KR102476316B1 - 좀개구리밥의 페룰산 생산 증진방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 에테폰을 이용하여 좀개구리밥의 페룰산 생산을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에테폰이 포함된 배지에서 배양된 좀개구리밥은 대조군과 비교하여 좀개구리밥의 잎수가 증가하였으며, 페룰산 및 가바 생산량이 증가된 것으로 확인됨에 따라, 상기 에테폰 처리를 통한 좀개구리밥 배양 방법은 산업적으로 이용가능한 페룰산 및 가바 대량생산 방법으로 제공될 수 있으며, 에테폰을 포함하는 조성물은 좀개구리밥의 페룰산 및 가바 함량 증진용 배지첨가제로 제공될 수 있다.

Description

좀개구리밥의 페룰산 생산 증진방법{Method for increasing ferulic acid productivity of Lemna paucicostata}
본 발명은 에테폰을 이용하여 좀개구리밥의 페룰산 생산을 증가시키는 방법 및 좀개구리밥 배양용 배지첨가제에 관한 것이다.
좀개구리밥 (Lemna paucicostata)으로 알려진 렘나(Lemna minor)과는 천남성과(Araceae)에 속하고, 빠르게 자라며 쉽게 수확될 수 있으며 무독성 식물이다. 건조 중량에서 43%의 단백질을 함유하고 있어 자연적 단백질의 원천으로 사용되어 왔으며, 수면 위를 떠내는 것만으로도 쉽게 수확할 수 있는 좀개구리밥은 추가 가공이 필요 없는 물고기의 먹이이고 해열 및 진통제 생산의 원료이다.
또한, 조류의 성장에 필요한 빛에 있어서 좀개구리밥의 부유 효과는 공장폐수로부터 크롬(Cr;Vi)을 제거할 수 있으며, 프로파닐(3,4-디클로로프로피오나닐라이드)의 독성을 평가에 사용되었다. 상기 식물의 펙틴질의 폴리사카라이드는 렘난(lemnan)으로 불려졌고, 식세포작용을 증가시키고 면역조절효과 활성을 나타낸다고 알려졌다.
고농도의 저렴한 단백질, 전분 및 지방산을 함유한 렘나과 종은 이미 식품 산업, 수프, 카레 및 샐러드와 같은 식품에 사용되고 있으며, 중국, 러시아 및 일부 유럽 국가에서 전통적으로 진통제, 구충제 및 항염증제로 인후 및 코 질환 치료에 널리 사용되고 있다.
한편, 동물에 있어서, 가바 (gamma-aminobutyric acid, GABA)는 중추신경 시스템의 신경전달물질로 알려져있으며, 식물에서는 세포 신호전달에 작용하고, 환경 스트레스에 반응하여 축적된다. 이러한 가바는 불면증, 기면증 및 뇌전증 치료에 있어서, 이완 및 호르몬 조절자로 사용된다.
또한, 페룰산(ferulic acid)은 천연 페놀로 항산화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 앞선 보고에 따르면, 번행초 (Tetragonia tetragonioides)에서 추출된 페눌산은 미백 및 주름 개선 효과를 나타내었으며, 표피에서 페룰산을 아스코르브산 및 α-토코페롤과 병용처리할 경우, 티민이량체 형성 및 ROS의 저해를 유도하는 것으로 확인됨에 따라, 생리 활성을 나타내는 가바 및 페룰산을 산업적으로 이용하기 위해 인체에 안전하고 손쉬운 방법으로 대량생산하기 위한 연구가 계속 진행되고 있다.
대한민국 공개특허 제10-2011-0088268호 (2011.08.03. 공개)
본 발명은 에테폰을 이용하여 페룰산과 가바 함량이 증가된 좀개구리밥 배양 방법 및 좀개구리밥 배양을 위한 배지첨가제를 제공하고자 한다.
본 발명은 에테폰을 유효성분으로 함유하는 배지에서 좀개구리밥을 배양하는 단계를 포함하는 좀개구리밥의 페룰산 생산 증진용 배양방법을 제공한다.
본 발명은 에테폰을 유효성분으로 함유하며, 좀개구리밥의 페룰산 함량 증진용 배지첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 에테폰을 유효성분으로 함유하는 배지에서 배양되며, 페룰산 함량이 증가된 좀개구리밥 식물체를 제공한다.
본 발명에 따르면, 에테폰이 포함된 배지에서 배양된 좀개구리밥은 대조군과 비교하여 좀개구리밥의 잎수가 증가하였으며, 페룰산 및 가바 생산량이 증가된 것으로 확인됨에 따라, 상기 에테폰 처리를 통한 좀개구리밥 배양 방법은 산업적으로 이용가능한 페룰산 및 가바 대량생산 방법으로 제공될 수 있으며, 에테폰을 포함하는 조성물은 좀개구리밥의 페룰산 및 가바 함량 증진용 배지첨가제로 제공될 수 있다.
도 1은 좀개구리밥의 총 건조 중량에 있어서, 다양한 에테폰 농도가 미치는 영향을 확인한 결과로, 각 처리군에서 세로 막대는 평균값으로 나타내었으며, 오차 막대는 표준편차로 나타내었다 (n = 3). 별표(*)는 대조군과 처리군 간의 유의적인 차이를 나타낸다 (p < 0.05).
도 2는 다양한 농도의 에테폰 처리하에서 배양된 좀개구리밥의 총 잎수를 확인한 결과로, 결과값은 평균값으로 나타내었으며, 세로 막대는 세 가지 생물학적 복제에서 표준편차를 나타낸다.
도 3은 다양한 에테폰 농도 조건에서 35일 배양된 좀개구리밥의 주요 대사산물의 상대적 수준을 확인한 결과로, KEGG database (http://www.genome.jp/kegg/)에 따라 제안된 대사산물의 경로를 나타낸 것으로, 결과값은 평균이며 오차 막대는 9개의 측정값의 표준편차(SD)를 나타낸다 (n = 9, 3 개의 생물학적 복제 및 3 개의 기술적 복제). Mann-Whitney test (p < 0.05)를 수행하여 대조군과 에테폰 처리군 간의 유의적인 차이를 확인하였으며, 각 에테폰 처리군의 유의적 차이를 별표로 나타내었다.
도 4는 정도관리 (QC) 샘플을 포함하여 PCA에 의해 유도된 점수 플롯을 나타낸 결과로, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 및 1 mM 농도의 에테폰 처리군 및 정도관리 (QC)를 각각 ○, ■, ▲, ▼, ◆, ● 및 ■으로 나타내었다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 인체에 우수한 생리 활성을 나타내는 가바 및 페룰산을 산업적으로 이용하기 위해 인체에 안전하고 손쉬운 방법으로 대량생산하기 위한 연구를 진행하던 중 에테폰이 포함된 배지에서 배양된 좀개구리밥은 대조군과 비교하여 좀개구리밥의 잎수가 증가하였으며, 페룰산 및 가바 생산량 증가를 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 에테폰을 유효성분으로 함유하는 배지에서 좀개구리밥을 배양하는 단계를 포함하는 좀개구리밥 (Lemna paucicostata)의 페룰산 생산 증진용 배양방법을 제공할 수 있다.
상기 에테폰은 좀개구리밥의 가바 (gamma-aminobutyric acid, GABA) 생산을 추가로 더 증진시키는 것일 수 있다.
상기 에테폰은 배지 중 0.01 내지 1 mM 농도로 포함되는 것일 수 있다.
상기 좀개구리밥은 에테폰이 함유된 배지에서 7 내지 40일동안 배양되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 35일간 배양되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 좀개구리밥을 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 또는 1 mM 농도의 에테폰이 첨가된 배지 100 mL이 포함된 200 mL 플라스크에 30 주(plants)씩 담아 배양한 후 배양 35일째에 시료를 수집하여 대사물질 수준을 확인한 결과, 표 4와 같이 1.599에서 5.041 mg/L 수준이었던 가바 생산량이 0.5 mM 에테폰 처리군에서 5.041 ± 1.373 mg/L, 0.2 mM 에테폰 처리군에서 3.394 ± 0.895 mg/L 및 0.05 mM 에테폰 처리군에서 3.101 ± 0.808 mg/L의 높은 가바(GABA) 생산이 확인되었다.
또한, 0.129에서 0.640 mg/L 수준이었던 페룰산의 생산량은 0.2 mM 에테폰 처리군에서 가장 높은 생산량 (0.640 ± 0.071 mg/L)이 확인되었다.
본 발명은 에테폰을 유효성분으로 함유하며, 좀개구리밥의 페룰산 함량 증진용 배지첨가제를 제공할 수 있다.
상기 배지첨가제는 좀개구리밥의 가바 함량을 추가로 더 증진시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 에테폰을 유효성분으로 함유하는 배지에서 배양되며, 페룰산 함량이 증가된 좀개구리밥 식물체를 제공할 수 있다.
상기 좀개구리밥은 가바 함량이 추가로 더 증가된 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 좀개구리밥 (Lemna paucicostata) 배양
좀개구리밥 (L. paucicostata) PC-10605 균주를 Korean Collection for Type Cultures (Biological Resource Center, Daejeon, Republic of Korea)로 부터 얻었으며, 앞서 보고된 방법에 따라 고체 배지에서 좀개구리밥을 배양하였다 (Biotechnol Bioprocess Eng. 2018;23: 23-30. doi:10.1007/s12257-017-0384-9).
좀개구리밥의 계대 배양은 2주마다 수행되었다. 액체 배지 조건에 대한 적응을 위해 좀개구리밥을 3일 동안 배지 1L에서 배양하였다. 액체 배지 적응 후, 다양한 농도의 에테폰이 첨가된 배지 100 mL이 포함된 200 mL 플라스크에 30 주(plants)씩 담았다. 실험은 3회 반복 수행되었다. 배양 35일째에 시료를 수집하여 48시간 동안 동결건조(Bondiro, Ilshin Lab. Co., Seoul, Republic of Korea)하고, 분석전까지 -75℃에 저장하였다.
2. 성장확인 (Growth measurement)
좀개구리밥 성장 배지에 에테폰을 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 또는 1 mM 농도로 용해시켰으며, 좀개구리밥 잎의 전체 수를 7일마다 계수하였다. 전체 건조 무게(DW)를 확인하기 위해, 수집된 전체 식물을 증류수로 세척하고 Whatman filter paper (Whatman No. 2, Whatman, Maidstone, UK)와 감압 플라스크를 이용하여 감압여과하였다. 그 후 15분간 건조시키고 코니칼 튜브로 옮겨 담았다.
동결 건조 후 전체 건조 무게를 확인하였다.
3. 종합적인 대사산물 프로파일링을 위한 GC-MS 분석
gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) 분석을 수행하기 위해 시료를 분쇄하였다. 추출 방법은 보고되어진 방법(Kim et al., PLoS ONE. 2017;12:e0187622. doi:10.1371/journal.pone.0187622)으로 수행되었다.
내부 표준(IS)으로 미리스틱-d27 산 (Tokyo Chemical Industry Co., Japan) 2,000 mg/L의 10 μL를 피리미딘에 용해시켜 사용하였다.
GC-MS 분석 조건은 이미 보고된 방법(Nat Protoc. 2006;1: 387-396. doi:10.1038/nprot.2006.59)에서 오븐 온도 설정을 변경하여 수행하였다.
실험 시작시 오븐 온도를 60℃로 설정하고 140℃ (5℃/min), 150℃ (10℃/min 및 3 min 유지), 180℃ (3℃/min), 185℃ (5℃/min 및 3 min 유지), 200℃ (3℃/ min), 225℃ (5℃/min), 230℃ (3℃/min), 280℃ (5℃/min)까지 증가시켰으며, 마지막으로 310℃ (8℃/min)까지 증가하도록 프로그래밍하였다. 총 실행시간은 59.42분이며, GC-MS 분석은 3회 수행되었다.
각 피크의 머무름 시간 및 질량 대 전하 비율 데이터가 포함된 스펙트럼 데이터를 Expressionist MSX software (version 2013.0.39, Genedata, Switzerland)에서 얻었으며, to.csv format (Excel Office 2016)으로 전환하였다.
GC-MS 분석으로 얻은 피크의 할당은 다양한 데이터베이스의 스펙트럼 라이브러리와 샘플에서 얻은 각 피크의 스펙트럼 데이터를 매칭시켜 수행하였다.
70% 이상 일치되는 피크가 선택되었다. 피크 할당은 Golm Metabolome Database (gmd.mpimp-golm.mpg.de/), Human Metabolome Database (HMDB) 및 National Institute of Standards and Technology (NIST)를 사용하여 수행되었다.
각 샘플의 상대적인 대사 물질 수준을 확인하기 위해, 각 피크의 강도를 IS의 강도로 나누어 피크 표준화를 수행하였다.
4. 가바 (GABA) 및 페룰산 (ferulic acid)의 정량
GABA, 카페인산 (caffeic acid) 및 페룰산의 정량을 GABA 표준 (0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, and 80 mg/L), 카페인산 표준 (0.5, 1, 2, 4, 8, and 16 mg/L)으로 구성된 검량선과 페룰산 표준(0.5, 1, 2, 4, 8, and 16 mg/L)에 대한 다른 곡선으로 수행하였다.
피크 영역 비율 (각 피크는 IS 피크 면적으로 나뉘어졌다) 및 농도로 검량선은 얻었다. 좀개구리밥 내 GABA, 카페인산 및 페룰산의 정량을 위해, 동일한 IS (2,000 mg/L myristic-d27 acid)의 농도를 사용하였다. 오븐 온도 설정을 변경하여 이전에 보고된 방법(Nat Protoc. 2006;1: 387-396. doi:10.1038/nprot.2006.59)으로 정량 분석을 수행하였다.
시작 오븐 온도를 100℃로 설정하고 150℃ (5℃/min), 180℃ (at 3℃/min), 185℃ (5℃/min 및 5 min 유지), 200℃ (3℃/ min), 225℃ (5℃/min) 및 230℃ (3℃/min)까지 온도를 증가시켰다.
GABA, 카페인산 및 페룰산의 GC-MS 분석을 세번 반복하여 수행하였다.
GABA, 카페인산 및 페룰산의 정량은 표 1의 회귀방정식(regression equations)을 사용하여 수행하였다.
Compound regression equation R 2 values LOD (μg/mL) LOQ (μg/mL)
γ-Aminobutyric acid (GABA) y = 0.0293x - 0.0065 0.997 0.64 1.93
Caffeic acid y = 0.0164x - 0.0209 0.983 0.05 0.15
Ferulic acid y = 0.0053x - 0.0068 0.976 0.22 0.67
LOD, Limit of detection; LOQ, Limit of quantitation.
<실시예 1> 에테폰 처리에 따른 좀개구리밥 (L. paucicostata) 성장 확인
좀개구리밥 전초(Whole plant)를 다양한 농도 (0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, or 1 mM)의 에테폰에 노출시켰다.
도 1을 참고하면, 대조군과 비교하여 모든 에테폰 처리군에서 총 건조중량이 전체적으로 감소하였다. 보다 상세하게 전체 건조중량은 0.5 mM 처리군을 제외한 모든 에테폰 처리군에서 유의하게 감소하였다.
또한, 도 2와 같이 0.05 및 0.1 mM 에테폰 처리하에서 좀개구리밥 잎의 전체 수가 증가된 것을 확인할 수 있었다.
식물 종, 조직 타입 및 농도에 따라, 에틸렌은 성장, 개체 수 또는 식물 크기에 영향을 미친다. 예를 들어, 쌀과 같은 일부 수중식물은 에틸렌이 성장을 촉진시키는 반면, 나도좀개구리밥 (Lemna minor)과 같은 다른 식물에서는 성장을 방해한다.
이전 연구에서 에테폰 처리가 화분에 담긴 프리지아의 전체 중량 변화없이 알줄기의 전체 수를 증가시키는 것으로 확인되었다. 또한, 에테폰 처리는 귀리 (Avena sativa), 겨이삭속 및 왕포아풀 (Poa pratensis)을 포함하여 몇몇 식물의 잎 크기를 감소시켰다.
이와 유사하게 좀개구리밥 배양에 있어 에테폰 처리는 잎의 수를 증가시키고 전제 건조중량을 감소시키는 것이 확인되었다.
<실시예 2> 좀개구리밥 배양에 있어서 에테폰에 의한 물질대사 프로파일의 변화 확인
GC-MS 분석을 수행하여 표 2와 같이 좀개구리밥에서 48개의 대사물질을 확인하였다.
도 3 및 표 3을 참고하면, 각각 다른 처리군의 대사물질 중에서 상대적 강도에 유의적 차이가 확인되었다. 에테폰 처리는 거의 모든 처리군에서 대부분의 알콜의 상대적인 수준을 증가시켰다. 그러나, 0.05, 0.2 및 0.5 mM 에테폰이 처리하에서는 아미노산의 상대적 수준이 유의적으로 증가한 반면, 1 mM 에테폰 하에서는 유의적으로 감소되었으며, 1 mM 에테폰 하에서 어떠한 변화도 나타나지 않았다.
에테폰 처리군에서 대부분의 지방산이 유의적으로 증가하였다. 유기산은 0.05 및 0.2 mM 에테폰 처리하에서 현저하게 증가하였으나 0.1, 0.5 및 1 mM 에테폰 처리 후 유의적으로 감소하는 경향이 확인되었다. 종합적으로 에테폰은 페놀 화합물 함량은 증가시켰으며, 당 함량은 감소시켰다. 흥미롭게도 에테폰의 모든 농도에서 GABA 함량은 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 3의 녹색 박스와 같이 대부분의 에테폰 처리군에서 미오이노시톨 (myo-inositol) 및 미오이노시톨 인산염의 상대적인 수준이 증가하는 동안 갈락토스의 상대적 수준은 감소하였다.
상기 결과로부터 갈락토스는 에테폰 처리하에서 미오이노시톨 및 미오이노시톨 인산염 합성에 사용되어 함량이 감소하는 것으로 제안될 수 있다.
미오이노시톨은 특히, 관상수 및 나도좀개구리밥의 성장 및 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다. 또한, 이노시톨 인산염은 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에서 세포 신호전달 역할을 한다. 앞선 보고에 따르면, 고무나무 세포의 세포질에 에틸렌 처리는 미노이노시톨 인산염 합성을 증가시켰으며, 글루코스-6-인산을 미오이노시톨 인산염으로 전환시켰다.
이에 따라, 미오이노시톨 인산염 합성효소는 에테폰 처리에 의해 유도될 수 있으며, 결과적으로 미오이노시톨 및 미오이노시톨 인산염의 상대적 수준을 증가시키는 것으로 제안될 수 있다.
프롤린 및 GABA 수준은 1 mM 에테폰 처리군을 제외하고 모든 에테폰 처리군에서 글루타민 수준 변화 없이 증가되었다. 또한, 도 3의 파랑 박스와 같이 글루타민산 수준은 0.05 mM 및 0.2 mM 에테폰 처리하에서 증가하였으며, 1 mM 농도에서는 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
글루타민산은 프롤린 및 GABA를 생성하는데 사용되지만 글루타민은 그렇지 않을 가능성이 있다.
프롤린 및 GABA는 스트레스 저항성 조절자로 알려져있다. 이전 연구에 따르면 올리브 잎에서 에테폰 처리는 산화스트레스를 야기시키는 활성산소종(ROS) 생산을 증가시켰다. 특히, GABA는 글루타민산 탈탄산효소를 통해 글루타민산으로부터 합성되며, 상기 효소는 Ca2+/calmodulin (CaM) 축적을 통해 조절되는 것으로 알려졌다.
이전 연구에서 환경 스트레스는 세포질내 Ca2+ 수준을 증가시키는 것으로 확인되었다. 대부분의 식물의 글루타민산 탈탄산효소는 칼모듈린 (calmodulin) 결합 도메인을 가지며, 상기 도메인은 Ca2+ 존재하에서 칼모듈린과 결합한다.
이에 따라, GABA의 증가 수준은 에테폰 처리에 의해 유도된 산화스트레스에 의한 것일 수 있으며, 글루타민산 탈탄산효로의 활성 증가에 유래한 것으로 제안될 수 있다.
세린, 글리신 및 트레오닌의 상대적 수준은 에테폰 처리군에서 증가하였다. 유사하게 카페인산 및 페룰산의 수준 또한 1 mM 에테폰 처리군을 제외한 대부분의 에테폰 처리군에서 증가하였다. 그러나, 트립토판 (tryptophan) 및 p-쿠마린산 (p-coumaric acid)은 대부분의 처리군에서 감소한 반면 트립타민 (tryptamine)의 수준 변화는 나타나지 않았다. 세린은 글리신과 트립토판 생합성 전구체이다.
트립토판은 p-쿠마린산의 생합성에 사용되므로, 도 3의 적색 박스와 같이 p-쿠마린산은 카페인산 및 페눌산으로 전환될 수 있다.
앞선 보고에 따르면, 에틸렌 처리된 상추에서 대조군과 비교하여 상대적으로 카페인산의 농도가 9배 증가한 것으로 확인됨에 따라, 에테폰이 p-쿠마린산을 통해 세린을 트립토판으로 전환시킨 후 트립토판을 카페인산 및 페눌산으로 전환시키는 역할을 하는 것으로 제안될 수 있다.
GC-MS로 얻은 대사 프로필을 PCA에 의해 유도된 점수 플롯으로 플롯팅하였으며, 도 4와 같이 좀개구리밥과 정도관리 (QC) 샘플의 PCA에 의해 유도된 점수 플롯은 처리 그룹간의 상관관계를 확인하기 위해 사용되었다.
GC-MS에서 모든 QC 샘플의 고응집은 PCA에 의해 유도된 점수 플롯에서 검출되었으며, 이를 통하여 전체 실험기간 동안 GC-MS 분석 플랫폼의 높은 안정성이 확인되었다. 처리군은 명확하게 분리된 반면, 샘플은 서로 밀접하게 모여있었으며, 에테폰 농도가 증가할수록 대조군과 처리군간의 분리가 증가하였다.
상기 결과로부터 에테폰 처리는 좀개구리밥의 대사 프로파일을 매우 영향을 나타내는 것이 확인되었다.
또한, 에테폰 처리에 의해 변화된 대사 프로파일을 기반으로 카페인산 (caffeic acid), GABA 및 페룰산 (ferulic acid)을 확인하였다. 상기 성분들은 단위 세포에서 증가된 상대적 강도 수준을 나타내었으며, 인간 건강 및 질병 관리에 유용한 것으로 알려져있다. 좀개구리밥 배양에서 상기 화합물의 생산 추정치를 얻기 위해 화합물을 정량화 하였다.
NO. Compound RT TMS Ion fragment (m/z)
Alcohols
1 Glycerol 13.40 3 103, 117, 205, 299
2 Glycerol-3-phosphate 27.95 4 103, 299, 357, 445
3 Myo-inositol 39.28 6 191, 217, 305, 318
4 Myo-inositol phosphate 47.53 7 217, 299, 318, 387
Amino acids
5 Alanine 8.80 2 100, 116, 133, 190
6
Figure 112020085244773-pat00001
-Alanine		 17.26 3 86, 174, 248, 290
7 Asparagine 22.21 2 100, 116, 130, 159
24.77 3 116, 132, 188, 231
8 Aspartic acid 19.77 3 100, 202, 218, 232
9 Cysteine 20.84 3 100, 132, 220, 294
10 Glutamic acid 23.10 3 128, 156, 218, 246
11 Glutamine 28.26 3 128, 156, 245, 347
12 Glycine 14.17 3 86, 133, 174, 248
13 Histidine 32.88 3 154, 218, 254, 356
14 Isoleucine 13.85 3 158, 180, 218, 299
15 Lysine 33.16 4 128, 156, 230, 317
16 Proline 13.94 2 99, 133 ,142, 216
17 Pyroglutamic acid 19.64 2 156, 230, 258, 273
18 Serine 12.90 2 57, 103, 116, 132
15.66 3 100, 188, 204, 218
19 Threonine 16.30 3 101, 117, 218, 291
20 Tryptophan 42.78 3 100, 202, 218, 291
21 Valine 8.44 1 55, 72, 146, 156
11.79 2 100, 144, 145, 218
Fatty acids
22 Glycerol monostearate 54.12 2 57, 129, 205, 399
23 Linoleic acid 42.95 1 81, 117, 129, 337
24 α-Linoleic acid 43.10 1 79, 95, 108, 129
25 Palmitic acid 37.98 1 117, 132, 145, 313
26 Stearic acid 43.84 1 117, 129, 132, 341
Organic acids
27 Citric acid 29.82 4 273, 347, 363, 375
28 Erythronic acid 20.49 4 117, 205, 220, 292
29 Fumaric acid 15.45 2 115, 133, 143, 245
30 Glyceric acid 14.87 3 103, 133, 189, 292
31 3-Hydroxy-3-methyl glutaric acid 22.44 3 115, 231, 247, 273
32 2-Keto-D-gluconic acid 18.56 4 103, 117, 205, 234
33 Malic acid 18.83 3 101, 175, 190, 233
34 Succinic acid 14.47 2 55, 129, 172, 247
Phenolics
35 Caffeic acid 40.93 3 191, 219, 381, 396
36 p-Coumaric acid 33.70 2 218, 249, 293, 308
37 Ferulic acid 39.41 2 249, 308, 323, 338
Sugars
38 Fructose 29.29 5 129, 217, 257, 437
31.48 5(MEOX) 103, 133, 217, 307
39 Galactose 32.47 5 129, 191, 204, 217
40 Glucose 32.11 5 129, 191, 204, 217
32.27 5(MEOX) 160, 205, 217, 319
41 Sucrose 51.81 8 217, 271, 361, 437
Others
42 γ-Aminobutyric acid (GABA) 20.01 3 86, 174, 216, 304
43 Phosphoric acid 13.28 3 133, 211, 299, 314
44 Serotonine 48.46 4 86, 174, 290, 449
45 Suberylglycine 23.30 3 188, 216, 231, 303
46 Threonic acid 20.50 4 117, 205, 220, 292
47 Threonic acid-1,4-lactone 15.92 2 101, 116, 131, 247
48 Tryptamine 42.90 3 86, 100, 174, 361
NO. Compound Control 0.05 mM 0.1 mM 0.2 mM 0.5 mM 1 mM
Alcohols
1 Glycerol 3.47 ± 0.72 4.58 ± 0.88 4.49 ± 0.37* 3.18 ± 0.72 3.76 ± 1.31 21.39 ± 9.00*
2 Glycerol-3-phosphate 1.55 ± 0.30 3.00 ± 0.43* 3.96 ± 0.39* 4.51 ± 0.64* 5.51 ± 0.70* 5.13 ± 0.68*
3 Myo-inositol 1.17 ± 0.18 1.48 ± 0.14* 1.38 ± 0.37 1.44 ± 0.18* 1.76 ± 0.16* 1.47 ± 0.42
4 Myo-inositol phosphate 2.51 ± 0.63 3.78 ± 0.74* 5.94 ± 0.68* 6.61 ± 1.07* 10.18 ± 1.72* 2.28 ± 0.42
Amino acids
5 Alanine 19.82 ± 5.20 22.15 ± 4.01 15.53 ± 4.31 23.97 ± 6.21 29.02 ± 12.02 36.21 ± 21.16
6
Figure 112020085244773-pat00002
-Alanine		 1.21 ± 0.35 2.66 ± 0.75* 2.47 ± 0.30* 3.43 ± 0.39* 3.17 ± 0.43* 3.61 ± 1.06*
7 Asparagine 125.41 ± 18.93 109.92 ± 8.78 103.85 ± 7.30* 106.28 ± 12.60* 96.15 ± 13.40* 0.17 ± 0.02*
8 Aspartic acid 3.38 ± 1.89 5.82 ± 1.96 2.79 ± 2.06 6.85 ± 0.55* 5.57 ± 1.82* 0.44 ± 0.10*
9 Cysteine 6.15 ± 1.43 3.59 ± 1.64* 5.99 ± 2.43 4.76 ± 2.76 5.78 ± 1.72 1.40 ± 0.11*
10 Glutamic acid 16.64 ± 4.19 30.99 ± 8.61* 16.47 ± 3.11 33.79 ± 6.33* 18.56 ± 3.01 0.21 ± 0.06*
11 Glutamine 229.77 ± 18.65 218.59 ± 7.87 211.77 ± 17.72 231.31 ± 17.66 233.15 ± 15.80 85.92 ± 8.97*
12 Glycine 3.88 ± 0.74 5.44 ± 0.85* 4.30 ± 0.42 4.90 ± 0.68* 6.16 ± 0.92* 6.24 ± 1.30*
13 Histidine 6.00 ± 1.28 5.51 ± 0.68 4.41 ± 1.12* 4.38 ± 0.50* 5.22 ± 0.68 ND
14 Isoleucine 9.03 ± 2.18 12.02 ± 3.67 8.00 ± 2.07 10.09 ± 0.62 7.48 ± 1.04 13.56 ± 2.28*
15 Lysine 0.58 ± 0.08 0.77 ± 0.19 0.64 ± 0.09 0.61 ± 0.10 0.30 ± 0.04* ND
16 Proline 0.67 ± 0.19 1.09 ± 0.39* 0.98 ± 0.32* 2.02 ± 0.38* 3.34 ± 1.22* 4.97 ± 1.04*
17 Pyroglutamic acid 99.97 ± 7.12 87.11 ± 9.48* 78.62 ± 16.65* 95.27 ± 13.34 112.54 ± 10.97* 40.24 ± 2.72*
18 Serine 5.29 ± 2.72 10.82 ± 5.67* 4.97 ± 0.83 12.60 ± 2.98* 9.42 ± 1.96* 5.26 ± 1.16
19 Threonine 7.95 ± 1.28 11.41 ± 2.82* 8.94 ± 0.84 11.38 ± 1.16* 9.66 ± 0.60* 3.91 ± 0.94*
20 Tryptophan 4.79 ± 1.01 4.90 ± 0.82 3.86 ± 1.40 3.74 ± 0.42* 2.42 ± 0.24* 0.84 ± 0.30*
21 Valine 23.28 ± 4.66 26.41 ± 3.41 22.76 ± 3.57 26.39 ± 3.04 33.43 ± 4.77* 30.75 ± 3.60*
Fatty acids
22 Glycerol monostearate 4.85 ± 1.37 7.76 ± 1.20* 8.65 ± 1.28* 7.79 ± 2.74* 7.21 ± 1.55* 5.54 ± 1.76
23 Linoleic acid 0.57 ± 0.15 0.55 ± 0.09 0.83 ± 0.08* 0.80 ± 0.06* 0.72 ± 0.05* 0.70 ± 0.28
24 α-Linoleic acid 2.66 ± 0.78 3.08 ± 0.49 4.79 ± 0.74* 4.21 ± 0.37* 3.41 ± 0.45* 2.00 ± 1.22
25 Palmitic acid 3.31 ± 0.58 3.38 ± 0.52 4.47 ± 0.30* 3.97 ± 0.26* 4.35 ± 0.38* 18.97 ± 2.46*
26 Stearic acid 0.61 ± 0.14 0.63 ± 0.08 0.79 ± 0.10* 0.76 ± 0.10* 0.77 ± 0.12* 2.53 ± 0.31*
Organic acids
27 Citric acid 16.89 ± 1.69 17.86 ± 2.61 14.33 ± 1.35* 14.94 ± 2.19 5.56 ± 1.94* ND
28 Erythronic acid 0.35 ± 0.06 0.40 ± 0.05 0.31 ± 0.05 0.41 ± 0.04* 0.34 ± 0.04 0.26 ± 0.04*
29 Fumaric acid 9.94 ± 2.90 16.70 ± 3.47* 12.16 ± 1.02 13.87 ± 1.00* 17.38 ± 1.89* 10.34 ± 0.88
30 Glyceric acid 0.69 ± 0.11 0.82 ± 0.09* 0.61 ± 0.14 0.64 ± 0.13 0.43 ± 0.05* 0.17 ± 0.02*
31 3-Hydroxy-3-methyl glutaric acid 13.19 ± 4.10 11.68 ± 4.13 4.06 ± 1.27* 6.88 ± 0.98* 2.63 ± 1.29* 0.38 ± 0.23*
32 2-Keto-D-gluconic acid 0.51 ± 0.08 0.67 ± 0.10* 0.69 ± 0.13* 0.72 ± 0.20* 0.78 ± 0.27* 0.27 ± 0.08*
33 Malic acid 4.06 ± 0.69 4.69 ± 1.42 2.24 ± 0.22* 3.55 ± 0.38 2.38 ± 0.16* 0.23 ± 0.04*
34 Succinic acid 1.16 ± 0.17 1.84 ± 0.54* 1.31 ± 0.31 1.37 ± 0.32 1.05 ± 0.08 0.35 ± 0.03*
Phenolics
35 Caffeic acid 0.24 ± 0.06 0.23 ± 0.04 0.27 ± 0.03 0.37 ± 0.06* 0.30 ± 0.03* ND
36 p-Coumaric acid 1.68 ± 0.31 1.84 ± 0.57 1.19 ± 0.11* 1.50 ± 0.14 1.22 ± 0.14* 0.98 ± 0.28*
37 Ferulic acid 0.50 ± 0.20 0.80 ± 0.10* 0.98 ± 0.19* 0.93 ± 0.13* 0.78 ± 0.14* 0.33 ± 0.05
Sugars
38 Fructose 160.14 ± 26.13 156.28 ± 13.87 118.18 ± 17.49* 149.31 ± 12.36 145.25 ± 23.11 197.05 ± 44.22*
39 Galactose 0.84 ± 0.15 0.57 ± 0.05* 0.54 ± 0.07* 0.41 ± 0.03* 0.45 ± 0.17* 0.84 ± 0.36
40 Glucose 284.90 ± 41.32 320.23 ± 72.82 198.86 ± 28.87* 277.29 ± 51.87 242.20 ± 34.96 745.75 ± 146.48*
41 Sucrose 361.83 ± 53.90 336.15 ± 31.19 336.21 ± 23.40 340.81 ± 49.04 319.94 ± 28.18 297.29 ± 58.31*
Others
42 γ-Aminobutyric acid (GABA) 67.46 ± 14.80 123.86 ± 43.57* 89.16 ± 17.37* 137.79 ± 29.05* 230.14 ± 70.29* 237.82 ± 33.13*
43 Phosphoric acid 65.00 ± 6.56 80.25 ± 12.16* 100.54 ± 7.87* 97.59 ± 13.90* 276.38 ± 54.82* 219.9 ± 15.36*
44 Serotonine 37.78 ± 3.66 34.83 ± 4.60 35.30 ± 5.33 37.64 ± 5.28 29.57 ± 4.17* 1.86 ± 0.21*
45 Suberylglycine 61.94 ± 7.70 43.90 ± 15.27* 39.28 ± 5.02* 41.39 ± 2.85* 32.70 ± 5.07* 2.09 ± 0.73*
46 Threonic acid 3.06 ± 0.39 2.93 ± 0.22 2.90 ± 0.33 3.02 ± 0.44 2.21 ± 0.58* 0.38 ± 0.20*
47 Threonic acid-1,4-lactone 0.38 ± 0.05 0.51 ± 0.04* 0.40 ± 0.03 0.41 ± 0.07 0.28 ± 0.03* 0.17 ± 0.02*
48 Tryptamine 8.53 ± 1.46 7.72 ± 2.36 8.70 ± 1.04 7.37 ± 0.77 8.02 ± 0.49 9.67 ± 1.36
<실시예 3> 다양한 에테폰 처리농도에 따른 좀개구리밥 배양에서 가바 및 페룰산의 생산량 확인
도 4 및 표 4를 참고하면 단위세포에서 카페인산의 상대적 수준이 증가하였으나, 에테폰 처리에 의해 카페인산의 유의한 감소가 확인됨에 따라, GABA 및 페룰산의 생산 수준을 확인하였다.
동물에 있어서, 가바는 중추신경 시스템의 신경전달물질로 알려져있으며, 식물에서는 세포 신호전달에 작용하고, 환경 스트레스에 반응하여 축적된다. 또한, 불면증, 기면증 및 뇌전증 치료에 있어서, 이완 및 호르몬 조절자로 사용된다.
또한, 페룰산은 천연 페놀로 항산화에 중요한 역할을 한다. 앞선 보고에 따르면, 번행초 (Tetragonia tetragonioides)에서 추출된 페눌산은 미백 및 주름 개선 효과를 나타내었으며, 표피에서 페룰산을 아스코르브산 및 α-토코페롤과 병용처리할 경우, 티민이량체 형성 및 ROS의 저해를 유도하는 것으로 확인되었다.
표 4를 참고하면 GABA 및 페룰산의 생산량은 각각 1.599에서 5.041 mg/L 및 0.129에서 0.640 mg/L 수준이었다. 그러나 0.5 mM 에테폰 처리군에서 5.041 ± 1.373 mg/L, 0.2 mM 에테폰 처리군에서 3.394 ± 0.895 mg/L 및 0.05 mM 에테폰 처리군에서 3.101 ± 0.808 mg/L의 높은 GABA 생산이 확인되었다.
상기 결과로부터 0.5 mM 에테폰은 GABA 생산 증가를 위한 최적의 농도인 것이 확인된 반면, 1 mM 에테폰은 GABA 생산을 증가시키지 못한 것이 확인되었다.
또한, 페룰산은 0.2 mM 에테폰 처리군에서 가장 높은 생산량 (0.640 ± 0.071 mg/L)이 확인되었다. 1 mM 처리군을 제외하고, 페룰산은 모든 처리군에서 생산량이 유의하게 증가하였다.
상기 결과로부터 0.2 mM 에테폰이 처리된 좀개구리밥 배양은 페룰산 생산을 향상시키므로, 화장품 및 의약품 산업에 유용하게 사용될 수 있음이 확인되었다.
Compounds (mg/L) Control 0.05 mM 0.1 mM 0.2 mM 0.5 mM 1 mM
γ-Aminobutyric acid (GABA) 1.655 ± 0.551 3.101 ± 0.808* 2.296 ± 0.789 3.394 ± 0.895* 5.041 ± 1.373* 1.599 ± 0.589
Caffeic acid 0.270 ± 0.003 0.255 ± 0.013* 0.233 ± 0.013* 0.270 ± 0.009 0.225 ± 0.036* ND
Ferulic acid 0.432 ± 0.077 0.592 ± 0.033* 0.600 ± 0.084* 0.640 ± 0.071* 0.571 ± 0.024* 0.129 ± 0.037*
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 에테폰을 유효성분으로 함유하는 배지에서 좀개구리밥을 21 내지 35일 동안 배양하는 단계를 포함하는 좀개구리밥의 페룰산 생산 증진방법으로,
    상기 에테폰은 배지 중 0.05 내지 0.2 mM 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 페룰산 생산 증진방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 에테폰은 좀개구리밥의 가바 (gamma-aminobutyric acid) 생산을 추가로 더 증진시키는 것을 특징으로 하는 페룰산 생산 증진방법.
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