KR102500978B1

KR102500978B1 - 이속사졸 유도체를 포함하는 탈모 완화 및 발모 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102500978B1
Application number: KR1020210059901A
Authority: KR
Inventors: 조성은; 이중회
Original assignee: 조성은; 이중회
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2023-02-17
Also published as: KR20220152684A

Abstract

본 발명은 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 유효성분으로 포함하는 탈모 완화 및 발모 촉진용 약학 조성물 및 탈모 완화 및 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 유효성분으로 포함하는 조성물은 혈관신생 자극을 통한 탈모 완화 및 발모 촉진 효과를 나타내어, 탈모증의 치료 및 예방을 위한 약학 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이속사졸 유도체를 포함하는 탈모 완화 및 발모 촉진용 조성물{COMPOSITIONS FOR REDUCING HAIR LOSS AND PROMOTING HAIR GROWTH COMPRISING ISOXAZOLE DERIVATIVE}

본 발명은 이속사졸 유도체를 포함하는 탈모 완화 및 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 유효성분으로 포함하는 탈모 완화 및 발모 촉진용 약학 조성물; 및 탈모 완화 및 발모 촉진용 화장료 조성물에 관한 것이다.

모발은 체온을 조절하고 물리적 충격을 완화하며 모발과 연결된 모낭신경수용체 등을 통해 감각을 수용할 수 있도록 하는 생물학적 기능을 가진다. 또한, 특히 인간의 경우 나이, 성 또는 종교와 같은 개인적인 믿음이나 사회적인 지위를 나타내는 역할을 하기도 한다.

모발은 성장기(anagen), 퇴행기(catagen) 및 휴지기(telogen)로 구성되는 모주기(hair cycle)를 거친다. 좀더 상세하게, 모유두(dermal papilla)의 자극을 받은 모모세포(keratinocyte)가 활발히 분열 및 증식하여 모발이 자라는 성장기, 모구(hair bulb)에 혈액공급이 끊기고 모유두가 모낭으로부터 분리되는 퇴행기 및 세포 증식이 멈춰 모발이 성장하지 않는 휴지기를 거쳐 다시 성장기로 들어가거나 모발이 두피로부터 빠지는 탈락기(exogen)로 가게 된다. 사람의 모발은 각각 독립된 성장주기를 가져 일부는 탈락기로, 일부는 성장기로 들어가며 전체적으로 동일 수준의 모발수를 유지하게 되는데, 이러한 균형이 탈락기로 기울어 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없어지는 상태를 탈모증(alopecia)이라 한다.

탈모증은 당사자들에 심각한 정신적인 고통을 유발하며, 최근 증상이 발생하는 연령층이 낮아지면서 이에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다. 탈모증의 원인은 다양하며, 크게 남성호르몬의 변성, 자가면역, 내분비질환, 출산, 폐경, 노화 등의 내적인 요인과 영양결핍, 약물, 스트레스, 두피 오염, 두피 건조, 모낭충 등의 외적인 요인이 있다.

이러한 탈모증을 개선하기 위해 많은 종류의 탈모 개선 또는 발모 유도 제제가 개발되고 있다. 현재 미국 식약의약품안전청(FDA) 승인 약물치료제 중 미녹시딜(Minoxidil)제제와 피나스테라이드(Finasteride) 외에는 공인된 치료제가 없는 실정이며, 상기 2가지 약품은 지속적으로 복용해야 효과가 있으므로 장기노출에 따른 부작용, 비용 및 불편함의 문제가 있다. 또한, 이 중 피나스테라이드는 탈모 방지 효과는 있지만 장기간 휴지기 상태에 있는 모발의 성장 효과가 미미하고 호르몬제로서 각종 부작용이 있다. 위와 같은 합성의약품들이 가지는 문제에 따라, 그 대안으로 식물 추출물 등의 천연 유래 물질이 개발되고 있으나, 실제 임상에서 사용하는 경우 탈모 개선 효과가 충분치 않은 등의 문제가 있다.

따라서 효과적이고 안전하며 지속적인 복용이 필요 없는 탈모 완화 및 발모 촉진 효과를 가지는 물질에 대한 요구가 존재한다.

한편, 모발과 관련된 신호전달 및 생체 변화에 대해서는 몇 가지 방향의 연구가 진행되어 왔다. 그 중 하나는 모주기가 혈관발달과 연관되어 있다는 것으로, 모낭 부근의 혈관은 성장기에 크게 증폭되었다가 퇴행기에 빠르게 감소하는 것으로 나타났다(Muller-Rover S. et al., J. Invest. Dermatol. (2001), 117(1):3-15). 이러한 혈관의 증감은 혈관신생을 촉진하는 신호물질인 VEGF(vascular endothelial growth factor)의 증감과 연동되고, VEGF가 증가된 유전자조작동물은 더 큰 모낭을 가지며(Yano K. et al., J. Clin. Invest. (2001), 107(4):409-17), VEGF를 저해 시 모낭이 가늘어지고(Yano K. et al., J. Invest. Dermatol. (2003), 120(1):14-9), 항-혈관신생 치료시 모발이 얇아지는 것이 보고되기도 하였다(Kubota Y. Keio J. Med. (2012), 61(2):47-56). 실제로, 승인된 탈모 치료제인 미녹시딜의 주요 발모 촉진 메커니즘으로 VEGF 생산 유도를 통한 혈관생성이 제시된 바 있다(Messenger A. G. & Rundegren J., Br. J. Dermatol. (2004), 150(2):186-94). 이러한 연구 결과들은 혈관신생을 자극하는 것이 모발 성장을 촉진하고 탈모를 개선할 수 있는 전략이 될 수 있음을 가리킨다.

본 발명의 발명자들은 앞서 수세미 수액의 주름방지, 주름개선, 항-UV손상 및 미백 효과와 관련된 유효성분으로서 4-bromo-3-methylisoxazol-5-amine(5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole과 상동)을 발굴한 바 있다(대한민국 공개특허 제10-2021-0023155호). 동 발명자들은 상기 물질에 대해 기존에 알려지지 않았던 혈관신생 자극 효과를 밝히고, 이를 통해 탈모 완화 및 발모 촉진을 유도할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2021-0023155호 (2021.03.04.)

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 탈모증을 예방 또는 치료하고 발모를 촉진할 수 있는 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 탈모 완화 및 발모 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

일 구현예에서, 상기 조성물 내에 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 0.1 μM 이상으로 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 탈모 완화 및 발모 촉진은 혈관신생 자극을 통한 탈모 완화 및 발모 촉진일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 피부외용제일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 탈모 완화 및 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 피부외용제일 수 있다.

본 발명에 의해, 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 처리하면 HUVEC 세포의 성장, 이동성, 혈관생성이 촉진되고, FAK, AKT, ERK1/2 단백질의 인산화가 증가되어 세포 내 신호 전달이 촉진되었으며, 신생혈관생성 연관 단백질이 증가되었을 뿐만 아니라, 누드마우스에서 뚜렷한 발모 효과 및 털 길이의 현저한 증가가 확인되어, 상기 화합물이 혈관신생 자극을 통한 탈모 완화 및 발모 촉진 효과가 우수하다는 것이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 유효성분으로 포함하는 조성물은 탈모 치료 효과가 필요한 약학 및 화장품 분야에서 탈모를 방지하거나 발모를 촉진할 수 있는 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 인간배꼽정맥세포(HUVEC)에 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 0, 0.5, 1, 5, 10 μM로 처리한 후, (A) 대조군(0 μM) 대비 성장율(viability), (B) 대조군(0 μM) 대비 이동한 세포(Migrated cells)의 비율 및 (C) 혈관 형성(Tube formation) 정도를 나타내는 교차점의 수(# of junctions)이다.
도2는 HUVEC에 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 0, 0.5, 1, 5, 10 μM로 처리한 후, FAK, AKT, ERK1/2 단백질의 인산화 정도를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도3은 HUVEC의 배양배지에 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole 10 μM을 24시간 처리한 후, 혈관신생(angiogenesis)에 연관된 4개 단백질(Ang-2, Endoglin, SerpinE1, Thrombopontin-1) 발현에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도4는 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole 비함유 크림(Mock)을 피부에 도포 시 누드 마우스의 모발 성장에 나타나는 영향을 보여주는 결과이다.
도5는 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole 10 μM이 함유된 크림을 피부에 도포 시 누드 마우스의 모발 성장에 나타나는 영향을 보여주는 결과이다.

본 발명의 일측면에 따른 탈모 완화 및 발모 촉진용 약학 조성물은, 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함한다.

[화학식 1]

일 구현예에서, 상기 약학 조성물 내에 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 0.1 μM 이상, 바람직하게 0.5 μM 이상, 더욱 바람직하게 1 μM 이상, 가장 바람직하게 10 μM 이상 100 mM 이하로 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 탈모 완화 및 발모 촉진은 혈관신생 자극을 통한 탈모 완화 및 발모 촉진일 수 있다. 5-amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 처리하면, HUVEC 세포의 성장, 이동성, 혈관생성이 촉진되고, FAK, AKT, ERK1/2 단백질의 인산화가 증가되어 세포 내 신호 전달이 촉진되었으며, 신생혈관생성 연관 단백질이 증가되었을 뿐만 아니라, 누드마우스에서 뚜렷한 발모 효과 및 털 길이의 현저한 증가가 확인되어, 상기 화합물이 혈관신생 자극을 통한 탈모 완화 및 발모 촉진 효과가 우수하다는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 크림제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

바람직하게, 상기 약학 조성물은 피부외용제일 수 있다. 상기 피부외용제는, 예컨대, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다. 상기 조성물이 피부외용제인 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 유효성분의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 유효성분 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르며, 환자에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 예를 들면, 상기 유효성분은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.001 내지 90 % 중량백분율로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 피부, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 탈모 완화 및 발모 촉진용 화장료 조성물은, 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함한다.

[화학식 1]

일 구현예에서, 상기 화장료 조성물 내에 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 0.1 μM 이상, 바람직하게 0.5 μM 이상, 더욱 바람직하게 1 μM 이상, 가장 바람직하게 10 μM 이상 100 mM 이하로 포함될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 화장료 조성물은 피부외용제일 수 있다.

이때, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 또는 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 스프레이, 헤어젤, 헤어팩, 샴푸, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 헤어에센스, 패취 또는 분무제 등과 같은 제형을 가질 수 있다.

바람직하게 본 발명의 화장료 조성물은 액상, 크림상, 페이스트상, 또는 고체상 등 두피에 적용시킬 수 있는 모든 제형으로 제조할 수 있고, 통상의 첨가제를 가하여 모발 성장 촉진을 위한 샴푸, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 액상의 발모제 타입 등의 조성물로 제조될 수 있으며, 여기에는 이들 제형의 에어로졸, 파우더 타입도 포함된다.

또한, 상기 화장료 조성물은 상기 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 외에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 샴푸 제형인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 화장료 조성물로 제품화되는 경우에, 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 샴푸 또는 린스 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장료 조성물의 경우에는 상기 유효성분을 비교적 높은 농도로 포함시킬 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 피부에 머무르게 되는 스프레이, 헤어크림 또는 헤어에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장료 조성물의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장료 조성물에 비해 낮은 농도의 상기 유효성분을 포함시켜도 무방할 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 시약 및 실험방법

(1) 세포 배양

인간 배꼽 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA)에서 구입하였다. HUVEC는 5 % CO₂포함 가습 대기, 37 ℃ 조건으로 EGM-2 Bulletkit 배지(Lonza Biologics, Hopkinton, MA)에서 배양하였다. 모든 세포 실험은 3-7 계대 내의 HUVEC을 사용하여 수행하였다.

(2) 시약

phosphor-FAK (Tyr397), FAK, phosphor-AKT (Ser473), AKT, phosphor-ERK1/2 (Thr202/204), ERK1/2, CD31, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)에 대한 항체는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole은 시그마 알드리치(SIGMA ALDRICH, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

(3) 세포 성장율 측정

5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole 처리 후 세포 성장율을 측정하기 위하여, WST-1[2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium] 시약 (Nalgene, Rochester, NY)을 사용하였다. 요약하면, HUVEC(5×10³/웰)를 96웰 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에 접종(seed)하고 37 ℃에서 72 시간 동안 서로 다른 군에 0.5, 1, 5 및 10 μM 농도의 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 처리하였다. WST-1 용액 10 μL을 각 웰에 첨가하고 10 분 정도 지난 다음, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). 그 결과, 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole를 처리하지 않은 군과 대비하여 그 처리 농도가 높아질수록 성장율이 증가하는 경향을 나타내며 5 및 10 μM을 처리한 군들에서 성장율이 유효하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 1A).

(4) 세포 이동성(migration) 평가

24-트렌스웰(24-Transwell) 장치(Corning, NY, USA)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 세포 이동성 평가를 수행하였다. 혈청 비포함 RPMI 배지를 포함하는 상부 챔버에 세포를 6 시간 동안 적용하였다. 트렌스웰 필터의 뒷면으로 이동한 세포를 6 시간 동안 염색하였다. 용출된 염료는 ELISA 판독기(Bio-Rad)로 560 nm에서 측정하였다.

그 결과, 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole를 처리하지 않은 군과 대비하여 그 처리 농도가 높아짐에 따라 세포 이동성 역시 증가하는 경향을 나타내었고, 특히 5 및 10 μM을 처리한 군들에서 세포 이동이 유효하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 1B).

(5) 내피 혈관(endothelial tube) 형성 평가

성장인자-감소 마트리젤(Matrigel, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 250 μL를 사용하여 24웰 플레이트 (SPL Life Sciences, Seoul, Korea)를 코팅하고 37 ℃에서 30 분 동안 중합되도록 하였다. 0.5, 1, 5 및 10 μM 농도의 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 포함하는 500 μL 무-혈청 배지에 HUVEC (3 x 10⁴세포/웰)을 현탁시켰다. 37 ℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경을 이용하여 웰당 4 개의 대표적 필드 사진을 촬영하였다. 내피 혈관(endothelial tube)은 2개 이상 가지 돌출의 시작점으로 정의되는 교차점의 수를 세어 정량하였다.

그 결과, 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole를 처리하지 않은 군과 대비하여 그 처리 농도가 높아질수록 교차점의 숫자가 증가하는 경향을 보였고, 특히 5 및 10 μM을 처리한 군들에서 교차점 수가 유효하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 1C).

(6) 웨스턴 블롯(Western blot) 분석

5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole의 처리에 의한 HUVEC의 세포 내 신호 전달의 시간에 따른 변화를 평가하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 이때, 세포를 10μM의 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole 로 지정된 시간(3’, 30’, 6 h, 12 h)까지 처리한 다음, 프로테아제 및 포스파타제 억제제와 함께 M-PER 용해 완충액(Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA)에서 용해시켰다. 이때, 분석대상 단백질은 phosphor-FAK (Tyr397), FAK, phosphor-AKT (Ser473), AKT, phosphor-ERK1/2 (Thr202/204), ERK1/2이었으며, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)를 대조군으로 하였다. 이들 단백질에 대한 항체는 모두 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 밴드는 X-ray 필름을 사용하여 웨스턴 블롯 검출 시약(iNtRON, Seoul, Korea)으로 시각화하고 ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 농도계(densitometry) 분석으로 측정하였다.

그 결과, FAK, AKT 및 ERK의 인산화가 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 처리하지 않은 경우에 비해 처리한 경우 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 처리 시간이 길어짐에 따라 인산화된 FAK, AKT 및 ERK가 증가한다는 것을 확인할 수 있었다(도2). 이들 FAK, AKT 및 ERK 단백질은 혈관신생을 촉진하는 것으로 알려진 신호물질인 VEGF의 하위 신호전달단백질로서, VEGF가 그 수용체를 활성화시키면 인산화되는 것으로 알려져 있다.

(7) 혈관신생 효능 평가

5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole 처리에 의한 혈관신생 신호 전달을 확인하기 위하여, 인간 혈관신생 어레이 키트(Human Angiogenesis Array kit, R & D Systems, Minneapolis, MN)를 제조업체의 지시에 따라 사용하였다.

5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole 10 μM을 24시간 처리함에 따라, HUVEC 내 혈관신생과 관련된 단백질인 Ang-2, Endoglin, SerpinE1 및 Thrombopontin-1의 발현이 증가된 것으로 나타났다(도3).

(8) 생체내( in vivo ) 모델 실험

6-8 주령 BALB/c 누드마우스는 오리엔트(한국 성남)에서 구입하였다. 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole 비포함 크림(정제수, 1.2-헥산다이올, 올리브유, 올리브유화왁스, 몬타왁스, 알로에베라잎즙) 및 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole 포함 크림(정제수, 1.2-헥산다이올, 올리브유, 올리브유화왁스, 몬타왁스, 알로에베라잎즙, 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole)은 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole을 제외한 모든 성분이 동일하도록 제조하였다. 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole 함유 크림은 30일 동안 1일 2회(500 μL씩 2회), 누드마우스 등에 도포하여 실험군으로, 비포함 크림 도포군은 대조군(Mock)으로 사용하였다. 이때, 체중은 정기적으로 기록하였으며, 동물 관리 및 실험은 제주 대학교 동물 생명 윤리위원회에서 승인한 지침에 따라 수행하였다.

그 결과, 대조군 누드마우스에서는 육안으로 털을 확인하기 어려운 반면(도 4), 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole 포함 크림 처리군의 경우 몸 전반적으로 털이 나 있는 것을 쉽게 확인할 수 있었다(도5).

(9) 통계분석

세포 성장율, 세포 이동성 및 내피 혈관 형성 평가 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표시하였다. 2개의 독립적 샘플 간의 비교를 위한 유의 수준은 t-검정(Student's t-test)를 사용하여 결정하였다. 각 군은 일원 분산분석(analysis of variance, ANOVA)과 Tukey 사후검정(Tukey's post-hoc test) (유의적인 주요 효과에 대하여 적용함)으로 비교하였다(SPSS 12.0K for Windows; SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

종합해보면, 5-Amino-4-bromo-3-methylisoxazole은 혈관신생을 자극할 수 있으며, 이에 따라 탈모를 완화하고 발모를 촉진할 수 있는 것으로 나타났다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 탈모 완화 및 발모 촉진용 약학 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 0.1 μM 이상으로 포함되는 것인, 탈모 완화 및 발모 촉진용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 발모 촉진이 혈관신생 자극을 통한 탈모 완화 및 발모 촉진인 것인, 탈모 완화 및 발모 촉진용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물이 피부외용제인 것인, 탈모 완화 및 발모 촉진용 약학 조성물.
하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 탈모 완화 및 발모 촉진용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제5항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 0.1 μM 이상으로 포함되는 것인, 탈모 완화 및 발모 촉진용 화장료 조성물.
제5항에 있어서,
상기 발모 촉진이 혈관신생 자극을 통한 탈모 완화 및 발모 촉진인 것인, 탈모 완화 및 발모 촉진용 화장료 조성물.
제5항에 있어서,
상기 조성물이 피부외용제인 것인, 탈모 완화 및 발모 촉진용 화장료 조성물.