KR102486546B1

KR102486546B1 - 피오멜라닌 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이에 의해 생산된 피오멜라닌

Info

Publication number: KR102486546B1
Application number: KR1020190172710A
Authority: KR
Inventors: 최권영; 서다희; 김은주
Original assignee: 아주대학교 산학협력단
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2023-01-06
Also published as: KR20210080783A

Abstract

본 발명은 피오멜라닌 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이에 의해 생산된 피오멜라닌에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물 및 피오멜라닌의 제조 방법을 이용하면 높은 수율로 피오멜라닌을 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 피오멜라닌은 다양한 색상으로 제조될 수 있어 코팅용 조성물 또는 염료로 사용할 수 있으며, 항산화 효과가 있어 항산화용 조성물로도 사용될 수 있다.

Description

피오멜라닌 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이에 의해 생산된 피오멜라닌 {Recombinant microorganism with pyomelanin production ability and pyomelanin produced thereby}

본 발명은 피오멜라닌 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이에 의해 생산된 피오멜라닌에 관한 것이다.

멜라닌은 합성하는 소스에 따라 특성, 구조, 역할이 다양하다. 동물은 L- 티로신에 대한 티로시나제의 작용을 통해 유멜라닌(Eumelanin)과 페오멜라닌(pheomelanin)을 합성하고, 유멜라닌과 페오멜라닌의 조합에 의해 생산되는 신경멜라닌(neuromelanin)은 세포 자멸사와 신경 퇴행과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 식물 또는 곰팡이에서 생산되는 알로멜라닌(allomelanin)은 질소가 전혀 없는 구조의 멜라닌이며, 디하이드록시페닐렌 멜라닌(dihydroxyphenylene melanin)과 같은 곰팡이 유래 멜라닌은 곰팡이가 균사체를 형성하거나 포자를 형성하는 동안 합성되는 멜라닌으로 알려져 있다.

최근, 박테리아 유래의 멜라닌인 피오멜라닌은 생명공학분야에서 잠재적 가치가 큰 물질로 연구되기 시작하였다. 바이오레메디에이션 분야에서 피오멜라닌은 우라늄, 몰리브덴, 비스무트와 같은 무기 오염물을 고정시켜 토양 오염을 방지하는 것이 연구되었다. 또한, 바이오 연료 공학 분야에서는 피오멜라닌이 전자 셔틀로 작용하며 박테리아에 의해 전달되는 전자의 비율을 증가시키는데 중요한 역할을 하는 것이 알려졌으며, 멜라닌을 생산하는 박테리아가 멜라닌을 생산하지 않는 박테리아에 비해 보다 많은 양의 전기를 생산하는 것이 확인된 바 있다. 또한, DNA 손상에 대한 회복능이 결핍되어 높은 광민감성과 피부암이 유발되기도 하는 색소성건피증(xeroderma pigmentosum) 환자의 섬유아세포에 피오멜라닌이 처리되었을 때, 자외선에 대한 저항능이 보다 증가하는 것이 피부의학 분야에서 최근 연구되었다.

따라서, 다양한 분야에서 널리 사용되는 피오멜라닌을 효과적으로 생산할 수 있는 방법이 요구되며, 유래 균에 따른 피오멜라닌의 특성을 보다 명확히 규명하여 적합한 용도를 발굴하는 것이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 피오멜라닌을 보다 효과적으로 생산하기 위한 생명공학적 방법을 연구하던 중, R.pickettii 유래 HPD 유전자를 대장균에 형질전환 하였을 때, 피오멜라닌을 높을 수율로 생산할 수 있는 것을 확인하였으며, 나아가, 특정 금속을 첨가하여 생산하게 되면 수율이 증가하는 것을 확인하고, 첨가하는 금속에 따라 다양한 색상의 피오멜라닌이 생산되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii) 유래 HPD 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환 된 것을 특징으로 하는 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는 것이며, 상기 재조합 미생물을 이용하여 피오멜라닌을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 피오멜라닌을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii) 유래 HPD(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)유전자를 포함하는 벡터로 형질전환 된 것을 특징으로 하는 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (2) 상기 (1)단계에서 수득한 미생물 배양액으로부터 피오멜라닌을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피오멜라닌의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii)로부터 피오멜라닌을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피오멜라닌의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 피오멜라닌을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피오멜라닌을 포함하는 코팅용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피오멜라닌을 포함하는 염료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피오멜라닌을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물 및 피오멜라닌의 제조 방법을 이용하면 높은 수율로 피오멜라닌을 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 피오멜라닌은 다양한 색상으로 제조될 수 있어 코팅용 조성물 또는 염료로 사용할 수 있으며, 항산화 효과가 있어 항산화용 조성물로도 사용될 수 있다.

도 1은 피오멜라닌(Pyomelanin) 생합성 재조합 대장균에 의한 피오멜라닌 생합성 경로를 나타낸 도이다.
도 2는 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균 제작을 위한 플라스미드를 도식화한 도이다.
도 3은 R.pickettii 균주를 이용하여 피오멜라닌을 생산하였을 때, 시간에 따른 피오멜라닌 생산량 및 DCW를 측정한 도이다.
도 4는 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균을 이용하여 피오멜라닌을 생산하였을 때, 시간에 따른 피오멜라닌 생산량 및 DCW를 측정한 도이다.
도 5는 피오멜라닌 생산시 첨가하는 금속을 달리하여 생산한 피오멜라닌을 나타낸 도이다.
도 6은 피오멜라닌 생산시 첨가하는 금속을 달리하여 생산한 피오멜라닌의 용매 별 용해도를 나타낸 도이다.
도 7은 피오멜라닌 생산시 첨가하는 금속을 달리하여 생산한 피오멜라닌의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 피오멜라닌을 LB 복합 배지에서 생산시, 망간(Mn)과 casamino acid를 첨가하였을 때 피오멜라닌의 생산량과 DCW를 측정한 도이다.
도 9는 R.pickettii 유래 피오멜라닌의 항산화 활성을 피오멜라닌의 농도를 달리하여 측정한 도이다.

본 발명은 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii) 유래 HPD(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)유전자를 포함하는 벡터로 형질전환 된 것을 특징으로 하는 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 피오멜라닌은 티로신 또는 이화작용에 의해 생산되는 물질이며, 박테리아에 의해 생산되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 랄스토니아 피케티 또는 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii) 유래 HPD(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)유전자를 포함하는 벡터로 형질전환 된 것을 특징으로 하는 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물에 의해 생산되는 것일 수 있다.

본 발명의 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii)는 그람 음성균이며, 간균의 형태를 띄는 토양 박테리아로써, 토양, 강 및 호수와 같은 습한 환경에서 주로 발견된다.

본 발명의 HPD(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)유전자는 알파-케토이소카프로에이트 디옥시제네이즈(α-ketoisocaproate dioxygenase, KIC dioxygenase)로도 알려진 효소로써, 티로신의 이화작용 중 4-하이드록시페닐파이루베이트(4-hydroxyphenylpyruvate)를 호모젠티세이트 (homogentisate)로의 전환을 촉매하는 산화효소이다. 바람직하게 상기 HPD 유전자는 서열번호 1을 포함하는 유전자일 수 있다. 상기 서열번호 1의 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 것 일 수 있다.

본 발명에서 용어 '벡터'는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 '작동가능하게 연결된 (operably linked)'는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에서 '목적 유전자의 발현'이란 것은 상기 목적 유전자를 발현시켜 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 생산하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서 목적 유전자를 발현하는 방법은 상기 목적 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체 숙주세포를 배양하여 상기 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 발현시키는 방법이며, 이를 통해 상기 단백질이 관여되는 생합성 경로의 최종산물을 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있고, 바람직하게는 플라스미드일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 상기 대장균은 HmgA(high mobility group A) 유전자가 없어 pyomelanin의 전구체인 호모젠티세이트(homogentisate)를 분해하지 못하는 균주일 수 있다.

본 발명에 있어서, 재조합 벡터를 세포 내로 도입시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 형질전환 방법이다. 여기서 '형질전환'은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 열 충격법(heat shock method), 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE (diethylaminoethyl)-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물은 HPD 효소를 발현하며 HmgA 효소를 발현하지 않는 특성이 있어, 티로신과 함께 배양하면, 야생형 랄스토니아 피케티 대비 높은 수율로 피오멜라닌을 생산하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물은 배양과정에서 금속을 첨가하여 피오멜라닌의 수율이 증대되는 것일 수 있으며, 바람직하게 상기 금속은 망간, 구리, 철일 수 있고, 가장 바람직하게는 망간일 수 있다.

본 발명의 상기 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물에 의해 생산된 피오멜라닌은 배양과정에서 첨가하는 물질에 따라 다양한 색상을 나타낼 수 있으며, 바람직하게 상기 첨가하는 물질은 망간(Mn), 구리(Cu), 철(Fe)일 수 있다. 상기 배양과정에서 티로신만으로 배양하면 옅은 갈색의 피오멜라닌이 생성되며, 티로신과 망간을 첨가하여 배양하면 짙은 갈색을 띄는 피오멜라닌이 생성되며, 티로신과 구리를 첨가하여 배양하면 옅은 갈색을 띄는 피오멜라닌이 생성되고, 티로신과 철을 첨가하여 배양하면 짙은 갈색을 띄는 피오멜라닌이 생성되는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물에 의해 생산된 피오멜라닌은 항산화효과가 있는 것 일 수 있다.

본 발명의 상기 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물에 의해 생산된 피오멜라닌은 항균 효과가 있는 것 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 통상적으로 알려진 배양방법을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 배양액으로부터 레티노이드의 분리 및 회수는 단백질의 물리, 화학적 특성에 따라 적합한 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그래피, 용매추출, 반응추출, HPLC 등을 이용할 수 있으며, 이들을 조합하여 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물을 배양하고 추출하여 1단계의 간단한 과정만으로 피오멜라닌을 높은 수율로 생산할 수 있는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 (1) 단계는 티로신을 첨가하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 티로신 및 금속을 첨가하는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 티로신; 및 망간, 구리 또는 철을 첨가하는 단계를 포함하는 것 일 수 있다.

본 발명의 상기 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii)에 의해 생산된 피오멜라닌은 배양과정에서 첨가하는 물질에 따라 다양한 색상을 나타낼 수 있으며, 바람직하게 상기 첨가하는 물질은 망간(Mn), 구리(Cu), 철(Fe)일 수 있다. 상기 배양과정에서 티로신만으로 배양하면 옅은 갈색의 피오멜라닌이 생성되며, 티로신과 망간을 첨가하여 배양하면 짙은 갈색을 띄는 피오멜라닌이 생성되며, 티로신과 구리를 첨가하여 배양하면 옅은 갈색을 띄는 피오멜라닌이 생성되고, 티로신과 철을 첨가하여 배양하면 짙은 갈색을 띄는 피오멜라닌이 생성되는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii)에 의해 생산된 피오멜라닌은 항산화 효과가 있는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 피오멜라닌 배양과정에 따라 나타날 수 있는 다양한 색상을 바탕으로 여러가지 색상으로 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 항균 효과가 있는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 염료 조성물은 다른 착색제를 추가적으로 포함하여 염료 조성물을 제조할 수 있으며, 상기 다른 착색제는 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물에는 발명의 목적 및 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 가용화제, 완충제, 빙결방지제 등의 기타 성분이 추가로 포함될 수 있다. 여기서, 상기 가용화제는 조성물의 뭉침을 방지하고 용해를 용이하게 해주는 성분이고, 상기 완충제는 저장 및 보관시 염료의 분해를 막아주기 위해 pH를 완충하는 역할을 하는 성분이며, 상기 빙결방지제는 액상 냉동보관시 어는점을 낮춰주어 액상 조성물이 얼지 않게 하는 역할을 하는 성분이다. 이러한 기타 첨가제는 조성물 전체 중량 기준 약 1~20 중량%의 범위로 첨가되는 것이 적절하다.

본 발명의 상기 조성물은 항균, 항산화 효과를 갖는 기능성 코팅, 염료 소재로 사용되는 것 일 수 있다.

본 발명에서 용어, "항산화"는 산화를 억제하는 작용일 수 있다. 활성 산소에 의한 생체지질의 산화에서는 생체막 인지질(불포화지방산포함) 이외에 단백질(여러 효소를 포함)이나 유전의 정보를 담당하는 DNA의 손상 등이 나타나며, 나아가 간 장해나 순환기계 질환 혹은 암 등의 질병 그리고 노화가 유도될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 유효성분을 항산화 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.990 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량" 항산화 활성을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 상기 항산화용 조성물을 이용하면, 활성산소에 의해 유발되는 산화 스트레스에 의한 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.

실시예 1. 피오멜라닌(Pyomelanin) 생합성 재조합 대장균 제작

피오멜라닌(Pyomelanin) 생합성 재조합 대장균에 의한 피오멜라닌 생합성 경로는 도 1과 같다.

1.1 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균 제작을 위한 대장균 준비

본 발명에서 재조합에 사용한 E.coli 균주는 BW25113 균주로써, E.coli(DE3) 유래의 wild type 대장균이다. 본 발명에서는 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균을 제조하기 위해, 상기 BW15113 균주의 fadD gene, araBAD gene, rhaBAD gene을 제거하여, BL21(DE3)βfadDβaraBADβrhaBAD 균주를 제조하였다. 제조한 BL21(DE3)βfadDβaraBADβrhaBAD 균주를 형질전환이 용이하게 되도록 하기 위하여, 고영양 배지인 SOB medium에서 E.coli 균주를 2%로 계대배양하고 early-log phase에서 0.1M CaCl₂, 15% glycerol 용액을 이용하여 세포의 외벽을 플라스미드의 흡수가 가능한 상태로 만든 컴피턴트(competent) 세포로 제조하였다. fadD는 지방산을 acyl-CoA로 전환되는데 관여하는 효소이고, araBAD와 rhaBAD는 각각 단당류인 L-arabinose와 L-rhamnose를 분해하는 데 관여하는 gene이다.

본 발명 재조합에 사용한 E.coli BW25113, Ralstonia pickettii (ATCC 27511) 및 Ralstonia pickettii (ATCC 27511)와 계통학적으로 유사한 Ralstonia pickettii 12D 균주에서 각각 피오멜라닌 생합성에 관여하는 효소가 존재하는 개수를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

표 1에 나타낸 바와 같이, E.coli BW25113 균주에는 피오멜라닌 의 전구체인 호모젠티세이트(Homogentisate)를 분해하는 생촉매인 HmgA 효소가 없어, BW25113 균주를 이용하여 피오멜라닌 생합성 재조합 균주를 제작하면, 호모젠티세이트의 축적을 통한 피오멜라닌의 생산성 증대를 기대 할 수 있다.

1.2 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균 제작을 위한 플라스미드 구축

Escerichia coli DH5α 균주를 클로닝 및 플라스미드 DNA 제조에 사용하였다. 클로닝에 사용한 HPD(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)의 서열(서열번호 1)은 Ralstonia pickettii (ATCC 27511)에서 forward primer : AAAGGATCCATGCAATTCACGCCTTGGG, backward primer : AAAAAGCTTTCAGGCCGGCTGGTC를 이용하여 LA-Taq polymerase(Takara 사)를 통해 증폭하였다. 증폭된 DNA는 전기영동을 통해서 1107bp 사이즈인 것을 확인하였고, ExpinTM Combo GP kit(Geneall 사)를 이용하여 필요한 염기서열의 유전자만을 정제하였다. 정제된 HPPD 유전자와 pET-28a 벡터를 BamH I-HF/HindIII-HF(NEB 사)의 제한효소를 통해 double cut을 진행한 후, T4D 리가아제 효소(TaKaRa사)를 사용하여 접합하고, R.pickettii 유래 HPD 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 구축하였다. 구축한 재조합 플라스미드를 대장균의 클로닝용 세포인 DH5a에 열 충격법을 사용하여 형질전환하였다. 구체적으로, 재조합 플라스미드와 DH5a세포를 섞고 얼음에 20분 동안 보관한 후, 42도에서 90초간 열 충격(heat shock)을 주었다. 열 충격 이후에 다시 얼음에 보관하고, LB 복합 배지에서 1시간 정도 재 생산(regeneration)을 시켜 준 뒤에 kanamycin(50μg/ml)을 포함한 LB-아가 플레이트에 접종하여 pET28a-HPD 플라스미드가 삽입된 클로닝용 대장균주를 제작하였다. 클로닝용 대장균을 geneall사의 mini-prep kit를 사용해서 pET28a-HPD 플라스미드를 정제하였다. HPD gene의 염기서열은 서열번호 1로 나타내었으며, HPD 아미노산 서열은 서열번호 2로 나타내었다. 구축한 플라스미드는 도식화하여 도 2에 나타내었다.

1.3 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균의 제작

실시예 1.1에서 제조한 BL21(DE3)△fadD△araBAD△rhaBAD 컴피턴트 세포와 실시예 1.2에서 정제한 pET28a-HPD 플라스미드를 섞고 실시예 1.2와 동일한 열 충격법을 사용하여 pET28a-HPD 플라스미드가 삽입된 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균주를 제조하였다.

실시예 2. 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균을 이용한 피오멜라닌의 생산

2.1 DCW 및 피오멜라닌 측정 방법의 설정

Dry Cell Weight(DCW)의 경우 멜라닌 생산에 따른 색상 간섭으로 인해 OD₆₀₀에서 무세포 상등액(cell-free supernatant)을 보정하여 측정하였으며, 해당 흡광도 값을 DCW g/L로 변환하였다. 변환 비율은 LB 복합 배지에서 배양한 것은 1 OD₆₀₀ = 1.30g/L 이고, M9 최소 배지에서 배양한 것은 1 OD₆₀₀ = 2.05g/L이다. 멜라닌의 정량은 OD₄₀₀에서 무세포 상등액 흡광도 값을 멜라닌 mg/L로 변환하였다. LB 복합 배지에서 배양한 것은 1 OD₄₀₀ = 73.16mg/L이고, M9 최소 배지에서 1 OD₄₀₀ = 65.74mg/L이다.

2.2 R.pickettii를 이용한 피오멜라닌의 생산

R.pickettii 균주를 LB 복합 배지 또는 M9 최소 배지에 최소 서 배양하여 피오멜라닌을 생산하는 실험을 진행하였다. LB 복합 배지 또는 M9 최소 배지 플레이트에 Ralstonia 균주를 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 그 후에 LB 복합 배지 또는 M9 최소 배지에 접종하여 24시간 동안 같은 30℃에서 배양하였다. 상기 배양액 1ml를 500ml flask에 50ml의 LB 복합 배지 또는 M9 최소 배지에 각각 첨가하여 계대 배양하였고, 배양 초기에 티로신(Tyrosine) 4mM, CuSO₄ 0.5Mm을 첨가하여 60시간 동안 배양하여 피오멜라닌을 생산하였다. 60시간 경과 후 배양액 내의 DCW와 피오멜라닌은 실시예 2.1과 동일한 방법으로 측정하였으며, 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 60시간 동안 티로신 4mM, CuSO₄ 0.5mM를 LB 복합 배지 또는 M9 최소 배지에 넣고 R.pickettii 균주를 배양한 경우, LB 복합 배지에 배양한 균주는 43mg/L의 피오멜라닌을 생산하고, M9 최소 배지에서 배양한 균주는 91mg/L의 피오멜라닌을 생산하는 것을 확인하였다.

2.3 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균을 이용한 피오멜라닌의 생산

카나마이신(50 mg/ml)을 포함한 LB 복합 배지에 실시예 1.3에서 제조한 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균 단일 집락을 접종 하고, 12시간 배양하였다. 상기 배양액 1ml를 500ml 플라스크에 50ml의 카나마이신(50 mg/ml)을 포함한 LB 복합 배지 또는 M9 최소 배지에 각각 첨가하여 37℃, 200 rpm에서 계대 배양하였다. LB 복합 배지의 경우 OD₆₀₀=0.7~0.8이 되었을 때, M9 최소 배지의 경우 OD₆₀₀=0.3이 되었을 때 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 (1M HCl에 티로신을 녹여서 제조하며, 첨가 시 6M NaOH로 중화)을 첨가하여 유도(induction)하였으며, 30℃, 200 rpm에서 24시간 배양하여 피오멜라닌을 생산하였다. 또한, 금속 첨가가 피오멜라닌 생산에 미치는 영향을 확인하기 위해, M9 최소 배지에서 위와 동일한 조건으로 실험을 수행하되, 0.5mM의 금속(MnSO₄, FeSO₄, CuSO₄)을 induction시에 첨가하여 피오멜라닌을 생산하였다. 상기 실험에 따른 피오멜라닌 생산량 및 DCW를 실시예 2.1에서 설정한 방법으로 측정하여 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균에서는 M9 최소 배지에서 유도(induction)시에 티로신(T)만을 넣은 경우, 약 10.6mg/L 정도의 피오멜라닌을 생산하였다. 유도(induction)단계에서 철(F)e 또는 구리(Cu)를 첨가한 경우에는 피오멜라닌이 각각 15.56mg/L, 25.56mg/L 생산되어, 티로신만을 넣은 경우에 비해 피오멜라닌의 생산이 1.5배, 2.4배 증가하였고, 유도(induction)단계에서 망간(Mn)을 첨가한 경우에는 피오멜라닌이 126mg/L 생산되어, 티로신만을 넣은 경우에 비해 피오멜라닌의 생산이 약 12배 정도 증가한 것을 확인하였다.

실시예 3. 첨가 금속에 따른 피오멜라닌의 특성 평가

피오멜라닌 생합성 재조합 대장균을 이용하여 피오멜라닌 생산시, 유도단계에서 첨가되는 금속에 따른 피오멜라닌의 색상, 용해도 및 구조를 비교, 평가하였다.

3.1 첨가 금속에 따른 피오멜라닌의 색상 평가

유도 단계에서 IPTG 0.25Mm 및 2mM 티로신만을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T), 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 및 망간(Mn)을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T+Mn), 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 및 구리(Cu)를 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T+Cu), 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 및 Fe을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T+Fe)으로 실험군을 설정하고, 실시예 2.3과 동일한 방법으로 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균을 배양하여 피오멜라닌을 생산하였다. 배양액 내의 피오멜라닌을 추출하기 위해, 50ml의 배양액을 8,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하고, 상등액을 6M HCl을 이용하여 pH를 2로 맞추고 상온, 암소에서 24시간 정치시켜 염료를 침전시켰다. 침전된 염료를 8,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하고 상등액을 버렸다. DW로 3번 워싱(washing)한 후에 50℃ 오븐에서 건조하여 피오멜라닌을 추출하였으며, 추출된 피오멜라닌을 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm 및 2mM 티로신만을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T)에서 추출한 피오멜라닌은 옅은 갈색을 띄었으며, 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 및 망간(Mn)을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T+Mn)에서 추출한 피오멜라닌은 짙은 갈색을 띄었고, 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 및 구리(Cu)을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T+Cu)에서 추출한 피오멜라닌은 옅은 갈색을 띄었으며, 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 및 Fe을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T+Fe)에서 추출한 피오멜라닌은 짙은 갈색을 띄는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균을 이용하여 피오멜라닌 생합성시 다양한 종류의 금속을 첨가하여 다양한 색상의 피오멜라닌을 추출할 수 있는 것을 확인하였으며, 이를 기초로 본 발명의 피오멜라닌은 다양한 색상으로 제조가 가능하여, 다양한 색상의 천연 고분자 물질 또는 염료로 활용할 수 있음을 확인하였다.

3.2 첨가 금속에 따른 피오멜라닌의 용해도 평가

첨가 금속을 달리하여 생산한 피오멜라닌의 여러 용매에 대한 용해도를 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 본 실시예에서 사용한 용매는 DW, 0.2M 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 에탄올, 메탄올 및 에틸 아세테이트(ethyl acetate, EA)이며, 실시예 3.1에서 건조, 추출한 피오멜라닌을 상기 용매에 녹여서 광학밀도(optical density)를 측정하여 용해도를 측정하였으며, 측정 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 용매 별로 용해도를 확인한 결과, 기존에 잘 용해되는 용매로 알려진 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)과 같은 알칼리성 용매 뿐만 아니라 DMSO와 메탄올 등의 유기용매에서도 잘 용해되는 것을 확인하였다.

3.3 첨가 금속에 따른 피오멜라닌의 구조 평가

첨가 금속을 달리하여 생산한 피오멜라닌의 구조를 비교, 평가하기 위한 실험을 실시하였다. 구체적으로 KBr 파우더와 실시예 3.1에서 생산한 피오멜라닌을 소량 혼합하여 펠렛을 제작한 후에 FT-IR (Frustrated total internal reflection)을 진행하였다. FT-IR은 작용기(functional group)와 같은 화학적 결합의 종류를 확인하는데 있어서 유용한 분석으로 Thermo사의 Nicolet Is50 장비를 이용하여 장비 프로토콜에 따라 분석하였다. FT-IR의 파장(wavelength)에 따른 특징적인 피오멜라닌 구조 내 작용기에 대한 정보를 표 2에 나타내었으며, 이를 기초로 한 FT-IR 분석 결과를 도 7에 나타내었다.

[표 2]

도 7에 나타낸 바와 같이, 유도 단계에서 망간(Mn)을 첨가하여 제조한 피오멜라닌(T+Mn)의 경우, 3500cm^-1 파장 부근의 peak 흡광도 값이 금속을 첨가하지 않거나, 다른 금속을 첨가하여 제조한 피오멜라닌 대비 높게 나타나는 것을 확인한 바, 망간(Mn)을 첨가하여 제조한 피오멜라닌의 경우 더 많은 -OH 기를 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한, 1500cm^-1 파장 부근의 peak 흡광도 값에서도 금속을 첨가하지 않거나, 다른 금속을 첨가하여 제조한 피오멜라닌 대비 높게 나타나는 것을 확인하여, 망간(Mn)을 첨가하여 제조한 피오멜라닌은 알킬기 또는 퀴논기 부분에서 차이가 존재하는 것을 확인하였다.

실시예 4. Casamino acid의 피오멜라닌 생산에 미치는 영향

유도 단계에서 IPTG 0.25Mm 및 2mM 티로신만을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T), 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 및 0.2% (v/v) Casamino acid를 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T+C), 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 및 망간(Mn)을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T+M), 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신, 망간(Mn) 및 0.2% Casamino acid을 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군 (T+M+C)으로 실험군을 설정하고, 실시예 2.3과 동일한 방법으로 LB 복합 배지에서 피오멜라닌 생합성 재조합 대장균을 24시간 배양하여 피오멜라닌을 생산하였으며, 피오멜라닌 생산량 및 DCW를 실시예 2.1에서 설정한 방법으로 측정하여 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 유도 단계에서 IPTG 0.25Mm, 2mM 티로신 및 0.2% Casamino acid를 첨가하여 피오멜라닌을 생산한 군(T+C)에서 피오멜라닌 315mg/L(=13.15mg/Lㆍhr)을 생산하는 것을 확인하였다.

실시예 5. R.pickettii 유래 피오멜라닌의 항산화능 측정

R.pickettii 유래 피오멜라닌의 항산화능을 측정하였다. 구체적으로 실시예 2.2와 동일한 방법으로 피오멜라닌을 생산하고, 생산한 피오멜라닌을 실시예 3.1과 동일한 방법으로 추출하였다. 추출한 피오멜라닌의 라디칼 소거능을 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)를 이용하여 측정하였다. PBS 버퍼를 이용하여 14.8Mm의 ABTS 용액(8.12mg/ml)을 만들고 용매를 물로 하여 4.9mM 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate) 용액을 만들었다. ABTS 용액과 4.9mM 포타슘 퍼설페이트 용액을 1:1로 섞어 최종 농도를 7.4Mm ABTS, 2.45Mm 포타슘 퍼설페이트로 맞추고, pH를 7.4로 맞춘 뒤 암소에서 24시간 정치시켰다. 상기 용액을 증류수로 OD₇₃₄에서 흡광도가 0.7±0.05가 되도록 희석하고 이를 워킹 솔루션(working solution)으로 사용하였다. 0.2M 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 용액 20㎕을 용매로하고, 실시예 3.1에서 제조한 피오멜라닌을 용해하여, 0.625μg/ml, 0.313μg/ml, 0.156μg/ml, 0.078μg/ml 농도의 피오멜라닌 용액을 제조하여 실험군을 설정하였다. 워킹 솔루션 180 μL와 상기 피오멜라닌 용액 20 μL를 혼합하여 암소에서 10분간 반응시킨 후에 OD₇₃₄에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 값과 아래의 식을 이용하여 라디칼 소거능을 계산하였으며, 계산된 라디칼 소거능을 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, R.pickettii 유래 피오멜라닌은 ABTS 라디칼 소거능이 있는 것을 확인하여, 항산화 효과가 있음을 확인하였으며, IC₅₀ 값이 109μg/ml인 것을 확인하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii) 유래 HPD(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)유전자를 포함하는 벡터로 형질전환 된 것을 특징으로 하는 피오멜라닌 제조능을 가지는 재조합 미생물.
(1) 제1항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
(2) 상기 (1)단계에서 수득한 미생물 배양액으로부터 피오멜라닌을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피오멜라닌의 제조 방법.
랄스토니아 피케티(Ralstonia pickettii)로부터 피오멜라닌을 회수하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피오멜라닌의 제조 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제