KR102461502B1 - 치료제가 봉입된 우유 엑소좀을 포함하는 경구형 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents
치료제가 봉입된 우유 엑소좀을 포함하는 경구형 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 치료제가 봉입된 우유 엑소좀을 포함하는 경구형 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 명세서는 치료제가 봉입된 우유 엑소좀을 포함하는 경구형 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
세포외소포체(extracellular vesicles)는 세포에서 분비되는 수 nm에서 수 ㎛에 이르는 미세한 크기의 입자를 지칭하며, 종래에는 이러한 세포외소포체가 세포에서 분비되는 찌꺼기로 여겨졌으나, 최근에는 세포외소포체들이 임상학적으로 의미있게 여겨지며, 다양한 연구가 진행되고 있다. 세포외소포체는 미세소포체라고 지칭된다. 미세소포체는 혈장, 소변, 모유, 양수 등 넓은 범위에서 존재하며, 생체 내에서 중요한 기능을 가 지고 있다. 특히, 기능성 단백질, RNA 및 항원을 포함하는 세포외 미세소포체는 세포내의 소통의 새로운 방식으로 사용된다. 세포외소포체는 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있는 것으로 알려지고 있으며, 엑소좀은 기본적으로 세포로부터 유래한 것이기 때문에 다른 나노입자와는 달리 생체 친화적이고, 내부나 표면에 약물이나 생물학적 활성성분을 담지하거나 표지할 수 있다는 점 때문에 약물 전달체나 화장품이나 의약품의 원료 물질로 사용하고자 하는 시도가 지속적으로 이루어지고 있다.
하지만, 비경제적인 생산성 (고비용, 저수율), 효율적인 치료제 담지 기술의 부재 등으로 개발에 어려움을 겪고 있으며, 세포외소포체의 투여경로를 다양화하기 어렵고, 특히 경구 투여할 경우 물질의 안정성과 안전성을 확보할 수 없다는 점이 개발의 허들로 지적된다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 최적의 방법을 통해 우유 엑소좀을 분리하고 상기 우유 엑소좀의 내부에 치료제를 봉입한 조성물에 대한 연구를 하여, 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 우유 엑소좀; 및 우유 엑소좀 내부에 봉입된 치료제를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 경구형 제형인, 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 조성물을 약학 조성물로 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 조성물을 약학 조성물 중 특히 백신 조성물로 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 조성물을 건강기능식품 조성물로 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물의 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면은 우유 엑소좀; 및 우유 엑소좀 내부에 봉입된 치료제;를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 경구형 제형인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 치료제는 전기천공법(Electroporation)으로 우유 엑소좀 내로 봉입되며, 상기 전기천공법은 300 내지 700 v의 전압,및 7 내지 13의 펄스의 조건에서 봉입되는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 치료제는 항체, 호르몬, 대사조절 효소, 면역조절 효소, 인터페론, 인터루킨, 성장 조절 효소 및 백신 중에서 선택된 어느 하나인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 치료제는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, iRNA, siRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA 중에서 선택된 어느 하나 이상의 핵산인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 치료제는 펩타이드 또는 단백질인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 동결 건조한 제형인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 우유 엑소좀은 직경이 30 nm 내지 300 nm 이며, 상기 치료제는 siRNA 또는 mRNA 이며; 상기 조성물은 백신용 조성물이며, 상기 조성물은 대상에게 경구로 투여되는 것인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제조 방법에 있어서, (a) 우유로부터 원심분리 및 여과를 통해 우유 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (b) 분리된 우유 엑소좀에 치료제를 전기천공법으로 봉입하는 단계;를 포함하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (b) 단계에서 전기천공법은 300 내지 700 v의 전압, 및 7 내지 13의 펄스의 조건에서 치료제를 우유 엑소좀 내로 봉입하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (a) 단계에서의 우유는 인간, 소, 양, 염소, 산양, 낙타, 버팔로 및 야크 유래 우유인, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (a) 단계에서의 우유는 초유(colostrum)인, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (a) 단계는 1 내지 8 ℃에서, 2000 내지 130,000 g의 힘으로 10분 내지 7시간 동안 원심분리하며, 포어 사이즈가 0.01 um 내지 1 um 인 여과막을 통하여 여과하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (a) 단계는 2 내지 6 ℃에서, 초유의 우유를 2000 내지 4000 g의 힘으로 15분 내지 45분 동안 원심분리하는 제 1 원심분리 단계; 제 1 원심분리 단계 이후 10,000 내지 14,000 g의 힘으로 30분 내지 90분 동안 원심분리하는 제 2 원심분리 단계; 제 2 원심분리 단계 이후 30,000 내지 40,000 g의 힘으로 30분 내지 90분 동안 원심분리하는 제 3 원심분리 단계; 제 3 원심분리 단계 이후 60,000 내지 80,000 g의 힘으로 150분 내지 210분 동안 원심분리하는 제 4 원심분리 단계; 제 4 원심분리 단계 이후 포어 사이즈가 0.7 um 내지 0.9 um 인 여과막을 통하여 여과하는 제 1 여과 단계; 제 1 여과 단계 이후 포어 사이즈가 0.4 um 내지 0.5 um 인 여과막을 통하여 여과하는 제 2 여과 단계; 제 2 여과 단계 이후 포어 사이즈가 0.1 um 내지 0.3 um 인 여과막을 통하여 여과하는 제 3 여과 단계; 및 제 3 여과 단계 이후 90,000 내지 120,000 g의 힘으로 30 분 내지 90 분 동안 원심분리하는 제 5 원심분리 단계;를 포함하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계 이후 치료제가 봉입된 우유 엑소좀 조성물을 동결 건조 하는 단계를 추가로 포함하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 치료제는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, iRNA, siRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA 중에서 선택된 어느 하나 이상의 핵산인, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 치료제는 펩타이드 또는 단백질인, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 다른 측면에 따라 제조된 조성물은 pH 변화에 따라 안정적인 엑소좀 사이즈 변화를 유지한다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 다른 측면에 따라 제조된 조성물은 장기 보관시에도 안정적인 사이즈를 유지한다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 다른 측면에 따라 제조된 조성물은 우유 엑소좀의 반복적인 동결 및 해동 후에도 안정적인 입자 크기 및 모양을 유지 한다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 다른 측면에 따라 제조된 조성물은 경구형 제형으로 투여가능하다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 다른 측면에 따라 제조된 조성물은 경구형 제형으로 투여하는 경우 생체 이용률이 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 다른 측면에 따라 제조된 조성물은 우유 엑소좀의 특성을 변화시키지 않고 안정적으로 목적하는 치료제를 엑소좀에 투여하기 때문에 치료 효능이 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 다른 측면에 따라 제조된 조성물은 경구 투여시에 치료제의 표적 세포로의 전달 효율이 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 다른 측면에 따라 제조된 조성물은 우유 엑소좀을 포함하며, 우유 엑소좀은 생체 외 세포로부터 추출하는 엑소좀에 비해 그 수율이 매우 높고, 현저히 저렴한 제조단가를 가진다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물 또는 본 발명의 다른 측면에 따라 제조된 조성물은 우유 엑소좀을 포함하며, 우유 엑소좀은 세포 엑소좀에 비해 면역 거부 반응 등 부작용이 거의 없어 높은 안전성을 가진다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본원발명 실시예 1의 우유 엑소좀의 분리 방법이다.
도 2는 본원발명 실시예 2-1의 결과이다.
도 3은 본원발명 실시예 2-2의 결과이며, 도 3a는 FBS 엑소좀, 도 3b는 실시예 1의 엑소좀이다.
도 4는 본원발명 실시예 2-3에서, 동결 해동 안정성을 투과전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5는 본원발명 실시예 2-3에서, 동결 해동 안정성을 동적 산란 분석을 통해 입도 분포를 분석한 결과이다.
도 6는 본원발명 실시예 2-3에서, 동결/해동 시의 결과이다.
도 7은 본원발명 실시예 3에서 경구 투여 후 시간별 혈액 채취 결과이다.
도 8은 본원발명 실시예 3에서 경구 투여 후 FMT 결과이다.
도 9은 본원발명 실시예 3에서 경구 투여 후 소장 적출 후 공초점 현미경으로 Cy5.5 레이블링된 우유 유래 엑소좀을 확인한 결과이다.
도 10은 본원발명 실시예 4에서 전기천공을 도입할 경우의 최적의 조건을 확인한 결과이다.
도 11은 본원발명 실시예 4에서 siRNA 봉입된 엑소좀이 유전자 침묵 효과가 일어나는지를 확인한 결과이다.
도 2는 본원발명 실시예 2-1의 결과이다.
도 3은 본원발명 실시예 2-2의 결과이며, 도 3a는 FBS 엑소좀, 도 3b는 실시예 1의 엑소좀이다.
도 4는 본원발명 실시예 2-3에서, 동결 해동 안정성을 투과전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5는 본원발명 실시예 2-3에서, 동결 해동 안정성을 동적 산란 분석을 통해 입도 분포를 분석한 결과이다.
도 6는 본원발명 실시예 2-3에서, 동결/해동 시의 결과이다.
도 7은 본원발명 실시예 3에서 경구 투여 후 시간별 혈액 채취 결과이다.
도 8은 본원발명 실시예 3에서 경구 투여 후 FMT 결과이다.
도 9은 본원발명 실시예 3에서 경구 투여 후 소장 적출 후 공초점 현미경으로 Cy5.5 레이블링된 우유 유래 엑소좀을 확인한 결과이다.
도 10은 본원발명 실시예 4에서 전기천공을 도입할 경우의 최적의 조건을 확인한 결과이다.
도 11은 본원발명 실시예 4에서 siRNA 봉입된 엑소좀이 유전자 침묵 효과가 일어나는지를 확인한 결과이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 우유로부터 분리된 엑소좀에 백신 및 치료제가 될 수 있는 단백질, 핵산과 같은 치료제 혹은 물질을 봉입함으로서 생체 내 다양한 환경 및 면역 반응을 피해 높은 효율로 안전하고 용이하게 전달할 수 있는 경구 투여형 약물 전달체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.
본 발명의 일측면은 우유 엑소좀; 및 우유 엑소좀 내부에 봉입된 치료제;를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 경구형 제형인, 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "엑소좀(exosome)"은 많은 어쩌면 혈액, 소변, 및 세포배양의 배양배지를 포함하는 모든 생물학적 액체에 존재할지 모르는 세포-유래의 소포(vesicle)로 세포외 소포(extracellular vesicle) 또는 소수포(microvesicle)라고도 불리운다. 엑소좀은 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비된다.
"엑소좀" 이라고 하는 용어는 "미세소포" , "리포좀" , "엑소좀형 입자" , "엑소좀형 소포" , "나노 벡터" , "아키솜(archeosome)" , "락토솜(lactosome)" , "세포 외 소포(extracellular vesicle)", "아르고솜(argosome)", "아포토시스 소체(apoptotic body)" 및 "엑소좀형 소포(exosome-like vesicle)"으로 불릴 수 있다.
일구현예에서, 본원발명의 엑소좀은 20 nm 내지 500 nm의 직경이다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 30 nm 내지 190 nm 또는 25 nm 내지 180 nm의 크기이다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 30 nm 내지 170 nm의 크기이다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 40 nm 내지 160 nm의 크기이다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 50 nm 내지 150nm 또는 60 nm 내지 140 nm, 70 nm 내지 130 nm, 80 nm 내지 120 nm 또는 90nm 내지 110 nm의 직경이다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 약 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 50 nm, 75 nm, 100 nm, 110 nm, 125 nm 또는 150 nm의 직경이다. 일부 실시예에서는 우유에서 단리 또는 유도된 엑소좀 조성물 또는 복수의 엑소좀 중의 평균 엑소좀 크기는 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 약 50 nm, 약 75 nm, 약 100 nm, 약 110 nm, 약 125 nm 또는 약 150 nm;또는 20 nm 내지 200 nm, 25 nm 내지 250 nm, 30 nm 내지 180 nm, 40 nm 내지 170 nm, 50 nm 내지 160 nm, 50 nm 내지 150 nm, 60 nm 내지 140 nm, 70 nm 내지 130 nm, 80 nm 내지 120 nm 또는 90 nm 내지 110 nm의 평균 직경이다.
본 명세서에서 "우유(milk)"는 영양을 아이에게 제공하기 위해 성숙한 포유동물의 유선에 의해 생산되는 단백질, 지방, 락토스 및 비타민 및 미네랄을 함유하는 불투명한 액체이다. 일구현예에서는 "우유"는 초유를 추가로 포함한다. 초유(colostrum)는 분만 직후, 즉 분만 후 4 내지 5일 까지 포유동물의 유선에 의해 분비되는 액체로서, 항체 및 미네랄이 풍부한 액체이다.
"우유 유래" 또는 "초유 유래"가 우유 또는 초유 유래의 엑소좀으로 사용될 경우, 이는 상기 유래 환경에서 단리되었거나 또는 다른 방법으로 조작된 엑소좀이며, 따라서, 천연의 산물이 아닌 엑소좀 혹은 미세소포를 가리킨다. 이것에 관해 "우유 유래 엑소좀" 및 "초유 유래 엑소좀"이라고 하는 용어는 본 명세서에서는 우유 또는 초유에서 단리 혹은 분리된 엑소좀에 관해 각각 "우유 엑소좀" 또는 "초유 엑소좀"이라고 하는 어구와 호환적으로 사용된다. 또한 일부 실시예에서는 "우유 유래"라고 하는 용어는 본원발명의 일부 구현예를 설명하기 위해 "우유에서 단리되었다" 또는 "우유에서 분리되었다"라고 하는 용어와 호환적으로 사용된다.
일부 실시예에서는 본 발명은 치료제를 봉입한 엑소좀을 제공한다. 본 명세서에서 사용될 경우, "치료제를 봉입한 엑소좀"에 관한 "봉입했다"라고 하는 용어는 엑소좀의 내측에 봉입된;엑소좀의 지질막과 회합한 또는 그 안에 부분적으로 포매(embedding)된(즉 엑소좀의 내부 내측에 부분적으로 돌출된);지질막 및 관련 성분의 외측 부분과 회합 또는 결합한(즉 엑소좀의 외측에 부분적으로 돌출되었거나 또는 완전하게 외측에 있다);또는 엑소좀의 지질막 내에 전체적으로 배치된(즉 지질막 내에 전체적으로 포함된다) 하나 또는 그것을 초과하는 치료제를 가지는 엑소좀을 가리킨다. 따라서, 일부 실시예에서는 치료제는 엑소좀의 내측에 봉입되어 있다. 일부 실시예에서는 치료제는 엑소좀의 지질막과 회합하고 있거나 또는 그 안에 부분적으로 포매되어 있다(즉 엑소좀의 내부 내측에 부분적으로 돌출되어 있다). 일부 실시예에서는 치료제는 지질막의 외측 부분과 회합 또는 결합되어 있다(즉 엑소좀의 외측에 부분적으로 돌출되어 있다). 일부 실시예에서는 치료제는 엑소좀의 지질막 내에 전체적으로 배치되어 있다(즉 지질막 내에 전체적으로 포함된다). 일부 실시예에서는 엑소좀은 단일 치료제가 부하되어 있다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 2개의(또는 그것을 초과한다) 다른 치료제가 봉입되어 있다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 2개 또는 그것을 초과하는 분자 또는 복사의 단일 치료제 또는 2개의(또는 그것을 초과한다) 다른 치료제가 봉입되어 있다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 3개 또는 그것을 초과하는 분자 또는 복사의 단일 치료제 또는 2개의(또는 그것을 초과한다) 다른 치료제가 봉입되어 있다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 2~5개의 분자 또는 복사의 단일 치료제 또는 2개의(또는 그것을 초과한다) 다른 치료제가 봉입되어 있다. 일부 실시예에서는 엑소좀 또는 그 의약 조성물은 1 내지 4,000개, 10 내지 4,000개, 50 내지 3,500개, 100 내지 3,000개, 200 내지 2,500개, 300 내지 1,500개, 500 내지 1,200개, 750 내지 1,000개, 1 내지 2,000개, 1 내지 1,000개, 1 내지 500개, 10 내지 400개, 50 내지 300개, 1 내지 250개, 1 내지 100개, 2 내지 50개, 2 내지 25개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 3 내지 50개, 3 내지 25개, 3 내지 25개, 3 내지 10개, 4 내지 50개, 4 내지 25개, 4 내지 15개, 4 내지 10개, 5 내지 50개, 5 내지 25개, 5 내지 15개 또는 5 내지 10개의 분자 또는 복사의 단일 치료제 또는 2개의(또는 그것을 초과한다) 다른 치료제가 봉입되어 있다.
일부 실시예에서는 엑소좀은 미세소포, 리포좀, 엑소좀, 엑소좀형 입자 또는 소포, 유지방구 피막, 나노 벡터, 아키오솜, 락토좀, 세포외소포, 아르고솜, 아포토시스 소체, 엑소좀형 소포, 미립자에서 선택된다. 일부 실시예에서는 엑소좀은 우유 유래 엑소좀이다. 일부 실시예에서는 우유 유래 엑소좀은 소, 인간, 버팔로, 염소, 양, 낙타, 로바, 말, 순록, 무스 또는 야크 유래의 우유 또는 초유에서 유래한다(예를 들면 단리, 분리 또는 조작된다). 일부 실시예에서는 우유는 소에서 유래한다.
다양한 치료제는 본 발명에 의한 미세소포 내로의 봉입에 적합하다. 일부 실시예에서는 치료제는 생물 제제이다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 iRNA, siRNA, miRNA, mRNA, ncRNA 또는 다른 올리고뉴클레오타이드 치료제에서 선택된다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 호르몬(예를 들면 어느 조직에 의해 생산되고 혈류에 의해 다른 조직에 운반되어 생리학적 활성, 예를 들면 성장 또는 대사를 일으키는 성장 호르몬, 부갑상선 호르몬 또는 인슐린 또는 다른 물질, 예를 들면 펩타이드 또는 스테로이드);인터페론(예를 들면 바이러스 감염 및 기타 자극에 응답해 세포에 의해 통상 생산되는 단백질);인터류킨(예를 들면 사이토카인 단백질, 예를 들면 다른 면역 세포의 분열 및 분화의 유도에 관여하는 것 등;성장 인자(예를 들면 비타민 B12 등의 물질 또는 성장, 예를 들면 세포 성장을 촉진하는 인터류킨);단일 클론 항체(mAb);폴리펩타이드, 예를 들면 10개 또는 그것을 초과하는 50개 미만의 아미노산을 함유하는 펩타이드;단백질, 예를 들면 50개 또는 그것을 초과하는 아미노산을 함유하는 단백질, 또는 약 10 kD 내지 약 30 kD, 또는 약 30 kD 내지 약 150또는 약 300 kD의 질량을 가지는 단백질;백신;진단제;항혈전 용해제;독소;또는 항독소에서 선택된다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 치료제는 전기천공법(Electroporation)으로 우유 엑소좀 내로 봉입되며, 상기 전기천공법은 300 내지 700 v의 전압,및 7 내지 13의 펄스의 조건에서 봉입되는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 치료제는 항체, 호르몬, 대사조절 효소, 면역조절 효소, 인터페론, 인터루킨, 성장 조절 효소 및 백신 중에서 선택된 어느 하나인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 치료제는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, iRNA, siRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA 중에서 선택된 어느 하나 이상의 핵산인, 조성물을 제공한다.
마이크로 RNA(miRNA) 일부 실시예에서는 치료제는 miRNA이다. 당업자에 의해 인식되도록, miRNA는 이들의 생물학적으로 활성한 형태로 약17 내지 약 25 뉴클레오타이드 염기(nt) 길이의 저분자 비코드 RNA이다. 일부 실시예에서는 miRNA는 17 내지 25nt 길이이다. miRNA는 표적 mRNA 번역을 감소시킴으로써 전사 후적으로 유전자 발현을 조절한다. miRNA는 음의 조절 인자로서 기능한다고 생각된다. 일반적으로 3개 형태 miRNA가 있는:일차 miRNA(프리 miRNA), 미성숙 miRNA(프레 miRNA) 및 성숙 miRNA. 일차 miRNA는 약수백 염기 내지 1 kb 초과의 스템 루프 구조 전사 산물로서 발현된다. 프리 miRNA 전사 산물은 Drosha에 의해 핵 내에서 절단된다. Drosha는 서로 차이의 절단으로 RNA 이중 사슬을 절단해, 5'인산 및 3'말단의 2 nt의 오버행이 남는다. 절단 산물인 미성숙 miRNA(프레 miRNA)는 약60 내지 약 110 nt 길이이며 접혀 헤어핀 구조가 형성된다. 프레 miRNA는 Ran-GTP 및 에크스포틴 5에 의해 핵에서 세포질로 수송된다. 프레 miRNA는 Dicer 라고 칭해지는 다른 RNaseII 엔도뉴클레아제에 의해 세포질 내에서 추가로 프로세싱된다. Dicer는 5'인산 및 3'오버행을 인식하고 스템-루프 접합부에서 루프를 절단하고, miRNA 이중 사슬을 형성한다. miRNA 이중 사슬은 RNA 유도성 사이렌싱 복합체(RISC)에 결합하고 안티센스 가닥이 우선적으로 분해되고 센스 가닥 성숙 miRNA가 RISC를 그 표적 부위로 유도한다. 그것은 , 약17 내지 약 25 nt 길이의 생물학적으로 활성한 형태의 miRNA인 성숙 miRNA이다. 일부 실시예에서는 본 개시 주제의 미세소포에 의해 봉입되는 miRNA는 miR-155(이것은 T세포 및 B세포 성숙 및 선천성 면역 반응의 조절 인자로서 작용하는 것이 공지이거나) 또는 miR-223(이것은 호중구 증식 및 활성화의 조절 인자로서 공지이다)에서 선택된다.
저분자 간섭 RNA(siRNA) 일부 실시예에서는 치료제는 siRNA이다. 저분자 간섭 RNA 또는 사이렌싱 RNA라고도 하는 소분자 간섭 RNA(siRNA)는(miRNA와 같은 길이의)20~25염기 대 길이의 이중가닥 RNA 분자의 클래스이다. siRNA는 일반적으로 RNA 간섭(RNAi) 경로를 통해 이들의 생물학적 효과를 발휘한다. siRNA는 일반적으로 리보뉴클레아제 Dicer에 의한보다 긴 사슬 전구체 RNA의 효소적 개열에 의해 생산되는 2 뉴클레오타이드의 오버행을 가진다. siRNA는 RNA 간섭(RNAi) 경로를 통한 파괴를 위해 이들의 RNA를 타겟팅함으로써 특정 유전자 발현을 제한할 수 있다. 그것은, 전사 후에 mRNA를 분해하고 번역을 방해함으로써 상보적 뉴클레오티드 배열을 가지는 특정 유전자 발현을 방해한다. siRNA는 또한 RNAi 관련 경로에 있어서 항바이러스 기구로서 작용할 수 있거나, 또는 게놈의 크로마틴 구조의 형성에 있어서 역할을 할 수 있다.
치료제는 또한 mRNA, 안티센스 RNA, 또는 본 명세서에 기재되는 다른 핵산 및 이들의 유사체에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 치료제는 펩타이드 또는 단백질인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 동결 건조한 제형인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 조성물을 제공한다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 의미한다. 담체의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 검, 알긴산 염, 젤라틴, 인산칼슘, 규산 칼슘, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 생리 식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항-응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 우유 엑소좀은 직경이 30 nm 내지 300 nm 이며, 상기 치료제는 siRNA 또는 mRNA 이며; 상기 조성물은 백신용 조성물이며, 상기 조성물은 대상에게 경구로 투여되는 것인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물인, 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 통상적인 방법에 따라 임의의 제형으로 제조될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어 경구 투여형(예: 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 환제 및 과립으로 제제화될 수 있다. 상기 조성물은 또한 전신 투여제형 또는 국소 제형으로 제제화될 수 있다. 유효물질의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약물 형태, 투여 경로 및 투여 간격에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택 될 수있다. 이러한 투여량은 예를 들어 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 또는 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 1 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 투여는 하루에 한 번, 하루에 여러 번, 일주일에 한 번, 2 주에 한 번, 3 주에 한 번, 4 주에 한 번 또는 일 년에 한 번 수행될 수 있다.
일부 실시예에서는 생물 제제는 질환 또는 상태, 예를 들면 폐, 눈, 간 또는 바이러스성 질환 또는 상태의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 국제공개 제2009/073809호, 국제공개 제2006/020768호 또는 국제공개 제2006/078278호에 개시되어 있는 iRNA 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에서 선택된다.
일부 실시예에서는 생물 제제는 고콜레스테롤 혈증 또는 고지혈증의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 국제공개 제2012/058693호, 국제공개 제2011/038031호, 국제공개 제2011/028938호, 국제공개 제2010/148013호, 국제공개 제2011/053994호, 국제공개 제2007/134161호, 국제공개 제2009/134487호, 국제공개 제2015/123264호, 국제공개 제2011/029016호, 국제공개 제2009/129465호 또는 국제공개 제2009/111658호에 개시되어 있는 iRNA 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에서 선택된다.
일부 실시예에서는 생물 제제는 의약품으로서 및 소정의 유전자 발현을 저해하기 위한 방법에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 국제공개 제2000/044895호에 개시되어 있는 iRNA 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에서 선택된다.
일부 실시예에서는 생물 제제는 C형 간염 바이러스(HCV) 감염증의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 미국 특허 제 8,273,868호에 개시되어 있는 iRNA 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에서 선택된다.
일부 실시예에서는 생물 제제는 B형 간염 바이러스(HBV), HCV 또는 D형 간염 바이러스(HDV) 감염증의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 예를 들면 적어도 2개의 다른 RNA 폴리머라제 III 프로모터를 포함한 수식 HBV 타겟팅 올리고뉴클레오타이드 또는 발현 구축물이며 각 프로모터는 RNA 이펙터 분자를 코딩하는 핵산 서열로 작동 가능하게 연결되었다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 피험체에 있어서의 유전자의 발현을 검출하는 방법 또는 과민증 반응을 경감시키는 방법에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 표적 배열과 상동한 배열을 포함한 부분 이중가닥 RNA 분자이다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 완전 이중가닥 RNA이다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 미국 특허 제 9,352,048호, 미국 특허출원공개 제2015/0119445호, 미국 특허 제 8,350,021호, 유럽 특허출원공개 제 1833967호, 유럽 특허출원공개 제 2316942호, 미국 특허출원공개 제2012/0028348호, 미국 특허 제 7,985,581호, 유럽 특허출원공개 제 2169072호, 유럽 특허출원공개 제 1784492호, 미국 특허출원공개 제2016/0122759호, 유럽 특허출원공개 제 2994167호, 국제공개 제2014/182661호, 미국 특허출원공개 제2014/0275211호, 유럽 특허출원공개 제 2723865호, 국제공개 제2012/177906호, 유럽 특허출원공개 제 1171586호, 유럽 특허출원공개 제 1171586호, 유럽 특허출원공개 제 1597351호, 유럽 특허출원공개 제 1597351호, 국제공개 제2016/077321호 또는 국제공개 제2016/077349호에 개시되어 있는 iRNA 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에서 선택된다.
일부 실시예에서는 생물 제제는 단일가닥 RNA 바이러스, 예를 들면 HCV의 복제 모듈레이트에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 이중가닥 RNA 매개성 유전자 사이렌싱(RNAi)을 통해 바이러스 복제를 모듈레이트하기 위한 방법 및 조성물에 유용하고 항바이러스 방법 및 조성물은 단일가닥 RNA 바이러스의 역쇄복제 중간체를 우선적으로 타겟팅한다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 이중가닥(ds) RNA 이펙터 분자 및 하나 또는 그것을 초과하는 이펙터 상보체를 포함한다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 피험체의 조직에 있어서의 유전자의 활성에 대해 분석하기 위한 방법 및 RNAi 컴퍼턴트(competent) 시스템의 선택 dsRNA 이펙터 분자에 의한 표적 뉴클레오티드 서열의 dsRNA 매개성 사이렌싱 또는 저해를 평가하기 위한 방법에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 미국 특허 제 9,198,927호, 미국 특허출원공개 제2010/0267805호, 유럽 특허출원공개 제 2325314호, 유럽 특허출원공개 제 1797185호, 유럽 특허출원공개 제 2772541호, 미국 특허출원공개 제2015/0315593호, 미국 특허 제 8,987,227호, 미국 특허 제 8,614,198호, 미국 특허출원공개 제2014/0141512호, 미국 특허출원공개 제2010/0324117호, 유럽 특허출원공개 제 2173900호, 미국 특허출원공개 제2012/0028348호, 미국 특허 제 7,985,581호, 유럽 특허출원공개 제 2169072호, 유럽 특허출원공개 제 1784492호, 미국 특허출원공개 제2016/0122759호, 유럽 특허출원공개 제 2994167호, 국제공개 제2014/182661호, 미국 특허출원공개 제2014/0275211호, 유럽 특허출원공개 제 2723865호, 국제공개 제2012/177906호, 미국 특허출원공개 제2012/0046478호, 유럽 특허출원공개 제 2068886호, 국제공개 제2008/042973호, 유럽 특허출원공개 제 1597351호 또는 유럽 특허출원공개 제 1597351호에 개시되어 있는 iRNA 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에서 선택된다.
일부 실시예에서는 생물 제제는 안드로겐 수용체 매개성 질환의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 특정 실시예에서는 안드로겐 수용체 매개성 질환은 케네디병이며 피험체는 케네디병과 관련된 안드로겐 수용체(AR) 유전자의 돌연변이, 예를 들면 CAG 트리뉴클레오타이드 반복의 확대를 가진다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 AR에 타겟팅되는 안티센스 화합물이다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 키네신(kinsesin) 형 1을 타겟팅한다. 일부 실시예에서는 질환은 암 또는 과잉 증식성 장애, 예를 들면 전립선암 (예를 들면 거세 저항성 전립선암 ) 또는 유방암, 난소암, 위암 및 방광암이다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 동물의 핵 내 지지 RNA(nrRNA) 또는 피루브산 키나제 M전사 산물의 발현을 감소시키거나, 또는 동물의 핵 내 지지 RNA 또는 피루브산 키나제 M전사 산물과 관련된 질환 또는 장애의 증후 처치, 개선, 지연 또는 경감에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 전이 관련폐선암전사 산물-1(MALAT-1) RNA 및/또는 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 실시예에서는 MALAT-1 발현의 감소는 암 , 예를 들면 결장암 , 장 암 , 폐암(예를 들면 비소세포 폐암), 간암 및/또는 전립선암을 치료한다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 유럽 특허출원공개 제 2991661호, 유럽 특허출원공개 제 2906225호, 유럽 특허출원공개 제 2906226호, 유럽 특허출원공개 제 2794880호, 유럽 특허출원공개 제 2253706호, 국제공개 제2016/061263호 또는 유럽 특허출원공개 제 2595664호에 개시되어 있는 iRNA, 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에서 선택된다.
일부 실시예에서는 생물 제제는 염증성 질환, 심혈관 질환 또는 대사성 질환, 장애 또는 상태의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 예시적인 질환, 장애 및 상태로서는 후레드리크손 I형 지질 이상증, FCS 및 LPLD;및 췌장염, 심혈관 질환 및 대사장애를 들 수 있다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 후레드리크손 I형 지질 이상증, FCS 또는 LPLD를 가지는 환자의 HDL 레벨을 증가시키고 및/또는 TG 대 HDL의 비율을 개선하고 혈장 지질 및 혈장 포도당을 감소시킨다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 아폴리포 단백질 CIII(ApoCIII)를 감소시켜 ApoCIII와 관련된 질환, 장애 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선한다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 아폴리포 단백질 B(ApoB) 또는 AGPAT5를 타겟팅한다. 일부 실시예에서는 아폴리포 단백질 B(ApoB)를 타겟팅하는 생물 제제로서는 미포메르센 및 ApoB를 타겟팅하는 다른 안티센스 화합물을 들 수 있다. 예시적인 생물 제제로서는 결합체 올리고머 화합물, 예를 들면 고친화성 뉴클레오타이드 수식을 포함한 짧은 안티센스 화합물, 또는 다른 iRNA 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체, 예를 들면 유럽 특허출원공개 제 2015758호, 유럽 특허출원공개 제 2458006호, 유럽 특허출원공개 제 2991656호, 유럽 특허출원공개 제 2956176호, 유럽 특허출원공개 제 2701713호, 유럽 특허출원공개 제 2521556호, 유럽 특허출원공개 제 2408796호 또는 국제공개 제2016/077704호에 개시되어 있는 것을 들 수 있다.
일부 실시예에서는 생물 제제는 열충격단백질과 관련된 질환 및 상태의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 당뇨병, 비만증, 대사증후군 X, 고혈당증 또는 고지혈증의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 (i) 동물의 혈중 포도당 레벨의 감소, (ii) 글루코코르티코이드 수용체와 관련된 질환 또는 상태를 가지는 동물의 처치, (iii) 동물에 있어서의 혈중 지질 레벨의 감소, 또는 (iv) 동물에 있어서의 체지방량의 감소에 유용하다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 글루코코르티코이드 수용체의 발현을 모듈레이트한다. 일부 실시예에서는 생물 제제는 유럽 특허출원공개 제 2363480호 또는 국제공개 제2016/077837호에 개시되어 있는 iRNA 또는 올리고뉴클레오타이드 또는 그 유사체에서 선택된다. 일부 실시예에서는 질환 또는 상태는 uORF 함유 유전자, 예를 들면 국제공개 제2016/077837호의 표 1 및 2에 개시되어 있는 것에 관련된다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인, 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제조 방법에 있어서, (a) 우유로부터 원심분리 및 여과를 통해 우유 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (b) 분리된 우유 엑소좀에 치료제를 전기천공법으로 봉입하는 단계;를 포함하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (b) 단계에서 전기천공법은 300 내지 700 v의 전압, 및 7 내지 13의 펄스의 조건에서 치료제를 우유 엑소좀 내로 봉입하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (a) 단계에서의 우유는 인간, 소, 양, 염소, 산양, 낙타, 버팔로 및 야크 유래 우유인, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (a) 단계에서의 우유는 초유(colostrum)인, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (a) 단계는 1 내지 8 ℃에서, 2000 내지 130,000 g의 힘으로 10분 내지 7시간 동안 원심분리하며, 포어 사이즈가 0.01 um 내지 1 um 인 여과막을 통하여 여과하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (a) 단계는 2 내지 6 ℃에서, 초유의 우유를 2000 내지 4000 g의 힘으로 15분 내지 45분 동안 원심분리하는 제 1 원심분리 단계; 제 1 원심분리 단계 이후 10,000 내지 14,000 g의 힘으로 30분 내지 90분 동안 원심분리하는 제 2 원심분리 단계; 제 2 원심분리 단계 이후 30,000 내지 40,000 g의 힘으로 30분 내지 90분 동안 원심분리하는 제 3 원심분리 단계; 제 3 원심분리 단계 이후 60,000 내지 80,000 g의 힘으로 150분 내지 210분 동안 원심분리하는 제 4 원심분리 단계; 제 4 원심분리 단계 이후 포어 사이즈가 0.7 um 내지 0.9 um 인 여과막을 통하여 여과하는 제 1 여과 단계; 제 1 여과 단계 이후 포어 사이즈가 0.4 um 내지 0.5 um 인 여과막을 통하여 여과하는 제 2 여과 단계; 제 2 여과 단계 이후 포어 사이즈가 0.1 um 내지 0.3 um 인 여과막을 통하여 여과하는 제 3 여과 단계; 및 제 3 여과 단계 이후 90,000 내지 120,000 g의 힘으로 30 분 내지 90 분 동안 원심분리하는 제 5 원심분리 단계;를 포함하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계 이후 치료제가 봉입된 우유 엑소좀 조성물을 동결 건조 하는 단계를 추가로 포함하는, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 치료제는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, iRNA, siRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA 중에서 선택된 어느 하나 이상의 핵산인, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 치료제는 펩타이드 또는 단백질인, 조성물의 제조 방법을 제공한다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 밀크 엑소좀의 분리
본 발명자들은 하기와 같은 방법으로 우유로부터 엑소좀을 분리하였다.
시중에 판매되는 저온 살균 유통 우유를 3,000 g에서 30분간 원심분리한 후, 12,000 g에서 1시간, 35,000 g에서 1시간 그리고 70,000 g에서 3시간 순차 초원심분리를 수행하였다.
그런 다음 0.8 μm 필터로 1차 여과를 하고, 0.45 μm 필터로 2차 여과를 한 후, 0.2 μm 필터로 3차 여과를 하였다. 여과액을 100,000 g로 1시간 동안 초원심분리를 한 후 펠렛을 회수하여 단백질 분해효소 억제제(Roche)를 포함하는 PBS에 재현탁하였다(도 1).
상기 과정은 4℃ 에서 수행되었다.
비교예로는 일반 동물세포(마우스 골수 유래 대식 세포) 유래 엑소좀을 사용하였다.
상기 우유로부터 분리된 엑소좀은 비교예와 같은 BCA 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 이용하여 분리된 엑소좀의 단백질 농도를 측정하였다.
실시예 2. 밀크 엑소좀의 특성
실시예 2-1. 엑소좀의 입자 크기 비교
본 발명자들은 이어서 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 엑조솜의 입도를 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석 장치(Malvern zetasizer nano ZS, UK)을 이용하여 분석하는 한편, 투과 전자현미경으로 생성된 엑소좀을 촬영하였다(도 2).
도 2에서 C-Ex는 비교예 엑소좀, Milk-Ex는 실시예 1의 우유 엑소좀이다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 우유 유래 엑소좀은 대조군 엑소좀과 유사하게 그 크기가 68.05 nm 내외의 상당히 좁은 스펙트럼을 갖고 있는 것으로 나타났고, 형태 역시 대조군 엑소좀과 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다.
실시예 2-2. 엑소좀의 pH 변화에 따른 안정성 확인
본 발명자들은 우유 유래 엑소좀의 pH 변화에 따른 안정성을 확인하기 위해, 대조군인 FBS 유래 엑소좀과 우유 유래 엑소좀을 pH7 중성상태에서 pH2 산성 상태로 변화 시켰고, 다시 pH7중성 상태로 변화 시킨 후, 각 엑소좀의 입도를 동적 광산란 분석 장치를 이용하여 확인하였다.
FBS(Fetal bovine serum) 유래 엑소좀은 세포 배양에 사용 되는 소태아 혈청으로부터 분리한 엑소좀이다.
실험 결과는 도 3a 및 3b와 같았다. 도 3a는 FBS 엑소좀, 도 3b는 본원발명 실시예 1의 엑소좀이다.
FBS 유래 엑소좀의 사이즈는 우유 유래 엑소좀에 비해 넓은 범위로 분포하며 그 형태 및 사이즈가 변화하였으나 우유 유래 엑소좀은 사이즈 변동 없이 유지 됨을 확인하였다.
실시예 2-3. 엑소좀의 동결 해동 안정성 분석
본 발명자들은 실시예 1에 의해 분리된 우유 유래 엑소좀과 대조군 엑소좀인 대식 세포 유래 엑소좀과의 보관 안정성 특히 동결 후 해동시 안정성 항목을 평가하고자 하였다.
이를 위해 대조군 엑소좀과 실시예 1에서 분리된 우유 유래 엑소좀을 -85℃에서 동결시킨 후 상온에서 해동한 후 투과 전자 현미경 촬영을 하였고, 해동된 엑소좀을 다시 -85℃에서 2차 동결한 후 상온에서 해동시킨 후 투과 전자현미경을 촬영을 하였고(도 4), 동적 산란 분석을 통해 입도분포를 분석하였다(도 5).
그 결과, 도 5에서 확인되는 바와 같이, 대조군 엑소좀은 1차 동결후 해동시 이미 엑소좀 간의 응집현상이 발생하여 원래의 엑소좀 형태를 상실한 반면, 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 우유 유래 엑소좀의 경우 2차 동결/해동시에도 원형을 그대로 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
또한 이러한 우유 유래 엑소좀은 동결건조 후, 다시 PBS에 녹였을 경우에도 그 사이즈를 유지 하는 것을 확인하였다(도 6).
실험 결과는 도 6과 같았다. 동결 건조 전 후 엑소좀의 사이즈 변화는 거의 없었고, 무게를 측정해 본 결과 단백질 정량으로 동결 건조 전 엑소좀의 무게 45mg은 동결 건조 후에도 42.5mg 이었다.(2L 기준)
실시예 3. 경구 제형의 제조
본 발명자는 우유 유래 엑소좀의 경구 제형 가능성을 확인하기 위해 Cy5.5가 레이블링 된 우유 유래 엑소좀 및 대조군 FBS 유래 엑소좀을 Balb/c 7주령 마우스에 경구로 투여 하여 혈액 중 각 엑소좀의 농도를 시간별로 측정하였다. 엑소좀은 약 1mg를 투여 하였으며, 투여 후 15분, 30분, 1시간, 4시간의 시간 별로 혈액을 채취하였다.
실험 결과는 도 7과 같았다.
실험결과 Cy5.5만 경구투여한 그룹에서는 혈액에서 발견되지 않았으며, 우유 유래 엑소좀이 대조군 엑소좀 대비 높은 농도로 장시간 유지 되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 이렇게 경구 투여한 엑소좀이 소장에서 발견되는지를 확인하기 위해 형광 분자 단층 촬영(fluorescence molecular tomographic, FMT)를 이용하여 엑소좀의 생체 내 분포 위치를 시간별로 확인하였다.
실험 결과는 도 8과 같았다.
또한, 동물 모델에서의 소장을 적출하여 파라핀 블락을 만든 후 박절(Sectioning)하여 공초점 현미경(Confocal microscopy)에서 Cy5.5가 레이블링 된 우유 유래 엑소좀을 확인하였다.
실험 결과는 도 9와 같았다.
3차원형광 분자 단층 촬영 결과 우유 유래 엑소좀은 위를 무사히 통과형 소장에 도달 하는 것을 확인하였으나, 대조군 엑소좀은 분해 되어 소장에 거의 도달 하지 못하는 것을 확인하였다. 또한, 파라핀 박절을 통한 조직 분석을 통해 소장 융털에서 우유 유래 엑소좀이 발견되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 전기천공을 이용한 치료제의 도입
본 발명자는 이어서 경구 제형화가 가능한 우유 유래 엑소좀에 전기천공법(Electroporation)을 이용하여 siRNA를 봉입하고자 다양한 조건들을 통해 조건을 최적화 하였다.
실험 결과는 도 10과 같았다.
500V, 10 pulse 상태에서 엑소좀의 크기가 변하지 않는 것을 확인하였다.(도 10)
또한, 상기 siRNA(CD47)가 봉인된 우유 유래 엑소좀이 세포에 흡수 되어 유전자 침묵(gene silenceing) 효과가 일어나는지 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 확인하였다.
Cell type은 CT26을 사용하였고, 기기는 Gene Pulser Xcell Electroporation Systems_Bio-rad를 사용하였다.
실험 결과는 도 11과 같았다.
공초점 현미경을 통해 형광 레이블링 된 우유 유래 엑소좀이 uptake 되는 것을 확인하였으며, siRNA가 봉입 된 우유 유래 엑소좀 그룹이 대조군 대비 약 40% 유전자 침묵 효과를 가지는 것을 확인하였으며, 이는 siRNA 전달체로 상용화 된 리포펙타민3000(Lipofectamine 3000)과 유사하게 높은 효율로 유전자 침묵 효과임을 확인하였다.
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (19)
- 우유 엑소좀; 및 우유 엑소좀 내부에 봉입된 치료제;를 포함하는 약학 조성물에 있어서,
상기 조성물은 경구형 제형이며,
상기 치료제는 전기천공법(Electroporation)으로 우유 엑소좀 내로 봉입되며,
상기 전기천공법은 300 내지 700 v의 전압,및
7 내지 13의 펄스의 조건에서 봉입되며,
상기 치료제는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, iRNA, siRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA 중에서 선택된 어느 하나 이상의 핵산이며,
상기 우유는 인간, 소, 양, 염소, 산양, 낙타, 버팔로 또는 야크 유래 우유이며,
상기 약학 조성물은 바이러스성 질환 또는 상태, 고콜레스테롤 혈증, 고지혈증, 안드로겐 수용체 매개성 질환, 암 또는 과잉 증식성 장애, 염증성 질환, 심혈관 질환, 대사성 질환, 열충격단백질과 관련된 질환 또는 상태의 치료, 예방 또는 개선용 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 동결 건조한 제형인, 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 우유 엑소좀은 직경이 30 nm 내지 300 nm 이며,
상기 치료제는 siRNA 또는 mRNA 이며;
상기 조성물은 백신용 조성물이며,
상기 조성물은 대상에게 경구로 투여되는 것인, 약학 조성물.
- 우유 엑소좀; 및 우유 엑소좀 내부에 봉입된 치료제;를 포함하는 건강기능식품 조성물에 있어서,
상기 조성물은 경구형 제형이며
상기 치료제는 전기천공법(Electroporation)으로 우유 엑소좀 내로 봉입되며,
상기 전기천공법은 300 내지 700 v의 전압,및
7 내지 13의 펄스의 조건에서 봉입되며,
상기 치료제는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, iRNA, siRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA 중에서 선택된 어느 하나 이상의 핵산이며,
상기 우유는 인간, 소, 양, 염소, 산양, 낙타, 버팔로 또는 야크 유래 우유인,
건강기능식품 조성물.
- 제 5항에 있어서,
상기 조성물은 동결 건조한 제형인, 건강기능식품 조성물.
- 제 5항에 있어서,
상기 우유 엑소좀은 직경이 30 nm 내지 300 nm 이며,
상기 치료제는 siRNA 또는 mRNA 이며;
상기 조성물은 대상에게 경구로 투여되는 것인, 건강기능식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 조성물의 제조 방법에 있어서,
(a) 우유로부터 원심분리 및 여과를 통해 우유 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(b) 분리된 우유 엑소좀에 치료제를 전기천공법으로 봉입하는 단계;를 포함하며,
상기 (b) 단계에서 전기천공법은 300 내지 700 v의 전압, 및 7 내지 13의 펄스의 조건에서 치료제를 우유 엑소좀 내로 봉입하며,
상기 치료제는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, iRNA, siRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, 안티센스 RNA 및 LNA 중에서 선택된 어느 하나 이상의 핵산이며,
상기 (a) 단계에서의 우유는 인간, 소, 양, 염소, 산양, 낙타, 버팔로 또는 야크 유래 우유인,
조성물의 제조 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 11항에 있어서,
상기 (a) 단계에서의 우유는 초유(colostrum)인, 조성물의 제조 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 (a) 단계는 1 내지 8 ℃에서, 2000 내지 130,000 g의 힘으로 10분 내지 7시간 동안 원심분리하며, 포어 사이즈가 0.01 um 내지 1 um 인 여과막을 통하여 여과하는, 조성물의 제조 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 (a) 단계는 2 내지 6 ℃에서,
초유의 우유를 2000 내지 4000 g의 힘으로 15분 내지 45분 동안 원심분리하는 제 1 원심분리 단계;
제 1 원심분리 단계 이후 10,000 내지 14,000 g의 힘으로 30분 내지 90분 동안 원심분리하는 제 2 원심분리 단계;
제 2 원심분리 단계 이후 30,000 내지 40,000 g의 힘으로 30분 내지 90분 동안 원심분리하는 제 3 원심분리 단계;
제 3 원심분리 단계 이후 60,000 내지 80,000 g의 힘으로 150분 내지 210분 동안 원심분리하는 제 4 원심분리 단계;
제 4 원심분리 단계 이후 포어 사이즈가 0.7 um 내지 0.9 um 인 여과막을 통하여 여과하는 제 1 여과 단계;
제 1 여과 단계 이후 포어 사이즈가 0.4 um 내지 0.5 um 인 여과막을 통하여 여과하는 제 2 여과 단계;
제 2 여과 단계 이후 포어 사이즈가 0.1 um 내지 0.3 um 인 여과막을 통하여 여과하는 제 3 여과 단계; 및
제 3 여과 단계 이후 90,000 내지 120,000 g의 힘으로 30 분 내지 90 분 동안 원심분리하는 제 5 원심분리 단계;를 포함하는, 조성물의 제조 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 방법은 (b) 단계 이후 치료제가 봉입된 우유 엑소좀 조성물을 동결 건조 하는 단계를 추가로 포함하는, 조성물의 제조 방법.
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