KR102471982B1

KR102471982B1 - 3d 바이오프린팅용 나노셀룰로오스, 3d 바이오프린팅용 나노셀룰로오스의 제조방법 및 그 활용

Info

Publication number: KR102471982B1
Application number: KR1020210068965A
Authority: KR
Inventors: 노상철; 정진호
Original assignee: 주식회사 에이엔폴리
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-11-30
Also published as: KR20210147970A

Abstract

본 발명은, 3차원 바이오 프린팅을 위한 나노셀룰로오스 조성물, 이의 제조방법 및 이의 활용 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 3차원 바이오 프린팅 기술을 이용한 나노셀룰로오스 기반의 코스메슈티컬용 기능성 바이오입자를 제공할 수 있다.

Description

3D 바이오프린팅용 나노셀룰로오스, 3D 바이오프린팅용 나노셀룰로오스의 제조방법 및 그 활용{nano-cellulose materials for 3d bioprinting, Method for preparing nano-cellulose and applications thereof}

본 발명은, 3D 바이오프린팅용 나노셀룰로오스 조성물, 3D 바이오프린팅용 나노셀룰로오스 조성물의 제조방법 및 그 활용에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 상피 세포 성장 인자(EGF), 저점도 나노셀룰로오스 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 3차원 바이오프린팅용 나노셀룰로오스 조성물, 그 제조방법 및 이의 활용을 제공한다.

최근 가습기 살균제, 정수기 중금속 사건, 화장품 유해물질, 생리대 발암물질 등 우리의 생활과 밀접한 제품에 대한 안전성 및 유해성 문제가 크게 대두되고 있으며, 이에 국내외로 더욱 안전한 제품에 대한 소비자 요구 및 정부 관련 정책이 급증하고 있다.

특히 화장품 조성물로 광범위하게 사용되고 있던 미세플라스틱(마이크로비즈)이 환경오염을 일으키고 인체에 유해성을 일으킬 수 있다는 점 때문에 한국의 경우 2017년 7월, 미국은 2018년부터 미세플라스틱이 포함된 화장품 제조뿐 아니라 화장품의 판매도 전면 금지함. 이러한 추세는 점차 세계적으로 확대되고 있다.

더욱이, 한국 2017년 7월, 미국 2018년 부터 미세플라스틱이 포함된 화장품 제조뿐 아니라 화장품의 판매도 전면 금지하고, 국내외적으로 보다 안전한 제품에 대한 소비자 요구 증가, 국내외 관련 정책 강화로 인하여 더욱 안전하고 우수한 친환경 제품 및 소재에 대한 시장 요구가 증가하고 있다.

각 화장품 관련 기업들은 미세플라스틱을 포함하여 합성화합물을 대체할 수 있는 소재 발굴에 힘쓰고 있으나 원료의 공급, 기능성, 활용성의 한계로 활용이 제한되고, 생물학적안전성이 뛰어나며, 동시에 기능적으로도 우수한 제품에 대한 선호 급증하고 이로 인하여 안전하고 기능적으로 우수하며 활용성이 높은 코스메슈티컬(cosmeceutical)용 기능성 소재 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.

본 발명은 상기 언급한 문제점을 해결하기 위해서, 3D 바이오프린팅이 가능한 독성이 없고 생물학적으로 안전한 3D 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, EGF등 기능성 물질, 약물 등을 균일하고 정밀하게 담지할 수 있는 기능성 물질이 담지된 나노셀룰로오스 조성물 기반의 바이오입자 및 이의 3D 바이오프린팅에 의한 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은, 저점도 나노셀룰로오스에 기능성 물질을 담지하지 않은 종래 기술에 비하여 활성이 오랜 기간 유지되는 안정화 기술을 제공하고, 이의 용도로 물질담지, 세포배양, 줄기세포 배양, 오가노이드 및 인공장기 배양을 위한 바이오잉크 소재로 확대할 수 있다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 분야 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 측면은, 상피 세포 성장인자(Epidermal Growth Factor; EGF), 저점도 나노셀룰로오스 및 비이온성 계면활성제를 포함하고, 상기 저점도 나노셀룰로오스는, 1 cp 이상 10 cp 이하인, 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물을 제공한다.

일 실시형태에 따르면, 상기 세포 성장인자는, 전체 나노셀룰로오스 조성물 대비 0.005 % 내지 0.015 % 농도를 가지며, 상기 나노셀룰로오스는, 전체 나노셀룰로오스 조성물 대비 1.51 % 내지 1.55 %의 농도를 갖는 나노셀룰로오스피브릴(CNF)인 것일 수 있다.

일 실시형태에 따르면, 상기 나노셀룰로오스 조성물은, 30 μm 내지 90 μm 의 지름을 갖는 비드를 포함할 수 있다.

일 실시형태에 따르면, 상기 나노셀룰로오스 조성물은, 1개의 비드당 10 ppm 내지 20 ppm 의 상피 세포 성장인자를 포함할 수 있다.

일 실시형태에 따르면, 상기 나노셀룰로오스는, 셀룰로오스 표면의 수산화기가 카르복시기로 표면 개질된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 저점도 나노셀룰로오스 제조 단계; 상기 저점도 나노셀룰로오스와 상피 세포 성장 인자(EGF) 용액의 혼합 단계; 및 혼합용액의 3차원 바이오 프린팅용 잉크젯 노즐 토출 단계; 를 포함하는, 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물 제조 방법을 제공한다.

일 실시형태에 따르면, 상기 저점도 나노셀룰로오스 제조 단계는. 나노셀룰로오스 현탁액의 준비 단계; 그라인더 또는 고압균질기를 이용한 나노결정화 단계; 및 초음파 처리로 수행되는 나노셀룰로오스의 점도 제어 단계;를 더 포함할 수 있다.

일 실시형태에 따르면, 상기 나노셀룰로오스는, 전체 나노셀룰로오스 조성물 대비 1.51 % 내지 1.55%의 농도일 수 있다.

일 실시형태에 따르면, 상기 나노결정화된 나노셀룰로오스의 사이즈는, 2.5 nm 내지 7.0 nm 일 수 있다.

일 실시형태에 따르면, 상기 저점도 나노셀룰로오스는, 나노셀룰로오스 1g 당 1.0 mmol 내지 2.5 mmol의 카르복시기를 포함할 수 있다.

일 실시형태에 따르면, 상기 저점도 나노셀룰로오스와 상피 세포 성장 인자(EGF) 용액의 혼합 단계는, 1.0 % 내지 2.5 % 농도의 저점도 나노셀룰로오스와 0.01 % 내지 0.05 % 농도의 상피 세포 성장 인자 용액을 2.5~1.5: 1의 혼합비로 혼합하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 전술한 본 발명의 일 측면에 따른 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물에 기능성 물질이 담지된, 바이오 입자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 전술한 본 발명의 일 측면에 따른 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물을 3차원 바이오 프린터에 충전하는 단계; 및 목적하는 조직 유사기관을 3차원 프린팅하는 단계;를 포함하는 오가노이드 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 전술한 본 발명의 일 측면에 따른 오가노이드 제조방법에 따라 제조된 오가노이드를 제공한다.

본 발명은, 생체적합성을 가지면서 3D 바이오프린팅이 가능한 바이오잉크 소재로 저점도 나노셀룰로오스를 제조하고, 여기에 3D 바이오프린팅 기술을 이용한 기능성 물질(예를 들어, EGF, 비타민, 약물, 미생물, 약물전달소재 등)을 담지할 수 있다

본 발명은, 생체적합성을 가지는 나노셀룰로오스를 제조하고, 기존 나노셀룰로오스는 바이오프린팅이 잘되지 않는데 이를 가능하게 하도록 각각 조건을 잡고, 점도를 낮추는 기술이며, 이를 바이오잉크로 3D 바이오프린팅 조건을 잡아서 일정하고 균일하게 EGF가 담지된 나노셀룰로오스 기반의 바이오입자를 제조한 것입니다.

도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 제조방법의 공정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 실시예 1에 따라 액적의 속도와 크기를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 실시예 2에 따라 비드 크기를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 실시예 3에 따라 세포 안정성 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 실시에 4에 따라 EGF 담지용량 분석 결과를나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 실시예 5에 따라 저점도 나노셀룰로오스를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 실시예 6에 따라 나노셀룰로오스 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 실시예 7에 따라 나노셀룰로오스 수용액의 농도별 유변학적 특성 분석(나노셀룰로오스 수용액의 농도별 동적 전단점도)을 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 실시예 8에 따라 나노셀룰로오스 잉크의 프린팅 적합성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 실시예 10에 따라 잉크젯 프린팅 변수에 따른 마이크로 입자의 크기 및 단분산도 평가를 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 실시예 11에 따라 제형 제어 단분산 나노셀룰로오스 바이오파티클 분산용액 제작 및 물리적 특성 평가를 나타낸 것이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.

명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은, 천연 유래 원료 및 기능성 물질을 포함하고 3차원 바이오프린터용 소재로 활용할 수 있는 나노셀룰로오스 조성물에 관한 것이고, 본 발명은, 고품질/고수율 바이오잉크용 나노셀룰로오스 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 3차원 바이오 프린팅 기술을 이용한 나노셀룰로오스 기반의 고밀도의 균일한 물질 담지 및 바이오파티클 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명은, 3차원 바이오 잉크젯 프린팅용 나노셀룰로오스를 개발하고, EGF를 나노셀룰로오스 매트릭스 내에 담지 할 수 있는 3차원 바이오 프린팅 기술을 제공하고, 상기 기술을 이용하여 피부재생 물질 중 한가지인 EGF가 균일하게 담지된 코스메슈티컬용 기능성 바이오입자를 제공할 수 있다.

본 발명은, 생물학적 안전성(세포독성, 피부자극시험 등)이 우수하면서, 바이오 잉크로 사용이 가능한 물성을 지닌 3차원 바이오 잉크젯 프린팅용 나노셀룰로오스 제조할 수 있고, 3차원 바이오 프린팅을 이용한 기능성 물질 담지 기술 및 정밀제어(크기, 조성, 함량)할 수 있다. 또한, 기능성 코스메슈티컬용로 활용할 수 있고, 기능성 코스메슈티컬용 소재의 제조기술을 제공할 수 있다.

본 발명은, 점도를 제어하는 방법으로 초음파 세척뿐만 아니라 pH 제어, 온도 제어 등 기타 방법으로 점도 조정이 가능할 수 있다.

본 발명에 의한 기술과 소재의 활용 범위는 물질 담지뿐 아니라 오가노이드, 인공장기, 줄기세포 배양, 3D 세포 배양 등으로 확대할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물은, 상피 세포 성장 인자(EGF), 저점도 나노 셀룰로오스 및 비이온성 계면활성제를 포함한다.

상기 상피 세포 성장 인자는, 본 발명의 실시예에 따른 조성물을 이용한 오가노이드, 조직 배양 등에서 인체 조직 기관과의 유기 결합성 및 생체적합성을 개선시킬 수 있으며, 나노셀룰로오스의 점도 제어를 통하여, 어떤 조건에서도 원하는 형태로 용이하게 바이오 프린팅할 수 있다.

이하 본 발명의 실시예에서 보다 상세하게 설명되며, 이는 본 발명의 구체적 이해에 도움을 주기위한 것이며 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예: 3차원 바이오 프린팅을 위한 저점도 나노셀룰로오스 제조를 위한 산화 반응조건 확립

<실험 방법>

셀룰로오스 300 g, NaClO 4 mmol/g cellulose, NaBr 0.02g/g cellulose, TEMPO 0.1 g/g cellulose를 증류수 20 L에 넣은 후 30℃에서 각각 4, 6, 8시간 반응하였다. NaClO 농도를 8 mmol/g cellulose로 변경 후 동일 조건으로 반응하고, 6개의 실험군을 각각 스톤 (grinding stone) 간격 - 60 um로 4회 grinding 처리하여 나노셀룰로오스 하이드로겔을 제조하였다.

제조한 나노셀룰로오스를 Deep freezer에서 24시간 보관한 후, 얼린 실험군을 3일 동안 동결건조하여 파우더를 확보하였다. Electric conductivity titration method로 표면개질 정도 (Carboxylate contents, C.C)를 측정하고, 그 결과는 표 1과 같다.

<반응 시간에 따른 표면개질 정도 비교>

NaClO 농도	표면개질률 (Carboxylate contents, mmol/g cellulose)
NaClO 농도	4 hr	6 hr	8 hr
4 mmol/g cellulose	1.2	1.4	1.4
8 mmol/g cellulose	1.8	2.0	2.1

NaClO의 농도가 낮을 때 (4 mmol/g cellulose) 반응 시간이 증가하여도 C.C 값이 크게 증가하지 않는 거동을 보였으며, 반대로 NaClO의 농도가 높을 때는 (8 mmol/g cellulose) 짧은 반응 시간에도 높은 C.C 값을 보임. 1.5 mmol/g cellulose 이상의 C.C 값을 확보하기 위해서는 최소 4 mmol/g cellulose 이상의 NaClO를 첨가해야 함을 의미한다.

반응 시간 (hr)	표면개질률 (Carboxylate contents, mmol/g cellulose)
반응 시간 (hr)	4 mmol/g cellulose	6 mmol/g cellulose	8 mmol/g cellulose
4 hr	1.0	1.8	1.9

NaClO 농도에 따른 표면개질 정도 비교

반응 시간을 4시간으로 고정한 후, 다양한 농도의 NaClO로 반응을 수행한 결과, 6 mmol/g cellulose 이상에서 만족할 만한 carboxylate contents 값이 나오는 것을 확인하였다.

실시예 1: EGF-CNF Bead Inkjet Printing

<실험 방법>

0.03%의 human EGF solution을 2.3% CNF와 1:2 비율로 섞어 최종 농도가 0.01% EGF를 함유한 1.53% CNF 잉크를 제조하였다. 80-μm 직경의 잉크젯 노즐로 프린팅하였다. Rise time, dwell time, fall time, voltage, frequency를 포함하는 프린팅 조건들을 조절하여 토출되는 droplet의 속도, 모양 및 크기를 최적화하였다. 프린팅 시스템에 포함된 drop analysis 기능을 통해 토출되는 액적의 속도와 크기를 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

<실험 결과>

0.01% EGF 담지한 1.53% CNF ink가 single droplet으로 잘 jetting됨을 확인하였다.

부피 100 pL 및 지름 60 μm 이내에 들어오는 droplet 형성 가능한 프린팅 조건을 찾았다.

실시예 2: Bead Size Control

<실험 방법>

0.03%의 human EGF solution을 2.3% CNF와 1:2 비율로 섞어 최종 농도가 0.01% EGF를 함유한 1.53% CNF 잉크를 제조하였다. 1% Pluronic F-127이 함유된 2% CaCl₂ 수조에 EGF-CNF를 inkjet printing하여 100 pL 부피의 bead를 형성하였다. 광학현미경으로 bead 사진을 획득하여 bead 크기를 확인하였다. 5개 독립적인 샘플 당 bead 120개의 size를 채택하였다. 그 결과 도 3에 나타내었다.

<실험 결과>

5개 독립적인 샘플에 대한 bead size를 광학현미경으로 측정하고, 60 μm 이내 크기로 bead가 형성됨을 확인하였다.

실시예 3: Cell Compatibility

<실험 방법>

0.03%의 human EGF solution을 2.3% CNF와 1:2 비율로 섞어 최종 농도가 0.01% EGF를 함유한 1.53% CNF 잉크를 제조하였다. 1% Pluronic F-127이 함유된 2% CaCl₂ 수조에 EGF-CNF를 inkjet printing하여 100 pL 부피의 bead를 형성하였다. Bead를 모아 세포 배양 multiwell plate에 첨가하여 5일 간 배양하면서 격일 단위로 CCK-8 colorimetric assay kit을 통해 세포 증식률과 세포 독성을 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

<실험 결과>

5개 독립적인 샘플에 대한 human dermal fibroblast의 증식률 비교하였다. Bead 상태로 EGF 담지한 샘플이 5일째에 높은 증식률을 보였다. 5일째까지 constant한 EGF release가 이루어져서 그런 것으로 예측하였다.

생체적합성(생물학적안전성)과 프린팅 성능은 공인시험성적서를 통해서 확인할 수 있다. 세포 독성 실험(ISO 10993-5)에서 음성, (88.9 ± 2.0) %결과를 확인하였다.

피부자극시험 (1차 피부자극시험 : 피부첩포시험, IS-MBIQ-001)에서 2% 나노셀룰로오스에 대하여 PCPC Guideline에 의거 인체 피부 일차자극시험 수행하여 30명에 대한 일차자극시험 결과 저자극 (평균 반응도 : 0.00)를 확인하였다.

실시에 4: EGF Quantification

<실험 방법>

0.045%의 human EGF solution을 2.3% CNF와 1:2 비율로 섞어 최종 농도가 0.015% EGF를 함유한 1.53% CNF 잉크를 제조하였다. 1% Pluronic F-127이 함유된 2% CaCl₂ 수조에 EGF-CNF를 inkjet printing하여 100 pL 부피의 bead를 형성하였다.

한 샘플 당 100 pL droplet을 100,000개씩 프린팅하여 독립적인 5개 샘플을 준비하였다. 프린팅된 100,000개의 bead를 microtube pestle로 homogenize한 후 검출가능 농도 범위로 희석하여 quantitative ELISA assay를 진행하였다. Colorimetric assay의 결과값으로 샘플이 함유하고 있던 EGF의 양을 확인하였다. 도 5에 나타내었다.

<실험 결과>

5개 독립적인 샘플에 대한 human EGF 정량화 실험하였다. Inkjet printing으로 제조한 100pL 부피의 개별 bead 당 15pg 상당(14.996 pg)의 EGF를 함유하고 있는 것을 quantitative ELISA assay를 통해 확인하였다. 이는 한 개의 bead 당 15 ppm 이상의 EGF를 함유하고 있음을 의미한다.

실시예 5: 저점도 나노셀룰로오스의 제어

도 6a에 나타낸 바와 같이, 제조한 3% 나노셀룰로오스 하이드로겔을 증류수로 희석하여 각각 0.5, 0.8%의 나노셀룰로오스 희석액으로 제조한 후 초음파 처리 전, 후에 대한 점도 변화(Visco QC300, Anton Paar, 측정 조건 : Din adapter 적용, 25℃, 150 rpm에서 10회 반복 측정)를 측정하였다. Ultrasonication(진동수 : 20 kHz, 10분)을 이용한 저점도 CNF 제조 (15cp → 8cp 로 감소)하였고, 1% CNF hydrogel의 경우 25cp → 8cp 로 감소하였다(도 6b).

나노셀룰로오스의 점도를 낮추기위하여 Ultrasonication method를 적용하고, 처리 전후의 점도를 비교한 결과 25cp에서 8cp로 감소하였으며, 이는 프린팅 가능 점도인 20cp 이하를 만족할 수 있다.

실시예 6: 균일한 직경을 가지는 나노셀룰로오스 제조

(1) 실험 조건

처리 시료 : 6 mmol/g cellulose NaClO에서 4시간 반응한 셀룰로오스 현탁액

(2) 실험 방법

그라인더(Grinder)를 이용한 나노결정화하고, 고압균질기(High Pressure Homogenizer)를 이용한 나노결정화하였다.

① 적용 압력 : ~20,000 PSI

② 처리 횟수 : 4 pass

각 조건에 따라 제조한 나노셀룰로오스의 크기 및 형태는 TEM (Transmission Electron Microscope)를 이용하여 관찰하였다.

Grinding method 및 High-pressure homogenizing method(HPH) 비교하여 도 7a에 나타내었다. 반응 시간에 따른 HPH method를 이용하여 제조한 나노셀룰로오스 크기 변화를 도 7b에 나타내었다.

즉, 다른 나노피브릴화 방법으로 나노셀룰로오스를 제조한 결과, high-pressure homogenizer를 이용하여 제조한 CNF의 직경이 보다 균일하였으며, 반응시간이 증가할 수록 CNF의 직경이 감소하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 7: 나노셀룰로오스 수용액의 농도별 유변학적 특성 분석

도 8에 나타낸 바와 같이, CNF의 농도가 높을 경우 한계 점도보다 높아 액적 형태로 토출되지 않고, 개발한 저점도 CNF의 경우 1% 고농도에서도 프린팅 가능한 전단점도를 형성할 수 있다.

측정한 동적 전단점도 값을 기준으로 초기 제작한 나노셀룰로오스 수용액의 경우, 0.5% 이하 농도에서만 잉크젯 젯팅이 가능할 것으로 예측하였으며, 실제 프린팅 적용 시 그 이상의 농도에서는 젯팅이 불가능함을 확인함. 이러한 문제를 해결하기 위하여 초음파 처리한 나노셀룰로오스를 제조하여 프린팅 가능성을 확인하였다. 붉은색 그래프에서 볼 수 있듯이 초음파 처리한 새로운 나노셀룰로오스 수용액의 경우 1%의 농도에서도 20 mPa·s 이내의 프린팅 가능한 전단점도를 형성하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 8: 나노셀룰로오스 잉크의 프린팅 적합성 평가

3D 바이오 잉크젯 프린터는 수십 마이크로 직경의 노즐을 사용하여 피코리터(10^-12L) 단위의 잉크를 토출하기 때문에 프린팅 조건을 최적화하여 직진성을 가지는 잉크의 토출 환경을 찾는 것이 매우 중요하고, 토출량, 토출 속도, 토출 획수 등의 다양한 토출 환경에 따른 직진성 시험 수행하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.

토출량, 토출 속도, 토출 횟수 등 다양한 토출 환경에 따른 직진성 시험 수행하였 단일 액적 상태로 노출되는 CNF 잉크의 최적 프린팅 조건 확립하였다.

실시예 9: 잉크젯-수조 기반의 바이오파티클 제조 공정 개발

양이온성 counter ion을 이용하여 이온 결합을 형성시켜 가교(cross-linking) 유도하고, 바이오파티클 형성이 더 빠르고 안정적으로 진행되도록 Pluronic F-127 (PE-127)을 첨가하였다. 이는 액적의 형태를 유지할 수 있도록 보조하는 역할을 제공하였다.

본 연구를 통해 제조한 나노셀룰로오스는 셀룰로오스 표면 (cellulose surface)의 OH기를 COO- 로 개질하여 음전하 (negative charge)를 부가하였기 때문에 양이온성 counter ion을 이용하여 이온결합을 형성시켜 가교할 수 있음. 이를 위하여 독성이 없고 친환경적인 공정으로 CaCl₂ 수용액을 수조로 선택하였으며, 잉크젯 프린팅으로 토출되는 나노셀룰로오스 액적이 수조와 만나면서 이온결합을 이뤄 하이드로겔 바이오파티클을 형성하도록 한다.

바이오파티클 형성이 더 빠르고 안정적으로 진행될 수 있도록 CaCl₂ 수용액에 Pluronic F-127 (PE-127)을 첨가함. PF-127은 FDA 승인을 받은 생체친화적인 비이온성 계면활성제로 나노셀룰로오스 액적이 CaCl₂ 수조에 담지가 되어 이온결합을 통한 경화가 일어나기까지 액적의 형태를 유지할 수 있도록 보조하는 역할을 한다.

CaCl₂ 농도와 PF-127 첨가 여부를 변화하면서 바이오파티클 형성을 위한 최적 공정 조건을 확립함. CaCl₂ 단독으로 존재하는 경우, 2~4% CaCl₂ 농도에서는 경화 속도가 느려 하이드로겔화 되기 전에 수조 용액과 섞여 액적 형태가 아닌 풀어진 형태로 경화되는 현상을 확인하였다.

8% CaCl₂의 경우, 수조에서 흩어지지 않고 경화가 일어나지만, 잉크젯에서 토출된 액적이 수조 용액에 완전히 담지 되기도 전에 수조의 표면에서부터 경화가 빠르게 일어나, 지름이 매우 크고 납작한 형태의 바이오파티클을 형성하는 것을 확인함. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 저농도의 CaCl₂ 수용액에 부가적으로 PF-127을 첨가하여 경화가 일어날 때까지 안정적으로 비드 모양의 액적을 유지할 수 있도록 하였다.

실시예 10: 잉크젯 프린팅 변수에 따른 마이크로 입자의 크기 및 단분산도 평가

도 10에 나타낸 바와 같이, Applied voltage를 unipolar 70V, rise time 5us, dwell time 10us, fall time 5us로 최적화하여 100pL 부피에 해당하는 액적을 토출하였다.

실시예 11: 제형 제어 단분산 나노셀룰로오스 바이오파티클 분산용액 제작 및 물리적 특성 평가

바이오 잉크젯 프린팅 조건 및 수조 환경 최적화를 통해 20~60um 범위의 크기를 가지는 나노셀룰로오스 바이오파티클 분산 용액 제조하였고, 잉크젯 프린터의 스테이지 이동 경로 설정을 통한 액적과 액적 사이의 간격 조절하여 뭉침 현상 해결하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 바이오파티클 뭉침 및 손상이 없는 나노셀룰로오스 바이오파티클 분산용액 제조 기술 확보하고, 50um 내외의 균일한 크기와 형태를 가지는 바이오파티클 제조하였다.

실시예 12: 바이오파티클 크기 측정 및 균일성 평가

각 시료에 대해 측정된 바이오파티클 직경 데이터를 무작위로 각각 120개씩 추출하여 평균 직경과 균일도 계산하였고, 평균 직경 50um 내외, 균일도 ±5% 내외로 균일한 바이오파티클을 제조하였다.

실시예 13: 수분보유력 비교시험

본 연구를 통해 최적 조건으로 제조한 나노셀룰로오스에 EGF가 담지된 바이오파티클(1 wt% CNF with EGF)에 대하여 수분 보유력 시험을 하였다.

빈 비이커의 무게를 정확하게 측정하고, EGF가 담지된 1% 나노셀룰로오스 수용액 40g을 100mL 비이커 5개에 각각 담아 시료 준비하고, 대조군으로 아무것도 첨가하지 않은 3차 증류수 40g을 별도의 비이커에 담아 준비하였다.

대조군을 포함하여 모든 시료의 무게를 정확하게 측정하여 기록한 후, 미리 70℃로 온도가 맞춰진 건조 오븐에 넣고, 30분 간격으로 무게를 측정하고, 아래의 식에 따라 수분증발률(%)을 계산하였다.

<수분 증발률 계산 공식>

즉, 대조군 대비 70% 이내의 증발률을 보였으며, 2시간 경과 후에는 81.67%의 증발률을 보여, 목표 성능지표인 대조군 대비 90% 이하를 만족하였다.

본 발명은, 상기 천연유래 물질 기반의 높은 생체적합성 및 생물학적 안전성을 제공하고, 나노셀룰로오스의 높은 보습력과 캡슐화를 통한 우수한 안정성 및 보존성을 나타낼 수 있다. 3차원 바이오 프린팅을 고밀도 물질 담지하고, 3차원 바이오 프린팅을 통한 재현성, 균일성 확보할 수 있고, 예를 들어, 코스메슈티컬용 소재로서 다양한 기능성 부여 가능 및 기능성 물질로 EGF 담지에 활용할 수 있다.

본 발명의 나노셀룰로오스 소재는, 화장품 및 의료용 소재로의 활용이 가능한 수준의 생물학적 안전성을 지닌다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

Claims

3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물로서,
상피 세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF), 저점도 나노셀룰로오스 및 비이온성 계면활성제를 포함하고, 상기 저점도 나노셀룰로오스는, 1 cp 이상 10cp 이하이며,
상기 저점도 나노셀룰로오스는 나노결정화된 것으로 2.5 nm 내지 7.0 nm의 사이즈를 갖는 것이고,
상기 저점도 나노셀룰로오스는 셀룰로오스 표면의 수산화기가 카르복시기로 표면 개질된 것이며,
상기 상피 세포 성장인자는, 전체 나노셀룰로오스 조성물 대비 0.005 중량% 내지 0.015 중량% 농도를 가지며,
상기 저점도 나노셀룰로오스는, 전체 나노셀룰로오스 조성물 대비 1.51 중량% 내지 1.55 중량% 의 농도를 갖는 나노셀룰로오스피브릴(CNF)인 것이고,
상기 나노셀룰로오스 조성물은, 비드를 포함하며 1개의 비드당 10 ppm 내지 20 ppm 의 상피 세포 성장 인자를 포함하는 것인,
3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 비드는 30 μm 내지 90 μm 의 지름을 갖는 것인, 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물.
삭제
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저점도 나노셀룰로오스 제조 단계;
상기 저점도 나노셀룰로오스와 상피 세포 성장인자(EGF) 용액의 혼합 단계; 및
혼합용액의 3차원 바이오 프린팅용 잉크젯 노즐 토출 단계;를 포함하는 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물 제조 방법으로서,
상기 저점도 나노셀룰로오스 제조 단계는,
나노셀룰로오스 현탁액의 준비 단계; 그라인더 또는 고압균질기를 이용한 나노결정화 단계; 및 초음파 처리로 수행되는 나노셀룰로오스의 점도 제어 단계;를 포함하고,
상기 나노결정화된 나노셀룰로오스의 사이즈는, 2.5 nm 내지 7.0 nm 이고,
상기 저점도 나노셀룰로오스는, 셀룰로오스 표면의 수산화기가 카르복시기로 표면 개질된 것이며,
상기 상피 세포 성장인자는, 전체 나노셀룰로오스 조성물 대비 0.005 중량% 내지 0.015 중량% 농도를 가지고,
상기 저점도 나노셀룰로오스는, 전체 나노셀룰로오스 조성물 대비 1.51 중량% 내지 1.55 중량% 의 농도를 갖는 나노셀룰로오스피브릴(CNF)인 것이며,
상기 나노셀룰로오스 조성물은, 비드를 포함하며 1개의 비드당 10 ppm 내지 20 ppm 의 상피 세포 성장 인자를 포함하는 것인,
3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물 제조 방법.
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제6항에 있어서,
상기 저점도 나노셀룰로오스는, 나노셀룰로오스 1g 당 1.0 mmol 내지 2.5 mmol의 카르복시기를 포함하는, 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물 제조 방법.
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제6항에 따라 제조한 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물에 기능성 물질이 담지된, 바이오 입자.
제6항에 따라 제조한 3차원 바이오 프린팅용 나노셀룰로오스 조성물을 3차원 바이오 프린터에 충전하는 단계; 및
목적하는 조직 유사기관을 3차원 프린팅하는 단계; 를 포함하는, 오가노이드(organoid) 제조 방법.
제13항의 방법에 따라 제조된 오가노이드(organoid).