KR102485182B1 - 멜라노코르틴-4 수용체 작용제 - Google Patents

멜라노코르틴-4 수용체 작용제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 멜라노코르틴 수용체에 대한 우수한 항진 활성을 나타내는 화합물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 1의 화합물, 이를 활성성분으로 포함하는 약제학적 조성물 및 용도에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 멜라노코르틴-4 수용체에 대한 우수한 기능 항진 활성을 보여, 특히 구체적으로 비만, 당뇨, 염증 및 발기부전증에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112020118762652-pat00042

상기 화학식 1에서, R1은 C2-C5 알킬이다.

Description

멜라노코르틴-4 수용체 작용제{MELANOCORTIN-4 RECEPTOR AGONISTS}
본 발명은 멜라노코르틴 수용체에 대한 우수한 항진 활성을 나타내는 화합물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 1의 화합물, 이를 활성성분으로 포함하는 약제학적 조성물 및 용도에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 멜라노코르틴-4 수용체에 대한 우수한 기능 항진 활성을 보여, 특히 구체적으로 비만, 당뇨, 염증 및 발기부전증에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112020118762652-pat00001
상기 화학식 1에서, R1은 C2-C5 알킬이다.
렙틴(leptin) 단백질은 체지방세포(adipocyte)에 의해 분비되는 호르몬으로서, 체내 지방 함량 증가에 따라 분비량이 증가하며 시상하부(hypothalamus)에서 생성되는 다양한 신경펩타이드(neuropeptide)의 기능을 조절함으로써 식욕, 체지방 함량 및 에너지 대사를 비롯한 다양한 생체 내 기능을 조절한다(Schwartz, et al., Nature 404, 661-671 (2000)). 렙틴 단백질에 의한 식욕과 체중조절의 신호전달은 그 하류(downstream)에 많은 요인들의 조절을 통하여 이루어지는데, 그 중 가장 대표적인 것이 멜라노코르틴(melanocortin), AgRP(agouti-related peptide) 및 신경펩타이드 Y(neuropeptide Y, NPY) 호르몬이다.
생체 내 칼로리 과다로부터 오는 결과로 혈액 내 렙틴의 농도가 증가하면, 뇌하수체(pituitary gland)에서의 proopiomelanocortin(POMC) 단백질 호르몬의 분비는 증가하게 되고 AgRP와 NPY의 생성은 감소된다. POMC 신경세포로부터 작은 펩티드 호르몬인 alpha-MSH(melanocyte stimulating hormone)가 생성되며, 이 호르몬은 2차 신경세포의 멜라노코르틴-4 수용체(Melanocortin-4 Receptor, MC4R) 항진제(agonist)로서 식욕 감소를 궁극적으로 유도한다. 반면 칼로리 결핍에서 오는 결과로부터 렙틴의 농도가 감소하면 MC4R 길항제(antagonist)인 AgRP의 발현이 증가되고 NPY의 발현도 증가되어 궁극적으로 식욕을 증진시키게 된다. 즉, 렙틴의 변화에 따라 alpha-MSH 호르몬과 AgRP 호르몬은 MC4R에 대해 항진과 길항 역할을 함으로써 식욕조절에 관여한다.
Alpha-MSH 호르몬은 MC4R 이외에 3개의 MCR subtype에도 결합해서 다양한 생리반응을 유도하게 된다. 현재까지 5가지의 MCR subtype이 규명되어 있는데, 그 중 MC1R의 경우 주로 피부 세포에서 발현되고 멜라닌 색소 조절(skin pigmentation)에 관여하며, MC2R은 부신(adrenal gland)에서 주로 발현되며 glucocorticoid hormone의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있으며 POMC로부터 유래된 ACTH(adrenocorticotropic hormone)만이 그 리간드이다. 중추 신경계에서 주로 발현되는 MC3R과 MC4R은 식욕, 에너지대사 및 체내지방 저장효율 조절 등에 관여하며, 다양한 조직에서 발현되는 MC5R은 외분비 기능(exocrine function)을 조절하는 것으로 알려져 있다(Wikberg, et al., Pharm Res 42 (5) 393-420 (2000)). 특히, MC4R 수용체의 활성화는 식욕의 감소와 에너지 대사의 증가를 유도함으로써 체중을 효율적으로 감소시키는 효과를 나타내므로 비만치료제 개발의 주요 작용점으로 입증되었다(Review: Wikberg, Eur. J. Pharmacol 375, 295-310 (1999)); Wikberg, et al., Pharm Res 42 (5) 393-420 (2000); Douglas et al., Eur J Pharm 450, 93-109 (2002); O'Rahilly et al., Nature Med 10, 351-352 (2004)).
식욕과 체중조절에 있어서 MC4R의 역할은 agouti 단백질의 이상발현 동물모델(agouti mouse) 실험을 통하여 일차적으로 입증되었다. Agouti mouse의 경우 유전적 변이에 의해 agouti 단백질이 중추신경계에도 높은 농도로 발현되고, 시상하부에서 MC4R의 길항제(antagonist) 역할을 함으로써 비만을 유도하는 것이 밝혀졌다(Yen, TT et al., FASEB J. 8, 479-488 (1994); Lu D., et al. Nature 371, 799-802 (1994)). 이후 연구결과에서는 시상하부 신경에서 실제 agouti 단백질과 유사한 AgRP(agouti-related peptide)가 발현되는 것이 관찰되었으며, 이들도 MC4R에 대한 길항제로서 식욕조절에 관여하는 것으로 알려졌다(Shutter, et al., Genes Dev., 11, 593-602 (1997); Ollman, et al. Science 278, 135-138 (1997)).
생체 내 MC4R 항진제인 alpha-MSH를 동물에 대뇌투여하면 식욕을 감소하는 효과가 나타내며, 여기에 MC4R 길항제(antagonist)인 SHU9119(peptide) 또는 HS014(peptide)를 처리하면 식욕을 다시 증가시키는 현상이 관찰 되었다(Kask et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 245, 90-93 (1998)). 뿐만 아니라, Melanotan II (MTII, Ac-Nle-c[Asp-His-DPhe-Arg-Trp-Lys]-NH2)와 그 유사한 항진제인 HP228을 이용한 동물 시험에서 대뇌, 복강 또는 피하 투여 후 식욕억제, 체중감소, 에너지대사의 증가 효능 등이 확인되었다. (Thiele T. E., et al. Am J Physiol 274 (1 Pt 2), R248-54 (1998); Lee M. D., et al. FASEB J 12, A552 (1998); Murphy B., et al. J Appl Physiol 89, 273-82 (2000)). 이와는 반대로 대표적인 SHU9119을 동물에 투여하면, 현저하며 지속적인 사료섭취 및 체중증가를 보여 주어, MCR 항진제가 비만치료제가 될 수 있다는 약리학적인 증거를 제공한다. MTII 투여 시 뚜렷이 나타나는 식욕감소 효과가 MC4R KO(knock-out) 마우스에서는 나타나지 않는데, 이 실험 결과는 식욕감소 효과가 주로 MC4R의 활성화를 통하여 이루어지고 있음을 다시 증명해 준다(Marsh, et al., Nat Genet 21, 119-122 (1999)).
현재까지 개발된 비만치료제로서는 중추신경계에 작용하는 식욕 저해제가 주종이며, 그 중에서도 신경신호전달 물질(neurotransmitter)의 작용을 조절하는 약물들이 대부분이었다. 그 예로서는 noradrenalin agent(phentermine과 mazindol), serotonergic agent인 fluoxetine 및 sibutramine 등이 있다. 그러나 상기 신경신호전달 물질 조절제의 경우는 수 많은 subtype 수용체들을 통하여 식욕저해 이외에 다양한 생리작용에도 광범위한 영향을 미친다. 따라서 상기 조절제들의 경우 각 subtype별 선택성이 결여되어 장기간 투여 시 다양한 부작용을 수반하게 되는 큰 단점이 있다.
반면, 멜라노코르틴은 신경신호전달 물질이 아닌 신경펩타이드(neuropeptide)로서, MC4R 유전자 KO 마우스에서 에너지 대사 이외의 다른 기능들은 모두 정상적인 점을 볼 때 다른 생리 기능에 대한 영향 없이 식욕저해를 통한 체중 감소만을 유도할 수 있다는 점에서 작용점으로서의 장점을 가진다. 특히 그 수용체가 현재까지 개발된 신약 작용점 중 가장 성공적인 범주에 속하는 G-단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR)로서 subtype 수용체에 대한 선택성 확보가 상대적으로 용이하다는 면이 기존의 작용점들과는 크게 구별된다.
이러한 멜라노코르틴 수용체를 작용점으로 활용한 예로, 국제공개번호 WO 2008/007930호 및 WO 2010/056022호에서는 멜라노코르틴 수용체의 항진제로서의 화합물들을 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 멜라노코르틴 수용체, 특히 멜라노코르틴-4 수용체(MC4R)에 대한 선택적인 항진 활성이 우수한 화학식 1으로 표시되는 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이성질체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1으로 표시되는 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 활성성분으로 상기 화학식 1으로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이성질체를 포함하는 멜라노코르틴 수용체 기능 항진용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1으로 표시되는 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이성질체를 비만, 당뇨, 염증 및 발기부전증에 대한 예방 또는 치료에서의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이성질체를 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112020118762652-pat00002
상기 화학식 1에서,
R1은 C2-C5 알킬이다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화합물들은 비대칭 탄소중심과 비대칭축 또는 비대칭평면을 가질 수 있으므로 cis 또는 trans 이성질체, R 또는 S 이성질체, 라세미체, 부분입체이성질체 혼합물 및 개개의 부분입체이성질체로서 존재할 수 있으며, 이들 모든 이성질체 및 혼합물은 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에서는 편의상 달리 명시되지 않는 한, 화학식 1의 화합물은 화학식 1의 화합물, 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 이성질체를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 상기 화학식 1의 R1은 C2 내지 C4 알킬이다. 본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화학식 1의 R1은 직쇄 또는 분지형 C2 내지 C4 알킬, 예를 들면 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-뷰틸, 이소뷰틸, sec-뷰틸 또는 tert-뷰틸이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화학식 1의 R1은 C2 또는 C3 알킬이다. 본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화학식 1의 R1은 직쇄 또는 분지형 C2 또는 C3 알킬, 예를 들면 에틸, n-프로필 또는 이소프로필이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아마이드이다:
[화학식 2]
Figure 112020118762652-pat00003
본 발명의 다른 구체예에서 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 3의 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)프로피온아마이드이다:
[화학식 3]
Figure 112020118762652-pat00004
본 발명의 다른 구체예에서 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 4의 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)피발아마이드이다:
[화학식 4]
Figure 112020118762652-pat00005
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 약제학적으로 허용되는 염은, 예를 들면 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 또는 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화합물은 화학식 1의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이고, 여기에서 R1은 에틸이며, 염은 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산과 같은 유기 카본산; 또는 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산과 같은 설폰산이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화합물은 화학식 1의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이고, 여기에서 R1은 n-프로필이며, 염은 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산과 같은 유기 카본산; 또는 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산과 같은 설폰산이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화합물은 화학식 1의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이고, 여기에서 R1은 이소프로필이며, 염은 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산과 같은 유기 카본산; 또는 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설 폰산, 나프탈렌설폰산과 같은 설폰산이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화합물은 화학식 1의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이고, 여기에서 R1은 n-뷰틸이며, 염은 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산과 같은 유기 카본산; 또는 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설 폰산, 나프탈렌설폰산과 같은 설폰산이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화합물은 화학식 1의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이고, 여기에서 R1은 이소뷰틸이며, 염은 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산과 같은 유기 카본산; 또는 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설 폰산, 나프탈렌설폰산과 같은 설폰산이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화합물은 화학식 1의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이고, 여기에서 R1은 sec-뷰틸이며, 염은 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산과 같은 유기 카본산; 또는 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설 폰산, 나프탈렌설폰산과 같은 설폰산이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화합물은 화학식 1의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이고, 여기에서 R1은 tert-뷰틸이며, 염은 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산과 같은 유기 카본산; 또는 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설 폰산, 나프탈렌설폰산과 같은 설폰산이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 약제학적으로 허용되는 염은 염산염이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 5의 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아마이드 염산염이다:
[화학식 5]
Figure 112020118762652-pat00006
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 6의 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)프로피온아마이드 염산염이다:
[화학식 6]
Figure 112020118762652-pat00007
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 7의 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)피발아마이드 염산염이다:
[화학식 7]
Figure 112020118762652-pat00008
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 화학식 5의 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아마이드 염산염, 상기 화학식 6의 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)프로피온아마이드 염산염 및 상기 화학식 7의 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)피발아마이드 염산염은 하기 반응식 1에 따라 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112020118762652-pat00009
상기 반응식 1에서,
R2는 C1-C5 알킬이고;
R3는 비치환되거나 1개 또는 2개의 C1-C5 알킬로 치환된 C3-C8 사이클로알킬이며;
R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 멜라노코르틴 수용체, 특히 멜라노코르틴-4 수용체(MC4R)에 대하여 우수한 항진작용을 나타내므로 본 발명은 또한, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 유효성분으로서 화학식 1의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 멜라노코르틴 수용체의 기능 항진용 약제학적 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 비만, 당뇨, 염증 및 발기부전증에 대한 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타내나 이들 질병에만 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 “담체(carrier)”란 세포 또는 조직 내로 화합물의 투입을 용이하게 하는 화합물을 의미한다.
본 발명의 화합물을 임상적인 목적으로 투여 시에 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여될 총 일일 용량은 체중 1㎏ 당 0.01 내지 10 ㎎의 범위가 바람직하나, 개개 환자에 대한 특이적인 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 환자의 체중, 성, 건강상태, 식이, 약제의 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 주사 또는 경구 투여를 할 수 있다.
주사용 제제는 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구투여용 고체투여 형태로는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제가 있으며, 고체투여 형태는 본 발명에 따른 화학식 1의 활성 화합물을 하나 이상의 불활성 희석제 및 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시켜 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 멜라노코르틴 수용체, 특히 멜라노코르틴-4 수용체(MC4R)에 대하여 우수한 항진작용을 나타내기에, 비만, 당뇨, 염증 및 발기부전증에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 멜라노코르틴-4 수용체에 대한 on-target 효과를 나타내어 체중 감소 및 식이 감소 효과를 나타내면서도 불안감 및 우울에 영향을 미치지 않고, hERG(human ether-a-go-go related gene) 저해에 대한 부작용이나 돌연변이 유발 같은 안전성의 문제 없이 투여가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 세포 독성 및 간 독성이 없어 안전하게 투여가 가능하다.
이하 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 메틸 (2 S ,4 S )-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00010
하기 단계 A, B, C, D 및 E의 과정을 거쳐 표제 화합물을 얻었다.
단계 A: 1-( tert -뷰틸) 2-메틸 (2 S ,4 S )-4-아지도피롤리딘-1,2-다이카복실레이트의 제조
질소 하에 1-(tert-뷰틸) 2-메틸 (2S,4R)-4-((메틸설포닐)옥시)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트 (48.5 g, 150 mmol)를 N,N'-다이메틸폼아마이드 (250ml)에 녹이고 소듐 아자이드 (19.5 g, 300 ml)를 첨가하였다. 80℃에서 16시간 동안 교반을 하고 반응 용매를 감압 농축 시킨 후, 물을 첨가하고 에틸 아세테이트로 두 번 추출을 하였다. 유기층을 염화 소듐 수용액과 물로 씻은 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조 여과하였다. 여액을 감압 농축하여 crude (39.59 g, 98%)를 얻었고 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
MS [M+H] = 271 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.43-4.37 (m, 1H), 4.35-4.27 (br, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s, 1.2H), 3.73-3.66 (m, 1H), 3.44-3.38 (m, 1H), 2.63-2.49 (m, 1H), 2.19-2.11 (m, 1H), 1.50 (s, 4.5H), 1.44 (s, 4.5H)
단계 B: 1-( tert -뷰틸) 2-메틸 (2 S ,4 S )-4-아미노피롤리딘-1,2-다이카복실레이트의 제조
상기 단계 A에서 얻은 1-(tert-뷰틸) 2-메틸 (2S,4S)-4-아지도피롤리딘-1,2-다이카복실레이트(24.59g, 91.0mmol)를 테트라하이드로퓨란 (180 ml)에 녹인 후, 0℃에서 1M 트라이메틸포스핀 테트라하이드로 용액 (109.2 ml, 109.2 mmol)을 천천히 첨가하였다. 동일 온도에서 1시간 동안 교반을 한 다음, 상온에서 3시간 동안 교반을 하였다. 반응 용매를 감압 농축 시킨 후, 다이클로로메탄 (100 ml)과 물 (150 ml)를 넣고 30분 정도 교반을 시켰다. 층 분리를 하고 다이클로로메탄으로 한번 더 추출한 후, 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조 여과하였다. 여액을 감압 농축하여 crude (20.62 g, 93%)을 얻었고 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
MS [M+H] = 245 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.77 (s, 1.8H), 3.76 (s, 1.2H), 3.75-3.67 (m, 1H), 3.50-3.42 (m, 1H), 3.22-3.17 (m, 1H), 2.58-2.47 (m, 1H), 1.82-1.71 (m, 1H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H)
단계 C: 1-( tert -뷰틸) 2-메틸 (2 S ,4 S )-4-(((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)아미노)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트의 제조
상기 단계 B에서 얻은 1-(tert-뷰틸) 2-메틸 (2S,4S)-4-아미노피롤리딘-1,2-다이카복실레이트 (20.62 g, 84.4 mmol)를 다이클로로에탄 (150 ml)에 녹이고 4-메틸사이클로헥사논 (9.5 ml, 101.3 mmol)을 첨가하였다. 0℃에서 소듐 트라이아세톡시보로하이드라이드 (26.8 g, 126.6 mmol)를 첨가하고, 상온에서 16시간 동안 교반을 하였다. 반응 용매를 감압 농축시키고 물을 첨가하고 에틸 아세테이트로 두 번 추출을 하였다. 유기층을 염화 소듐 수용액으로 씻은 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조 여과하였다. 여액을 감압 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (22.9 g, 80%)을 얻었다.
MS [M+H] = 341 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.26 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.71 (m, 1H), 3.49-3.40 (m, 1H), 3.22-3.16 (m, 1H), 2.69-2.60 (br, 1H), 2.58-2.46 (m, 1H), 1.87-1.77 (m, 1H), 1.73-1.63 (m, 1H), 1.62-1.35 (m, 8H), 1.48 (s, 4.5H), 1.42 (s, 4.5H), 0.96 (d, 3H)
단계 D: 1-( tert -뷰틸) 2-메틸 (2 S ,4 S )-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아미도)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트의 제조
상기 단계 C에서 얻은 1-(tert-뷰틸) 2-메틸 (2S,4S)-4-(((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아미노)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트 (37.29 g, 109.5 mmol)를 다이클로로메탄 (500 ml)에 녹이고 트라이에틸 아민 (61.1 ml, 438.1 mmol)를 넣은 후, 0℃에서 아이소뷰티릴 클로라이드 (11.7 ml, 219 mmol)를 천천히 첨가하였다. 상온에서 16시간 동안 교반을 시킨 후, 반응 용매를 감압 농축 시키고 나서 탄산 수소 소듐 수용액을 첨가하고 에틸 아세테이트로 두 번 추출을 하였다. 유기층을 염화 소듐 수용액과 물로 씻은 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조 여과하였다. 여액을 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (38.79 g, 86%)을 얻었다.
MS [M+H] = 411 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.27 (m, 1H), 3.76 (s, 1.8H), 3.75 (s, 1.2H), 3.78-3.72 (m, 1H), 3.50-3.41 (m, 1H), 3.33-3.14 (m, 1H), 2.69-2.60 (m, 2H), 2.57-2.43 (m, 1H), 1.87-1.79 (m, 1H), 1.70-1.61 (m, 1H), 1.60-1.32 (m, 8H), 1.47 (s, 4.5H), 1.41 (s, 4.5H), 1.10 (dd, 6H), 0.99 (d, 3H)
단계 E: 메틸 (2 S ,4 S )-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 염산 염의 제조
상기 단계 D에서 얻은 1-(tert-뷰틸) 2-메틸 (2S,4S)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아미도)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트 (34.0 g, 82.8 mmol)를 다이클로로메탄 (200 ml)에 녹인 후, 0℃에서 4N 염산 1,4-다이옥산 용액 (82.8 ml, 331.3 mmol)을 첨가하였다. 상온에서 6시간 동안 교반 시킨 후, 반응 용매를 감압 농축하여 crude (28.7 g, 99%)를 얻었고 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
MS[M+H] = 311 (M+1)
제조예 2: (3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카복실산의 제조
Figure 112020118762652-pat00011
국제공개번호 WO 2004/092126호에 기재된 방법으로 표제 화합물을 얻었다.
MS[ M+H] = 282 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.43-7.33 (m, 4H), 3.90-3.69 (m, 3H), 3.59 (dd, J = 11.2, 10.0 Hz, 1H), 3.29 (dd, J = 11.2, 11.2 Hz, 1H), 3.18-3.09 (m, 1H), 1.44 (s, 9H)
제조예 3: 메틸 (2 S ,4 S )-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)프로피온아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00012
하기 단계 A 및 B의 과정을 거쳐 표제 화합물을 얻었다.
단계 A: 1-( tert -뷰틸) 2-메틸 (2 S ,4 S )-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)프로피온아미도)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트의 제조
Figure 112020118762652-pat00013
제조예 1의 단계 C에서 얻은 1-(tert-뷰틸) 2-메틸 (2S,4S)-4-(((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아미노)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트(1.0 g, 2.9 mmol)와 프로피오닐 클로라이드(0.33 g, 3.5 mmol)를 이용하여 제조예 1의 단계 D와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.98 g, 84 %)을 얻었다.
MS [M+Na] = 419.5 (M+23)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.33 (m, 1H), 4.00-3.80 (m, 2H), 3.75 (m, 3H), 3.58 (m, 1H), 3.47 (m, 1H), 2.85-2.68 (m, 1H), 2.38 (q, 2H), 2.31 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.80 (m, 2H), 1.72-1.55 (m, 4H), 1.45 (m, 2H), 1.45-1.41 (m, 9H), 1.07 (m, 6H)
단계 B: 메틸 (2 S ,4 S )-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)프로피온아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00014
상기 단계 A에서 얻은 1-(tert-뷰틸) 2-메틸 (2S,4S)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)프로피온아미도)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트(0.98 g, 2.4 mmol)를 이용하여 제조예 1의 단계 E와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.76 g, 93 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 297.4 (M+1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.95 (brs, 1H), 8.63 (brs, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.53 (m, 1H), 3.40 (m, 2H), 2.53 (m, 1H), 2.37 (q, 2H), 2.24 (m, 1H), 1.88 (m, 1H), 1.68-1.55 (m, 4H), 1.52 (m, 2H), 1.40 (m, 2H), 0.97 (m, 6H)
제조예 4: 메틸 (2 S ,4 S )-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)피발아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00015
하기 단계 A 및 B의 과정을 거쳐 표제 화합물을 얻었다.
단계 A: 1-( tert -뷰틸) 2-메틸 (2 S ,4 S )-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)피발아미도)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트의 제조
Figure 112020118762652-pat00016
국제공개번호 WO 2008/007930호에 기재된 방법으로 표제 화합물을 얻었다.
MS [M+Na] = 447.5 (M+23)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.34 (m, 1H), 3.90-3.75 (m, 2H), 3.73 (m, 3H), 3.45 (m, 2H), 2.75-2.60 (m, 1H), 2.30 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.85 (m, 2H), 1.66 (m, 4H), 1.50 (m, 2H), 1.45-1.41 (m, 9H), 1.25-1.20 (m, 9H), 1.05 (d, 3H)
단계 B: 메틸 (2 S ,4 S )-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)피발아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00017
상기 단계 A에서 얻은 1-(tert-뷰틸) 2-메틸 (2S,4S)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)피발아미도)피롤리딘-1,2-다이카복실레이트(0.80 g, 1.88 mmol)를 이용하여 제조예 1의 단계 E와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.68 g, 99 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 325.4 (M+1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.24 (brs, 1H), 8.60 (brs, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.22 (m, 1H), 3.77 (m, 3H), 3.40-3.28 (m, 3H), 2.55 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.70-1.50 (m, 6H), 1.40 (m, 2H), 1.21-1.10 (m, 9H), 1.00 (m, 3H)
실시예 1: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아마이드 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00018
하기 단계 A, B, C 및 D의 과정을 거쳐 표제 화합물을 얻었다.
단계 A: 메틸 (2 S ,4 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아미도)피롤리딘-2-카복실레이트의 제조
제조예 1에서 얻은 메틸 (2S,4S)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 염산염 (28.7 g, 82.73 mmol), 제조예 2에서 얻은 (3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카복실산 (24.5 g, 86.87 mmol), 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(22.2 g, 115.83 mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(15.7 g, 115.83 mmol)을 N,N'-다이메틸폼아마이드 (400ml)에 녹이고 N,N'-다이아이소프로필에틸아민 (72.0 ml, 413.66 mmol)을 천천히 첨가하였다. 상온에서 16시간 동안 교반을 하고 반응 용매를 감압 농축 시킨 후, 0.5N 수산화 소듐 수용액을 넣고 에틸 아세테이트로 두 번 추출을 하였다. 유기층을 염화 소듐 수용액과 물로 두 번씩 씻어 준 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조 여과하였다. 여액을 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (41.19 g, 87%)을 얻었다.
MS [M+H] = 575 (M+1)
단계 B: (2 S ,4 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아미도)피롤리딘-2-카복실산의 제조
상기 단계 A에서 얻은 메틸 (2S,4S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 (39. 4 g, 68.62 mmol)를 메탄올 (450 ml)에 녹인 후, 6N 수산화 소듐 수용액 (57.2 ml, 343.09 mmol)을 첨가하였다. 상온에서 16시간 동안 교반을 하고 6N 염산 수용액으로 pH 5 정도 맞춘 후, 반응 용액을 감압 농축 시켰다. 농축액을 다이클로로메탄으로 녹인 후, 녹지 않는 고체는 종이 필터로 여과하였다. 여과액을 감압 농축하여 crude (38.4 g, 99%)를 얻었고 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
MS [M+H] = 561 (M+1)
단계 C: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아마이드의 제조
상기 단계 B에서 얻은 (2S,4S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아미도)피롤리딘-2-카복실산 (38.4 g, 68.60 mmol), 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(18.4 g, 96.04 mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트 (13.0 g, 96.04 mmol)를 N,N'-다이메틸폼아마이드 (200ml)에 녹인 후, 순차적으로 모르폴린 (5.9 ml, 68.80 mmol)과 N,N'-다이아이소프로필에틸아민 (59.7 ml, 343.02 mmol)를 천천히 첨가하였다. 상온에서 16시간 동안 교반을 하고 반응 용액을 감압 농축 시킨 후, 0.5N 수산화 소듐 수용액을 넣고 에틸 아세테이트로 두 번 추출을 하였다. 유기층을 염화 소듐 수용액과 물로 두 번씩 씻어준 후, 무수 황산 마그네슘으로 건조 여과하였다. 여과액을 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 화합물 (37.05 g, 86%)을 얻었다.
MS [M+H] = 630 (M+1)
단계 D: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아마이드 염산염의 제조
상기 단계 C에서 얻은 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아마이드 (5.0 g, 7.95 mmol)를 에틸 아세테이트 (50 ml)에 녹인 후, 2N 염산 에틸 아세테이트 용액 (3.97 ml, 15.89 mmol)를 천천히 첨가하였다. 상온에서 30분 동안 교반을 시킨 후, 반응 용매를 감압 농축 시켰다. 생성된 crude 고체는 헥산과 다이에틸 에테르를 사용하여 trituration으로 정제하여 표제 화합물 (5.23 g, 99%)를 얻었다.
MS [M+H] = 630 (M+1)
1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.49-7.44 (m, 4H), 4.83 (m, 1H), 4.23-4.20 (m, 1H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.79-3.47 (m, 14H), 3.03-3.00 (m, 1H), 2.86-2.82 (m, 1H), 2.73-2.67 (m, 1H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.97 (m, 1H), 1.80-1.62 (m, 5H), 1.50 (s, 9H), 1.44-1.27 (m, 3H), 1.06-1.04 (m, 9H)
실시예 2: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)프로피온아마이드 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00019
하기 단계 A, B, C 및 D의 과정을 거쳐 표제 화합물을 얻었다.
단계 A: 메틸 (2 S ,4 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)프로피온아미도)피롤리딘-2-카복실레이트의 제조
Figure 112020118762652-pat00020
제조예 3에서 얻은 메틸 (2S,4S)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)프로피온아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 염산염(0.76 g, 2.28 mmol)과 제조예 2에서 얻은 (3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카복실산(0.64 g, 2.28 mmol)을 이용하여 실시예 1의 단계 A와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.45 g, 35 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 560.4 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.39-7.30 (m, 4H), 4.45 (m, 1H), 4.04 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.65-3.35 (m, 6H), 3.13 (m, 2H), 2.99 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 2.34 (q, 2H), 2.20 (m, 1H), 1.92 (m, 1H), 1.75-1.55 (m, 6H), 1.42 (m, 2H), 1.22 (m, 9H), 1.03 (m, 6H)
단계 B: (2 S ,4 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)프로피온아미도)피롤리딘-2-카복실산의 제조
Figure 112020118762652-pat00021
상기 단계 A에서 얻은 메틸 (2S,4S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)프로피온아미도)피롤리딘-2-카복실레이트(0.45 g, 0.80 mmol)를 이용하여 실시예 1의 단계 B와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.44 g, 99 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 546.4 (M+1)
단계 C: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)프로피온아마이드의 제조
Figure 112020118762652-pat00022
상기 단계 B에서 얻은 (2S,4S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)프로피온아미도)피롤리딘-2-카복실산(0.44 g, 0.80 mmol)을 이용하여 실시예 1의 단계 C와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.28 g, 53 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 615.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.36 (m, 4H), 4.79 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 3.80-3.40 (m, 15H), 3.20 (m, 1H), 3.03 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.33 (q, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.71-1.56 (m, 6H), 1.40-1.20 (m, 11H), 1.00 (m, 6H)
단계 D: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)프로피온아마이드 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00023
상기 단계 C에서 얻은 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)프로피온아마이드(0.08 g, 0.13 mmol)를 이용하여 실시예 1의 단계 D와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.08 g, 94 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 615.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.43 (m, 4H), 4.82 (t, 1H), 4.20 (m, 1H), 4.06-3.40 (m, 15H), 2.97 (m, 1H), 2.69 (m, 1H), 2.33 (m, 2H), 2.15 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.80-1.53 (m, 5H), 1.47 (s, 9H), 1.50-1.25 (m, 4H), 1.01 (m, 6H)
실시예 3: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)피발아마이드 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00024
하기 단계 A, B, C 및 D의 과정을 거쳐 표제 화합물을 얻었다.
단계 A: 메틸 (2 S ,4 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)피발아미도)피롤리딘-2-카복실레이트의 제조
Figure 112020118762652-pat00025
제조예 4에서 얻은 메틸 (2S,4S)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)피발아미도)피롤리딘-2-카복실레이트 염산염(0.65 g, 1.8 mmol)과 제조예 2에서 얻은 (3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카복실산(0.50 g, 1.8 mmol)을 이용하여 실시예 1의 단계 A와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.70 g, 66 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 588.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.40-7.30 (m, 4H), 4.49 (m, 1H), 4.00-3.50 (m, 4H), 3.71 (s, 3H), 3.40 (m, 3H), 3.20-3.05 (m, 2H), 3.00 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.27 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.73-1.60 (m, 6H), 1.60-1.35 (m, 2H), 1.25-1.17 (m, 18H), 1.01 (m, 3H)
단계 B: (2 S ,4 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-( N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)피발아미도)피롤리딘-2-카복실산의 제조
Figure 112020118762652-pat00026
상기 단계 A에서 얻은 메틸 (2S,4S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)피발아미도)피롤리딘-2-카복실레이트(0.10 g, 0.18 mmol)를 이용하여 실시예 1의 단계 B와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.10 g, 99 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 574.4 (M+1)
단계 C: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)피발아마이드의 제조
Figure 112020118762652-pat00027
상기 단계 B에서 얻은 (2S,4S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-4-(N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)피발아미도)피롤리딘-2-카복실산(0.10 g, 0.18 mmol)을 이용하여 실시예 1의 단계 C와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.020 g, 17 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 643.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.40-7.30 (m, 4H), 4.79 (m, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.80-3.40 (m, 15H), 3.10 (m, 1H), 2.96 (m, 1H), 2.71 (m, 1H), 2.15 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.80-1.35 (m, 8H), 1.21-1.15 (m, 18H), 1.02 (m, 3H)
단계 D: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -((1 s ,4 R )-4-메틸사이클로헥실)피발아마이드 염산염의 제조
Figure 112020118762652-pat00028
상기 단계 C에서 얻은 N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)피발아마이드(0.33 g, 0.51 mmol)를 이용하여 실시예 1의 단계 D와 동일한 방법으로 표제 화합물(0.29 g, 83 %)을 얻었다.
MS [M+H] = 643.5 (M+1)
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.41 (m, 4H), 4.80 (m, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.90 (m, 2H), 3.80-3.40 (m, 13H), 2.94 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.11 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.75 (m, 2H), 1.60 (m, 4H), 1.46 (s, 9H), 1.15 (s, 9H), 1.45-1.30 (m, 3H), 1.01 (m, 3H)
비교예 1: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(2,4-다이플루오로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -(4,4-다이메틸사이클로헥실)아세타마이드 염산염 (A95)의 제조
Figure 112020118762652-pat00029
국제공개번호 WO 2008/007930호의 A95 화합물을 기재된 것과 동일한 방법을 수행하여 얻었다.
비교예 2: N -((3 S ,5 S )-1-((3 S ,4 R )-1-( tert -뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)- N -(4,4-다이메틸사이클로헥실)아세타마이드 염산염 (A96)의 제조
Figure 112020118762652-pat00030
국제공개번호 WO 2008/007930호의 A96 화합물을 기재된 것과 동일한 방법을 수행하여 얻었다.
실험예 1: Luciferase Assay
MC4R(멜라노코르틴-4 수용체)에 대한 항진능력 측정을 위하여 MC4R와 CRE(cAMP response element) 조절 하의 루시퍼라아제 유전자(CRE-LUC)를 영구 발현시키는 세포주를 확립하였다. MC4R 유전자를 포함한 포유 동물세포 발현 벡터(pCDNA3 (Neo)) (Invitrogen)를 제조한 다음, CRE(cAMP response element) 조절하의 루시퍼라아제 유전자(CRE-LUC)를 발현시키는 벡터(pCRE-Luc) (Stratagen)와 함께 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 HEK(Human Embryonic Kidney) 세포주를 형질전환 시켰다. 형질전환된 세포주(HEK MC4R-Luc)들을 24시간 동안 5% CO2가 존재하는 37℃ 항온 배양기에서 10% Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum(GIBCO/BRL)을 함유한 Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM)을 사용하여 배양하였다. 상기 세포주들을 10 ml의 선택 배지(10% Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum(GIBCO/BRL), 100 unit/ml penicillin(GIBCO/BRL), 100 unit/ml streptomycin(GIBCO/BRL), 800 μg/ml Geneticin(G418) (GIBCO/BRL)을 함유한 Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM)) 존재 하에서 4일간 배양하였다. 선택 배지에 의해 사멸되는 세포들을 다시 10 ml의 새로운 선택 배지로 교체해 줌으로써 제거해 주는 과정을 4일 마다 한 번씩 3 회 반복하였다. 최종적으로 선택되어 번식해 나오는 클론들에 의해 형성된 개별 colony들을 현미경 하에서 각 well 당 1 ml의 선택 배지를 함유한 24-well 세포 배양 판으로 옮기고 4일 동안 배양하였다. Forskolin(SIGMA)을 최종농도 10 μM이 되게 처리한 다음 5% CO2가 존재하는 37℃ 항온 배양기에서 5시간 동안 배양하였다. 각 well에 50 μl의 Bright-Glo 루시페라제 시약(Promega)을 처리한 다음 15분간 상온에 방치한 뒤 발광측정기(Luminometer, Victor)를 사용하여 각 well의 발광 정도(luminescence)를 측정하였다. Forskolin의 처리에 의해 기본 값 대비 100배 이상의 발광 정도(luminescence)를 나타내는 클론들을 선별 하여 각 화합물의 MC4R 항진력 측정에 사용하였다.
HEK MC4R-Luc 세포를 96-well 발광측정기(Luminometer)용 세포 배양 판(Costar)의 각 well에 100 μl의 배양액에 2.5 × 104 세포가 되도록 첨가한 뒤 6% CO2가 존재하는 37℃ 항온 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 사용하여 각 단계별 농도로 희석시킨 MCR 항진제를 최종 DMSO 농도가 1%를 넘지 않게 처리한 다음 6% CO2가 존재하는 37℃ 항온 배양기에서 5시간 동안 배양하였다. 각 well에 50 μl의 Bright-Glo 루시페라제 시약(Promega)를 처리한 다음 5분간 상온에 방치한 뒤 발광측정기(Luminometer, Victor) 를 사용하여 각 well의 발광 정도(luminescence)를 측정하였다. 각 단계별 농도로 희석된 항진제에 의해 유도되는 Luminescence양은 10 μM의 NDP-α-MSH처리에 의해 나타나는 양에 대한 상대적인 % 값으로 환산하였다. EC0.5 MSH는 NDP-α-MSH에 의해 유도될 수 있는 최대 luminescence양의 50%를 유도시키는 농도로 표시하였고, EC50는 각 항진제에 의해 유도될 수 있는 최대 luminescence양의 50%를 유도시키는 농도로 표시하였다. 상기 측정치는 통계 소프트웨어(Prizm)를 사용하여 측정하였다.
상기 실험을 통해 얻어진 각 화합물들의 MC4R의 항진 능력 측정 결과를 EC50(nM) 단위로 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112020118762652-pat00031
상기 표 1로부터 볼 수 있듯이, 잘 알려진 생체 내 멜라노코르틴 수용체들 중에 생체 내 에너지 대사와 체중조절에 관여하는 멜라노코르틴-4 수용체(MC4R)에 대하여 실시예의 화합물이 비교예의 화합물들(A95 및 A96) 보다 우수한 MC4R 항진 능력을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: cAMP Assay
멜라노코르틴 수용체는 G-단백질 결합 수용체(GPCR)의 일종으로, G-단백질의 주된 역할은 2차 전달자를 활성화시켜 신호전달을 통해 많은 생리학적 자극에 대한 세포의 반응을 조절한다. MC4R은 Gs-coupled 수용체로 항진제와 상호작용하면 adenylate cyclase(AC)가 활성화되면서 세포 내 2차 전달자 중 하나인 cyclic AMP(cAMP) 농도를 증가시킨다고 알려져 있다. 따라서 cAMP 신호 발생 측정을 통해 멜라노코르틴 수용체의 활성을 평가할 수 있다.
항진제 반응에 의한 세포 내 cAMP level 증가의 측정이 가능하도록 MC1R, MC3R, MC4R 및 MC5R이 각각 과발현된 cAMP Hunter Gs-coupled 세포주(CHO-K1 세포주)를 확립한 후, white 세포 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 분주하고 나서 5% CO2가 존재하는 37℃ 항온배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 2:1 HBBS / 10mM HEPES : cAMP XS+ Ab reagent를 15 ㎕ 넣어주었다. 버퍼로 4배 희석된 샘플을 5 ㎕ 넣어준 후, vehicle 농도는 1%가 되도록 하고 단계별 농도로 희석한 MC4R 항진 화합물을 첨가한 후 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 항진 화합물의 활성 (%)은 100% x (샘플의 평균 RLU값 - vehicle control의 평균 RLU값) / (Max control의 평균 RLU값 - vehicle control의 평균 RLU값)으로 나타내며, 상기 값은 CBIS data analysis suite(ChemInnovation, CA)를 통해 분석하였다.
상기 실험을 통해 얻어진 각 화합물들의 멜라노코르틴 수용체의 항진 능력 측정 결과를 EC50 (nM) 단위로 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112020118762652-pat00032
상기 표 2로부터 볼 수 있듯이, 잘 알려진 생체 내 멜라노코르틴 수용체들 중에 생체 내 에너지 대사와 체중 조절에 관여하는 멜라노코르틴-4 수용체(MC4R)에 대하여 실시예의 화합물이 비교예의 화합물들(A95 및 A96) 보다 우수한 수용체 항진 능력을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: β-arrestin Assay
멜라노코르틴 수용체는 G-단백질 결합 수용체(GPCR)의 일종으로, 많은 신경전달물질의 신호들을 전달하여 다양한 생리반응을 조절한다. GPCR이 인산화 되면 β-arrestin이 수용체의 인산화된 부분이 결합하게 되고, 다른 단백질과의 상호작용을 통하여 세포 내 다양한 신호전달경로를 활성화시키는 중요한 작용을 한다. 멜라노코르틴 수용체가 항진제와 상호작용하면 β-arrestin이 동원되면서 β-arrestin 매개 신호전달경로에 관여한다고 알려져 있다. 따라서 β-arrestin 측정을 통해 멜라노코르틴 수용체의 활성을 평가할 수 있다.
Prolink (PK)-tagged MC1R, MC3R, MC4R, MC5R과 Enzyme acceptor (EA)-tagged β-arrestin이 함께 발현되어 있는 Pathhunter eXpress β-arrestin 세포주(U2OS 세포주)를 확립하였다. 이 세포주는 MCR-PK 부분이 활성화되면 β-arrestin-EA가 동원되어 β-galactosidase 효소 단편인 enzyme acceptor(EA)와 Prolink(PK)가 상호작용하게 된다. 활성화된 효소는 β-galactosidase 활성에 의해 기질을 가수분해하여 화학발광 신호를 만들기 때문에 활성을 측정할 수 있게 된다. Pathhunter eXpress β-arrestin 세포주(U2OS 세포주)를 배양한 후, 세포 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 분주한 뒤 5% CO2가 존재하는 37℃ 항온배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 버퍼로 5배 희석된 샘플을 5 ㎕ 넣어준 후, vehicle 농도는 1%가 되도록 하고 단계별 농도로 희석한 MC4R 항진 화합물을 첨가한 후 37℃에서 90분 동안 반응시켰다. 각 항진 화합물의 활성(%)은 100% x (샘플의 평균 RLU값 - vehicle control의 평균 RLU값) / (control 리간드의 평균 최댓값 - vehicle control의 평균 RLU값) 으로 나타내며, 상기 값은 CBIS data analysis suite(ChemInnovation, CA)를 통해 분석하였다.
상기 실험을 통해 얻어진 각 화합물들의 멜라노코르틴 수용체의 활성 능력 측정 결과를 EC50 (nM) 단위로 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure 112020118762652-pat00033
상기 표 3으로부터 볼 수 있듯이, 잘 알려진 생체 내 멜라노코르틴 수용체들 중에서 생체 내 에너지 대사와 체중 조절에 관여하는 멜라노코르틴-4 수용체(MC4R)에 대하여 실시예의 화합물이 비교예의 화합물들(A95 및 A96) 보다 우수한 수용체 활성 능력을 갖는다는 확인할 수 있었다.
실험예 4: Binding Affinity
생체 내 멜라노코르틴 수용체(MCR)는 5가지 subtype이 알려져 있으며, 그 중 subtype 4인 MC4R의 경우는 에너지 대사와 체중 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 다른 MCR subtype의 경우 피부색소침착, 에너지 항상성, 외분비 기능 등 다양한 생체 내 기능의 조절에 관여하기 때문에 MC4R 항진 화합물들의 MC4R에 대한 선택성 확보가 향후 발생 가능한 부작용 방지에 매우 중요하다. 따라서 MC4R 항진제들의 MCR subtype별 수용체 결합 능력을 측정하였다.
Human recombinant MC1R을 발현시킨 CHO-K1 세포주, MC3R, MC4R 및 MC5R을 발현시킨 HEK-293 세포주를 확립한 후, 각 세포주들에서 membrane을 모았다. 96-웰 세포 배양 플레이트에 well 당 MC1R membrane 3 μg과 0.04 nM 125I-NDP-α-MSH를 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. MC3R, MC5R membrane 3 μg과 0.035 nM 125I-NDP-α-MSH를 37℃에서 1시간 동안 반응시켰으며, MC4R membrane 3.12 μg과 0.02 nM 125I-NDP-α-MSH를 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 때, 각 well에 단계별 농도로 희석시킨 MCR 항진제를 함유한 25 mM HEPES-KOH 흡착 완충액(pH 7.0)을 넣은 후 반응시켰다. 반응한 용액을 필터로 옮기고 흡착 완충액으로 세척한 후 방사능을 측정하였다. 각각의 총 결합 양에서 1 μM (MC1R), 3 μM (MC3R, MC4R, MC5R) NDP-α-MSH 존재 하에서의 비특이적 결합 양을 제외한 값을 125I-NDP-α-MSH의 특이적 결합 양으로 사용하였다. 각 단계별 농도로 희석된 항진제에 의해 상기 125I-NDP-α-MSH 특이 결합이 저해되는 정도를 측정하였다. IC50는 50%의 125I-NDP-α-MSH 특이 결합을 저해하는 각 항진제의 농도로 표시하였다.
상기 실험을 통해 얻어진 각 화합물들의 멜라노코르틴 수용체의 결합 측정 결과를 Ki (nM) 단위로 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure 112020118762652-pat00034
상기 표 4로부터 볼 수 있듯이, 잘 알려진 생체 내 멜라노코르틴 수용체들 중에 생체 내 에너지 대사와 체중 조절에 관여하는 멜라노코르틴-4 수용체(MC4R)에 대하여 실시예의 화합물이 비교예의 화합물들(A95 및 A96) 보다 우수한 수용체 결합 능력을 갖는다는 확인할 수 있었다.
실험예 5: 약물동태학 및 약물 대사
실험예 5-1: Pharmacokinetic profile
실시예 1의 화합물과 비교예의 화합물의 pharmacokinetics(PK) 특성을 규명하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
실시예 1의 화합물과 비교예의 화합물들(A95 및 A96)에 대한 PK 시험을 실시하기 위하여, 약 7주령의 C57BL6 마우스를 준비하고 투여 물질 당 12마리의 개체를 배정하여 군 분리를 한 다음 경구투여를 위해 절식을 실시하였다. 투여 당일 DW(distilled water)를 vehicle로 하여 1 mg/mL의 농도로 약액을 준비하고 이것을 각 개체의 kg body weight 당 1 mL로 경구투여하여 최종 투여용량을 10 mg/kg로 하였다. 투여 후 1, 3, 8 및 24시간 시점에 군별 3마리 개체 각각에서 심장채혈을 통해 전혈을 채취하고 헤파린 튜브에 넣어 응고를 방지하였다. 이 후 각 개체의 대뇌를 채취하여 EP tube에 넣고 조직 무게를 칭량 후, -20℃에 냉동 보관 하였다.
분석 당일 조직 tube 각각에 조직 무게의 4배 volume의 DDW를 넣고 homogenize하여 균질화 하였으며, 보관된 혈장은 상온에서 해동하였다. 혈장과 같이 조직 균질화액 중 50 μL를 취하여 별도의 tube로 옮긴 다음, 혈장과 조직 균질화액 각각의 tube에 샘플 volume의 총 4배인 200 μL의 acetonitrile(AN)을 첨가하여 제단백을 실시하였다. 이때 AN은 internal standard를 포함하였다. 검량선 작성을 위하여 0.1, 0.5, 5, 50 및 500 ng/mL을 기지농도로 하는 AN solution (with Internal Standard)을 제조하고 혈장과 뇌 각각의 blank plasma에 상기 volume과 같이 4배의 volume으로 제단백하여, 혈장의 경우 최종 0.4~2,000 ng/mL, 뇌의 경우 1, 5, 50, 500 및 5,000 ng/mL의 검량선을 작성하였다. 제단백 이후에 얻어진 상층액을 0.5 μL씩 LC-MS/MS에 주입 후 실시예의 화합물과 비교예의 화합물(A95 및 A96)의 peak area를 IS의 peak area로 보정하여 각 시료 수집시점에서의 peak response를 구하고 검량선을 통해 농도 환산하였다.
투여군 별 시간에 따른 혈중농도의 값에 대해 WinNonlin 8.1을 사용하여 비구획적분석방법을 통해 약동학 파라미터(Cmax, AUCinf, t1/2 등)를 산출하였다.
약물 투여군 별 노출 및 반감기 변화 등을 비교하여 각 화합물들의 약동학적 특징을 비교하였고, 그에 따른 결과값들을 표 5 및 6에 나타내었다. 또한, 혈중노출 대비 뇌중 노출의 비에 따른 결과값들은 표 7에 나타내었다.
[표 5]
Figure 112020118762652-pat00035
[표 6]
Figure 112020118762652-pat00036
[표 7]
Figure 112020118762652-pat00037
상기 결과로부터, 각 화합물들의 노출은 전신 및 뇌중에서 실시예 1의 화합물, 비교예 2의 화합물(A96), 비교예 1의 화합물(A95) 순으로 확인되었다. 관찰기간 내 뇌중 소실 반감기는 혈중에서 관찰된 값에 비해 높으며, 이는 일련의 물질이 효능발현 부위에서 효율적인 지속을 의미할 수 있는 것으로 추측된다. 또한, 각 화합물의 동일용량 투여 시, 실시예의 화합물이 뇌 중 절대 노출 및 지속력이 가장 좋음을 확인하였다. 그리고 혈중노출 대비 뇌중 노출의 비 역시 실시예 1의 화합물이 비교예의 화합물들(A95 및 A96)에 비해 가장 좋음을 확인하였다.
이런 결과와 더불어 각각의 화합물들의 in vitro 활성, 약물의 지속력 등을 종합적으로 고려하였을 때, 실시예 1의 화합물은 비교예의 화합물과의 비교에서 동일용량 투여 시 가장 좋은 효능을 기대할 수 있으며, 특정 수준의 효능을 달성하기 위하여 보다 낮은 용량이 투여될 수도 있고, 이를 통해 전신 노출에 기인하는 부작용을 최소화할 수 있을 것으로 기대된다.
실험예 5-2: CYP inhibition (%)
CYP(cytochrome P450) isozyme에 대한 약물상호작용을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
실시예 1의 화합물과 비교예 2의 화합물(A96)에 대한 저해능을 측정, 비교하기 위해 CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4 recombinant enzyme을 준비하였다. 각 물질의 저해능을 측정하기 위한 probe substrate, 양성 대조군, isozyme의 사용 및 측정 조건은 다음의 표 8을 참고하여 실시하였다.
[표 8]
Figure 112020118762652-pat00038
배양(incubation)은 96-well plate(Costar, 3792-black, round bottom)에서 진행하였고, 대사에 사용되는 buffer 시스템은 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4로 최종 반응 부피는 250 μL이었다. 총 buffer내 실시예 1의 화합물, 비교예 2의 화합물(A96) 및 양성 대조군의 최종농도는 10 μM (2% methanol(v/v))이었으며, 각각 negative control (methanol only, 2% (v/v))을 포함하였다. 실험 화합물이 spike된 buffer를 동일 볼륨의 CYP isozyme prep solution과 섞어 최종 농도를 10 μM로 하여 37℃ fluorescence plate-reader 내에서 10분간 pre-warm 하였다. 각 well NRS solution (NADPH Regeneration System : 0.22 mM β-NADP, 2.8 mM glucose-6-phosphate 및 0.6 units/mL of glucose-6-phosphate dehydrogenase)을 넣어 30분간 pre-incubation 하였다. 이 후 pre-incubation을 실시한 well에 substrate을 넣어 반응을 개시하고, 30분간 각 기질에 대한 측정 파장에서 1분 간격으로 모니터링 하였다. 양성 대조군 및 실시예 1의 화합물에서 얻어진 측정값을 negative control (no inhibition or compound)의 fluorescence intensity와 비교하여 각 화합물의 isozyme에 대한 저해능을 확인하였다. 각 화합물을 10 μM로 처리하였을 때, 각 isozyme에 대한 저해능(%)을 표 9에 나타내었다. 저해능(%)은 다음 기준에 의거하여 표시하였다: A = <50%, B = >50%.
화합물을 10 μM의 처치 농도는 매우 높은 수준이며 이를 기준으로 저해능을 평가하여 50% 보다 낮은 저해율을 갖는 약물을 후보로 선정하는 것은 보수적인 기준으로, 이 때 선정된 후보 약물은 CYP isozyme을 저해할 확률이 매우 낮다고 판단할 수 있다.
[표 9]
Figure 112020118762652-pat00039
상기 결과로부터, 동일농도 처치 시, 주요 CYP isozyme에 대한 실시예 1의 화합물의 저해능은 비교예 2의 화합물(A96)의 저해 수준에 비해 더 낮거나 유사함을 확인하였다. 비교예 2의 화합물(A96)은 CYP2C9에 대해 매우 큰 저해능으로 인해 약물상호작용 발생의 우려가 있다. CYP2C9의 경우 전체 시판되는 약물의 약 10%의 대사에 관여하고, narrow therapeutic window를 갖는 약물의 효능 소실에 주요한 기능을 담당하는 것으로 알려져 있다. 또한, CYP2C9은 각 개인에 따르는 polymorphism이 보고되어 있어 연구나 임상의 측면 모두에서 매우 중요한 의미를 갖는다. 이는 CYP2C9이 FDA DDI(drug-drug interaction) guidance에서 약물 개발 중 반드시 그 저해 영향을 확인해야 하는 필수 isozyme 리스트에 제시되어 있는 것으로도 알 수 있다.
이를 바탕으로 실시예 1의 화합물을 투여 시, CYP 저해에 기인하는 약물상호작용 발생은 비교예의 화합물(A96)에 비해 낮을 것으로 판단되었다.
실험예 6: 약리 효과(Pharmacology)
본 발명의 화합물의 멜라노코르틴-4 수용체 작용제의 약리 효과를 다음과 같은 비만 모델에서 평가하였다.
실험예 6-1: 고지방 식단으로 유도된 마우스 비만 모델
고지방 식단으로 유도된 마우스 비만 모델을 사용하여 비만에 대한 멜라노코르틴-4 수용체 작용제의 효과를 평가하였다.
5주령의 수컷 C57BL/6Ntaconic 마우스에 60 kcal% fat diet (D12492, Research Diet.)를 15주간 공급하여 비만을 유도하였다. 실시예 1의 화합물 및 비교예의 화합물들(A95 및 A96)과 양성 대조군인 sibutramine 물질을 증류수에 제조하고, 19주령의 고지방 식단으로 유도된 마우스 비만 모델에 제1일부터 제16일까지 매일 1회 경구 투여하였다. 제1일부터 제16일까지 체중은 매일 1회, 식이 섭취량은 주 5회, 음수 섭취량은 주 2회 측정하였다. 제15일에는 혈당 및 당화혈색소를 측정하고, 제17일에 모든 동물을 희생시켰다. 복대정맥을 통해 혈액을 채취하고, 간 및 부고환 지방 조직을 적출하여 무게를 측정하였다. 채취한 혈액은 헤파린 튜브에 넣고 원심분리하여 혈장을 분리한 후 혈장 생화학 분석을 실시하였다.
표 10는 각 화합물들의 용량 별로 제12일에 측정한 vehicle 대비 체중변화율의 차이를 나타낸 것이다.
[표 10]
Figure 112020118762652-pat00040
이러한 마우스 비만 모델에서, 특히 실시예 1의 화합물만 투여 시 유의적인 체중 감소를 나타냈다. 실시예 1의 화합물은 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량으로 투여 시 각각 용매 투여 대조군(vehicle control) 대비 -9.4% 및 -15.1%의 체중 증가 억제를 야기하였으며, 비교예의 화합물들(A95 및 A96) 대비 통계학적으로 유의성 있는 체중 감소 효과를 나타내었다.
이는 실시예 1의 화합물이 비교예의 화합물들 보다 우수한 in vitro MC4R 항진 능력, 월등한 brain 절대 노출 및 지속력, 그리고 혈중노출 대비 우수한 뇌중노출 비로 기인한 것으로, 낮은 투여 용량에서도 유의적인 차이를 보일 것으로 판단된다.
또한, 실시예 1의 화합물이 기존 비만치료제인 Sibutramine (Reductil) 대비 효능 면에서 동등 이상의 우수한 결과를 나타내어, 실제 임상 적용시 유의미한 약효를 나타낼 수 있을 것이라 기대된다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 입체이성질체:
    [화학식 1]
    Figure 112022078625118-pat00041

    상기 화학식 1에서,
    R1은 C2-C5 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 C2-C4 알킬인 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 입체이성질체.
  3. 제2항에 있어서, R1이 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-뷰틸, 이소뷰틸, sec-뷰틸 또는 tert-뷰틸인 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 입체이성질체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물이 다음으로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 입체이성질체:
    N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)아이소뷰티르아마이드;
    N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)프로피온아마이드; 및
    N-((3S,5S)-1-((3S,4R)-1-(tert-뷰틸)-4-(4-클로로페닐)피롤리딘-3-카보닐)-5-(모르폴린-4-카보닐)피롤리딘-3-일)-N-((1s,4R)-4-메틸사이클로헥실)피발아마이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 염이 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산 및 요오드화수소산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 입체이성질체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 염이 염산염인 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 입체이성질체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 입체이성질체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는,
    비만, 당뇨, 염증 및 발기부전증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용인 것인, 멜라노코르틴-4 수용체 기능 항진용 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 당뇨의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 발기부전증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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