KR102472643B1 - 고처리율 스크리닝에서의 사용에 적합한 신규 이중특이적 포맷 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 이중특이적 단백질 복합체, 및 이 복합체를 사용하여 상승적이거나 신규한 생물학적 기능을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 이중특이적 포맷은 그의 모든 성분들이 세포로부터 개별 유닛들(units)로서 발현될 수 있고 상기 유닛들이 접합 또는 커플링 화학반응을 이용하는 일 없이 단순히 혼합에 의해 조립될 수 있기 때문에 고처리율 스크리닝에 특히 적합하다.

Description

고처리율 스크리닝에서의 사용에 적합한 신규 이중특이적 포맷{NEW BISPECIFIC FORMAT SUITABLE FOR USE IN HIGH-THROUGH-PUT SCREENING}
본 개시내용은 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 생물학적 기능을 탐지하는 방법, 특히 시험관내/생체외 방법, 상기 이중특이적 단백질 복합체의 라이브러리/다중체(multiplex), 및 이의 키트 및 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 개시내용은 상기 신규 이중특이적 단백질 복합체, 그리고 요법, 연구 및 실험 목적(특히, 상승적인 생물학적 기능을 찾는 분석법)에서의 상기 복합체의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 개시내용은 상기 이중특이적 복합체를 제조하는 방법까지 확장된다.
생체내 생물학적 기작은 해석하고 이해하기 어려운, 극도로 복잡한 신호의 캐스케이드이다. 이러한 신호전달의 일례는 T 세포의 활성화에 필요한 신호전달이 있다(도 1 참조, 출처 www.cellsignal.com). T 세포의 활성화는 2 이상의 신호를 필요로 한다.
T 세포 수용체에 의한 항원의 인식은 제1 신호로서 간주되고, 제2 신호는 T 세포 상의 추가 표면 분자와 항원 제시 세포 상의 추가 분자의 라이게이션으로부터 비롯된 동시자극으로부터 발생한다.
따라서, T 세포 활성화는 생물학적 기능의 조절이 다수의 신호들을 필요로 할 수 있다는 것을 예시하는 데에 이용될 수 있다. 다른 생물학적 과정들은 동등하게 복잡하거나 더 복잡하다. 세포에 기초한 시험관내 스크리닝은 생체내 기작을 파악하는 데에 도움을 줄 수 있지만, 생물학적 기능을 조절하는 적절한 리간드 쌍을 어떻게 확인할 것인라는 문제점이 여전히 발생한다.
이중특이적 항체들은 차세대 생물치료에서 주된 역할을 수행할 것으로 크게 기대된다(D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798). 이들은 더 큰 비율의 환자들에 있어서 더 우수한 장기간의 광범위한 효능을 전달할 잠재력을 가진다. 이는, 공통된 질환 경로 내에서 동시에 상이한 항원들을 공동-결합(co-engaging)시켜 불필요한 중복을 감소시킴으로써, 또는 독립적인 경로들로부터의 항원들을 표적화하여 가산적 또는 상승적 효과를 제공함으로써 달성될 수 있다.
이중특이적 항체는 하기와 같은 신규한 생물학에 대한 접근을 용이하게 한다:
1) 세포 상의 수용체들을 교차연결하는 것,
2) 세포 매개 효과를 유도하는 것,
3) 사이토카인을 세포에 편재화하여 신호전달을 조절하거나 사이토카인 기능을 국소적으로 차단하는 것, 및
4) 다수의 에피토프들과 동시에 맞물려, 단일 단일클론 항체 또는 연결되지 않은 항체들의 실제 혼합물('다중-단일클론')에 의해 나타날 수 없는 "신규 활성"을 생성하거나 기능 또는 특이성을 증가시키는 것.
이중 표적을 맞물리게 하는 현재의 방법은 주로 공지된 기작의 합리적인 디자인에 기초하고 억제 수용체들의 교차연결, 수용체들의 공동-맞물림/클러스터링, 다수의 자극 경로들의 차단, 억제 수용체들의 선택적 맞물림 및 상이한 경로들, 예컨대, 동시자극 및 사이토카인 신호전달의 차단을 포함한다. 그러나, 공지된 기작 및 표적과 관련된 현재 기술 수준은 이 분야에서 진보하기 위한 제한 요인이다.
이중특이적 항체들은 생물학적 치료제로서 거대한 잠재력을 갖지만, 이들은 단일클론 항체에 비해 발견 및 개발 내에서 증가된 도전과제 세트도 제시한다. 어려운 두 가지 핵심 영역들은 1) 성공적인 이중특이적 항체 포맷의 개발, 및 2) 이중특이적 항체가 교차연결하거나 공동-맞물릴 표적 쌍의 선택이다.
DVD-Ig(Abbvie), 듀오바디스(DuoBodies)(Genmab), 놉스-인-홀스(Knobs-in-Holes)(Genentech), 및 커몬 경쇄(Common light chain)(Merus)를 비롯한, 성공적인 치료제로서 잠재적으로 작용할 수 있는 많은 유망한 이중특이적 항체 포맷들이 현재 개발되어 있다. 그러나, 이들 경우들 각각에서 이들 포맷들은 이중특이적 항체와 교차연결될 신규 항원 쌍들의 발견을 가능하게 하는 고처리율 표적-이중-항원 발견 스크리닝에 이상적으로 적합하지 않다.
전형적으로, 2개 이상의 가변 영역들이 발견 벡터의 원천 공급원(예를 들면, 파지 디스플레이, 하이브리도마 또는 단일 B 세포 클로닝)으로부터 적절한 이중특이적 발현 벡터 내로 서브클로닝될 필요가 있는 단일 이중특이적 항체 구축물의 경우, 상기 이중특이적 항체의 각각의 아암(arm)이 발현되어야 하고 생성 이중특이적 항체가 정제되어야 한다. 다수의 가변 영역 쌍들이 발견된 가변 영역들의 가장 효율적인 조합에 대해 스크리닝하거나 신규 항원 쌍을 발견하기 위한 시도에서 조합되어야 하는 경우 이 클로닝 및 후속 발현 노력은 곧 상당한 실질적 장애가 된다.
예를 들면, 50개의 세포 표면 표적들의 패널에 대해 50개의 독특한 항체들이 발견되는 경우, 총 2500개의 이중특이적 항체들이 잠재적으로 생성될 수 있다(X-by-Y 격자로서 예상됨). 전술된 이중특이적 항체 포맷을 사용하는 경우, 이것은 100개 이상의 개별 클로닝 반응들(50-X 및 50-Y)에 이은 2500회 항체 발현 실험들을 요구할 것이다. 출발 단일클론 항체의 수를 100까지 증가시키는 것은 클로닝 반응의 최소 수를 200(100-X 및 100-Y)으로 증가시키고 발현 횟수를 10,000까지 증가시킬 것이다.
일반적으로, 이 '발현 장애'의 근원은 전술된 포맷이 최종 이중특이적 구축물의 단백질 쇄 '절반들' 둘 다로 하여금 동일한 세포에서의 단일 발현 실험 내에서 동시에 발현될 것을 요구한다는 사실이다. 따라서, 많은 포맷들의 경우, 2500개의 이중특이적 항체들을 생성하기 위해 2500회의 발현 실험들이 요구된다.
클로닝 실험의 횟수가 상기 소정의 횟수에 대해 각각 2500 및 10,000일 것이기 때문에 이중특이적 항체 포맷이 단일시스트론성(monocistronic)을 가진(즉, 단일 쇄 단백질로서 클로닝되고 발현되는) 경우, 예를 들면, 단일 쇄 디아바디인 경우 '발현 장애'는 더 악화된다.
더욱이, 발현 후, 원하는 구축물을 단리하기 위해 광범위한 정제가 요구될 수 있다.
일부 이중특이적 방법들은 클로닝의 양을 감소시키기 위해 이중특이적 구축물에서 공통된 경쇄를 사용하지만, 이것은 발현 실험의 횟수를 감소시키지 않는다. 더욱이, 항체가 한 쇄, 예컨대, 중쇄만을 통해 충분히 높은 친화도로 그의 항원에 결합할 필요가 있으므로 출발 항체 가변 도메인을 찾는 것이 더 어렵기 때문에 공통된 쇄, 예컨대, 공통된 경쇄의 사용은 항체 발견이라는 도전과제를 더 힘들게 만든다.
따라서, 신규 항원 쌍을 확인하기 위한 현재 이중특이적 포맷의 대규모 사용 및 고처리율 스크리닝은 비현실적이고 이중특이적 항원 표적화에의 가설-유도된 접근법만의 연속된 이용을 초래하였다.
본 발명자들은 2개의 공지된 표적들 상의 소정의 에피토프들과 맞물리는 이중특이적 항체의 제한된 선택을 디자인하고 시험하기 보다는 오히려 오직 이중특이적 항체들 또는 단백질 리간드들의 큰 다양한 조합 패널을 사용한 넓은 기능 스크리닝 노력을 통해 이중특이적 항체를 사용한 신규 생물학에의 접근을 개척할 진정한 잠재력을 달성할 수 있다는 것을 제안한다. 이 스크리닝을 용이하게 하기 위해, 다양한 기능 스크린들에서 용이하게 구축될 수 있고 기능적 효과에 대해 용이하게 스크리닝될 수 있는 다수의 다양한 이중특이적 단백질들의 생성을 가능하게 하는 포맷 및 방법이 요구된다. 이 방법은 상승적인 쌍들의 뜻하지 않는 확인을 가능하게 한다.
따라서, 다양한 항원 특이성들의 조합물로서 제공된 다수의 이중특이적 단백질 복합체들을 생성하고 스크리닝하는 것이 유용할 것이다. 특히, 다수의 상이한 이중특이적 항체 복합체들을 신속하고 효율적인 방식으로 생성하고 스크리닝할 수 있는 것이 유용할 것이다. 이미 전술된 바와 같이 이중특이적 항체를 제조하는 다양한 기존 방법들이 존재한다. 그러나, 이들 방법들 각각은 이하에 더 상세히 더 기재된 바와 같이 대안적인 방법이기 때문에 그의 단점을 가진다.
이중특이적 구축물 및 다중특이적 구축물에 대한 표적을 어떻게 효율적으로 확인할 것이라는 문제점은 당분야에서 적절히 다루어지고 있지 않다. 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2014/001326호는 단백질과 DNA 단편의 화학적 접합을 이용하는데, 이때 상기 DNA 단편은 2개 이상의 표적화 물질들을 포함하는 맞춤형 환자 특이적 다중특이적 분자를 생성하기 위해 2개의 이러한 단백질들을 연결하는 상보적 DNA 서열에 혼성화한다. 이 방법이 신규 이중특이적 조합물을 확인하는 데에 적용될 경우 이 방법과 관련된 다수의 어려움들이 존재하는데, 예를 들면, 단백질과 DNA의 접합은 단백질의 활성 및/또는 구조에 대한 손상을 초래할 수 있다. 특히, 단백질-DNA 하이브리드는 천연적으로 생성되지 않으므로, 간섭에 대한 잠재력이 존재한다. 추가로, 단백질과 DNA를 연결하기 위해 요구된 화학적 접합은 복잡성, 시간 및 비용을 공정에 부가한다.
항체 약물 접합체를 생성하기 위한 커플링 및 접합 기법 및 생체내 표적화 기술이 존재한다. 전통적인 화학적 교차연결은 관련 종들이 동종이량체 및 다른 원치 않는 부산물로부터 정제될 필요가 있을 수 있기 때문에 노동 집약적이다. 또한, 화학적 변경 단계는 단백질의 통합성을 변경시킴으로써, 좋지 않은 안정성 또는 변경된 생물학적 기능을 유발할 수 있다. 결과적으로, 화학적 가교연결에 의한 이중특이적 항체의 생성은 종종 비효율적이고 항체 활성의 손실을 초래할 수도 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 또 다른 방법은 세포-융합(예를 들면, 하이브리드 하이브리도마)이고, 이때 조작된 세포는 무작위적으로 조립하는 2개의 항체 중쇄들 및 2개의 항체 경쇄들을 발현한다. 선택될 4개의 가능한 변이체들이 존재하기 때문에, 이것은 10개의 가능한 이중특이적 항체 조합물들의 생성을 야기하고, 이들 중 단지 일부(많은 경우들에서 단지 1개의) 조합물들이 원하는 조합물들일 것이다. 따라서, 세포-융합에 의한 이중특이적 항체의 생성은 낮은 생성 수율을 초래하고 원하는 이중특이적 항체를 생성된 다른 이중특이적 항체로부터 단리하기 위해 추가 정제 단계도 요구한다. 이들 단점들은 제조 시간 및 비용을 증가시킨다.
재조합 DNA 기법도 이중특이적 항체를 생성하는 데에 이용되고 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 기법도 '놉 인투 홀' 이중특이적 항체를 생성하는 데에 이용되고 있다. '놉 인투 홀' 기법은 CH3 도메인 계면에서 다량체화 도메인 내의 입체적으로 상보적인 돌연변이를 조작하는 단계를 포함한다(예를 들면, 문헌(Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-621 (1996)) 및 문헌(Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)) 참조; 미국 특허 제5,731,168호 및 제7,183,076호 또한 참조). 이 방법의 한 요건은 2개의 모 항체들의 경쇄들이 동일한 세포에서 발현될 때 원치 않는 분자 및/또는 불활성 분자의 미스페어링(mispairing) 및 형성을 방지하기 위해 동일해야 한다는 점이다. 각각의 이중특이적 항체(이의 중쇄 및 경쇄)는 단일 세포에서 발현되어야 하고 단백질 생성물은 일반적으로 추후에 정제에 의해 제거되는 약 20%의 동종이량체를 함유한다.
다른 방법은 전장 IgG4 분자(젠맙 듀오바디)에서의 천연 쇄 교환에 기초한다. 그러나, 이 방법도 Fc 영역 없이 구축물이 제조될 수 있게 하지 않기 때문에 어려움을 가진다. Fc 영역은 생물학적 활성에 기여할 수 있기 때문에, 관찰된 활성이 가변 영역들의 조합에 기초한 것인지, Fc에 기초한 것인지, 아니면 Fc를 포함하는 이중특이적 분자에 기초한 것인지를 확립하는 것은 어려울 수 있다. 더욱이, 교환은 동적 과정이고 이것은 실제로 시험된 물질이 무엇인지와 관련하여 어려움을 초래할 수 있다.
이중특이적 항체의 더 효율적이고 더 빠른 고처리율 스크리닝을 가능하게 하는 이중특이적 단백질 복합체를 생성하는 신규 방법이 필요하다. 특히, 예를 들면, 동종이량체의 형성을 피하거나 최소화하면서 사용가능한 항체 또는 항체 단편들의 풀(pool)로부터 임의의 2개의 항체들 또는 항체 단편들의 선택을 용이하게 조합하여 상이한 이중특이적 항체들의 다중체를 효율적으로 생성할 수 있는 포맷 및 방법이 필요하다. 항체 특이성들의 신규 조합에 대한 상승적인 생물학적 기능에 대해 스크리닝하는 경우, 특히 이종이량체가 그 기능을 발견하기 위해 필수적인 경우 상이한 이중특이적 항체들의 효율적인 조립은 특히 중요하다.
한 양태에서, 모든 성분들이 본질적으로 응집 없이 개별 유닛들로서 세포로부터 발현될 수 있고 상기 유닛들이 접합 또는 커플링 화학반응을 이용하지 않고 동종이량체화를 최소화하는 혼합에 의해 단순히 조립될 수 있기 때문에 스크리닝에서 사용되기에 특히 적합한 신규 이중특이적 포맷이 제공된다.
따라서, 식 A-X:Y-B를 갖는 이중특이적 단백질 복합체로서,
상기 식에서
A-X는 제1 융합 단백질이고;
Y-B는 제2 융합 단백질이며;
X:Y는 이종이량체성(heterodimeric)-테터(tether)이고;
:은 X와 Y 사이의 결합 상호작용이며;
A는 Fab 또는 Fab' 단편으로부터 선택된 이중특이적 단백질 복합체의 제1 단백질 성분이고;
B는 Fab 또는 Fab' 단편으로부터 선택된 이중특이적 단백질 복합체의 제2 단백질 성분이며;
X는 항원 또는 항체 또는 이의 결합 단편으로부터 독립적으로 선택된 결합 쌍의 제1 결합 파트너이고;
Y는 항원 또는 항체 또는 이의 결합 단편으로부터 독립적으로 선택된 결합 쌍의 제2 결합 파트너이며;
단, X가 항원인 경우 Y는 X로 표시된 항원에 대해 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편이고, Y가 항원인 경우 X는 Y로 표시된 항원에 대해 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편인, 이중특이적 단백질 복합체가 제공된다.
한 실시양태에서, 변수 X 또는 Y는 항체 결합 단편, 예컨대, scFv, Fv, VH, VL 또는 VHH이고 다른 변수는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 변수 X 또는 Y는 scFv 또는 VHH이고 다른 변수는 펩티드이다.
따라서, 이중특이적 포맷은 예를 들면, 항체 결합 단편(예컨대, scFv 또는 VHH) 및 펩티드 결합 상호작용에 의해 그들의 C-말단을 통해 연결된 상이한 특이성을 가진 2개의 Fab 아암들을 포함한다. 유닛 A-X 또는 유닛 B-Y를 발현하는 어려움이 없기 때문에 이 유형의 정렬은 스크리닝에서 사용되기에 이상적이다. Fab/Fab' 단편은 매우 안정하고 부적절한 이량체화에 민감하지 않다. 따라서, 각각의 유닛(A-X 또는 B-Y)의 발현 후 요구된 정제의 양은 최소한이거나 사실상 불필요하다. 이중특이적 복합체는 관련 유닛들을 단순히 혼합함으로써, 즉 접합 및 커플링 화학반응에 의존하지 않고 1:1 몰 비로 형성될 수 있다. Fab/Fab' 단편에서 불변 영역은 Fab/Fab' 성분들의 이량체화를 유도하고 결합 파트너 X 및 Y는 필요한 이종이량체 이중특이적 복합체를 형성하는 데에 더 유리하도록 평형을 유도한다. 마찬가지로, 이종이량체화 후 복합체의 형성 후 정제가 거의 또는 전혀 요구되지 않는다. 따라서, 다수의 A-X 및 B-Y가 용이하게 제조될 수 있고 조합될 수 있다.
복합체에서 Fab/Fab' 물질은 결합 도메인들이 고전적인 항체 기하구조를 모방하는 생물학적으로 적절한 배향으로 유지되어 있다는 것을 의미하고 이것은 본 명세서에 후술된 스크리닝 방법에 의해 확인된 가변 영역들의 쌍을, 활성을 보유하는 다른 이중특이적 치료 포맷으로 성공적으로 전환하는 데에 기여할 수 있다. Fc 단편 CH2-CH3을 결여하는 이중특이적 복합체를 제조하고 스크리닝하는 능력도 관찰된 생물학적 활성이 사실상 오로지 상기 복합체의 가변 영역 쌍에 기인한다는 것을 보장한다. 본 발명의 이중특이적 복합체 및 이의 제조 방법의 단순성은 신규 표적 항원 조합을 찾고 소정의 조합에 대해 가변 영역 서열을 최적화하기 위한 가변 도메인 쌍의 고처리율 스크리닝을 용이하게 한다는 면에서 큰 장점이다.
한 실시양태에서, A는 Fab 단편이다. 한 실시양태에서, B는 Fab 단편이다. 한 실시양태에서, A 및 B는 둘 다 Fab 단편(본 명세서에서 Fab-Kd-Fab로서도 지칭됨)이다.
한 실시양태에서, X는 Fab 또는 Fab' 단편 내의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단, 특히 중쇄의 C-말단에 융합되어 있다.
한 실시양태에서, Y는 Fab 또는 Fab' 단편 내의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단, 특히 중쇄의 C-말단에 융합되어 있다.
한 실시양태에서, X는 scFv, VHH 및 펩티드로부터 독립적으로 선택되고, 단, X가 펩티드인 경우 Y는 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, scFv 또는 VHH이고, X가 scFv 또는 VHH인 경우 Y는 항원, 예컨대, 펩티드이다.
한 실시양태에서, Y는 scFv, VHH 및 펩티드로부터 독립적으로 선택되고, 단, Y가 펩티드인 경우 X는 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, scFv 또는 VHH이고, Y가 scFv 또는 VHH인 경우 X는 항원, 예컨대, 펩티드이다.
한 실시양태에서, (결합 파트너들 중 하나인) 펩티드는 길이 면에서 5 ∼ 25 개 아미노산 범위 내에 있다.
한 실시양태에서, X와 Y 사이의 결합 친화도는 5 nM이거나 더 강하고, 예를 들면, 이종이량체성 테터의 결합 친화도는 900 pM이거나 더 강하고, 예컨대, 800, 700, 600, 500, 400 또는 300 pM이다.
한 실시양태에서, X 또는 Y는 펩티드 GCN4에 대해 특이적인 scFv 또는 VHH이고, 예를 들면, scFv는 52SR4(서열번호 3, 또는 서열번호 3의 아미노산 1-243)이다.
한 실시양태에서, X 또는 Y는 펩티드 GCN4(서열번호 1, 또는 서열번호 1의 아미노산 1-38))이다.
한 실시양태에서, A 및/또는 B는 세포 표면 수용체, 예컨대, T 세포 또는 B 세포 신호전달 수용체, 동시자극 분자, 체크포인트(checkpoint) 억제제, 자연 살해 세포 수용체, 면역글로불린 수용체, 면역글로불린-유사 수용체, 메탈로프로테아제(metalloproteases)의 매트릭스 메탈로프로테아제 및 막 유형 매트릭스 메탈로프로테아제 조직 억제제, TNFR 패밀리 수용체, B7 패밀리 수용체, 유착 분자, 인테그린, 사이토카인/케모카인 수용체, GPCR, 성장 인자 수용체, 키나제 수용체, 조직 특이적 항원, 암 항원(종양 관련 항원 및 펩티드), 병원체 인식 수용체, 보체 수용체, 호르몬 수용체, 스캐빈저(scavenger) 수용체, 또는 가용성 분자, 예컨대, 사이토카인, 케모카인, 류코트리엔, 성장 인자, 호르몬 또는 효소, 또는 이온 통로(하나 이상의 에피토프를 포함하는 이들의 번역 후 변경된 버전 및 이들의 단편을 포함함)를 포함하는 군으로부터 선택된 항원에 대해 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 하나 이상의 이중특이적 복합체를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물이 제공된다.
나아가, 본 발명자들은
(i) 하나 이상의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질을 포함하는 다중체의 일부 또는 전부에 대한 기능 분석법으로 활성에 대해 시험하는 단계; 및
(ii) 상기 기능 분석법으로부터의 판독결과를 분석하여 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 생물학적 기능을 확인하는 단계
를 포함하는, 식 A-X:Y-B의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법으로서,
X:Y는 예를 들면, X 및 Y가 동종이량체를 형성하기에 부적합한 경우 이종이량체성-테터이고,
A 및 B는 각각 X 및 Y를 지닌 융합 단백질의 형태에서 이중특이적인 성분들인, 방법을 고안하였다.
상기 방법은 식 A-X:Y-B를 가진 신규 이중특이적 단백질 복합체 포맷을 사용하고, 상기 식에서
A-X는 제1 융합 단백질이고;
Y-B는 제2 융합 단백질이며;
X:Y는 이종이량체성-테터이고;
A는 이중특이적 단백질 복합체 포맷의 제1 단백질 성분이며;
B는 이중특이적 단백질 복합체 포맷의 제2 단백질 성분이고;
X는 결합 쌍의 제1 결합 파트너이며;
Y는 결합 쌍의 제2 결합 파트너이고;
:는 X와 Y 사이의 상호작용(예를 들면 결합 상호작용)이고, 특히 상기 상호작용은 복합체를 형성하고 복합체 형태로 융합 단백질을 유지하기에 충분하다.
특히, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체는 시험관내에서 A-X와 B-Y를 혼합함으로써 제조된다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 방법은 A-X와 B-Y를 접촉시키는 시험관내 혼합 단계를 포함한다.
따라서, 일반적으로 융합 단백질 A-X 및 B-Y는 동일한 세포에서 공-발현되지 않는다. 이것은 예를 들면, 100개의 융합 단백질들이 발현되고 임의적으로 정제될 수 있게 하고 다양한 순열로 100개의 융합 단백질들의 후속 혼합이 10,000개의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체들을 제공할 수 있고 이들 중 5,000개가 독특한 쌍이기 때문에 유리하다.
대조적으로, 일부 종래기술의 방법들은 이중특이적 단백질 복합체들의 공동-발현을 요구하므로 10,000개의 복합체들의 경우 10,000회의 형질감염, 발현 및 정제가 요구된다.
그러나, 원하는 경우, A-X 및 B-Y는 동일한 세포에서 발현될 수 있다.
결합 파트너 X 및 Y는 서로에 대한 친화도를 갖고 벨크로(velcro)® 또는 막대와 자석의 생물학적 등가물로서 작용하고 함께 복합체를 지탱한다. 유리하게는, 이것은 융합 단백질 A-X 및 Y-B가 단순히 융합 단백질들을 함께 혼합함으로써 이중특이적 단백질 복합체로 용이하게 조립될 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체는 예를 들면, 격자 유사 방식으로 항원 특이성들의 상이한 조합을 가진 이중특이적 단백질 복합체의 순열들의 큰 패널을 생성하기 위해 2개의 상이한 단백질들이 용이하게 조립될 수 있게 하는 모듈 구조를 가진다. 이것은 가산적, 상승적 또는 신규 생물학적 기능을 탐지하기 위해 다수의 이중특이적 단백질 복합체의 효율적 및 체계적인 스크리닝을 가능하게 한다.
X 및 Y가 서로에 대해 특이적이라고 가정하면, 이것은 동종이량체를 형성하는 능력을 상당히 감소시킨다. X 및 Y는 본 명세서에서 결합 쌍 또는 결합 파트너로서 총칭된다. 한 실시양태에서, X는 다른 X들에 대한 높은 친화도를 갖지 않는다. 한 실시양태에서, Y는 다른 Y들에 대한 높은 친화도를 갖지 않는다. 유리하게는, X 및 Y가 동종이량체를 형성하지 않을 때, 이것은 원치 않는 단일특이적 단백질 복합체의 형성을 방해하고, 원하는 이중특이적 단백질 복합체의 수율을 증가시키고, 단일특이적 단백질 복합체를 제거하기 위한 힘든 정제 단계에 대한 필요성을 제거한다.
이것은 대다수의 종래기술 방법들, 특히 일반적으로 광범위한 정제 단계를 요구하는 종래기술 방법들에 의해 효율적으로 수득될 수 없는 수율 및/또는 순도로 이중특이적 단백질 복합체의 신속한 조립을 가능하게 한다. 이중특이적 복합체의 수율은 본 발명에서 전형적으로 75% 이상이다.
추가로 유리하게는, 이중특이적 단백질 복합체는 복합체의 스크리닝을 가능하게 하고, 이때 (성분 단백질에 의해 결합되는 항원을 비롯한) 성분 단백질들은 공지된 관계를 갖지 않거나 상이한 잠재적으로 무관한 경로들에서 작용하는데, 예컨대, 2개의 상이한 경로들에서 작용하고, 예를 들면, 당업자가 통상적으로 서로 접촉할 것으로 예상하지 않을 2개의 단백질들이 가산적, 상승적 및/또는 신규 기능을 확인하기 위해 이중특이적 단백질 복합체에서 시험될 수 있다.
나아가, 소정의 항원 또는 에피토프에 대한 다수의 결합 영역들(예컨대, 가변 영역들)은 생물학적 기능에서의 미묘한 차이를 확인하기 위해 동시에 조사될 수 있다. 이것은 소정의 한 쌍의 항원들에 대해 유도된 가변 영역 서열들의 조합이 조사되고 최적화될 수 있게 한다.
본 방법은 과학이 결과를 보여줄 수 있게 하고 생물학적 기능에 대한 선입견 및 기술적 편견에 의존하지 않는다.
유리하게는, X 및 Y 성분들은 융합 단백질들의 상이한 순열들로 구성된 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 다중체가 신속히 용이하게 조립될 수 있게 한다.
한 실시양태에서, 단백질 A 및 B는 항체 또는 항체 단편이다. 항체 또는 항체 단편이 X 및 Y를 통해 복합체로서 함께 유지될 때, 이것은 이중특이적 항체 복합체를 형성한다.
도 1은 T 세포의 활성화에 관여된 주요 세포 신호전달 경로들을 보여주는 계략도이다.
도 2는 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체의 구조 및 조립을 보여주는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 이중특이적 항체를 사용하는 기능 스크리닝을 위한 예시적 4x4 격자를 보여주는 표이다. 이 격자를 사용하여 16개의 상이한 이중특이적 단백질 복합체들을 조립할 수 있고 상승적인 기능에 대해 효율적으로 스크리닝할 수 있다.
도 4는 본 개시의 대표적인 이중특이적 항체 복합체를 보여주는 개략도이다. 상기 개략도는 어떻게 2개의 상이한 Fab 단편들이 Fab 단편에 부착된 결합 파트너들 사이의 고친화성 상호작용을 통해 함께 이중특이적 항체 복합체를 형성하게 되는 지를 보여준다.
도 5는 2개의 상이한 표적 항원들에 대해 특이적인 2개의 Fab 단편들이 그들의 특이성을 보유하고 2개의 Fab 단편들이 조합되어 본 개시의 이중특이적 항체 복합체를 형성할 때 그들의 상응하는 표적 항원들에 동시에 공동-맞물릴 수 있다는 것을 입증하는 유세포분석(flow cytometry) 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 결과는 Fab 단편에 부착된 결합 파트너의 부착의 역전이 그들 각각의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 단편들의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것도 입증한다. 복합체 형성 부재 대조군은 두 특이성들이 펩티드에 융합될 때(Y:Y) 검출된 결합의 부재를 보여준다.
채워진 영역 = [항-항원 5 Fab-펩티드 'GCN4'] : [항-항원 6 Fab-펩티드 'GCN4'] : [바이오티닐화된-항원 6] : [FITC-STREP]. 복합체 형성 부재 대조군.
얇은 선 = [항-항원 5 Fab-scFv '52SR4'] : [항-항원 6 Fab-펩티드 'GCN4'] : [바이오티닐화된-항원 6] : [FITC-STREP]
두꺼운 선 = [항-항원 5 Fab-펩티드 'GCN4'] : [항-항원 6 Fab-scFv '52SR4'] : [바이오티닐화된-항원 6] : [FITC-STREP]
도 6은 서로에 대한 결합 파트너들의 높은 친화도를 입증하는, 비아코어(BIAcore) 기록선을 보여주는 그래프 및 표이다. 칩 상의 펩티드 'GCN4'에 대한 Fab A-scFv '52SR4' 결합이 검출된다.
도 7은 항원 3, 항원 1, 항원 4 및 항원 2에 대한 특이성을 가진 항체들의 이중특이적 및 2가 조합물들에 대한 인산화된 Akt의 억제의 상대적 효능의 막대 차트이다.
도 8은 항원 3, 항원 1, 항원 4 및 항원 2에 대한 특이성을 가진 항체들의 이중특이적 및 2가 조합물들에 대한 인산화된 PLCg2의 억제의 상대적 효능의 막대 차트이다.
도 9는 항원 3, 항원 1, 항원 4 및 항원 2에 대한 특이성을 가진 항체들의 이중특이적 및 2가 조합물들에 대한 CD86 발현의 억제의 상대적 효능의 막대 차트이다.
도 10은 항원 1 및 항원 2에 대한 특이성을 가진 항체들의 이중특이적, 2가 또는 혼합물뿐만 아니라 단일 Fab' 대조군에 대한 인산화된 Akt의 억제의 상대적 효능의 막대 차트이다.
도 11은 항원 3 및 항원 2에 대한 특이성을 가진 항체들의 이중특이적, 2가 또는 혼합물에 대한 인산화된 Akt의 억제의 상대적 효능의 막대 차트이다.
도 12는 항원 3 및 항원 2에 대한 특이성을 가진 항체들의 이중특이적, 2가 또는 혼합물에 대한 인산화된 PLCg2의 억제의 상대적 효능의 막대 차트이다.
도 13은 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 총 IkB 수준에 대한 항-항원 3과 항-항원 2의 이중특이적 조합물의 효과의 적정을 보여주는 그래프이다.
도 14는 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD86 발현에 대한 항원 3과 항원 2의 이중특이적 조합물의 효과의 적정을 보여주는 그래프이다.
도 15는 항원 4 및 항원 2에 대한 특이성을 가진 항체들의 이중특이적, 2가 또는 혼합물에 대한 인산화된 Akt의 억제의 상대적 효능의 막대 차트이다.
도 16은 항원 4 및 항원 2에 대한 특이성을 가진 항체들의 이중특이적, 2가 또는 혼합물에 대한 인산화된 PLCg2의 억제의 상대적 효능의 막대 차트이다.
도 17은 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD86 발현에 대한 항원 4와 항원 2의 이중특이적 조합물의 효과의 적정을 보여주는 그래프이다.
도 18은 실시예 11의 실험 1로부터의 중첩된 크기 배제 A280 신호 기록선들을 보여주는 그래프이다. 제시된 기록선들은 Fab-X(VR4247) 대조군, Fab-Y(VR4248) 대조군, 및 Fab-X(VR4247) 및 Fab-Y(VR4248) 복합체의 500 ㎍/㎖의 1 대 1 몰 비 혼합물이다. 피크는 280 nm의 흡광도에서 검출되었다.
도 19는 실시예 11의 실험 2로부터의 중첩된 크기 배제 A214 신호 기록선들을 보여주는 그래프이다. 제시된 기록선들은 Fab-X(VR4130) 대조군, Fab-Y(VR4131) 대조군, 및 Fab-X(VR4130) 및 Fab-Y(VR4131) 복합체의 500 ㎍/㎖의 1 대 1 몰 비 혼합물이다. 피크는 214 nm의 흡광도에서 검출되었다.
도 20은 실시예 11의 실험 2로부터의 중첩된 크기 배제 A214 신호 기록선들을 보여주는 그래프이다. 제시된 기록선들은 표시된 바와 같이 모두 500 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖의 Fab-X(VR4130)/Fab-Y(VR4131) 1 대 1 몰 비 혼합물이다. 피크는 214 nm의 흡광도에서 검출되었다.
도 21은 항원 격자 교차 특이성에 대한 데이터를 보여주는 표이다. 값은 Syk의 인산화의 백분율 억제(활성화에 대한 음성 값)이고 평가된 다수의 V 영역 조합물들의 평균을 나타낸다.
도 22는 항원 격자 교차 특이성에 대한 데이터를 보여주는 표이다. 값은 PLCg2의 인산화의 백분율 억제(활성화에 대한 음성 값)이고 평가된 다수의 V 영역 조합물들의 평균을 나타낸다.
도 23은 항원 격자 교차 특이성에 대한 데이터를 보여주는 표이다. 값은 AKT의 인산화의 백분율 억제(활성화에 대한 음성 값)이고 평가된 다수의 V 영역 조합물들의 평균을 나타낸다.
도 24는 Fab-Y 내의 항원 3과 조합된 Fab-X 내의 항원 2에 대한 각각의 V 영역 조합물에 대한 Syk, PLCg2 및 AKT의 인산화의 백분율 억제를 보여주는 그래프이다.
도 25는 Fab-Y 내의 항원 2와 조합된 Fab-X 내의 항원 3에 대한 각각의 V 영역 조합물에 대한 Syk, PLCg2 및 AKT의 인산화의 백분율 억제를 보여주는 그래프이다.
도 26은 Fab-Y 내의 항원 4와 조합된 Fab-X 내의 항원 2에 대한 각각의 V 영역 조합물에 대한 Syk, PLCg2 및 AKT의 인산화의 백분율 억제를 보여주는 그래프이다.
도 27은 Fab-Y 내의 항원 2와 조합된 Fab-X 내의 항원 4에 대한 각각의 V 영역 조합물에 대한 Syk, PLCg2 및 AKT의 인산화의 백분율 억제를 보여주는 그래프이다.
도 28은 정제된 Fab'로서 또는 일과성 상청액으로부터의 Fab'로서 조합될 때 항원3Fab'-X 및 항원2Fab'-Y에 의한, B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD71 발현의 백분율 억제에 대한 데이터를 보여주는 그래프이다.
원형 - 정제된 항원2Fab-Y + 항원3Fab-X IC50 0.3224 nM
정사각형 - 일과성 상청액 항원2-Y + 항원3-X IC50 0.2640 nM
삼각형 - 모의 형질감염된 상청액 대조군
도 29는 정제된 Fab'로서 또는 일과성 상청액으로부터의 Fab'로서 조합될 때 항원3-Fab'-X 및 항원2-Fab'-Y에 의한, B 세포에서의 p38의 항-IgM 유도된 인산화의 백분율 억제에 대한 데이터를 보여주는 그래프이다.
원형 - 정제된 항원2Fab-Y + 항원3Fab-X IC50 0.1413 nM
정사각형 - 일과성 상청액 항원2-Y + 항원3-X IC50 0.1816 nM
삼각형 - 모의 형질감염된 상청액 대조군
도 30 내지 33에 대한 핵심
1. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6066); 2. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6078); 3. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6079); 4. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6080); 5. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6082); 6. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6067); 7. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6068); 8. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6070); 9. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6071); 10. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6073); 11. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6075); 12. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6076); 13. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6077); 14. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6069); 15. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6072); 16. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6074); 17. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(VR6081); 18. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(TSUP-24117); 19. 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(TSUP-24432); 20. 모의 상청액 1; 21. 모의 상청액 2; 22. 정제된 항원2Fab-Y(VR4447) + 항원3Fab-X(4126).
도 30은 UCB_Cone_172로부터의 IgM 자극된 B 세포 상의 항원 3 특이적 Fab-X 일시적 생성물과 조합된 정제된 항원 2 특이적 Fab-Y(VR4447)에 의한 인 판독대상의 억제를 보여주는 그래프이다.
도 31은 UCB_Cone_173으로부터의 IgM 자극된 B 세포 상의 항원 3 특이적 Fab-X 일시적 생성물과 조합된 정제된 항원 2 특이적 Fab-Y(VR4447)에 의한 인 판독대상의 억제를 보여주는 그래프이다.
도 32는 UCB_Cone_172로부터의 IgM 자극된 B 세포 상의 항원 3 특이적 Fab-X 일시적 생성물과 조합된 정제된 항원 2 특이적 Fab-Y(VR4450)에 의한 인 판독대상의 억제를 보여준다.
도 33은 UCB_Cone_173으로부터의 IgM 자극된 B 세포 상의 항원 3 특이적 Fab-X 일시적 생성물과 조합된 정제된 항원 2 특이적 Fab-Y(VR4450)에 의한 인 판독대상의 억제를 보여준다.
도 34는 항원 3 및 항원 2 특이적 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포에서의 항-IgM 유도된 인산화된 PLCγ2의 백분율 억제에 대한 데이터를 보여준다.
도 35는 항원 3 및 항원 2 특이적 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포에서의 항-IgM 유도된 인산화된 P38의 백분율 억제에 대한 데이터를 보여준다.
도 36은 항원 3 및 항원 2 특이적 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포에서의 항-IgM 유도된 인산화된 Akt의 백분율 억제에 대한 데이터를 보여준다.
도 37은 항원 3 및 항원 2 특이적 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD71 발현의 백분율 억제에 대한 데이터를 보여준다.
도 38은 항원 3 및 항원 2 특이적 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD40 발현의 백분율 억제에 대한 데이터를 보여준다.
도 39는 항원 3 및 항원 2 특이적 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한, B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD86 발현의 백분율 억제에 대한 데이터를 보여준다.
도 40은 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상에서의 CD27 발현의 억제를 보여준다.
도 41은 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상에서의 CD71 발현의 억제를 보여준다.
도 42는 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상에서의 CD86 발현의 억제를 보여준다.
도 43은 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상에서의 CD27 발현의 억제를 보여준다.
도 44는 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상에서의 CD71 발현의 억제를 보여준다.
도 45는 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상에서의 CD86 발현의 억제를 보여준다.
본 명세서에서 사용된 "이중특이적 단백질 복합체"는 이종이량체성-테터에 의해 함께 보유된 2개의 단백질들(본원에서 이중특이적 성분으로서 지칭되는 A 및 B로서, 본원에서 각각 이중특이적인 제1 단백질 성분 및 제2 단백질 성분으로도 지칭됨)을 포함하는 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 상기 단백질들 중 하나 또는 둘 다가 결합 단백질을 갖고, 예를 들면, 상기 단백질들 중 하나 또는 둘 다가 항체 또는 그의 단편이다(특히, Fab 또는 Fab' 단편에서, 예컨대, 이러한 복합체는 Fab-Kd-Fab로서도 지칭된다).
본 명세서에서 사용된 "융합 단백질"은 결합 파트너 X 또는 Y(적절한 경우)에 융합된 단백질 성분 A 또는 B를 포함한다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 유전적 구축물로부터 재조합 기법에 의해 발현된, 예를 들면, 숙주에서 DNA 구축물로부터 발현된 번역 단백질이다. 본 개시와 관련하여, 융합 단백질의 핵심 특성들 중 하나는 상기 융합 단백질이 세포로부터 "단일 단백질/유닛"으로서 발현될 수 있다는 것이다(물론 Fab/Fab' 단편을 포함하는 융합 단백질의 경우, 2개의 쇄들이 존재할 것이지만, 이것은 1개의 쇄, 전형적으로 본 명세서에 후술된 바와 같이 적절한 경우 임의적으로 링커를 통해 그의 C-말단에서 X 또는 Y에 융합된 중쇄를 가진, 본 명세서의 목적을 위한 단일 단백질로서 간주될 것이다).
이종이량체성-테터 X:Y의 기능은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 A와 B의 상승적인 기능이 달성될 수 있거나 확인될 수 있도록 단백질 A와 B를 서로 인접하여 보유하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 "이종이량체성-테터"는 2개의 결합 파트너들을 함께 보유하기에 충분한 전체 친화도를 가진, 서로 간에 상호작용 :(예컨대, 결합)을 형성하는 2개의 상이한 결합 파트너들 X 및 Y를 포함하는 테터를 지칭한다. 한 실시양태에서, X 및/또는 Y는 동종이량체를 형성하기에 부적합하다.
이종이량체적으로 테터링된 및 이종이량체성-테터는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
한 실시양태에서, 본 명세서에서 사용된 "동종이량체를 형성하기에 부적합한"은 일단 형성되면 X-Y의 이종이량체의 형성이 동종이량체보다 더 바람직하다는 것, 예를 들면, 더 안정하다는 것, 예컨대, 열역학적으로 안정하다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, X와 Y 사이의 결합 상호작용은 1가이다.
한 실시양태에서, X-Y 상호작용은 X-X 또는 Y-Y 상호작용보다 더 유리할 수 있다. 이것은 융합 단백질 A-X와 B-Y가 혼합될 때 동종이량체 X-X 또는 Y-Y의 형성을 감소시킨다. 전형적으로, 1:1 몰 비 혼합 후 75% 초과의 이종이량체가 형성된다.
원하는 경우, 예를 들면, 본 개시에 따른 융합 단백질 유닛 및/또는 이중특이적 단백질 복합체를 정제하기 위해 정제 단계(특히, 1-단계 정제), 예컨대, 컬럼 크로마토그래피가 이용될 수 있다.
한 실시양태에서, 전형적으로 응집체 수준이 낮을지라도, 정제 단계는 각각의 융합 단백질의 발현 후에 제공된다. 따라서, 한 실시양태에서, 시험관내 혼합 전에, 융합 단백질(들)은 실질적으로 순수한 형태로 제공된다. 본 명세서에서 사용된 "실질적으로 순수한 형태"는 융합 단백질이 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 단량체인 경우를 지칭한다.
한 실시양태에서, 융합 단백질 또는 단백질들의 정제는 수행되지 않는다.
한 실시양태에서, 각각의 융합 단백질 유닛은 상이한 발현 실험/실시에서 발현된다.
한 실시양태에서, 융합 단백질 또는 단백질들의 정제는 이중특이적 단백질 복합체를 생성하기 위한 혼합 전에 수행되지 않는다. 한 실시양태에서, 융합 단백질 또는 단백질들의 정제는 혼합 전 및/또는 후에 수행되지 않는다.
한 실시양태에서, 정제는 이중특이적 단백질 복합체 형성 후에 요구되지 않는다.
한 실시양태에서, 혼합 후 일반적으로 추가 정제가 없을 때, 조성물의 50% 이상은 원하는 이중특이적 단백질 복합체이고, 예를 들면, 조성물의 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상은 요구된 이중특이적 단백질 복합체이다.
한 실시양태에서, 본 방법의 시험관내 혼합 단계에서 사용되는 융합 단백질의 비는 0.8:1 내지 3:1, 예컨대, 1.5:1 또는 2:1의 A-X 대 B-Y이다.
한 실시양태에서, 본 방법의 시험관내 혼합 단계에서 사용되는 융합 단백질의 비는 특히 0.8:1 내지 3:1, 예컨대, 1.5:1 또는 2:1 몰 비의 B-Y 대 A-X이다.
한 실시양태에서, 시험관내 혼합 단계에서 사용되는 A-X 대 B-Y의 비는 1:1, 특히 1:1 몰 비이다.
또한, 본 개시는 예를 들면, 1: 몰 비로 융합 단백질 A-X와 B-Y를 혼합하는 단계를 포함하는, 본 개시에 따른 이중특이적 복합체를 제조하는 방법까지 확장된다.
한 실시양태에서, 혼합은 시험관내에서 일어난다.
한 실시양태에서, 혼합은 세포, 예를 들면, 숙주 세포에서 일어난다.
한 실시양태에서, 혼합은 생체내에서 일어난다. 즉, 융합 단백질 A-X와 B-Y는 대상체의 체내에서 서로 상호작용하여 이종이량체성-테터 및 결과적으로 이중특이적 단백질 복합체를 형성한다.
한 실시양태에서, X 및 Y는 서로에 대해 완전히 특이적이고 세포에서 또는 대상체의 체내에서 임의의 다른 펩티드/단백질에 결합하지 않는다. 이것은 예를 들면, X 및 Y가 표적 세포 또는 표적 대상체의 체내에 천연적으로 존재하지 않도록 보장함으로써 달성될 수 있다. 이것은 예를 들면, 대상체와 상이한 종 또는 물질(예를 들면, 효모 단백질)로부터 유래하도록 X 또는 Y를 선택하고 다른 변수가 그에 특이적이도록 보장함으로써 달성될 수 있다. 유리하게는, 이것은 융합 단백질 A-X 및/또는 B-Y와 원치 않는 표적이 결합함으로써, 원치 않는 탈-표적(off-target) 효과를 생성하는 것을 방지한다.
한 실시양태에서, 결합 파트너들 중 하나(또는 하나 이상)는 동종이량체를 형성할 수 없고, 예를 들면, 결합 파트너의 아미노산 서열은 동종이량체의 형성을 제거하거나 최소화도록 돌연변이된다.
한 실시양태에서, 결합 파트너들 둘 다는 동종이량체를 형성할 수 없고, 예를 들면, 펩티드 결합 파트너의 아미노산 서열은 동종이량체의 형성을 제거하거나 최소화하도록 돌연변이되고 이에 대해 특이적인 VHH가 사용된다.
본 명세서에서 사용된 "동종이량체 또는 응집체를 형성할 수 없는"은 동종이량체 또는 응집체를 형성하는 낮은 또는 제로 성향을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 "낮은"은 예를 들면, 혼합 또는 발현 또는 정제 후에 5% 이하, 예컨대, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 이하의 응집체를 지칭한다.
융합 단백질에서의 소량의 응집체 또는 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서의 잔류물은 일반적으로 본 개시의 스크리닝 방법에 최소한으로 영향을 미친다. 따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질(들) 및/또는 이중특이적 복합체(들)의 정제는 특히 혼합 단계 후에 상기 방법에서 이용되지 않는다.
한 실시양태에서, :는 인력, 예를 들면, 반 데르 발스(Van der Waals) 힘, 예컨대, 수소 결합에 기초한 결합 상호작용, 및 특히 항원(예컨대, 펩티드)에 대한 항체 특이성에 기초한 정전기 상호작용이다.
한 실시양태에서, :는 특이적 화학적 상호작용, 예컨대, 클릭(click) 화학반응으로부터 형성된 공유 결합이다. 한 실시양태에서, :는 공유 결합이 아니다. 한 실시양태에서, 접합/커플링 화학반응은 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체를 제조하는 데에 이용되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 "복합체를 형성한다"는 복합체가 조립되고 융합 단백질들이 함께 보유되는 적절한 조건 하에서 융합 단백질 성분들 A-X 및 B-Y가 접촉할 때 충분히 특이적이고 강한, 결합 상호작용 또는 화학반응을 비롯한 상호작용을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "함께 보유되는"은 X:Y 결합 후 복합체가 마치 한 분자인 것처럼 취급될 수 있고 많은 경우들에서 단일 분자처럼 거동하고 작용하도록 성분들(융합 단백질들)을 서로 인접하여 유지하는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 보유는 복합체가 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되기에 적합하게, 즉 하나 이상의 기능 스크린에서 사용되기에 적합하게 만든다.
본 명세서에서 사용된 "특이성"은 예를 들면, 상호작용, 예를 들면, X:Y에서의 파트너들, 또는 A와 항원 또는 B와 항원이 서로만을 인식하거나 비-파트너에 비해 서로에 대한 유의하게 더 높은 친화도, 예를 들면, 무관한 비-파트너 단백질에의 배경 결합 수준보다 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이상 더 높은 친화도를 갖는 경우를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "X 및 Y에 대한 특이성"은 상호작용에서 결합 파트너 X와 Y가 서로만을 인식하거나 비-파트너에 비해 서로에 대한 유의하게 더 높은 친화도, 예를 들면, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이상 더 높은 친화도를 갖는 경우를 지칭한다.
한 실시양태에서, 결합 상호작용은 가역적이다. 한 실시양태에서, 결합 상호작용은 본질적으로 비가역적이다.
본 명세서에서 사용된 "본질적으로 비가역적"은 항체 또는 결합 단편의 느린 해리 속도(해리 상수)를 지칭한다.
한 실시양태에서, X와 Y 사이의 결합 상호작용은 낮은 해리 상수를 가진다.
낮은 해리 상수의 예로는 1-9x10-2 s-1 이하, 예를 들면, 1-9x10-3 s-1, 1-9x10-4 s-1, 1-9x10-5 s-1, 1-9x10-6 s-1 또는 1-9x10-7 s-1이 있다. 특히 적합한 해리 상수는 2x10-4 s-1 이하, 예를 들면, 1x10-5 s-1, 1x10-6 s-1 또는 1x10-7 s-1을 포함한다.
이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 낮은 해리 상수(해리 속도로서도 지칭됨)는 분자가 이중특이적 단백질 복합체를 특히 기능 스크리닝 분석법에서 유용하게 만들 정도로 충분히 안정할 수 있게 한다.
한 실시양태에서, 서로에 대한 X 및 Y의 친화도는 5 nM이거나 더 강하고, 예를 들면, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM이거나 더 강하다.
한 실시양태에서, 서로에 대한 X 및 Y의 친화도는 900 pM이거나 더 강하고, 예컨대, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 또는 50 pM이거나 더 강하다.
또 다른 실시양태에서, 서로에 대한 X 및 Y의 친화도는 10 pM이거나 더 강하고, 예를 들면, 9, 8, 7, 6 또는 5 pM이다.
친화도는 물질의 결합 및 해리 속도로부터 계산된 값이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "친화도"는 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들면, 펩티드) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 그의 결합 파트너에 대한 분자의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화도는 본 명세서에 기재된 방법들, 예컨대, 표준 플라스몬 공명 방법, 특히 비아코어를 비롯한, 당분야에서 공지되어 있는 통상의 방법들에 의해 측정될 수 있다.
그러나, 복합체를 함께 유지하는 능력은 거의 친화도가 아니다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 사실상 3종의 유의한 성분들, 즉 결합 속도, 해리 속도 및 친화도가 존재한다는 가설을 세운다. 친화도에 대한 계산은 결합 속도 및 해리 속도에 기초한다. 따라서, 결합 속도가 낮고 해리 속도가 빠른 경우, 친화도는 낮을 것이고 이중특이적 단백질 복합체를 함께 유지하기에 충분하지 않을 것이다. 그러나, 느린 결합 속도는 느린 해리 속도에 의해 보상되어, 전체 적합한 친화도를 제공할 수 있을 것이다. 일부 실시양태들에서, 높은 결합 속도는 상기 복합체를 함께 유지하기에 충분할 수 있다.
복합체에서 사용된 결합 파트너들(X 및 Y)이 느린 결합 속도를 가진 경우, 복합체가 형성될 수 있게 하기 위해 성분들의 혼합 후 추가 시간이 요구될 수 있다.
결합 파트너들 사이의 친화도가 충분히 높은 경우, 이중특이적 단백질 복합체의 단백질들(A 및 B)의 친화도가 그들의 표적들에 단지 약하게 결합하는 경우조차도 이중특이적 단백질 복합체가 그의 원하는 생물학적 기능을 수행할 수 있다. 대조적으로, 단백질들(A 및 B)이 그들의 표적들에 강하게 결합할 수 있는 경우, 서로에 대한 결합 파트너들(X 및 Y)의 친화도가 낮은 경우조차도 동일한 생물학적 기능을 달성할 수 있다. 즉, 결합 파트너들 사이의 보다 높은 친화도가 표적들에 대한 보다 낮은 친화도를 보상할 수 있고 역의 경우도 가능할 수 있도록 '삼위일체' 관계가 존재한다.
한 실시양태에서, 그의 리간드 또는 항원에 대한 단백질 A의 친화도는 약 100 nM이거나 더 강하고, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM 또는 100 pM이거나 더 강하고, 특히 50 pM이거나 더 강한 결합 친화도이다.
한 실시양태에서, 그의 리간드 또는 항원에 대한 단백질 B의 친화도는 약 100 nM이거나 더 강하고, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM 또는 100 pM이거나 더 강하고, 특히 50 pM이거나 더 강한 결합 친화도이다.
한 실시양태에서, 중쇄 내의 불변 도메인, 예컨대, CH1과 경쇄 내의 불변 도메인, 예컨대, C카파 사이의 상호작용은 본 개시에 따른 이중특이적 복합체의 형성 및/또는 안정성에 기여한다. 따라서, 본 개시의 이중특이적 복합체에서의 Fab 또는 Fab' 단편의 사용은 유익하다.
한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 복합체는 이펙터 기능을 가진 성분을 포함하지 않고, 예를 들면, 상기 복합체는 CH1 및 C카파 또는 C람다 이외의 불변 도메인을 포함하지 않고, 특히 CH2, CH3, CH4 및 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택된 불변 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 복합체는 Fc 영역을 결여한다.
한 실시양태에서, 본원의 방법은 라이브러리로부터 본 개시의 융합 단백질을 제조함으로써 나이브(naive) 파지 라이브러리를 스크리닝하는 데에 이용된다.
본 발명의 이중특이적 단백질 복합체는 기능 스크리닝을 비롯한 임의의 적합한 적용에서 사용될 수 있다. 이 신규 포맷은 기능을 기초로 단백질 표적을 확인하고 이중특이적 요법에 의해 표적화될 수 있는, 이러한 표적 단백질 상의 최적 에피토프를 확인하기 위한 다중체 기능 스크리닝에서 특히 유용하다. 더욱이, 단백질 A 및 B가 항체 또는 이의 결합 단편인 경우, 이중특이적 단백질 복합체는 이중특이적 항체 치료제에서 사용될 최적 가변 영역 쌍을 확인하기 위한 다중체 기능 스크리닝을 위해 사용될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 "다중체"는
동일한 또는 상이한 포맷으로 하나 이상의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체 및 하나 이상의 관련 생물학적 비교대상을 생성하기 위해 조합된 2개 이상의 성분 융합 단백질들(A-X 및 Y-B), 또는
동일한 또는 상이한 포맷으로 임의적으로 하나 이상의 관련 생물학적 비교대상을 가진 2개 이상의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체
를 포함하는, 시험용 물질들의 집단이다.
명확히 유용하기 위해, 비교대상으로서 사용된 상이한 포맷은 본 개시에서 이용된 시험관내 기능 분석법으로 시험되기에 적합해야 한다. 일례에서, 상기 다중체에서의 상기 비교대상은 A-X와 B-X의 1가 혼합물 또는 A-X-Y-A의 2가 단일특이적 복합체이다.
한 실시양태에서, 다중체는 특히 2개 내지 100개의 제1 융합 단백질들 및 제2 융합 단백질들(A-X 및 B-Y)을 격자에서 혼합함으로써 생성된 1개 내지 방대한 수의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체들, 예를 들면, 2개 내지 500,000개의 상기 복합체들, 예컨대, 2개 내지 100,000개 또는 2개 내지 10,000개의 상기 복합체들을 포함한다. 한 실시양태에서, 다중체는 예를 들면, 2개 내지 1,000개, 예컨대, 2개 내지 900개, 2개 내지 800개, 2개 내지 700개, 2개 내지 600개, 2개 내지 500개, 2개 내지 400개, 2개 내지 300개, 2개 내지 200개, 2개 내지 100개, 2개 내지 90개, 3개 내지 80개, 4개 내지 70개, 5개 내지 60개, 6개 내지 50개, 7개 내지 40개, 8개 내지 30개, 9개 내지 25개, 10개 내지 20개 또는 15개의 이중특이적 단백질 복합체들을 포함한다. 이러한 격자의 일례에 대해서는 도 3을 참조한다.
한 실시양태에서, 이 다중체에서 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질들의 수는 n2이고, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 이상이다.
다중체는 어레이, 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트의 형태로 존재할 수 있고, 상기 마이크로플레이트의 각각의 웰은 상이한 이중특이적 단백질 복합체를 함유할 수 있다. 이중특이적 단백질 복합체는 고체 기판 표면, 예를 들면, 비드에 부착될 수 있거나, 예를 들면, 웰 또는 소적 내부에 액체(예를 들면, 용액 또는 매질) 형태로 현탁될 수 있다.
한 실시양태에서, 다중체에서 모든 'A'는 상이한 단백질, 바람직하게는 표적 항원에 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편이고, 모든 'B'는 상이한 단백질, 바람직하게는 표적 항원에 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편이다.
한 실시양태에서, 다중체는 이하에 논의된 격자, 예를 들면, 각각 64개, 256개 또는 320개의 샘플에 해당하는 8x8, 16x16 또는 16x20의 격자에 제공된다.
본 명세서에서 사용된 "격자"는 한 변수, 예컨대, (A-X에서) 단백질 A가 한 축, 예컨대, X-축(수평 축)을 따라 변경되고 또 다른 변수, 예컨대, (B-Y에서) 단백질 B가 다른 축, 예컨대, Y 축(수직 축)을 따라 변경되는 2차원적 평면도 또는 어레이를 지칭한다. 이 정렬은 변수들의 다양한 조합들(순열들)을 체계적으로 평가하는 데에 도움을 준다.
한 실시양태에서, 다중체는 96웰 플레이트 상에 제공되고, 분석되는 샘플의 수는 그의 배수, 즉 96, 192, 384 등일 수 있다.
유리하게는, 격자 정렬은 본 개시에 따른 이중특이적 단백질 복합체의 생물학적 기능을 효율적으로 스크리닝하는 데에 특히 유리하다. 도 3은 이러한 격자의 일례를 보여주고, 상기 격자에 의해 4개의 제1 융합 단백질들은 4개의 제2 융합 단백질들과 용이하게 조합되어 16개의 이중특이적 단백질 복합체들을 생성할 수 있다.
스크리닝 격자의 다른 변경은 당업자에게 자명할 것이고, 예를 들면, 제1 융합 단백질(A-X)에서의 제1 단백질(A)은 일정하게 유지될 수 있는 반면, 제2 융합 단백질(B-X)에서의 제2 단백질(B)은 변경된다. 이것은 소정의 제1 단백질로 다수의 상이한 제2 단백질들을 상승적인 기능에 대해 신속히 스크리닝하는 데에 유용할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 단백질 A는 각각의 항체 변이체가 동일한 항원에 대해 특이적이되 가변 영역들의 상이한 조합을 갖도록 단백질 A의 항체 가변 영역을 변화시킴으로써 한 축을 따라 변경된다. 단백질 B는 일정하게 유지될 수 있거나, 동일한 방식으로 변경될 수도 있거나 단백질 B에 대한 항원 특이성이 (격자를 횡단하여 또는 격자 아래로) 변화하도록 변경될 수도 있다.
유리하게는, 이러한 스크리닝 격자는 이중특이적 단백질 복합체가 동일한 항원에 대해 특이적이되 가변 영역들의 상이한 조합을 가질 때 상승적인 기능에서의 작은 차이의 검출을 잠재적으로 가능하게 할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 "공통된" 제1 융합 단백질(A-X)은 각각의 웰 내부에 존재할 수 있다. 그 다음, 본 개시에 따른 다양한 상이한 제2 융합 단백질들(B-Y)이 각각의 웰 내로 분배될 수 있다. 그 후, 2개의 결합 파트너들(X와 Y)의 특이적 결합 상호작용은 이중특이적 단백질 복합체를 형성하도록 2개의 융합 단백질들을 물리적으로 함께 존재하게 한다. 이것은 공통된 제1 표적 항원(A에 의해 결합됨)에 모두 결합하되 이중특이적 단백질 복합체마다 상이할 수 있는 제2 표적 항원(B에 의해 결합됨)에도 결합할 수 있는 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 다중체를 생성한다.
한 실시양태에서, B-Y 융합 단백질은 A-X 내의 가변 영역과 조합될 때 B에 의해 결합된 소정의 표적 항원의 가변 영역 및/또는 에피토프의 최적화를 가능하게 하기 위해 동일한 표적 항원에 대한 상이한 가변 영역들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "공통된" 제1 융합 단백질은 그의 A 또는 B 성분이 동일한 단백질 또는 에피토프에 결합하는, 특히 A 또는 B 성분이 공통된 융합 단백질에서 완전한 동일성을 갖는, 즉, 공통된 제1 융합 단백질이 항상 동일한 가변 영역 서열을 포함하는 경우의 융합 단백질을 지칭한다.
당업자는 다중체 내의 각각의 위치에서 이중특이적 단백질 복합체의 원하는 특이성이 용이하게 조절될 수 있도록 전술된 사항들을 상이하게 변경시키는 것도 인식할 것이다. 이것은 이러한 다중체가 기능 분석법에서 사용될 때 이중특이적 단백질 복합체의 상이한 조합물들의 효율적인 스크리닝을 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 격자에서 이용된 변수를 정의하기 위해 요인 디자인이 이용된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 방법은 고처리율 분석에 이바지한다.
한 실시양태에서, 다수의 이중특이적 단백질 복합체들이 동시에 또는 본질적으로 동시에 시험된다.
본 명세서에서 사용된 "동시에"는 샘플들/분자들/복합체들이 동일한 분석법, 예를 들면, 동일한 "실시"에서 분석되는 경우를 지칭한다. 이것은 일반적으로 소정의 샘플 실시를 위해 사용된 시약들이 동일한 회분(batch), 농도, 세포 공급원 등일 것이므로 동일한 성질을 가질 것이기 때문에 유리할 수 있다. 나아가, 분석법이 수행되는 환경적 조건, 예컨대, 온도 및 습도가 유사할 가능성이 있다.
한 실시양태에서, "동시에"는 신호 출력물이 본질적으로 동일한 시간에 기계에 의해 분석되는 동시적 분석을 지칭한다. 이 신호는 수득된 결과를 해석하기 위한 데콘볼루션(deconvolution)을 요구할 수 있다.
유리하게는, 다수의 이중특이적 단백질 복합체들의 시험은 다수의 이중특이적 단백질 복합체들의 보다 효율적인 스크리닝 및 새롭고 흥미로운 관계의 확인을 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 다수의 이중특이적 단백질 복합체들은 상기 정의된 다중체를 사용하고 이를 하나 이상의 기능 분석법으로 분석함으로써 시험된다. 따라서, 본 발명은
(i) 하나 이상의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 다중체의 일부 또는 전부에 대한 기능 분석법에서 활성에 대해 시험하는 단계; 및
(ii) 상기 기능 분석법으로부터의 판독결과(들)를 분석하여 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 생물학적 기능을 확인하거나 탐지하는 단계
를 포함하는, 식 A-X:Y-B의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 생물학적 기능을 탐지하는 방법으로서,
X:Y가 이종이량체성-테터이고,
:가 X와 Y 사이의 결합 상호작용이며,
A 및 B가 각각 X 및 Y를 지닌 융합 단백질의 형태로 이중특이적 단백질 복합체의 단백질 성분이고,
Y가 항원이고 X가 Y에 대해 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편이거나, X가 항원이고 Y가 X에 대해 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편인, 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 기능"은 시험되는 생물학적 물질에 천연적으로 존재하는 활성 또는 시험되는 생물학적 물질의 목적인 활성, 예를 들면, 세포, 단백질 또는 이와 유사한 물질의 천연 활성을 지칭한다. 이상적으로, 생물학적 기능의 존재는 포유동물 세포, 예컨대, 생존 세포, 예컨대, B 또는 T 세포, 또는 생체외 조직을 사용하는 분석법을 비롯한 시험관내 기능 분석법을 이용함으로써 시험될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "천연 기능"은 비정상적인 기능, 예컨대, 질환, 예컨대, 암과 관련된 기능도 포함한다.
본 명세서에서 사용된 관련 "생물학적 비교대상"은 임의의 변화 또는 신규 활성 또는 기능이 존재하는지를 확립하기 위해 이중특이적 단백질 복합체에 대해 이용된 분석법과 동일한 분석법에서 활성을 평가하기에 적합한 물질을 지칭한다. A-X:Y-B에 적합한 비교대상은 천연 형태로 존재하거나 이중특이적 단백질 복합체와 동일한 포맷, 예를 들면, A와 B가 동일한 물질인 경우, 예컨대, A-X:Y-A 또는 B-X:Y-B, 즉 2가 단일특이적 복합체로 제공되는 (재조합 단백질을 비롯한) 정제된 단백질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 비-복합체화된 형태에서 융합 단백질 A-X 또는 B-Y는 비교대상 단독으로서 사용될 수 있거나, 비-복합체화된 혼합물, 예컨대, 함께 A-X 및 B-X 또는 함께 A-Y 및 B-Y로서 사용될 수 있다. 대안적으로, (특히 본 명세서에 기재된) 상이한 포맷들의 다수의 비교대상들이 사용될 수 있다. 당업자는 문헌에서 발견되는 통상의 일반 지식 또는 정보를 기초로 적합한 대조군/비교대상을 확인하여 포함시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "상승적인 기능" 또는 "상승적인 생물학적 기능"은 하기 생물학적 활성 또는 생물학적 활성의 수준, 또는 생물학적 기능 또는 활성에 대한 영향을 지칭한다.
Figure 112016120995546-pct00001
이중특이적 단백질 복합체가 사용될 때까지 개별 융합 단백질 성분의 사용 시 관찰되지 않는 (그리고 이중특이적 포맷으로 존재하지 않는, 항체와 상기 항원의 조합물의 사용 시 관찰된 활성을 포함할 수 있되, 특히 2개의 결합 도메인들이 이중특이적 포맷으로 연결되어 있을 때에만 관찰된 활성을 지칭하는) 활성, 또는
Figure 112016120995546-pct00002
본 개시의 이중특이적 단백질 복합체의 제1 단백질 및 제2 단백질이 개별적으로 사용될 때 관찰된 활성, 예를 들면, 이중특이적 형태에서만 관찰되는 활성에 비해 더 높거나 더 낮은 활성.
따라서, "상승적"은 신규 생물학적 기능 또는 신규 활성을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "상승적인 기능"은 일반적으로 단순한 표적화, 즉 결합에만 근거한 표적화를 포함하지 않되, 일반적으로 결합 후에 일부 억제, 활성화, 신호전달 또는 유사한 기능을 수반할 것이다.
본 명세서에서 사용된 "신규 생물학적 기능 또는 신규 활성"은 2개 이상의 상승적인 물질들(단백질 A 및 단백질 B)이 (이중특이적 단백질 복합체로서 또는 다른 방식으로) 함께 존재할 때까지 명확하지 않거나 존재하지 않는 생물학적 기능 또는 활성, 또는 이전에 확인되지 않은 기능을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "보다 높은"은 이중특이적 단백질 복합체에서 예를 들면, 일부 활성의 0으로부터의 증가를 비롯한 활성의 증가를 지칭하고, 이때 개별 비-복합체화된 이중특이적 성분 또는 성분들은 관련 기능 분석법에서 활성을 갖지 않는다(본 명세서에서 신규 활성 또는 신규 생물학적 기능으로서도 지칭됨). 본 명세서에서 사용된 "보다 높은"은 (단독으로 또는 연결된 상태로 함께 시험된) 개별 비-복합체화된 이중특이적 성분들에 비해 관련 기능 분석법에서 이중특이적 단백질 복합체의 기능의 가산적 증가 초과의 증가, 예를 들면, 관련 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 300% 이상의 증가도 포함한다.
한 실시양태에서, 비-복합체화된 단백질들은 함께 이중특이적 단백질 복합체와 동일한 활성을 갖고, 이 활성 또는 기능은 이전에 공지되어 있지 않았다. 이것도 본 명세서의 문맥에서 신규 상승적인 기능이다.
한 실시양태에서, 상승적인 기능은 보다 높은 기능이다.
한 실시양태에서, 상승적인 기능은 보다 낮은 기능이다.
본 명세서에서 사용된 "보다 낮은 기능"은 관련 기능 분석법에서 이중특이적 단백질 복합체가 동일한 조건 하에서 개별 단백질로서 분석되었거나 단백질들의 혼합물로서 분석되었을 때, 관련 기능 분석법에서 활성을 가진 개별 비-복합체화된 이중특이적 성분(들)(예컨대, 천연 단백질, 즉 융합 단백질에 존재하지 않고 상기 단백질의 활성 도메인 또는 단편을 비롯한, 생체내에서 발생하는 복합체 이외의 임의의 다른 복합체의 일부도 아닌 재조합 단리된 단백질)에 비해 보다 낮은 활성을 갖거나 활성을 갖지 않는 경우, 예를 들면, 관련 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 300% 이상의 감소를 지칭한다(본 명세서에서 신규 활성 또는 신규 생물학적 기능으로서도 지칭됨). 100% 초과의 활성 감소는 상이한 방향으로 긍정적인 활성을 획득하는 것을 지칭하는데, 예를 들면, 물질이 아고니스트인 경우 100% 초과의 활성 감소는 물질을 길항제로 만들 수 있고 역의 경우도 가능하다.
한 실시양태에서, 이중특이적 복합체의 활성은 단백질 A와 단백질 B의 공지된 기능의 합계보다 더 낮다.
일부 실시양태들에서, 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체는 단순히 가산적 생물학적 기능을 가진다. 본 명세서에서 사용된 "가산적 생물학적 기능"은 동일한 조건 하에서 시험될 때 성분 A 및 B 각각의 개별적 기능의 합계와 동일한 기능을 지칭한다. 가산적 기능은 활성 또는 기능이 이전에 공지되어 있지 않거나 확인되어 있지 않은 경우 신규 기능일 수 있다.
스크리닝은 확인될 원하는 기능에 따라 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적합한 분석을 이용함으로써 수행된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 방법에서 이용된 기능 분석법은 시험관내 또는 생체외 분석법이다.
본 명세서에서 사용된 "기능 분석법"은 분석 조건에 따라 이중특이적 단백질 복합체, 항체 복합체 또는 항체들의 혼합물의 하나 이상의 원하는 성질 또는 활성을 확인하는 데에 이용될 수 있는 분석법이다. 적합한 기능 분석법은 결합 분석법, 아폽토시스 분석법, 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC) 분석법, 보체 의존적 세포독성(CDC) 분석법, 세포 성장 또는 증식의 억제(세포증식억제 효과) 분석법, 세포 사멸(세포독성 효과) 분석법, 세포 신호전달 분석법, 사이토카인 생성 분석법, 항체 생성 및 이소타입 전환, 세포 분화 분석법, 콜로니 형성 분석법, 화학주성 분석법, 세포 부착 분석법, 세포 이동 분석법, 세포 주기 분석법, 대사 분석법(전체 세포 및 소기관 기능), 병원체와 표적 세포의 결합의 억제를 측정하는 분석법, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 또는 다른 분비되는 분자의 분비를 측정하는 분석법, 세균발육억제에 대한 분석법, 살세균 활성, 바이러스의 중화, 제자리 혼성화 방법을 비롯한, 항체가 결합된 부위로의 면역 시스템의 성분들의 유인을 측정하는 분석법, 표지부착 방법 등일 수 있다.
한 실시양태에서, 생체내 분석법, 예컨대, 마우스 종양 모델, 자가면역 질환의 모델, 바이러스-감염된 또는 세균-감염된 설치류 또는 영장류 모델 등을 비롯한 동물 모델이 이용될 수 있다.
당업자는 조사되는 표적/단백질을 기초로 적합한 기능 분석법을 잘 선택할 수 있다. 그러나, 신규 기능성을 확인하고자 하는 시도에서 적절할 것으로 생각되는 분석법을 미리 선택하지 않고 복합체를 "표준" 분석법의 패널로 분석할 수 있다.
이중특이적 항체 복합체와 관련하여, 본 개시에 따른 이중특이적 항체 복합체의 효능은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 공지되어 있는 방법에 의해 이러한 모델에서 개별 항체들 또는 항체들(또는 단편들)의 혼합물과 비교될 수 있다.
예를 들면, 이중특이적 항체 복합체는 항원과의 결합 이외의 성질을 포함하는 생물학적 기능인, 증식을 억제하거나, (예를 들면, 염료, 예컨대, 알라마르 블루(allamar blue)를 사용하거나 세포에 의해 발현된 루시퍼라제에 기인하는 발광을 모니터링함으로써 측정된) 세포의 생존능 또는 대사 활성에 영향을 미치거나 암세포의 아폽토시스를 야기하는 능력에 대해 시험될 수 있다.
관심 있는 특정 질환과 밀접하게 관련된 기능 분석법을 선택함으로써 본 개시의 방법은 공지되어 있거나 공지되어 있지 않은 표적 분자에 결합하는 잠재적 치료 항체를 확인하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 개시의 방법을 이용하여 신규 표적 분자를 확인하고/하거나 잠재적 치료 항체를 직접적으로 확인할 수 있다. 유리하게는, 본 방법은 임의의 특정 분석법(들)으로 한정되지 않고 요건에 따라 가장 적절한 기능 분석법을 선택하도록 완전한 유연성을 사용자에게 제공한다.
원하는 생물학적 기능에 대해 이중특이적 항체 복합체를 스크리닝할 때, 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 예를 들면, 항체를 함유하는 배지를 생물학적 활성에 대해 직접적으로 스크리닝할 수 있다. 대안적으로, 생물학적 활성에 대해 스크리닝하기 전에 항체를 코팅된 비드 또는 마이크로타이터 플레이트에 결합시킬 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질은 니켈 포획 정제 단계에서 His 태그를 통해 정제될 수 있다. 이러한 방법은 항체의 국소 농도를 증가시켜, 기능 분석법으로부터 보다 깨끗한 결과를 이끌어낼 수 있다.
결과의 신뢰성을 향상시키기 위해 특정 이중특이적 항체 복합체의 상이한 샘플들을 사용하거나 사용하지 않고 필요에 따라 기능 분석법을 다회 반복할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 다양한 통계학적 검정들을 이용하여 통계적으로 유의한 결과를 확인할 수 있으므로, 생물학적 기능을 가진 이중특이적 항체 복합체를 확인할 수 있다.
스크리닝을 위한 기능 분석법을 확립할 때, 당업자는 확인된 활성이 '히트(hit)'로서 간주되는 수준을 초과하는 적합한 역치를 설정할 수 있다. 하나 초과의 기능 분석법이 이용되는 경우, 각각의 분석에 대한 역치를 적합한 수준에서 설정하여 관리가능한 히트율을 확립할 수 있다. 일례에서, 히트율은 3% 내지 5%일 수 있다. 일례에서, B 세포 기능을 억제하는 항원 쌍들을 검색할 때 설정된 기준은 B 세포 활성화 분석에서 2개 이상의 인 판독대상들의 30% 이상의 억제일 수 있다.
본 발명의 이중특이적 단백질 복합체에서 하기 단백질 및 펩티드 성분이 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 결합 쌍의 제1 결합 파트너 X 및 제2 결합 파트너 Y 중 하나 이상은 펩티드 및 단백질로부터 독립적으로 선택되고; 예를 들면, 제1 결합 파트너 또는 제2 결합 파트너는 펩티드이다.
적합한 펩티드는 GCN4, Fos/Jun(인간 및 뮤린 Fos는 각각 유니프롯(Uniprot) 번호 P01100 및 P01101을 갖고, 인간 및 뮤린 jun은 각각 유니프롯 번호 05412 및 05627을 가짐), 인간 인플루엔자 헤마글루티닌의 아미노산 98 내지 106에 상응하는 HA-태그, 폴리히스티딘(His), c-myc 및 FLAG를 포함하는 군을 포함한다. 다른 펩티드도 본 개시에서 사용되기에 적합한 것으로서 고려되고, 특히 적합한 펩티드는 단백질 정제용 친화도 태그들인데, 이는 이러한 태그들이 그들 각각의 결합 파트너에 높은 친화도로 결합하는 성향을 갖기 때문이다.
한 실시양태에서, 펩티드는 E5B9가 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산들의 짧은 중합체를 지칭하고, 이때 상기 펩티드는 2개 내지 100개의 아미노산들, 예를 들면, 5개 내지 99개, 예컨대, 6개 내지 98개, 7개 내지 97개, 8개 내지 96개 또는 5개 내지 25개의 아미노산들을 함유한다. 한 실시양태에서, 본 개시에서 사용된 펩티드는 50개 이하의 아미노산 잔기들, 예를 들면, 40개, 30개, 20개 또는 10개 이하의 아미노산 잔기들의 아미노산 서열이다. 본 개시에서 사용되는 펩티드는 목적에 맞추기에 충분한 길이를 갖고, 예를 들면, 펩티드가 링커인 경우, 이 펩티드는 그에 연결되는 단편이 그의 생물학적 기능을 수행할 수 있게 하기에 적합한 길이를 가질 필요가 있고; 대안적으로, 펩티드가 결합 파트너인 경우, 이 펩티드는 또 다른 물질, 예컨대, 항체에 특이적으로 결합할 수 있어야 한다.
한 실시양태에서, 결합 쌍의 다른 결합 파트너(대안적인 제1 또는 제2 결합 파트너)는 단백질이다.
본 명세서에서 사용된 "단백질"은 100개 이상의 아미노산들의 아미노산 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, 본 명세서에서 사용된 "단백질"은 2차 또는 3차 구조를 가진 아미노산 서열을 지칭한다.
폴리펩티드와 단백질은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 폴리펩티드는 일반적으로 단순한 구조를 가진, 예를 들면, 2차 및/또는 3차 구조를 거의 갖지 않는 단백질일 것이다.
한 실시양태에서, 펩티드와 단백질의 구별은 2차 구조 및/또는 3차 구조의 존재 또는 부재를 기준으로 하고, 이때 펩티드는 2차 구조를 갖지 않고, 2차 구조 및/또는 3차 구조를 가진 아미노산들은 단백질로서 간주된다.
한 실시양태에서, 단백질은 항체 또는 항체 단편이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 하나 이상의 항원 인식 부위(본 명세서에서 결합 부위로서도 지칭됨)를 통해 표적 항원, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드, 펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "항체 분자"는 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "항체 단편"은 Fab, 변경된 Fab, Fab', 변경된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, 2가, 3가 또는 3가 항체, Bis-scFv, 디아바디, 트리바디, 테트라바디 및 이들 중 임의의 분자의 에피토프 결합 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 항체 결합 단편을 지칭한다(예를 들면, 문헌(Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136) 및 문헌(Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) 참조). 이들 항체 단편들을 생성하고 제조하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181) 참조). 본 개시에서 사용될 다른 항체 단편은 국제 특허출원 공보 제WO05/003169호, 제WO05/003170호 및 제WO05/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성, 예를 들면, 이중특이성을 포함할 수 있거나 단일특이적일 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO92/22853호, 제WO05/113605호, 제WO2009/040562호 및 제WO2010/035012호 참조).
본 명세서에서 사용된 "결합 단편"은 단편을 표적 펩티드 또는 항원에 대해 특이적인 단편으로서 특징규명하기에 충분한 친화도로 표적 펩티드 또는 항원에 결합할 수 있는 단편을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fab 단편"은 경쇄의 VL(가변 경쇄) 도메인 및 불변 도메인(CL)을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH(가변 중쇄) 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 일례에서, Fab 단편의 중쇄 서열은 CH1의 쇄간 시스테인에서 "종결된다". 한 실시양태에서, 본 개시의 융합 단백질, 예컨대, A-X 및/또는 B-Y에서 사용되는 Fab 단편은 1가 Fab 단편이다.
본 명세서에서 사용된 "Fab' 단편"은 힌지 영역의 전부 또는 일부를 추가로 포함하는 Fab 단편을 지칭한다. 한 실시양태에서, 본 개시의 융합 단백질, 예컨대, A-X 및/또는 B-Y에서 사용되는 Fab' 단편은 1가 Fab' 단편이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단일 쇄 Fv" 또는 약칭 "scFv"는 (예를 들면, 펩티드 링커에 의해) 연결되어 단일 폴리펩티드 쇄를 형성하는 VH 및 VL 항체 도메인들을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역들은 이 포맷에서 생략된다. 본 명세서에서 사용된 "단일 쇄 Fv"는 그의 디설파이드 안정화된 버전을 포함하고, 이때 펩티드 링커 이외에 디설파이드 결합이 가변 영역들 사이에 존재한다.
디설파이드 안정화된 scFv는 가변 영역들이 분리되고 다시 합쳐지는 것과 관련된, 동력학적으로 호흡하는 일부 가변 영역들의 성향을 제거할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단일 도메인 항체"는 단일 단량체성 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. 단일 도메인 항체의 예로는 VH 또는 VL 또는 VHH가 있다.
한 실시양태에서, 항체 결합 단편 및/또는 이중특이적 항체 복합체는 Fc 영역을 포함하지 않는다. 본 명세서에서 사용된 "Fc 영역을 포함하지 않는"은 보다 적은 불변 도메인, 예컨대, 존재하지 않는 CH2, CH3 및 CH4를 지칭한다. 그러나, 불변 도메인, 예컨대, CH1, C카파/C람다가 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고 항체 경쇄는 CL 도메인 카파 또는 람다를 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 CL 도메인 카파 또는 람다를 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체의 제1 단백질 A 및/또는 제2 단백질 B는 항체 또는 항체 단편이다. 이러한 이중특이적 단백질 복합체는 이중특이적 항체 복합체로서 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "이중특이적 항체 복합체"는 2개 이상의 항체 결합 부위들을 포함하는 이중특이적 단백질 복합체를 지칭하고, 이때 성분 항체, 단편 또는 이들 둘 다가 이종이량체성-테터에 의해 함께 복합체화된다.
이중특이적 항체 복합체는 통상적으로 2개 이상의 항원 결합 부위들을 포함하는 분자를 지칭하고, 이때 상기 결합 부위들은 동일하지 않은 특이성을 가진다.
한 실시양태에서, 2개의 단백질들(예를 들면, 항체, 단편, 또는 항체와 단편의 조합물)은 동일한 항원을 표적화하고, 예를 들면, 동일한 표적 항원 상의 2개의 상이한 에피토프들에 결합한다(본 명세서에서 바이파라토프성(biparatopic) 이중특이적 단백질로서도 지칭됨).
또 다른 실시양태에서, 2개의 단백질들(예를 들면, 항체, 단편, 또는 항체와 단편의 조합물)은 상이한 항원 특이성을 가질 수 있고, 예를 들면, 2개의 상이한 표적 항원들에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 2개의 단백질들은 동일하므로, 즉 동일한 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합하므로, 복합체는 단일특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 항체 복합체에서 사용되는 각각의 항체 또는 단편은 1개의 결합 부위를 포함한다. 즉, 각각의 결합 부위는 각각의 표적 항원에 대해 1가이다.
융합 단백질(A-X 또는 B-Y)에서 사용되는 전장 항체 또는 항체 단편은 단일특이적, 1가, 다가 또는 이중특이적일 수 있다.
유리하게는, 2개의 이중특이적 항체들 또는 항체 단편들의 사용은 본 개시의 이중특이적 항체 복합체가 최대 4개의 상이한 항원들에 대한 특이성을 잠재적으로 나타낼 수 있게 한다(즉, 상기 복합체는 사중특이적일 수 있다). 이것은 친화력(avidity) 유형 효과가 조사될 수 있게 한다.
한 실시양태에서, 제1 융합 단백질(A-X)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 단일특이적 항체 또는 항체 단편, 특히 1가 Fab, Fab', scFv, Fv, VHH 또는 유사한 물질이다.
한 실시양태에서, 제2 융합 단백질(B-Y)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 단일특이적 항체 또는 항체 단편, 특히 1가 Fab, Fab', scFv 또는 유사한 물질이다.
본 명세서에서 사용된 "단일특이적"은 1개의 표적 항원에만 결합하는 능력을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "1가"는 단일 결합 부위를 가짐으로써 오직 표적 항원에만 한 번 결합하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
한 실시양태에서, 제1 융합 단백질(A-X)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가, 즉 2개 이상의 결합 도메인들을 가진다.
한 실시양태에서, 제2 융합 단백질(B-Y)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가, 즉 2개 이상의 결합 도메인들을 가진다.
한 실시양태에서, 제1 융합 단백질(A-X)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 1가이고 제2 융합 단백질(B-Y)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 1가이다.
한 실시양태에서, 제1 융합 단백질(A-X)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 1가이고 제2 융합 단백질(B-Y)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가이다.
한 실시양태에서, 제1 융합 단백질(A-X)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가이고 제2 융합 단백질(B-Y)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 1가이다.
한 실시양태에서, 제1 융합 단백질(A-X)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가이고 제2 융합 단백질(B-Y)에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가이다.
한 실시양태에서, A-X 또는 B-Y는 2개의 scFv들, 즉 항원 CD33에 대해 특이적인 1개의 scFv 및 항원 CD3에 대해 특이적인 1개의 scFv를 포함하는 융합 단백질 또는 대안적으로 이들 2개의 항원들에 대해 특이적인 이중특이적 복합체 포맷이 아니다.
한 실시양태에서, A-X 또는 B-Y는 펩티드 E5B9에 연결된 CD3에 대해 특이적인 scFv(또는 대안적으로 또 다른 항체 포맷)을 포함하는 융합 단백질이 아니다.
본 명세서에서 사용된 "결합 도메인 또는 부위"는 항원/에피토프와 접촉하고 이들과의 결합 상호작용에 참여하는 항체의 부분이다. 한 실시양태에서, 결합 도메인은 하나 이상의 가변 도메인 또는 이의 유도체, 예를 들면 한 쌍의 가변 도메인들 또는 이들의 유도체, 예컨대, 동족 쌍의 가변 도메인들 또는 이들의 유도체를 함유한다.
한 실시양태에서, 결합 도메인은 특히 결합 도메인이 도메인 항체, 예컨대, VH, VL 또는 VHH인 경우 3개의 CDR들을 포함한다. 한 실시양태에서, 결합 도메인은 2개의 가변 도메인들 및 6개의 CDR들 및 골격을 포함하고 이들 요소들은 함께 항체 또는 결합 단편과 항원/에피토프의 결합 상호작용의 특이성에 기여한다.
본 명세서에서 사용된 "동족 쌍"은 미리 형성된 커플로서 숙주로부터 단리된 중쇄 및 경쇄 쌍을 지칭한다. 이 정의는 라이브러리로부터 단리된 가변 도메인을 포함하지 않고, 이때 숙주로부터의 원래의 페어링은 보유되지 않는다. 동족 쌍은 숙주에서 종종 친화 성숙되므로 그가 특이성을 나타내는 항원에 대한 높은 친화도를 가질 수 있기 때문에 유리할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "천연 생성 도메인의 유도체"는 예를 들면, 바람직하지 않은 성질을 제거함으로써, 도메인의 성질을 최적화하기 위해 천연 생성 서열에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 교체되어 있거나 결실되어 있되 도메인의 특징적인 특징(들)이 보유되어 있는 경우를 지칭하기 위한 것이다. 변경의 예는 글리코실화 부위, GPI 앵커 또는 용매 노출된 라이신을 제거하기 위한 변경이다. 이들 변경들은 관련 아미노산 잔기를 보존적 아미노산 치환으로 교체함으로써 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 항체 복합체 또는 이의 항체/단편 성분을 프로세싱하여 표적 항원 또는 항원들에 대한 개선된 친화도를 제공한다. 이러한 변이체는 CDR들의 돌연변이(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 쇄 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 이. 콜라이(E. coli)의 돌연변이자 균주의 사용(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 성적 PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 비롯한 다수의 친화도 성숙 프로토콜들에 의해 수득될 수 있다. (상기) 문헌(Vaughan et al.)은 이들 친화 성숙 방법들을 논의한다.
한 실시양태에서, 제1 항체 또는 항체 단편(A)은 제1 항원에 대해 특이적이고 제2 항체 또는 항체 단편(B)은 제2 항원에 대해 특이적이고, 이때 제1 항원과 제2 항원은 상이하다. 유리하게는, 이중특이적 항체 복합체는 2개의 상이한 항원들에 대해 특이적일 수 있다. 이것은 항체 복합체가 상이한 물질 상에 각각 위치하는 2개의 상이한 항원들에 결합함으로써 상기 2개의 물질들이 서로 물리적으로 가깝게 인접하여 위치하게 할 가능성을 제공한다.
대안적으로, 제1 항체 또는 항체 단편(A)은 제1 에피토프에 대해 특이적일 수 있고 제2 항체 또는 항체 단편(B)은 제2 에피토프에 대해 특이적일 수 있고, 이때 제1 에피토프와 제2 에피토프는 둘 다 동일한 항원 상에에 존재한다. 이것은 항원과 이중특이적 항체 복합체 사이의 다중 상호작용으로 인해 항원에 대한 이중특이적 항체 복합체의 친화력을 크게 향상시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 항체 복합체의 제1 항체(A) 또는 제2 항체(B), 또는 제1 항체 및 제2 항체 둘 다가 임의적으로 불활성 또는 활성 Fc 영역을 가진 IgG일 수 있다.
한 실시양태에서, 제1(A) 또는 제2(B) 항체 단편은 항원 결합 단편(Fab), Fab', 단일 쇄 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체(sdAb), 예컨대, VHH로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 항체 복합체의 제1 항체/단편(A), 제2 항체/단편(B), 또는 제1 항체/단편 및 제2 항체/단편 둘 다가 Fab일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 항체 복합체의 제1 항체/단편(A), 제2 항체/단편(B), 또는 제1 항체/단편 및 제2 항체/단편 둘 다가 Fab'일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 항체 복합체의 제1 항체/단편(A), 제2 항체/단편(B), 또는 제1 항체/단편 및 제2 항체/단편 둘 다가 scFv일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 항체 복합체의 제1 항체/단편(A), 제2 항체/단편(B), 또는 제1 항체/단편 및 제2 항체/단편 둘 다가 VHH이다.
편의를 위해, 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체는 본 명세서에서 A-X:Y-B로서 지칭된다. 그러나, 본 발명자들의 실험은 결합 파트너 X 및 Y가 본 방법에 악영향을 주지 않으면서 역전될 수 있다는 것, 즉 A-Y 및 B-X일 수 있다는 것을 시사하기 때문에 이 명명법은 융합 단백질 A-X 및 B-Y가 어떻게 디자인되는지를 한정하기 위한 것이 아니다. 따라서, A와 B 및 X와 Y는 본 기술의 설명을 보조하기 위해 지칭되는 명목상의 표지이다.
본 명세서에서 사용된 "부착된"은 직접적으로 또는 링커, 예컨대, 펩티드 링커(이의 예들은 이하에 논의되어 있음)를 통해 간접적으로 연결된 또는 회합된 상태를 지칭한다. "직접적으로 연결된"은 함께 융합된(예를 들면, 펩티드 결합) 또는 화학적으로 접합된 상태를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "결합 파트너"는 결합 쌍의 한 성분 부분을 지칭한다.
한 실시양태에서, 결합 파트너의 친화도는 높고, 5 nM이거나 더 강하고, 예컨대, 900, 800, 700, 600, 500, 400 또는 300 pM이거나 더 강하다.
본 명세서에서 사용된 "결합 쌍"은 서로 특이적으로 결합하는 2개의 결합 파트너들을 지칭한다. 결합 쌍의 예는 펩티드와 그에 대해 특이적인 항체 또는 결합 단편, 또는 효소와 리간드, 또는 효소와 그 효소의 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(X)는 전장 항체, Fab, Fab', Fv, dsFv, scFv 및 sdAb를 포함하는 군으로부터 선택되고, 이때 sdAb의 예로는 VH 또는 VL 또는 VHH가 있다.
X가 항체 또는 이의 결합 단편인 경우, Y는 단백질 또는 펩티드, 특히 펩티드이다.
한 실시양태에서, 제2 파트너(Y)는 전장 항체, Fab, Fab', Fv, dsFv, scFv 및 sdAb를 포함하는 군으로부터 선택되고, 이때 sdAb의 예로는 VH 또는 VL 또는 VHH가 있다.
Y가 항체 또는 이의 결합 단편인 경우, X는 단백질 또는 펩티드, 특히 펩티드이다.
한 실시양태에서, A가 항체 또는 이의 단편인 경우, 제1 결합 파트너(X)는 제1 항체 또는 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 부착되고, 예를 들면, 제1 결합 파트너(X)는 제1 항체 또는 항체 단편(A)의 중쇄의 C-말단에 부착된다.
또 다른 실시양태에서, B가 항체 또는 이의 단편인 경우, 제2 결합 파트너(Y)는 제2 항체 또는 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 부착되고, 예를 들면, 제2 결합 파트너(Y)는 제2 항체 또는 항체 단편(B)의 중쇄의 C-말단에 부착된다.
한 실시양태에서, X는 항체 또는 단편(단백질 A)의 중쇄의 C-말단에 부착되고 Y는 항체 또는 단편(단백질 B)의 중쇄의 C-말단에 부착된다.
한 실시양태에서, X는 당분야에서 공지되어 있거나 본 명세서에 후술되어 있는 링커(예컨대, ASGGGG 서열번호 71 또는 ASGGGGSG 서열번호 72) 또는 임의의 다른 적합한 링커를 통해 항체 또는 단편(단백질 A)의 중쇄의 C-말단에 부착되고 Y는 링커(예컨대, ASGGGG 서열번호 71 또는 ASGGGGSG 서열번호 72)를 통해 항체 또는 단편(단백질 B)의 중쇄의 C-말단에 부착된다.
적합한 결합 쌍(X 또는 Y)의 예로는 GCN4(서열번호 1, 또는 HIS 태그를 결여함, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 38) 또는 이의 변이체, 및 GCN4에 대해 특이적인 scFv인 52SR4(서열번호 3, 또는 HIS 태그를 결여함, 서열번호 3의 아미노산 1 내지 243) 또는 이의 변이체가 있을 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(명목상 X)는 GCN4(예를 들면, 서열번호 1로 표시됨), 또는 이의 단편 또는 변이체(예를 들면, His 태그를 갖지 않음)이고 제2 결합 파트너(명목상 Y)는 GCN4에 대해 특이적인 scFv 또는 VHH(예를 들면, 서열번호 3으로 표시됨) 또는 이의 변이체이다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(명목상 X)는 GCN4에 대해 특이적인 sFv 또는 VHH(예를 들면, 서열번호 3으로 표시됨) 또는 이의 변이체이고 제2 결합 파트너(명목상 Y)는 GCN4(예를 들면, 서열번호 1로 표시됨), 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
GCN4 변이체는 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. GCN4 변이체는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서열, 또는 엄격한 조건 하에서 서열번호 2와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열도 포함한다.
GCN4에 대해 특이적인 적합한 scFv는 52SR4(서열번호 3) 또는 이의 변이체이다. 52SR4의 변이체는 서열번호 3과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 52SR4 변이체는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서열, 또는 엄격한 조건 하에서 서열번호 4와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열도 포함한다.
본 발명자들은 단일 쇄 항체 52SR4 및 펩티드 GCN4가 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체에서 사용되기에 적합한 결합 쌍이다.
대안적으로, 임의의 적합한 항체/단편 및 항원(예컨대, 펩티드)은 X 및 Y로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 X 및 Y 쌍은 A-X 및 Y-B가 1:1 몰 비로 조합될 때 75% 초과의 이종이량체를 생성한다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(X) 및 제2 결합 파트너(Y)는 단백질이다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(X)는 효소 또는 이의 활성 단편이고 제2 결합 파트너(Y)는 리간드이거나, 역의 경우도 가능하다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(X)는 효소 또는 이의 활성 단편이고 제2 결합 파트너(Y)는 그 효소의 억제제이거나, 역의 경우도 가능하다.
본 명세서에서 사용된 "활성 단편"은 물질에 대한 전체 아미노산 서열보다 더 짧고 본질적으로 동일한 생물학적 활성 또는 관련 생물학적 활성, 예를 들면, 50% 초과, 예컨대, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 활성을 보유하는 아미노산 단편을 지칭한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 결합 파트너 X는 글루타티온(GSH)이고 제2 결합 파트너 Y는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)이거나, 역의 경우도 가능하다.
또 다른 실시양태에서, X는 Fos이고 Y는 Jun이거나, 역의 경우도 가능하다.
또 다른 실시양태에서, X는 His이고 Y는 항-His이거나, 역의 경우도 가능하다.
또 다른 실시양태에서, 결합 쌍은 칼모듈린 결합 펩티드이고 Y는 칼모듈린이거나, 역의 경우도 가능하다.
또 다른 실시양태에서, X는 말토스 결합 단백질이고 Y는 항-말토스 결합 단백질 또는 이의 단편이거나, 역의 경우도 가능하다.
다른 효소-리간드 조합물도 결합 파트너에서 사용될 것으로 예상된다. 단백질 정제용으로 당분야에서 공지되어 있는 친화도 태그들은 그들 각각의 결합 파트너에 높은 친화도로 결합하는 성향을 갖기 때문에 이들도 적합하다.
본 명세서에서 사용된 "동일성"은 정렬된 서열 내의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에 동일하다는 것을 표시한다. 본 명세서에서 사용된 "유사성"은 정렬된 서열 내의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열들 사이에 유사한 유형의 아미노산 잔기라는 것을 표시한다. 예를 들면, 이소류신 또는 발린을 류신으로 치환시킬 수 있다. 종종 또 다른 아미노산을 치환시킬 수 있는 다른 아미노산은 하기 아미노산들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 가진 아미노산);
- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 가진 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 가진 아미노산).
동일성 및 유사성의 정도는 용이하게 계산될 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 결합 파트너(X 또는 Y)는 단백질 또는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질은 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다. 상기 링커는 융합 단백질 내의 다양한 위치들에서 도입될 수 있다. 예를 들면, 링커는 결합 파트너와 이에 부착된 단백질 사이에 도입될 수 있다.
한 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "펩티드 링커"는 아미노산 서열을 가진 펩티드를 지칭한다. 다양한 적합한 펩티드 링커들이 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
한 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체의 결합 파트너들은 펩티드 링커를 통해 그들 각각의 단백질에 연결된다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 번역 융합체, 즉 융합 단백질을 발현하는 유전적 구축물을 포함하는 숙주 세포에서 발현된 융합 단백질이다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 임의적으로 펩티드 링커를 통해 A의 중쇄를 X에 융합시키고/시키거나 B의 중쇄를 Y에 융합시킴으로써 제조된다.
한 실시양태에서, 펩티드 링커는 길이 면에서 50개 이하의 아미노산들, 예를 들면, 20개 이하의 아미노산들이다.
일반적으로, 융합 단백질을 재조합적으로 발현하는 것이 더 효율적일 것이므로, 숙주 세포에 의해 발현될 수 있는 직접적인 펩티드 결합 또는 펩티드 링커가 유리할 수 있다.
한 실시양태에서, 링커는 서열번호 5 내지 72로 표시된 서열 또는 PPP로부터 선택된다.
Figure 112016120995546-pct00003
Figure 112016120995546-pct00004
Figure 112016120995546-pct00005
강성 링커의 예로는 펩티드 서열 GAPAPAAPAPA(서열번호 69), PPPP(서열번호 70) 및 PPP가 있다.
다른 링커는 표 3에 표시되어 있다:
Figure 112016120995546-pct00006
한 양태에서, 하기 단계들을 포함하는, 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체를 제조하는 방법이 제공된다:
(a) 결합 쌍의 제1 결합 파트너(X)에 부착된, 제1 단백질(A)을 포함하는 제1 융합 단백질(A-X)을 제조하는 단계;
(b) 결합 쌍의 제2 결합 파트너(Y)에 부착된, 제2 단백질(B)을 포함하는 제2 융합 단백질(B-X)을 제조하는 단계;
(c) 단계 a) 및 b)에서 제조된 제1 융합 단백질(A-X)과 제2 융합 단백질(B-Y)을 함께 혼합하는 단계
를 포함하는, 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체를 제조하는 방법이 제공된다.
전형적으로, 단계 (c)에서의 A-X와 B-Y의 혼합은 1:1 몰 비로 수행된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 복합체에서 사용된 각각의 융합 단백질은 발현 실험에서 숙주 세포 또는 숙주 세포들에서의 발현에 의해 제조된다.
한 양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질 복합체를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들:
(a) 결합 쌍의 제1 결합 파트너(X)에 부착된 제1 단백질(A)을 포함하는 제1 융합 단백질(A-X)을 발현시키는 단계; 및
(b) 결합 쌍의 제2 결합 파트너(Y)에 부착된 제2 단백질(B)을 포함하는 제2 융합 단백질(B-Y)을 발현시키는 단계
를 포함하며, 융합 단백질 A-X 및 B-Y가 동일한 숙주 세포 또는 상이한 숙주 세포들로부터 발현되는 것인 방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용된 "상이한 숙주 세포"는 동일한 유형(심지어 동일한 클론 유형)의 세포를 비롯한 개별 세포를 지칭한다.
한 실시양태에서, 발현은 일과성 발현이다. 일과성 발현의 사용은 정제에 의존하지 않으면서 이중특이적 복합체를 생성하는 능력과 조합될 때 매우 유리하다. 일과성 형질감염이 안정한 형질감염보다 훨씬 더 단순하고 덜 자원 집중적이기 때문에 이것은 이중특이적 단백질 복합체를 생성하는 신속한 방법을 유발한다.
한 실시양태에서, 발현은 안정한 발현이고, 즉 해당 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 삽입되어 있다.
한 실시양태에서, 동일한 또는 상이한 폴리뉴클레오티드 서열 상에서 A-X를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 B-Y를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 기능 분석법의 일부로서 세포 내로 형질감염되고, 이때 단백질은 세포에서 발현되고/되거나 세포로부터 방출된다. 특히, 상기 폴리뉴클레오티드들은 동일한 또는 상이한 플라스미드들 상에 일과성 형질감염되어 있다.
A-X와 B-Y의 혼합은 일반적으로 X와 Y가 상호작용할 수 있는 조건에서 수행된다. 한 실시양태에서, 융합 단백질을 세포 배양 조건 하에서 세포 배양 배지에서 항온처리하고, 예를 들면, 융합 단백질을 37℃/5% CO2 환경에서 90분 동안 항온처리한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 융합 단백질을 수성 환경에서 혼합하고, 예를 들면, 한 융합 단백질을 고체 표면, 예컨대, 비드 또는 플레이트에 결합시킬 수 있고, 이것에 다른 융합 단백질을 수성 용액/현탁액 상태로 도입할 수 있다. 고체상은 여분의 성분 및 시약이 용이하게 세척될 수 있게 한다. 한 실시양태에서, 융합체들 중 어느 것도 고체상에 부착시키지 않고 액체/용액/매질에서 단순히 혼합한다. 따라서, 한 실시양태에서, A-X 및 B-Y를 수성 매질 중의 유리 단백질로서 혼합한다.
유리하게는, 본 개시의 방법은 이종 쌍들 사이에(즉, 제1 융합 단백질[A-X]과 제2 융합 단백질[B-Y] 사이에) 형성된 복합체를 제조하는 데에 이용될 수 있고, 이때 동종 쌍들 사이의(즉, 2개의 제1 융합 단백질들[A-X] 또는 제2 융합 단백질들[B-Y] 사이의) 상호작용은 최소화된다. 따라서, 본 방법은 동종이량체성 복합체로 최소한으로 오염되어 있거나 전혀 오염되어 있지 않은 다수의 이중특이적 단백질 복합체가 제조될 수 있게 한다. 본 개시의 구축물 및 방법의 장점은 A-X 대 B-Y의 비가 A-X 및 B-Y의 성질에 의해 조절되고, 특히 1:1의 몰 비가 달성될 수 있다는 것이다. 조절이라는 이 요소는 일부 종래기술 방법들에 비해 유의한 개선이다.
한 실시양태에서, 본 개시의 방법은 상승적인 활성을 갖는 것으로서 확인된 1쌍의 가변 영역들(특히, 2쌍의 가변 영역들)을 필요하다면 임의적으로 미리 인간화시키면서 상기 가변 영역들을 대안적인 이중특이적 포맷 내로 전달하는 추가 단계를 포함하고, 상기 대안적인 이중특이적 포맷은 대안적인 치료 포맷, 및/또는 보다 길게 지속되는(예를 들면, 1주 이상 실시되는) 분석법에서 시험되기에 적합한 연장된 반감기를 가진 포맷이다.
다가 포맷은 당분야에서 공지되어 있는 다가 포맷 및 본 명세서에 기재된 다가 포맷, 예컨대, DVD-Ig, 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2009/040562호 및 제WO2010/035012호에 개시된 FabFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 등을 포함한다.
이중특이적 포맷 및 다중특이적 포맷(치료 포맷을 포함함)의 다른 예로는 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 텐덤 scFv, 텐덤 scFv-Fc, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab'-scFv, diFab, diFab', 에스씨디아바디(scdiabody), 에스씨디아바디-Fc, ScFv-Fc-scFv, 에스씨디아바디-CH3, IgG-scFv, scFv-IgG, V-IgG, IgG-V, DVD-Ig, 및 듀오바디(DuoBody)가 있다.
본 명세서에서 사용된 "디아바디"는 2개의 Fv 쌍들, 즉, 제1 Fv의 VH가 제2 Fv의 VL에 연결되고 제1 Fv의 VL이 제2 Fv의 VH에 연결되도록 2개의 상호-Fv 링커들을 가진 VH/VL 및 추가 VH/VL 쌍을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "트리아바디"는 3개의 Fv 쌍들 및 3개의 상호-Fv 링커들을 포함하는, 디아바디와 유사한 포맷을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "테트라바디"는 4개의 Fv 쌍들 및 4개의 상호-Fv 링커들을 포함하는, 디아바디와 유사한 포맷을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "텐덤 scFv"는 단일 상호-Fv 링커가 존재하도록 단일 링커를 통해 서로 연결된 2개의 scFv들(링커를 각각 포함하는 것이 통상적인 방식임)을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "탠덤 scFv-Fc"는 각각 하나가 예를 들면, 힌지를 통해 불변 영역 단편 -CH2CH3의 CH2 도메인의 N-말단에 추가되어 있는 2개의 탠덤 scFv들을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "FabFv"는 중쇄의 CH1 및 경쇄의 CL 각각의 C-말단에 추가된 가변 영역을 가진 Fab 단편을 지칭한다. 이 포맷은 그의 PEG화된(PEGylated) 버전으로서 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "Fab'Fv"는 FabFv와 유사하고, 이때 Fab 부분은 Fab'로 교체되어 있다. 이 포맷은 그의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "FabdsFv"는 인트라-Fv 디설파이드 결합이 추가된 C-말단 가변 영역을 안정화시키는 FabFv를 지칭한다. 이 포맷은 그의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "Fab-scFv"는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단 상에 추가된 scFv를 가진 Fab 분자이다.
본 명세서에서 사용된 "Fab'-scFv"는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단 상에 추가된 scFv를 가진 Fab' 분자이다.
본 명세서에서 사용된 "DiFab"는 자신들의 중쇄 C-말단을 통해 연결된 2개의 Fab 분자들을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "DiFab'"는 그의 힌지 영역에서 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 연결된 2개의 Fab' 분자들을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "에스씨디아바디"는 분자가 3개의 링커들을 포함하고 추가 Fv 쌍의 가변 영역들 중 하나에 각각 연결된 VH 및 VL 말단을 가진 정상 scFv를 형성하도록 인트라-Fv 링커를 포함하는 디아바디이다.
본 명세서에서 사용된 "에스씨디아바디-Fc"는 각각 하나가 예를 들면, 힌지를 통해 불변 영역 단편 -CH2CH3의 CH2 도메인의 N-말단에 추가되어 있는 2개의 에스씨디아바디들이다.
본 명세서에서 사용된 "ScFv-Fc-scFv"는 각각 하나가 -CH2CH3 단편의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 N-말단 및 C-말단에 추가되어 있는 4개의 scFv들을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "에스씨디아바디-CH3"은 예를 들면, 힌지를 통해 CH3 도메인에 각각 연결된 2개의 에스씨디아바디 분자들을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "IgG-scFv"는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C-말단 상에서 scFv를 가진 전장 항체이다.
본 명세서에서 사용된 "scFv-IgG"는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N-말단 상에서 scFv를 가진 전장 항체이다.
본 명세서에서 사용된 "V-IgG"는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N-말단 상에서 가변 도메인을 가진 전장 항체이다.
본 명세서에서 사용된 "IgG-V"는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C-말단 상에서 가변 도메인을 가진 전장 항체이다.
(이중 V 도메인 IgG로서도 공지되어 있는) DVD-Ig는 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄의 N-말단 상에서 하나씩 4개의 추가 가변 도메인들을 가진 전장 항체이다.
본 명세서에서 사용된 듀오바디 또는 'Fab-아암 교환'은 2개의 상이한 단일클론 항체들의 불변 도메인(전형적으로 CH3) 내의 일치된 상보적 조작된 아미노산 변화가 혼합 시 이종이량체의 형성을 유발하는 경우의 이중특이적 IgG 항체 포맷이다. 잔기 조작의 결과로서, 제1 항체로부터의 중쇄/경쇄 쌍은 제2 항체의 중쇄:경쇄 쌍과 회합하는 것을 더 선호한다.
존재하는 경우 본 개시의 이중특이적 항체 복합체 또는 항체 분자의 불변 영역 도메인은 상기 복합체 또는 항체 분자의 제안된 기능 및 특히 요구될 수 있는 이펙터 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있고, 특히 항체 분자가 치료 용도를 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구될 때 IgG1 및 IgG3 이소타입의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, IgG2 및 IgG4 이소타입은 항체 분자가 치료 목적을 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때 사용될 수 있다. 이들 불변 영역 도메인들의 서열 변이체도 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들면, 위치 241의 세린이 문헌(Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108)에 기재된 바와 같이 프롤린으로 교체되어 있는 IgG4 분자가 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체가 IgG4 항체인 실시양태에서, 상기 항체는 돌연변이 S241P를 포함할 수 있다.
당업자는 항체가 다양한 번역 후 변경들을 겪을 수 있다는 것도 이해할 것이다. 이들 변경들의 유형 및 정도는 종종 항체를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포주에 의존할 뿐만 아니라 배양 조건에도 의존한다. 이러한 변경은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변경을 포함할 수 있다. 흔한 변경은 (문헌(Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995)에 기재된 바와 같이) 카복시펩티다제의 작용으로 인한 카복시-말단 염기성 잔기(예컨대, 라이신 또는 아르기닌)의 상실이다. 따라서, 항체 중쇄의 C-말단 라이신이 존재하지 않을 수 있다.
본 개시는 전술된 하나 이상의 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 조성물로서, 예를 들면, 동종이량체성 복합체로 최소한으로 오염되어 있거나 전혀 오염되어 있지 않은 본 개시에 따른 이종이량체성 이중특이적 복합체를 주로 포함하는 조성물도 제공한다.
한 실시양태에서, 조성물에서 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 융합 단백질이 이중특이적 단백질 복합체 형태로 존재한다.
한 실시양태에서, 조성물에서 60% 이상의 융합 단백질이 이중특이적 단백질 복합체 형태로 존재한다.
한 실시양태에서, 형성된 복합체는 추가 정제 단계를 요구하지 않으므로, 조성물은 정제되지 않은 이중특이적 복합체를 포함한다.
한 실시양태에서, 형성된 복합체는 1개의 정제 단계, 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피를 요구한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 예를 들면, 본 개시에 따른 융합 단백질의 발현 후 및 상기 융합 단백질의 혼합 전에 하나 이상의 정제 단계를 추가로 포함한다.
한 양태에서, 본 개시는 본 명세서에서 정의된 융합 단백질, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체, 상기 융합 단백질 또는 상기 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 조성물, 다중체, 어레이 및 라이브러리에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체는 용액 또는 현탁액 중에 존재한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체는 고체 기판 표면 상에 고착되어 있다.
한 실시양태에서, 다중체는 어레이, 예를 들면, 마이크로플레이트, 예컨대, 96 또는 384 웰 플레이트의 형태로 존재한다. 이러한 어레이는 원하는 기능성을 가진 이중특이적 단백질 복합체를 확인하기 위한 스크리닝 분석법에서 용이하게 실험될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체는 비드에 접합되어 있다.
상기 정의된 융합 단백질은 본 개시에 따른 이중특이적 단백질 복합체의 성분이다. 한 양태에서, 본 개시는 본 명세서에 기재된 융합 단백질에 관한 것이다.
추가 양태에서, 2개 이상의 상기 정의된 융합 단백질들을 포함하는 라이브러리가 제공된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "라이브러리"는 본 개시의 2개 이상의 이중특이적 항체 복합체들, 또는 조합되어 본 개시에 따른 2개 이상의 상이한 이중특이적 항체 복합체들을 형성할 수 있는 본 개시의 다수의 융합 단백질들을 지칭한다. 본 명세서 전체에 기재된 바와 같이, 용어 "라이브러리"는 그의 가장 넓은 의미로 사용되고 서브라이브러리도 포괄할 수 있다.
유리하게는, 라이브러리는 그 자신에 부착된 특정 결합 쌍의 제1 결합 파트너(X) 또는 제2 결합 파트너(Y)를 가진 다양한 상이한 융합 단백질들을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 라이브러리의 일부는 결합 파트너 X에 각각 연결된 단백질/항체/단편을 포함하고, 라이브러리의 나머지는 결합 파트너 Y에 각각 연결된 동일한 단백질/항체/단편을 포함한다. 따라서, 한 융합 단백질이 부착된 결합 쌍의 제1 결합 파트너를 갖고 다른 융합 단백질이 부착된 결합 쌍의 제2 결합 파트너를 갖는 한, 이것은 임의의 2개 융합 단백질들이 용이하게 조합되어 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체를 형성할 수 있게 한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질 복합체는 치료 적용에 적합하고 질환을 치료하기 위한 신규 요법을 제공할 수 있다. 따라서, 추가 양태에서, 요법에서 사용될 전술된 이중특이적 단백질 복합체가 제공된다. 이중특이적 단백질 복합체는 다양한 질환들, 예컨대, 자가면역 질환 및 암을 치료하는 데에 적합하다.
대조적으로, 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체는 T-림프구에 대해 특이적인 한 항체 또는 항체 단편, 및 암 특이적 항원에 대해 특이적인 또 다른 항체 또는 항체 단편을 갖도록 조작될 수 있다. 그 결과, 본 개시의 이중특이적 항체 복합체는 유리하게는 통상의 단일클론 항체에 비해 더 높은 세포독성력을 가질 수 있다.
본 개시의 이중특이적 단백질 복합체는 다양한 자가면역 질환들에서 면역 및 자가면역 반응을 조절하기 위해 B 세포 기능을 억제하는 데에도 특히 적합하다.
따라서, 본 개시는 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 질환을 치료하는 방법까지 확장된다.
한 양태에서, 본 개시의 하나 이상의 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 방법을 위해 수득되었거나 수득될 수 있는 융합 단백질이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 방법으로부터 수득되었거나 수득될 수 있는 이중특이적 항체 복합체가 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시에 따른 방법에 의해 확인된 가변 영역 조합물을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체 분자가 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시의 방법으로부터 수득된 융합 단백질, 이중특이적 항체 복합체 또는 이중특이적/다중특이적 항체 분자를 포함하는 조성물, 예컨대, 약학 조성물이 제공된다.
약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 비롯한 다양한 상이한 성분들이 조성물에 포함될 수 있다. 조성물은 임의적으로 본 발명의 항체 집단의 특성을 변경시킴으로써, 예를 들면, 항체의 기능을 감소시킬 수 있고/있거나, 안정화시킬 수 있고/있거나, 지연시킬 수 있고/있거나, 조절할 수 있고/있거나 활성화시킬 수 있는 추가 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 고체 또는 액체 형태로 존재할 수 있고, 특히 분말, 정제, 용액 또는 에어로졸의 형태로 존재할 수 있다.
본 개시는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 약학 또는 진단 조성물도 제공한다. 따라서, 병리학적 상태 또는 장애의 치료에서 사용되기 위한, 또는 병리학적 상태 또는 장애의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명의 이중특이적 단백질 복합체의 용도가 제공된다.
병리학적 상태 또는 장애는 예를 들면, 감염(바이러스, 세균, 진균 및 기생충), 감염과 관련된 내독성 쇼크, 관절염, 예컨대, 류마티스 관절염, 천식, 예컨대, 중증 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 골반 염증 질환, 알츠하이머병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 결장염, 페이로니병(Peyronie's Disease), 복강 질환, 담낭 질환, 필로니달병(Pilonidal disease), 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 졸중, I형 당뇨병, 라임병, 수막뇌염, 자가면역 포도막염, 중추 및 말초 신경계의 면역 관련 염증성 장애, 예컨대, 다발성 경화증, 루푸스(예컨대, 전신 홍반 루푸스) 및 귈랑-바레 증후군, 아토피성 피부염, 자가면역 간염, 섬유화 폐포염, 그레이브스병, IgA 신병증, 특발성 저혈소판자색반병, 메니에르병, 천포창, 원발성 담관 간경화증, 사르코이드증, 공피증, 베게너 육아종증, 다른 자가면역 장애, 췌장염, 외상(수술), 이식편-대-숙주 질환, 이식 거부, 허혈성 질환, 예컨대, 심근경색 및 죽상동맥경화증을 포함하는 심장 질환, 혈관내 응고, 골 재흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염, 위산감소증, 및 유방암, 폐암, 위암, 난소암, 간세포암, 결장암, 췌장암, 식도암, 두경부암, 신장암, 특히 신장 세포 암종, 전립선암, 간암, 흑색종, 육종, 골수종, 신경모세포종, 태반 융모막암종, 자궁경부암 및 갑상선암, 및 이들의 전이성 형태를 포함하는 암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 개시는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 약학 또는 진단 조성물도 제공한다. 따라서, 치료 및 약제의 제조에서 사용되기 위한 본 발명의 이중특이적 단백질 복합체의 용도가 제공된다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 통상적으로 포함할 멸균 약학 조성물의 일부로서 통상적으로 공급될 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체 분자 또는 이중특이적 항체 복합체를 첨가하고 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 또는 진단 조성물의 제조 방법도 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 부형제"는 본 개시의 조성물의 원하는 특성을 향상시키기 위한 약학적으로 허용가능한 제제화 담체, 용액 또는 첨가제를 지칭한다. 부형제는 당분야에서 잘 공지되어 있고 완충제(예를 들면, 구연산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제 및 중탄산염 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들면, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해가능한 마이크로스피어 내에 캡슐화될 수 있다. 제제는 일반적으로 멸균 제조 공정을 이용함으로써 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.
이것은 제제를 위해 사용되는 완충된 용매 용액을 제조하고 여과로 멸균하는 단계, 항체를 멸균 완충된 용매 용액에 무균 현탁하는 단계, 및 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 익숙한 방법으로 제제를 멸균 용기 내에 분배하는 단계를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 그 자체가 조성물을 제공받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고 독성을 나타내지 않아야 한다. 적합한 담체는 느리게 대사되는 큰 거대분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염, 예를 들면, 무기산 염, 예컨대, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산 염, 예컨대, 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염이 사용될 수 있다.
치료 조성물의 약학적으로 허용가능한 담체는 액체, 예컨대, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자에 의한 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로서 제제화될 수 있게 한다.
본 발명의 이중특이적 단백질 복합체는 예를 들면, 용액 또는 현탁액의 형태로 용매에 분산되어 전달될 수 있다. 상기 복합체는 적절한 생리학적 용액, 예를 들면, 생리학적 식염수, 약학적으로 허용가능한 용매 또는 완충된 용액에 현탁될 수 있다. 당분야에서 공지되어 있는 완충된 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하도록 물 1 ㎖당 0.05 mg 내지 0.15 mg의 에데트산이나트륨, 8.0 mg 내지 9.0 mg의 NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg의 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg의 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg의 구연산나트륨을 함유할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 현탁액은 예를 들면, 동결건조된 항체로부터 제조될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체의 철저한 논의는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991))으로부터 입수가능하다.
이중특이적 항체 복합체(또는 본 개시의 이중특이적/다중특이적 항체 분자)는 약학 또는 진단 조성물에서 유일한 활성 성분일 수 있거나, 다른 항체 성분, 예를 들면, 항-TNF, 항-IL-1β, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체, 또는 비-항체 성분, 예컨대, 잔틴을 포함하는 다른 활성 성분을 동반할 수 있다. 다른 적합한 활성 성분은 내성을 유도할 수 있는 항체, 예를 들면, 항-CD3 또는 항-CD4 항체를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 개시에 따른 항체, 단편 또는 조성물은 추가 약학적 활성 물질, 예를 들면, 코르티코스테로이드(예컨대, 플루티카손 프로피오네이트) 및/또는 베타-2-아고니스트(예컨대, 살부타몰, 살메테롤 또는 포르모테롤) 또는 세포 성장 및 증식의 억제제(예컨대, 라파마이신, 사이클로포스프마이드, 메토트렉세이트) 또는 대안적으로 CD28 및/또는 CD40 억제제와 함께 사용된다. 한 실시양태에서, 억제제는 소분자이다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 표적에 대해 특이적인 항체이다.
약학 조성물은 적합하게는 치료 유효량의 본 발명의 이중특이적 항체 복합체(또는 본 개시의 이중특이적/다중특이적 항체 분자)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 표적화된 질환 또는 상태를 치료하거나, 완화시키거나 예방하기 위해, 또는 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내기 위해 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 항체의 경우, 치료 유효량은 세포 배양 분석 또는 동물 모델, 통상적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 먼저 평가될 수 있다. 동물 모델은 투여의 적절한 농도 범위 및 경로를 결정하는 데에 이용될 수도 있다. 그 다음, 이러한 정보는 인간에서 투여를 위한 유용한 용량 및 경로를 결정하는 데에 이용될 수 있다.
인간 대상체를 위한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식습관, 투여의 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 요법에 대한 내성/반응에 의존할 것이다. 이 양은 상용적인 실험에 의해 결정될 수 있고 임상의의 판단 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg, 예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg일 것이다. 대안적으로, 용량은 하루에 1 내지 500 mg, 예컨대, 하루에 10 내지 100, 200, 300 또는 400 mg일 수 있다. 약학 조성물은 소정의 양의 본 발명의 활성 물질을 함유하는 유닛 용량 제형으로 편리하게 제공될 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있고 다른 물질, 약물 또는 호르몬과 함께(예를 들면, 동시에, 순차적으로 또는 별도로) 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 투여되는 용량은 치료될 상태의 성질, 존재하는 염증의 정도, 및 항체 분자가 예방적으로 사용되는 것인지 아니면 기존 상태를 치료하기 위해 사용되는 것인지의 여부에 의존한다. 용량의 빈도는 항체 분자의 반감기 및 그의 효과의 지속시간에 의존할 것이다. 항체 분자가 짧은 반감기(예를 들면, 2시간 내지 10시간)를 가진 경우, 하루에 하나 이상의 용량을 제공할 필요가 있을 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 긴 반감기(예를 들면, 2일 내지 15일)를 가진 경우, 단지 하루에 1회, 주마다 1회 또는 심지어 1개월 또는 2개월마다 1회 용량을 제공할 필요가 있을 수 있다.
본 개시에서, 최종 제제의 pH는 항체 또는 단편의 등전점의 값과 유사하지 않고, 제제의 pH가 7인 경우, 8 내지 9 또는 그 이상의 pI가 적절할 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 이것은 궁극적으로 개선된 안정성을 가진 최종 제제를 제공할 수 있다고, 예를 들면, 항체 또는 단편이 용액에 남아있다고 생각된다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 경막내, 심실내, 경진피, 경피(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO98/20734호 참조), 피하, 복강내, 코내, 장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 수의 경로들에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 투여하기 위해 하이포스프레이(Hyposprays)도 사용할 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 달성될 것이거나, 조직의 사이질 공간으로 전달될 것이다. 조성물은 관심 있는 특정 조직 내로 투여될 수도 있다. 용량 치료는 단회 용량 일정 또는 다회 용량 일정일 수 있다.
생성물이 주사 또는 주입을 위한 생성물인 경우, 상기 생성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고 제제화제, 예컨대, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 단백질 복합체(또는 본 개시의 이중특이적/다중특이적 항체 복합체)는 사용 전에 적절한 멸균 액체에 의해 재구성될 건조된 형태로 존재할 수 있다. 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 상기 조성물은 항체를 분해로부터 보호하되, 일단 위장관으로부터 흡수되면 이중특이적 단백질 복합체를 방출하는 물질을 함유할 필요가 있을 것이다.
본 개시에 따른 분무가능한 제제는 예를 들면, 포일 외피로 포장된 단회 용량 유닛(예를 들면, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)으로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 일정 부피, 예를 들면, 2 ㎖의 용매/용액 완충제에 유닛 용량을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "변이체"는 상응하는 야생형 펩티드 또는 단백질의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 변경을 함유하는 펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 변이체는 상응하는 야생형 펩티드 또는 단백질에 대한 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 그러나, 변이체가 그의 상응하는 야생형 펩티드 또는 단백질과 실질적으로 유사한 기능을 나타내는 한, 변이체는 80% 미만의 서열 동일성을 포함할 수 있다.
항원은 세포 표면 수용체, 예컨대, T-세포 또는 B-세포 신호전달 수용체, 동시자극 분자, 체크포인트 억제제, 자연 살해 세포 수용체, 면역글로불린 수용체, TNFR 패밀리 수용체, B7 패밀리 수용체, 유착 분자, 인테그린, 사이토카인/케모카인 수용체, GPCR, 성장 인자 수용체, 키나제 수용체, 조직 특이적 항원, 암 항원, 병원체 인식 수용체, 보체 수용체, 호르몬 수용체 또는 가용성 분자, 예컨대, 사이토카인, 케모카인, 류코트리엔, 성장 인자, 호르몬, 효소 또는 이온 통로, 및 이들의 에피토프, 단편 및 번역 후 변경된 형태를 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체는 1개 또는 2개의 세포 표면 수용체 특이성을 포함한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체는 1개 또는 2개의 사이토카인 또는 케모카인 특이성을 포함한다.
본 개시에 따른 방법에 의해 확인된 한 쌍의 표적들에 대한 항체 또는 단편은 실험실 시약, 분석 시약 또는 치료제로서 사용되기에 적합한 임의의 포맷 내로 도입될 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 개시는 임의의 포맷(이의 예는 앞서 제시되어 있음)으로 쌍으로서 항체 단편 또는 이의 조합물을 사용하는 것까지 확장된다.
또한, 본 개시는 특정 항원 특이성을 가진 상기 신규 포맷을 포함하는 조성물, 예컨대, 약학 조성물까지 확장된다.
추가 양태에서, 본 개시는 치료에 있어서 상기 포맷 및 상기 조성물의 용도를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체는 관심 있는 항원 또는 항원들의 활성을 기능적으로 변경시키는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 이중특이적 단백질 복합체는 상기 항원 또는 항원들의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 중화시킬 수 있거나, 길항할 수 있거나 촉진할 수 있다.
또한, 본 개시는 예를 들면,
a) 결합 쌍의 제1 결합 파트너(X)에 부착된 제1 항체 또는 항체 단편(A)을 포함하는 하나 이상의 융합 단백질(A-X); 및
b) 결합 쌍의 제2 결합 파트너(Y)에 부착된 제2 항체 또는 항체 단편(B)을 포함하는 하나 이상의 융합 단백질(B-Y)로서, 상기 제2 결합 파트너가 제1 결합 파트너에 대해 특이적인 것인, 예를 들면, 제1 결합 파트너(X)가 펩티드 또는 폴리펩티드이고 제2 결합 파트너(Y)가 이에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편인, 하나 이상의 융합 단백질(B-Y)
을 포함하는 키트로서,
제2 결합 파트너 Y가 제1 결합 파트너 X에 대해 특이적이고 제2 결합 파트너가 예를 들면, 이에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편이고; 상기 2개의 결합 파트너들의 특이적 상호작용(예컨대, 결합 상호작용)이 a) 및 b)로부터의 상기 2개의 융합 단백질들을 물리적으로 함께 존재하게 하여 이중특이적 단백질 복합체를 형성하는 이종이량체성-테터를 형성하고;
융합 단백질(들)이 복합체화된 또는 비-복합체화된 형태로 존재하는 것인, 키트까지 확장된다.
유리하게는, 키트는 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체를 포함할 수 있거나, 복합체화된 또는 비-복합체화된 형태로 존재하는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 전자의 경우, 이중특이적 단백질 복합체는 "상자로부터 꺼내어" 사용할 준비가 된 상태이고, 이것은 사용 편의 및 용이함을 제공하는 반면, 후자의 경우, 이중특이적 단백질 복합체는 상이한 융합 단백질들을 조합함으로써 사용자의 요구에 따라 조립될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 사용 설명서도 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 기능 분석법을 수행하기 위한 하나 이상의 시약도 포함한다.
한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 융합 단백질, 이중특이적 단백질 복합체, 다중체, 격자, 라이브러리, 조성물 등은 실험실 시약으로 사용되기 위한 것이다.
추가 양태에서, 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 상기 정의된 융합 단백질 및/또는 이중특이적 단백질 복합체를 코딩하는 DNA 서열이 제공된다.
한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 본 개시에 따른 이중특이적 단백질 복합체를 코딩하는 DNA 서열이 제공된다.
한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 본 개시에 따른 이중특이적 또는 다중특이적 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열이 제공된다.
또한, 본 명세서의 개시는 상기 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터까지 확장된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 그 자신에 연결되어 있는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 일례는 추가 DNA 분절이 라이게이션될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프인 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 벡터들은 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면, 세균 복제기점을 가진 세균 벡터 및 에피좀성 포유동물 벡터). 다른 벡터들(예를 들면, 비-에피좀성 포유동물 벡터)은 숙주 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있고, 이들은 나중에 숙주 세포에서 숙주 게놈과 함께 복제된다. 플라스미드는 벡터의 가장 흔히 사용되는 형태이기 때문에, 본 명세서에서 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing)을 참조한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "선택 마커"는 마커 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되어 있거나 형질감염되어 있는 세포를 확인할 수 있게 하는 발현을 가진 단백질을 지칭한다. 광범위한 선택 마커들이 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포에게 약물, 예컨대, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선택 마커는 예를 들면, 시각적으로 식별가능한 마커, 예컨대, 형광 마커일 수도 있다. 형광 마커의 예로는 로다민, FITC, TRITC, 알렉사 플루오르(Alexa Fluors) 및 이들의 다양한 접합체들이 있다.
본 개시의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 본 개시의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 사용할 수 있다. 세균, 예를 들면, 이. 콜라이 및 다른 미생물 시스템을 사용할 수 있거나, 진핵, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포 발현 시스템도 사용할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 개시는 본 개시의 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유발하기에 적합한 조건 하에서 본 개시의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 개시에 따른 융합 단백질의 제조 방법도 제공한다.
본 개시의 이중특이적 단백질 복합체는 진단/탐지 키트에서 사용될 수 있고, 이때 항원 특이성의 특정 조합을 가진 이중특이적 단백질 복합체가 사용된다. 예를 들면, 키트는 둘 다 동일한 유형의 세포 상에 존재하는 2개의 항원들에 대해 특이적인 이중특이적 항체 복합체를 포함할 수 있고, 이때 양성 진단은 항원들 둘 다가 성공적으로 검출되는 경우에만 내려질 수 있다. 비-복합체화된 형태로 2개의 별도의 항체들 또는 항체 단편들을 사용하기 보다는 본 개시의 이중특이적 항체 복합체를 사용함으로써 검출의 특이성을 크게 향상시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 이중특이적 항체 복합체는 고체 표면 상에 고정된다. 고체 표면은 예를 들면, 칩 또는 ELISA 플레이트일 수 있다.
샘플에서 제1 펩티드 및 제2 펩티드의 존재를 탐지하기 위한 본 개시의 이중특이적 단백질 복합체의 용도도 제공되고, 이로써 상기 이중특이적 복합체는 검출제로서 사용된다.
본 개시의 이중특이적 항체 복합체는 예를 들면, 결합된 항체-항원 복합체의 검출을 용이하게 하는 형광 마커에 접합될 수 있다. 이러한 이중특이적 항체 복합체는 면역형광 현미경관찰을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 항체 복합체는 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA를 위해 사용될 수도 있다.
한 실시양태에서, 항체(특히, 본 발명에 따른 항체 또는 단편)를 정제하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 불순물이 컬럼 상에서 체류되고 항체가 비-결합된 분획에서 유지되도록 비-결합 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 본 개시에 따른 융합 단백질 또는 이중특이적 단백질 복합체를 정제하는 방법이 제공된다. 상기 단계는 예를 들면, 약 6 내지 8의 pH에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 예를 들면, 약 4 내지 5의 pH에서 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 초기 포획 단계도 포함할 수 있다.
상기 방법은 생성물 및 방법 관련 불순물이 생성물 스트림으로부터 적절하게 해상되는 것을 보장하기 위해 추가 크로마토그래피 단계(들)도 포함할 수 있다.
정제 방법은 하나 이상의 한외여과 단계, 예컨대, 농축 및 정용여과 단계도 포함할 수 있다.
상기 사용된 "정제된 형태"는 90%(중량/중량) 이상의 순도, 예컨대, 91%(중량/중량), 92%(중량/중량), 93%(중량/중량), 94%(중량/중량), 95%(중량/중량), 96%(중량/중량), 97%(중량/중량), 98%(중량/중량) 또는 99%(중량/중량) 이상의 순도를 지칭하기 위한 것이다.
본 명세서의 문맥에서, "포함하는"은 "비롯한"으로서 해석되어야 한다.
또한, 특정 요소를 포함하는 본 개시의 양태는 관련 요소로 "구성"되거나 "본질적으로 구성"된 대안적 실시양태까지 확장되기 위한 것이다.
본 명세서에서 사용된 긍정적인 실시양태는 본 개시의 특정 양태를 배제하기 위한 근거로서 사용될 수 있다.
이중특이적 복합체에 대한 방법과 관련된 개시는 복합체 그 자체에 동등하게 적용되고 역의 경우도 가능하다.
단락:
1. (i) 하나 이상의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질을 포함하는 다중체의 일부 또는 전부에 대한 기능 분석법에서 활성에 대해 시험하는 단계; 및
(ii) 상기 기능 분석법으로부터의 판독결과를 분석하여 상기 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 생물학적 기능을 확인하는 단계
를 포함하는, 식 A-X:Y-B의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법으로서,
X:Y가 이종이량체성-테터이고,
A 및 B가 각각 X 및 Y를 지닌 융합 단백질의 형태로 상기 이중특이적 단백질 복합체의 성분인, 방법.
2. 단락 1에 있어서, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체의 다중체를 형성하는 제1 단계를 추가로 포함하는, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, X가 펩티드 또는 단백질이고 Y가 X에 대해 특이적인 펩티드 또는 단백질 결합 파트너인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
4. 단락 3에 있어서, 이종이량체성-테터의 결합 친화도가 5 nM이거나 더 강한 것인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
5. 단락 4에 있어서, 이종이량체성-테터의 결합 친화도가 900 pM이거나 더 강하고, 예컨대, 800, 700, 600, 500, 400 또는 300 pM인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
6. 단락 3에 있어서, X가 항체 또는 이의 결합 단편인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
7. 단락 6에 있어서, X가 Fab, Fab', 단일 쇄 Fv 및 단일 도메인 항체, 예컨대, VHH를 포함하는 군으로부터 선택된 항체 단편인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
8. 단락 7에 있어서, X가 단일 쇄 Fv인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
9. 단락 8에 있어서, 단일 쇄 Fv가 펩티드 GCN4에 대해 특이적인 것인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
10. 단락 9에 있어서, 단일 쇄 Fv가 52SR4인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
11. 단락 3 내지 10 중 어느 한 단락에 있어서, Y가 펩티드인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
12. 단락 11에 있어서, 펩티드는 길이가 5개 내지 25개의 아미노산들을 갖는 것인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
13. 단락 1 내지 12 중 어느 한 단락에 있어서, A가 항체 또는 이의 결합 단편인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
14. 단락 1 내지 13 중 어느 한 단락에 있어서, B가 항체 또는 이의 결합 단편인, 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체에서 상승적인 기능을 탐지하는 방법.
15. 단락 1 내지 14 중 어느 한 단락에 있어서, 다중체가 하나 이상의 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질에 대한 하나 이상의 생물학적 비교대상을 포함하는 것인 방법.
16. 단락 1 내지 15 중 어느 한 단락에 있어서, 다수의 이중특이적 단백질 복합체들이 동시에 시험되는 것인 방법.
17. 식 A-X:Y-B를 갖는 이중특이적 단백질 복합체로서,
상기 식에서
A-X는 제1 융합 단백질이고;
Y-B는 제2 융합 단백질이며;
X:Y는 이종이량체성-테터이고;
A는 이중특이적 단백질 복합체의 제1 단백질 성분이고;
B는 이중특이적 단백질 복합체의 제2 단백질 성분이며;
X는 결합 쌍의 제1 결합 파트너이고;
Y는 결합 쌍의 제2 결합 파트너이며;
:은 X와 Y 사이의 상호작용(예컨대, 결합 상호작용)인, 이중특이적 단백질 복합체.
18. 단락 17에 있어서, X와 Y 사이의 결합 상호작용이 낮은 해리 상수를 갖는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
19. 단락 18에 있어서, 해리 상수가 1-9x10-3 s-1 이하, 예를 들면, 1-9x10-3 s-1, 1-9x10-4 s-1, 1-9x10-5 s-1, 1-9x10-6 s-1 또는 1-9x10-7 s-1의 범위 내에 있는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
20. 단락 19에 있어서, 해리 상수가 1x10-4 s-1 이하, 예를 들면, 1x10-5 s-1, 1x10-6 s-1 또는 1x10-7 s-1인 이중특이적 단백질 복합체.
21. 단락 17 내지 20 중 어느 한 단락에 있어서, 서로에 대한 X 및 Y의 친화도가 5 nM이거나 더 강하고, 예를 들면, 900 pM이거나 더 강하고, 예컨대, 800, 700, 600, 500, 400 또는 300 pM인 이중특이적 단백질 복합체.
22. 단락 17 내지 21 중 어느 한 단락에 있어서, Y가 펩티드 또는 단백질인 이중특이적 단백질 복합체.
23. 단락 22에 있어서, 펩티드가 GCN4인 이중특이적 단백질 복합체.
24. 단락 16 내지 23 중 어느 한 단락에 있어서, X가 항체 또는 항체 단편인 이중특이적 단백질 복합체.
25. 단락 24에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', 단일 쇄 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체(sdAb), 예컨대, VHH로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
26. 단락 25에 있어서, 항체 단편이 scFv인 이중특이적 단백질 복합체.
27. 단락 26에 있어서, scFv가 52SR4인 이중특이적 단백질 복합체.
28. 단락 17 내지 27 중 어느 한 단락에 있어서, X 또는 Y가 펩티드이고 상기 펩티드가 E5B9로서 지칭된 펩티드 에피토프 이외의 것인 이중특이적 단백질 복합체.
29. 단락 17에 있어서, 결합 파트너 쌍이
(i) X가 글루타티온(GSH)이고 Y가 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)인 경우,
(ii) X가 Fos이고 Y가 Jun인 경우,
(iii) X가 FLAG이고 Y가 항-FLAG 항체 또는 이의 단편인 경우,
(iv) X가 His이고 Y가 항-His인 경우, 및
(v) X가 말토스 결합 단백질이고 Y가 항-말토스 결합 단백질 또는 이의 단편인 경우
로부터 선택되는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
30. 단락 17 내지 29 중 어느 한 단락에 있어서, A가 항체, 항체 단편, 리간드, 수용체, 억제제 및 효소, 예컨대, 항체 및 항체 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
31. 단락 17 내지 30 중 어느 한 단락에 있어서, B가 항체, 항체 단편, 리간드, 수용체, 억제제 및 효소, 예컨대, 항체 및 항체 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
32. 단락 30 또는 31에 있어서, A 및/또는 B가 세포 표면 수용체에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편인 이중특이적 단백질 복합체.
33. 단락 29 또는 30에 있어서, A 및/또는 B가 사이토카인 또는 케모카인에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편인 이중특이적 단백질 복합체.
34. 단락 30 내지 34 중 어느 한 단락에 있어서, X가 제1 항체 또는 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 부착되어 있는 것인, 예를 들면, X가 제1 항체 또는 항체 결합 단편의 중쇄의 C-말단에 부착되어 있는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
35. 단락 31 내지 35 중 어느 한 단락에 있어서, Y가 제2 항체 또는 항체 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 부착되어 있는 것인, 예를 들면, Y가 제2 항체 또는 항체 단편의 중쇄의 C-말단에 부착되어 있는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
36. 단락 17 내지 36 중 어느 한 단락에 있어서, A가 제1 항원에 대해 특이적인 항체 또는 항체 결합 단편이고 B가 제2 항원에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편이고, 이때 제1 항원과 제2 항원이 상이한 것인 이중특이적 단백질 복합체.
37. 단락 17 내지 36 중 어느 한 단락에 따른 하나 이상의 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 조성물.
38. 단락 37에 있어서, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 융합 단백질이 이중특이적 단백질 복합체 형태로 존재하는 것인 조성물.
39. 단락 38에 있어서, 60% 이상의 융합 단백질이 이중특이적 단백질 복합체 형태로 존재하는 것인 조성물.
40. 단락 19 내지 37 중 어느 한 단락에 따른 2개 이상의 이중특이적 단백질 복합체들을 포함하는 이중특이적 단백질 복합체들의 다중체로서, 상기 이중특이적 단백질 복합체들이 상이한 특이성을 갖는 것인 다중체.
41. 단락 40에 있어서, 이중특이적 단백질 복합체들이 용액에 존재하거나 고체 기판 표면 상에 고정되어 있는 것인 다중체.
42. 단락 41에 있어서, 어레이 또는 격자, 예를 들면, 마이크로플레이트, 예컨대, 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트의 형태로 존재하는 다중체.
43. 단락 40 내지 42 중 어느 한 단락에 있어서, 이중특이적 단백질 복합체들이 비드에 접합되어 있는 것인 다중체.
44. 단락 1 내지 37 중 어느 한 단락에 정의된 융합 단백질 A-X 또는 B-Y.
45. 단락 1 내지 37 중 어느 한 단락에 정의된 2개 이상의 융합 단백질들을 포함하는 라이브러리.
46. 단락 1 내지 37 중 어느 한 단락에 정의된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
47. 단락 47에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
48. 요법에 사용하기 위한, 단락 17 내지 37 중 어느 한 단락에 따른 이중특이적 단백질 복합체 또는 단락 38내지 40 중 어느 한 단락에 따른 조성물.
49. 단락 7 내지 36 중 어느 한 단락에 따른 이중특이적 단백질 복합체 또는 단락 37 내지 39 중 어느 한 단락에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
50. a) 하나 이상의 융합 단백질 A-X; 및 b) 하나 이상의 융합 단백질 B-Y를 포함하는 키트로서,
X:Y가 이종이량체성-테터이고;
A가 이중특이적 단백질 복합체의 제1 단백질 성분이며;
B가 이중특이적 단백질 복합체의 제2 단백질이고;
X가 결합 쌍의 제1 결합 파트너, 예컨대, 펩티드 또는 단백질이며;
Y가 결합 쌍의 제2 결합 파트너, 예를 들면, X에 대해 특이적인 펩티드 또는 단백질이고;
X와 Y 사이의 특이적 결합 상호작용이 이종이량체성-테터를 형성하고 상기 2개의 융합체들을 물리적으로 함께 존재하게 하여 이중특이적 단백질 복합체를 형성하도록 X 및 Y가 동종이량체를 형성할 수 없으며;
키트 내의 상기 융합 단백질(들)이 복합체화된 또는 비-복합체화된 형태로 존재하는 것인, 키트.
51. 단락 51에 있어서, 사용 설명서를 추가로 포함하는 키트.
52. 단락 50 또는 51에 있어서, 하나 이상의 기능 분석법을 수행하기 위한 하나 이상의 시약을 추가로 포함하는 키트.
본원에서 언급된 모든 참고문헌들은 특히 참고로 인용된다.
참고문헌
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실시예
실시예들의 일부에서 이용된 일반적인 방법
일반적인 방법 1 : 혈소판 성분채집술 추체로부터 유래된 인간 PBMC를 동결된 분취액으로서 보관하였다. 분석을 수행하기 전, 세포를 해동시키고 DMEM(Life Technologies)으로 세척하고 37℃ 및 5% CO2 환경에 적응시켰다.
일반적인 방법 2 : Fab'A-X 및 Fab'B-Y를 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 항온처리한 후, V-바닥 96 웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC 플러스 이중특이적(Fab'A-X 및 Fab'B-Y) 또는 2가(예를 들면, Fab'A-X FabA'-Y) 조합물을 추가 90분 동안 함께 항온처리하였다. 이 시간 후, 37℃에서 8분 동안 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(Southern Biotechnology)을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 그 다음, 동등한 부피의 사이토픽스(Cytofix) 완충제(BD Biosciences)를 첨가하여 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후 5분 동안 500g에서 원심분리하였다. 유동 완충제에 재현탁된 세포 펠렛으로부터 여분의 상청액을 따라 버리고 한 번 더 세척하였다. 그 다음, 세포를 30분 동안 빙냉 펌(Perm) 완충제 III(BD Biosciences)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다.
일반적인 방법 3 : 세포를 일반적인 방법 2에 기재된 바와 같이 활성화시키고 형광 표지된 항-CD20 항체(BD Biosciences), 위치 473에서 변경된 세린 잔기를 인식하는 항-인 Akt 항체, 위치 759에서 변경된 티로신 잔기를 인식하는 항-인 PLCg2 항체 및 총 IkB를 인식하는 항-IkB 항체로 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트(Intellicyt) HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20, Akt 및 PLCg2의 세포 발현을 측정하였다.
실시예 1 - 본 개시의 FabB-GCN4(7P14P):52SR4-FabA의 이중특이적 항체 복합체의 구축
도 2 및 4는 본 개시의 대표적인 이중특이적 항체 복합체를 보여준다. 이 이중특이적 항체 복합체는 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질로 구성된다.
제1 융합 단백질(A-X)은 Fab 단편의 CH1 도메인 및 scFv의 VL 도메인의 C-말단에 연결된 펩티드 링커 ASGGGG(서열번호 71)를 통해 X인 scFv(클론 52SR4, 서열번호 3)에 부착된, 항원 6에 대한 특이성을 가진 Fab 단편(Fab A(Fab#1로서도 지칭됨))을 포함한다. scFv 그 자체는 그의 VL 도메인과 VH 도메인 사이에 위치한 펩티드 링커도 함유한다.
제2 융합 단백질(B-Y)은 Fab 단편(항원 5에 대한 특이성을 가진 Fab B[Fab#2로서도 지칭됨])을 포함한다. 그러나, 제1 단백질에 비해 Fab 단편은 Fab 단편의 CH1 도메인에 연결된 펩티드 링커 ASGGGG(서열번호 71)를 통해 Y인 펩티드 GCN4(클론 7P14P, 서열번호 1)에 부착되어 있다.
X인 scFv는 결합 파트너 Y인 GCN4에 대해 특이적이고 상보적이다. 그 결과, 상기 2개의 융합 단백질들이 서로 접촉할 때, scFv와 GCN4 펩티드 사이의 비-공유 결합 상호작용이 일어남으로써, 상기 2개의 융합 단백질들을 이중특이적 항체 복합체의 형태로 물리적으로 보유한다.
GCN4(7P14P)로 면역화된 마우스의 비장으로부터의 리보좀 디스플레이 VL-링커-VH scFv 라이브러리를 구축하고 패닝(panning)함으로써 단일 쇄 항체(scFv) 52SR4를 유도하였다(참고문헌 1). 추가 2004년 문헌에는 무작위화된 라이브러리의 리보좀 디스플레이를 다시 이용하여 52SR4를 보고된 5 pM까지 친화 성숙시키는 것이 기재되어 있다(참고문헌 2).
위치 7 및 14에서 프롤린 잔기를 포함시킴으로써 효모 전사 인자 GCN4로부터 GCN4 펩티드를 유도하였으므로, GCN4(7P14P)는 베르거 등(Berger et al)에 의한 1999년 문헌에 기재된 바와 같이 scFv 결합에 대해 단량체성 상태로 유지된다(참고문헌 3).
GCN4 펩티드 및 52SR4 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열들을, CH1을 함유하고 항체 VH 영역을 수용하도록 미리 디자인된 사내(in-house) 중쇄 Fab 발현 벡터의 다운스트림에서 2개 별도의 벡터들 내로 클로닝하였다.
그 다음, 항-항원 6 항체 및 항-항원 5 항체로부터의 VH 영역들을 이들 2개의 중쇄 벡터들 내로 별도로 클로닝하였다.
GCN4 펩티드 및 52SR4 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열들을, CK를 함유하고 항체 VL 영역을 수용하도록 디자인된 사내 경쇄 Fab 발현 벡터의 다운스트림에서 각각 제1 벡터 및 제2 벡터 내로 별도로 클로닝하였다.
Fab-scFv 및 Fab-펩티드 단백질을 발현하기 위해 항-항원 6 항체 및 항-항원 5 항체로부터의 VL 영역들을, 적절한 중쇄 벡터와 공동-발현될 사내 경쇄 발현 벡터 내로 CK와 인 프레임(in frame)으로 별도로 클로닝하였다.
그 다음, 벡터를 서열분석하여, 클로닝이 성공적이고 그 후 세포가 각각 항-항원 6 항체 및 항-항원 5 항체로부터의 V 영역을 가진 Fab-scFv 및 Fab-펩티드 단백질을 별도로 발현하였다는 것을 확인하였다. 실시예 1에서 항원 5 및 6은 큰 격자 포맷을 사용한 하기 실시예들에서의 항원-표지된 항원 5 및 항원 6이 아니다.
실시예 2 - 2개의 표적 항원들과 동시에 공동-맞물릴 수 있는 비-공유 이중특이적 항체를 형성하는 scFv:펩티드 상호작용의 유세포분석 입증
도 5는 scFv:펩티드 결합 상호작용을 이용함으로써 형성된 2개의 상이한 이중특이적 항체 복합체의 항원 특이성을 입증하는 유세포분석 실험의 결과를 보여준다.
하기 2개의 융합 단백질들을 사용하여 제1 이중특이적 항체 복합체를 구축하였다:
1. 항-항원 5 Fab-scFv(52SR4); 및
2. 항-항원 6 Fab-펩티드(GCN4).
하기 2개의 융합 단백질들을 사용하여 제2 이중특이적 항체 복합체를 구축하였다:
1. 항-항원 5 Fab-펩티드(GCN4); 및
2. 항-항원 6 Fab-scFv(52SR4).
따라서, 상기 2개의 이중특이적 항체 복합체들은 동일한 Fab 단편 및 동일한 결합 파트너(즉, 52SR4 및 GCN4)를 가졌다. 상기 2개의 이중특이적 항체 복합체들 사이의 차이는 Fab 단편이 어느 결합 파트너에 부착되어 있는 지에 있었다.
복합체를 형성하지 않은 대조군 혼합물을 하기 융합 단백질들로부터 제조하였다:
1. 항-항원 5 Fab:GCN4; 및
2. 항-항원 6 Fab:GCN4.
항원 5에 결합하는 이중특이적 항체 복합체의 능력을 입증하기 위해, 상기 복합체를, 항원 5를 발현하는 Jurkat 세포와 함께 항온처리하였다. 항원 6에 결합하는 이중특이적 항체 복합체의 능력을 입증하기 위해, Jurkat 세포 상의 항원 5에 일단 결합된 상기 복합체를 바이오티닐화된 항원 6과 접촉시켰다. 그 다음, 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 바이오티닐화된 항원 6을 검출하였다.
그 다음, Jurkat 세포를 팩스칼리부르(Facscalibur) 유세포분석기에 통과시켰는데, 이때 이중특이적 항체 복합체에 결합된 후 항원 6에 결합될 때에만 표지됨으로써, 상기 이중특이적 항체 복합체가 항원 5 및 항원 6 둘 다에 결합할 수 있다는 것을 시사할 수 있는 형광 표지된 Jurkat 세포는 복합체를 형성할 수 없는 펩티드에 둘 다 융합된 항원 5 및 항원 6에 결합할 수 있는 2개의 융합 단백질들과 함께 항온처리된 Jurkat 세포로부터 분리될 수 있다.
도 5의 FACS 도표는 이중특이적 항체 복합체들 둘 다에 대한 유의한 이동(채워진 배경을 초과하여 위에 존재하는 얇은 선 및 두꺼운 선)을 보여줌으로써, 상기 이중특이적 항체 복합체들이 상기 표적 항원들 둘 다에 성공적으로 결합할 수 있고 소정의 Fab 단편이 scFv 또는 펩티드에 연결되어 있는지와 관계없이 상기 표적 항원들 둘 다에 결합하는 능력이 유지된다는 것을 입증한다.
C-말단에서 항-항원 6 Fab에 각각 융합된 펩티드 또는 scFv의 후속 포획은 형광 표지된 스트렙타비딘에 의해 최종 층에서 검출되는 바이오티닐화된 항원 6의 추가 포획을 가능하게 한다. 따라서, FACS 도표에 표시된 결과는 본 개시의 이중특이적 항체 복합체가 2개의 상이한 표적 항원들에 동시에 성공적으로 결합할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 2의 항원 5 및 6은 하기 큰 격자 포맷을 사용한 하기 실시예들에서의 항원-표지된 항원 5 및 항원 6이 아니다.
실시예 3 - scFv:펩티드 상호작용의 비아코어 입증
도 6은 scFv:펩티드(즉, 52SR4:GCN4) 상호작용의 친화도를 입증하는 표면 플라스몬 공명 기록선을 보여준다. 비아코어 3000(GE Healthcare)을 이용하여 표면 플라스몬 공명을 수행하였다. 모든 실험들을 25℃에서 수행하였다. 아민 커플링 화학반응을 통해 대략 1750 반응 유닛의 최종 수준까지 스트렙타비딘(사내제조됨)을 CM5 센서 칩(GE Healthcare) 상에 고정시켰다. HBS-N 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl; GE Healthcare)를 고정 및 펩티드 포획용 런닝 완충제로서 사용하였다. HBS-N 중의 바이오틴-GCN4 펩티드(10 nM, M.W. 4360)의 5 ㎕ 주입을 이용하여 고정된 스트렙타비딘 상에서의 대략 6 RU의 포획을 달성하였다. 항-GCN4(52SR4) scFv 결합 동력학을 측정하기 위해 런닝 완충제를 HBS-EP+ 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%(부피/부피) 계면활성제 P20; GE Healthcare)로 전환하였다. 30 nM로부터 3배 연속 희석된 Fab-scFv(사내제조됨) 또는 HBS-EP+ 완충제 대조군을 30 ㎕/분의 유속으로 고정된 GCN4 펩티드(3분 결합, 15분 해리) 상에 주입하였다. 각각 10 ㎕/분의 유속으로 주입한 후 2 M 구아니딘-HCl의 2회 연속 60초 주입으로 표면을 재생시켰다. 표준 절차에 따라 3000 BIAEval 소프트웨어(버전 4.1)를 이용하여 이중 기준 배경 차감된 결합 곡선을 분석하였다. 1:1 결합 모델 알고리즘을 피팅함으로써 동력학적 파라미터를 결정하였다. 데이터는 scFv가 펩티드에 대한 516 pM의 친화도를 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 4 - 기능 분석법을 위한 Fab -A( Fab - scFv [A-X]) 및 Fab -B( Fab -펩티드 [B-Y])의 제조
클로닝 방법 : 제한 효소 부위 DNA 서열을 플랭킹하는 PCR 또는 유전자 합성으로 항체 가변 영역 DNA를 생성하였다. 이들 부위들은 가변 중쇄의 경우 HindIII 및 XhoI이었고 가변 경쇄의 경우 HindIII 및 BsiWI이었다. 이것은 중쇄 가변 영역이 2개의 중쇄 벡터들(FabB-Y를 가진 pNAFH 및 FabA-X를 가진 pNAFH) 내로 라이게이션될 수 있게 만드는데, 이는 이들이 상보적 제한 부위를 갖기 때문이다. 이것은 가변 영역 업스트림(또는 5')을 뮤린 불변 영역 및 펩티드 Y(GCN4) 또는 scFv X(52SR4)에 라이게이션시킴으로써 전체 판독 프레임을 생성한다. 경쇄를, 동일한 상보적 제한 부위를 사용하는 표준 사내 뮤린 불변 카파 벡터(pMmCK 또는 pMmCK S171C) 내로 클로닝하였다. 가변 영역이 토끼로부터 단리되는 경우 pMmCK S171C 벡터가 사용된다. 전체 개방 판독 프레임을 플랭킹하는 프라이머를 사용하여 서열분석함으로써 클로닝 사건을 확인하였다.
CHOSXE의 배양 : 현탁 CHOSXE 세포를 2 mM(100x) 글루타맥스로 보충된 CDCHO 배지(Invitrogen)에 미리 적응시켰다. 세포를 진탕기 항온처리기(Kuner AG, 스위스 비르스펠덴 소재) 상에서 140 rpm에서 교반된 상태로 대수 생장기에서 유지하고 8% CO2로 보충된 37℃에서 배양하였다.
전기천공 형질감염 : 형질감염 전, CEDEX 세포 카운터(nnovatis AG, 독일 빌레펠트 소재)를 이용하여 세포 수 및 생존능을 측정하였고 요구된 양의 세포(2x108개의 세포/㎖)를 원심분리 원추 튜브 내로 옮기고 10분 동안 1400 rpm에서 회전시켰다. 펠렛화된 세포를 멸균 얼스(Earls) 균형 염 용액에 재현탁하고 추가 10분 동안 1400 rpm에서 회전시켰다. 상청액을 따라 버렸고 펠렛을 원하는 세포 밀도까지 재현탁하였다.
2x108개 세포/㎖ 혼합물을 위해 400 ㎍ 및 800 ㎕의 최종 농도로 벡터 DNA를 피펫으로 큐벳(Biorad) 내에 넣었고 사내 전기천공 시스템을 이용하여 전기천공하였다.
Fab -A( Fab - scFv [A-X]) 및 Fab -B( Fab -펩티드[B-Y])를 별도로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 2 mM 글루타맥스로 강화된 ProCHO 5 배지 및 항생제 항유사분열(100X) 용액(500 중 1)을 함유하는 1x3 ℓ 삼각 플라스크 내로 직접 옮겼고, 세포를 37℃, 5% CO2 및 140 rpm 진탕으로 설정된 쿠너 진탕기 항온처리기에서 배양하였다. 공급 보충제 2 g/ℓ ASF(AJINOMOTO)를 형질감염시킨 지 24시간 후에 첨가하였고 온도를 추가 13일 배양 동안 32℃까지 낮추었다. 4일째 날, 3 mM 부티르산나트륨(n-부티르산 나트륨 염, Sigma B-5887)을 배양물에 첨가하였다.
14일째 날, 배양물을 튜브로 옮겼고 4000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후 세포로부터 상청액을 분리하였다. 보유된 상청액을, 0.22 ㎛ 사르토브란(SARTOBRAN)® P 밀리포어(Millipore)에 이어 0.22 ㎛ 감마 금 필터를 통해 더 여과하였다. 최종 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
대규모(1.0 ℓ) 정제 : 악타 익스프레스(AKTA Xpress) 시스템 및 히스트랩 엑셀(HisTrap Excel) 예비팩킹된 니켈 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 친화도 포획으로 Fab-A 및 Fab-B를 정제하였다. 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였고, 필요하다면 약산 또는 약염기를 사용하여 pH를 중성까지 조절한 후 컬럼 상에 적재하였다. 15 내지 25 mM 이미다졸을 함유하는 2차 세척 단계를 이용하여 니켈 수지로부터 임의의 약하게 결합된 숙주 세포 단백질/비-특이적 His 결합제를 제거하였다. 10 mM 인산나트륨, pH 7.4 + 1 M NaCl + 250 mM 이미다졸을 사용하여 용출을 수행하였고 2 ㎖ 분획을 수집하였다. 1 컬럼 부피가 용출되면, 용출 피크를 더 선명하게 하고 결과적으로 총 용출 부피를 감소시키기 위해 시스템을 10분 동안 중단시켰다. 가장 깨끗한 분획을 풀링하였고 완충제를 PBS(Sigma)(pH 7.4)로 교환하고 0.22 ㎛ 여과하였다. 최종 풀을 A280 스캔, SE-HPLC(G3000 방법) 및 SDS-PAGE(환원 및 비-환원)로 분석하였고 PTS 엔도세이프(Endosafe) 시스템을 이용하여 내독소에 대해 분석하였다.
실시예 5 - (B 세포 활성화의 척도로서) Akt 신호전달의 억제를 기초로 기능성, 2가 및 이중특이적 항원 표적 조합물을 선택하기 위한 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체 포맷의 Fab -A( Fab - scFv [A-X]) 및 Fab -B( Fab -펩티드[B-Y])의 사용
인간 PBMC를 일반적인 방법 1에 따라 준비하였다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 항원 3, 항원 1, 항원 4 및 항원 2에 대한 다양한 항원 특이성을 가진 등몰(200 nM) 양의 Fab'-A(Fab-scFv) 및 Fab'-B(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이적 또는 2가 항체의 격자를 생성하였다. 이 격자는 표 4에 표시되어 있다.
Figure 112016120995546-pct00008
실시예 4에 기재된 정제 후 Fab'A-X 및 Fab'B-Y를 일반적인 방법 2에 따라 PMBC와 함께 항온처리하였다.
그 다음, 세포를 단백질 상의 위치 473에서 변경된 세린 잔기를 인식하는 형광 표지된 항-CD20 항체(BD Biosciences) 및 형광 표지된 항-인 Akt 항체로 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 시간 후, 플레이트를 2회 더 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 Akt의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트(Forecyt)™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 Akt 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다. 항원 3에 대한 항체(VR0982), 항원 1에 대한 항체(VR4247), 항원 4에 대한 항체(VR4248) 및 항원 2에 대한 항체(VR4246)의 조합물의 상대적 효과는 표 5에 제시되어 있다(↓ = 억제, ↑ = 자극 및 ↔ = 전체 효과 없음). 화살표의 수는 활성의 강도를 표시한다.
Figure 112016120995546-pct00009
이 데이터는 평균 값으로서 막대그래프(도 7)의 형태로도 제시되어 있고, 오차 막대는 95% 신뢰구간을 보여준다. 데이터는 항원 3에 대한 Fab(VR0982)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물, 항원 1에 대한 Fab(VR4247)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물 및 항원 4에 대한 Fab(VR4248)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물 모두가 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인-Akt 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, 항원 3에 대한 Fab(VR0982)와 항원 3에 대한 Fab(VR0982)의 조합물 및 항원 3에 대한 Fab(VR0982)와 항원 4에 대한 Fab(VR4248)의 조합물은 상승된 수준의 인-Akt 발현을 나타내었다. 시험된 모든 다른 조합물들은 효과를 보이지 않았다.
실시예 6 - (B 세포 활성화의 척도로서) PLCg2 신호전달의 억제를 기초로 기능성, 2가 및 이중특이적 항원 표적 조합물을 선택하기 위한 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체 포맷의 용도
인간 PBMC를 일반적인 방법 1에 따라 준비하였다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 항원 3, 항원 1, 항원 4 및 항원 2에 대한 항원 특이성을 가진 등몰(200 nM) 양의 Fab'-A(Fab-scFv[A-X]) 및 Fab'-B(Fab-펩티드[B-Y])를 희석함으로써 이중특이적 또는 2가 항체의 격자를 생성하였다. 이 격자는 표 6에 제시되어 있다.
Fab'A-X 및 Fab'B-Y를 일반적인 방법 2에 따라 항온처리하였다.
그 다음, 세포를, 단백질 상의 위치 759에서 변경된 티로신 잔기를 인식하는 형광 표지된 항-CD20 항체(BD Biosciences) 및 형광 표지된 항-인 PLCg2 항체로 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 시간 후, 플레이트를 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 PLCg2의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 PLCg2 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다. 항원 3, 항원 1, 항원 4 및 항원 2에 대한 "항체" 조합물의 상대적 효과는 표 6에 제시되어 있다(↓ = 억제, ↑ = 자극 및 ↔ = 전체 효과 없음). 화살표의 수는 활성의 강도를 표시한다.
Figure 112016120995546-pct00010
이 데이터는 평균 값을 보여주는 막대그래프(도 8)로서도 표시되어 있고, 오차 막대는 95% 신뢰구간이다. 상기 데이터는 항원 3에 대한 Fab(VR0982)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물, 항원 1에 대한 Fab(VR4247)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물 및 항원 4에 대한 Fab(VR4248)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물 모두가 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인-PLCg2 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, 항원 3에 대한 Fab(VR0982)와 항원 3에 대한 Fab(VR0982)의 조합물 및 항원 3에 대한 Fab(VR0982)와 항원 4에 대한 Fab(VR4248)의 조합물은 상승된 수준의 인-PLCg2 발현을 나타내었다. 항원 1에 대한 Fab와 항원 1에 대한 Fab의 조합물은 효과를 보이지 않았다.
실시예 7 - (B 세포 활성화의 척도로서) CD86 발현의 억제를 기초로 기능성, 2가 및 이중특이적 항원 표적 조합물을 선택하기 위한 이종이량체적으로 테터링된 이중특이적 단백질 복합체 포맷의 용도
인간 PBMC를 일반적인 방법 1에 따라 준비하였다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 항원 3, 항원 1, 항원 4 및 항원 2에 대한 항원 특이성을 가진 등몰(200 nM) 양의 Fab'-X(Fab-scFv) 및 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이적 또는 2가 항체의 격자를 생성하였다. 이 격자는 표 7에 제시되어 있다.
Fab'A-X 및 Fab'B-Y를 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 90분 동안 함께 항온처리한 후 V-바닥 96 웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하였다. 그 다음, PBMC 플러스 이중특이적 또는 2가 조합물을 추가 90분 동안 함께 항온처리하였다. 이 시간 후, 37℃에서 24시간 동안 200 nM의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(Southern Biotechnology)을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 얼음 위에 놓고 빙냉 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)로 1회 세척하였다. 그 다음, 세포를 형광 표지된 항-CD19 항체(BD Biosciences) 및 형광 표지된 항-CD86 항체로 염색하고 암실에서 1시간 동안 얼음 위에서 항온처리하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD19 및 CD86의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 CD86 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다. 항원 3에 대한 Fab(VR0982), 항원 1에 대한 Fab(VR4247), 항원 4에 대한 Fab(VR4248) 및 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물의 상대적 효과는 표 7에 제시되어 있다(↓ = 억제, ↑ = 자극 및 ↔ = 전체 효과 없음). 화살표의 수는 활성의 강도를 표시한다.
Figure 112016120995546-pct00011
이 데이터는 평균 값으로서 막대그래프(도 9)로서도 표시되어 있고, 오차 막대는 95% 신뢰구간이다. 상기 데이터는 항원 3에 대한 Fab(VR0982)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물, 항원 1에 대한 Fab(VR4247)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물, 항원 4에 대한 Fab(VR4248)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물 및 항원 2에 대한 Fab(VR4246)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 조합물 모두가 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD86 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, 항원 3에 대한 Fab(VR0982)와 항원 3에 대한 Fab(VR0982)의 조합물 및 항원 1에 대한 Fab(VR4247)와 항원 4에 대한 Fab(VR4248)의 조합물은 상승된 수준의 CD86 발현을 나타내었다. 시험된 모든 다른 조합물들은 효과를 보이지 않았다.
실시예 8 - 항원 1에 대한 Fab(VR4247) 및 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 억제 효과는 항체들이 이중특이적 배향으로 정렬되어 있을 때에만 재현될 수 있다.
인간 PBMC를 일반적인 방법 1에 따라 준비하였다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 항원 1 및 항원 2에 대한 항원 특이성을 가진 등몰(200 nM) 양의 Fab'A-X(Fab-scFv) 및/또는 Fab'B-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이적 항체들, 2가 항체들 또는 항체의 혼합물들의 조합물을 생성하였다. 추가로, 단일 Fab 대조군(Fab'-X 및 Fab'-Y)도 첨가하였다. 이들 조합물들은 표 8에 제시되어 있다.
Figure 112016120995546-pct00012
Fab'A-X 및/또는 Fab'B-Y를 일반적인 방법 2에 따라 항온처리하였다.
그 다음, 세포를, 단백질 상의 위치 473에서 변경된 세린 잔기를 인식하는 형광 표지된 항-CD20 항체(BD Biosciences) 및 형광 표지된 항-인 Akt 항체로 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 25 ㎕의 유동 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 Akt의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 Akt 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다. 도 10은 항원 1에 대한 Fab(VR4247)와 항원 2에 대한 Fab(VR4246)의 이중특이적 조합물만이 B 세포 인-Akt 수준을 조절할 수 있고 임의의 다른 조합물은 조절할 수 없다는 것을 보여준다(데이터는 평균 값을 표시하고 오차 막대는 95% 신뢰구간이다).
실시예 9 - 항-항원 3(VR0982)과 항-항원 2(VR4246)의 억제 효과는 항체들이 이중특이적 배향으로 정렬되어 있을 때에만 재현될 수 있다.
인간 PBMC를 일반적인 방법 1에 따라 준비하였다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 항원 1 및 항원 2에 대한 항원 특이성을 가진 등몰(200 nM) 양의 Fab'-X(Fab-scFv) 및/또는 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이적 항체들, 2가 항체들 또는 항체의 혼합물들의 조합물을 생성하였다. 이들 조합물들은 표 9에 제시되어 있다.
Figure 112016120995546-pct00013
Fab'A-X 및/또는 Fab'B-Y를 일반적인 방법 2에 따라 항온처리하였다.
그 다음, 세포를 일반적인 방법 3에 따라 염색하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 Akt 및 PLCg2 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다. 도 11 및 12는 항원 3 및 항원 2에 대한 이중특이적 조합물만이 인산화된 Akt 및 PLCg2 발현을 억제하였고 항-항원 3 항체(VR0982)와 항-항원 2 항체(VR4246)의 혼합물은 억제하지 않았다는 것을 보여준다(데이터는 평균 값을 표시하고 오차 막대는 95% 신뢰구간이다).
항원 3 및 항원 2에 대한 이중특이적 조합물을 사용할 때 관찰된 억제를 검증하기 위해, 항-항원 3 항체(VR0982)와 항-항원 2 항체(VR4246)의 혼합물과 함께 이 조합물을 적정하였고 B 세포에서 총 세포내 IkB(신호전달 판독대상) 및 CD86(24시간 후 활성화 마커)의 억제를 측정하였다.
도 13에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 항원-3-X/항원-2-Y의 조합물은 총 IkB 단백질의 수준에 의해 측정될 때 항-IgM 자극 후 NF-kB 신호 활성화를 억제할 수 있었으나 항원-3-X/항원-2-X의 조합물(즉, 연결되지 않은 단순한 혼합물)은 억제할 수 없었다. 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 6을 이용한 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트를 이용함으로써 추정된 IC50은 7.5 nM이었다(데이터는 평균 값을 표시하고 오차 막대는 표준 편차이다). 추가로, 항원-3-X/항원-2-Y의 조합물의 적정은 24시간 후 B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD86 발현을 억제할 수 있었으나 항원-3-X/항원-2-X의 조합물의 적정은 억제할 수 없었다(도 14 참조). 그래프패드 프리즘 6을 이용한 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트를 이용함으로써 추정된 IC50은 10.3 nM이었다(데이터는 평균 값을 표시하고 오차 막대는 표준 편차이다).
실시예 10: 항-항원 4 및 항-항원 2의 억제 효과는 항체들이 이중특이적 배향으로 정렬되어 있을 때에만 재현될 수 있다.
인간 PBMC를 일반적인 방법 1에 따라 준비하였다. 이 기간 동안, 10% 소 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세포 표면 단백질 항원 4 및 항원 2에 대한 항원 특이성을 가진 등몰(200 nM) 양의 Fab'A-X(Fab-scFv) 및/또는 Fab'B-Y(Fab-펩티드)를 희석함으로써 이중특이적 항체들, 2가 항체들 또는 항체의 혼합물들의 조합물을 생성하였다. 이들 조합물들은 표 10에 제시되어 있다.
Figure 112016120995546-pct00014
Fab'A-X 및/또는 Fab'B-Y를 일반적인 방법 2에 따라 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 일반적인 방법 3에 따라 염색하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 Akt 및 PLCg2 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다.
도 15 및 16은 항-항원 4 항체(VR4248)와 항-항원 2 항체(VR4246)의 이중특이적 조합물만이 인산화된 Akt 및 PLCg2 발현을 억제하였고 항-항원 4 항체(VR4248)와 항-항원 2 항체(VR4246)의 혼합물은 억제하지 않았다(데이터는 평균 값을 표시하고 오차 막대는 95% 신뢰구간이다).
항-항원 4(VR4248)와 항-항원 2(VR4246)의 이중특이적 조합물을 사용할 때 관찰된 억제를 검증하기 위해, B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD86 발현을 측정하는 분석 시스템에서 이 조합물을 적정하였다.
도 17에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 항원 4-X/항원 2-Y의 조합물의 적정은 24시간 후 B 세포 상에서의 항-IgM 유도된 CD86 발현을 억제할 수 있었다. 그래프패드 프리즘 6을 이용한 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트를 이용함으로써 추정된 IC50은 4.7 nM이었다(데이터는 평균 값을 표시하고 오차 막대는 표준 편차이다).
실시예 11 - 이중특이적 복합체 특징규명
기능성 스크리닝 시약의 정제 : 표준 CHO 발현 후 기능성 스크리닝 포맷 Fab-X(Fab-scFv-His) 및 Fab-Y(Fab-펩티드-His)를 다음과 같이 정제하였다. 1 ℓ 스테리컵(stericup)을 이용하여 맑은 세포 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였다. pH를 측정하였고 필요에 따라 pH 7.4까지 조절하였다. 준비된 상청액을 10 mM 인산나트륨 및 0.5 M NaCl(pH 7.4)으로 평형화된 5 ㎖ 히스트랩 니켈 엑셀(GE Healthcare) 컬럼 상에 5 ㎖/분의 속도로 적재하였다. 컬럼을 15 mM 이미다졸, 10 mM 인산나트륨 및 0.5 M NaCl(pH 7.4)으로 세척한 후 250 mM 이미다졸, 10 mM 인산나트륨 및 0.5 M NaCl(pH 7.4)으로 용출하였다. 용출 후 280 nm에서 흡광도를 측정하였고 용출 피크를 수집하였다. 피크 용출물을 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 유속으로 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 10 kDa 분자량 컷 오프 막을 가진 아미콘(Amicon) 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃(swing out) 로터로 400xg에서 원심분리하여 충분한 순도의 샘플을 1 mg/㎖ 과의 농도까지 농축하고 PBS(pH 7.4)(Sigma Aldrich Chemicals) 내로 정용여과하였다. 생성물 품질이 충분하지 않은 경우, 니켈 컬럼 용출물을 농축하고 PBS(pH 7.4)(Sigma Aldrich Chemicals)로 평형화된 XK16/60 또는 XK16/60 수퍼덱스(Superdex)200(GE Healthcare) 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 각각 1 ㎖/분 또는 2.6 ㎖/분의 속도로 PBS(pH 7.4)(Sigma Aldrich Chemicals)의 등용매 구배로 현상하였다. 분획을 수집하고 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 유속으로 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 선택된 분획을 풀링하고 10 kDa 분자량 컷 오프 막을 가진 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 400xg에서 원심분리하여 1 mg/㎖ 초과의 농도까지 농축하였다.
용액에서의 이중특이적 형성의 분석
실험 1
정제된 Fab-X(VR4247)와 정제된 Fab-Y(VR4248)를 500 ㎍/㎖의 총 단백질 농도로 1 대 1 몰 비로 혼합하고 주위 온도에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 대조군은 그들이 혼합물 상태로 존재할 때와 동일한 농도로 혼합물의 개별 부분들로 구성되었다. 100 ㎕의 샘플 및 각각의 대조군을 1 ㎖/분의 속도로 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에 주입하였다.
도 18의 크기 배제 크로마토그램은 Fab-X(VR4247) 대조군이 8.610 미터법 분의 체류 시간과 함께 총 피크 면적의 92%의 주요 피크를 갖는다는 것을 보여준다. Fab-Y(VR4248) 대조군은 10.767 미터법 분의 체류 시간과 함께 총 피크 면적의 94%의 주요 피크를 가진다. 동일한 조건 하에서 실시된 바이오라드(BioRad) 겔 여과 표준물(151-1901)의 체류 시간으로부터 생성된 표준 곡선을 이용하여 Fab-X 및 Fab-Y 대조군들에 대해 측정된 체류 시간을 각각 95 kDa 및 35 kDa의 겉보기 분자량으로 전환하였다. 이들 겉보기 분자량들은 Fab-scFv 및 Fab-펩티드 분자에 대한 예상된 겉보기 분자량과 일치한다. Fab-X(VR4247)/Fab-Y(VR4248) 혼합물에 대한 주요 피크는 9.289 미터법 분의 체류 시간을 가진다. 이것을 전술된 바와 같이 187 kDa의 겉보기 분자량으로 전환한다. 이 겉보기 분자량은 1개의 Fab-X(VR4247)와 1개의 Fab-Y(VR4248)의 페어링에 대해 예상된 겉보기 분자량과 일치한다. 상기 주요 피크도 총 피크 면적의 84%인데, 이것은 대부분의 Fab-X(VR4247) 및 Fab-Y(VR4248)가 1 대 1 이중특이적 단백질 복합체를 형성하였다는 것을 암시한다. 주요 피크 후 용출되는 작은 추가 쇼울더(shoulder) 및 피크는 Fab-X(VR4247) 및 Fab-Y(VR4248) 출발 물질과 일치한다.
실험 2
정제된 Fab-X(VR4130)와 Fab-Y(VR4131)를 500 ㎍/㎖의 총 단백질 농도로 1 대 1 몰 비로 혼합하였다. 그 다음, 이 혼합물의 분취물을 50 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖의 농도까지 PBS(pH 7.4)로 희석하였다. 500 ㎍/㎖의 혼합물로 존재하였을 때와 동일한 농도로 혼합물의 개별 부분들로 구성된 대조군들도 설정하였다. 모든 혼합물들 및 대조군들을 주위 온도에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 100 ㎕의 모든 샘플들 및 대조군들을 1 ㎖/분의 속도로 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에 주입하였다. 214 nm에서 흡광도로 검출하였다(도 19, 도 20 및 표 11 참조).
도 19의 크기 배제 크로마토그램은 Fab-X(VR4130) 대조군이 8.634 미터법 분의 체류 시간과 함께 총 피크 면적의 91%의 주요 피크를 갖는다는 것을 보여준다. Fab-Y(VR4131) 대조군은 9.361 미터법 분의 체류 시간과 함께 총 피크 면적의 97%의 주요 피크를 가진다. 동일한 조건 하에서 실시된 바이오라드 겔 여과 표준물(151-1901)의 체류 시간으로부터 생성된 표준 곡선을 이용하여 Fab-X 및 Fab-Y 대조군들에 대해 측정된 체류 시간을 각각 109 kDa 및 55 kDa의 겉보기 분자량으로 전환하였다. 이들 겉보기 분자량들은 Fab-scFv 및 Fab-펩티드 분자에 대한 예상된 겉보기 분자량과 일치한다. Fab-X(VR4130)/Fab-Y(VR4131) 혼합물에 대한 주요 피크는 8.016 미터법 분의 체류 시간을 가진다. 이것을 전술된 바와 같이 198 kDa의 겉보기 분자량으로 전환하였다. 이 겉보기 분자량은 1개의 Fab-X(VR4130)와 1개의 Fab-Y(VR4131)의 페어링에 대해 예상된 겉보기 분자량과 일치한다. 상기 주요 피크도 총 피크 면적의 82%인데, 이것은 대부분의 Fab-X(VR4130) 및 Fab-Y(VR4131)가 1 대 1 복합체를 형성하였다는 것을 암시한다. 주요 피크 후 용출되는 2개의 작은 피크들은 Fab-X(VR4130) 및 Fab-Y(VR4131) 출발 물질과 일치한다.
도 20의 크기 배제 크로마토그램은 500 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖ 농도의 Fab-X(VR4130)/Fab-Y(VR4131) 1 대 1 혼합물들에 대한 결과이다. 모든 기록선들은 샘플이 유사한 체류 시간 및 유사한 상대적 피크 높이 및 면적을 가진 샘플들 사이에 상응하는 피크와 유사하다. 백분율 피크 면적은 표 11에 대비되어 있는데, 이때 각각의 피크의 %는 혼합물의 희석 시 꽤 일정하게 유지된다. 이것은 Fab-X/Fab-Y 1 대 1 복합체가 시험된 모든 농도들에서 복합체로서 유지된다는 것을 시사한다. 혼합물이 복합체에 대한 40 nM의 농도에 해당하는 5 ㎍/㎖까지 희석될 때조차도 75%의 Fab-X 및 Fab-Y는 1 대 1 복합체로서 존재한다.
Figure 112016120995546-pct00015
따라서, 이들 실험들의 결과는 높은 비율의 Fab-X 및 Fab-Y 융합 단백질들이 최소 비율의 단량체를 남기고 동종이량체 형성의 증거를 보이지 않으면서 원하는 이중특이적 복합체를 형성한다는 것을 시사한다.
실시예 12: 신규 이중특이적 항체 표적을 확인하기 위한 이종이량체적으로 테터링된 단백질 복합체의 큰 패널의 격자 스크리닝
도입 : 상기 실시예들에서 이중특이적 포맷 및 스크리닝 방법을 성공적으로 검증한 후, 스크리닝을 보다 많은 수의 항원 쌍들로 확장하였다. B 세포 상에서 발현된 23개의 상이한 항원들에 대한 항체 가변(V) 영역 쌍들의 패널을 생성하였다. Fab-Kd-Fab[즉, A-X:Y-B, 이때 A 및 B는 Fab 단편임] 포맷을 사용하여 315개의 상이한 항원 쌍 조합물들 각각의 다수의 V 영역 조합물들을 대표하는, 이종이량체적으로 테터링된 단백질 복합체들의 격자를 형성하였다. 이중특이적 항체에 의한 중재를 위한 신규 표적 쌍을 선택하기 위해 고처리율 유세포분석에서 BCR(B 세포 수용체) 신호전달을 조절하는 능력에 대해 이들 조합물들을 스크리닝하였다.
면역화 : 선택된 항원을 코딩하는 DNA를 유전자 합성 또는 상업적 공급원으로부터 입수하고 강력한 항시성(constitutive) 프로모터를 가진 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 그 다음, 사내 전기천공 시스템을 이용하여 플라스미드 DNA를 Rab-9 토끼 섬유모세포(ATCC® CRL-1414™) 내로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 유세포분석으로 항원 발현에 대해 확인하고 사용될 때까지 액체 질소 중의 분취물로 동결하였다. 동일한 세포 상에서 공동-발현시키거나 단일 또는 다중 형질감염된 세포들의 혼합물을 제조함으로써 토끼 1마리당 최대 6개의 항원들을 면역화시켰다. 토끼를 3회 용량의 세포로 면역화시켰다.
항체 발견 : 문헌(Zubler et al. (1985))에 기재된 방법과 유사한 방법을 이용하여 B 세포 배양물을 제조하였다. 요약하건대, 면역화된 토끼로부터의 비장 또는 PBMC-유래 B 세포를, 5% CO2의 대기 중에서 37℃에서 7일 동안 10% FCS(PAA laboratories ltd), 2% HEPES(Sigma Aldrich), 1% L-글루타민(Gibco BRL), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Gibco BRL), 0.1% β-머캡토에탄올(Gibco BRL), 3% 활성화된 비장세포 배양 상청액 및 감마-조사된 돌연변이체 EL4 뮤린 흉선종 세포(5x104/웰)로 보충된 200 ㎕/웰 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)를 가진 바코딩된 96 웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 대략 2000개 내지 5000개 세포의 밀도로 배양하였다.
토끼를 면역화시킨 항원으로 공동-형질감염된 HEK293 세포를 사용한 균질 형광-기초 결합 분석을 이용하여 B 세포 배양물 상청액 중의 항원 특이적 항체의 존재를 확인하였다. 스크리닝은 매트릭스 플레이트메이트(Platemate) 액체 핸들러(handler)를 이용하여 10 ㎕의 상청액을 바코딩된 96 웰 조직 배양 플레이트로부터, 표적 항원으로 형질감염된 HEK293 세포를 함유하는 바코딩된 384 웰 흑색-벽 분석 플레이트(대략 3000개의 세포/웰) 내로 옮기는 단계를 포함하였다. 염소 항-토끼 IgG Fcγ 특이적 Cy-5 접합체(Jackson)로 결합을 보여주었다. 플레이트를 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 8200 세포 검출 시스템 상에서 판독하였다.
일차 스크리닝 후, 아비소 온닉스 히트-픽킹 로봇(Aviso Onyx hit-picking robot)을 이용하여 양성 상청액들을 96 웰 바코딩된 마스터 플레이트 상에서 통합하였고 세포 배양 플레이트 내의 B 세포를 -80℃에서 동결하였다. 그 다음, 마스터 플레이트를 별도로 항원으로 형질감염된 HEK293 세포 및 항원의 공급원인 재조합 단백질로 코팅된 수퍼아비딘(Superavidin™) 비드(Bangs Laboratories)에 대한 균질 형광-기초 결합 분석에서 스크리닝하였다. 각각의 웰에 대한 항원 특이성을 확인하기 위해 이것을 수행하였다.
관심 있는 선택된 웰로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하기 위해, B 세포의 불균질 집단을 함유하는 소정의 웰에서 항원 특이적 B 세포가 확인될 수 있도록 데콘볼루션(deconvolution) 단계를 수행하였다. 형광 초점 방법(Clargo et al., 2014. Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159; EP1570267B1)을 이용하여 이것을 달성하였다. 요약하건대, 양성 웰로부터의 면역글로불린 분비 B 세포를 표적 항원으로 형질감염된 HEK293 세포 또는 바이오티닐화된 표적 항원으로 코팅된 스트렙타비딘 비드(New England Biolabs) 및 염소 항-토끼 Fcγ 단편 특이적 FITC 접합체(Jackson)의 1:1200 최종 희석물과 혼합하였다. 1시간 동안 37℃에서 정적 항온처리를 수행한 후, 항원 특이적 B 세포를 둘러싸는 형광 할로의 존재로 인해 상기 B 세포를 확인할 수 있었다. 그 다음, 올림푸스(Olympus) 현미경을 이용함으로써 확인된 다수의 이들 개별 B 세포 클론들을 에펜도르프 미세조작기(Eppendorf micromanipulator)로 선택하고 PCR 튜브 내에 침착시켰다. 형광 초점 방법을 다시 이용하여 면역화된 토끼의 골수로부터 직접적으로 B 세포의 불균질 집단으로부터의 항원 특이적 B 세포를 확인하였다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이적 프라이머를 사용한 역전사(RT)-PCR로 단일 세포로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하였다. 2 라운드의 PCR을 수행하였는데, 이때 네스티드 이차 PCR은 3' 말단 및 5' 말단에서 제한 부위를 도입함으로써, 가변 영역이 마우스 Fab-X 및 Fab-Y(VH) 또는 마우스 카파(VL) 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있게 한다. Fab-X 및 Fab-Y 발현 벡터를 위한 중쇄 및 경쇄 구축물을, 펙틴(Fectin) 293(Life Technologies)을 사용하여 HEK-293 세포, 또는 엑스피펙타민(Expifectamine)(Life Technologies)을 사용하여 Expi293 세포 내로 공동-형질감염시켰고 재조합 항체를 5 ㎖의 부피로 6 웰 조직 배양 플레이트에서 발현시켰다. 상청액을 항원으로 형질감염된 HEK293 세포 및 재조합 단백질 또는 항원 형질감염된 HEK 세포로 코팅된 수퍼아비딘™ 비드(Bangs Laboratories)에 대한 균질 형광-기초 결합 분석에서 시험하였다. 클로닝된 항체의 특이성을 확인하기 위해 이것을 수행하였다.
소규모 Fab A-X 및 Fab B-Y의 제조 (소규모(50 ㎖) Expi293 형질감염)
Expi293 세포를 0.5x106개의 생존 세포/㎖의 최종 농도까지 Expi293™ 발현 배지에서 상용적으로 하위배양하고 120 rpm 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 항온처리기(멀티트론(Multitron), Infors HT)에서 항온처리하였다.
형질감염 당일에 자동화된 세포 카운터(Vi-CELL, Beckman Coulter)를 이용하여 세포 생존능 및 농도를 측정하였다. 2.5x106개 생존 세포/㎖의 최종 세포 농도를 달성하기 위해, 적절한 부피의 세포 현탁액을 멸균 250 ㎖ 삼각 진탕 플라스크에 첨가하고 각각 50 ㎖의 형질감염을 위해 새로운 미리 가온된 Expi293™ 발현 배지를 첨가함으로써 부피가 42.5 ㎖가 되게 하였다.
각각의 형질감염을 위한 지질-DNA 복합체를 제조하기 위해, 총 50 ㎍의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA를 Opti-MEM® I 배지(Life Technologies)로 2.5 ㎖의 총 부피까지 희석하고 135 ㎕의 엑스피펙타민™ 293 시약(Life Technologies)을 Opti-MEM® I 배지로 2.5 ㎖의 총 부피까지 희석하였다. 모든 희석물들을 약하게 혼합하고 실온에서 5분 이하의 시간 동안 항온처리한 후, 각각의 DNA 용액을 각각의 희석된 엑스피펙타민™ 293 시약에 첨가하여 5 ㎖의 총 부피를 수득하였다. DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 혼합물을 약하게 혼합하고 실온에서 20분 내지 30분 동안 항온처리하여 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체가 형성되게 하였다.
DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체 항온처리가 완료된 후, 5 ㎖의 DNA-엑스피펙타민™ 293 시약 복합체를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다. 진탕 플라스크를 120 rpm, 8% CO2 및 37℃에서 궤도 진탕 항온처리기(멀티트론, Infors HT)에서 항온처리하였다.
형질감염시킨 지 대략 16시간 내지 18시간 후, 250 ㎕의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 1(Life Technologies) 및 2.5 ㎖의 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 2(Life Technologies)를 각각의 진탕 플라스크에 첨가하였다.
형질감염시킨 지 7일 후, 세포 배양물을 회수하였다. 세포를 50 ㎖ 스핀 튜브(팔콘) 내로 옮기고 4000 rpm에서 30분 동안 회전시킨 후 0.22 ㎛ 스테리컵(Merk Millipore)을 통해 멸균 여과하였다. 정화되고 멸균 여과된 상청액을 4℃에서 저장하였다. 최종 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
소규모( 50 ㎖ ) 정제 : 소규모 진공-기초 정제 시스템을 이용하여 친화도 포획으로 Fab-X 및 Fab-Y 둘 다를 별도로 정제하였다. 요약하건대, 50 ㎖의 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과한 후, 500 ㎕의 Ni 세파로스 비드(GE Healthcare)를 첨가하였다. 그 다음, 상청액 비드 혼합물을 약 1시간 동안 텀블링시킨 후, 진공을 적용함으로써 상청액을 제거하였다. 그 다음, 비드를 세척제 1(50 mM 인산나트륨 1 M NaCl pH 6.2) 및 세척제 2(0.5 M NaCl)로 세척하였다. 50 mM 아세트산나트륨(pH 4.0) + 1 M NaCl을 사용하여 용출을 수행하였다. 용출된 분획을 PBS(Sigma, pH 7.4)로 완충제 교환하고 0.22 ㎛ 여과하였다. 최종 풀을 A280 스캔, SE-UPLC(BEH200 방법) 및 SDS-PAGE(환원 및 비-환원)로 분석하였고 PTS 엔도세이프 시스템을 이용하여 내독소에 대해 분석하였다.
스크리닝 분석
37℃로 설정된 수조를 이용하여 기증자 PBMC들을 신속히 해동하고 50 ㎖ 팔콘 튜브로 조심스럽게 옮겼다. 그 다음, 이들을 분석 배지로 5 ㎖까지 적가 희석하여 삼투압 쇼크를 최소화하였다. 그 다음, 세포를 20 ㎖까지 조심스럽게 희석한 후 최종 배지 희석제를 첨가하여 50 ㎖의 부피를 만들었다. 그 다음, 세포를 5분 동안 500g에서 회전시킨 후, 상청액을 제거하고 세포를 1 ㎖의 배지에 재현탁하였다. 그 다음, 세포를 카운팅하고 1.66x106개 세포/㎖까지 희석한 후, 웰당 30 ㎕를 V-바닥 TC 플레이트 내로 분배하여 5.0x104개 세포/웰의 최종 분석 농도를 제공하였다. 그 다음, 세포 플레이트가 요구될 때까지 이 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 항온처리기 내에서 덮여진 상태로 저장하여, 상기 세포 플레이트에게 최소 1시간의 휴식을 제공하였다.
Fab-X 시약과 Fab-Y 시약을 분석 배지에서 5x 최종 분석 농도로 등몰 비로 혼합하고 37℃ 및 5% CO2에서 90분 동안 항온처리하였다. 샘플을 96 웰 U-바닥 폴리프로필렌 플레이트에서 제조하고 항온처리 동안 덮어두었다.
10 ㎕의 5x Fab-KD-Fab 혼합물을 세포가 함유된 적절한 시험 웰에 첨가하고 30초 동안 1000 rpm에서 진탕함으로써 혼합한 후 37℃ 및 5% CO2에서 90분 동안 항온처리하였다.
그 다음, 세포를 10 ㎕의 항-인간 IgM으로 자극하였다. 자극의 최종 분석 농도는 분석 패널 판독대상에 따라 변경되었고, 3개의 항체 칵테일 A, B 및 C(이하에 상세히 기재됨)를 50 ㎍/㎖(칵테일 A 및 C) 또는 25 ㎍/㎖(칵테일 B)의 최종 분석 농도에서 자극하였다. 그 다음, 분석 플레이트를 30초 동안 1000 rpm에서 약하게 혼합한 후 5분(항체 칵테일 A 및 C) 또는 2분(항체 칵테일 B) 동안 37℃ 및 5% CO2에서 항온처리하였다. 150 ㎕의 빙냉 BD 사이토픽스를 모든 웰들에 첨가하여 분석을 중단하고 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 고정된 세포를 5분 동안 500g에서 회전시켜 세포를 펠렛화하고 바이오텍(BioTek) ELx405 플레이트 세척제를 사용하여 상청액의 제거를 가능하게 하였다. 플레이트를 30초 동안 2400 rpm에서 볼텍싱함으로써 펠렛을 재현탁하였다. 그 다음, 100 ㎕의 빙냉 BD 세포 투과가능화 완충제 III을 첨가함으로써 30분 동안 4℃에서 세포를 투과가능하게 만들었다. 그 다음, 세포를 100 ㎕ FACS 완충제로 세척하고 5분 동안 500g에서 회전시켰다. 상청액을 ELx405로 다시 제거한 후, 이를 사용하여 200 ㎕의 FACS 완충제를 신속히 분배함으로써 임의의 잔류 투과가능화 완충제를 씻어내었다. 세포를 500g에서 다시 회전시켰고 뒤집어 상청액을 제거하였다. 이전 회전 단계 동안 FACS 완충제에서 항체 칵테일을 제조하고 광으로부터 차폐된 상태로 보관하였다. 그 다음, 세포를 볼텍싱(2400 RPM, 30초)으로 재현탁한 후, 20 ㎕의 항체 칵테일을 모든 웰들에 첨가하였고 플레이트를 1000 rpm에서 30초 동안 진탕하였다. 그 다음, 세포를 실온의 암실에서 60분 동안 항온처리하였다.
그 다음, 세포를 500g에서 회전시키면서 200 ㎕ FACS 완충제로 2회 세척하였고, 각각의 단계 후 상청액을 제거하였다. 마지막으로, 세포를 2400 rpm에서 30초 동안 볼텍싱함으로써 재현탁한 후, 최종 20 ㎕의 FACS 완충제를 첨가하였다. 그 다음, 플레이트(들)를 인텔리사이트 HTFC/iQue 기계 상에서 판독하였다.
FACS 완충제 = PBS + 1% BSA + 0.05% NaN3 + 2 mM EDTA
항체 칵테일 A = 1:2 CD20 PerCp-Cy5.5(BD Biosciences) + 1:5 PLCγ2 AF88 + 1:10 Akt AF647 + 1:50 ERK1/2 PE(FACS 완충제로 희석됨)
항체 칵테일 B = 1:2 CD20 PerCp-Cy5.5(BD Biosciences) + 1:5 Syk PE + 1:5 BLNK AF647(FACS 완충제로 희석됨)
항체 칵테일 C = 1:5 CD20 PerCp-Cy5.5(Biolegend) + 1:5 PLCγ2 AF488 + 1:10 Akt AF647 + 1:5 Syk PE(FACS 완충제로 희석됨)
Figure 112016120995546-pct00016
Fab-X + Fab-Y 조합물을 항체 칵테일 A 및 B 또는 C 단독으로 스크리닝하였다. 모든 스크린들을 2명의 상이한 혈액 기증자들로부터의 원추 세포에 대해 수행하였다. 상업적으로 입수가능한 소프트웨어 수단을 이용하여 데이터를 포획하고 평가하였다. 총 2500 Fab-X + Fab-Y 조합물을 315개의 상이한 항원 조합물들에 대해 스크리닝하였다.
결과
B 세포 기능을 억제하는 항원들의 신규 조합물을 찾는 본 실시예에서 각각의 Fab-Kd-Fab[즉, A-X:Y-B, 이때 A 및 B는 Fab 단편임] 조합물에 의한 BCR 신호전달 캐스케이드 단백질의 인산화 유도의 백분율 억제를 계산하였고, 양성 조합물에 대한 기준을 V 영역들의 하나 이상의 조합물에 의한 2개 이상의 인-판독대상들의 30% 이상의 억제로서 설정하였다. 이 역치에 따르면, 조사된 315개 중 11개의 신규 항원 쌍 조합물들이 요구된 기준을 충족시켰다. 이것은 3.5% 히트율을 나타냄으로써, 원하는 활성의 조합물을 찾기 위한 다수의 조합물들의 스크리닝의 중요성을 입증한다.
도 21 내지 23은 항원 격자 교차 특이성에 대한 데이터를 보여준다. 값들은 각각 Syk, PLCg2 및 AKT의 인산화의 백분율 억제(활성화에 대한 음성 값)이고 평가된 다수의 V 영역 조합물들의 평균을 나타낸다. 315개의 상이한 항원 조합물들을 시험하였고 관찰될 수 있는 바와 같이 항체의 상이한 조합물들에 의한 BCR 신호전달에 대한 효과는 강한 억제, 예를 들면, Fab-Y 상의 항원 3 및 4와 조합된 Fab-X 상의 항원 2(인 Syk의 69.66% 및 70.4% 억제, 도 21)부터 활성화, 예를 들면, X 상의 항원 6 및 Y 상의 항원 11(마이너스 118.10% 인 Syk, 도 21)까지 상당히 다양하였다.
도 21 내지 23에 표시된 평균 % 값을 나타내는 각각의 데이터 점은 도 24에서 Fab-X 상의 항원 2 및 Fab-Y 상의 항원 3에 대해 표시되어 있다. 이 경우, 상이한 항체 V 영역들의 23개 상이한 조합물들을 평가하였다. 대안적인 배향의 동일한 항원 조합물(즉, Fab-Y 상의 항원 2 및 Fab-X 상의 항원 3)은 도 25에 표시되어 있다. 이 경우, 상이한 항체 V 영역들의 9개 상이한 조합물들을 평가하였다. 모든 V 영역들은 억제를 보이지만, 유리하게는 이 방법은 최적 V 영역 조합물의 선택에서도 사용될 수 있다.
유사하게, 도 21 내지 23에 표시된 평균 % 값을 나타내는 각각의 데이터 점은 도 26에서 Fab-X 상의 항원 조합물 2 및 Fab-Y 상의 항원 4에 대해 표시되어 있다. 이 경우, 상이한 항체 V 영역들의 10개 상이한 조합물들을 평가하였다. 대안적인 배향의 동일한 항원 조합물, 즉 Fab-Y 상의 항원 2 및 Fab-X 상의 항원 4는 도 27에 표시되어 있다. 이 경우, 상이한 항체 V 영역들의 6개 상이한 조합물들을 평가하였다. 다시, 모든 V 영역들은 억제를 보이지만, 상기 방법을 이용하여 최적 V 영역 조합물을 확인하고 선택할 수 있다.
실시예 13 - FabA-X:Y-FabB 격자 스크리닝이 단백질 정제에 의존하지 않으면서 신규 이중특이적 항체 표적을 확인할 수 있는지를 평가하기 위한 일과성 발현된 이종이량체적으로 테터링된 단백질 복합체의 평가
도입 : Fab-Kd-Fab[FabA-X:Y-FabB] 포맷의 사용 및 이종이량체적으로 테터링된 단백질 복합체의 격자 스크리닝에 의해 확인된 이중특이적 항체로서 B 세포 신호전달을 억제하는 2개의 상이한 항원들인 항원 2 및 3에 대한 V 영역들을 FabA-X 및 FabB-Y로서 일과성 발현시켰다. (후속 정제 없이) 일과성 발현되고 정제된 FabA-X 및 FabB-Y 조합물의 활성을 비교하여, 격자 스크리닝이 정제된 성분 대신에 일과성 발현의 직접적인 생성물에 의해 수행될 수 있는지를 평가하였다.
면역화 : 항원 발현 세포의 제조 및 토끼의 면역화를 실시예 12에 기재된 방식과 동일한 방식으로 수행하였다.
항체 발견
B 세포 배양물을 실시예 12에 기재된 방식과 동일한 방식으로 제조하였다.
B 세포 배양 상청액에서의 항원 특이적 항체의 스크리닝 및 항원 특이적 B 세포의 확인을 위한 데콘볼루션 단계를 실시예 12에 기재된 방식과 동일한 방식으로 결정하였다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이적 프라이머를 사용한 역전사(RT)-PCR로 단일 세포로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하였다. 2 라운드의 PCR을 수행하였는데, 이때 네스티드 2o PCR은 3' 말단 및 5' 말단에서 제한 부위를 도입하여, 가변 영역이 마우스 Fab-X 및 Fab-Y(VH) 또는 마우스 카파(VL) 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝되게 하였다. 그 다음, 3o PCR을 수행하여 증폭된 가변 영역, 인간 CMV 프로모터 단편 및 토끼 감마 1 중쇄 불변 또는 토끼 카파 불변 단편의 조합이 별도의 중쇄 및 경쇄 전사적 활성 PCR(TAP) 단편을 생성할 수 있게 하였다. 293펙틴(Life Technologies)을 사용하여 HEK-293 세포에서, 또는 엑스피펙타민(Life Technologies)을 사용하여 Expi293 세포에서 토끼 전장 IgG 항체를 재조합 발현시키기 위해 이들 DNA 단편들을 직접적으로 사용하였다.
그 다음, 항원으로 형질감염된 HEK-293 세포 및 재조합 단백질로 코팅된 수퍼아비딘™ 비드(Bangs Laboratories)에 대한 균질 형광-기초 결합 분석을 이용하여 항원 결합에 대해 생성 재조합 항체를 스크리닝하였다. 일단 TAP 일시적 생성물에 의해 특이성이 확인되면, 항체 유전자를 Fab-X 및 Fab-Y 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄 구축물을, 펙틴 293(Life Technologies)을 사용하여 HEK-293 세포 내로, 또는 엑스피펙타민(Life Technologies)을 사용하여 Expi293 세포 내로 공동-형질감염시고 재조합 항체를 5 ㎖의 부피로 6 웰 조직 배양 플레이트에서 발현시켰다. 5일 내지 7일 발현 후, 상청액을 수거하였다. 상청액을 항원으로 형질감염된 HEK293 세포 및 재조합 단백질 또는 항원 형질감염된 HEK 세포로 코팅된 수퍼아비딘™ 비드(Bangs Laboratories)에 대한 균질 형광-기초 결합 분석에서 상청액을 시험하였다. 클로닝된 항체의 특이성을 확인하기 위해 이것을 수행하였다.
Fab-X 및 Fab-Y를 함유하는 일과성 상청액의 제조
실시예 12에 기재된 방법과 동일한 Expi293 형질감염 방법을 이용하여 Fab-X 및 Fab-Y를 함유하는 일과성 상청액을 제조하였다.
정제된 Fab-X 및 Fab-Y의 제조
현탁 CHOSXE 세포를 2 mM(100x) 글루타맥스로 보충된 CDCHO 배지(Invitrogen)에 미리 적응시켰다. 세포를 진탕기 항온처리기(Kuner AG, 스위스 비르스펠덴 소재) 상에서 140 rpm으로 교반된 상태로 대수 생장기에서 유지하고 8% CO2로 보충된 37℃에서 배양하였다.
형질감염 전, CEDEX 세포 카운터(Innovatis AG, 독일 빌레펠트 소재)를 이용하여 세포 수 및 생존능을 측정하였고 요구된 양의 세포(2x108개의 세포/㎖)를 원심분리 원추 튜브 내로 옮기고 10분 동안 1400 rpm에서 회전시켰다. 펠렛화된 세포를 멸균 얼스 균형 염 용액에 재현탁하고 추가 10분 동안 1400 rpm에서 회전시켰다. 상청액을 따라 버렸고 펠렛을 원하는 세포 밀도까지 재현탁하였다.
2x108개 세포/㎖ 혼합물을 위해 400 ㎍ 및 800 ㎕의 최종 농도로 벡터 DNA를 피펫으로 큐벳(Biorad) 내에 넣었고 사내 전기천공 시스템을 이용하여 전기천공하였다.
형질감염된 세포를, 2 mM 글루타맥스로 강화된 ProCHO 5 배지 및 항생제 항유사분열(100x) 용액(500 중 1)을 함유하는 1x3 ℓ 삼각 플라스크 내로 직접 옮겼고, 세포를 37℃, 5% CO2 및 140 rpm 진탕으로 설정된 쿠너 진탕기 항온처리기에서 배양하였다. 공급 보충제 2 g/ℓ ASF(AJINOMOTO)를 형질감염시킨 지 24시간 후에 첨가하였고 온도를 추가 13일 배양 동안 37℃까지 낮추었다. 4일째 날, 3 mM 부티르산나트륨(n-부티르산 나트륨 염, Sigma B-5887)을 배양물에 첨가하였다.
14일째 날, 배양물을 튜브로 옮겼고 4000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후 세포로부터 상청액을 분리하였다. 보유된 상청액을, 0.22 ㎛ 사르토브란® P 밀리포어에 이어 0.22 ㎛ 감마 금 필터를 통해 더 여과하였다. 최종 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
악타 익스프레스 시스템 및 히스트랩 엑셀 예비팩킹된 니켈 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 친화도 포획으로 Fab-X 및 Fab-Y를 정제하였다. 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였고, 필요하다면 약산 또는 약염기를 사용하여 pH를 중성까지 조절한 후 컬럼 상에 적재하였다. 15 내지 25 mM 이미다졸을 함유하는 2차 세척 단계를 이용하여 니켈 수지로부터 임의의 약하게 결합된 숙주 세포 단백질/비-특이적 His 결합제를 제거하였다. 10 mM 인산나트륨(pH 7.4) + 1 M NaCl + 250 mM 이미다졸을 사용하여 용출을 수행하였고 2 ㎖ 분획을 수집하였다. 1 컬럼 부피가 용출되면, 용출 피크를 더 선명하게 하고 결과적으로 총 용출 부피를 감소시키기 위해 시스템을 10분 동안 중단시켰다. 가장 깨끗한 분획을 풀링하였고 완충제를 PBS(Sigma)(pH 7.4)로 교환하고 0.22 ㎛ 여과하였다. 최종 풀을 A280 스캔, SE-HPLC(G3000 방법) 및 SDS-PAGE(환원 및 비-환원)로 분석하였고 PTS 엔도세이프 시스템을 이용하여 내독소에 대해 분석하였다.
기능 분석법
활성화 마커 분석 : 정제된 상태, 또는 일과성 상청액 중의 항원 2 특이적 Fab'-Y 및 항원 3 특이적 Fab'-X를 등몰 농도로 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 항온처리하였다. 1:4 연속 희석에서 185 nM의 출발 몰농도부터 조합물을 적정하였다. 순수물(neat)로부터 적정된 모의 상청액도 포함시켰다. V-바닥 96 웰 플레이트에서, 1.5x105개의 PBMC들을 웰에 첨가하였고, 이것에 적정된 Fab'-X 및 Fab'-Y 조합물 또는 모의 상청액을 첨가하였다. 그 다음, 상기 조합물과 세포를 추가 90분 동안 함께 항온처리하였다. 이 시간 후, 12.5 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(Southern Biotechnology)을 첨가함으로써 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 B 세포를 활성화시켰다.
100 ㎕의 빙냉 FACS 완충제(PBS + 1% BSA + 0.1% NaN3 + 2 mM EDTA)를 웰에 첨가하였고, 플레이트를 밀봉하고 대략 15분 동안 젖은 얼음으로 덮은 후, 4℃에서 5분 동안 500xg에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 따라 버리고 플레이트를 30초 동안 2000 rpm에서 진탕하였다.
그 다음, 세포를 형광 표지된 항-CD19 항체, 항-CD20 항체 및 항-CD71 항체(BD Biosciences)의 칵테일로 염색하였다. 플레이트를 짧게 진탕하고 암실 내의 젖은 얼음 위에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 시간 후, 플레이트를 2회 세척하고 20 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 iQUE® 스크리너 유세포분석기를 이용하여 CD19, CD20 및 CD71의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 CD71 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다.
인유동 ( PhosFlow ) 분석 : 정제된 상태, 또는 일과성 상청액 중의 항원 2 특이적 Fab'-Y 및 항원 3 특이적 Fab'-X를 등몰 농도로 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 항온처리하였다. 1:4 연속 희석에서 185 nM의 출발 몰농도부터 조합물을 적정하였다. 순수물로부터 적정된 모의 상청액도 포함시켰다. V-바닥 96 웰 플레이트에서, 5.0x104개의 PBMC들을 웰에 첨가하였고, 이것에 적정된 Fab'-X 및 Fab'-Y 조합물 또는 모의 상청액을 첨가하였다. 그 다음, 상기 조합물과 세포를 추가 90분 동안 함께 항온처리하였다. 이 시간 후, 25 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(Southern Biotechnology)을 첨가함으로써 37℃ 및 5% CO2에서 15분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 다음, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(BD Biosciences)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500xg에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 따라 버리고 이 세포 펠렛을 FACS 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3 + 2 mM EDTA)에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 그 다음, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(BD Biosciences)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다.
그 다음, 형광 표지된 항-CD20 항체(BD Biosciences), 및 보존된 이중 인산화된 부위 pT180/pY182를 인식하는 항-인산화된 p38 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 20 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 iQUE® 유세포분석기를 이용하여 CD20 및 인-p38의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 p38 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다.
결과
활성화 마커 분석 : 도 28에서 볼 수 있는 바와 같이, 데이터는 정제된 것이든 아니면 일과성 상청액으로부터 유래된 것이든 관계없이 항원 3과 항원 2의 조합물이 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD71 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
인유동 분석 : 도 29의 데이터는 정제된 것이든 아니면 일과성 상청액으로부터 유래된 것이든 관계없이 항원 3과 항원 2의 조합물이 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인산화된 p38을 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
정제에 의존하지 않고 일과성 발현된 배양물로부터 직접적으로 본 발명의 이중특이적 복합체를 구축할 수 있는 놀라운 능력은 정제된 성분들이 사용될 때보다 이중특이적 복합체의 훨씬 더 우수한 고처리율 스크리닝이 달성될 수 있게 한다.
실시예 14 - 최적 항원 3 항체 V 영역을 선택하기 위한, 이종이량체적으로 테터링된 단백질 복합체에서 정제된 항-항원 2 Fab -Y를 사용한 Fab -X로서의 항원 3에 대한 일과성 발현된 V 영역의 스크리닝
도입 : 이종이량체적으로 테터링된 단백질 복합체의 격자 스크리닝을 이용하여 항원 2 특이적 V 영역과 조합된 이중특이적 항체로서 B 세포 신호전달을 억제하는 항원 3에 대한 신규 V 영역을 확인하였다. 항원 3 V 영역을 Fab-X로서 일과성 발현시키고 정제된 항-항원 2 Fab-Y와 조합하였다. B 세포 신호전달의 활성화의 억제를 측정하여 가장 강력한 항원 3 및 항원 2 V 영역을 선택하였다.
항원 발현 세포의 제조 및 토끼의 면역화를 실시예 12에 기재된 방식과 동일한 방식으로 수행하였다.
항체 발견 : B 세포 배양물을 실시예 12에 기재된 방식과 동일한 방식으로 준비하였다.
B 세포 배양 상청액에서의 항원 특이적 항체의 스크리닝 및 항원 특이적 B 세포의 확인을 위한 데콘볼루션 단계를 실시예 12에 기재된 방식과 동일한 방식으로 결정하였다.
추가 가변 영역을 면역화된 마우스의 비장 및 골수-유래 B 세포로부터 직접적으로 직접적인 초점 방법으로 발견하였다. 요약하건대, 4x105개 내지 8x105개 세포/㎖의 최종 밀도로 세포를 바이오티닐화된 항원으로 코팅된 스트렙타비딘 비드(New England Biolabs) 및 염소 항-마우스 Fcγ 단편 특이적 FITC 접합체(Jackson)의 1:1200 최종 희석물과 혼합하였다. 1시간 동안 37℃에서 정적 항온처리를 수행한 후, 항원 특이적 B 세포를 둘러싸는 형광 할로의 존재로 인해 이 B 세포를 확인할 수 있었다. 그 다음, 올림푸스 현미경을 이용함으로써 확인된 다수의 이들 개별 B 세포 클론들을 에펜도르프 미세조작기로 선택하고 PCR 튜브 내에 침착시켰다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이적 프라이머를 사용한 역전사(RT)-PCR로 단일 세포로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하였다. 2 라운드의 PCR을 수행하였는데, 이때 네스티드 2o PCR은 3' 말단 및 5' 말단에서 제한 부위를 도입하여, 가변 영역이 마우스 Fab-X 및 마우스 카파(VL) 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝되게 하였다. 이들 벡터들을, 293펙틴(Life Technologies)을 사용하여 HEK-293 세포 내로, 또는 엑스피펙타민(Life Technologies)을 사용하여 Expi293 세포 내로 공동-형질감염시켰고 6일 동안 발현하도록 방치하였다. 상청액을 항원으로 형질감염된 HEK293 세포 및 재조합 단백질 또는 항원 형질감염된 HEK 세포로 코팅된 수퍼아비딘™ 비드(Bangs Laboratories)에 대한 균질 형광-기초 결합 분석에서 시험하였다. 클로닝된 항체의 특이성을 확인하기 위해 이것을 수행하였다.
Fab-X 일과성 상청액 이외에, 무관한 대조군 DNA를 사용하여 동일한 방식으로 음성 대조군 모의 상청액을 제조하였다.
Fab-X의 발현 수준을 단백질 G-HPLC로 측정하였다.
정제된 Fab -Y의 제조 : 실시예 13에 기재된 방법과 동일한 방법을 이용하여 정제된 Fab-Y를 제조하였다.
기능 분석법
3개의 상이한 항체 칵테일들 대신에 1개의 칵테일만이 실시예 12에서 항체 칵테일 A에 대해 기재된 분석 농도 및 항온처리 조건과 동일한 분석 농도 및 항온처리 조건과 함께 사용되었다는 점을 제외하고 실시예 12에 기재된 기능 분석법과 동일한 기능 분석법을 이용하였다.
항체 칵테일 = 1:3 CD20 PerCp-Cy5.5 + 1:5 PLCγ2 AF88 + 1:10 Akt AF647 + 1:5 p38 MAPK PE(FACS 완충제로 희석됨).
결과
도 30 내지 33에서 볼 수 있는 바와 같이, 데이터는 Fab-X에서의 상이한 일과성 발현된 항원 3 마우스 V 영역들과 Fab-Y에서의 2개의 상이한 정제된 항원 2 V 영역들(VR447 및 VR4450)의 조합물이 B 세포 활성화를 상이한 수준까지 억제할 수 있으므로, 스크리닝이 최적 V 영역의 선택을 용이하게 한다는 것을 보여준다. 일과성 Fab-X를 가진 조합물은 정제된 Fab-X(VR4126)를 가진 기준 조합물과 비교된다.
실시예 15 - Fab-Kd-Fab 스크리닝 포맷과 분자적으로 연결된 이중특이적 BYbe 포맷에서 항원 2 플러스 항원 3 공동-표적화의 활성 비교
도입 : Fab-Kd-Fab 이종이량체적으로 테터링된 스크리닝 복합체에서 확인된 표적 쌍 활성이 대안적인 치료 분자적으로 연결된 포맷에서의 유사한 원하는 활성으로 해석될 수 있는지를 확인하기 위해, 항원 2 특이성(VR4447) 및 항원 3 특이성(VR4130)을 BYbe 포맷으로 생성하였다. 이 BYbe 포맷은 항-항원 2 Fab(VR4447)의 중쇄에 융합된 디설파이드 안정화된(ds) 단일 쇄(sc)-Fv로서 항-항원 3 V 영역들(VR4130)로 구성된다 .
방법 :
기능 스크리닝을 위한 BYbe들의 정제를 다음과 같이 수행하였다는 점을 제외하고 실시예 13에 기재된 바와 같다:
기능 스크리닝 BYbe(Fab-dsscFv[Fab 중쇄의 C-말단으로부터 떨어져 있는 scFv]) 포맷을 다음과 같이 정제하였다. 표준 expiHEK 또는 CHO 발현으로부터의 정화된 세포 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였다. 여과된 상청액을 PBS(pH 7.4)(Sigma Aldrich Chemicals)로 평형화된 50 ㎖ 감마바인드플러스 세파로스(GammabindPlus Sepharose) XK26 컬럼(GE Healthcare) 상에 2 ㎖/분의 속도로 적재하였다. 적재 후, 컬럼을 PBS(pH 7.4)로 세척한 후 0.1 M 글리신/HCl(pH 2.7)으로 용출하였다. 용출 후, 280 nm에서 흡광도를 측정하였고, 용출 피크를 수집한 후 25분의 1 부피의 2 M 트리스/HCl(pH 8.5)로 중화시켰다. 10 kDa(BYbes) 분자량 컷 오프 막을 가진 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 4000xg에서 원심분리하여 상기 중화된 샘플을 농축하였다. 농축된 샘플을 PBS(pH 7.4)로 평형화된 XK16/60 또는 XK26/60 수퍼덱스200 컬럼(GE Healthcare)에 적용하였다. 상기 컬럼을 각각 1 ㎖/분 또는 2.6 ㎖/분의 속도로 PBS(pH 7.4)의 등용매 구배로 현상하였다. 분획을 수집하고 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도로 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 선택된 단량체 분획을 풀링하고 10 kDa 분자량 컷 오프 막을 가진 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 4000xg에서 원심분리하여 1 mg/㎖ 초과의 농도까지 농축하였다. 최종 샘플을 농도에 대해서는 A280 스캐닝 UV-가시광선 분광계(Cary 50Bio)로 분석하였고; % 단량체에 대해서는 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도로 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였고; 53분 동안 (겔당) 50 mA에서 4-20% 트리스-글리신 1.5 mm 겔(Novex) 상에서의 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 실시로 분석하였고; 내독소에 대해서는 리뮬러스 아베보사이트 용해물(LAL) 시험 카트리지를 갖춘 찰스 리버의 엔도세이프® 휴대용 시험 시스템으로 분석하였다.
기능 분석법
활성화 마커 분석 : 항원 2 특이적 Fab'-Y 및 항원 3 특이적 Fab'-X를 등몰 농도로 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 항온처리하였다. 조합물을 1:4 연속 희석에서 100 nM의 출발 몰농도부터 적정하였다. 항원 2 및 3 특이적 BYbe도 1:4 연속 희석에서 100 nM의 출발 몰농도부터 적정하였다. V-바닥 96 웰 플레이트에서, 1.5x105개의 PBMC들을 웰에 첨가하였고, 이것에 적정된 Fab'-X 및 Fab'-Y 조합물 또는 적정된 BYbe를 첨가하였다. 그 다음, Fab'-X 및 Fab'-Y 조합물 또는 BYbe를 추가 90분 동안 세포와 함께 항온처리하였다. 이 시간 후, 25 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(Southern Biotechnology)을 첨가함으로써 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 B 세포를 활성화시켰다.
100 ㎕의 빙냉 FACS 완충제(PBS + 1% BSA + 0.1% NaN3 + 2 mM EDTA)를 웰에 첨가하였고, 플레이트를 밀봉하고 대략 15분 동안 젖은 얼음으로 덮은 후, 4℃에서 5분 동안 500xg에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 따라 버리고 플레이트를 30초 동안 2000 rpm에서 진탕하였다.
그 다음, 세포를 형광 표지된 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD71 항체, 항-CD40 항체 및 항-CD86 항체(BD Biosciences)의 칵테일로 염색하였다. 플레이트를 짧게 진탕하고 암실 내의 젖은 얼음 위에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 시간 후, 플레이트를 2회 세척하고 20 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 iQUE® 스크리너 유세포분석기를 이용하여 CD19, CD20, CD71, CD40 및 CD86의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 CD71, CD40 및 CD86 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다.
인유동 분석 : 항원 2 특이적 Fab'-Y 및 항원 3 특이적 Fab'-X를 등몰 농도로 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 항온처리하였다. 조합물을 1:4 연속 희석에서 100 nM의 출발 몰농도부터 적정하였다. 항원 2 및 3 특이적 BYbe도 1:4 연속 희석에서 100 nM의 출발 몰농도부터 적정하였다. V-바닥 96 웰 플레이트에서, 5.0x104개의 PBMC들을 웰에 첨가하였고, 이것에 적정된 Fab'-X 및 Fab'-Y 조합물 또는 적정된 BYbe를 첨가하였다. Fab'-X 및 Fab'-Y 조합물 또는 BYbe를 추가 90분 동안 함께 세포와 함께 항온처리하였다. 이 시간 후, 25 ㎍/㎖의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(Southern Biotechnology)을 첨가함으로써 37℃ 및 5% CO2에서 15분 동안 B 세포를 활성화시켰다. 그 다음, 동등한 부피의 사이토픽스 완충제(BD Biosciences)를 첨가함으로써 신호전달 반응을 중단시켰다. 그 다음, 플레이트를 15분 동안 실온에서 방치한 후, 5분 동안 500xg에서 원심분리하였다. 여분의 상청액을 세포 펠렛으로부터 따라 버리고 이 세포 펠렛을 FACS 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3 + 2 mM EDTA)에 재현탁하고 1회 더 세척하였다. 그 다음, 세포를 30분 동안 빙냉 펌 완충제 III(BD Biosciences)에 재현탁한 후 유동 완충제로 2회 세척하였다.
그 다음, 세포를 형광 표지된 항-CD20 항체(BD Biosciences), 항-인산화된 PLCγ2 항체, 항-인산화된 Akt 항체 및 항-인산화된 p38 항체(BD Biosciences)로 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 재현탁하고 실온의 암실에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이 시간 후, 플레이트를 추가 2회 세척하고 20 ㎕의 FACS 완충제에 재현탁하였다. 인텔리사이트 iQUE® 유세포분석기를 이용하여 CD20, 인-PLCγ2, 인-Akt 및 인-p38의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 팩키지 포어사이트™(Intellicyte)를 이용하여 B 세포가 다른 세포 집단과 상이하다는 것을 확인하였고 각각의 웰에 대해 PLCγ2, Akt 및 p38 수준의 기하 평균을 계산하였다. 그 다음, 모든 데이터들을 최대 반응(항-IgM 단독) 마이너스 배경(세포 단독)의 백분율 억제로서 표현하였다.
결과
인유동 분석 : 도 34의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서 항원 3 및 항원 2의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인산화된 PLCγ2를 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 35의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서 항원 3 및 항원 2의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인산화된 p38을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 36의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서 항원 3 및 항원 2의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포에서 인산화된 Akt를 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
활성화 마커 분석 : 도 37에서 볼 수 있는 바와 같이, 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서 항원 3 및 항원 2의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD71 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 38의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서 항원 3 및 항원 2의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD40 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 39의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷에서 항원 3 및 항원 2의 표적화가 항-IgM으로 자극된 B 세포 상에서의 CD86 발현을 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 16 - 생체내 반감기를 연장시키기 위해 항-알부민 결합 도메인이 추가된, 분자적으로 연결된 이중특이적 Bybe 포맷에서 항원 2 플러스 항원 3 공동-표적화의 활성 비교
도입 : Fab-Kd-Fab 이종이량체적으로 테터링된 스크리닝 복합체에서 확인된 표적 쌍 활성이 항-알부민 표적화된 생체내 반감기 연장을 가진 잠재적 치료 분자적으로 연결된 포맷에서의 유사한 원하는 활성으로 해석될 수 있는지를 확인하기 위해, 항-알부민 항체 단편을 실시예 15에 기재된 BYbe 포맷의 항원 3 Fab의 경쇄에 융합시켰다. 항-알부민 단편(VR0645)이 추가된 Bybe 포맷 및 추가되지 않은 Bybe 포맷에서 항원 2 특이성(VR4447) 및 항원 3 특이성(VR4130 및 VR4126)이 생성되었다.
본 실험에서 사용된 구축물의 설명
Figure 112016120995546-pct00017
방법
기능 스크리닝을 위한 BYbe들의 정제 :
기능 스크리닝 BYbe(Fab-dsscFv[Fab 중쇄의 C-말단으로부터 떨어져 있는 scFv]) 포맷을 다음과 같이 정제하였다. 표준 expiHEK 또는 CHO 발현으로부터의 정화된 세포 배양 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였다. 여과된 상청액을 PBS(pH 7.4)(Sigma Aldrich Chemicals)로 평형화된 50 ㎖ 감마바인드플러스 세파로스 XK26 컬럼(GE Healthcare) 상에 2 ㎖/분의 속도로 적재하였다. 적재 후, 컬럼을 PBS(pH 7.4)로 세척한 후 0.1 M 글리신/HCl(pH 2.7)으로 용출하였다. 용출 후, 280 nm에서 흡광도를 측정하였고, 용출 피크를 수집한 후 25분의 1 부피의 2 M 트리스/HCl(pH 8.5)로 중화시켰다. 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷 오프 막을 가진 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 4000xg에서 원심분리하여 상기 중화된 샘플을 농축하였다. 농축된 샘플을 PBS(pH 7.4)로 평형화된 XK16/60 또는 XK26/60 수퍼덱스 200 컬럼(GE Healthcare)에 적용하였다. 상기 컬럼을 각각 1 ㎖/분 또는 2.6 ㎖/분의 속도로 PBS(pH 7.4)의 등용매 구배로 현상하였다. 분획을 수집하고 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도로 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 선택된 단량체 분획을 풀링하고 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷 오프 막을 가진 아미콘 울트라-15 농축기를 이용하고 스윙 아웃 로터로 4000xg에서 원심분리하여 1 mg/㎖ 초과의 농도까지 농축하였다. 최종 샘플을 농도에 대해서는 A280 스캐닝 UV-가시광선 분광계(Cary 50Bio)로 분석하였고; % 단량체에 대해서는 280 nm에서 흡광도로 검출하면서 1 ㎖/분의 속도로 0.2 M 인산염(pH 7.0)의 등용매 구배로 현상된 TSK 겔 G3000SWXL(5 ㎛, 7.8x300 mm) 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였고; 53분 동안 (겔당) 50 mA에서 4-20% 트리스-글리신 1.5 mm 겔(Novex) 상에서의 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 실시로 분석하였고; 내독소에 대해서는 리뮬러스 아베보사이트 용해물(LAL) 시험 카트리지를 갖춘 찰스 리버의 엔도세이프® 휴대용 시험 시스템으로 분석하였다.
100 nM의 각각의 구축물 정제된 단백질을 RMPI 1640 배지 플러스 10% 태아소 혈청 및 2 mM 글루타맥스(R10 배지)에서 37℃/5% CO2에서 60분 동안 5명의 별도의 기증자들로부터 유래된 인간 PBMC와 함께 예비항온처리하였다. 60분 후, B 세포만을 자극하도록 디자인된 25 ㎍/㎖의 염소 항-IgM 항체를 사용하여 세포를 자극하였다. 24시간 후, 플레이트를 얼음 위에 놓아 임의의 추가 세포 활성화를 중단시킨 후, 빙냉 유세포분석 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)로 1회 세척하였다. 모든 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 재현탁하였다. 세포를 얼음 위에 놓고 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD27 항체, 항-CD71 항체 및 항-CD86 항체의 칵테일을 첨가하였다. 세포를 60분 동안 항온처리한 후, 유세포분석 완충제로 2회 세척하였다. iQUE 고처리율 유세포분석기를 이용하여 항-CD27, 항-CD71 및 항-CD86과 CD19/CD20 양성 B 세포의 결합에 대한 데이터를 생성하였다. 포어사이트 소프트웨어를 이용하여, 항-CD27, 항-CD71 및 항-CD86 항체와 B 세포의 결합에 대한 막대그래프를 생성하고 기하 평균 강도 판독결과를 유도하였다. 이 데이터를 엑셀 내로 불러내고 각각의 조합물에 대해 백분율 억제 값을 생성하였다. 그 다음, 데이터를 그래프패드 프리즘 내로 불러내고 각각의 조합물에 대해 상자 및 세선 차트를 생성하였는데, 이때 평균은 '+'로 표시되어 있다.
도 40은 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된, B 세포 상에서의 CD27 발현의 억제를 보여준다. 시험된 5명의 기증자들에 걸쳐 이들 물질들 둘 다가 항-IgM 유도된 CD27의 일관되게 유사한 억제 수준을 보여주었다. 도 41은 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된, B 세포 상에서의 CD71 발현의 억제를 보여준다. 5명의 기증자들에 걸쳐 이들 물질들 둘 다가 항-IgM 유도된 CD71의 일관되게 유사한 억제 수준을 보여주었다. 도 42는 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된, B 세포 상에서의 CD86 발현의 억제를 보여준다. 5명의 기증자들에 걸쳐 이들 물질들 둘 다가 항-IgM 유도된 CD86의 일관되게 유사한 억제 수준을 보여주었다.
Figure 112016120995546-pct00018
이때, 굵은 글자체의 아미노산들은 임의적이고 이탤릭체의 아미노산들은 연결 서열이다.
Figure 112016120995546-pct00019
Figure 112016120995546-pct00020
SEQUENCE LISTING <110> UCB Pharma <120> New Bispecific Format Suitable for Use in High-Through-Put Screening <130> G0221_WO01 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GCN4(7P14P) sequence <400> 1 Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys 20 25 30 Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His 35 40 <210> 2 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding SEQ ID NO: 1 <400> 2 gctagcggag gcggaagaat gaaacaactt gaacccaagg ttgaagaatt gcttccgaaa 60 aattatcact tggaaaatga ggttgccaga ttaaagaaat tagttggcga acgccatcac 120 catcaccatc ac 132 <210> 3 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 52SR4 ds scFv sequence <400> 3 Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro 130 135 140 Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Leu Leu Thr 145 150 155 160 Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Cys Leu Glu 165 170 175 Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala 180 185 190 Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val 195 200 205 Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr 210 215 220 Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Glu 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gtgagcagcg cggccgccca tcaccatcac catcacgaac agaaactgat tagcgaagaa 780 gatctgtaat ag 792 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLEXIBLE PEPTIDE LINKER <400> 5 Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLEXIBLE PEPTIDE LINKER <400> 6 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLEXIBLE PEPTIDE LINKER <400> 7 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLEXIBLE PEPTIDE LINKER <400> 8 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLEXIBLE PEPTIDE LINKER <400> 9 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu 1 5 10 15 Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr 20 25 30 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLEXIBLE PEPTIDE LINKER <400> 10 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His 1 5 10 15 Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr 20 25 30 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLEXIBLE PEPTIDE LINKER <400> 11 Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 <210> 12 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLEXIBLE PEPTIDE LINKER <400> 12 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp 1 5 10 15 Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala 20 25 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLEXIBLE PEPTIDE LINKER <400> 13 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 14 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 15 Asp Lys Thr His Thr Ser 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 16 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 17 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 18 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 19 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 20 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 20 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 21 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 22 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 15 <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 23 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ser Ala Ser 20 <210> 24 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 24 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25 <210> 25 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 25 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25 30 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 27 Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr 20 25 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 28 Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 29 Ala Thr Thr Thr Gly Ser 1 5 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 30 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 31 Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu 1 5 10 15 Ser His Lys Ser Pro 20 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 32 Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 34 Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 35 Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 36 Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 37 Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 38 Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 39 Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val 1 5 10 15 Arg Pro <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 40 Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu 1 5 10 15 Thr Thr <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 41 Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr 1 5 10 15 Phe Asn <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 42 Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu 1 5 10 15 Pro Ala <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 43 Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile 1 5 10 15 Arg Thr <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 44 Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Phe Gly <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 45 Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu 1 5 10 15 Gly Ala <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 46 Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro 1 5 10 15 Asp Leu <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 47 Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Ser Leu <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 48 Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ser <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 49 Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Pro <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 50 Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe 1 5 10 15 Pro Pro <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 51 Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro 1 5 10 15 Pro Tyr <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 52 Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr 1 5 10 15 Pro <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 53 Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn 1 5 10 15 Leu Arg <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 54 Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr 1 5 10 15 Phe Pro <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 55 Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 56 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 57 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp 1 5 10 15 <210> 58 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 58 Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Glu Asp Asp Glu 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 59 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val 20 <210> 60 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 60 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val Lys 20 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 61 Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 62 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 63 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 64 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp 1 5 10 15 <210> 65 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 65 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 66 Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys 1 5 10 15 Pro Leu Arg Gly 20 <210> 67 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 67 Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu 1 5 10 15 Arg Ser Glu Gln 20 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 68 Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met 1 5 10 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence <400> 69 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 70 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence <400> 70 Pro Pro Pro Pro 1 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 71 Ala Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 72 Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5

Claims (38)

  1. 식 A-X:Y-B를 갖는 이중특이적 단백질 복합체로서,
    상기 식에서
    A-X는 제1 융합 단백질이고;
    Y-B는 제2 융합 단백질이며;
    X:Y는 이종이량체성(heterodimeric)-테터(tether)이고;
    :은 X와 Y 사이의 결합 상호작용이며;
    A는 Fab 또는 Fab' 단편으로부터 선택된 이중특이적 단백질 복합체의 제1 단백질 성분이고;
    B는 Fab 또는 Fab' 단편으로부터 선택된 이중특이적 단백질 복합체의 제2 단백질 성분이며;
    X는 scFv 또는 펩티드로부터 독립적으로 선택되고, 단, X가 펩티드인 경우 Y는 scFv이며, X가 scFv인 경우 Y는 펩티드이고;
    X 또는 Y는 펩티드 GCN4(서열번호 1, 또는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 38)에 대해 특이적인 scFv이며; scFv는 52SR4(서열번호 3, 또는 서열번호 3의 아미노산 1 내지 243)이고, X 또는 Y는 펩티드 GCN4(서열번호 1, 또는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 38)인 이중특이적 단백질 복합체.
  2. 제1항에 있어서, A는 Fab 단편이고/이거나; B는 Fab 단편인 이중특이적 단백질 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X 및/또는 Y는 Fab 또는 Fab' 단편 내의 중쇄의 C-말단에 융합되어 있는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, X 및/또는 Y는 Fab 또는 Fab' 단편 내의 중쇄의 C-말단에 링커를 통해 융합되어 있는 것인 이중특이적 단백질 복합체.
  5. 제1항 또는 제2항에 기재된 하나 이상의 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 조성물.
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