KR102477868B1

KR102477868B1 - EctP1 펩타이드 태그 및 상기 태그를 이용한 재조합 단백질의 고정화 또는 정제 방법

Info

Publication number: KR102477868B1
Application number: KR1020200059185A
Authority: KR
Inventors: 백승필; 모하메드 아브델타왑 아브달라 아브델하미드; 여기백; 김종기
Original assignee: 고려대학교 세종산학협력단
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2020-05-18
Publication date: 2022-12-15
Also published as: KR20200135191A

Abstract

본 발명은 EctP1 펩타이드 태그를 이용한 표적 단백질의 실리카 또는 티타니아 고정화 및 정제 방법에 관한 것에 관한 것으로서, 본 발명은 간단하면서도 재생산이 가능한 방법이며, 대장균 용해액으로부터 재조합단백질을 직접적으로 고정하고 이를 방출시켜 고순도로 정제할 수 있다.

Description

EctP1 펩타이드 태그 및 상기 태그를 이용한 재조합 단백질의 고정화 또는 정제 방법 {Novel EctP1-peptide tag and method for immobilization or purification of recombinant proteins using thereof}

본 발명은 EctP1 펩타이드 태그와 상기 태그와 실리카 또는 티타니아를 이용한 재조합 단백질의 고정화 및 정제 방법 등에 관한 것이다.

단백질을 고정화 하면 안정성이 높아지고 분리가 쉬우며 지속적으로 재사용 가능한 장점이 있다. 하지만 비특이적 흡착에 기반한 기존의 단백질 고정화 방식은 단백질의 기능을 저하시킬 가능성이 높다는 단점이 있다.

또한, 전통적인 단백질 정제 방법인 His-tag를 이용한 정제 방법은 pH 7 이하에서 단백질의 흡착 효율이 급격히 떨어지는 한계점이 있으며, His-tag은 단백질의 불용성을 증가시키고 구조상의 변이를 가져올 가능성이 있으며, 단백질 회수에 사용되는 이미다졸은 단백질의 안정성을 저해하는 단점이 있다.

전술한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 종래 기술들의 문제점을 해결할 수 있는 새로운 단백질 고정화 및 정제 방법에 관해 예의 연구하던 중, EctP1 펩타이드 태그를 이용할 경우 단백질의 기능 및 안정성을 저하시키지 않으면서 단백질을 효과적으로 고정 및 정제할 수 있다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

KR 10-1975754

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 본 발명에서는 신규의 EctP1 펩타이드태그와 상기 태그를 암호화하는 유전자, 이를 발현하는 벡터 및 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 태그와 표적 단백질이 융합된 재조합 단백질과 이를 암호화하는 유전자, 이를 발현하는 벡터, 및 상기 벡터가 주입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 태그와 표적 단백질이 융합된 재조합 단백질과 실리카 또는 티타니아의 흡착을 유도하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 고정화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 실리카 또는 티타니아에 고정된 재조합 단백질을 아르기닌 단량체와 반응시키는 단계를 포함하는 재조합 단백질 정제 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 신규의 EctP1 펩타이드 태그를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 펩타이드 태그는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 숙주세포에 주입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 숙주세포는 대장균(E.coli)일 수 있다.

또한, 본 발명은 EctP1 펩타이드 태그와 표적 단백질이 융합된 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터와 상기 발현 벡터가 숙주세포에 주입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 고정화 방법을 제공한다:

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 태그와 표적 단백질이 융합된 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 제조단계;

(b) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 제조단계;

(c) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체 제조단계; 및

(d) 상기 형질전환체의 용해액을 실리카(silica) 또는 티타니아(titania)와 혼합하여 재조합 단백질을 실리카 또는 티타니아에 흡착을 유도하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 정제 방법을 제공한다:

(a) EctP1 펩타이드 태그와 표적 단백질이 융합된 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 제조단계;

(b) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 제조단계;

(c) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체 제조단계;

(d) 상기 형질전환체의 용해액을 실리카(silica) 또는 티타니아(titania)와 혼합하여 재조합 단백질을 실리카 또는 티타니아에 흡착을 유도하는 단계; 및

(e) 실리카 또는 티타니아에 흡착된 재조합 단백질에 아르기닌 단량체를 혼합하는 단계.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 (d) 단계는 pH 2 내지 pH 9 조건에서 재조합 단백질을 실리카에 흡착을 유도하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (d) 단계는 pH 6 내지 pH 9 조건에서 재조합 단백질을 티타니아에 흡착을 유도하는 것일 수 있다.

본 발명의 신규의 EctP1 펩타이드 태그와 실리카 또는 티타니아를 이용한 단백질 고정화 방법은 단백질의 기능에 영향을 미치지 않으며 His-tag 방법과 달리 산성 조건에서도 높은 효율로 단백질을 고정화할 수 있고, 상기 고정화 이후에 아르기닌을 이용한 단백질 분리 및 정제 방법은 안정성이 높고 보관이 용이한 고순도 재조합 단백질을 경제적으로 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 재조합 단백질을 발현하는 형질전화체의 용해액으로부터 재조합 단백질을 직접 고정하고 이를 방출시킬 수 있는바, 본 발명은 광촉매 및 센서 소재와 의료용 소재 등 다양한 분야에 응용될 것으로 기대된다.

도 1은 세포 용해물 속의 EctP1 융합단백질이 실리카/티타니아에 고정화되는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 버퍼 조건에 따라 BCA-EctP1 융합단백질이 실리카 또는 티타니아 표면에 고정화되는 효율을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 25 mM sodium phosphate (pH 6 ~ pH 6.5) 또는 Tris-HCl (pH 7 ~ pH 8.5) 버퍼에 0.5% Tween 20을 첨가하여 사용하였으며, 세포 용해물에 포함된 단백질 대비, 흡착된 단백질의 양과 순도를 회색 바와 흰색 바로 나타내었다.
도 3은 SDS-PAGE 분석을 통해 대장균 세포 용해액으로부터 실리카 파티클(2,3)과 티타니아 파티클(4, 5)에 직접 고정화된 BCA-EctP1 융합단백질을 확인한 결과를 나타낸 것이다(1, 세포용해액; 2 와 4, Tris-HCl 버퍼 (pH 8.5)를 사용한 경우; 3 과 5, Tris-HCl 버퍼 (pH 8.5)에 0.5% Tween 20을 첨가하여 사용한 경우; M, 단백질 마커). 화살표는 BCA-EctP1 융합단백질의 위치를 나타내며, 2, 3, 4, 5 단백질은 Laemmli 샘플 버퍼를 가열하여 실리카 또는 티타니아 파티클에 흡착된 단백질을 방출시킨 결과를 나타낸다.
도 4는 실리카와 티타니아에 고정시킨 BCA-EctP1 융합단백질의 안정성 비교한 것으로, (A)는 고정화된 단백질의 총량에서 방출시키고 남은 미방출 단백질의 양을 나타내고, (B)는 고정화하기 전과 고정화한 다음 비교한 BCA-EctP1 융합단백질의 esterase 활성을 나타낸다. 이때, 단백질은 다양한 pH 조건에서 실리카 또는 티타니아에 1시간 동안 고정하였다. (C)는 다양한 온도조건에서 BCA-EctP1 융합단백질의 활성을 비교한 것이고, (D)는 고정화한 BCA-EctP1과 고정화 하지않은 BCA-EctP1의 활성 비교한 결과를 나타낸다. 4 ℃25 mM Tris-HCl buffer pH 8.5 조건에서 실험을 진행하였다.
도 5는 Elution 용액의 종류에 따른 BCA-EctP1 융합단백질의 방출 특성을 비교한 결과를 나타낸다. (A)는 실리카에서, (B)는 티타니아에서 방출된 단백질이다. 각 elution 용액은 0.5 M 농도의 NaCl, MgCl2, l-arginine을 사용하였으며, R,elution 용액으로 단백질을 방출시킨 뒤 파티클에 남아있는 미방출된 단백질을 나타낸다. 1 ~ 5는 elution fraction을 나타낸다.
도 6은 실리카 또는 티타니아에 고정화된 mRFP-EctP1 융합단백질을 나타낸다. 조건실험으로 mRFP을 이용하여 mRFP-EctP1 융합단백질과 흡착능력을 비교하였다. 각각의 단백질은 0.5% Tween 20을 함유한 25 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.5) 환경에서 실리카 또는 티타니아 파티클과 10분간 반응시킨 후 광학현미경(BF)과 형광현미경(FL)으로 비교하였다.
도 7은 실리카 또는 티타니아로부터 정제된 mRFP-EctP1 융합단백질과 조건실험용 mRFP의 활성을 비교한 것이다. (A)는 실리카 또는 티타니아로부터 정제한 mRFP-EctP1 융합단백질의 SDS-PAGE 결로서, 검정 화살표와 흰색 화살표는 모두 mRFP-EctP1의 위치를 나타낸다. 다만, mRFP-EctP1의 20 kDa 밴드(흰색 화살표)는 SDS-PAGE를 위해 단백질을 가열하는 과정에서 RFP에 포함된 N-acylimine의 부분적 가수분해가 일어나 나타나는 현상이다. (1, 세포용해액; 2, 실리카 파티클에서 방출된 단백질; 3, 티타니아에서 방출된 단백질; M, 단백질 마커). (B)는 mRFP의 excitation(왼쪽)과 emission(오른쪽) 그래프를 나타낸다. mRFP는 니켈 레진으로 정제하였고 mRFP-EctP1 융합단백질은 실리카 또는 티타니아로 정제하여 비교하였다.

본 발명은 서열번호 1(EctP1 단백질)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 이용한 단백질 고정화 및 정제 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서는 EctP1 펩타이드를 새로운 단백질 융합 태그로 이용하여 표면처리를 하지 않은 실리카(Silica, SiO2) 또는 티타니아(Titania, TiO2) 표면에 단백질이 흡착되도록 개발하였다. EctP1 펩타이드를 bovine carbonic anhydrase(BCA) 단백질에 융합하고 흡착조건을 최적화한 결과 대장균 단백질들의 비특이적인 흡착이 배제되고 BCA만 흡착시킬 수 있었다. 티타니아에 대한 BCA-EctP1 재조합 단백질의 안정적인 흡착은 pH 2 ~ pH 9에서 이루어졌고 실리카에 대한 BCA-EctP1 재조합 단백질의 안정적인 흡착조건은 pH 6 ~ pH 9로 확인되었다. 또한 EctP1 재조합 단백질을 이용한 공유결합 기반 고정화 방식은 단백질의 회수에도 장점을 보였으며 특히 아르기닌 단량체에 의한 EctP1 재조합 단백질의 회수율은 약 84%로 기타 다른 염화물(NaCl: 30%, MgCl2: 50%) 보다 높은 결과를 나타냈다. BCA와 mRFP(monomeric red fluorescent protein)을 이용하여 EctP1 재조합 단백질을 제작하고 테스트 한 결과, 단백질의 활성을 보유한 채로 80%의 회수율 및 93%의 순도를 보였다. 본 기술은 간단하면서도 재생산이 가능한 방법으로써 대장균 용해액으로부터 재조합단백질을 직접적으로 고정하고 이를 방출시켜 고순도로 정제할 수 있다.

또한, 기존의 전통적인 His-tag 정제 방법은 pH 7 이하에서 단백질의 흡착 효율이 급격히 떨어지는 한계점이 있으나 본 기술은 단백질 흡착 조건이 pH 2 ~ pH 9로 훨씬 넓으므로 다양한 조건에서 활용할 수 있다. 또한 His-tag은 단백질의 불용성을 증가시키고 구조상의 변이를 가져올 가능성이 있다고 보고되어 있으며, His-tag 정제방식에서 단백질 회수에 사용되는 이미다졸은 단백질의 안정성을 저해하는 단점이 있지만 본 기술에서 단백질 회수에 사용하는 아르기닌은 단백질의 aggregation을 방지하여 안정성을 높여주는 효과가 있다. 경제적인 측면에서 실리카, 티타니아는 코발트 또는 니켈 기능화된 레진보다 훨씬 저렴하며 사용하거나 보관시에도 안정성이 높은 장점이 있다. 특히, 티타니아에 단백질을 직접적으로 흡착시킨 사례는 해당 연구결과가 최초이며 산업적으로 활용가치가 높은 광촉매 또는 센서 소재, 의료용 소재로 응용하기 용이하다.

본 발명에서 "폴리뉴클레오타이드"란 비변형(non-modified) 또는 변형된(modified) 모든 폴리리보뉴클레오타 이드(RNA) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(DNA)를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합 물인 RNA, 단일- 또는 이중 가닥, 또는 단일- 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 비번역된 서열 (예를 들어, 인트론)을 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다 (예를 들어, cDNA). 펩타이드가 코딩되는 정보는 코돈을 사용하여 구체화된다. 전형적으로, 아미 노산 서열은 유니버셜 유전자 코드를 사용하여 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. "코돈"은 폴리펩타이드 사슬에서 아미노산 서열을 결정하는 뉴클레오타이드의 트리플렛 (triplet)을 나타낸다. 대부분의 유기체는 단백질 또는 단백질 전구체인 이들의 폴리펩타이드를 제조하는데 20 또는 21개 아미노산을 이용한다. DNA에는 네개의 가능한 뉴클레오타이드 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 티민 (T)이 존재하기 때문에, 20개 아미노산과 말단 시그널을 코딩할 수 있는 64개의 가능한 트리플렛이 존재한다. 이러한 중복성으로 인해, 대부분의 아미노 산은 1개 이상의 트리플렛에 의해 코딩된다. 이에 따라, 코딩되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않으면서 뉴클레오타이드 서열의 변화를 허용할 수 있고, 이를 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의한 침묵변이라 한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 모든 침묵변이는 본 발명의 범위내에 있다.

뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌 (Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체 상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명에서 EctP1 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나 서열번호 2의 염기서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 EctP1 펩타이드 태그과 표적 단백질이 융합된 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명에서 “재조합 단백질”은 각각의 부분이 별개의 기능을 포함하는 적어도 2개의 부분을 포함 하는 아미노산(펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질)의 중합체를 의미한다. 재조합 단백질의 적어도 하나의 제1부분은 적어도 하나의 본 발명의 태그를 포함하고, 재조합 단백질의 적어도 하나의 제2부분은 적어도 하나의 표적 단백질(또는 펩타이드)를 포함한다.

본 발명에서 “표적 단백질”은 고정 또는 정제의 목적이 되는 임의의 단백질로서, 펩타이드를 포함하는 의미이고, 본 명세서 내에서 “목적 단백질” 용어와 혼용될 수 있다.

본 발명자들은 mRFP(monomem red fluorescent protein)과 BCA(bocine carbonic angydrase)를 목적 단백질로 EctP1 태그와 융합시킨 재조합 단백질을 제조하여 실리카 또는 티타니아와 흡착을 유도하여 안정적으로 단백질 고정이 가능함을 확인하였다. 또한, 실리카 또는 티타니아에 고정된 재조합 단백질은 아르기닌 단량체를 이용하여 고순도로 분리 및 정제가 가능함을 구체적인 실험을 통해 확인하였다.

본 발명의 펩타이드 태그는 목적 단백질의 C-말단뿐만 아니라, N-말단 또는 단백질의 기능성에 실질적인 영향을 미치지 않는 한 단백질 내부의 어느 곳에라도 삽입할 수 있다. 여기에서 단백질의 기능성에 실질적인 영향을 미치지 않는다는 것은 상기 펩타이드 태그를 융합시키기 전에 단백질이 갖는 활성을 80% 이상, 바람직하게는 95% 이상 유지한다는 것을 의미한다

한편, 본 발명의 펩타이드 태그는 표적 단백질과 공유결합에 의해 연결되어 재조합 단백질의 일부로 제공될 수 있으나, 표적 단백질과 비공유결합에 의해 연결된 융합 단백질의 일부로 제공될 수 있고, 이때 상기 태그와 표적 단백질은 직접적으로 접촉하거나 링커와 같은 매개자에 의해 매개될 수 있고, 상기 링커는 상기 고정화 이후에 절단 가능하여 목적 단백질이 융합 단백질로부터 회수될 수 있도록 설계될 수 있다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[실험 재료 및 방법]

1. 재료

실리카 파티클 (α-quartz, ~ 0.8 μm)은 Kojundo Chemical Laboratory (Saitama, Japan) 에서 구입. 티타니아 (anatase, = 5 μm)은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) 에서 구입. 모든 시약은 analytical 등급을 사용하였다.

2. 단백질 발현용 플라스미드 제작

BCA-EctP1 융합단백질은 BCA의 유전자를 원형으로 사용하고 BCAEctP1-F와 BCA-EctP1-R 프라이머로 PCR을 통해 제작하였다. PCR 결과물은 정제 후 EcoRI / AatII 제한효소로 절단하고 pET-EctP1 플라스미드의 EcoRI-AatII 부분에 삽입하였고 이를 pET-BCA-EctP1로 명명하였다. 동일한 방법으로 pcDNA3-mRFP 유전자와 RFP-EctP1-F / RFP-EctP1-R 프라이머를 이용하여 PCR 증폭 후 BamHI / KpnI 제한효소로 절단하고 pET-EctP1의 BamHI-KpnI 부분에 삽입하여 pET-RFP-EctP1 플라스미드를 제작하였다.

EctP1 태그와 설계된 재조합 단백질의 구체적인 서열정보는 하기 표 1와 같다.

하기 표 1의 BCA-EctP1 및 mRFP-EctP1 아미노산 서열에서 제한효소와 his-tag 영역은 밑줄로 표시하였고, 단백질 부분은 굵은 글씨로 표시하였다. 표시되지 않은 부분은 EctP1 tag 서열이다.

서열번호		서열
1	EctP1 아미노산 서열	SSRSSSHRRHDHHDHRRGS
2	EctP1 DNA 서열	TCTAGCCGCAGCAGCAGCCATCGCCGCCATGATCATCATGATCATCGCCGCGGCAGC
3	BCA-EctP1 아미노산 서열	MGSSHHHHHHSQDPNSLVPRGS MSHHWGYGKHNGPEHWHKDFPIANGERQSPVDIDTKAVVQDPALKPLALVYGEATSRRMVNNGHSFNVEYDDSQDKAVLKDGPLTGTYRLVQFHFHWGSSDDQGSEHTVDRKKYAAELHLVHWNTKYGDFGTAAQQPDGLAVVGVFLKVGDANPALQKVLDALDSIKTKGKSTDFPNFDPGSLLPNVLDYWTYPGSLTTPPLLESVTWIVLKEPISVSSQQMLKFRTLNFNAEGEPELLMLANWRPAQPLKNRQVRGFPKDVGT LQSGSSRSSSHRRHDHHDHRRGS
4	mRFP-EctP1 아미노산 서열	MGSSHHHHHHSQDP ASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERMYPEDGALKGEIKMRLKLKDGGHYDAEVKTTYMAKKPVQLPGAYKTDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGAGT LQSGSSRSSSHRRHDHHDHRRGS

3. 융합단백질의 발현과 정제

제작한 융합단백질 발현용 벡터는 BL21 (DE3) 대장균에 형질전환하여 37℃LB배지(암피실린 100 μg/mL 포함)에서 배양하였다. 단백질의 과발현을 유도하기 위해 O.D₆₀₀값 0.5에서 0.5 mM IPTG (isopropyl-β를 첨가하고 37℃에서 3시간 추가 배양하였다. 배양된 대장균은 5,000 x g에서 5분간 원심분리하여 펠렛으로 얻었다. 컨트롤 실험을 위해서 His-tag 정제를 통한 융합단백질도 확보하였다. His-tag 정제를 위해 pH 8.0 Tris-saline 버퍼(TBS; 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 25 U/mL DNase, Halt protease inhibitor cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 포함)로 sonication 후 20,000 Хg 에서 40분간 4℃에서 원심분리 하였다. 상층액을 HisPur Ni-NTA Superflow Agarose (Thermo Scientific) 컬럼에 흡착시키고 washing 버퍼(TBS buffer pH 8.0, 20 mM imidazole)로 세척 후 elution 버퍼(TBS buffer pH 8.0, 200 mM imidazole)로 융합단백질을 얻었다.

4. BCA-EctP1의 실리카와 티타니아에 대한 흡착조건 최적화

이전 단계에서 얻은 펠렛을 흡착반응용 버퍼(25 mM sodium phosphate buffer (pH 6-6.5) 또는 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7-8.5) with 0.5% (v/v) Tween 20)에 부유시키고 sonication 후 20,000 Хg 에서 40분간 원심분리하여 상층의 lysate를 얻었다. Lysate는 30 mg의 실리카 또는 20 mg의 티타니아와 10분간 shaking 하여 흡착시킨 후 8,000 Хg 로 10분 원심분리하여 단백질이 흡착된 파티클을 얻었다. 파티클은 흡착반응용 버퍼로 3회 세척 및 원심분리 후 Laemmli 샘플 버퍼를 넣고 가열하여 단백질만 분리하였고 SDS-PAGE에서 순도를 측정하였다. 파티클에 대한 융합단백질의 흡착 최적화를 위해 Tris 버퍼 (25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), 0.5% [v/v] Tween 20)에서 다양한 농도의 실리카 또는 티타니아 파티클(10 ~ 40 mg/mL)을 이용하여 반응시간(1 ~ 60분)에 따른 효율을 측정하였다.

5. 파티클 표면에 고정된 EctP1 융합단백질의 회수

BCA-EctP1 또는 mRFP-EctP1 단백질이 흡착된 파티클을 0.5 M NaCl, MgCl2 또는 L-arginine을 포함한 25 mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.5) 1 mL로 elution을 유도하였고 8,000 Хg 에서 2분간 원심분리하여 단백질이 포함된 상층액을 얻어 회수율을 측정하였다.

[실험 결과]

실시예 1. EctP1를 이용한 단백질의 정제

실리카 및 티타니아 표면에 대한 EctP1의 흡착능력을 확인하기 위해 carbonic anhydrase 효소를 모델 단백질로 선택하여 BCA-EctP1 융합단백질을 제작하였다. BCA-EctP1 융합단백질은 415 ± 25 U/mg의 효소활성을 보였으며 기존의 BCA (420 ± 30 U/mg) 활성과 유사한 값을 보여, BCA의 C-말단에 융합된 EctP1 펩타이드 태그는 효소의 활성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 그 다음으로 BCA-EctP1 융합단백질을 포함한 대장균 세포 용해액을 실리카 또는 티타니아와 상온에서 반응시켜 흡착을 유도하였다. 실리카 또는 티타니아에 흡착된 단백질은 원심분리를 통해 수거하여 흡착반응에 사용한 동일 버퍼를 이용하여 수차례 세척하였다. 실리카 또는 티타니아 표면에 결합된 단백질을 분리하기 위해 SDS 샘플버퍼에 넣고 가열하였고 이를 SDS-PAGE에서 확인하였다. BCA-EctP1 융합단백질은 고체 매트릭스에 대해 높은 흡착성을 보였으며 pH 6 ~ pH 8.5 조건에서 80% 이상이 실리카 또는 티타니아 표면에 흡착되었음을 확인하였다. 그러나 pH 6 ~ pH 7 조건에서의 BCA-EctP1 정제 순도는 실리카가 29~35%, 티타니아가 30~35%로 다소 낮았다. 이 결과는 대장균 단백질의 대부분이 산성의 성질을 가지기 때문에 정전기적 이끌림에 의해 실리카와 티타니아에 비특이적으로 결합했기 때문으로 분석된다. 따라서 흡착반응 시 대장균 단백질의 평균 등전점 6.97 보다 높은 조건인 pH 7.5 이상의 버퍼를 사용했을 경우 비특이적 결합이 줄어들어 BCA-EctP1의 정제 순도가 향상되었다. pH 8 ~ pH 8.5 조건에서 실리카와 티타니아에 대한 BCA-EctP1의 정제 순도는 각각 60 ~76%, 55 ~ 74%로 확인되었다. (도 2)

실시예 2. 실리카 또는 티타니아에 대한 EctP1의 흡착조건 최적화

고체 표면에 대한 BCA-EctP1 의 결합을 향상시키기 위해 ionic strength와 비특이적 결합의 관계를 확인하였다. 150 mM NaCl을 포함한 버퍼조건에서는 BCA-EctP1과 비교하여 대장균 단백질의 비특이적 결합정도가 높게 나타났는데 이는 버퍼속의 염성분이 음으로 하전된 고체표면과 대장균 단백질 사이의 정전기적 반발력을 차단했기 때문으로 분석되며, 이후 실험에서는 NaCl이 포함되지 않은 버퍼를 사용하였다.

그리고 실리카 및 티타니아에 대한 BCA-EctP1 융합단백질의 흡착선택성 및 특이성을 개선하기 위해 0.5% Tween 20을 버퍼용액에 첨가하였다. 비 이온성 계면활성제인 Tween 20은 실리카와 티타니아에 대한 소수성 결합을 억제하는 것으로 알려져 있으므로 원하지 않는 비특이적 결합을 감소시키기 위해서 사용될 수 있다. 0.5% Tween 20이 포함된 pH 8 버퍼 조건에서는 대장균 단백질의 비특이적 결합이 현저하게 줄어들어 실리카와 티타니아에 거의 흡착되지 않았다. 반면 BCA-EctP1 융합단백질의 흡착효율에는 큰 영향이 없어서 실리카와 티타니아에 대한 흡착률은 각각 82%, 85%를 보였고 단백질 분리 순도는 각각 85%, 84%로 향상되었다. pH 8.5 버퍼(25 mM Tris-HCl, 0.5% Tween 20)를 사용할 경우 실리카와 티타니아 표면의 이온화도를 증가시켜 실리카와 티타니아에 대한 흡착률은 86%와 85%로, 분리 순도는 모두 92%를 보였다(도 2 및 도 3). 그리고 고정화된 BCA-EctP1 융합단백질은 다른 pH 조건들과 비교해서 pH 8.5 일 때 높은 회수 후 활성을 보였으므로 최적의 pH 조건을 pH 8.5로 결정하였다. 따라서 이후 실험에서는 0.5% Tween 20을 포함한 pH 8.5 버퍼조건에서 실험을 진행하였다.

EctP1 태그를 포함하지 않은 BCA는 동일한 조건하에서 실리카와 티타니아에 10%, 20% 미만의 결합력을 보였으므로 EctP1 태그가 고체 매트릭스에 선택적으로 결합한다는 것을 나타낸다.

실시예 3. 고정화된 EctP1 융합단백질의 회수

BCA-EctP1 융합단백질은 실리카 및 티타니아 표면에 비공유적으로 결합되므로 이 결합은 가역적이다. 이러한 가역적 결합은 단백질의 기능성을 쉽게 회복시킬 수 있다는 장점과 더불어 고체 매트릭스를 여러 번 재사용 할 수 있다는 경제적 이점도 제공한다. 본 발명에서는 고체 매트릭스로부터 EctP1 융합단백질의 해리조건을 찾기 위해 실리카 및 티타니아 입자에 결합된 BCA-EctP1을 0.5M의 각각 다른 염들(NaCl, MgCl₂, L-아르기닌)이 포함된 버퍼(25 mM Tris-HCl pH 8.5)와 섞어준 뒤 10분간 단백질의 용출을 유도하였다(도 5). 0.5M NaCl을 사용했을 경우 실리카 및 티타니아 표면으로부터 BCA-EctP1의 용출이 효과적으로 일어나지 않았으며 5회의 반복된 용출과정 후 BCA-EctP1의 30%, 38%가 각각 실리카와 티타니아 표면으로부터 회수되었다. 2가 염인 MgCl₂를 0.5M 사용한 경우 회수 수율은 약 50% 로 증가하였다. 흥미롭게도 0.5M L-아르기닌을 사용했을 경우 대부분의 단백질은 고체 매트릭스로부터 용출되어 실리카와 티타니아로부터 각각 84%, 78%의 BCA-EctP1 융합단백질이 회수되었다. 이 결과를 통해 단백질 응집 억제제인 아르기닌이 포함된 버퍼(25 mM Tris HCl, 0.5 M 아르기닌, pH 8.5)가 실리카 또는 티타니아의 표면에 고정된 BCA-EctP1 융합단백질의 회수에 효과적인 용출 버퍼로 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research and Business Foundation, Sejong Campus <120> Novel EctP1-peptide tag and method for immobilization or purification of recombinant proteins using thereof <130> DHP19-690-P1 <150> KR 102019-0060702 <151> 2019-05-23 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EctP1 <400> 1 Ser Ser Arg Ser Ser Ser His Arg Arg His Asp His His Asp His Arg 1 5 10 15 Arg Gly Ser <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EctP1 <400> 2 tctagccgca gcagcagcca tcgccgccat gatcatcatg atcatcgccg cggcagc 57 <210> 3 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCA-EctP1 <400> 3 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Gln Asp Pro Asn Ser 1 5 10 15 Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His 20 25 30 Asn Gly Pro Glu His Trp His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Asn Gly Glu 35 40 45 Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile Asp Thr Lys Ala Val Val Gln Asp Pro 50 55 60 Ala Leu Lys Pro Leu Ala Leu Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ser Arg Arg 65 70 75 80 Met Val Asn Asn Gly His Ser Phe Asn Val Glu Tyr Asp Asp Ser Gln 85 90 95 Asp Lys Ala Val Leu Lys Asp Gly Pro Leu Thr Gly Thr Tyr Arg Leu 100 105 110 Val Gln Phe His Phe His Trp Gly Ser Ser Asp Asp Gln Gly Ser Glu 115 120 125 His Thr Val Asp Arg Lys Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His 130 135 140 Trp Asn Thr Lys Tyr Gly Asp Phe Gly Thr Ala Ala Gln Gln Pro Asp 145 150 155 160 Gly Leu Ala Val Val Gly Val Phe Leu Lys Val Gly Asp Ala Asn Pro 165 170 175 Ala Leu Gln Lys Val Leu Asp Ala Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly 180 185 190 Lys Ser Thr Asp Phe Pro Asn Phe Asp Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asn 195 200 205 Val Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu 210 215 220 Leu Glu Ser Val Thr Trp Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser 225 230 235 240 Ser Gln Gln Met Leu Lys Phe Arg Thr Leu Asn Phe Asn Ala Glu Gly 245 250 255 Glu Pro Glu Leu Leu Met Leu Ala Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu 260 265 270 Lys Asn Arg Gln Val Arg Gly Phe Pro Lys Asp Val Gly Thr Leu Gln 275 280 285 Ser Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser His Arg Arg His Asp His His Asp 290 295 300 His Arg Arg Gly Ser 305 <210> 4 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mRFP-EctP1 <400> 4 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Gln Asp Pro Ala Ser 1 5 10 15 Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu 20 25 30 Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly 35 40 45 Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly 50 55 60 Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Gln Tyr 65 70 75 80 Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu 85 90 95 Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe 100 105 110 Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp 115 120 125 Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser 130 135 140 Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr 145 150 155 160 Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Met 165 170 175 Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr 180 185 190 Thr Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Lys Thr 195 200 205 Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val 210 215 220 Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Ala Gly Thr 225 230 235 240 Leu Gln Ser Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser His Arg Arg His Asp His 245 250 255 His Asp His Arg Arg Gly Ser 260

Claims

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(1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 태그와 표적 단백질이 융합된 재조합 단백질을 포함하는 용액을 준비하는 단계; 및
(2) 상기 용액을 실리카(silica) 또는 티타니아(titania)를 포함하는 용기에 투입하여 재조합 단백질의 흡착을 유도하는 단계;
(3) 상기 용기에 아르기닌 단량체를 혼합하는 단계;를 포함하는, 재조합 단백질의 정제 방법으로,
상기 (2) 단계는 pH 6 내지 pH 9 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 정제 방법.
제 7항에 있어서,
상기 용기는 티타니아(titania)인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 정제 방법.
제 7항에 있어서,
상기 (2) 단계에서 pH는 8 내지 9인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 정제 방법.
제 9항에 있어서,
상기 pH 8.5이며, 이때 상기 용기에 대한 흡착률은 85% 이상이며, 분리순도는 92% 이상인 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 정제 방법.
제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질의 정제 방법에 사용되는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드 태그.
제 11항에 있어서,
상기 펩타이드 태그는 타겟단백질과 재조합된 후, 타이타이아에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드 태그.