 구조의 액적, PBA(Phenylboronic acid)가 고정된 IPN 구조의 액적, 및 1가 양이온으로 기능화된 IPN 구조의 액적으로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 액적을 포함하고, 상기 선택된 액적은 각각 구획화된 영역에 분리하여 배치된 다중 탐지용 센서를 제공한다.

본 발명의 다중 탐지용 센서의 IPN 구조의 액적은 비반응성 키랄 도판트를 제거한 CLC 액적 및 상기 CLC 액적의 내부 공간에 침투된 수화겔을 포함하고, 완전한 고상인 것에 특징이 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 다중 탐지용 센서는 비반응성 키랄 도판트를 제거한 고상의 CLC 액적을 기본 구조체로 한다. CLC 액적은 비반응성 키랄 도펀트와 반응성 네마틱 메조겐을 혼합한 후 경화하여 형성할 수 있다. 균일한 크기의 액적을 얻기 위하여 PDMS 기반의 미세유체장치(microfluidic flow-focusing device)를 이용할 수 있다. 상이한 유속의 2개의 유체를 미세유체장치에 연결하고 제어된 속도로 상을 주입하여 볼(ball)을 형성할 수 있다. 이후 전방향 UV 경화를 진행하고 아세톤으로 비반응성 키랄 도판트를 제거하여 고상의 CLC 액적을 준비할 수 있다.

완전한 고상(solid)이면서도 광결정의 피치를 유지하여 안정성을 확보할 수 있고, 액적은 구형상(sphere)이므로 보는 각도의 변화에도 균일한 색상이 나타나는 특징이 있다.

본 발명의 다중 탐지용 센서의 IPN 구조는 full-IPN 구조 또는 semi-IPN 구조일 수 있다. 키랄 도판트가 추출된 공간에 하이드로겔 단량체를 투입하고 전방향 UV 경화한다. 반침투 IPN 구조의 경우 경화 후 완충용액(pH 12)을 이용하여 외부 하이드로겔을 녹여 반침투 구조를 형성할 수 있다.

반침투(semi-IPN(Interpenetrating Polymer Network)) 구조는 크로스 링킹(cross linking) 구조와 선형(linear) 구조를 동시에 가지도록 침투된 구조인 반면 기존의 IPN 구조(full-IPN)는 크로스 링킹 구조만으로 구성된다. full-IPN은 두 종류의 polymer network가 상호적으로 얽혀있는 구조인 반면, semi-IPN은 한 polymer network에 다른 선형 polymer가 상호적으로 얽혀있는 구조이다.

구형 구조체의 경우 하이드로겔이 침투되고 UV 경화과정을 거치면 외부가 경화됨에 따라 내부 변화를 감지하기 어려운 문제가 있으나, 본 발명의 구조체는 외부 하이드로겔이 녹아서 제거되고, 구형 내부에만 하이드로겔이 반침투 구조를 형성함에 따라 불필요한 외부 구조 없이 내부 구성에 따른 기능을 활용할 수 있고, 기능화 결과도 확인할 수 있는 점에서 기존 full-IPN 구조와 차이가 있다.

고상의 CLC 액적은 요소 분해효소, 페닐보론산(PBA, phenylboronic acid)는 대표적인 수화겔인 PAA의 카르복실산과 결합하여 고정됨에 따라 기능화될 수 있다. 1가 양이온은 K⁺또는 Na⁺일 수 있고, 액적을 기능화하는 것에 대한 구체적인 설명은 다음과 같다.

1-ethyl-3-3(dimethylaminopropyl) carboddimide(EDC)와의 커플링 반응을 통한 카르복실기 매개 요소 고정화는 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 필름의 반사 색상을 변경할 수 있다.

또한 비효소 수용체인 아미노 페닐보론산(APBA)을 EDC 커플링을 통해 PAA 네트워크에 고정할 수 있다. 페닐보론산(PBA)은 포도당과 선택적으로 결합할 수 있으며, PBA와 포도당 사이의 복합체화 반응으로 인해 도난 삼투압이 생성되어 PAA 네트워크에서 부피 변화가 야기하고, 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 배열 필름의 피치와 반사 색상을 변경할 수 있다.

나아가 여러 질병에 대한 필수 바이오 마커 역할을 하는 금속 이온과 관련하여 PAA의 반응성이 높은 카르복실기와 금속 이온과 복합체를 형성하여 기능화 할 수 있다. 보다 구체적으로 K^+, Na⁺와 같은 1가 이온으로 구성된 결과 복합체를 형성할 수 있다. 카르복실기 사이의 수소 결합을 차단하여 PAA 네트워크를 팽창시키고, 나선형 피치를 증가시키며 반사된 색상을 적색편이 시킬 수 있다. 반면에 Ca²⁺, Mg²⁺과 같은 2가 이온(Ms)을 포함하는 복합체는 PAA 네트워크 팽창을 억제하고 나선형 피치를 감소시키며 반사된 색상을 청색편이 시키는 다리 구조의 -COO-M-OOC-를 형성한다. 특히 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 이온에 대한 선택성이 우서하다. 1가 이온으로 전처리 되어 팽창된 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적은 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 이온으로 처리할 때 청색 편이가 확인됨에 따라 그 농도를 감지할 수 있다. 이는 2가 이온의 더 높은 반응성과 카르복실산 이온과 반응하는 경향으로 인해 1가 이온을 대체할 수 있기 때문이다.이를 이용하여 1가 이온 처리된 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적을 사용하여 2가 이온을 감지할 수 있다.

포토닉(photonic) IPN 구조를 만들기 위해 CLC_solid 액적이 하이드로겔 단량체 혼합물에 배치되면 단량체 혼합물을 CLC_solid 액적 내부와 외부 모두에서 경화된다. 따라서 CLC_solid 내부의 포토닉 IPN 구조와 CLC_solid 액적 외부의 고체 상태 하이드로겔 매트릭스 구조의 형성이 동시에 발생할 수 있다. 포토닉 CLC_solid 고체 액적을 포함하는 수화겔 혼합물을 지정된 용기에 채운 다음 UV 또는 열 경화를 통해 응고하면 임의적 모양의 매트릭스가 형성될 수 있다.

포토닉 IPN CLC_solid 고체 액적을 포함하는 이 매트릭스는 센서를 위한 다양한 플랫폼을 제공한다. 예를 들어 배열 필름의 패턴 도트는 여러 감지 목적으로 사용하거나 사람 피부에 패치로 사용할 수 있다. 얽힌 PAA 수화겔이 생물학적 조건에 반응하는 경우 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적은 바이오 센서에 적용할 수 있다.

본 발명의 액적 및 이를 포함하는 센서는 정교한 분석 장비 없이 직접 변화를 관찰할 수 있고, 용이하게 광학 바이오 센서를 구축할 수 있는 특징이 있다. 나아가 효소, 비효소, 이온 등으로 기능화하여 선택성이 우수한 센서를 제공할 수 있다.

나아가 본 발명은 PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드를 사용하여 다중 패턴 도트 배열 필름을 제공할 수 있다. 본 발명의 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적을 포함하는 필름은 2가 금속 이온, 요소 및/또는 포도당을 검출하기 위한 바이오 센서로 사용될 수 있다. 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적이 함침된 패턴 배열 필름은 어레이 도트의 포토닉 IPN CLC_solid 액적의 구획화 및/또는 거울상 도펀트의 농도를 조정하여 제어되고, 이에 따라 상이하게 나타나는 초기 반사 색상을 통해 대상 물질을 구별할 수 있는 광범위한 바이오 센서 플랫폼을 제공할 수 있음에 특징이 있다.

이하, 첨부된 도면들을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 상세히 설명하기로 한다. 한편, 해당 기술분야의 통상적인 지식을 가진 자로부터 용이하게 알 수 있는 구성과 그에 대한 작용 및 효과에 대한 도시 및 상세한 설명은 간략히 하거나 생략하고 본 발명과 관련된 부분들을 중심으로 상세히 설명하도록 한다.

<실시 및 제조예>

재료

반응성 액정 혼합물 RMM727(Merck, UK), (S)-4-cyano-4´-(2-methylbutyl) biphenyl(CB15, Synthon, Germany), 글리세린(Duksan, South Korea), poly(vinyl alcohol)(PVA, Yakuri, Japan), trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane(PFOTS, 97 %, Sigma-Aldrich, USA), tetraethyl orthosilicate(TEOS, TCI Chemicals, Japan), 3-(trimethoxysilyl)propyl 메타 크릴레이트(TMSPMA, 98 %, Sigma-Aldrich, 미국), 유리 슬라이드(독일 마리엔 펠트), 아크릴산(AA, Junsei, 일본), Irgacure 500 광개시제(Ciba Inc., 스위스), 아세톤(Duksan, South) 한국), Poly/Bed® 812(EPON, Polysciences, USA), dodecanylsuccinic anhydride(DDSA, Polysciences, USA), nadic methyl anhydride(NMA, Polysciences, USA), 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl) phenol(DMP), Polysciences, USA), 수산화칼륨 (KOH, Duksan, 대한민국), 무수 염화칼슘(CaCl₂, Yakuri, Japan), 질산(HNO₃, Duksan, 대한민국), poly(dimethylsiloxane)(PDMS, Sylgard® 184 Silicone 엘라스토머 키트, 미국 다우 코닝), N-hyd roxysuccinimide(NHS, Sigma-Aldrich, USA), N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide 염산염(EDC/HCl, Sigma-Aldrich, USA), pH 완충용액(Samchun ⓒ대한민국), 로다민 6G( TCI, 일본), 요소(Sigma-Aldrich, 미국), 요소 분해 효소(Sigma-Aldrich, 미국), 포도당(Sigma-Aldrich, 미국), 콜레스테롤(Sigma-Aldrich, 미국), L-ascorbic acid(Sigma-Aldrich, 미국), 요산 (Sigma-Aldrich, USA), 구리(II) 질산 삼수화물(Cu(NO₃)₂·3H₂O, Junsei, 일본), 아연 질산염 6 수화물(Zn(NO₃)₂·6H₂O, Sigma-Aldrich, 미국), 마그네슘 나이트레이트 헥사 하이드레이트(Mg(NO₃)₂·6H₂O, Sigma-Aldrich, USA), 나트륨 나이트레이트 (NaNO3, Duksan, 대한민국), 인간 혈청(Sigma-Aldrich, USA) 및 철(II) 염화물 4 수화물(FeCl₂·4H₂O, Samchun, South Korea)는 앞서 언급 한 공급 업체에서 구입하여 받은 대로 사용했다. 탈이온수(DI)는 μPure RO 역삼투 시스템 (Romax, 대한민국)을 사용하여 정제되었다. 달리 명시되지 않는 한 모든 실험에 DI 물을 사용했다. 미리 결정된 양의 RMM717, CB15를 혼합하고 60℃에서 12시간 동안 자기적으로 교반했다. 생성된 투명한 거울상 혼합물은 완전히 교반하고 25℃로 냉각한 후 유백색이 되었다.

실시예 - 패턴화된 포토닉 CLCsolid 액적

균일한 CLC_solid 액적은 RMM/CB15 혼합물의 전 방향 UV 경화 및 거울상 도펀트 추출과 함께 미세 유체 채널에서 종래 기술에 따른 방법으로 준비하였다. UV 조사 방향에 영향을 받는 비대칭 광 구조의 형성을 방지하기 위해 전 방향 UV 경화 고정이 채택되었다. 이는 단방향 조사로 인해 UV 셰드 측에서 먼저 상 분리가 발생하여 경화 과정 중에 상 분리된 거울상 도펀트가 UV 충격 영역의 다른 면으로 이동하기 때문이다. 이것은 더 높은 거울상 도펀트 함량으로 인해 CLC 액적 반구의 다른 쪽에서 반사된 색상을 청색편이 시킨다. 따라서 전 방향 UV 경화는 이 문제를 피할 수 있었다.

구체적으로 미세 유체 흐름을위한 PDMS 기반 장치를 제작하기 위해 권장 비율 10/1(w/w)로 프리폴리머와 가교제를 완전히 혼합하여 PDMS를 준비했다. 이 혼합물을 데시 케이 터에서 30분 동안 탈기하여 기포를 제거했다. 최종 혼합물을 구조화된 실리콘 웨이퍼 몰드에 붓고 60℃ 오븐에서 2시간 동안 경화시킨 다음 몰드에서 제거했다. 패턴화된 PDMS는 짧은 산소 플라즈마 처리(300초, Femto Science Inc., 대한민국)를 사용하여 미리 세척된 유리 현미경 슬라이드에 결합되었다. 입구 채널, 오리피스 및 출구 채널의 폭은 각각 70, 70, 300μm이고 채널의 깊이는 100μm로 설정하였다. 채널 벽과 장치 자체는 20℃에서 30분 동안 TEOS(에탄올에서 5 wt%)로 처리하여 친수성이 되도록 하였다.

유량은 두 가지 다른 속도로 두 유체를 펌핑할 수 있는 공압 미세 유체 유량 제어 시스템(OB1 Pressure Controller, Elveflow, France)을 사용하여 제어되었다. 이 시스템은 유연한 플라스틱 튜브 (Tygon®, 0.02 in ID, 0.06 in OD) 및 PTFE 튜브 (0.035 in ID, 0.055 in OD)를 사용하여 미세 유체 장치에 연결되었다. 미세하게 제어된 속도로 액체가 들어있는 바이알에 공기를 펌핑함으로써 Elveflow 장치는 바이알을 가압하여 유체가 튜브를 통해 장치로 흐르도록 했다. 내부 및 외부 유체의 일반적인 압력은 각각 4mbar 및 7mbar이었다. 장치의 볼 형성은 광학 현미경 (JSP-20T, Samwon, South Korea)에 부착된 디지털 카메라(STC-TC83USB-AS, SenTech, Japan)를 사용하여 캡처되었습니다. 분산된 CLC 액적을 중간 입구에 천천히 주입하고, PVA(1 중량%)를 포함하는 연속 수성상을 분산상의 방향과 수직 위치에서 다른 입구에 주입하였다. 연속적인 상 흐름은 교차점에서 만나고 각 흐름이 채널의 목을 가로 지르면 볼이 형성되었다.

준비된 반응성 CLC 액적을 하루 동안 어닐링하여 균일한 포토닉 구조를 생성한 다음 어닐링된 액적을 전 방향 UV 경화를 위해 특별히 설계된 기계 내부의 글리세린/물 혼합물이 들어있는 바이알에서 균일하게 UV 경화했다. 글리세린/물 비율은 CLC 액적의 밀도와 일치하도록 제어되었다. 365nm에서의 UV 강도는 중앙에서 300μW·cm^-2였다. 키랄 도펀트 추출 전에 준비된 UV 경화 포토닉 CLC 액적은 도펀트 함량(Φ)이 29.4 중량% 일 때 녹색 중앙 반사를 나타냈다. 그 후, CB15를 아세톤으로 추출하여 청색 중심 반사를 갖는 포토닉 CLC 고체 볼을 생성하였다.

거울상 도펀트의 양(Φ)은 달리 언급하지 않는 한 29.4wt%로 고정되었다. at Φ = 29.4 wt%에서 CLC_solid 액적의 반사된 중심 색상은 건조된 상태에서 파란색 반사를 나타낸다. CB15 추출 및 건조 후 CLC_solid 액적의 단면 표면을 통해 완벽한 동심원 고리와 공극이 없는 조밀한 구조는 UV 경화와 CB15 추출 후에도 CLC 나선형 구조가 유지되었음을 확인할 수 있었다. 이 온전한 CLC 포토닉 구조는 RMM과 CB15의 완전한 혼합성과 균일한 UV 견화 과정의 결과일 수 있다. 동심원 고리는 나선형 피치(P)에 해당하는 간격이 있는 나선형 구조를 나타낸다. 364nm에서 측정된 p는 473nm의 PBG(λ_PBG)에서 파장을 제공했다. 이것은 λ_PBG= nP를 사용하여 계산되었으며, 여기서 n(1.3)은 평균 반사 지수이다. 473nm에서 λ_PBG는 청색 범위에 있었고 관찰된 색상에 가깝다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 포토닉 CLCsolid 액적 제조방법을 나타낸 모식도이다. 도 1을 참고하여 설명하면, PDMS 몰드에서 복제된 PAA 패턴 배열 필름의 도트에 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 준비를 보여준다. PDMS 몰드는 일반적인 포토 레지스트 방법을 통해 준비되었다. 즉, SU80은 100μm 두께의 실리콘 웨이퍼에 코팅되었고, 검은색 배경의 정사각형에서 중심에서 중심으로 200μm 분리된 투명 200×200 어레이 원(직경 100μm)이 포함된 포토 마스크와 함께 UV를 사용하여 패턴화되었다. 실리콘 웨이퍼에 개발된 패턴에는 높이가 100μm인 원통형 기둥이 있다. PDMS 전구체를 실리콘 웨어퍼를 포함하는 페트리 접시 바닥에 부었다. 진공 펌프를 사용하여 기포를 제거한 후, PDMS 전구체를 Innocure 5000(Lichtzen, 한국)을 사용하여 UV 경화시켰다. 패턴화된 실리콘 웨어퍼에서 벗겨진 PDMS 몰드에는 원통형 구멍이 형성된다.

제조된 CLC_solid 액적은 AA 모노머(98.5 wt%), TPGDA(0.5 wt%), Irgacure 500(1 wt%)을 포함하는 혼합물에 분산되었다. 결합된 CLC_solid 액적-AA 혼합물을 5분동안 O₂플라즈마로 처리한 PDMS 몰드에 붓고, 5분동안 방치하여 CLC_solid 물액적을 PDMS 구멍에 정착시키고 상단에 유리 슬라이드로 압착했다.

AA 혼합물에 분산된 CLC_solid 액적이 250 μW·cm^-2의 강도로 균일한 경화를 보장하기 위해 특별히 설계된 UV 경화 기계를 사용하여 전 방향 UV 경화됨에 따라 CLC_solid 액적의 중앙 반사의 파란색이 녹색이 되었다. 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적을 포함하는 점선 PAA 패턴 배열 필름을 PDMS몰드에서 벗겨냈다.

제조예 1 - 요소 감지용 바이오센서

얽힌 PAA 네트워크에서 요소분해효소의 고정화는 다음 방법을 통해 로다민 6G로 요소 분해효소를 라벨링하여 추적되었다. 요소 분해효소 수용액(1 wt%, 5 mL)을 EDC/NHS 1/2 v/v, 0.2M/0.2M, 1 mL) 용액과 1시간 동안 자기 교반하여 혼합시키고 요소 분해효소를 활성화시켰다. EDC 활성화된 요소 분해효소 수용액(1wt%, 6mL)을 10시간 동안 자기 교반에 의해 로다민 6G(0.5mg)와 혼합하였다. 로다민 6G 고정화 요소 분해효소(rho-urease)는 수성과 황산 암모늄을 첨가하고 VS-21SMT 원심분리기(Vision, 한국)를 사용하여 15분동안 5000rpm에서 원심분리하여 침전시켰다. 상층액을 따라 내고 분말을 진공 오븐에서 40℃로 1시간 동안 건조시켰다. 건조된 분말은 나중에 사용하기 위해 보관되었다. 패턴 배열 필름에서 요소 분해효소(rho-urease)로 고정된 CLCsolid-PAA 액적들(CLC_{solid-PAA-urease} 및 CLC_{solid-PAA-rho-urease})은 다음 방법으로 준비되었다.

패턴화 배열 필름을 수성 EDC/NHS (1/2 v/v, 0.2M/0.2M, 1 mL)에 담그고 2시간 동안 방치했다. 요소 분해효소 수용액(및 rho-urease)(10 mg/mL, 1 mL)을 pH 7 완충 용액에서 EDC 활성화 패턴 배열 필름에 첨가하고 12시간 동안 방치한 다음 다량의 물로 세척했다. 패턴 배열 필름은 다양한 농도의 수성 분석물 용액(1mL)에 이들(1×1×0.1 cm³)을 담가 실험하였다.

제조예 2 - 포도당 감지용 바이오센서

포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적에 대한 PBA 고정화는 상기 제조예 1의 요소분해효소 고정화 과정에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 수행되었다. 여기에서 CLC_solid 액적은 소량의 포도당 용액(0.5mL)에 대해 더 눈에 띄는 색상 반응을 보장하기 위해서 더 높은 농도의 거울상 도펀트(29.4wt% 대신 30.5wt%)로 준비되었다. PBA 수용액(30mM, 0.5mL)을 완충용액(pH7)의 EDC 활성화 패턴 필름에 첨가하고 2시간 동안 방치했다. 패턴화된 필름(1×1×0.1 cm³)에서 생성된 PBA-고정화 CLCs_olid-PAA(CLC_{solid-PAA-PBA}로 약칭됨) 액적을 분석물 용액(1×1×0.1 cm³)에 담그고 실험하기 전에 다량의 물로 세척하여 준비하였다.

제조예 3 - 이온 감지용 바이오센서

PAA 패턴 배열 필름의 CLC_solid-PAA 액적을 KOH 수용액(1M, 0.5mL)에 5동안 침지(1×1×0.1 cm³) 하여 K⁺이온으로 처리했다. 그 다음, 패턴 배열 필름에 생성된 KOH 처리된-CLC_solid-PAA(CLC_{solid-PAA-KOH}로 약칭됨) 액적을 공기 건조시켰다. 패턴 배열 필름에 있는 CLC_{solid-PAA-KOH} 액적은 다양한 농도의 금속 이온 수용액(0.5mL)에 담금 (1×1×0.1 cm³)에 의해 이온을 감지하는데 사용하였다.

제조예 4 - 다중 탐지용 바이오센서

CLC_solid 액적은 포토닉 IPN CL_Csolid-PAA 액적을 구성하는데 사용된 것과 동일한 방법을 통해 개별적으로 분리된 semi-IPN CLC_solid-PAA 액적(패턴 배열 필름의 점이 아님)을 준비하여 기능화되었다. 선형 가용성 PAA 매트릭스 필름은 직사각형, 패턴화되지 않은 PDMS 몰드에서 가교제 없이 AA 모노머에 분산된 CLC_solid 액적의 UV 경화를 통해 얻어졌다.

Full-IPN CLC 액적의 경우 AAc에 가교제를 첨가하여 팽윤(swelling)된 AAc 경화 시 Full IPN 형태로 가교 되어 매트릭스 상인 PAA가 쉽게 녹아나지 않는다. 또한 매트릭스 상의 PAA와 액적 내부에 존재하는 PAA가 연결되어 있기 때문에 하나의 단일 센서로써 사용하기에 적합하다. Semi-IPN CLC 액적은 가교제를 첨가하지 않은 AAc를 팽윤 및 경화시켜 semi-IPN 형태로서 가교된다. 매트릭스 상인 PAA를 쉽게 제거할 수 있다는 점이 있고, 따라서 내부에 PAA가 존재하는 액적만 회수할 수 있다는 장점이 있다. 매트릭스상에서 독립적인 semi-IPN CLC 액적 각각에 기능화를 시켜 총 4가지의 기능을 할 수 있는 droplet을 하나의 패턴 배열 필름상에 혼합, 가교함으로써 다중센서로서 응용할 수 있다.

준비된 semi-IPN CLC_solid-PAA(semiCLC_solid-PAA로 약칭) 액적은 완충 용액(pH12)애 용해시키고 개별적으로 분리된 semi CLC_solid-PAA 액적을 수집하여 PAA 매트릭스에서 분리할 수 있다. 해당하는 semi CLC_{solid-PAA-urease}, semi CLC_{solid-PAA-PBA} 및 semi CLC_{solid-PAA-KOH} 액적을 각각 얻기 위해 상기 제조예 1 내지 3의 방법을 통해 요소 분해 효소, PBA 및 KOH로 semiCLC_solid-PAA 액적의 후속 기능화하였다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 다중 탐지용 패턴 어레이 필름 제조방법을 나타낸 모식도이다. 도 2를 참고하여 설명하면, semi CLC_{solid-PAA-urease}, semi CLC_{solid-PAA-PBA} 및 semi CLC_{solid-PAA-KOH} 액적을 AA 단량체(98.5 wt %), TPGDA(0.5wt%) 및 Irgacure 500(1wt%)을 포함하는 혼합물과 다시 혼합했다. 그런 다음 패턴 배열 필름에서 원하는 위치에 배치하였다. 한쪽면에 접착제가 있는 3mm 두께의 PDMS 필름을 "십자"모양으로 자르고 PDMS 몰드에 벽으로 부착하여 semi_CLCsolid-PAA 액적을 4개의 다른 위치로 구획화했다. 4개의 구획화된 도트에 포토닉 semi CLC_solid-PAA, semi CLC_{solid-PAA-urease}, semi CLC_{solid-PAA-PBA} 및 semi CLC_{solid-PAA-KOH} 액적을 포함하는 패턴 배열 필름은 IPN CLC_solid-PAA 액적을 포함하는 PAA 패턴 배열 필름의 구성과 같이 상기 언급한 방법을 통해 준비되었다.

<결과 및 평가>

실험 및 측정방법

패턴 어레이 필름에서 CLC_solid 및 CLC_solid-PAA 액적의 반사 색상은 반사 모드에서 STC-TC83USB-AS 디지털 카메라(Sen Tech, 일본)가 장착된 ANA-006 광학 현미경(Leits, 독일)으로 관찰되었다. 패턴화된 어레이 필름에서 CLC_solid 및 IPN CLC_solid-PAA 액적의 단면 표면은 MC14503 다이아몬드 칼(Diatome, 스위스)을 사용하여 마이크로 토밍(EM UC6, Leica, Austria) 에폭시 성형 샘플을 통해 얻었다. 에폭시 성형 절차는 CLC_solid 액적 또는 CLC_solid-PAA 액적을 포함하는 패턴 배열 필름의 작은 절단 조각을 캡 끝에 배치하여 수행했다(Cavity Embedding Mold, Ted Pella, USA). 다음으로, 캡을 EPON (2mL), DDSA (1.25mL), NMA (1.25mL) 및 DMP (0.075mL)의 에폭시 혼합물로 채웠다. CLC_solid 및 CLC_solid-PAA 액적의 단면 이미지는 5kV의 가속 전압에서 작동하는 모델 SU8220 전계 방출 주사 전자 현미경 (FE-SEM, Hitachi, Japan)을 사용하여 얻었다.

FE-SEM 샘플은 단면 표면을 백금으로 코팅하여 준비되었다. 포토닉 IPN CLC_{solid-PAA-rho-urease} 액적 내부에서 Rho-urease의 고정은 480nm의 들뜸 파장에서 BX51 형광 광학 현미경 (한국 올림푸스)을 통해 얻은 단면 이미지를 사용하여 확인되었다.

반사된 색상은 Color Grab 소프트웨어 (Loomatix, Israel)를 사용하여 패턴화 된 어레이 필름에서 포토닉 IPN CLCs_olid-PAA 액적의 중앙 반사 이미지에서 얻은 CIE XYZ 좌표를 통해 디지털화되었다. 이미지의 xy 좌표는 CIE 1931 시스템에 따라 xy 색도 다이어그램에 표시되었다. 주 파장(λ_dominant)은 기준 백색 점(x=0.3127, y=0.3290)의 색도 좌표와 다이어그램의 반사된 색상 사이의 선형 선을 기준으로 계산되었다. 말굽 모양의 곡선에서 그 지점에 대한 외삽은 그 지점과 관련된 λ_dominant 값을 알려주었다.

포토닉 IPN CLCsolid-PAA 액적 확인

CLC_solid 액적은 패턴화된 PDMS 몰드에 배치되었다. PDMS 몰드에는 개별 CLC_solid 액적을 배치할 수 있는 원통형 배열 구멍이 존재한다. PDMS 금형(110 mm)의 구멍 직경은 CLCsolid 액적(80 mm)의 구멍 직경에 가깝다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 IPN CLC 액적이 포함된 PDMS 몰드의 광학 현미경 사진이다. 도 3의 (a)는 구멍에 AA 침투 포토닉 CLC 고체 방울이있는 PDMS 몰드이고, (b) 점에 포토닉 IPN CLC 고체 -PAA 방울을 포함하는 PAA 패턴 배열 필름이다. 도 3의 (a)를 참고하여 설명하면, 개별 CLC_solid 액적을 각 구멍에 별도로 배치하고 CLC_solid 액적에서 뚜렷한 반사 색상을 관찰할 수 있었다. PAA 패턴 배열 필름은 UV 경화 후 PDMS 몰드에서 분리하였다. 도 3의 (b)를 참고하여 설명하면, 포토닉 CLC_solid-PAA 액적은 명확하게 보였고, 건조 CLC_solid 액적의 파란색 반사 색상은 PAA가 CLC_solid 액적의 빈 공간으로 침투하여 PAA 매트릭스에서 녹색이 되었다. 이를 통해 PDMS 몰드를 사용하여 PAA 패턴 배열 필름에 내장된 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적이 성공적으로 생성되었음을 확인할 수 있었다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 단면 표면의 SEM 사진이다. 도 4를 참고하여 설명하면, CLC_solid-PAA 액적(415 nm)의 측정된 P는 얽힌 pH 반응성 PAA 사슬 때문에 CLC_solid 액적(364nm) 보다 높게 나타났다. 415nm의 측정된 P는 λ_PBG = nP를 사용하여 계산된 540nm의 l_PBG를 가졌으며, 여기서 n (1.3)은 평균 반사 지수 13, 16이다. 540nm에서의 λ_PBG는 녹색이었고 관찰된 색상과 근접함을 확인하였다.

액적의 형태 및 반응성

포토닉 IPN CL_Csolid-PAA 액적의 pH 반응성을 테스트했다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 서로 다른 pH 값에서의 광학 현미경 사진이다. 도 5를 참고하면, 여기서 pH ≤ 5의 녹색 반사는 pH 6 및 7에서 노란색으로 전환되었다. pH 8에서 주황색, 그리고 마지막으로 pH ≥ 9에서 빨간색이었다. 반사된 색상 변화 외에도, CLC_solid-PAA 액적을 둘러싼 PAA 매트릭스가 분리되고 점에 구멍이 pH ≥ 5에서 생성되었다. pH 수준이 증가함에 따라 구멍이 확장되었다.

전체적인 모양은 젤라틴 물질로 둘러싸인 개구리 배아의 모양과 비슷했다. 반사색의 적색 편이는 높은 pH에서 음이온성 카르복실기 사이의 정전 기적 반발로 인한 PAA 사슬의 팽창 때문이었다. 팽창된 PAA 매트릭스의 크기가 CLC_solid-PAA 액적의 크기보다 클 때 CLC_solid-PAA 액적이 매트릭스에서 분리되었다. pH 값의 상승으로 인한 네트워크 확장의 결과로 빈 공간이 생겼다.

PAA 네트워크의 측정 가능한 차원의 변화는 PAA 하이드로 겔 매트릭스와 관련된 또 다른 이점을 제공했다. 반사된 색상은 어레이 필름에서 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 중앙 반사 이미지에서 파생된 CIE XYZ 좌표를 사용하여 디지털화되었다. 도 6 및 도 7은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 xy 색도 다이어그램과 pH 함수로서의 λ_dominant이다.

도 6 및 도 7을 참고하여 설명하면, λ_dominant는 pH 2에서 녹색(538nm)에서 pH 7에서 노란색(571nm)으로, 마지막으로 pH 12에서 빨간색(610nm)으로 전이되었다. 따라서 이러한 계산된 l_dominant 값은 동안 광학현미경을 사용하여 관찰된 색상(도 5)과 일치했다. 다양한 pH 값에서 PAA 패턴 배열 매트릭스의 도트에서 포토닉 IPN CLC_solid 액적의 직경 변화를 보여준다. 여기서 직경은 pH 5로 약간 증가한 후 pH 6과 7 사이에서 단계적으로 증가하고 pH ≥ 8에서 약간의 증가가 관찰되었다. 이 경향은 반사된 색상에서 관찰된 변화와 유사하며, 반사된 색상 변화는 부풀어 오른 PAA 네트워크 때문이었다.

패턴화된 필름은 평균적으로 많은 점을 가지도록 제작할 수 있다. 도 8은 본 발명의 일 제조예에 따른 어레이 패턴 필름의 광학 현미경 사진이다. 도 8의 (a)는 pH 12, (b)는 pH 2에서의 도트이다. 도 8을 참고하여 설명하면, 5×5 어레이 패턴의 광학 현미경 이미지에서 25 개의 도트가 관찰되었고, 평균 λ_dominant 및 표준 편차는 pH = 12 및 2에서 각각 611±4 nm 및 541±6 nm로 계산되었다. 작은 표준 편차(즉, pH = 12에서 4nm, pH 2에서 6nm)는 PAA 패턴 배열 매트릭스의 도트에 있는 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적이 균일하고 측정 절차가 정확함을 나타낸다. 따라서 배열 필름의 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적은 실제로 pH에 민감하며 pH 반응성 바이오 센서를 구성하는 데 사용할 수 있음을 확인하였다.

요소 바이오 센서의 반응성

요소는 신장 및 간 질환 진단에 중요한 바이오 마커이다. 본 발명의 패턴 배열 필름의 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적은 Rho-urease를 사용하여 확인된 요소 분해 효소의 고정화를 통해 요소 바이오 센서 적용에 사용되었다. 도 9는 본 발명의 일 제조예에 따라 요소 분해효소 고정화된 액적의 형광 현미경 사진이다. 도 9의 (a)는 Rho-urease의 고정화 전, (b)는 고정화 후의 사진이다. (c)는 비반응 로다밍 6G를 제거한 후의 사진이고, (d)는 포토닉 IPN CLC 액적의 단면 사진이다.

도 9의 (a), (b)를 참고하여 설명하면, 고정화 전에 청색 형광이 관찰된 반면(a), Rho-urease 고정화는 모든 미반응 로다민 6G 분자가 제거된 후 녹색으로 전환된 유사한 색의 노란색 배경과 함께 노란색으로 색이 변했다(b). 관찰된 황색 형광은 로다민 6G의 고농도 때문이었다. 이러한 관찰은 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적에 대한 고정화 과정을 확인하는 역할을 했다.

도 9의 (d)를 참고하여 설명하면, 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적 내부에서 Rho-urease의 고정화는 포토닉 IPN CLC_{solid-PAA-Rho-urease} 액적의 단면을 검사하여 확인할 수 있었다. 주변에 표시된 노란색이 액적 내부에서 볼 수 있는 것보다 더 강렬함에도 불구하고 전체 단면 영역은 노란색이었다. 이는 요소 분해효소 분자가 주변을 관통하고 IPN CLC_solid 액적 내부에 고정되었고, 더 많은 요소 분해효소 분자가 외부 표면에도 고정되었음을 나타낸다. 따라서 요소분해효소와 요소 사이의 반응은 IPN CLC_solid 액적 내부에서 발생하여 반사된 색상의 변화를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

다음으로 패턴 배열 필름의 포토닉 IPN CLC_{solid-PAA-urease} 액적의 요소에 대한 반응성을 확인하였다. 도 10은 본 발명의 일 제조예에 따른 요소 바이오 센서의 액적에 다양한 농도(C_urea)의 요소 수용액 처리 후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다. 도 10을 참고하여 설명하면, C_urea=0 및 3.5mM (i-ii)에서 관찰된 초기 녹색은 C_urea=5mM(iii)에서 노란색으로, C_urea=6.5 및 7.5mM에서 주황색으로 전환되었다(iv-v), 마지막으로 C_urea≥ 14mM에서(14mM, 60mM, 120mM) 빨간색으로 변하는 것을 확인하였다(vi-viii).

도 11은 본 발명의 일 제조예에 따른 요소 바이오 센서의 액적에 다양한 농도(C_urea)의 요소 수용액 처리 후 색상에 대해 얻은 해당 XY 색도 다이어그램과 C_urea의 함수로서 λ_dominant 플롯이다. 도 11을 참고하여 설명하면, 각각의 λ_dominant과 관련된 색상은 C_urea=0 및 3.5mM에서 녹색(567nm)에서 C_urea=5mM에서 노란색(576nm)으로, 마지막으로 C_urea=14mM에서 빨간색(593nm)으로 전환되었다. 패턴 배열 필름에서 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적의 중앙 반사 색상은 시스템의 pH 변화에 대해 유사한 반응을 보였으며, 계산된 λ_dominant 값은 광학 현미경으로 관찰된 색상과 잘 일치했다. 인간 혈액 샘플에서 추출한 요소의 비정상적인 농도는 7.5mM 이상이었다. 따라서 빨간색으로의 전환은 요독증에 대한 경보 신호로 사용될 수 있음을 확인하였다.

도 12는 본 발명의 일 제조예에 따른 요소 바이오 센서의 액적에 다양한 종류의 수용액 처리후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다. 패턴 배열 필름에서 포토닉성 IPN CLC_{solid-PAA-urease} 액적의 선택성은 요소(7.5mM, (i)), 포도당(10mM, (ii)), 콜레스테롤(6.5mM, (iii)), 아스코르브산(1.5mM, (iv)), 요산(0.4mM, (v))을 포함한 다양한 수용액(0.5mL)을 사용하여 테스트되었다. 용액의 농도는 인간 혈액에서 발견되는 정상 농도 범위보다 약간 높게 유지되었다. 도 12를 참고하여 설명하면, 요소를 제외한 기타 수용액에 대하여 액적의 초기 녹색은 변하지 않았으며, 이를 통해 액적이 매우 선택적이어서 효소 기반 요소 바이오 센서 역할을 할 수 있음을 확인할 수 있었다.

포도당 바이오 센서의 반응성

패턴 배열 필름의 도트에 있는 포토닉 IPN CLC_{solid-PAA-PBA} 액적을 포도당 검출 목적으로 테스트했다. 도 13은 본 발명의 일 제조예에 따른 포도당 바이오 센서의 액적에 다양한 농도(C_g)의 포도당 수용액 처리 후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다. 도 13을 참고하여 설명하면, C_g=0 및 2mM(i-ii)의 초기 석회 색상은 Cg=5mM(iii)에서 녹색, C_g=10mM에서 노란색으로 전환되었다(iv). C_g=15mM에서 주황색(v), C_g=20mM에서 마지막으로 주황색/빨간색으로 표시되었다(vi). 당뇨병 환자로부터 채취한 인간 혈액 샘플의 비정상적으로 높은 포도당 농도는 11mM 이상이었다. 따라서 눈에 띄는 주황색/빨간색 변화는 당뇨병에 대한 경보 신호로 사용될 수 있음을 확인하였다.

도 14는 본 발명의 일 제조예에 따른 포도당 바이오 센서의 액적에 다양한 농도(C_g)의 포도당 수용액 처리 후 색상에 대해 얻은 해당 XY 색도 다이어그램과 C_g의 함수로서 λ_dominant 플롯이다. λ_dominant 플롯은 각각 C_g의 함수로 결정되었다. 도 14를 참고하여 설명하면,계산된 λ_dominant 값은 광학 현미경으로 관찰된 색상과 일치함을 확인할 수 있었다.

도 15는 본 발명의 일 제조예에 따른 포도당 바이오 센서의 액적에 다양한 종류의 수용액 처리후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다. 패턴 배열 필름에서 포토닉 IPN CLC_{solid-PAA-PBA} 액적의 선택성은 요소(7.5mM, (i)), 포도당(10mM, (ii)), 콜레스테롤(6.5mM, (iii)), 아스코르브산(1.5mM, (iv)), 요산(0.4mM, (v))을 포함한 다양한 수용액(0.5mL)을 사용하여 테스트되었다. 수용액의 농도는 인간 혈액에서 발견되는 정상 농도 범위보다 약간 높게 유지되었다. 도 15를 참고하여 설명하면, 포도당 샘플을 제외하고 초기 녹색 반사 색상은 변하지 않았으며, 이는 포토닉 IPN CLC_{solid-PAA-PBA} 액적이 매우 선택적이므로 비효소적 포도당 바이오 센서로 적용될 수 있음을 나타낸다.

이온 바이오 센서의 반응성

도트 배열의 포토닉 IPN CLC_{solid-PAA-KOH} 액적은 금속 이온 검출 목적으로 적용 가능함을 확인하였다. 즉, 1M KOH 수용액을 처리하여 카르복실기 사이의 수소 결합을 억제하고, 서로 얽힌 PAA 네트워크를 확장하며, 포토닉 나선 피치를 증가시키고, 반사된 색상을 적색편이 하는 것으로 알려진 COO-K⁺ 염을 형성하도록 제조하였다.

도 16은 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 다양한 농도(C_Ca)의 칼슘 수용액 처리 후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다. 초기 액적은 물에서 빨간색 반사 색상을 나타냈다. Ca²⁺와 같은 2가 금속 이온이 -COO-Ca-OOC- 결합을 형성할 수 있기 때문에 포토닉 IPN CLC_{solid-PAA-KOH} 액적의 팽창 정도는 칼슘 이온 수용액 처리 후 감소될 수 있다. 도 16을 참고하여 설명하면, 초기 적색반사 색상(i)은 C_Ca = 0.1mM(ii), 노란색 C_Ca = 0.2mM (iii), 라임색 C_Ca = 0.3mM (iv), 마지막으로 C_{Ca =} 0.4mM에서 녹색으로 변함을 확인하였다(v-vi). 이는 칼슘 이온 수용액으로 처리한 후 PAA 네트워크에서 -COO-Ca-OOC- 결합이 형성되었음을 나타낸다. C_Ca가 상승함에 따라 팽창 감소의 정도(청색편이의 정도)가 증가했다. 이를 통해 패턴 배열 필름의 포토닉 IPN CLC_{solid-PAA-KOH} 액적은 2가 금속 이온을 감지하는 데 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

도 17은 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 다양한 농도(C_Ca)의 칼슘 수용액 처리 후 색상에 대해 얻은 해당 XY 색도 다이어그램과 C_Ca의 함수로서 λ_dominant 플롯이다. λ_dominant 플롯은 각각 C_Ca의 함수로 결정되었다. 도 17을 참고하여 설명하면, 중앙 반사색(도 16)에서 얻은 xy색도 다이어그램에서 측정된 λ_dominant 값에 표시된 것처럼 광학 현미경으로 관찰된 색상과 일치하였다.

2가 이온을 갖는 가교 구조의 형성 및 선택성을 다양한 금속 이온을 사용하여 확인하였다. 도 18은 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 다양한 종류의 수용액 처리후 색상을 나타낸 광학 현미경 사진이다. 구체적으로. 금속 수용액(0.5 mL), 즉 NaNO₃(0.8mM), Cu(NO₃)₂(0.4mM), Zn(NO₃)₂ (0.4mM), FeCl₂(0.4mM), Mg(NO₃)₂(0.4mM) 및 CaCl₂ (0.4mM) 첨가 후 CLC_{solid-PAA-KOH} 액적의 광학 현미경 이미지를 보여준다. 이온의 원자가를 고려할 때 Na⁺의 농도는 2가 이온의 두 배였다. 도 18을 참고하여 설명하면, 1가 Na⁺ 이온을 추가하면 1가 이온이 가교구조를 형성할 수 없기 때문에 CLC_{solid-IPN-KOH} 액적의 적색반사 색상에 거의 변화가 없었다(i). 그러나 Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺ 및 Ca²⁺와 같은 2가 이온으로 처리하면 주황색/노란색(Cu²⁺, (ii)), 라임색(Zn²⁺, (iii)), 라임색/녹색(Fe²⁺, (iv)), 마지막으로 녹색(Mg²⁺ 및 Ca²⁺, (v-vi))이 되었다. 대부분의 2가 금속 이온은 가교구조를 형성할 수 있었기 때문에 CLC_{solid-PAA-KOH} 액적의 팽창을 방지하고 반사된 색상의 청색 편이를 유도했다.

도 19는 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 다양한 종류의 금속 수용액 처리 후 색상에 대해 얻은 해당 XY 색도 다이어그램과 2가 금속 이온 종류의 함수로서 λ_dominant 플롯이다. 도 19를 참고하여 설명하면, λ_dominant값은 Cu²⁺, Zn²⁺, Fe2+, Mg²⁺ 및 Ca²⁺에 대해 각각 582, 573, 568, 555 및 548 nm였다. 청색편이의 크기는 Cu²⁺ < Zn²⁺ < Fe²⁺ < Mg²⁺ < Ca²⁺의 순서를 따랐다.

다양한 CaCl₂ 수용액을 사용하여 이미 테스트된 패턴 배열 필름에서 CLC_{solid-PAA-KOH} 액적의 재사용 가능성은 -COO-Ca-COO- 구조에서 -COOH를 회수할 수 있는 HNO₃ 처리 후 평가되었다. 도 20은 본 발명의 일 제조예에 따른 이온 센서의 액적에 대한 4주기에 걸쳐 순차적인 KOH(1M, 0.5mL, (a, d, g, j)), CaCl₂(0.3mM, 0.5mL, (b, e, h, k)) 및 HNO₃(0.1M, 0.5mL, (c, f, i, l)) 수용액 처리 후 광학 현미경 사진이다. 도 20을 참고하여 설명하면, 첫번째 주기 동안 순차적인 KOH, CaCl₂ 및 HNO₃ 처리 후 빨간색, 노란색 및 녹색 반사가 관찰되었다. CaCl₂ 처리 후 노란색 반사 색상은 -COO-Ca-COO- 구조에서 -COOH의 형성을 통해 HNO₃ 처리 후 녹색이 되었다. 두번째 주기 동안 KOH, CaCl₂, HNO₃를 사용하여 동일한 순차 처리를 한 후 적색, 황색 및 녹색 반사 색상이 완전히 회복되었다. 이 발견은 패턴 배열 필름의 Ca²⁺ 처리된 CLC_{solid-PAA-KOH} 액적이 HNO₃ 처리를 통해 재사용 가능함을 확인할 수 있었다. 녹색과 빨간색의 교대가 네번째 주기가 끝날 때까지 관찰되었다.

다중 탐지용 바이오 센서의 반응성

개별적으로 분리된 semi-CLC_solid-PAA 액적에 대하여 pH 반응성 테스트한 결과는 다양한 pH 수준에서 패턴 배열 필름의 도트에있는 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적에 대해 기록된 결과와 유사하게 나타났다. 이는 선형 PAA 사슬이 거울상 도펀트 추출을 통해 생성된 CLC_solid 액적의 공간에서 서로 얽혀 있음을 나타낸다. 이에 기능화된 semi-CLC_{solid-PAA-KOH}, semi-CLC_{solid-PAA-urease} 및 semi-CLC_{solid-PAA-PBA} 액적은 모델 연구로 다중 검출에 이용하였다. 패턴 배열 필름을 사용하거나 패턴 배열 필름의 원하는 위치에서 CLC_solid 액적을 먼저 구획화함으로써 다중 검출을 수행하였다. 4개의 서로 다른 위치에서 CLC_solid 액적의 구획화는 CLC_solid 액적을 O₂ 플라즈마 처리된 PDMS 몰드의 서로 다른 구획에 주황색/빨간색, 노란색/녹색, 녹색 및 녹색/파란색 중심 색상(Φ= 24.0, 29.4, 31.5 및 33.0wt%에서 각각 준비됨)별로 배치하였다. 서로 다른 Φ를 가진 CLC_solid 액적은 각 구역에서 구획화될 수 있으며, 이는 기능화된 CLC_solid-PAA 액적이 사용된 경우 CLC_solid 액적이 다중 검출에 사용될 수 있음을 나타낸다. 개별적으로 분리된 semi-CLC_solid-PAA는 다중 감지를 위해 기능화되고 분류될 수 있었다.

도 21은 본 발명의 일 제조예에 따라 구획화된 다중 탐지용 바이오 센서의 액적의 광학 현미경 사진이다. (a)는 각각 왼쪽 상단, 오른쪽 상단, 왼쪽 하단 및 오른쪽 하단 구역에 semi-CLC_solid-PAA, semi-CLC_{solid-PAA-KOH}, semi-CLC_{solid-PAA-urease} 및 semi-CLC_{solid-PAA-PBA} 액적을 포함하는 6개의 패턴 배열 필름 사진을 보여준다. semi-CLC_{solid-PAA-KOH}(ii), semi-CLC_{solid-PAA-urease}(iii) 및 semi-CLC_{solid-PAA-PBA} (iv) 액적에 대한 반응이 CaCl₂에 대해 기록되었다. 모든 semi-CLC_solid-PAA 액적은 Φ= 29.4 wt %로 준비되었다. (b) 내지 (d)는 CaCl₂(0.4mM), 요소(14mM) 및 포도당 (15mM) 수용액 처리 후 4개 구역((a)의 빨간색 상자 영역)의 확대된 개별 점들의 광학 현미경 이미지를 보여준다. semi-CLC_{solid-PAA-KOH} (ii), semi-CLC_{solid-PAA-urease} (iii) 및 semi-CLC_{solid-PAA-PBA} (iv) 액적의 CaCl₂. 요소, 수용액에 녹아있는 포도당에 대한 반응이 기록되었다. 반면 semi-CLC_solid-PAA(i) 액적은 어떤 처리에도 반응하지 않았다. 이러한 결과는 semi-CLC_{solid-PAA-KOH}, semi-CLC_{solid-PAA-urease} 및 semi-CLC_{solid-PAA-PBA} 액적이 각각 2가 금속 이온, 요소 및 포도당에 대해 매우 선택적이고 하나의 패턴 배열 필름에서 다중 검출이 가능함을 나타낸다.

순수한 DI물 대신 DI물로 희석된 인간 혈청으로 동일한 실험을 수행하였다. 도 22는 본 발명의 일 제조예에 따른 따라 구획화된 다중 탐지용 바이오 센서에 인간 혈청을 첨가한 액적의 광학 현미경 사진이다. 도 22를 참고하면, 수용액과 유사한 결과가 얻어졌는데 이는 포토닉 IPN CLC_solid 액적이 인간 혈액 샘플과 함께 사용될 수 있음을 나타낸다. (i)는 CLC_solid-PAA, (ii)는 CLC_{solid-PAA-KOH}, (iii)는 CLC_{solid-PAA-urease}, (iv)는 CLC_{solid-PAA-PBA} 액적이고, (a)는 CaCl₂ (0.4 mM, 0.5mL), (b)는 요소(14 mM, 0.5mL), (C)는 포도당(15 mM, 0.5mL)를 처리한 조건이다.

혼합 용액의 선택성과 관련하여 CaCl₂(0.4mM) + 요소(14mM), CaCl₂(0.4mM) + 포도당(15mM), 요소(14mM) + 포도당(15mM) 및 CaCl₂(0.4mM) + 요소(14mM) + 포도당(15mM) 수용액(0.5mL) 처리 후 4개 구역의 각 점들의 반사색을 확인하였다. 도 23은 본 발명의 일 제조예에 따른 따라 구획화된 다중 탐지용 바이오 센서에 혼합 용액을 첨가한 후 나타난 액적의 광학 현미경 사진이다. (i)는 CLC_solid-PAA, (ii)는 CLC_{solid-PAA-KOH}, (iii)는 CLC_{solid-PAA-urease}, (iv)는 CLC_{solid-PAA-PBA} 액적이고, (a)는 CaCl₂(0.4 mM)+요소(14 mM), (b)는 CaCl₂(0.4 mM)+포도당(15 mM), (c)는 요소(14 mM) + 포도당(15 mM), (d)는 CaCl₂(0.4 mM)+ 요소(14 mM)+포도당(15 mM) 수용액(0.5 mL)을 첨가한 경우이다.

도 23을 참고하여 설명하면, CaCl₂/요소, CaCl₂/포도당, 요소/포도당 및 CaCl₂/요소/포도당 수용액은 semi-CLC_{solid-PAA-KOH}/semi-CLC_{solid-PAA-urease}, semi-CLC_{solid-PAA-KOH}/semi-CLC_{solid-PAA-PBA}, semi-CLC_{solid-PAA-urease}/semi-CLC_{solid-PAA-PBA}, semi-CLC_{solid-PAA-KOH}/semi-CLC_{solid-PAA-urease}/semi-CLC_{solid-PAA-PBA} 액적에 반응함을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 구획화된 semi-CLC_solid-PAA 액적을 통해 PAA 패턴 배열 필름으로 다중 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

포토닉 CLC_solid 액적은 패턴 배열 필름의 도트에서 개별 소형 센서로 사용할 수 있다. 포토닉 CLC_solid 액적은 패턴 배열 필름에서 서로 얽힌 PAA 네트워크가 있는 전체(full) 및 반(semi) IPN 구조로 사용되었다. PDMS 몰드의 구멍에 위치한 포토닉 CLC_solid 액적이 PDMS 몰드에서 벗겨지고 수용체로 기능화된 교차 결합 가능한 AA 혼합물을 사용하여 UV 경화될 때 패턴 배열 필름의 전체 포토닉 IPN CLC_solid 액적이 생성되었다. 그 후에 점에 작은 분석 구형 포토닉 센서가 많이 있는 패치형 패턴 센서로 사용될 수 있다.

포토닉 CLC_solid 액적의 semi-IPN 구조와 여러 센서에 대한 적용은 가교제 없이 AA 모노머로 UV 경화된 포토닉 CLC_solid 액적을 사용하여 조사되었다. PAA 매트릭스에서 분리, 다양한 수용체를 사용한 기능화, 도트의 다양한 위치에서의 구획화, 교차 결합 가능한 AA 혼합물을 사용한 UV 경화는 모두 패턴 배열 필름을 생성하였다. 패턴 배열 필름의 포토닉 IPN CLC_solid-PAA 액적은 각각 KOH 처리, 요소분해효소 고정화 및 비효소 PBA와의 반응을 통해 2가 금속 이온, 요소 및 포도당의 검출에 성공적으로 적용되었다. 그 결과 전체 IPN 구조의 단일 분석물 센서가 만들어졌으며 semi-IPN 구조를 사용하여 다중 분석물 센서가 개발되었다. 결과 센서는 인간 혈청의 주요 구성 요소에 대해 매우 선택적이며, 고체 상태 구조를 통해 촉진되는 구성 요소의 안정성에 상대적으로 우수한 감도를 나타냈다. 포토닉 IPN CLC_solid 액적이 함침된 패턴 어레이 필름은 평균 데이터의 정확도를 높이고 다양한 분석 도트를 사용한 다중 검출을 제공하여 반응형 하이드로 겔 매트릭스 및 수용체의 다양한 조합으로 다양한 분야에 응용이 가능한 점에서 우수하다.

전술한 내용은 후술할 발명의 청구범위를 더욱 잘 이해할 수 있도록 본 발명의 특징과 기술적 장점을 다소 폭넓게 상술하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

요소 분해효소가 고정된 상호 침투 고분자 네트워크(IPN) 구조의 액적, PBA(Phenylboronic acid)가 고정된 상호 침투 고분자 네트워크(IPN) 구조의 액적, 및 1가 양이온으로 기능화된 상호 침투 고분자 네트워크(IPN) 구조의 액적으로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 액적을 포함하고,
상기 상호 침투 고분자 네트워크(IPN)구조는 전체 상호 침투 고분자 네트워크(full-IPN) 또는 반침투 고분자 네트워크(semi-IPN)구조이며,
상기 선택된 액적은 구형상(sphere)으로 각각 구획화된 영역에 분리하여 배치된 다중 탐지용 센서.
제 1 항에 있어서,
상기 상호 침투 고분자 네트워크(IPN) 구조의 액적은 비반응성 키랄 도판트를 제거한 콜레스테릭 액정(CLC) 액적 및 상기 콜레스테릭 액정(CLC) 액적의 내부공간에 침투된 수화겔을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 탐지용 센서.
제 1 항에 있어서,
상기 상호 침투 고분자 네트워크(IPN) 구조의 액적은 완전한 고상인 것을 특징으로 하는 다중 탐지용 센서.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 1가 양이온은 K⁺또는 Na⁺인 것을 특징으로 하는 다중 탐지용 센서.