KR102495820B1 - 5t4 및 cd3에 대한 3개 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 - Google Patents

5t4 및 cd3에 대한 3개 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR102495820B1
KR102495820B1 KR1020177018818A KR20177018818A KR102495820B1 KR 102495820 B1 KR102495820 B1 KR 102495820B1 KR 1020177018818 A KR1020177018818 A KR 1020177018818A KR 20177018818 A KR20177018818 A KR 20177018818A KR 102495820 B1 KR102495820 B1 KR 102495820B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
gly
thr
val
tyr
Prior art date
Application number
KR1020177018818A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170094319A (ko
Inventor
니코 메르텐스
필립 제프리 쿤나
아나 리타 다 폰세카 리카르도
Original Assignee
치오메 바이오사이언스 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 치오메 바이오사이언스 가부시키가이샤 filed Critical 치오메 바이오사이언스 가부시키가이샤
Publication of KR20170094319A publication Critical patent/KR20170094319A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102495820B1 publication Critical patent/KR102495820B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

본 발명은 3개 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자에 관한 것이고, 여기서 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 세포외 5T4에 결합할 수 있고, 나머지 결합 도메인(들)은 T 세포 상의 CD3 수용체 복합체에 결합할 수 있다. 더욱이, 본 발명은 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질의 생산 방법, 상기 융합 단백질의 의학적 용도 및 상기 융합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

5T4 및 CD3에 대한 3개 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 {FUSION PROTEIN COMPRISING THREE BINDING DOMAINS TO 5T4 AND CD3}
본 발명은 3개 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자에 관한 것이고, 여기서 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 세포외 5T4에 결합할 수 있고, 나머지 결합 도메인(들)은 T 세포 상의 CD3 수용체 복합체에 결합할 수 있다.
모노클로날 항체 5T4에 의해 정의된 세포 표면 항원은, 9주 발달과 같이 조기에 모든 유형의 트로포블라스트에 의해 발현되는 72-kD 당단백질이다. 성인 조직에서, 5T4 발현은 소수의 특수화된 상피 세포형으로 한정되지만, 성인 간장, 폐, 기관지, 심장, 정소, 난소, 뇌 또는 근육에서는 검출되지 않는다. 항원은, 발생 기원의 것들을 포함하여 다양한 종양 세포주에 의해 선택적으로 발현된다. 분자 특성, 비교적 제한된 정상 조직 분포 및 특정 종양 세포형에 의한 발현은 이러한 항원을 악성 종양의 진단 마커로서 사용하는데 가치가 있게 한다[참조: Hole & Stern, Br J Cancer. (1988) 57(3), 239-46].
암 및 암 진행에서 5T4의 관여에 대한 명확한 증거가 있다. 암 세포의 표면 상에서 고도의 5T4 발현은 난소암[참조: Wrigley E, McGown AT, Rennison J, et al. 5T4 oncofetal antigen expression in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 1995;5:269-274], 결장암[참조: Starzynska T, Marsh PJ, Schofield PF, Roberts SA, Myers KA, Stern PL. Prognostic significance of 5T4 oncofetal antigen expression in colorectal carcinoma. Br J Cancer. 1994;69:899-902], 자궁경부암[참조: Jones H, Roberts G, Hole N, McDicken IW, Stern P. Investigation of expression of 5T4 antigen in cervical cancer. Br J Cancer. 1990;6:69-100], 위암[참조: Starzynska T, Rahi V, Stern PL. The expression of 5T4 antigen in colorectal and gastric carcinoma. Br J Cancer. 1992;66:867-869 and above] 및 폐암[참조: Forsberg G, Ohlsson L, Brodin T, et al. Therapy of human non-small-cell lung carcinoma using antibody targeting of modified superantigen. Br J Cancer. 2001 ;85:129-136.]에 대해 제시되어 있다. 질환 진행, 즉 전이와의 연관도 또한 입증되어 있다[참조: Mulder WM, Stern PL, Stukart MJ, et al. Low intercellular adhesion molecule 1 and high 5T4 expression on tumor cells correlate with reduced disease-free survival in colorectal carcinoma patients. Clin Cancer. 1997;3:1923-1930 and Starzynska T, Wiechowska-Kozlowska A, Marlicz K, et al. 5T4 oncofetal antigen in gastric carcinoma and its clinical significance. Eur J Gastroenterol Hepatol. 1998;10:479-484. and Naganuma H, Kono K, Mori Y, et al. Oncofetal antigen 5T4 expression as a prognostic factor in patients with gastric cancer. Anticancer Res. 2002;22:1033-1038]. 암성 병변과 대조적으로 정상 조직 상에서 5T4의 발현은 제한되기 때문에[참조: AN A, Langdon J, Stern PL, Partidge M. The pattern of expression of 5T4 oncofoetal antigen on normal, dysplastic and malignant oral mucosa. Oral Oncol. 2001;37:57-64], 5T4는 표적화된 암 요법에 적합한 표적 항원으로 제안되어 왔다[참조: Woods AM, Wang WW, Shaw DM, et al. Characterization of the murine 5T4 oncofoetal antigen: a target for immunotherapy in cancer. Biochem J. 2002;366:353-365 and Hole N, Stern PL. Isolation and characterization of 5T4, A tumor-associated antigen. Int J Cancer. 1990;45:179-184].
항체에 기초하는 암 요법은 활성화하기 위해 암 세포의 표면에 단단하게 결합된 표적 항원을 필요로 한다. 표면 표적에 결합함으로써, 항체는 치명적 시그날을 암 세포에 직접 또는 간접적으로 전달할 수 있다. 이상적 치료 시나리오에 요구되는 바와 같이, 표적 항원 5T4는 특정 암 세포 상에 풍부하게 존재하고 접근 가능하며, 정상 세포 상에 존재하지 않거나 차폐되거나 훨씬 덜 풍부하다. 그러나, 5T4 항원은 20년 이상 전에 종양학 표적으로서 동정되었지만, 항-5T4 면역요법은 암을 치료하기 위해 승인되어 있지 않다. 따라서, 이러한 항원을 표적화하는 유효한 치료제가 명백하게 필요하다.
당해 분야에서는, 종양 세포의 표면 상에서 세포독성 세포, 즉 세포독성 T 세포에 대한 하나의 도메인과 결합하고 5T4에 대한 제2 결합 도메인과 결합하는 이중특이적 분자 형태의 항체-기반 요법을 제공하는 것이 공지되어 있다. 보다 구체적으로, 국제공개공보 제WO2013041687호에는 제1 및 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자가 기재되어 있고, 여기서 (a) 제1 결합 도메인은 5T4의 에피토프 클러스터 4에 결합할 수 있고; (b) 제2 결합 도메인은 T 세포 상에서 CD3 수용체 복합체에 결합할 수 있다.
Fab로서 불리우는, 항체의 항원 결합 암의 각각의 쇄에 대한 2개의 동일하거나 상이한 단백질 또는 펩티드의 융합 단백질 또는 이의 유도체가 공지되어 있다. 이의 가장 고전적 의미에서, Fab는 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 Fd 쇄와, VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 L-쇄 사이의 헤테로이량체이다. 가변 도메인 VH 및 VL은 상이한 종 또는 항체 아부류로부터 유래할 수 있다. 융합 단백질은 Fab-융합 단백질을 헤테로이량체화하기 위해 CH1:CL 헤테로이량체 상호작용의 잇점을 취한다. 국제공개공보 제WO9937791호(다목적 항체 유도체)는 전통적 입체배좌에서 Fab의 사용을 교시한다. VH-CH1:VL-CL 헤테로이량체는 제2 및 제3 기능 또는 심지어 제4 및 제5 기능에 의해 C-말단 및/또는 N-말단으로 신장된다. 확장 기능은 펩티드, 단백질 또는 단백질 부분 또는 유도체에서 코딩된다. 국제공개공보 제WO9937791호는 VL 가변 경쇄 항체 도메인, 이어서 CL 불변 경쇄 항체 도메인에 대한 융합체를 갖는 헤테로이량체를 형성하기 위해 VH 중쇄 가변 도메인, 이어서 CH1 중쇄 불변 도메인-1을 갖는 융합체의 사용을 교시한다. VH-CH1:VL-CL(또는 VHCH1:VLCL로 기재됨) 헤테로이량체는 4개 이하의 펩티드 또는 단백질 융합체로 신장할 수 있다.
본 발명은 3개 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자(추가로 "융합 단백질" 또는 "트리바디 융합 단백질" 또는 "Tb-5T4 융합 단백질"로서 지칭됨)에 관한 것이고, 여기서 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 세포외 5T4 항원에 결합할 수 있고, 나머지 결합 도메인(들)은 T 세포 상에서 CD3 수용체 복합체에 결합할 수 있다. 더욱이, 본 발명은 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질의 생산 방법, 상기 융합 단백질의 의학적 사용 및 상기 융합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 개시를 통해, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서가 특정 인용에 의해 참조된다. 이들 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서의 개시는 본 발명이 관계되는 기술 수준을 보다 완전하게 기재하기 위해 본 명세서 중에 참조로서 원용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 복수의 참조를 포함하는 것에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들면, "시약"에 대한 언급은 이러한 상이한 시약의 하나 이상을 포함하고, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 방법을 변형 또는 치환할 수 있는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 등가의 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 지시하지 않는 한, 일련의 요소들의 앞에 오는 용어 "적어도"는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당해 기술분야의 숙련가는 더 이상의 통상적 실험을 하지 않고도 본원에 기재된 본 발명의 실시형태에 대한 다수의 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이와 같은 균등물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
용어 "및/또는"은, 본원에서 어디에 사용되는지에 관계없이, "및", "또는" 및 "상기 용어에 연결되는 모든 요소의 임의의 기타 조합"의 의미를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 ±20% 이내, 바람직하게는 ±10% 이내 및 보다 바람직하게는 ±5% 이내를 의미한다.
본 명세서 및 후속하는 청구항 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형태들은, 언급된 정수(integer) 또는 단계 또는 정수 또는 단계들의 그룹을 포함하지만, 다른 어떤 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 경우, 용어 "포함하는(comprising)"은 용어 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)" 또는 때때로 본원에서 사용되는 용어 "갖는(having)"으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, "이루어진(consisting of)"은 청구항의 요소로 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 경우, "필수적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 청구항의 기본적 및 신규한 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본원의 각 경우에서, "포함하는", "필수적으로 이루어진(consisting essentially of)" 및 "이루어진(consisting of)" 중의 임의의 용어는 다른 두 용어로 대체될 수도 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 "결합 도메인"은 주어진 표적 에피토프와 특이적으로 결합/상호작용하는 (주어진 표적 에피토프와 결합/상호작용할 수 있는) 폴리펩티드의 도메인을 특징으로 한다. "에피토프"는 항원성이고, 따라서 용어 에피토프는 때때로 또한 "항원성 구조" 또는 "항원성 결정기"로서 본원에서 지칭된다. 따라서, 결합 도메인은 "항원-상호작용-부위"이다. 용어 "항원-상호작용-부위"는, 본 발명에 따라서, 특정 항원 또는 특정 그룹의 항원, 예를 들면, 상이한 종의 동일한 항원과 특이적으로 상호작용할 수 있는 폴리펩티드의 모티브를 정의한다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인식"을 정의하는 것으로 이해된다. 한 가지 예에서, 주어진 표적 에피토프와 특이적으로 결합/상호작용하는 상기 폴리펩티드는 항체이고, 상기 도메인은 항체의 VH 및/또는 VL 영역 또는 도메인이다.
용어 "에피토프"는 항체 또는 면역글로불린 또는 면역글로불린 또는 항체의 유도체 등과 같은 결합 도메인이 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접 아미노산으로부터 또는 단백질의 3차 중첩에 의해 나란히 놓인 비-인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. "선형 에피토프"는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 선형 에피토프는 고유 서열 중에 전형적으로 적어도 3개 및 보다 일반적으로 적어도 5개, 예를 들면, 약 8 내지 10개 아미노산을 포함한다.
선형 에피토프와 대조적으로, "입체배좌 에피토프"는 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이 인식된 에피토프의 유일한 정의 성분이 아닌 에피토프(예를 들면, 에피토프를 정의한 항체에 의해 아미노산의 1차 서열이 반드시 인식되는 것은 아닌 에피토프)이다. 전형적으로, 입체배좌 에피토프는 선형 에피토프와 비교하여 증가된 수의 아미노산을 포함한다. 입체배좌 에피토프의 인식과 관련하여, 결합 도메인은 항원의 3차원 구조, 바람직하게는 펩티드 또는 단백질 또는 이의 단편(본 발명의 문맥에서, 하나의 결합 도메인에 대한 항원은 5T4 단백질이다)을 인식한다. 예를 들면, 단백질 분자가 중첩하여 3차원 구조를 형성하는 경우, 입체배좌 에피토프를 형성하는 특정 아미노산 및/또는 폴리펩티드 골격은 항체가 에피토프를 인식할 수 있도록 나란히 위치하게 된다. 에피토프의 입체배좌를 결정하는 방법은, 이로써 한정되지 않지만, x-선 결정학, 2차원 핵 자기공명 분광분석 및 부위-지시된 스핀 라벨링 및 전자 상자성 공명 분광분석을 포함한다.
본 발명에 따라, 용어 "특이적으로 결합/상호작용하는", "특이적으로 인식하는", "에 대해 지시된" 및 "와 반응하는"은 결합 도메인이 에피토프의 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 보다 바람직하게는 적어도 4개 아미노산과 특이적으로 상호작용 및/또는 이에 결합할 수 있음을 의미한다. 이러한 결합은 "록-앤-키-원리"의 특이성에 의해 예시될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 상호작용하는", "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합한다"는 결합 도메인이 특정 단백질 또는 항원에 대해 상당한 친화성을 나타내고, 일반적으로 다른 단백질 또는 항원과의 유의한 교차-반응성을 나타내지 않는 것을 의미한다. "상당한" 또는 바람직한 결합은 약 10-6M(KD) 또는 그 이상의 친화성으로 결합하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 결합은, 결합 친화성이 약 10-11 내지 10-8M, 바람직하게는 약 10-11 내지 10-9M인 경우에 특이적인 것으로 간주된다. 필요한 경우, 비특이적 결합은 결합 조건을 변화시킴으로써 특이적 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않고서 감소시킬 수 있다. 결합 도메인이 표적과 특이적으로 반응 또는 결합하는지는, 특히 상기 결합 도메인 중의 하나와 표적 단백질 또는 항원과의 반응을 상기 결합 도메인과 다른 단백질 또는 항원과의 반응과 비교함으로써 용이하게 시험할 수 있다.
특이적 결합은 결합 도메인 및 항원의 아미노산 서열 중의 특이적 모티브에 의해 영향을 받는 것으로 생각된다. 따라서, 결합은 이들의 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과 및 상기 구조의 2차 변형의 결과로서 달성된다. 항원-상호작용-부위와 이의 특이적 항원과의 특이적 상호작용은 또한 항원에 대한 상기 부위의 단순한 결합을 가져올 수 있다. 더욱이, 항원-상호작용-부위와 이의 특이적 항원과의 특이적 상호작용은, 대안적으로, 예를 들면, 항원의 입체배좌의 변화의 유도에 기인하는 시그날의 개시, 항원의 올리고머화 등을 가져올 수 있다. 한 가지 예에서, 결합 도메인은 항체이다.
용어 "본질적으로 결합하지 않는다"는 본 발명의 융합 단백질의 결합 도메인이 또 다른 단백질에 결합하지 않는 것, 즉 또 다른 단백질과 30% 미만, 바람직하게는 20%, 보다 바람직하게는 10%, 특히 바람직하게는 9, 8, 7, 6 또는 5% 미만의 교차-반응성을 나타내는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "교차-종 특이성", "교차-종 인식" 및 "종간 특이성"은 인간 및 비인간 종, 바람직하게는 영장류 종에서 동일한 표적 분자에 결합하는 결합 도메인의 능력을 의미한다. 따라서, "교차-종 특이성" 또는 "종간 특이성"은 상이한 종에서 발현되지만 X 이외의 분자(예: 5T4 또는 CD3)에서는 발현되지 않는 동일한 분자 X(예: 5T4 또는 CD3)에 대한 종간 반응성을 설명한다.
단백질(통상 30개 미만의 아미노산을 갖는 이의 단편, 바람직하게는 생물학적 활성 단편 및 펩티드를 포함)은 공유 펩티드 결합(아미노산의 쇄를 제공)을 통해 서로 커플링된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 30개 초과의 아미노산으로 이루어지거나 이를 포함하는 분자 그룹을 나타낸다. 폴리펩티드는 추가로 이량체, 삼량체 및 고차원의 올리고머 등과같이, 즉 1개 초과의 폴리펩티드 분자로 이루어지거나 이를 포함하는 다량체를 형성할 수 있다. 이러한 이량체, 삼량체 등을 형성하는 폴리펩티드 분자는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 이러한 다량체와 같은 상응하는 고차원 구조는, 결과적으로, 호모- 또는 헤테로이량체, 호모- 또는 헤테로삼량체 등으로 지칭된다. 헤테로다량체의 예는, 이의 천연에 존재하는 형태에서, 2개의 동일한 폴리펩티드 경쇄 및 2개의 동일한 폴리펩티드 중쇄로 이루어지거나 이를 포함하는 항체 분자이다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 또한 자연적으로 변형된 폴리펩티드/단백질을 지칭하고, 여기서 상기 변형은, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등과 같은 번역후 변형에 의해 영향을 받는다. 이러한 변형은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
상기 본원에서 서술된 바와 같이, 한 가지 양태에서, 융합 단백질의 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 인간 및 칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus), 사귀누스 오에디푸스(Saguinus oedipus) 또는 사이미리 시우레우스(Saimiri sciureus) 5T4에 결합할 수 있고/있거나 나머지 결합 도메인(들)은 인간 및 칼리트릭스 자쿠스, 사귀누스 오에디푸스 또는 사이미리 시우레우스 CD3 엡실론에 결합할 수 있다. 이러한 실시형태에 따라, 본 발명의 융합 단백질의 모든 3개 결합 도메인은 영장류의 포유동물 목의 구성원에 대해 종간 특이적이다.
한 가지 실시형태에서, 제1 또는 제2 또는 제3 결합 도메인은 항체로부터 유래한다. 또 다른 실시형태에서, 모든 결합 도메인은 항체로부터 유래한다.
용어 "항체"의 정의는 모노클로날, 키메라, 단일 쇄, 인간화 및 인간 항체, 또한 항체 단편, 특히 Fab 단편 등의 실시형태를 포함한다. 항체 단편 또는 유도체는 추가로 F(ab')2, Fv, scFv 단편 또는 도메인 항체 또는 나노바디 등의 단일 도메인 항체, 다른 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는, VHH, VH 또는 VL일 수 있는, 하나의 가변 도메인만을 포함하는 단일 가변 도메인 항체 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다[참조: Harlow and Lane (1988) and (1999), loc. cit; Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 and Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009]. 이러한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단리된 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드 뿐만 아니라, 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 단량체를 포함하는 보다 큰 폴리펩티드를 포함한다.
다양한 공정이 당해 기술분야에 공지되어 있고, 이러한 항체 및/또는 단편의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, (항체) 유도체는 펩티도미메틱에 의해 제조될 수 있다. 추가로, 단일 쇄 항체의 생산에 대해 기재된 기술[참조: 특히 미국 특허 제4,946,778호, Kontermann and Dubel (2010), loc. cit. and Little(2009), loc. cit.]은 선택된 폴리펩티드(들)에 특이적인 단일 쇄 항체를 생산하기 위해 채용할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 및 융합 단백질에 특이적인 인간화된 항체를 발현시킬 수 있다. 모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속 세포주 배양에 의해 생산된 항체를 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술의 예는 하이브리도마 기술[참조: Kohler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497], 트리오마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72] 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96]을 포함한다. BIAcore 시스템에 사용된 표면 플라즈몬 공명을 사용하여, CD3 엡실론과 같은 표적 폴리펩티드의 에피토프에 결합하는 파지 항체의 효율을 증가시킬 수 있다[참조: Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13]. 본 발명의 문맥에서, 용어 "항체"는 하기 기재된 바와 같이 숙주에서 발현될 수 있는 항체 작제물, 예를 들면, 그 중에서도, 바이러스 또는 플라스미드 벡터에 의해 형질감염되고/되거나 형질도입될 수 있는 항체 작제물을 포함한다.
추가로, 본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 기재된 항체와 동일하거나 유사한 특이성을 나타내는 본원에 기재된 항체의 유도체 또는 변이체에 관한 것이다. 유사한 특이성은, 변이체 또는 유도체가 유래하는 초기/대조군 항체 특이성의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 105%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%의 특이성이다. "항체 변이체"의 예는 비-인간 항체의 인간화된 변이체, "친화성 성숙된" 항체[참조: Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) and Lowman et al., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)] 및 변화된 효과기 기능(들)을 갖는 항체 돌연변이체[참조: 미국 특허 제5,648,260호, Kontermann and Dubel (2010), loc. cit. and Little(2009), loc. cit]를 포함한다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "항원-결합 도메인", "항원-결합 단편", "항체 결합 도메인" 및 "항체 결합 영역"은 항체와 항원 사이의 특이적 결합에 관여하는 아미노산을 포함하는 항체 분자의 부분이다. 항체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 항원의 부분은 상술한 바와 같이 본원에서 "에피토프"로 지칭된다. 상술한 바와 같이, 항원-결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있다; 그러나, 양자를 모두 포함해야만 하는 것은 아니다. Fd 단편은, 예를 들면, 2개의 VH 영역을 갖고 종종 완전한 항원-결합 도메인의 일부 항원-결합 기능을 보유한다. 항체의 항원-결합 단편의 예는 (1) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 갖는 1가의 단편; (2) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 갖는 2가의 단편; (3) 2개의 VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; (4) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편, (5) VH 도메인을 갖는 dAb 단편[참조: Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546]; (6) 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 및 (7) 단일 쇄 Fv(scFv)을 포함한다. Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH은 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 페어링되어 1가 분자(단일 쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 참조, 예를 들면, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 이들을 제조할 수 있게 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 이들 항체 단편들은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 종래의 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 완전한 항체와 동일한 방식으로 기능이 평가된다. 본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하고, 즉, 모집단을 포함하는 개개 항체는 미량으로 존재할 수 있는, 천연에 존재할 수 있는 돌연변이 및/또는 번역-후 변형(예를 들면, 이성화, 아미드화)을 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는, 단일 항원성 부위에 대하여 지향되며, 고도로 특이적이다. 또한, 상이한 결정기(에피토프)에 대하여 지향되어 전형적으로 상이한 항체를 포함하는 종래의 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대하여 지향된다. 이들의 특이성에 추가하여, 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되고, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득된 것으로 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(참조, 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 이와 같은 항체의 단편을 포함한다[참조: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]. 본원에서 목적하는 키메라 항체는 비-인간 영장류(예를 들면, Old World Monkey, Ape 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "원영화된(primitized)" 항체를 포함한다.
비-인간(예: 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는, 대부분 인간 서열의 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예: Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 아서열)이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수령자의 초가변 영역(또한 CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 수용능을 갖는 마우스, 랫트 또는 래빗 등의 비-인간 종의 초가변 영역(공여자 항체)으로부터의 잔기로 대체되어 있는 인간 면역글로불린(수령자 항체)이다. 몇몇 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 추가로, 본원에서 사용된 "인간화된 항체"는 또한 수령자 항체 및 공여자 항체에서 발견할 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개량 및 최적화하기 위해 이루어진다. 최적의 인간화된 항체는 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 더욱 상세하게는, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)] 참조.
용어 "인간 항체"는, 예를 들면, 문헌[참조: Kabat et al. (Kabat et al. (1991)) loc. cit.]에 의해 기재된 것을 포함하는, 당해 기술분야에서 공지된 인간 생식세포계 면역글로불린 서열에 실질적으로 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들면, CDR 및 특히 CDR3에서, 인간 생식세포계 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관 내에서 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기로 대체된 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 위치를 가질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "시험관내에서 생성된 항체"는 가변 영역(예: 적어도 하나의 CDR)의 전부 또는 일부가 비-면역 세포 선별로 생성되는 항체이다(예를 들면, 시험관내 파지 디스플레이, 단백질 칩 또는 항원에 결합하는 후보 서열의 능력을 시험할 수 있는 임의의 기타 방법). 따라서, 이 용어는 바람직하게는 면역 세포에서 게놈 재배열에 의해 생성된 서열을 제외한다. "이중특이적" 또는 "기능성 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 페어 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)] 참조. 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 수득하기 위하여 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방법이 이용가능하다. 예를 들면, 항체는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산될 수 있다(미국 특허 제4,816,567호). 모노클로날 항체는 또한 공지된 방법에 따라 하이브리도마의 생성에 의해 생산될 수 있다[참조: Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499]. 이어서, 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마를 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 표면 플라즈몬 공명(BIACORE™) 분석과 같은 표준 방법을 사용하여 스크리닝함으로써, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 동정할 수 있다. 임의 형태의 특정 항원이 면역원, 예를 들면, 재조합 항원, 천연에 존재하는 형태, 임의의 변이체 또는 이의 단편 및 이의 항원성 펩티드로서 사용될 수 있다.
항체를 제조하는 한 가지 예시적 방법은 단백질 발현 라이브러리의 스크리닝, 예를 들면, 파지 또는 리보좀 디스플레이 라이브러리의 스크리닝을 포함한다. 파지 디스플레이는, 예를 들면, 문헌[참조: Ladner et al., U.S. Patent No.5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628]에 기재되어 있다.
인간화된 항체 또는 이의 단편은 항원 결합과 직접적으로 연루되어 있지 않은 Fv 가변 도메인의 서열을 인간 Fv 가변 도메인으로부터의 등가의 서열로 대체함으로써 생성될 수 있다. 인간화된 항체 또는 이의 단편을 생성하는 예시적인 방법이 문헌[참조: Morrison (1985) Science 229:1202-1207; by Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; 및 US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US　5,859,205; 및 US 6,407,213]에 의해 제공된다. 이들 방법들은 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄로부터의 면역글로불린 Fv 가변 도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리, 조작 및 발현하는 것을 포함한다. 이와 같은 핵산은, 상기 기재한 바와 같이, 소정의 표적에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 수득될 수도 있고, 다른 공급원으로부터 수득될 수도 있다. 이어서, 인간화된 항체 분자를 코딩하는 재조합 DNA를 적절한 발현 벡터로 클로닝할 수 있다.
인간화된 항체는 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 생식세포 치환 및/또는 역 돌연변이의 도입에 의해 최적화시킬 수 있다. 이와 같은 변화된 면역글로불린 분자는 당해 기술분야에서 공지된 몇몇 기술중 어느 하나에 의해 제조될 수도 있고[참조: Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982], 유럽 특허 제EP 239 400호에서 개시된 바에 따라 제조될 수도 있다. 항체 또는 이의 단편은 또한 인간 T 세포 에피토프의 특이적 결실 또는 국제공개공보 제WO 98/52976호 및 제WO 00/34317호에 기재된 방법에 의한 "탈면역화"에 의해 변형시킬 수도 있다. 요약하면, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 MHC 부류 II에 결합하는 펩티드에 대하여 분석할 수 있다; 이들 펩티드는 잠재적 T 세포 에피토프를 나타낸다(WO 98/52976 및 WO 00/34317에 정의된 바와 같음). 잠재적 T 세포 에피토프를 검출하기 위해, "펩티드 트레딩(peptide threading)"이라 명명된 컴퓨터 모델링 접근법이 적용될 수 있고, 또한 국제공개공보 제WO 98/52976호 및 제WO 00/34317호에 기재된 바와 같이, VH 및 VL 서열에 존재하는 모티브에 대하여 인간 MHC 부류 II 결합 펩티드의 데이터베이스를 검색할 수 있다. 이 모티브는 18개 주요 MHC 부류 II DR 알로타입의 어떤 것에도 결합하고, 따라서 잠재적 T 세포 에피토프를 구성한다. 검출된 잠재적 T-세포 에피토프는 가변 도메인에서 소수의 아미노산 잔기의 치환에 의해, 또는 바람직하게는 단일 아미노산 치환에 의해 제거될 수 있다. 전형적으로, 보존적 치환이 이루어진다. 전적으로는 아니지만, 종종, 인간 생식세포 항체 서열 중의 위치가 공통되는 아미노산이 사용될 수도 있다. 인간 생식세포 서열은, 예를 들면, 문헌[참조: Tomlinson, et al. (1992) J. MoI. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; 및 Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638]에 기재되어 있다. V BASE 디렉토리는 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 종합적 디렉터리를 제공한다[참조: Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK에 따름]. 이들 서열은 인간 서열의 공급원, 예를 들면, 프레임워크 영역 및 CDR로서 사용될 수 있다. 또한, 예를 들면, 미국 특허 제6,300,064호에 기재된 바와 같이, 컨센서스 인간 프레임워크 영역이 사용될 수 있다.
VH 및 VL의 페어링은 함께, 이후에 "조합된 VH/VL 결합 도메인"으로 지칭되는, 단일 항원-결합 부위를 형성한다. VH에 가장 근접한 CH 도메인은 CH1로 지정된다. 각 L 쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 쇄에 연결되고, 2개의 H 쇄는 동종 H 쇄에 따라 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 초가변 서열의 3개의 영역에 대한 스캐폴드를 형성하는 (상보성 결정 영역, CDR) VH 및 VL 도메인은 프레임워크 영역이라 불리는 비교적 보존된 서열의 4개 영역으로 이루어진다(FR1, FR2, FR3 및 FR4). CDR은 항체가 항원과 특이적으로 상호작용하는데 관여하는 대부분의 잔기를 함유한다. CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭된다. 따라서, 중쇄의 CDR 성분은 H1, H2 및 H3으로 지칭되고, 경쇄의 CDR 성분은 L1, L2 및 L3으로 지칭된다.
용어 "가변"은 이들의 서열에서 가변성을 나타내고 특정 항체의 특이성 및 결합 친화성을 결정하는데 관여하는 면역글로불린 도메인의 일부를 지칭한다(즉, "가변 도메인(들)"). 가변성은 항체의 가변 도메인을 통하여 균일하게 분포되지 않는다; 이는 각 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서브-도메인에 집중된다. 이들 서브-도메인은 "초가변" 영역 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이라 불리운다. 가변 도메인의 보다 보존된 (즉, 비-초가변) 부분은 "프레임워크" 영역(FRM)이라 불리운다. 천연에 존재하는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 주로 β-시트(β-sheet) 형태인, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 일부 경우에 루프의 일부를 형성하는, 각각 4개의 FRM 영역을 포함한다. 각 쇄에서 초가변 영역은, FRM에 의해 및 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께, 매우 근접하게 서로 유지되어 있고, 항원-결합 부위의 형성에 기여한다[참조: Kabat et al., loc. cit.]. 불변 도메인은 항원 결합에 직접 연루되지 않지만, 예를 들면, 항체-의존성, 세포-매개된 세포독성 및 보체 활성화 등의 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
용어 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"는 일반적으로 알라닌(Ala 또는 A); 아르기닌(Arg 또는 R); 아스파라긴(Asn 또는 N); 아스파르트산(Asp 또는 D); 시스테인(Cys 또는 C); 글루타민(Gln 또는 Q); 글루탐산(GIu 또는 E); 글리신(Gly 또는 G); 히스티딘(His 또는 H); 이소류신(He 또는 I): 류신(Leu 또는 L); 리신(Lys 또는 K); 메티오닌(Met 또는 M); 페닐알라닌(Phe 또는 F); 프롤린(Pro 또는 P); 세린(Ser 또는 S); 트레오닌(Thr 또는 T); 트립토판(Trp 또는 W); 티로신(Tyr 또는 Y); 및 발린(Val 또는 V)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 등과 같이 당해 기술분야에서 인식된 정의를 갖는 아미노산을 지칭하지만, 변형, 합성 또는 희귀 아미노산도 필요한 경우 사용될 수 있다. 일반적으로, 아미노산은 비극성 측쇄(예를 들면, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, VaI); 음전하 측쇄(예를 들면, Asp, GIu); 양전하 측쇄(예를 들면, Arg, His, Lys); 또는 비하전된 극성 측쇄(예를 들면, Asn, Cys, GIn, GIy, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, 및 Tyr)을 갖는 것으로 분류할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"(또한 "상보성 결정 영역" 또는 CDR로서 공지됨)은 항원-결합 부위를 형성하는 면역글로불린의 V-영역 도메인 내에 존재하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭하고(극단 서열 가변성의 보통 3개 또는 4개의 짧은 영역), 항원 특이성의 주요 결정기이다. CDR 잔기를 동정하기 위한 적어도 2개의 방법이 있다: (1) 종간-교차 서열 가변성에 기반한 접근법[참조: Kabat et al., loc. cit.]; 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학 연구에 기반한 접근법[참조: Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)]. 그러나, 2개의 잔기 동정 기술은 동일한 영역이 아닌 중첩되는 영역을 정의하므로, 이들은 하이브리드 CDR을 정의하기 위하여 조합될 수 있다. 그러나, 일반적으로, CDR 잔기는 바람직하게는 소위 카뱃(Kabat)(넘버링) 시스템에 따라 동정된다.
본 발명은 Fab(VHCH1:VLCL) 또는 교차-Fab(VHCL:VLCH1) 또는 도메인-Fab(V1CH1:V2CL)의 사용을 포함한다. 본 발명자들은 Fab-유래된 헤테로이량체가 VHCH1:VLCL; VHCL:VLCH1 및 V1CH1:V2CL 기반 구조를 참조할 것이다. 본 발명에서, 2개의 신장만이 Fab-유래 및 CH1:CL 구동 헤테로이량체에 대해 이루어졌다. 바람직한 구성에서, 쇄를 포함하는 각각의 CH1 및 CL은 펩티드-결합 기반 신장을 갖는다. 가장 바람직한 구성에서, 이들 신장은 CH1-포함 및 CL-포함 쇄의 C-말단에 존재한다. 이러한 위치에서, 이들은 Fab 분자의 결합능에 영향을 미치지 않을 것이고, 따라서 완전하게 기능하는 삼기능성, 3가, 2가 이중특이적, 또는 삼중특이적 분자를 생성할 것이다. 놀랍게도, 본 발명의 C-말단 융합은 또한 도 6A 및 6B에서 입증된 바와 같이 최종 융합 단백질의 안정성 및 전체적 용융 온도를 증가시킨다.
본 발명의 융합 단백질은 추가로 결합 또는 효과기 분자로 신장되어, 종양 항원 및 단일 면역 활성화 기능에 대한 이중 결합 기능을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질은 종양 연관된 항원(TAA) 5T4에 대한 2가 결합을 T-세포 활성화 기능과 조합한다. Tb-5T4 트리바디 계열의 예에서, 5T4에 대한 2가 결합은 CD3에 대한 1가 결합과 조합될 것이다. 2가 5T4 결합은 5T4 항원을 과발현하는 종양 세포에 대한 특이성을 증가시킨다. 2가 결합은 또한 표적 복합체의 해리 속도를 감소시켜 시간적으로 결합을 안정화시킨다. T-세포 CD3에 대한 1가 결합은 OKT3 및 OKT3-유래된 (Fab')2(CD3에 대한 2가 결합 Fab 단편)에 의해 관찰된 바와 같이 2가 CD3 결합 분자에 의한 T-세포의 활성화를 회피한다. 이들 분자는 T-세포 활성화, 이어서 활성화 유도된 세포 사멸에 대해 공지되어 있고, T-세포를 아네르기성(anergic)으로 되게 하고, 이식된 기관의 거부를 회피하는데 유용한 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질은 CH1:CL 구동 헤테로이량체를 형성하는 2개 융합 쇄로 구성된다. 추가의 실시형태에서, 융합 단백질은 2개의 상이한 쇄를 포함하고, 여기서 (i) 하나의 쇄는 2개 VH 항체 결합 도메인, 1개 VL 항체 결합 도메인 및 1개 CH1 또는 CL 항체 결합 도메인을 포함하고, (ii) 다른 쇄는 2개 VL 항체 결합 도메인, 1개 VH 항체 결합 도메인 및 1개 CL 또는 CH1 항체 도메인을 포함하며, 1개 쇄의 CH1 항체 도메인과 다른 쇄의 CL 항체 도메인 사이의 하나의 헤테로이량체 상호작용을 함유하는 융합 단백질은, (a) 쇄 내에 형성된 1 또는 2개의 조합된 VH/VL 결합 도메인은 세포외 5T4 항원에 결합할 수 있고; (b) 쇄 내에 형성된 나머지 1 또는 2개의 조합된 VH/VL 결합 도메인은 T 세포 상의 CD3 수용체 복합체에 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 융합 단백질은 하기 형태를 가질 수 있거나 또한 다음과 같이 정의될 수 있다:
VL(5T4)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(5T4)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)와 조합된
VH(5T4)-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VH(5T4)-CH1-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3).
또는
VL(5T4)CL-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VL(5T4)CL-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)와 조합된
VH(5T4)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(5T4)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)의 형태.
또는
VL(CD3)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(CD3)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)와 조합된
VH(CD3)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(CD3)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)의 형태.
또는
VH(CD3)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(CD3)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)와 조합된
VL(CD3)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(CD3)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)의 형태.
또는 교차-Fab(VHCL:VLCH1)에 기반한,
VH(5T4)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(5T4)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)와 조합된
VL(5T4)-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VL(5T4)-CH1-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)의 형태.
또는
VH(5T4)CL-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VH(5T4)CL-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)와 조합된
VL(5T4)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(5T4)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4).
모든 이들 융합 단백질은 도 1B 및 1C에 제시되어 있다.
Tb-5T4 융합 단백질을 포함하는 기타는 구조가 CH1 및 CL 헤테로이량체(dFab)에 대한 단일 도메인 결합 융합에 기반하는 것들이다(또한 도 1D 참조):
도 1D의 (xiii) 및 (xvi)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
V2-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
V2-CH1-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)(여기서, V2는 5T4 또는 CD3에 대한 것과는 상이한 특이성을 갖는 단일 도메인 결합제이다)와 조합된
V1(5T4)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V1(5T4)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4) (여기서, V1은 5T4에 대한 특이성을 갖는 단일 도메인 결합제이다),
또는
도 1D의 (xiv) 및 (xvii)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
V1(5T4)CL-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
V1(5T4)CL-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)와 조합된
V2-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V2-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)(여기서, V2는 5T4 또는 CD3에 대한 것과는 상이한 특이성을 갖는 단일 도메인 결합제이다)의 상이한 형태의 조직,
또는
도 1D의 모델(xv) 및 (xviii)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
V2-CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V2-CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)(여기서, V2는 5T4 또는 CD3에 대한 것과는 상이한 특이성을 갖는 단일 도메인 결합제이다)와 조합된
V1(CD3)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V1(CD3)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)의 상이한 형태의 조직.
도 1D에 도시된 모든 조합에서, scFv는 또한 디설파이드 안정화된 단일 쇄 가변 단편(dsFv)일 수 있다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 융합 단백질이 본 발명에 포함된다. 이러한 융합 단백질은 하기 2개의 상이한 쇄를 포함한다:
a) 제1 쇄: 하기 제2 쇄와 조합된, VH(5T4)-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VH(5T4)-CH1-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)
제2 쇄: VL(5T4)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(5T4)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4),
b) 제1 쇄: 하기 제2 쇄와 조합된, VH(5T4)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(5T4)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)
제2 쇄: VL(5T4)CL-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VL(5T4)CL-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3),
c) 제1 쇄: 하기 제2 쇄와 조합된, VH(CD3)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(CD3)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)
제2 쇄: VL(CD3)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(CD3)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4),
d) 제1 쇄: 하기 제2 쇄와 조합된, VL(CD3)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(CD3)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)
제2 쇄: VH(CD3)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(CD3)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4),
e) 제1 쇄: 하기 제2 쇄와 조합된, VL(5T4)-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VL(5T4)-CH1-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)
제2 쇄: VH(5T4)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(5T4)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4),
f) 제1 쇄: 하기 제2 쇄와 조합된, VL(5T4)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(5T4)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)
제2 쇄: VH(5T4)CL-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VH(5T4)CL-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3),
g) 제1 쇄: 하기 제2 쇄와 조합된, V1(5T4)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V1(5T4)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)
제2 쇄: V2-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
V2-CH1-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)
h) 제1 쇄: 하기 제2 쇄와 조합된, V2-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V2-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)
제2 쇄: V1(5T4)CL-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
V1(5T4)CL-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)
i) 제1 쇄: 하기 제2 쇄와 조합된, V1(CD3)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V1(CD3)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)
제2 쇄: V2-CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V2-CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)
여기서, VH 및 VL는 항체 결합 도메인이고, CH1 및 CL은 항체 도메인이고, 상기 융합 단백질은, (a) 쇄 내에 형성된 1 또는 2개의 조합된 VH/VL 결합 도메인이 세포외 5T4 항원에 결합할 수 있고; (b) 쇄 내에 형성된 나머지 1 또는 2개의 조합된 VH/VL 결합 도메인이 T 세포 상의 CD3 수용체 복합체에 결합할 수 있도록 한다.
한 가지 실시형태에서, 융합 단백질로도 불리우는 Tb-5T4 융합 단백질은, CH1:CL 포함 부분이 5T4 항원에 결합하고 각각 CH1-포함 및 CL-포함 쇄가 또 다른 결합 분자와 함께 C-말단으로 신장되는 융합 단백질을 포함한다. CH1:CL 포함 부분이 하나의 5T4 결합 기능을 제공하는 경우에, 추가의 융합된 결합제는 적어도 하나의 다른 5T4 결합 분자 및 하나의 다른 CD3-결합 분자를 포함할 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 통상의 항체에서 발견되는 바와 같이 V-도메인의 조합으로부터 유래할 수 있다. 이들은 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 형태를 가질 수 있다. scFv는 VH-링커-VL의 형태 또는 VL-링커-VH의 형태로 존재할 수 있다. 두 형태는 결합 특성 및 안정성의 차이를 가질 수 있다. 두 형태는 당해 기술분야의 숙련가에 의해 과도한 부담 없이 비교될 수 있다. scFv의 사용은 국제공개공보 제WO8801649호(단일 폴리펩티드 결합 분자) 및 제US5455030호(단일 쇄 폴리펩티드 결합 분자를 사용한 면역요법)에 의해 고려되어 있다.
scFv 분자는 당해 기술분야에 기재된 링커 분자를 포함한다. 이 기술은 링커 서열이 VH 및 VL의 특정 페어(pair)에 대해 최적화될 수 있는 예를 함유한다. 바람직한 링커는 제1 V-도메인의 C-말단 및 제2 V-도메인의 N-말단 사이의 거리에 걸쳐 있다. 바람직한 링커는 또한 가변 영역의 폴딩을 방해하지 않을 정도로 충분히 유연하다. 바람직한 링커는 임의의 항원성 항체-에피토프 및 면역원성 T-세포 에피토프를 함유하지 않는다. scFv에서 2개 V-도메인을 연결하는 바람직한 링커의 예는 다수의 글리신(가요성, 비-면역원성 아미노산) 및 세린(가요성, 고도의 용해도를 갖는 저-면역원성 아미노산)을 함유하는 15 내지 18개 아미노산 길이의 펩티드이다. 당해 기술분야에 공지된 가장 바람직한 링커의 예는 GGGGSGGGGSGGGGS이거나 (GGGGS)3으로 기재된다.
가변 도메인은 일반적으로 안정한 상호작용을 갖지 않고, VH-VL 해리 상수는 10mM과 같이 높을 수 있다. 결과적으로, V-도메인 이량체는 종종 해리한다. 양 도메인을 융합하는 링커는 재-결합의 기회를 증가시킨다.
한 가지 다른 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다: 국제공개공보 제WO9429350호(결합 특이성을 갖는 재조합 디설파이드-안정화된 폴리펩티드 단편을 제조하는 방법: Methods of making recombinant disulphide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity)는 인공적 디설파이드 브릿지를 조작하기 위해 VH 및 VL 사이의 특정 부위에서의 조작을 교시한다. 본 발명에서, 가변 결합 단편은 단일 쇄 폴리펩티드로서 바람직할 것이다. 2개가 Tb-5T4 트리바디 등의 융합 단백질에 요구되기 때문에, 단일 쇄 형태는 V-도메인의 미스-페어링 및 따라서 생성물의 편차 및 비-기능성 유도체의 생성을 회피한다. 그러나, VH-VL 페어의 빈번한 해리 및 재-결합은 특정한 경우에 Tb-5T4 등의 또 다른 융합 단백질과의 이량체 형성을 유도할 수 있다. 이들 생성물은 가능한 2가 항-CD3 결합을 가질 것이고, 따라서 종양 표적 세포에서 축적되지 않는 경우에도 T-세포의 잠재적 활성화를 가질 것이다.
scFv 분자에 기반한 다수의 이중특이적 T-세포 결합자는 염증성 사이토카인 생성의 형태에서 오프-표적 독성을 유도한다. 유도된 전형적 사이토카인은 IL-2, IFN-감마 및 TNF-알파이다. 자극이 높고/높거나 사이토카인 폭풍이 임상적으로 제어되지 않는 경우, 이는 기관 부전을 유도할 수 있고 생명을 위협하게 될 수 있다.
본 발명은 국제공개공보 제WO8801649호에 교시된 바와 같은 단일 쇄 가변 도메인 기술 및 국제공개공보 제WO9429350호에 교시된 바와 같은 V-단편의 디설파이드 안정화의 조합을 이용 또는 사용하여 디설파이드 안정화된 단일 쇄 가변 도메인(dsFv)을 생성할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 조립하기 위해, 기능적 결합 분자를 형성하는 가변 도메인이 선택되어야 한다. 정상 조직에서 무설명 교차-반응성과 함께 5T4 TAA에 결합하는 적합한 항체는 마우스 모노클로날 5T4.H8로서 공지되어 있다. 5T4.H8의 가변 도메인은 서열번호 1 및 서열번호 16에 제공되거나 이들로 구성되거나 이들로 이루어진다. 이들 서열의 구조적으로 보다 안정한 유도체는 서열번호 2 및 서열번호 17에 제공되거나 이들로 구성되거나 이들로 이루어진다. 뮤린 가변 도메인 프레임워크 영역은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 인간화시킬 수 있다. 인간화된 가변 도메인의 예는 VH 도메인의 경우에 서열번호 3 내지 15(서열번호 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15) 및 VL 도메인의 경우에 서열번호 18 내지 25(서열번호 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25)에 제공되거나 이들로 구성되거나 이들로 이루어진다. 인간화된 프레임워크 잔기는, 일반적으로 이들이 덜 항원성 및/또는 면역원성인 것으로 생각되기 때문에 바람직하다. 따라서, 본 발명의 Tb-5T4 등의 바람직한 융합 단백질은 서열번호 3 내지 15의 VH 서열과 서열번호 18 내지 25의 VL 서열의 조합을 가질 것이다. 따라서, 한 가지 실시형태는, 서열번호 3 내지 15 중의 하나와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열 중의 하나를 포함하거나 이들로 이루어진 VH 서열과 서열번호 18 내지 25 중의 하나와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열 중의 하나를 포함하거나 이들로 이루어진 VL 서열과의 조합을 갖는 본 발명의 Tb-5T4 등의 융합 단백질에 관한 것이다. 이어서, 기능적 조합은 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 포맷의 디설파이드 안정화된 단일 쇄 가변 도메인(dsFv)로 포맷될 수 있거나, VHCH1:VLCL Fab 또는 VHCL:VLCH1 교차-Fab를 생성하기 위해 CH1 또는 CL 도메인 내로 이식될 수 있다.
CD3 복합체에 대한 적합한 결합제는 유사한 방식으로 조립될 수 있다. 다수의 T-세포 활성화 CD-엡실론 결합제는 당해 기술분야에 공지되어 있다. OKT3은 이식 거부를 예방하기 위해 사용된 마우스 모노클로날이다. OKT3 서열(서열번호 26 및 서열번호 34 또는 이들 서열을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열)은 제US6750325호(CD3 특이적 재조합 항체) 및 국제공개공보 제WO2008079713호(감소된 독성을 갖는 면역억제 모노클로날 항체를 사용한 LADA 및 기타 성인-개시 자가면역 당뇨병의 치료 방법: Methods for the treatment of LADA and other adult-onset autoimmune diabetes using immunosuppressive monoclonal antibodies with reduced toxicity)에 의해 교시되어 있다. OKT3 가변 서열의 인간화된 형태는 제US7635475호(신규한 디아바디-형 이중특이적 항체: Novel diabody-type bispecific antibody) 및 국제공개공보 제WO2005040220호(다중특이적 탈면역화된 CD3-결합제: Multispecific deimmunized CD3-binders)에 개시되어 있다. 인간화된 OKT3 유래된 VH 도메인 서열은 서열번호 27; 28; 29(또는 이들 서열을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열)에 제공되어 있다. 인간화된 OKT3 유래된 VL 도메인 서열은 서열번호 35; 36; 37(또는 이들 서열을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열)에 제공되어 있다. scFv, dsFv Fab 또는 교차-Fab 조합을 생성하기 위해 OKT3 가변 도메인에 기반한 CD3 결합 잔기는 서열번호 35-37(또는 이들 서열을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열)과 함께 서열번호 27-29(또는 이들 서열을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열)로 구성될 수 있다.
CD3에 대한 다른 결합제는 제US7728114호(Anti-CD3 antibodies and methods of use thereof)(서열번호 30 및 38 또는 이들 서열을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열); 국제공개공보 제WO9404679호(Humanized antibodies and methods for making them)(서열번호 32 및 40 또는 이들 서열을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열), 제US7381803호(Humanized antibodies against CD3)(서열번호 33 및 40 또는 이들 서열을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열)에 의해, 또는 문헌[참조: Li et al (2005). "Construction and characterization of a humanized anti-human CD3 monoclonal antibody 12F6 with effective immunoregulation functions." Immunology 116(4): 487-498.](서열번호 31 및 39 또는 이들 서열을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열)에 기재된 바와 같이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 다른 종 CD3 분자에 또한 결합하는 적합한 항-CD3 결합제의 다른 예는 국제공개공보 제WO2008119567호(Cross-species-specific binding domain)에 기재되어 있고, 또한 국제공개공보 제WO2010037835호에 이중특이적 T-세포 결합자의 생성에서 이들의 용도가 기재되어 있다.
본 발명의 실시형태에서, VH 및 VL의 선택된 조합은 이어서 단일 쇄 가변 단편의 형태를 가질 수 있다. 이는 배향 VH-L2-VL 또는 VL-L2-VH으로 존재할 수 있고, 여기서 L2는 제1 가변 도메인의 C-말단을 제2 가변 도메인의 N-말단과 연결하는 링커 서열이다. 바람직한 링커는 15-30개 아미노산 길이이고, 최소 소수성 및 면역원성 또는 항원성과 조합된 고도의 유연성을 갖는다. 바람직한 링커의 예는 몇개(2-4)의 작은 아미노산으로 신장할 수 있는 (GGGGS)3 링커이다. 이러한 신장된 (GGGS)3 링커의 예는 서열 ASGGGGSGGGGSGGGGSAG이다. 대체 링커는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 항체 단편에 대한 구조적 방해를 최소화하고 안정성 또는 옹해도를 증가시키기 위해 최적화되어 왔다. 당해 기술분야에 공지된 링커는 보다 최적 scFv 분자를 수득하기 위해 평가할 수 있다. L2 링커의 추가의 최적화는 선택 시스템에 커플링된 랜덤화를 통해 수득할 수 있다. 이러한 최적화의 예는 문헌[참조: Tang et al. 1996 “Selection of Linkers for a Catalytic Single-chain Antibody Using Phage Display Technology”, The Journal of Biological Chemistry, 271, 15682-15686]에 제공되어 있다.
본 발명의 scFv는 디설파이드 안정화된 형태의 scFv를 도입함으로써 추가로 안정화시킬 수 있다. 국제공개공보 제WO9429350호는 어떠한 위치가 VH 및 VL 도메인의 C-말단 절반 사이의 비-천연 디설파이드 결합을 조작하는데 적합한지를 설명한다. 다른 예는 문헌[참조: Schiedl et al, 2000 "Expression of a bispecific dsFv-dsFv′ antibody fragment in Escherichia coli" Protein Eng. (2000) 13 (10): 725-734]에 설명되어 있다. 이들 간행물의 교시와는 달리, 놀랍게도, 본 발명의 바람직한 분자는 단일 펩티드 분자를 사용하고, 이는 적절한 VH 및 VL 사이의 조작된 디설파이드 결합으로 더욱 안정화된 단일 쇄 가변 단편이다. 이는 CD3 결합제의 다량체화에 기인하여 고도 활성화 복합체의 형성을 방해했다. 놀랍게도, 융합 단백질에 존재하는 2개의 상이한 scFv에서 도메인간 디설파이드 결합을 조작하는 경우에도 어떠한 부정합 페어는 형성되지 않았다. 융합 단백질이 8개 도메인내 및 1개 쇄간 디설파이드 결합을 함유하고 이제 2개 이상의 도메인간 디설파이드 결합이 도입되어 있는 것을 고려하면, 본 발명의 융합 단백질에서 디설파이드 미스-페어링의 전체 부재도 동등하게 놀라운 것이다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 전체 분자의 보다 높은 안정성을 갖는 것도 놀라운 것이다. 예는, 신규한 인간화된 형태의 CD3-결합 scFv(OKT3)(dshuOKT3-31)을 탈-안정화시킬 때에 T-세포 활성화 효력의 놀라운 증가이다. 조합된 VH/VL 결합 도메인(즉, 조합된 VH/VL로도 불리움)에 대한 서열은 5T4 결합제의 경우에 서열번호 42(scFv5T4); 서열번호 43(scFvhu5T4); 서열번호 44(dsFvhu5T4)에 제공되어 있다. 결합이 OKT3에 기반하는 CD3에 대한 조합된 VH/VL 결합 도메인에 대한 서열은 서열번호 45(scFvOKT3); 서열번호 46(scFvhuOKT3v32) 및 서열번호 47(dsFvhuOKT3v32)이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 융합 단백질은 서열번호 48(dsFvhuUCHT1-24)에서 UCHT1에 기반하는 인간화된, 디설파이드 안정화된 CD3 결합제를 함유한다. 명백하게는, 당해 기술분야의 숙련가는 서열번호 1-41 중의 서열 목록에 기반하여 다른 기능적 조합물(즉, 융합 단백질의 인공적 서열 부분으로도 불리움)을 제조할 수 있다. 이들 서열(즉 서열번호 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48)을 포함하거나 이들 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 서열은 본 발명에 포함된다. 또한, 항원 결합에 관여하는 영역을 상이한 프레임워크에 이식하는 것은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 항원 결합 부위는 "베르니어(Vernier)" 영역 중의 구조적 소수성 코어에 의해 지지되는, 6개 별개 상보성 결정 영역(CDR)으로 구성되어 있다. CDR 및 필수 지지 서열의 이식은 제US8399625호에 교시되어 있고, 예를 들면, 제WO9109967호; 제US5225539호; 제US5693761호 또는 제US5821337호에 개시된 바와 같이, 상이한 종의 항원 결합 부위를 인간 프레임워크 잔기와 조합하기 위해 빈번히 사용된다. 항체에 따라, CDR 루프의 모든 서열이 필요한 것은 아니며, 본질적 위치는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의해 결정할 수 있다. 여기서, CDR 루프 중의 각각의 아미노산은 Ala로 변화시키고 결합에 대해 평가한다. 항원 결합 부위를 보존하기 위해 최소 잔기를 결정하는 기술의 보다 최근의 바람직한 변이체는 제WO2012038609호("Super-humanized antibodies") 및 문헌[참조: Pelat et al (2011) "Engineering the variable region of therapeutic IgG antibodies" MAbs 3(3): 243252]에 기재되어 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 서열번호 1-41에 수록된 바와 같이 상이한 프레임워크로 본 발명의 융합 단백질에 함유된 항원 결합 부위를 용이하게 변화시킬 수 있다.
목적하는 V-도메인이 동정되면, 정합 페어는 Fab 불변 도메인 CH1 및 CL로 이식하기 위해 선택되어야 한다. 이 기술은 Fab 분자가 V-도메인(VH 및 VL) 및 C-도메인(CH1 및 CL)의 비-천연 조합을 함유하는 "키메라"를 제공한다. 치환은 결합 및 안정성에 영향을 미칠 수 있는 Fab 폴딩을 방해하지 않도록 천연 Fab 서열에 대한 상동성에 의해 유도할 수 있다. Fab 키메라화는 당해 기술분야[참조: US20030095964, Process for producing humanized chimera antibody"]에 잘 기재되어 있다. VHCL:VLCH1 구성에서 교차-Fab 쇄의 생성이 잘 기재되어 있고 V-도메인의 성공적 이식을 가능하게 한다[참조: Fenn et al. (2013). "Crystal structure of an anti-Ang2 CrossFab demonstrates complete structural and functional integrity of the variable domain." PLoS One 8(4): e61953].
본 발명의 실시형태에서, Fab-유래된 쇄의 C-말단 아미노산(한편에서는 CH1-함유 쇄 및 다른 한편에서는 CL 함유 쇄)는 선택된 링커 서열 L1에 의해 선택된 scFv 또는 dsFv 또는 단일 도메인 결합제 또는 효과기 분자(항체 유래 또는 비-항체 유래)에 연결될 것이다. L1은, 기능적으로 요구되는 한, 단일 아미노산과 같이 짧을 수 있다. 바람직하게는, L1은 2개의 scFv-유래된 구성 블록 및 Fab-유래된 잔기 사이의 일부 공간을 도입해야 한다. 또한, 바람직하게는, L1은 일부 링커 유연성을 가져야 한다. L1의 길이는 에피토프의 위치와 CD3 사이의 최적 거리에 적합하도록 최적화할 수 있다. 이러한 예는 문헌[참조: Hombach et al. (2007). "T cell activation by antibody-like immunoreceptors: the position of the binding epitope within the target molecule determines the efficiency of activation of redirected T cells." J Immunol 178(7): 4650-4657; and Guest et al. (2005). "The role of extracelluar spacer regions in the optimal design of chimeric immune receptors: evaluation of four different scFvs and antigens." J Immunother 28(3): 203-211]에서 발견할 수 있다. 링커 서열의 조성은 강성, 프로테아제 내성을 위해 최적화될 수 있거나 추가의 기능을 함유할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 뮤린 5T4 결합제(Tb535C)에 기반한 융합 단백질의 경우에 서열번호 49(CH1-함유 쇄) 및 서열번호 50(CL-함유 쇄), 및 인간화된 5T4 결합제(Tb535H)에 기반한 본 발명의 융합 단백질의 경우에 서열번호 51(CH1-함유 쇄) 및 서열번호 52(CL-함유 쇄)를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 뮤린 5T4 결합제(Tb535C)에 기반한 융합 단백질의 경우에 서열번호 49(CH1-함유 쇄)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖고 서열번호 50(CL-함유 쇄)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 인간화된 5T4 결합제(Tb535H)에 기반한 본 발명의 융합 단백질의 경우에 서열번호 51(CH1-함유 쇄)과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖고 서열번호 52(CL-함유 쇄)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 뮤린 5T4 결합제(Tb535C)에 기반한 융합 단백질의 경우에 서열번호 49(CH1-함유 쇄) 및 서열번호 50(CL-함유 쇄)의 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 인간화된 5T4 결합제(Tb535H)에 기반한 본 발명의 융합 단백질의 경우에 서열번호 51(CH1-함유 쇄) 및 서열번호 52(CL-함유 쇄)의 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
최상의 결과는 Tb535H로 수득되고: 놀랍게도, 이는 소형의 구성을 갖는다(도 5A). 따라서, 이는 매우 안정하고(도 6AD) 제조가 용이한 것(최적 수율은 도 7D에서 수득되었다)으로 가정될 수 있다. 또한, 놀랍게도, 이러한 융합 단백질은 대용적의 분포 및 느린 정화를 갖는 것으로 밝혀졌다(도 10). 마지막으로, 이러한 융합 단백질의 활성은 상이한 종 타입에 대해 최적이다(도 9, 11A, 11B).
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 1 또는 2개의 VH 결합 도메인을 포함하고, 이들은 서열번호 1 내지 15 중의 어느 하나로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는다. 바람직한 VH는 서열번호 6으로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열로 나타내어진다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 1 또는 2개의 VL 결합 도메인을 포함하고, 이들은 서열번호 16 내지 25 중의 어느 하나로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는다. 바람직한 VL은 서열번호 19로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열에 의해 나타내어진다. 바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 1 내지 15 중의 어느 하나와 서열번호 16 내지 25 중의 임의의 것과의 조합을 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 융합 단백질은 서열번호 6으로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열로 나타내어지는 VH 및 서열번호 19로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열로 나타내어지는 VL의 조합을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 i) 서열번호 26 내지 33 중의 어느 하나로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는 1 또는 2개의 VH 결합 도메인을 포함하거나, ii) 서열번호 34 내지 41 중의 어느 하나로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는 1 또는 2개의 VL 결합 도메인을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 26 내지 33 중의 어느 하나와 서열번호 34 내지 41 중의 임의의 것과의 조합을 포함한다. 보다 바람직하게는, 융합 단백질은 i) 서열번호 29로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는 1 또는 2개의 VH 결합 도메인을 포함하거나, ii) 서열번호 37로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는 1 또는 2개의 VL 결합 도메인을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 42 내지 44 중의 어느 하나 또는 서열번호 45 내지 48 중의 어느 하나로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는 1 또는 2개의 조합된 VH/VL 결합 도메인을 포함하고, 보다 특히, 1 또는 2개의 조합된 VH/VL 결합 도메인은 서열번호 42 내지 44 중의 어느 하나로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖고, 나머지 1 또는 2개의 조합된 VH/VL 결합 도메인은 서열번호 45 내지 48 중의 어느 하나로 이루어지거나 이들을 포함하거나 이들과 적어도 90% 동일성을 갖는다. 보다 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질의 하나의 쇄는 서열번호 49를 포함하고 다른 쇄는 서열번호 50을 포함하거나, 하나의 쇄는 서열번호 51을 포함하고 다른 쇄는 서열번호 52를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또한 이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 또는 이러한 핵산 서열 또는 이러한 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 생산하는 방법으로 이루어지거나 이를 포함하고, 여기서 상기 방법은 상기 정의된 숙주 세포를, 본 발명의 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 배양하고 생산된 융합 단백질을 배양물로부터 회수하는 것을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 의약으로서 사용하기 위한, 보다 구체적으로는, 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한, 본 발명의 융합 단백질을 포함하거나 상기 기재된 방법에 따라 생산된 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자, 상기 기재된 바와 같은 벡터 또는 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 융합 단백질은 바람직하게는 "단리된" 융합 단백질이다. 본원에 개시된 융합 단백질을 기재하기 위해 사용될 때 "단리된"은 이의 생산 환경의 성분으로부터 동정, 분리 및/또는 회수된 융합 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 융합 단백질은 이의 생산 환경으로부터 모든 다른 성분과의 연관이 없다. 재조합 형질감염된 세포로부터 생성되는 것과 같은, 이의 생산 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료 용도를 전형적으로 간섭할 수 있는 물질이고, 이는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 융합 단백질은 (1) 회전 컵 배열 결정장치의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분할 정도로, 또는 (2) 쿠마시에 블루 또는, 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비-환원 또는 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다. 그러나, 통상, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. 당해 기술분야의 숙련가는 본 발명의 융합 단백질이 자연적으로 이와 같이 발생하지 않음을 이해할 것이다. 이는 재조합 분자 생물학적 기술에 의해 생산되었다.
본 발명의 문맥에서, 단백질은 아미노산 서열에 의해 제시된다. 이러한 발명의 문맥에서, 바람직한 단백질은 본원에서 동정된 융합 단백질 또는 이의 쇄이다.
본 발명의 문맥에서, 이러한 단백질 또는 융합 단백질 또는 이의 쇄를 코딩하는 핵산 분자로서의 핵산 분자는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열에 의해 제시된다. 핵산 분자는 조절 영역을 포함할 수 있다.
소정 서열 식별 번호(서열번호)에 의해 본원에서 동정된 각각의 단백질은 개시된 이러한 특정 서열로 제한되지 않고, 또한 본원에서 처음에 정의된 것과 유사한 활성을 나타내는 단백질 변이체 또는 이의 유도체를 포함한다. 동일한 것은 소정 서열번호 X(예를 들면)에 의해 동정되고 이러한 단백질을 코딩하는 각각의 핵산 분자에도 해당하고: 본 발명은 또한 서열번호 X에 의해 초기에 코딩된 하나의 단백질과 유사한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자 변이체 또는 이의 유도체를 포함한다. 이러한 문맥에서, 활성은 5T4에 대한 융합 단백질의 결합 및/또는 5T4 발현 세포, 바람직하게는 종양 세포의 유도된 사멸일 수 있다. 보다 바람직하게는, 결합 및/또는 사멸의 평가는 도 8에 도시된 실험으로 수행된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 소정 단백질 또는 융합 단백질 또는 이의 쇄를 코딩하는 특정 뉴클레오티드 서열의 서열번호(예로서 서열번호 X를 취함)를 지칭할 때마다, 이를 다음으로 치환할 수 있다:
i. 서열번호 X와 적어도 60% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열;
ii. (i) 상보성 가닥이 서열의 핵산 분자와 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열;
iii. 유전자 코드의 축중에 기인하여 서열이 (i) 또는 (ii)의 핵산 분자의 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열; 또는
iv. 뉴클레오티드 서열 서열번호 X에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 60% 아미노산 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
본원 전반에 걸쳐, 특정 아미노산 서열의 서열번호(예로서 서열번호 Y를 취함)을 지칭할 때마다, 이를 다음으로 치환할 수 있다: 아미노산 서열 서열번호 Y와 적어도 60% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 융합 단백질 또는 이의 쇄.
소정 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과 각각 이의 동일성 또는 유사성 퍼센트(적어도 60%)의 측면에서 본원에 기재된 각각의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은, 추가의 바람직한 실시형태에서, 소정 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 각각 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 서열 동일성 또는 유사성은 본원에서 동정된 서열의 전체 길이를 비교함으로써 결정된다. 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 소정 서열번호와의 동일성 또는 유사성은 상기 서열의 전체 길이(즉, 이의 전체 길이에 걸쳐 또는 전체로서)에 기반한 동일성 또는 유사성을 의미한다.
"서열 동일성"은, 서열을 비교하여 결정되는 바와 같이, 2개 이상의 아미노산(폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오티드) 서열 사이의 관계로서 본원에서 정의된다. 바람직한 실시형태에서, 서열 동일성은 2개의 소정 서열번호의 전체 길이 또는 이의 일부에 기반하여 계산된다. 이의 일부는 바람직하게는 양 서열번호의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 의미한다. 당해 기술분야에서, "동일성"은 또한, 경우에 따라 이러한 서열의 스트링 사이의 정합에 의해 결정되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다.
2개 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 서열 대체물을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교하여 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은, 이로서 한정되는 것은 아니지만, 문헌[참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)]에 기재된 것들을 포함하는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있다.
동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험된 서열 사이의 최대 정합을 제공하도록 설계되어 있다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화되어 있다. 2개 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은, 예를 들면, GCG 프로그램 팩키지[참조: Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)], BestFit, BLASTP, BLASTN 및 FASTA[참조: Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]를 포함한다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 기타 공급업자[참조: BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]로부터 공개적으로 입수가능하다. 공지된 스미스 워터맨(Smith Waterman) 알고리즘도 또한 동일성의 결정에 사용될 수 있다.
폴리펩티드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); 비교 매트릭스: BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992); 갭 패널티: 12; 및 갭 길이 패널티: 4. 이들 파라미터에 유용한 프로그램은 위스콘신주 매디슨에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 "Ogap" 프로그램으로 공개적으로 이용가능하다. 상술된 파라미터는 아미노산 비교(최종 갭에 대한 패널티 없음)를 위한 디펄트 파라미터이다.
핵산 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); 비교 매트릭스: matches=+10, mismatch=0; 갭 패널티: 50; 갭 길이 패널티: 3. 위스콘신주 매디슨에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹의 Gap 프로그램으로 이용가능하다. 핵산 비교를 위한 디펄트 파라미터는 상기 제공되어 있다.
임의로, 아미노산 유사성의 정도를 결정하는데 있어서, 당해 기술분야의 숙련가는 또한, 당해 기술분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 호환성을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열 중의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 이의 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것들이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 보존적이다. 각각의 천연 존재 아미노산에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 Ser으로; Arg에서 Lys으로; Asn에서 Gln 또는 His으로; Asp에서 Glu으로; Cys에서 Ser 또는 Ala으로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp으로; Gly에서 Pro으로; His에서 Asn 또는 Gln으로; Ile에서 Leu 또는 Val으로; Leu에서 Ile 또는 Val으로; Lys에서 Arg으로; Gln 또는 Glu; Met에서 Leu 또는 Ile으로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser에서 Thr으로; Thr에서 Ser으로; Trp에서 Tyr으로; Tyr에서 Trp 또는 Phe으로; 및 Val에서 Ile 또는 Leu으로.
포함되는 몇몇 유형의 융합 단백질 변이체는 하기 기재되어 있다. 본원에 기재된 융합 단백질의 아미노산 서열 변형이 의도된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 융합 단백질의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 융합 단백질의 핵산 내로 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조한다.
이러한 변형은, 예를 들면, 융합 단백질의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 잔기 내로의 삽입, 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 도달하기 위해 이루어지고, 단 최종 작제물은 목적하는 특성을 보유한다. 아미노산 변화는 또한, 예를 들면, 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는, 융합 단백질의 번역후 프로세스를 변경할 수 있다. 바람직하게는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산이 CDR에서 치환될 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 25개 아미노산이 FR에서 치환될 수 있다. 치환은 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 보존적 치환이다. 추가로 또는 대안적으로, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산은 CDR의 각각에서 삽입되거나 결실될 수 있고(물론, 이들의 길이에 의존하여), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 25개 아미노산은 FR의 각각에서 삽입 또는 결실될 수 있다.
돌연변이유발을 위한 바람직한 위치인 융합 단백질의 특정 잔기 또는 영역의 유용한 동정 방법은 문헌[참조: Cunningham and Wells in Science, 244: 1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불리운다. 여기서, 융합 단백질 내의 표적 잔기의 잔기 또는 그룹을 동정하고(예: arg, asp, his, lys 및 glu 등의 하전된 잔기), 아미노산과 에피토프와의 상호작용에 영향을 미치기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환할 수 있다.
이어서, 치환에 대해 기능적 감수성을 입증하는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위를 위해 추가의 또는 기타 변이체를 도입함으로써 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하는 부위는 예정되어 있지만, 돌연변이 자체의 성질은 예정할 필요는 없다. 예를 들면, 소정 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 융합 단백질 변이체를 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
바람직하게는, 아미노산 서열 삽입은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 융합 단백질의 삽입 변이체는 효소에 대한 항체의 N 또는 C-말단에 대한 융합, 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 융합을 포함한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 바람직하게는 상이한 잔기에 의해 치환된 융합 단백질 내의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이에 대한 가장 관심있는 부위는 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR, 특히 초가변성 영역을 포함하지만, 중쇄 및/또는 경쇄 중의 FR 변경도 또한 의도된다.
예를 들면, CDR 서열이 6개 아미노산을 포함하는 경우, 1, 2 또는 3개의 이들 아미노산이 치환되는 것으로 상정된다. 유사하게는, CDR 서열이 15개 아미노산을 포함하는 경우, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이들 아미노산이 치환되는 것으로 상정된다.
일반적으로, 아미노산이 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상 또는 모든 CDR에서 치환되는 경우, 이렇게 수득된 "치환된" 서열은 본원에서 앞에 정의된 바와 같이 "본래" CDR 서열과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 65%, 보다 더 바람직하게는 70%, 특히 바람직하게는 75%, 보다 특히 바람직하게는 80% 동일하다. 이는, "치환된" 서열과 동일한 정도로 CDR의 길이에 의존적임을 의미한다. 예를 들면, 5개 아미노산을 갖는 CDR은 바람직하게는 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖도록 하기 위해 이의 치환된 서열과 80% 동일하다. 따라서, 융합 단백질의 CDR은 이들의 치환된 서열에 대해 상이한 정도의 동일성을 가질 수 있고, 예를 들면, CDRL1은 80%를 가질 수 있는 반면, CDRL3은 90%를 가질 수 있다. 바람직한 치환(또는 대체)는 보존적 치환이다. 그러나, 임의의 치환(비-보존적 치환 포함)은 융합 단백질이 제1 결합 도메인에 의해 5T4에 결합하고 제2 결합 도메인에 의해 CD3에 결합하는 이의 능력을 보유하고 이의 CDR이 이렇게 치환된 서열에 대해 동일성("본래" CDR 서열에 대해 적어도 60%, 보다 바람직하게는 65%, 보다 바람직하게는 70%, 특히 바람직하게는 75%, 보다 특히 바람직하게는 80% 동일성)을 갖는 것으로 상정된다.
융합 단백질의 다른 변형이 본원에서 의도된다. 예를 들면, 융합 단백질은 다양한 비단백질성 폴리머, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중의 하나와 연결될 수 있다. 융합 단백질은 또한, 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐(예를 들면, 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타아크릴레이트) 마이크로캡슐)에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐), 또는 마크로에멀젼에 포집될 수 있다. 이러한 기술들은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 기재되어 있다. 본원에서 개시된 융합 단백질은 또한 면역-리포좀으로 제형화될 수 있다. "리포좀"은, 포유동물에 약물을 전달하기에 유용한, 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 소포이다. 리포좀의 성분은 통상 이중층 형태로 배열되어, 생물학적 막의 지질 배열과 유사하다. 항체를 함유하는 리포좀은 다음과 같이 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조된다[참조: Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); US Pat. Nos. 4,485,045 및 4,544,545; 및 1997년 10월 23일 공개된 W0　97/38731]. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물로 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 정해진 기공 크기의 필터를 통해 압출하여 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디설파이드 교환 반응을 통해 문헌[참조: Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 함유된다[참조: Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)].
재조합 기술을 사용할 때, 융합 단백질은 세포 내에서, 주변세포질 공간 내에서 생산되거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 융합 단백질이 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 입자 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편들이, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌[참조: Carter　et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]는 대장균의 주변세포질 공간 내로 분비되는 항체들을 단리하는 과정을 기재한다.
세포로부터 제조된 융합 단백질 조성물은, 예를 들면, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 상기 핵산 분자는 바람직하게는 숙주 세포 내에 포함되는 벡터 내로 바람직하게 포함된다. 상기 숙주 세포는, 예를 들면, 본 발명의 핵산 서열로 형질전환 또는 형질감염 후, 융합 단백질을 발현할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 핵산 분자는 조절 서열과 작동적으로 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 형질전환, 형질감염 등의 방법에 의해 도입되는 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손도 지칭하는 것으로 이해해야 할 것이다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실 모세포와 동일한 것은 아닐 수 있지만, 본원에서 사용된 용어의 범위내에 여전히 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비를 포함하는, 본 발명의 융합 단백질의 생산에 관여하는 임의의 단계를 포함한다.
용어 "조절 서열"은 특정 숙주 생물체에서 작동적으로 연결될 코딩 서열의 발현을 위해 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵세포에 적합한 조절 서열은, 예를 들면, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치할 때 "작동적으로 연결"된다. 예를 들면, 전구서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동적으로 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진시키도록 배치되는 경우에 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열들이 인접하고, 분비 리더의 경우에, 인접하고 리딩 단계에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해야 하는 것은 아니다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 관례에 따라 사용된다. 적합한 숙주 세포는 효모, 곰팡이, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵세포 및 원핵세포를 포함한다. 본 발명의 융합 단백질은 박테리아에서 생산될 수 있다.
발현 후, 본 발명의 융합 단백질, 바람직하게는 융합 단백질은 가용 분획 내의 대장균 세포 페이스트로부터 단리되고, 예를 들면, 친화성 크로마토크래피 및/또는 크기 배제를 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는, 예를 들면, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 수행될 수 있다. 원핵세포에 추가하여, 사상 진균 또는 효모 등의 진핵성 미생물은 본 발명의 융합 단백질에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 제빵 효모는 하급 진핵성 숙주 생물체 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이에스(Kluyveromyces) 숙주(예를 들면, K.　lactis, K.　fragilis(ATCC 12424), K.　bulgaricus(ATCC 16045), K.　wickeramii(ATCC 24178), K.　waltii(ATCC 56500), K.　drosophilarum(ATCC 36906), K.　thermotolerans, 및 K.　marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402 226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183 070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244 234); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 슈와니마이세스(Schwanniomyces)(예를 들면, Schwanniomyces occidentalis); 및 예를 들면, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼길루스(Aspergillus) 숙주(예를 들면, A.　nidulans and A.　niger.) 등의 사상 진균과 같은 다양한 다른 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수가능하고 본원에서 유용하다.
본 발명의 글리코실화된 융합 단백질, 바람직하게는 항체 유래 융합 단백질의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 다세포 생물체로부터 유래한 것이다. 무척추 세포의 예는 식물 및 동물 세포를 포함한다. 다수의 바쿨로바이러스 균주 및 변이체 및 스포도프테르 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용가능한 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주들은 공개적으로 입수가능하며, 예를 들면, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주, 및 이러한 바이러스들은 본 발명에 따라 본원에서의 바이러스로서, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 아라비돕시스 및 담배의 식물 세포 배양물도 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포 배양에서의 단백질 발현에서 유용한 클로닝 및 발현 벡터들은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, 및 Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986] 참조.
그러나, 척추동물 세포가 가장 관심이 있고, 배양물 중의 척주동물 세포의 증식(조직 배양)이 일반적 과정으로 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질감염된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양액 중의 성장에 대해 서브클로닝된 293 또는 293 세포주, 문헌[참조: Graham et al. , J. Gen Virol. 36 : 59 (1977)]); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, 문헌[참조: Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포(TM4, 문헌[참조: Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포(CVI ATCC CCL 70); 아프리카 녹색원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL1587); 인간 자궁경부암종(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2,1413 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL5 1); TRI 세포[참조: Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383 : 44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 세포주(Hep G2)이다. 재조합 기술을 사용할 때, 본 발명의 융합 단백질은 세포내에서, 주변세포질 공간 내에서 생산되거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 융합 단백질이 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 입자 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편들이, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌[참조: Carter　et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]은 대장균의 주변세포질 공간 내로 분비되는 항체들을 단리하는 과정을 기술한다. 요약하면, 세포 페이스트를 나트륨 아세테이트(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재하에서 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거한다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 일반적으로 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 먼저 농축시킨다. PMSF과 같은 단백질 억제제를 앞서 언급한 임의의 단계에 포함시켜 단백질분해를 억제할 수 있으며, 항생제를 포함시켜 우발적인 오염원의 성장을 예방할 수 있다.
숙주 세포로부터 제조된 본 발명의 융합 단백질은, 예를 들면, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 빈번하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 조절된 포어 글라스 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 공정 시간을 가능하게 한다. 본 발명의 융합 단백질이 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABXMresin(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)이 정제를 위해 유용할 수 있다. 회수되는 항체에 따라 이온-교환 컬럼 상에서의 분별, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로즈(SEPHAROSETM) 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예: 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토-포커싱, SDS-PAGE 및 암모늄 설페이트 침전법과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술들도 또한 이용가능하다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 융합 단백질의 생산 방법이 제공되며, 상기 생산 방법은 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 본원에서 정의된 숙주 세포를 배양하고 배양물로부터 생산된 융합 단백질을 회수하는 것을 포함한다. 대안적 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 방법에 따라 생산된 융합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 바람직하게는 상기 조성물은 약제학적 조성물이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 특히 바람직한 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 융합 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 담체, 안정화제 및/또는 부형제의 적합한 제형을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 비경구, 경피, 체강내(intraluminal), 동맥내, 척수관내 및/또는 비강내 투여를 위한 또는 조직으로의 직접 주사를 위한 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 주입 또는 주사를 통해 환자에게 투여되는 것이 특히 상정된다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식에 의해, 예를 들면, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해 실시될 수 있다. 특히, 본 발명은 적합한 조성물의 중단되지 않는 투여를 제공한다. 비제한적 예로서, 중단되지 않는, 즉, 연속적 투여는 환자의 체내로 치료제의 유입을 계측하기 위한 환자에게 장착된 작은 펌프 시스템에 의해 실현될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 상기 펌프 시스템을 사용함으로써 투여될 수 있다. 이러한 펌프 시스템은 당해 기술분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 통상적으로 주입되는 치료제를 함유하는 카트리지의 주기적 교환에 의존한다. 이러한 펌프 시스템에서 카트리지를 교환할 때, 환자의 체내로 치료제의 달리 중단되지 않는 유동의 일시적 중단이 발생할 수 있다. 이러한 경우에, 카트리지 대체 이전의 투여 단계 및 카트리지 대체 이후의 투여 단계는 본 발명의 약제학적 수단 및 방법의 의미 내에서 이러한 치료제의 하나의 "중단되지 않는 투여"를 함께 구성하는 것으로 여전히 간주될 것이다.
본 발명의 이들 융합 단백질의 연속적 또는 중단되지 않는 투여는 저장소 외부로 유체를 유도하기 위한 유체 유도 기구 및 상기 유도 기구를 작동시키기 위한 작동 기구를 포함하는 유체 전달 장치 또는 작은 펌프 시스템에 의해 정맥내 또는 피하로 투여될 수 있다. 피하 투여용 펌프 시스템은 환자의 피부를 관통하여 환자의 신체에 적합한 조성물을 전달하기 위한 니들 또는 캐뉼라를 포함할 수 있다. 상기 펌프 시스템은 환자의 정맥, 동맥 또는 혈관과 독립적으로 환자의 피부에 직접 고정되거나 부착되어 상기 펌프 시스템과 환자의 피부 사이의 직접 접촉을 가능하게 할 수 있다. 상기 펌프 시스템은 24시간에서 수일까지 동안 환자의 피부에 부착될 수 있다. 상기 펌프 시스템은 작은 용적을 위한 저장소를 갖는 작은 크기일 수 있다. 비제한적 예로서, 투여되는 적합한 약제학적 조성물에 대한 저장소의 용적은 0.1 내지 50ml일 수 있다.
연속 투여는 피부에 착용되고 간격을 두고 대체되는 패치에 의한 경피 투여일 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 이러한 목적에 적합한 약물 전달용 패치 시스템을 알고 있다. 1차 소진된 패치의 대체가 유리하게는, 예를 들면, 1차 소진된 패치와 바로 인접한 피부 표면 상에 및 1차 소진된 패치의 제거 직전에, 새로운 2차 패치의 배치와 동시적으로 수행될 수 있으므로, 경피 투여는 특히 중단되지 않는 투여를 잘 처리할 수 있다는 점에 유의한다. 유동 중단 또는 전원 셀 오류의 문제는 발생하지 않는다.
본 발명의 조성물은 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 용액, 예를 들면, 인산 완충 식염수 용액, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액, 리포좀 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 공지된 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 제형화는 카보하이드레이트, 완충 용액, 아미노산 및/또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 카보하이드레이트는 비환원당, 바람직하게는 트레할로스, 슈크로스, 옥타설페이트, 솔비톨 또는 자일리톨일 수 있다. 일반적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여에 적합한, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제를 포함한다. 약제학적 활성 성분에 대한 이러한 매질 및 시약의 사용은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수령자에게 무독성이며 다음을 포함한다: 추가의 완충 시약; 보존제; 공용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; EDTA와 같은 킬레이팅제; 금속 복합체(예를 들면, Zn-단백질 복합체); 폴리에스테르와 같은 생분해성 폴리머; 나트륨, 다가 당 알콜과 같은 염-형성 카운터이온; 알라닌, 글리신, 아스파라긴, 2-페닐알라닌 및 트레오닌과 같은 아미노산; 트레할로스, 슈크로스, 옥타설페이트, 솔비톨 또는 자일리톨 스타키오스, 만노오스, 소르보스, 자일로스, 리보오스, 마이오이니시토스(myoinisitose), 갈락토오스, 락티톨, 리비톨, 마이오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예: 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 당 또는 당 알콜; 글루타티온, 티옥산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, [알파]-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 설페이트와 같은 황 함유 환원제; 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 기타 면역글로불린과 같은 저분자량 단백질; 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머. 이러한 제형은 펌프 시스템과 함께 및/또는 없이 정맥내 또는 피하일 수 있는 연속 투여를 위해 사용될 수 있다. 아미노산은 하전된 아미노산, 바람직하게는 리신, 리신 아세테이트, 아르기닌, 글루타메이트 및/또는 히스티딘일 수 있다. 계면활성제는 바람직하게는 >1.2 KD의 분자량을 갖는 세제 및/또는 바람직하게는 >3 KD의 분자량을 갖는 폴리에테르일 수 있다. 바람직한 세제에 대한 비제한적 예는 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80 또는 트윈 85일 수 있다. 바람직한 폴리에테르에 대한 비제한적 예는 PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 또는 PEG 5000일 수 있다. 본 발명에서 사용된 완충 시스템은 바람직하게는 5-9의 pH를 가질 수 있으며, 시트레이트, 석시네이트, 포스페이트, 히스티딘 및 아세테이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비-침팬지 영장류, 예를 들면, 마카크에 대해 본원에 기재된 종간 특이성을 나타내는 본 발명의 폴리펩티드의 증가하는 용량을 투여함으로써, 예를 들면, 용량 확대 연구에 의해 결정될 수 있는 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 본원에서 기재된 종간 특이성을 나타내는 본 발명의 폴리펩티드는 비침팬지 영장류에서 임상전 시험에서와 동일한 형태로 유리하게 사용될 수 있고 인간에서 약물로서 사용될 수 있다. 이들 조성물은 또한 다른 단백질성 및 비단백질성 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 이들 약물을 본원에서 정의된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 동시에 또는 상기 폴리펩티드의 투여전 또는 후에 별도로 정해진 시간 간격과 용량으로 투여될 수 있다. 용량 섭생은 주치의와 임상적 인자에 의해 결정될 수 있을 것이다. 의학 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 용량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여받고 있는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함한 다수의 인자들에 의존한다.
비경구 투여용 제제는 멸균 수성 및 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 에틸올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 수성 담체는, 식염수 및 완충 매질을 포함하여, 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거액 또는 불휘발성유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예: 링거 덱스트로스에 기초한 것들) 등을 포함한다. 예를 들면, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은, 예를 들면, 바람직하게는, 인간 기원의, 혈청 알부민 또는 면역글로불린과 같은 단백질성 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 본원에서 정의된 본 발명의 폴리펩티드에 추가하여 조성물의 의도된 용도에 따라 추가의 생물학적 활성제를 포함할 수 있는 것으로 상정된다. 이러한 활성제는 위-장관계에 작용하는 약물, 세포정지제(cytostatica)로 작용하는 약물, 고요산혈증을 예방하는 약물, 면역반응을 억제하는 약물(예: 코르티코스테로이드), 염증 반응을 조절하는 약물, 순환계에 작용하는 약물 및/또는 당해 기술분야에 공지된 사이토카인과 같은 물질일 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 또한 동시-요법, 즉 다른 항암 의약과 함께 조합하여 적용되는 것이 또한 상정된다.
본원에서 정의된 약제학적 조성물의 생물학적 활성은 하기 예, 국제공개공보 제WO 99/54440호 또는 문헌[참조: Schlereth et al., Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12]에 기재되어 있는 바와 같은, 예를 들면, 세포독성 검정에 대해 측정될 수 있다. 본원에서 사용된 "효능" 또는 "생체내 효능"은, 예를 들면, 표준화된 NCI 반응 기준을 사용하여 본 발명의 약제학적 조성물에 의한 치료법에 대한 반응을 지칭한다. 본 발명의 약제학적 조성물을 사용한 치료법의 성공 또는 생체내 효능은 이의 의도된 목적에 대한 조성물의 효과, 즉 이의 목적하는 효과, 즉, 병리학적 세포, 예를 들면, 종양세포의 고갈을 야기하는 조성물의 능력을 지칭한다. 생체내 효능은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 백혈구 계수, 감별, 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 골수천자를 포함한, 각각의 질환 실체에 대한 확립된 표준 방법에 의해 모니터링할 수 있다. 또한, 다양한 질환 특이적 임상적 화학 파라미터 및 기타 확립된 표준 방법들이 사용될 수 있다. 추가로, 컴퓨터-보조 토모그래피, X-선, 핵자기공명 토모그래피(예를 들면, National Cancer Institute-기준 기반의 반응 평가[Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244]를 위해), 양전자 방사 토모그래피 스캐닝, 백혈구 계수, 감별, 형광 활성화된 세포 분류, 골수천자, 림프절 생검/조직학 및 다양한 림프종 특이적 임상적 화학 파라미터(예를 들면, 락테이트 디하이드로게네이즈) 및 기타 확립된 표준 방법들이 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물과 같은 약물의 개발에서 또 다른 주요 도전은 약동학적 특성의 예측가능한 조절이다. 이 측면에서, 약물 후보의 약동학적 프로파일, 즉, 소정 상태를 치료하기 위한 특정 약물의 능력에 영향을 미치는 약동학적 파라미터의 프로파일을 확립할 수 있다. 특정 질환 실체를 치료하기 위한 약물의 능력에 영향을 미치는 약물의 약동학적 파라미터는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 반감기, 분포 용적, 간 초회 통과 대사 및 혈액 혈청 결합의 정도를 포함한다. 소정 약물의 효능은 상기 언급된 각각의 파라미터에 의해 영향을 받을 수 있다.
"Tmax"는 약물의 최대 혈중 농도가 도달된 후의 시간이고, "Cmax"는 소정 약물로 최대 수득된 혈중 농도이다. 이의 생물학적 효과에 요구되는 약물의 혈액 또는 조직 농도에 도달하는 시간은 모든 파라미터에 의해 영향을 받는다. 상기 개략된 바와 같이 비침팬지 영장류의 임상전 동물 시험에서 결정될 수 있는 종간 특이성을 나타내는 이중특이적 단일 쇄 항체의 약동학적 파라미터는, 예를 들면, 문헌[참조: Schlereth et al., Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12]에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "독성"은 유해 사례 또는 심각한 유해 사례에서 나타난 약물의 독성 효과를 지칭한다. 이들 부작용은 투여후 일반적으로 약물의 관용성의 결여 및/또는 국소 관용성의 결여를 지칭할 수 있다. 독성은 또한 약물에 의해 야기된 기형발생 또는 발암 효과를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "안전성", "생체내 안정성" 또는 "관용성"은 약물의 투여 직후(국소적 관용성) 및 약물의 장기간의 적용 동안 심각한 유해 사례를 직접 유도하지 않는 약물의 투여를 정의한다. "안전성", "생체내 안정성" 또는 "관용성"은, 예를 들면, 치료와 추적관찰 기간 동안 규칙적 간격으로 평가할 수 있다. 측정은 임상적 평가, 예를 들면, 기관 소견 및 실험실 비정상의 스크리닝을 포함한다. 임상 평가가 수행될 수 있고, 정상 소견에 대한 일탈이 NCI-CTC 및/또는 MedDRA 표준에 따라 기록/코딩된다. 기관 소견은, 예를 들면, 문헌[참조: Common Terminology Criteria for adverse events v3.0(CTCAE)]에 기재된 바와 같은 알러지/면역학, 혈액/골수, 심장 부정맥, 응집 등과 같은 기준을 포함한다. 시험될 수 있는 실험실 파라미터는, 예를 들면, 혈액학, 임상 화학, 응집 프로파일 및 뇨 분석, 및 혈청, 혈장, 림프액 또는 척수액, 액체 등과 같은 다른 체액의 검사를 포함한다. 따라서, 안전성은 물리적 검사, 이미징 기술(즉, 초음파, x-레이, CT 스캔, 자기공명영상(MRI)), 기술적 장비를 사용한 다른 측정(즉, 심전도), 활력 징후에 의해, 실험 파라미터를 측정하고 유해 사례를 기록함으로써 평가될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 용도 및 방법에서 비침팬지 영장류의 유해 사례는 조직병리학적 및/또는 조직화학적 방법에 의해 검사될 수 있다.
용어 "유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 목적하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 용어 "치료학적 유효 용량"은 이미 질환을 앓고 있는 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치료 또는 적어도 부분적으로 차단하기에 충분한 양으로서 정의된다. 이러한 용도에 효과적인 양은 감염의 중증도 및 환자 자신의 면역계의 일반 상태에 의존할 것이다. 용어 "환자"는 예방적 또는 치료적 처치를 받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "유효 및 무독성 용량"은 주요 독성 효과 없이 또는 실질적으로 없이 병리학적 세포의 고갈, 종양 제거, 종양 수축 또는 질환의 안정화를 야기하기에 충분히 높은 본 발명의 융합 단백질의 용인가능한 용량을 지칭한다. 이러한 유효 및 무독성 용량은, 예를 들면, 당해 기술분야에서 기재된 용량 확대 연구에 의해 결정될 수 있으며, 심각한 부작용 사례를 유도하는 용량 미만이어야 한다(용량 제한 독성, DLT).
상기 용어들은 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997]을 참고한다.
본 발명의 융합 단백질의 적절한 용량 또는 치료학적 유효량은 치료될 병태, 병태의 중증도, 이전 치료법, 및 환자의 임상적 병력 및 치료제에 대한 반응에 의존할 것이다. 적당한 용량은 의사의 판단에 따라 1회 또는 그 이상의 일련의 투여로 환자에게 투여될 수 있도록 조절될 수 있다. 약제학적 조성물은, 필요에 따라, 단독 치료법으로 또는 항암 요법과 같은 추가의 치료법과 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 특히 비경구 투여, 즉 피하, 근육내, 정맥내, 관절내 및/또는 활막내 투여에 유용하다. 비경구 투여는 일시 주사 또는 연속 주입에 의할 수 있다. 약제학적 조성물이 동결건조되는 경우, 동결건조된 물질은 우선 투여 전에 적당한 액체 중에서 재구성된다. 동결건조된 물질은, 예를 들면, 주사를 위한 주사용 정균수(BWFI), 생리식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 또는 동결건조 이전의 단백질의 동일 제형 중에서 재구성될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 융합 단백질을 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용된다. 본 발명의 대안적 실시형태는, 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 융합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 개선 방법을 제공한다. 종양성 질환은 암으로 치환될 수 있다. 바람직한 암은 세포외 항원 5T4가 종양 세포에서 발현되는 암이다. 5T4의 발현은 FACS 분석을 사용하여 평가할 수 있다. 보다 바람직한 암은 중피종, 유방암, 난소암, 결장직장암, 자궁경부암, 위암, 폐암 또는 결장암이다. 바람직한 유방암은 소위 트리플 음성 유방암이다. 바람직한 대장암은 KRAS-돌연변이된 대장암이다.
본원에서 기재된 제형은 이를 필요로 하는 환자에서 본원에 기재된 병리학적 의학적 병태의 치료 및/또는 예방에서 약제학적 조성물로서 유용하다. 용어 "치료"는 치료적 처치 및 방지책 및 예방책 모두를 지칭한다. 치료는, 질환, 질환의 증상 또는 질환에 대한 소인을 낫게 하거나, 치유, 완화, 경감, 변화, 구제, 개선, 향상 또는 영향을 미칠 목적으로, 질환/장애, 질환/장애의 증상 또는 질환/장애에 대한 소인을 갖는 환자의 신체, 단리된 조직 또는 세포에 제형을 적용 또는 투여하는 것을 포함한다.
이들 "치료를 필요로 하는"은 이미 당해 장애를 갖고 있는 것들 뿐만 아니라 당해 장애를 예방하기 위한 것들도 포함한다. 용어 "질환"은 본원에 기재된 단백질 제형으로의 치료로 혜택을 받는 임의의 병태이다. 이는 포유동물을 문제의 당해 질환에 취약하게 하는 이들 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료되는 질환/장애의 비제한적 예는 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 융합 단백질, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 융합 단백질을 함유하는 하나 이상의 바이알 및 사용 지침서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본 발명의 융합 단백질을 투여하기 위한 수단, 예를 들면, 시린지, 펌프, 인퓨저 등을 함유할 수 있다. 추가의 양태에서, 본 발명은 이의 용도에 관한 것이다.
본원에서의 본 발명은 특정한 방법론, 프로토콜 또는 시약으로 한정되지 않으며, 이러한 것들은 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 본원에서 제공된 논의 및 예들은 오로지 특정 실시형태를 기재하기 위한 목적으로 제시되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 본 발명의 범위는 오로지 청구항에 의해서만 정의된다. 전술 또는 후술되는, 본 명세서의 본문 전체에 걸쳐 사용된 모든 간행물 및 특허(모든 특허, 특허출원, 과학적 간행물, 제조사의 설명서, 지침서 등)는 이들 전체가 참조로 본원에 도입된다. 본원의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 개시를 앞설 자격이 없다는 것을 시인하는 것으로 이해되어서는 않된다. 참조로서 도입된 문헌들이 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는다면, 본 명세서는 이러한 문헌들을 대체할 것이다.
도 1A 는 본 발명의 융합 단백질(또한 "트리바디 융합 단백질"로 불리움)을 제조하는 바람직한 원리를 나타낸다.
A: 예를 들면, 항체의 V-도메인으로부터 또는 기타 결합 분자로부터 유래하는, 5T4 및 T-세포 활성화 CD3 에피토프에 대한 최소 결합 영역을 단리한다. 이들 최소 결합 도메인은 CH1:CL 헤테로이량체화 도메인 상으로 N-말단 신장으로서 기능하기 위한 형태를 가지고/가지거나 단일 쇄 가변 도메인의 형태를 가지고 본 발명의 융합 단백질의 N-말단까지 신장시킨다.
B: 동일한 세포에서 동시-발현하는 경우, Fab 헤테로이량체를 형성하는, Fab L(VL 및 CL 도메인을 포함) 및 Fab Fd(VH 및 CH1 쇄를 포함)의 유전자 구조의 개략도.
C: 단일 쇄 가변 도메인(scFv) 형태의 여분 결합 도메인이 mRNA 수준에서 유전자 융합에 의해 CL 및 CH1 도메인의 C-말단에 융합되어 있는 본 발명의 융합 단백질 형태의 유전자 구조의 개략도. 예에서, 유전자 구조는 인트론-리스(intron-less) 연속 코딩 서열에 기반한다.
D: 리본 및 공간-충전 표현에서 본 발명의 융합 단백질의 분자 모델.
E: CH1과 이의 신장된 C-말단 결합제 및 CL과 이의 신장된 C-말단 결합제 사이에 10개 아미노산 링커를 함유하는 본 발명의 융합 단백질의 분자 모델. 분자 시뮬레이션은 SGGGSGGGSS 링커 서열에 기반하여 최대 유연성을 사용한다. 표현은 공간-충전으로 하고, 보다 어두운 도메인은 융합 단백질이고, 은색 도메인은 결합된 항원이다(모든 3개 결합 잔기에 대해 모델에서 동일한 항원).
도 1B는 구조가 Fab-쇄 헤테로이량체(VH-CH1:VLCL)에 기반하는 융합 단백질에서 결합 구조의 조직에서 상이한 변이 중의 몇몇을 나타낸다:
모델 (i) 및 (iv)에서 2개의 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
VL(5T4)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(5T4)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)과 조합된
VH(5T4)-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VH(5T4)-CH1-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)
또는
모델 (ii) 및 (v)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
VL(5T4)CL-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VL(5T4)CL-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)과 조합된
VH(5T4)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(5T4)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)의 상이한 형태-조직
또는
모델 (iii) 및 (vi)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
VL(CD3)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(CD3)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)과 조합된
VH(CD3)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(CD3)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)의 상이한 형태-조직
모든 조합에서, scFv는 또한 디설파이드 안정화된 단일 쇄 가변 단편(dsFv)일 수 있다.
도 1C는 구조가 교차-Fab-쇄(cFab) 헤테로이량체(VHCL:VLCH1)에 기반하는 Tb-5T4 융합 단백질에서 결합 구조의 조직에서 상이한 변이의 몇몇을 나타낸다:
(vii) 및 (x)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
VH(5T4)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(5T4)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)과 조합된
VL(5T4)-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VL(5T4)-CH1-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3).
또는
(viii) 및 (xi)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
VH(5T4)CL-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
VH(5T4)CL-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)과 조합된
VL(5T4)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(5T4)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)의 상이한 형태-조직.
또는
모델 (ix) 및 (xii)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
VH(CD3)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VH(CD3)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)과 조합된
VL(CD3)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
VL(CD3)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)의 상이한 형태-조직.
모든 조합에서, scFv는 또한 디설파이드 안정화된 단일 쇄 가변 단편(dsFv)일 수 있다.
도 1D는 구조가 CH1 및 CL 헤테로이량체(dFab)에 대한 단일 도메인 결합제 융합에 기반하는 Tb-5T4 융합 단백질에서 결합 구조의 조직에서 상이한 변이의 몇몇을 나타낸다:
(xiii) 및 (xvi)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
V2-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
V2-CH1-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)(여기서, V2는 5T4 또는 CD3에 대한 것과는 상이한 특이성을 갖는 단일 도메인 결합제이다)와 조합된
V1(5T4)CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V1(5T4)CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)(여기서, V1은 5T4에 대한 특이성을 갖는 단일 도메인 결합제이다)
또는
(xiv) 및 (xvii)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
V1(5T4)CL-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3) 또는
V1(5T4)CL-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)와 조합된
V2-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V2-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)(여기서, V2는 5T4 또는 CD3에 대한 것과는 상이한 특이성을 갖는 단일 도메인 결합제이다)의 상이한 형태-조직
또는
모델 (xv) 및 (xviii)에서 2개 가능한 조합에 대해 설명된 바와 같이,
V2-CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V2-CL-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)(여기서, V2는 5T4 또는 CD3에 대한 것과는 상이한 특이성을 갖는 단일 도메인 결합제이다)와 조합된
V1(CD3)-CH1-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4) 또는
V1(CD3)-CH1-L1-VL(5T4)-L2-VH(5T4)의 상이한 형태-조직
모든 조합에서, scFv는 또한 디설파이드 안정화된 단일 쇄 가변 단편(dsFv)일 수 있다.
도 2
A: 프레임워크 및 예측된 CDR 영역(박스)에서 차이를 나타내는, 문헌[참조: Forsberg 1997 (J. Biol. Chem 272:12430-12436)]에 의해 공개된 뮤린 5T4.H8 VH 및 VL 서열(서열번호 2 및 16)과 인간화된 서열(서열번호 6 및 19)의 비교.
B: 서열번호 2 및 16의 뮤린 V(5T4) 서열을 포함하는 Tb535C와 서열번호 6 및 19의 인간화된 V(5T4)를 포함하는 Tb535H-1120의 개략도.
C: 뮤린 및 인간화된 VH 및 VL에 대한 평균(z-스코어)의 편차로 나타낸 인간 스코어의 유의한 증가를 나타낸다.
D: VH(5T4) 및 VL(5T4)의 상이한 인간화된 형태를 포함하고 CH1-함유 쇄(HHHHHH)의 C-말단에서 HIS-tag로 신장시킨 2개 트리바디 융합의 IMAC(고정화 금속 친화성 크로마토그래피) 또는 SEC(크기 배제 크로마토그래피) 후의 생산 수율.
도 3
A: 인간화된 융합 단백질 Tb535H(서열번호 51 및 52)의 개략도.
B: dsFv 포맷, Fab-포맷, IgG 포맷 또는 BiTE 포맷(scFv(5T4)-scFv(CD3) 융합)에서 인간화된 VH(5T4) 서열번호 6 및 VL(5T4) 서열번호 19와 비교하여 Tb535H 및 Tb535C(서열번호 49 및 50)의 KD 평형 해리 상수의 비교.
C: 이의 부분 Fab(5T4) 및 dsFv(5T4)와 비교하여 Tb535H의 5T4의 재조합 세포외 도메인에 대한 ELISA 결합 곡선의 그래프 표시.
D: MSTO-211H 5T4-양성 중피종 세포주에 대한 Tb535H 및 이의 부분 Fab(5T4) 및 dsFv(5T4)의 포화 조건하에 양성 FACS 장식.
E: MSTO-211H 5T4-양성 중피종 세포주에 대한 Tb535H의 결합의 적정 및 ELISA 방법에 의한 50% 결합 농도(KD)의 비교.
F: 3개의 상이한 공여자의 말초혈 단핵구에 대한 Tb535H의 결합의 적정. KD 값은 대략 25nM에서 재현가능하다.
도 4A
A: 단백질에 존재하는 모든 디설파이드 결합의 지표와 함께 Tb535H의 개략도.
B: Tb535H에서 모든 천연 및 조작된 디설파이드 결합의 목록.
C: Tb535H의 서열에 대한 모든 디설파이드 결합의 표시.
D: 놀랍게도 Tb535C(비-환원 BOLT SDS-PAGE)보다 Tb535H에서 더욱 우수한, 조작된 디설파이드 결합의 형성의 비교. 환원 겔은 예상된 분자량의 쇄를 나타낸다. 이들 사이에, 분자량 교정 곡선이 제시되어 있다.
도 4B
A: Tb-5T4에 도입된 CD3 결합제 VH(CD3) 서열번호 29 및 VL(CD3) 서열번호 37의 인간화 및 안정화의 영향을 비교하는 활성 적정 곡선.
B: 다량체이 형성에 대한 비-디설파이드 안정화된 Tb-5T4 상의 유도된 스트레스의 영향. 도면은 20℃ 또는 37℃에서 3일 동안 배양한 후에 분석적 겔 여과 용출의 중첩 프로파일을 나타낸다. 단량체(1) 및 다량체(2-4)가 제시되어 있다.
C: 37℃에서 3일 후에 다량체의 형성에 대한 디설파이드 안정화된 Tb-5T4 상의 유도된 스트레스의 영향. 출발 상황과 비교하여 다량체 형성의 변화는 없었다.
도 5 Tb535 융합 단백질의 분석
A: Tb535C 및 Tb535H를 비교하는 분석적 겔 여과의 용출 프로파일. 150 kDa, 100 kDa, 50 kDa 및 25 kDa IgG-유래 분자를 사용하는 교정이 제시되어 있다. 테이블은 교정 라인으로부터 유래된 Tb535H 및 Tb535C의 예상된 크기를 나타낸다.
B: Tb535H의 질량 분석은 정확한 분자량을 나타내고, 동종 MW를 식별한다.
C: Tb535H의 분석적 양이온 교환 분석은 제한된 수의 전하 이성체를 식별한다.
D: 등전점 전기영동은 Tb535C, Tb535H를 IgG 형태와 비교한다.
도 6A 단백질의 용융 곡선에 기반한 Tb535의 안정성
A: Tb535H의 모식도.
B: Tb535C 및 Tb535H 사이의 써모플루오르 검정으로 용융 온도에 의한 안정성의 비교.
C: 이의 개개 성분(Fab(5T4); dsFv(5T4), dsFv(CD3))과 함께 Tb535H의 써모플루오르 검정에 의한 용융 곡선의 비교. 성분들의 이론적 합계가 또한 제시되어 있다. 놀랍게도, Tb535H는 성분들의 합계가 아니고, 융합 단백질은 보다 안정하다.
D: 동일한 V-도메인 서열에 기반한 BiTE(dsFv(5T4)-dsFv(CD3) 융합) 및 IgG1(5T4) 포맷과 함께 Tb535H의 써모플루오르 검정에 의한 용융 곡선의 비교. 놀랍게도, Tb535H는 IgG 및 scFv-융합(BiTE)보다 더욱 안정하다.
도 6B 37℃에서 72시간 배양 후의 Tb535의 안정성
A: Tb535H 및 Tb535C 형태를 PBS에서 72시간 동안 37℃에서 배양하고, 배양 전후에 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석했다. 어떠한 다량체 형성도 배양 후에 관찰되지 않는다.
B: Tb535H 및 Tb535C 형태를 인간 혈청 중에서 72시간 동안 37℃에서 배양하고, 이어서 세포 사멸 검정(인간 PBMC E:T 5:1을 사용한 MSTO-211H 5T4-양성 중피종 세포주, 48h 검정)에서 활성 적정에 의해 분석했다. 활성의 어떠한 차이도 배양 후에 확인되지 않았다.
도 7 본 발명의 융합 단백질(Fab-(scFv)2과 BiTE(scFv-scFv) 포맷의 비교.
A:양 융합 단백질 포맷을 사용한 단량체 및 이량체의 전형적 형성. BiTE 포맷은 형성된 이량체의 비율이 보다 높은 경향이 있다.
B: 본 발명의 융합 단백질 포맷을 100%로 설정하고 동일한 서열을 갖는 BiTE 포맷과 비교한 몰 비교의 상대적 수율. 본 발명의 융합 단백질의 포맷은 전형적으로 보다 높은 생산 수율을 갖는다.
C: 동일한 서열에 기반한 BiTE 포맷과 융합 단백질(Tb535H-1120)의 정제 후의 생산 수율의 비교.
D: BiTE 포맷과 융합 단백질 포맷의 활성 적정의 비교(혼합된 배양물에서 인간 PBMC에 의한 5T4-양성 종양 세포의 사멸 유도)는 동일한 범위의 EC50 값을 나타내지만, 종양 세포의 보다 높은 비율은 본 발명 형태 T-세포 결합제의 융합 단백질 포맷을 사용하여 사멸된다.
도 8 Tb535C 및 Tb535H의 결합 및 활성의 비교
A: 5T4 항원의 재조합 세포외 도메인 상의 ELISA 결합.
B: 인간 T-세포주(Jurkat) 상의 ELISA 결합.
C: MSTO-211H 5T4-양성 중피종 종양 세포의 혼합 배양물에서 세포독성 적정.
D: Tb535C 및 Tb535H의 결합 및 활성을 비교하는 테이블.
도 9 Tb535H는 상이한 종양 유형의 범위에서 활성적이다.
A: 상이한 형태의 중피종, 트리플 음성 유방암 및 KRAS-돌연변이된 대장암의 대표 세포주를 사용하여 Tb535의 활성 적정(혼합 배양물에서 인간 PBMC에 의한 5T4-양성 종양 세포의 사멸 유도). 피코몰 농도의 EC50 값이 제공된다.
B: 세포 사멸 검정으로 수득된 EC50 값과 함께 FACS-장식에 의해 측정된, 5T4 막 발현 수준의 비교.
도 10
A: 마우스 C57BL/6에서 주사후에 평형 및 제거 상의 반감기 평가. 혈액은 희생된 동물로부터 회수하고, 기능적 Tb535의 농도는 세포독성 유도 활성 검정을 사용하여 측정했다. 평가는 대용적의 분포 및 느린 정화를 시사한다.
B: Tb535의 열화는 전혈 단백질을 항-FLAG tag 웨스턴 블롯 분석으로 프로빙함으로써 관찰할 수 없다.
도 11A 인간 PBMC로 재구성된 중피종 이종이식 NOD/SCID 마우스에서 Tb535의 유효성
A: 피하 성장하는 중피종 종양의 그림.
B: 다양한 농도의 Tb535H에서 1:1의 효과기:표적 비율에서 종양 성장의 피하 모델 및 진화.
C: 다양한 농도의 Tb535H에서 2:1의 효과기:표적 비율에서 종양 성장의 피하 모델 및 진화.
D:중피종 세포주에서 중피종 종양 성장 동소의 사진.
E: NOD/SCID 마우스에서 동소 유도된 중피종에서, 인간 PBMC로 재구성한 마우스 및 Tb535H에 의한 처치는 종양의 형성 및 사망을 완전히 방지한다(인간 종점 희생).
도 11B 지시된 일수에서 10E7 인간 PBMC 및 Tb535의 IP 주사후 확립된 피하 종양의 치료. 종양 용적은 칼리퍼를 사용하여 측정했다.
도 12A 종양 세포와 PBMC와의 혼합 배양물에서 Tb535H에 의한 TH1 사이토카인의 유도. 특히 IL-2, 인터페론-감마 및 TNF-알파는 상향조절된다.
양성 대조군은 OKT3-IgG이다(무로모맵-CD3) (+) 및 무첨가 (-)).
도 12B 1mM(밀리몰)의 Tb535H 농도까지 3개 인간 공여자로부터 PBMC와 함께 Tb535H 배양의 사이토카인 유도의 부재.
양성 대조군은 OKT3-IgG이다(무로모맵-CD3) (+) 및 무첨가 (-)).
도 12C 1mM(밀리몰) 농도까지 5T4-양성 종양 세포의 부재하에 PBMC에 대한 T-세포 활성화 마커 유도(CD69 및 CD25)의 부재(개방 심볼). 폐쇄 심볼은 활성화 마커가 10000배 낮은 농도에서 개시하여 유도되는 혼합 종양 세포/PBMC 공생배양의 대조군이다.
도 13 인간 PBMC에서 주요 효과기 세포의 분석. 완전 PBMC는 정제된 CD4-양성 T-세포 분획, CD8-양성 T-세포 분획, 양자의 조합 및 CD56-양성 NK 세포 분획과 비교했다.
도 14A TB535는 화학적으로 정련된 배지 및 공급물을 사용하여 공급 배치식 생물반응기 프로세스로 최대 1g/L에서 안정한 CHO 클론으로부터 생산한다.
도 14B 포획(A), 정제(B) 및 연마(C) 단계를 사용하여 소비된 배지로부터 Tb535의 단리. 쿠마시에 브릴리언트 블루로 염색한 겔 여과 분석(D) 및 SDS-PAGE.
하기 실시예는 본 발명의 양식을 설명하기 위해 포함되었다. 하기 실시예의 특정 양태는 본 발명의 실시에서 충분히 기능하도록 본 공동-발명자에 의해 발견되거나 의도된 기술 및 과정과 관련하여 기재되어 있다. 이들 실시예는 공동-발명자들의 표준 실험실 실시를 나타낸다. 본 발명의 개시 및 당업자의 일반적 수준에 비추어, 당업자는 하기 실시예가 예시만을 의도하고 있음을 이해할 것이다.
실시예 1 발현
HEK 293 세포에서 일시적 발현
서열-검증된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 플라스미드의 클론을 제조업자의 프로토콜에 따라 FreeStyle-293 발현 시스템(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)에서 형질감염 및 단백질 발현에 사용했다. 발현된 단백질을 함유하는 상청액을 수득하고, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 -20℃에서 저장했다. scFv 분자에 대한 VH-VL 또는 VL-VH 조합의 위치(예: 도 1B: i-iii) 및/또는 사용(예: 도 1B iv-vi), 또는 Fab 중의 교차된 V-도메인의 사용(예: 도 1C vii-xii) 또는 도메인 결합제와의 조합(예: 도 1D xiii-xviii)에 따라 5T4 및 CD3 결합제의 상이한 과돌연변이를 유전자 수준에서 작제하고, 다른 특징 중에서 CMV 프로모터 및 Kozak 번역 개시 부위를 조합한 pES33 벡터에 클로닝시켰다. 모든 작제물을 HIS-tag(HHHHHH)로 C-말단에서 및 FLAG-tag(DYKDDDDK)로 N-말단에서 융합시켰다. 소비된 배지를 IMAC 포획의 TCA 침전, 이어서 항-HIS 항체, 항-FLAG 항체, 항-인간 Fab 또는 항-인간 카파 혈??으로 프로빙된 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 후에 분석했다. 단백질은 엄격한 단량체성 분획의 단리를 보장하기 위해 IMAC 포획, 이온 교환 정제 및 겔 여과 상의 연마 단계를 사용하여 정제했다.
다양한 형태의 5T4×CD3 이중특이적 항체를 트리바디(즉 Fab-(scFv)2) 또는 BiTE(즉 scFv-scFv) 포맷으로 비교하고, 생산된 단량체 단백질의 상대 수율 및 상대 분획을 스코어링했다. 트리바디 형태는 일반적으로 보다 많은 이중특이적 단백질 및 보다 높은 분획의 단량체 단백질을 제공하는 것으로 밝혀졌다(도 7A, 7B 및 7C 참조).
CHO 세포에서 안정한 발현
서열-검증된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 플라스미드의 클론을 작제물의 진핵생물 발현을 위해 DHFR 결핍 CHO 세포에 형질감염시켰다. DHFR 결핍 CHO 세포에서 진핵생물 단백질 발현은 문헌[참조: Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566]에 기재된 바와 같이 수행했다. 작제물의 유전자 증폭은 메토트렉세이트(MTX)의 농도를 20nM MTX의 최종 농도까지 증가시킴으로써 유도했다. 정치 배양의 2회 계대 후, 세포를 수거 전에 7일 동안 뉴클레오사이드-비함유 HyQ PF CHO 액체 대두 배지(0.1% 플루로닉 F-68과 함께 4.0mM L-글루타민 함유; HyClone)로 롤러 병에서 성장시켰다. 세포는 원심분리에 의해 제거하고, 발현된 단백질을 함유하는 상청액을 -20℃에서 저장했다.
안정한 TB535 발현 세포주는 혈청/동물 성분 비함유 현탁 적응 CHO 세포를 사용하여 생성한다. 트리바디의 Fd 및 L 유전자를 벡터에 클로닝시키고, CHO 세포에 동시-형질감염시킨다. 플라스미드는 고도의 발현을 생성하는 요소와 함께 선택가능한 마커를 함유한다. 발현 풀로부터, 제한 희석 클로닝을 수행하여 최고 수율의 가장 안정한 클론을 선택한다. TB535는 화학적으로 정련된 배지 및 공급물을 사용하여 공급 배치식 생물반응기 프로세스로 최대 1g/L에서 안정한 클론으로부터 생성한다. 도 14A는 통상의 TB535 생물반응기 프로세스를 위한 세포 성장 및 TB535 역가를 나타낸다.
생물반응기는 심층 여과에 의한 세포 제거로 수거한다. TB535를 회수하고, 크로마토그래피 단계, 예를 들면, 친화성, 이온 교환 및 크기 배제(도 14B), 이어서 저장을 위한 제형 완충제로의 최종 농축/투석여과의 조합을 사용하여 정화 소비된 배지 상으로부터 정제한다. 이러한 정제 프로세스는 정제된 안정하게 제형화된 TB535 트리바디 약 400mg/L를 제공한다. 도 14B-D/E에 설명된 바와 같이, 분석적 크기 배제 및 비-환원 SDS PAGE를 포함하는 다수의 분석 방법에 의해 측정된 바와 같이, 이러한 프로세스로 생산된 TB535는 >98%의 순도이다.
안정한 인간 5T4의 재조합 형태의 발현
인간 5T4의 코딩 서열(GenBank, 수탁 번호 NM_006670)는 5T4의 세포외 도메인만을 포함하는 인간 5T4의 가용성 단백질을 코딩하는 인공 cDNA 서열의 작제에 사용했다.
인간 알부민과의 융합을 위해, 변형된 cDNA 단편은 먼저 작제물의 진핵생물 발현을 위한 Kozak 부위, 이어서 시그날 펩티드 및 세포외 도메인에 상응하는 아미노산 1 내지 355를 포함하는 인간 5T4 단백질의 코딩 서열, 이어서 프레임 내에서 Flag tag의 코딩 서열, 이어서 프레임 내에서 변형된 히스티딘 tag(SGHHHHHH)의 코딩 서열 및 정지 코돈을 함유하도록 설계했다.
상술한 공정은 모두 표준 프로토콜에 따라 수행했다[참조: Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)].
실시예 2 인간화
키메라 및 인간화된 항-5T4 항체는 뮤린 H8 항체 및 인간 항체 서열로부터 유래하는 서열을 사용하여 제조했다. 본 발명의 대표적 항체의 일부 서열은 도 2에 제시되어 있다.
뮤린 H8 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열(예: 서열번호 16 또는 서열번호 17과 조합된 서열번호 01 또는 서열번호 02) 및 인간 불변 영역 서열 CH1 및 CL-kappa를 갖는 키메라 H8 항체를 작제했다. 키메라 및 인간화된 H8 항체를 제조하기 위해 사용된 대표적 인간 불변 영역은 인간 IgG1, 인간 kappa 및 인간 IgG4의 것들을 포함한다. IgG 불변 영역을 코딩하는 서열의 클로닝을 위해, 인트론 서열은 임의로 결실될 수 있다. 하나의 항체 쇄가 뮤린 H8 가변 영역(키메라 항체와 같이)을 포함하고 다른 항체 쇄가 인간화된 H8 가변 영역, 즉 반-인간화된 항체를 포함하는 항체가 또한 제조되었다.
인간화된 H8 가변 영역은 인간 또는 실질적으로 인간 프레임워크 영역으로 이식된 뮤린 H8의 CDR을 포함하도록 작제했다. 큐린 H8 항체의 CDR은 AbM 정의를 사용하여 동정했고, 이는 구조적 루프 영역의 위치 뿐만 아니라 서열 가변성에 기반한다. 인간 수용체 프레임워크는, 이들이 뮤린 H8 항체의 프레임워크 영역과 실질적으로 유사하거나, 가변 영역 서브패밀리의 컨센서스 서열과 가장 유사한 기준으로 선택했다(도 2 참조). 광범위하게 나타낸 서열이 보다 적은 모집단 서열보다 바람직하도록, 인간에서 프레임워크 좌의 표현을 또한 고려했다. 예를 들면, 항원 접촉에 관여하는 것으로 생각되는 뮤린 잔기 및/또는 항원-결합 부위의 구조적 통합에 관여하는 잔기를 복원하기 위해 인간 프레임워크 수용체 서열의 추가의 돌연변이를 수행했다. 아미노산 서열은 또한 CHO 세포의 코돈 선택을 위해 및 제한 효소 부위를 제거하기 위해 최적화시켰다. 펩티드 구조 예측 프로그램을 사용하여, 인간화 설계에 의해 도입된 번역후 단백질 변형 부위를 동정 및 회피하는 인간화된 가변 중쇄 및 경쇄 영역 서열을 분석했다. 이러한 전략을 사용하여, 인간화된 H8 가변 영역의 3개 버젼을 작제했다. 버젼 1은 항체 통합 및 항원 결합에 중요한 것으로 생각되는 프레임워크 서열 내의 위치에 뮤린 H8 잔기를 보유한다. 버젼 2는 CDR 내에만 뮤린 잔기를 보유한다. 버젼 3은, 컨센서스 가변 영역 서열이 중쇄 수용체 프레임워크로서 사용되는 것을 제외하고는 버젼 2와 유사하다. 버젼 3 항체의 경쇄 가변 영역은 버젼 2 항체의 것과 동일하다.
인간화된 H8 경쇄 가변 영역의 작제를 위해, DPK24 생식세포계 서열 VL-IV/유전자좌 B3을 수용체 프레임워크로서 사용했다. DPK24 서열은 뮤린 H8 경쇄 가변 영역과 68% 동일하고, 뮤린 H8 경쇄 프레임워크 서열과 비교하는 경우, 18개 아미노산 치환을 함유한다.
인간화된 항체는 또한 생식세포 클론 아그룹 VκIII 및 VκI의 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역을 사용하여 작제했다. 특히, 경쇄 VκIII 아그룹 프레임워크 영역 및 개시된 인간화된 H8 항체 버젼 1을 포함하는 항체는 둘 다 고도로 발현되고 안정하다.
인간화된 H8 중쇄 가변 영역의 작제를 위해, DP75 생식세포계 서열 VH-I/유전자좌 1-02를 수용체 서열로서 사용했다. DP75 서열은 뮤린 H8 중쇄 가변 영역과 65% 동일하고, 뮤린 H8 중쇄 프레임워크 서열과 비교하는 경우, 28개 아미노산 치환을 함유한다. 인간화된 H8 중쇄 가변 영역 버젼 1은 중쇄 및 경쇄 가변 영역과의 항원 접촉에 중요한 뮤린 H8 잔기 K38 및 S40, 뿐만 아니라 가변 영역 및 CDR2와의 항원 접촉에 중요한 I48을 유지했다. 대안적으로, 인간화된 H8 중쇄는 중쇄 가변 영역 아그룹 컨센서스 서열을 사용하여 제조했다. 컨센서스 서열은, 뮤린 H8 중쇄 프레임워크 서열과 비교하는 경우, 25개 아미노산 치환을 함유한다.
인간화된 H8 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 중첩 올리고뉴클레오티드를 함께 어닐링시키고 이들을 인간 항체 불변 영역을 함유하는 pUC57 클로닝 벡터에 결찰시킴으로써 작제했다. 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 또한 PCR 돌연변이유발 또는 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여 작제할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 설계는 CHO 세포 발현을 위한 코돈 사용의 최적화 및 제한 효소 부위의 제거를 포함했다.
추가의 최적화는 VH CDR1, VH CDR2, VL CDR1 또는 VL CDR2를 가장 근접한 상동성 생식세포 서열로 치환시킴으로써 수행했다. 변이체는 수율 및 결합 활성에 따라 랭킹화했다. VH 및 CDR1 치환은, EP0703926에 기재된 바와 같이 scFv에서 안정화 디설파이드 결합을 효과적으로 형성한 분자의 수의 예상치 않은 증강을 가졌기 때문에, 특히 흥미롭다(도 4A 및 도 4B-A, B 및 C 참조).
도 5는 마우스 기반 항체와 함께 인간화된 형태의 예상된 거동 및 비교능을 나타내는 겔 여과, MALDI-TOFF 및 분석적 이온 교환에 기반한 분석을 나타낸다(도 5B, C, D). 분석적 겔 여과는 또한 Tb535C(키메라: 마우스 V-도메인 함유)와 비교하여 약간 보다 압축 형태의 Tb535H(인간화됨)를 나타낸다.
도 8은 CD3 뿐만 아니라 5T4에 대한 비교가능한 결합, 및 뮤린 가변 도메인(서열번호 02 및 서열번호 17)에 기반한 트리바디와 비교하여 Tb535H(서열번호 06 및 서열번호 19에 기반)의 비교가능한 활성을 나타낸다.
실시예 3 결합 검정
FACS 분석: 장식, 적정, PBMC 결합
시험하는 세포(종양 세포주, PBMC)를 수집하고(1×106 세포/샘플), PBS에서 세척하고, 아이스 상에서 1시간 동안 PBS/10% FBS 중의 1㎍의 결합 분자(예: 항체/트리바디)와 함께 배양했다. 종양 세포주에 의한 5T4 발현의 특성화를 위해, 상업적 항-5T4 항체를 사용했다(Cat-No: MAB49751, R&D Systems).
인간 5T4 도메인에 대한 항-5T4 분자(scFv, Fab 및 트리바디 포맷)의 결합을 평가하기 위해, 이상 중피종 세포주 MSTO-211H(ATCC CRL-2081)는 이노바 바이오사이언시스(Innova Biosciences)사의 라이트닝-링크(Lightning-Link®) APC 키트에 의해 알로피코시아닌(APC)과 함께 직접 표지된 분자를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 FACS 결합 검정에 의해 시험했다. 평형 해리 상수(KD)의 결정을 위해, Tb535 농도는 0.05 내지 500nM 범위였다.
이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 세포 표면에 대한 결합은 BD FACsalibur 장치를 사용하여 유세포 분석에 의해 평가한다.
유르카트 세포-기반 ELISA
인간 CD3 도메인에 대한 구조의 결합을 평가하기 위해, 세포 기반 ELISA T-세포 림프종(CD3+) 세포주를 사용했다. 유르카트 세포를 수집하고, 세척하고, 환저 ELISA 플레이트의 각 웰에 등분시켰다. 트리바디 및 단일 쇄 희석물을 PBS에서 제조하고, 세포에 첨가했다. 세척 단계 후, 검출 항체를 샘플(알칼리 포스파타제 접합된 모노클로날 항-FLAG, Cat-No: A9469, Sigma)에 첨가한다. 2차 항체는 p-NPP(Cat-No: N7653, Sigma)의 첨가시 비색 반응의 발달에 의해 검출하고, 흡광도는 마이크로-웰 플레이트 판독기 상에서 정량하고, 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀에 의해 처리했다.
세포-기반 또는 단백질 기반 ELISA는 표준 프로토콜[참조: Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)]에 따라 수행했다.
인간 CD3 도메인에 대한 친화성의 경우, T-세포 림프종(CD3+) 세포주(Jurkat)로 세포 기반 ELISA를 사용했다. 유르카트 세포를 수집하고, 세척하고, 환저 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 등분시켰다. 트리바디/샘플 희석물을 PBS에서 제조하고, 세포에 첨가하고, 배양했다. 세척 단계 후, 검출 항체를 샘플(항-인간 Kappa 경쇄 AP; 예를 들면, Sigma, Cat. No. K4377)에 첨가했다. 결합된 검출 항체는 p-NPP(Cat-No: N7653, Sigma)의 첨가시 비색 반응의 발달에 의해 측정하고, 흡광도는 마이크로-웰 판독기로 정량하고, 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀에 의해 처리했다.
5T4 표적 항원에 대한 친화성의 경우, 5T4 항원으로 ELISA를 사용한다. 사내에서 생산한 표적 항원, 5T4 세포외 도메인을 폴리스티렌 평저 96 웰 마이크로플레이트에 코팅하고, 차단시킨다. 트리바디/샘플 희석물을 0.2% w/v 분유와 함께 TBS에서 제조하고, 플레이트에 첨가하고, 배양했다. 세척 단계 후, 검출 항체를 샘플(항-인간 Kappa 경쇄 AP; 예를 들면, Sigma, Cat. No. K4377)에 첨가한다. 결합된 검출 항체는 p-NPP(Cat-No: N7653, Sigma)의 첨가시 비색 반응의 발달에 의해 측정하고, 흡광도는 마이크로-웰 플레이트 판독기로 정량하고, 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀에 의해 처리했다.
5T4 재조합 단백질에 결합하는 다양한 포맷의 친화성
KD (5T4-ECD에 대한 ELISA)
dsFv 2,3 nM
BiTE 2 nM
Fab 2,9 nM
Tb535H 0,9 nM
Tb535C 1 nM
IgG 0,7 nM
표 1에 제시된 바와 같이, 이가 결합 Tb535는 비교가능한 BiTEs(scFv-scFv 포맷) 등의 1가 포맷과 비교하여 2 내지 3배 높은 친화성을 갖는다. 트리바디 포맷을 사용하여 IgG 포맷에 근접한 5T4에 대한 친화성을 수득한다(도 3A, B 및 C 참조). 도 3C 및 D는 scFv 및 Fab 등의 1가 형태와 비교하여 트리바디의 결합에서 명확한 이점을 나타낸다.
Tb535 구성에서 항-CD3 결합은 상이한 공여자의 PBMC 뿐만 아니라 유르카트 세포에 대한 결합에 의해 입증된 바와 같이 유효 상태로 잔류한다(도 3F).
실시예 4 활성 검정
표적 세포 표지화
유세포 분석 검정에서 세포 용해의 분석을 위해, 형광 막 염료 DiOCi8(DiO) (분자 프로브 Cat-No: V22886)을 사용하여 인간 또는 마카크 5T4-형질감염된 CHO 세포 또는 5T4-발현 인간 세포를 표적 세포로서 표지하고, 이들을 효과기 세포와 구별했다. 요약하면, 세포를 수거하고, PBS로 1회 세척하고, 2%(v/v) FBS 및 막 염료 DiO(5㎕/106 세포)를 함유하는 PBS에서 106 세포/mL로 조정했다. 3분 동안 37℃에서 배양한 후, 세포를 완전한 RPMI 배지에서 2회 세척하고, 세포 수를 1.25 × 105 세포/mL로 조정했다. 세포의 활력은 0.5%(v/v) 등장성 에오신G 용액(Roth Cat-No: 45380)을 사용하여 측정했다.
인간 PBMC를 사용한 FACS-기반 세포독성 검정
인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)는 농축된 림프구 제제(버피 코트), 수혈용 혈액을 수집하는 혈액 은행의 부산물로부터 리콜 밀도 구배 원심분리에 의해 제조했다. 버피 코트는 지방 혈액 은행에 의해 공급되었고, PBMC는 혈액 수집과 같은 날에 제조했다. 피콜 밀도 원심분리 및 둘베코 PBS(Gibco)를 사용한 충분한 세척 후, 잔류하는 적혈구는 적혈구 용해 완충제(155mM NH4CI, 10 mM KHC03, 100 mM EDTA)와의 배양에 의해 PBMC로부터 제거했다. 혈소판은 100×g으로 PBMC의 원심분리시 상청액을 통해 제거했다. 잔류하는 림프구는 주로 B 및 T 림프구, NK 세포 및 단핵구를 포함한다. PBMC는 10% FCS(Gibco)를 갖는 RPMI 배지(Gibco)에서 37℃/5% CO2에서 배양물에 유지했다.
트리바디의 생물활성은 상이한 종양 세포주를 사용하여 FACS-기반 시험관내 세포독성 검정에 의해 분석했다: 표적 세포로서 MDA-MB468(ATCC HTB-132), MSTO-211H(ATCC CRL-2081), NCI-H2052(ATCC　CRL-5915), NCI-H2452(ATCC　CRL-5946), NCI-H28(ATCC　CRL-5820), MDA-MB231(ATCC　HTB-26), HS-578T(ATCC　HTB-126), BT-549(ATCC　HTB-122), SW-620(ATCC　CCL-227), HCT-116(ATCC　CCL-247), HCT-15(ATCC　CCL-225). 인간 PBMC는 CD3/CD28/IL-2 자극 후에 효과기 세포로서 사용했다. 자극을 위해 T-플레이크(75cm3)를 37℃에서 2시간 동안 7.5ml PBS 1×에서 5㎍/ml αCD3(ImmunoTools Cat-No: 21620030)로 코팅했다. 플라스크를 PBS로 세정한 다음, 전체 PBMC를 10% FBS(PAA Cat-No: A15-151), 5㎍/ml αCD28(ImmunoTools Cat-No: 21330280) 및 30U/mL의 인간 재조합 IL-2(ImmunoTools Cat-No: 11340023)가 보충된 RPMI-1640(Sigma Cat-No: R8758)에서 첨가했다. 37℃ 및 5% CO2에서 3일 자극 후, PBMC를 코팅되지 않은 T-플라스크로 옮기고, 내재화된 T 세포 수용체를 세포 표면으로 재-전달되도록 하기 위해 추가로 24시간 동안 10% FBS 및 30U/ml의 IL-2와 함께 RPMI-1640에서 배양했다. 표적 세포를 제조업자의 지시에 따라 PKH67 염료(Sigma Cat-No: MINI67-1KT)로 표지하고, 세포 부착을 위해 밤새 배양했다. 인간 PBMC(Tebu Cat-No: 192PMBC)를 5:1의 효과기:표적 비율로 첨가하고, 트리바디를 이중으로 1000 내지 0.001ng/ml의 농도 범위로 제조했다. 표적, 효과기 세포 및 트리바디를 48시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다. 배양 후, 세포를 수거하고, 트리바디를 갖지 않는 세포를 제외하고는, 프로피디움 요오다이드(Sigma Cat-No: P4864)를 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. 특이적 세포독성은 사멸 세포(PI+)와 비교하여 순수한 살아있는 표적 세포(PKH67+ 세포)의 함수로서 측정했다.
세포는 BD FACsaliber 장치를 사용하고 세포 탐구 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석에 의해 평가했다. 표적 세포의 절반-최대 용해가 발생(EC50)하는 평가된 트리바디 농도의 측정을 위해, 특이적 세포독성 값을 트리바디 농도에 대해 플로팅하고, 그래프-패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀에 의해 처리했다.
Tb535 5T4×CD3 트리바디의 활성은 몇몇 암성 징후(예: 도 9A 및 B)를 나타내는 일련의 세포주에서 측정된 낮은-피코몰 범위에 항상 존재했다.
놀랍게도, 5T4×CD3 트리바디는, 포화 결합 조건하에 시험관내에서 측정하는 경우에도(도 7D 참조), BiTE scFv-scFv 형태와 비교하여 보다 높은 비율의 세포 사멸을 나타냈다.
T-세포 활성화 마커의 검출
PBMC 건강한 공여자(Tebu-Bio)를 이중으로 표적 MSTO-211H 세포의 존재 및 부재하에 TB535H와 함께 배양했다. PBMC를 해동시키고, 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 RPMI에서 배양했다. MSTO-211H 세포를 24-웰 플레이트에서 8×104 세포/웰로 파종하고, 세포 부착을 위해 밤새 배양했다. PBMC를 소정 범위의 트리바디 농도로 10:1(비-활성화됨)의 효과기:표적에서 첨가했다.
MSTO-211H 세포주의 존재 및 부재하에 hPBMC 및 트리바디의 24시간 배양 후, PBMC(공급자: Tebu-Bio)를 원심분리(300×g, 5분, 실온)에 의해 수거하고, 1㎍ 항체/백만 세포의 농도에서 APC-표지된 항-CD69(Immunotools Cat-No: 21270564) 및 FITC 접합된 항-CD3(Immunotools Cat-No: 21620033)로 염색했다. CD25의 측정을 위해, 또 다른 T-세포 활성화 마커, 세포를 48시간 배양 후에 수거하고, APC-항-CD25(Immunotools Cat-No: 21270256) 및 FTIC 항-CD3으로 염색했다. 항체를 암 상태에서 1시간 동안 4℃로 배양했다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, 결과를 FACSCalibur 장치에서 유세포 분석에 의해 평가했다.
도 12C는 PBMC와 함께 종양 세포의 생체외 공생배양이 Tb535 농도 의존성 T-세포 활성화 마커 발현을 유도하고, 이것이 1μM 이하의 농도에서도 표적 세포의 부재하에 존재하지 않음을 나타낸다.
CD4+, CD8+ 및 NK 아집단에 의한 세포독성 검정
상업적으로 이용가능한 CD4+, CD8+ 및 CD56+ 농축 세포는 CD4+ T-헬퍼 세포, CD8+ 효과기 T-세포 및 NK 세포의 세포독성 활성을 평가하기 위해 구입했다(공급자: Tebu-bio).
Tb535H의 생물활성은 효과기 세포의 제제로 변경하여 FACS-기반 시험관내 세포독성 검정에 의해 평가했다. PBMC와 동일하게, 이들 세포 모집단을 또한 해동시키고, 세포독성 검정에 사용하기 전에 밤새 배양했다. 그러나, 10:1의 고정된 E:T 비율을 사용하는 대신에, PBMC에 대해서는, 효과기 세포의 양을 각 세포 아집단에 적합시켰다. 전형적으로, CD4+ T-헬퍼 세포, CD8+ 효과기 T-세포 및 NK 세포는 PBMC의 전체 모집단의 50%, 25% 및 10%를 나타낸다. 이러한 가정과 함께, 이러한 세포독성 검정에 사용된 E:T 비율은 CD4+ T-헬퍼의 경우에 5:1, CD8+ 효과기 T-세포의 경우에 2.5:1 및 NK 세포의 경우에 1:1이었다. 대조군으로서 이 검정은 또한 10:1의 E:T에서 PBMC의 전체 모집단으로 수행했다. 추가로, CD4+ 및 CD8+ 세포의 혼합도 시험했다.
이들 세포 모집단의 세포독성 활성은 100.000 pM에서 Tb535의 배양으로 측정했다. 특이적 세포독성은 사멸 세포(PI+)와 비교하여 순수한 살아있는 표적 세포(PKH67+ 세포)의 함수로서 측정했다.
도 13에서 입증된 바와 같이, CD8+ T 세포는 주요 효과기 세포이고, 유효성은 CD4+ 세포의 포함에 의해 증강되었다. NK 세포는 Tb535에 의해 표적 세포를 사멸시키는 것을 자극하지 않는다.
실시예 5 안정성
써모플루오르 분석
scFv-PO3 및 scFv-SP34 샘플을 0.1 mg/ml의 최종 농도까지 PBS pH 7.4로 희석시켰다. 5㎕의 200x 희석된 시프로 레드(Sypro Red) 겔 염색(Cat-No: S-6653, Invitrogen)을 55㎕의 희석 샘플에 첨가했다. 20㎕의 각 제조된 샘플을 모세관에 부하하고, 5초 동안 700g에서 원심분리한다. 검출을 위해, 써모사이클러(Roche Lightcycler 1.5)를 640nm로 설정하고, 10초 동안 37℃에서 제1 단계로 프로그래밍하고, 이어서 연속 데이터 획득으로 초당 0.5℃로 95℃까지 세정했다.
분석적 크기 배제(겔 여과).
트리바디를 정량화하고 순도, 단량체 대 고분자량 가용성 응집된 형태, 예를 들면, 이량체, 삼량체 등, 및 보다 소분자량 단편화된 형태, 예를 들면, 유리 경쇄의 비율을 측정하기 위한 분석은, 280nm에서 UV에 의한 검출과 함께 Ultimate 3000 HPLC(Dionex) 상의 인산나트륨/NaCl pH 7.0으로 1ml min-1에서 Bio SEC-5, 5um, 300A, 7.8×300mm, 컬럼(Agilent) 상에서 수행했다. 정량화는 정제된 표준을 사용하여 생성된 교정 곡선에 대해 AUC를 사용하여 수행한다.
트리바디 포맷-및, 특히 디설파이드를 함유하는 경우, 안정화된 단일 쇄-는 비교가능한 scFv-scFv(BiTE) 형태 및 놀랍게는 동일한 V 도메인 서열을 함유하는 IgG 형태와 비교하는 경우보다도 더욱 안정한 것으로 밝혀졌다(도 6A-D).
Tb535의 현저한 안정성은 37℃에서 3일 동안 PBS 또는 인간 혈청에서 배양에 의해 추가로 설명된다. 단량체 가용성 분획의 변화가 없고(도 6B-A) 및 활성의 손실도 없다(도 6B-B).
실시예 6 분석
하전된 동종의 비율을 특성화하고 측정하기 위한 분석적 양이온 교환 분석은 280nm에서 UV에 의한 검출과 함께 Ultimate 3000 HPLC(Dionex) 상에서 염 구배 용출을 사용하여 0.5ml min-1에서 MabPac SCX-10 3㎛, 4×50mm, 컬럼(Thermofisher) 상에서 수행했다.
등전점 전기영동은 BIO-RAD Power Pac HV과 함께 XCell Surelock 미니-세포(Invitrogen)에서 작동하는 IEF 3-10 프리캐스트 겔(Serva)을 사용하는 비-평형 pH 겔 전기영동을 사용하여 수행했다.
SDS PAGE는 BIO-RAD Power Pac HV, MOP 완충제와 함께 XCell Surelock™ 미니-세포(Invitrogen)에서 작동하는 NuPAGE Novex 비스-트리스 4-12% 겔(Invitrogen) 상에서 수행하고, SimplyBlue™ SafeStain(Invitrogen)으로 염색했다. 분석을 위해, 샘플을 부하 완충제, NuPAGE LDS(Invitrogen)으로 희석시키고, SDS PAGE를 환원시키기 위해 DTT로 추가로 환원시켰다.
웨스턴 블롯을 위해, 샘플을, BIO-RAD Power Pac HV, MOPs 완충제와 함께 XCell Surelock 미니-세포(Invitrogen)에서 작동하는 비-환원 SDS PAGE, NuPAGE Novex 비스-트리스 4-12% 겔(Invitrogen)에 의해 먼저 분리하고, PVDF 막으로 옮기고, 항-인간 Kappa 경쇄 AP; 예를 들면, Sigma, Cat. No. K4377을 사용하여 검출했다. 결합된 검출 항체는 AP 접합체 키트, Cat. No. 170-6432, Biorad를 사용하여 발달시켰다.
실시예 7 마우스 모델에서 약물동태 및 약력학
세포독성 검정에 의한 반감기의 측정
30마리 마우스(FOXP3-GFP; 혼합 성별; 시점당 2마리 수컷 및 1마리 암컷)에게 10mg/kg의 Tb535를 주사하고, 상이한 시점: 주사후 5분 및 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 및 16시간에서 3마리 마우스 그룹에서 희생시켰다. 혈청 샘플 중의 Tb535H의 생물활성은 상기 기재된 바와 같이 FACS-기반 시험관내 세포독성 검정에 의해 평가했다. 요약하면, 표적 세포(MSTO-211H)를 제조업자의 지시에 따라 PKH67 염료(Sigma-Aldrich)로 표지하고, 세포 부착을 위해 밤새 배양했다. 상업적 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 CD3/CD28/IL2로 활성화시키고, 5:1의 효과기 대 표적 비율로 효과기로서 사용했다. 각각의 혈청 샘플에 대해 2 내지 3개 희석물을 제조하고, 표적 세포에 첨가하고, 72시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다. 대조군으로서, 공지된 농도의 Tb535H 샘플을 또한 포함시켜, 트리바디 농도를 이러한 특이적 PBMC 공여자에 대한 세포독성과 상관시키는 교정 곡선을 확립했다. 배양 후, 세포를 수거하고, 특이적 세포독성은 BD FACSCalibur 장치를 사용하고 세포 탐색 소프트웨어를 사용하는 유세포 분석에 의해 평가된 바와 같이 사멸 세포(PI+)와 비교하여 순수한 살아있는 표적 세포(PKH67+ 세포)의 함수로서 측정했다. 이러한 방법에 의해 평가된 Tb535H 농도 및 반감기의 측정을 위해, 특이적 세포독성 값을 시간에 대해 플로팅하고, α 및 β 상을 고려하여 선형 회귀에 의해 처리했다.
도 10은 대용적의 분포 및 상대적으로 느린 정화를 나타내는 반감기 측정의 예를 나타낸다.
유효성의 측정: 조기 치료
초기 종양 모델에 대한 트리바디(10; 1; 0.1; 0.01mg/kg)의 유효성을 시험하기 위해, NOD/SCID 마우스에게 2.5×106 또는 5×106 인간 PBMC와 혼합된 2.5×106 중피종 종양 세포를 피하 주사했다. 트리바디는 종양 주사후 0, 2, 4, 7, 9 및 11일에서 정맥내 제공했다. 종양 성장은 칼리퍼로 측정했다.
동소성 중피종 모델을 모방하기 위해, 2.5×106 중피종 종양 세포를 흉골내 주사했다. 동물은 지방 윤리 위원회에 의해 승인된 인간 종점을 측정하기 위해 호흡 곤란 및 >20% 체중 감량에 대해 정기적으로 검사했다.
도 11A-ABC는 인간 PBMC로 재구성된 피하 이종이식된 NOD/SCID 마우스의 치료에서 Tb535의 유효성을 나타내고, 도 11A-D 및 E는 동소성(흉골내 주사) 중피종 종양 모델에서 활성을 설명한다.
유효성의 측정: 후기 치료
확립된 종양의 치료는 NSG 마우스(NOD-scid IL2Rgamma<null>, The Jackson Laboratory)에서 이종이식 연구를 사용하여 입증하고, 5×106 암 세포의 피하 이식 7일 후, 마우스에게 IP에 의해 6일마다 10×106 활성화된 PBMC를 3회 주사했다. 모든 연구를 위해, 초기 PBMC 주입 2일 후, 마우스에게 격일로 7일 용량의 Tb535 또는 식염수로 정맥내 처리했다. 종양은 칼리퍼로 1주 2회 측정하고, 종양 용적은 W×L×H로 계산했다.
도 11B는 Tb535가 또한 확립된 종양에 대해 활성적임을 나타낸다.
실시예 8 생체외 세포독성
사이토카인 방출 검정
4명의 건강한 공여자의 PBMC를 표적 MSTO-211H 세포의 존재 및 부재하에 TB535H와 함께 배양했다. PBMC를 해동시키고, 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 RPMI에서 배양했다. MSTO-211H 세포를 24-웰 플레이트에서 8×104 세포/웰로 파종하고, 세포 부착을 위해 밤새 배양했다. PBMC를 다양한 트리바디 농도로 10:1(비-활성화된)의 효과기:표적으로 첨가했다. 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 또는 48시간 배양할 때, 세포를 수거하고, 원심분리(300×g, 5분, 실온)하고, 상청액을 새로운 튜브에 수집하고, 사이토카인 방출에 대해 검정했다.
배양 배지 내로의 사이토카인 방출은 제조업자의 지시에 따라 하기 키트를 사용하여 ELISA에 의해 평가했다: IL-2, Mabtech 3445-1H-6; IFN-감마 Mabtech 3420-1H-6; TNF-알파 Mabtech 3510-1H-6; TGF-베타 1 R&D DY240-05; IL-4 R&D DY204-05 및 IL-6 R&D DY206. 일부 샘플은 결과를 표준 곡선, 즉 TGF1-베타(1:7 희석), IL-6(1:10 희석) 및 IFN-감마(10ng/ml 및 그 이상의 Tb535H 농도를 위해 NOEL 표적 샘플에서 1:40 희석)에 대해 적합시킬 수 있도록 희석해야 한다. 샘플은 IL-2, IFN-감마, TNF-알파 및 IL-6의 정량화를 위해 24시간 배양 후에 측정했다. IL-4 및 TGF-베타 1은 48시간 배양 후에 배양 배지로부터 정량했다.
도 12는 유형 I 반응의 PBMC와 함께 종양 세포의 생체외 공생배양에서 사이토카인 유도를 나타내고, 도 12B는 표적 세포의 부재(PBMC + Tb535 단독)하에 유의한 사이토카인 유도의 결여를 나타낸다.
아미노산 서열
서열번호 서열
01 EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHGKSLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKAILTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGVTTSVTVSS
02 EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSS
03 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGQGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
04 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRINPNNGVTLYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
05 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRINPNNGVTLYNQKFKDRVTITRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
06 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYYMHWVKQSPGQGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
07 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGQGLEWIGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
08 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRINPNNGVTLYNQKFKDKFVFSLDTSVSTAYLQICSLKAEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
09 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLEWMGRINPNNGVTLYNQKFKDKVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
10 QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQARGQRLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAASTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
11 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQRLEWMGRINPNNGVTLYNQKFKDKVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
12 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRINPNNGVTLYNQKFKDKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
13 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRINPNNGVTLYNQKFKDKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
14 QVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGYSFTGYYMHWVRQSPGQGLEWLGRINPNNGVTLYNQKFKDKKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTTVTVSS
15 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSFTGYYMHWVRQPPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSS
16 DIVMTQTPTFLLVSACDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPTLLISYTSSRYAGVPDRFIGSGYGTDFTFTISTLQAEDLAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
17 ASIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
18 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
19 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQPPKLLIYYTSSRYAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
20 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQGIRNDLGWYQQKPGQPPKLLIYYTSSRYAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
21 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQPPKLLIYAASSLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
22 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKRLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
23 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQPPKLLIYYTSSRYAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
24 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQDYNSPPTFGQGTKLTVL
25 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASQSVSNDVAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWHFGQGTKVEIK
26 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSS
27 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS
28 DVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSS
29 QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQCLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSS
30 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFKFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQMGYWHFDLWGRGTLVTVSS
31
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYHQLSSLTSEDSAVYYCARWQDYDVYFDYWGQGTT
32 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVTTYADSVKGRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
33 QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFISYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSSSSAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSAYYDYDGFAYWGQGTLVTVSA
34 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQIT
35 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN
36 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
37 DIQLTQSPSILSASVGDRVTITCRASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTEYTLTISSMQPEDFATYYCQQWSSNPLTFGCGTKVEIKRT
38 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGTKVEIK
39 QIVLSQSPALLSASPGEKVTMTCRASSSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLETK
40 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK
41 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYKQKSGTSPKRWTYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGSGTKLEIK
42 EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGASIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
43 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGQGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQPPKLLIYYTSSRYAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
44 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYYMHWVKQSPGQCLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQPPKLLIYYTSSRYAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYNSPPTFGCGTKLEIK
45 QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN
46 QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGDIQLTQSPSILSASVGDRVTITCRASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTEYTLTISSMQPEDFATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIK
47 QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQCLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGDIQLTQSPSILSASVGDRVTITCRASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTEYTLTISSMQPEDFATYYCQQWSSNPLTFGCGTKVEIK
48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKCLEWVALINPYKGVTTYADSVKGRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGCGTKVEIK
49 EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTGPGGGSPGQVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQCLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGDIQLTQSPSILSASVGDRVTITCRASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTEYTLTISSMQPEDFATYYCQQWSSNPLTFGCGTKVEIK
50 SIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGPGGGSPGEVQLVQSGPDDVKPGGSVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKCLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGDIVMTQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTSSRYAGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGCGTKLEIKSG
51 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYYMHWVKQSPGQGLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTGPGGGSPGQVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQCLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTADKSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGDIQLTQSPSILSASVGDRVTITCRASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTEYTLTISSMQPEDFATYYCQQWSSNPLTFGCGTKVEIKSG
52 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQPPKLLIYYTSSRYAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGPGGGSPGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYYMHWVKQSPGQCLEWIGRINPNNGVTLYNQKFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSAGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVAWYQQKPGQPPKLLIYYTSSRYAGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYNSPPTFGCGTKLEIKSG
<110> BIOTECNOL LIMITED <120> Fusion protein comprising three binding domains to 5T4 and CD3 <130> IPA170636-NL <150> EP14199493.9 <151> 2014-12-19 <160> 52 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Val 100 105 110 Thr Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 10 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 14 Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Lys Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe 65 70 75 80 Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 16 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Leu Val Ser Ala Cys 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 17 Ala Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Ser Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn 20 25 30 Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 20 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Articial sequence part of the fusion protein <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 24 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 25 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp His Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 28 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Met Gly Tyr Trp His Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 31 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 His Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr <210> 32 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 33 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 34 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr 100 105 <210> 35 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 35 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 <210> 36 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence parr of the fusion protein <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 37 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 38 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 38 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 39 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Leu Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Tyr Met His Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr 35 40 45 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala 65 70 75 80 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys 100 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence part of the fusion protein <400> 41 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Lys Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Thr Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 42 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Combined VH/VL <400> 42 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ser Ile Val Met 130 135 140 Thr Gln Thr Pro Thr Ser Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr 145 150 155 160 Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr 165 170 175 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser 180 185 190 Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly 195 200 205 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala 210 215 220 Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 43 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Combined VH/VL <400> 43 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asp Ile Val Met Thr 130 135 140 Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile 145 150 155 160 Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser 180 185 190 Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 44 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Combined VH/VL <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asp Ile Val Met Thr 130 135 140 Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile 145 150 155 160 Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser 180 185 190 Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Cys Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 45 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Combined VH/VL <400> 45 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr 145 150 155 160 Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr 195 200 205 Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Ile Asn <210> 46 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Combined VH/VL <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ile Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys <210> 47 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Combined VH/VL <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ile Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys <210> 48 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Combined VH/VL <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asp Ile Gln 130 135 140 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 145 150 155 160 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr 180 185 190 Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 210 215 220 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly 225 230 235 240 Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 49 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CH1 containing chain of Tb535c <400> 49 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Gly Pro Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gln Val Gln Leu 225 230 235 240 Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val 245 250 255 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp 260 265 270 Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn 275 280 285 Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala 290 295 300 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg 305 310 315 320 Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr 325 330 335 Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 340 345 350 Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 355 360 365 Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile 370 375 380 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 385 390 395 400 Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 405 410 415 Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro 420 425 430 Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile 435 440 445 Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 450 455 460 Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 465 470 475 480 <210> 50 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CL containing chain of Tb535c <400> 50 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Ser Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Pro Gly Gly Gly Ser Pro Gly Glu Val 210 215 220 Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Asp Val Lys Pro Gly Gly Ser Val 225 230 235 240 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Met 245 250 255 His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly Arg 260 265 270 Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp 275 280 285 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Glu 290 295 300 Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 305 310 315 320 Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 325 330 335 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 340 345 350 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr 355 360 365 Pro Thr Ser Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 370 375 380 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 385 390 395 400 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr 405 410 415 Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe 420 425 430 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Phe 435 440 445 Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys 450 455 460 Leu Glu Ile Lys Ser Gly 465 470 <210> 51 <211> 482 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CH1 containing chain of Tb535h <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Gly Pro Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gln Val Gln Leu 225 230 235 240 Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val 245 250 255 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp 260 265 270 Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn 275 280 285 Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala 290 295 300 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg 305 310 315 320 Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr 325 330 335 Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 340 345 350 Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 355 360 365 Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile 370 375 380 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 385 390 395 400 Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 405 410 415 Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro 420 425 430 Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile 435 440 445 Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 450 455 460 Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 465 470 475 480 Ser Gly <210> 52 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CL containing chain of Tb535h <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Pro Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gln Val 210 215 220 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 225 230 235 240 Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Met 245 250 255 His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile Gly Arg 260 265 270 Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp 275 280 285 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 290 295 300 Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 305 310 315 320 Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 325 330 335 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 340 345 350 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 355 360 365 Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 370 375 380 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 385 390 395 400 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr 405 410 415 Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 420 425 430 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 435 440 445 Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys 450 455 460 Leu Glu Ile Lys Ser Gly 465 470

Claims (22)

  1. 제2 쇄: VL(5T4)-CL-L1-VH(5T4)-L2-VL(5T4)와 조합된 제1 쇄: VH(5T4)-CH1-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)의 2개의 상이한 쇄를 포함하는 융합 단백질의 헤테로이량체로서,
    여기서,
    VH와 VL은 항체 가변 결합 도메인이고, CH1과 CL은 항체 불변 도메인이고, 및 L1과 L2는 링커이고,
    융합 단백질의 헤테로이량체는 제1 쇄의 CH1과 제2 쇄의 CL 항체 불변 도메인 사이의 하나의 헤테로이량체 상호작용을 함유하고,
    융합 단백질의 헤테로이량체는 (a) 상기 융합 단백질의 헤테로이량체 내에 형성된 2개의 조합된 VH/VL 결합 도메인이 세포외 5T4 항원에 결합할 수 있도록 하고; (b) 제1 쇄 내에 형성된 나머지 하나의 조합된 VH/VL 결합 도메인이 T 세포 상의 CD3 수용체 복합체에 결합할 수 있도록 하고,
    제1 쇄는 서열번호 51로 이루어지고, 제2 쇄는 서열번호 52로 이루어진 융합 단백질의 헤테로이량체.
  2. 제1항의 융합 단백질의 헤테로이량체를 코딩하는 핵산.
  3. 제2항의 핵산을 포함하는 벡터.
  4. 제2항의 핵산 또는 제3항의 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
  5. 제1항의 융합 단백질의 헤테로이량체의 생산 방법으로서, 상기 방법은
    제1항의 융합 단백질의 헤테로이량체의 발현을 가능하게 하는 조건 하에서 제2항의 핵산 또는 제3항의 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계 및
    배양물로부터 생산된 융합 단백질의 헤테로이량체를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  6. 제1항의 융합 단백질의 헤테로이량체를 포함하는, 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  7. 제5항에 따라 생산된 융합 단백질의 헤테로이량체를 포함하는, 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한 융합 단백질의 헤테로이량체.
  9. 제6항에 있어서, 종양성 질환은 세포외 항원 5T4가 종양 세포에서 발현되는 암인 약제학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 종양성 질환은 세포외 항원 5T4가 종양 세포에서 발현되는 암인 약제학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 종양성 질환은 세포외 항원 5T4가 종양 세포에서 발현되는 암인 융합 단백질의 헤테로이량체.
  12. 제1항의 융합 단백질의 헤테로이량체를 포함하는, 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한 키트.
  13. 제2항의 핵산 또는 제3항의 벡터를 포함하는, 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한 키트.
  14. 제4항의 숙주 세포를 포함하는, 증식성 질환, 종양성 질환 또는 면역학적 질환으로부터 선택된 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한 키트.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
KR1020177018818A 2014-12-19 2015-12-21 5t4 및 cd3에 대한 3개 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 KR102495820B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14199493.9 2014-12-19
EP14199493 2014-12-19
PCT/EP2015/080795 WO2016097408A1 (en) 2014-12-19 2015-12-21 Fusion protein comprising three binding domains to 5t4 and cd3

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170094319A KR20170094319A (ko) 2017-08-17
KR102495820B1 true KR102495820B1 (ko) 2023-02-06

Family

ID=52282472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177018818A KR102495820B1 (ko) 2014-12-19 2015-12-21 5t4 및 cd3에 대한 3개 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10941207B2 (ko)
EP (1) EP3233917B1 (ko)
JP (1) JP6709003B2 (ko)
KR (1) KR102495820B1 (ko)
CN (1) CN107406509B (ko)
AU (1) AU2015366166B2 (ko)
BR (1) BR112017012910A2 (ko)
CA (1) CA2970986C (ko)
GB (1) GB2549632B (ko)
MX (1) MX2017007826A (ko)
WO (1) WO2016097408A1 (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018054484A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
JP7305549B2 (ja) * 2017-04-05 2023-07-10 エックスディーシーエクスプローラー （シャンハイ） カンパニー リミテッド ヒト化抗ｔｐｂｇ抗体およびその製造方法、その複合体および使用
MY200973A (en) 2017-04-11 2024-01-26 Inhibrx Inc Multispecific Polypeptide Constructs Having Constrained Cd3 Binding And Methods Of Using The Same
KR20200010429A (ko) * 2017-05-23 2020-01-30 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양-연관 항원에 결합하는 단백질
KR20200055729A (ko) 2017-09-22 2020-05-21 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 신규한 이중특이적 폴리펩티드 복합체
BR112020005675A2 (pt) * 2017-09-22 2020-10-20 WuXi Biologics Ireland Limited novos complexos de polipeptideo cd3/cd19 biespecíficos
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
PE20210339A1 (es) * 2018-03-12 2021-02-22 Genmab As Anticuerpos
TW202021986A (zh) * 2018-10-11 2020-06-16 美商英伊布里克斯公司 5t4單域抗體及其治療性組合物
CN109776683B (zh) * 2019-03-19 2020-04-07 益科思特(北京)医药科技发展有限公司 一种双特异性抗体及其制备方法与应用
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
US20230257479A1 (en) * 2019-09-12 2023-08-17 Genmab A/S Bispecific antibodies binding to 5t4 and cd3 for use in treatment of cancer
WO2021247805A1 (en) * 2020-06-05 2021-12-09 The Johns Hopkins University Humanized antibodies directed against kcnk9
CA3202891A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Kara Olson Compositions and methods for treating cytokine release syndrome
US20230357446A1 (en) 2022-04-11 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
WO2024005204A1 (ja) * 2022-06-30 2024-01-04 株式会社カイオム・バイオサイエンス 融合タンパク質

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991009967A1 (en) 1989-12-21 1991-07-11 Celltech Limited Humanised antibodies
CN101490085A (zh) 2006-06-12 2009-07-22 特鲁比昂药品公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
WO2013041687A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific binding molecules for 5t4 and cd3
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2714738T3 (en) * 2011-05-24 2019-01-28 Zyngenia Inc MULTIVALENT AND MONOVALENT MULTISPECIFIC COMPLEXES AND THEIR APPLICATIONS

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991009967A1 (en) 1989-12-21 1991-07-11 Celltech Limited Humanised antibodies
CN101490085A (zh) 2006-06-12 2009-07-22 特鲁比昂药品公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
WO2013041687A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific binding molecules for 5t4 and cd3
JP2014533929A (ja) 2011-09-23 2014-12-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー ５ｔ４およびｃｄ３に対する二重特異的結合性分子
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nico Mertens, Tribodies: Fab-scFv fusion proteins as a platform to create multi-functional pharmaceuticals, In "Bispecific Antibodies" (ed. R. Kontermann), SpringerLink 2011, pp.135-149(2011.) 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015366166B2 (en) 2021-08-05
GB2549632B (en) 2020-09-23
CA2970986C (en) 2021-10-26
US20170342160A1 (en) 2017-11-30
WO2016097408A1 (en) 2016-06-23
JP6709003B2 (ja) 2020-06-10
CA2970986A1 (en) 2016-06-23
AU2015366166A1 (en) 2017-06-29
GB201709537D0 (en) 2017-08-02
GB2549632A8 (en) 2020-08-26
KR20170094319A (ko) 2017-08-17
EP3233917A1 (en) 2017-10-25
EP3233917B1 (en) 2024-04-17
US10941207B2 (en) 2021-03-09
CN107406509A (zh) 2017-11-28
BR112017012910A2 (pt) 2018-02-06
CN107406509B (zh) 2021-10-29
MX2017007826A (es) 2018-02-13
GB2549632A (en) 2017-10-25
JP2018500025A (ja) 2018-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102495820B1 (ko) 5t4 및 cd3에 대한 3개 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질
JP6845177B2 (ja) 長寿命ポリペプチド結合分子
US20220251243A1 (en) Binding molecules for bcma and cd3
CN105980406B (zh) Bcma和cd3的结合分子
KR20180033501A (ko) Dll3 및 cd3에 결합하는 이중특이적인 항체 작제물
WO2016135239A1 (en) Fusion protein comprising three binding domains to her2

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant