KR102424960B1

KR102424960B1 - A Novel Biomarker for Atopic Dermatitis

Info

Publication number: KR102424960B1
Application number: KR1020200105247A
Authority: KR
Inventors: 이광훈; 박창욱; 김서형; 곡원호; 김지혜; 이승희
Original assignee: 주식회사 프로라젠
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2022-07-25
Also published as: KR20220023477A

Abstract

본 발명은 아토피피부염을 비롯한 알레르기 질환 환자에서의 면역 치료에 대한 반응성 예측용 조성물 및 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 아토피피부염의 발병 여부, 중증도, 완치 여부 및 특정 치료제의 반응성에 대한 신뢰도 높은 정보를 제공함으로써, 장기적인 치료를 요하는 만성 질환인 아토피피부염에 대한 합리적 치료 전략을 조기에 수립하는 데에 유용하게 이용될 수 있다. The present invention relates to a composition for predicting responsiveness to immunotherapy in patients with allergic diseases including atopic dermatitis and a composition for diagnosis. The present invention is useful for early establishment of a rational treatment strategy for atopic dermatitis, a chronic disease requiring long-term treatment, by providing reliable information on the onset, severity, and cure of atopic dermatitis and the reactivity of a specific therapeutic agent. can be used

Description

A Novel Biomarker for Atopic Dermatitis

본 발명은 아포지단백질-AIV(APO-AIV)를 바이오마커로 하여 아토피피부염을 비롯한 알레르기 질환의 발병 여부, 중증도, 완치 및 특정 치료제에 대한 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for predicting the onset, severity, and cure of allergic diseases, including atopic dermatitis, and reactivity to specific therapeutic agents using apolipoprotein-AIV (APO-AIV) as a biomarker.

알레르기(allergy)란 면역 시스템의 오작동으로 인해 특정 항원에 대한 과민한 면역 반응이 유발됨으로써 신체에 손상이 가해지는 현상을 의미한다. 알레르기에는 아나필랙시스(anaphylaxis)를 유발하는 즉시과민반응인 제1형 알레르기, 항체 매개 과민반응인 제2형 알레르기, 면역복합체에 의한 제3형 알레르기 및 후천 면역에 의한 제4형 알레르기의 4가지 형태가 있다. Allergy refers to a phenomenon in which damage to the body is caused by inducing a hypersensitive immune response to a specific antigen due to a malfunction of the immune system. There are four types of allergies: type 1 allergy, which is an immediate hypersensitivity reaction that causes anaphylaxis, type 2 allergy, which is an antibody-mediated hypersensitivity reaction, type 3 allergy due to immune complex, and type 4 allergy due to acquired immunity. there is a form

대부분의 알레르기 질환은 제1형 알레르기에 의한 과민반응으로, 천식, 비염, 결막염, 두드러기, 아토피피부염 등이 이에 속하며, 심한 급성 과민증 쇼크로 인해 생명을 위협하기도 한다. 제1형 알레르기는 IgE 매개 즉시반응(IgE mediated acute reaction) 기전에 의한 것으로, 비만세포(mast cell) 표면의 IgE에 알레르기 항원(알레르겐)이 접촉하면 세포 내 다양한 신호경로를 통해 혈관 확장으로 인한 투과성 증가, 평활근 수축으로 인한 호흡장애, 국소적 염증 등의 증상이 개시된다. Most allergic diseases are hypersensitivity reactions caused by type 1 allergy, and include asthma, rhinitis, conjunctivitis, urticaria, and atopic dermatitis, which can be life-threatening due to severe acute anaphylaxis. Type 1 allergy is due to the IgE mediated acute reaction mechanism. When an allergen (allergen) comes into contact with IgE on the surface of mast cells, permeability due to vasodilation through various intracellular signaling pathways Symptoms such as increase, respiratory disturbance due to smooth muscle contraction, and local inflammation are onset.

한편, 외부 항원에 대한 알레르기 반응으로 발생된 알레르기 질환의 발병기전에서 알레르겐 특이적 IgE-항체가 가장 핵심적인 중요한 역할을 한다고 보고되어 왔으므로(Platts-Mills TA. Am J Respir Crit Care Med 2001;164:S1-5), 아토피피부염을 비롯한 제1형 알레르기 질환의 가장 합리적인 바이오마커로 IgE가 자연스럽게 제안된 바 있다. 그러나, 아토피피부염의 중증도와 총 IgE 수치의 상관성이 높지 않아 신뢰도 있는 표지자로 기능할 수 없음이 밝혀졌으며, 대안으로써 호산구양이온단백질(Eosinophil cationic protein, ECP), 젖산탈수효소(lactate dehydrogenase, LDH)와 같은 새로운 바이오마커들이 아토피피부염의 중증도를 추적할 수 있는 대안으로 연구되고 있으나 그 실효성이 검증되지 못하고 있다.On the other hand, since it has been reported that allergen-specific IgE-antibody plays the most important role in the pathogenesis of allergic diseases caused by an allergic reaction to a foreign antigen (Platts-Mills TA. Am J Respir Crit Care Med 2001;164) :S1-5), IgE has been naturally proposed as the most reasonable biomarker for type 1 allergic diseases including atopic dermatitis. However, it was found that the correlation between the severity of atopic dermatitis and the total IgE level was not high and thus could not function as a reliable marker. The same new biomarkers are being studied as alternatives to track the severity of atopic dermatitis, but their effectiveness has not been verified.

이에, 만성, 난치성 질환으로서 장기적인 치료를 요하는 아토피피부염 등의 제1형 알레르기 질환의 치료에 있어, 치료 경과를 파악하고 이에 따라 치료 전략을 수정하기 위해 질환의 중증도, 진행 경과 및 완치 여부를 정확하게 반영하는 새로운 바이오마커에 대한 요구가 커지고 있다.Accordingly, in the treatment of type 1 allergic diseases such as atopic dermatitis that require long-term treatment as a chronic, intractable disease, the severity of the disease, the progress of the disease, and whether or not it is cured are accurately determined in order to understand the treatment progress and modify the treatment strategy accordingly. There is a growing demand for new biomarkers that reflect it.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced throughout this specification and their citations are indicated. The disclosure contents of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to more clearly describe the level of the technical field to which the present invention pertains and the content of the present invention.

특허문헌 1. 미국 등록특허 제7,820,396호Patent Document 1. US Registered Patent No. 7,820,396

본 발명자들은 복잡한 발병 기작을 가지는 알레르기 질환, 구체적으로는 아토피피부염에 있어 면역 치료의 진행에 따른 질환의 호전 정도를 정확하게 반영하는 신뢰도 높은 바이오마커를 발굴하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 면역 치료를 통해 면역 관용(Immune tolerance)이 유도된 개체에서 아포지단백질-AIV(Apolipoprotein-AIV, APO-AIV)의 발현이 현저히 증가함을 확인함으로써, APO-AIV가 아토피피부염을 비롯한 알레르기 질환의 발병 여부 및 진행 정도 뿐 아니라 면역치료 반응성을 예측할 수 있는 효율적인 진단 표지자임을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors made intensive research efforts to discover reliable biomarkers that accurately reflect the degree of improvement of the disease according to the progress of immunotherapy in allergic diseases having a complex pathogenesis, specifically atopic dermatitis. As a result, it was confirmed that the expression of apolipoprotein-AIV (APO-AIV) was significantly increased in an individual whose immune tolerance was induced through immunotherapy, so that APO-AIV was used for allergies including atopic dermatitis. The present invention was completed by discovering that it is an effective diagnostic marker that can predict not only the onset and progression of a disease but also the immunotherapy responsiveness.

따라서 본 발명의 목적은 알레르기 질환 환자에서의 면역 치료에 대한 반응성 예측용 조성물을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for predicting responsiveness to immunotherapy in allergic disease patients.

본 발명의 다른 목적은 아토피 피부염의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosis of atopic dermatitis.

본 발명의 또 다른 목적은 아토피 피부염의 치료 보조제 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide an adjuvant composition for the treatment of atopic dermatitis.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아포지단백질-AIV(APO-AIV) 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환 환자에서의 면역 치료에 대한 반응성 예측용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides apolipoprotein-AIV (APO-AIV) or an agent for measuring the expression level of a gene encoding the same as an active ingredient for predicting responsiveness to immunotherapy in patients with allergic diseases A composition is provided.

본 발명자들은 복잡한 발병 기작을 가지는 알레르기 질환, 구체적으로는 아토피피부염에 있어 면역 치료의 진행에 따른 질환의 호전 정도를 정확하게 반영하는 신뢰도 높은 바이오마커를 발굴하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 면역 치료를 통해 면역 관용(Immune tolerance)이 유도된 개체에서 아포지단백질-AIV(Apolipoprotein-AIV, APO-AIV)의 발현이 현저히 증가함을 확인함으로써, APO-AIV가 아토피피부염을 비롯한 알레르기 질환의 발병 여부 및 진행 정도 뿐 아니라 개체에서의 면역치료 반응성을 예측할 수 있는 효율적인 진단 표지자임을 발견하였다. The present inventors made intensive research efforts to discover reliable biomarkers that accurately reflect the degree of improvement of the disease according to the progress of immunotherapy in allergic diseases having a complex pathogenesis, specifically atopic dermatitis. As a result, it was confirmed that the expression of apolipoprotein-AIV (APO-AIV) was significantly increased in an individual whose immune tolerance was induced through immunotherapy, so that APO-AIV was used for allergies including atopic dermatitis. It was found to be an effective diagnostic marker that can predict the onset and progression of a disease as well as the immunotherapy responsiveness in an individual.

본 명세서에서 용어“개체”는 APO-AIV 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하기 위한 시료를 제공하고, 궁극적으로 면역 치료 반응성의 분석 대상이 되는 대상체를 의미한다. 개체는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함하며, 구체적으로는 인간이다. 본 발명의 조성물은 면역 치료의 알레르기 질환에 대한 치료적 반응성 뿐 아니라 예방적 반응성을 예측하기 위한 정보도 제공하기 때문에, 본 발명의 개체는 알레르기 질환(예를 들어 아토피피부염) 환자일 수도 있고 아직 해당 질환으로 확진되지 않은 정상개체(healthy subject)일 수도 있다. As used herein, the term “subject” refers to a subject that provides a sample for measuring the expression level of APO-AIV or a gene encoding the same, and ultimately becomes an analysis target for immunotherapy responsiveness. Subjects include, without limitation, humans, mice, rats, guinea pigs, dogs, cats, horses, cattle, pigs, monkeys, chimpanzees, baboons or rhesus monkeys, specifically humans. Since the composition of the present invention provides information for predicting prophylactic as well as therapeutic responsiveness to allergic diseases of immunotherapy, the subject of the present invention may be a patient with an allergic disease (eg, atopic dermatitis) It may be a healthy subject that has not been confirmed with a disease.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 따라서“치료적 반응성”은 면역 치료를 위한 알레르겐(allergen)이 대상체에 치료적 유효량으로 투여되었을 때 생체 내에서 위와 같은 작용을 하는 정도를 의미한다. As used herein, the term “treatment” refers to (a) inhibiting the development of a disease, disorder or condition; (b) alleviation of the disease, condition or condition; or (c) eliminating the disease, condition or symptom. Therefore, “therapeutic responsiveness” refers to the degree to which an allergen for immunotherapy acts as described above in vivo when an allergen for immunotherapy is administered in a therapeutically effective amount to a subject.

본 명세서에서, 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 따라서 “예방적 반응성”은 면역 치료용 알레르겐이 아직 알레르기 질환으로 확진되지 않은 정상인에게 예방적 유효량으로 투여되었을 때 생체 내에서 과도한 면역 반응에 의한 질환의 발생을 억제하는 정도를 의미한다. As used herein, the term “prevention” refers to inhibiting the occurrence of a disease or disease in a subject who has never been diagnosed as having a disease or disease, but is likely to be afflicted with the disease or disease. Therefore, “prophylactic reactivity” refers to the degree to which an immunotherapeutic allergen suppresses the occurrence of a disease caused by an excessive immune response in vivo when an allergen for immunotherapy is administered in a prophylactically effective amount to a normal person who has not yet been diagnosed with an allergic disease.

본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 약리성분, 예를 들어 면역 치료용 알레르겐의 치료적 또는 예방적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다. As used herein, the term “administration” or “administering” refers to direct administration of a therapeutically or prophylactically effective amount of a pharmacological component, for example, an allergen for immunotherapy, to the subject so that the same amount is formed in the subject's body.

본 명세서에서 용어“알레르기 질환”은 개체 자신에게 해로운 결과로 나타나는, 특정 항원에 대한 모든 형태의 면역학적인 과민반응 및 이로 인하여 발생하는 부작용, 병적 상태 및 합병증을 포괄하는 의미이다. 구체적으로, 본 발명의 알레르기 질환은 IgE 매개 즉시반응(IgE mediated acute reaction) 기전에 의한 제1형 알레르기 질환이며, 보다 구체적으로는 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 두드러기, 식품 및/또는 약물 알레르기, 알레르기성 중이염, 아나필락시스 쇼크 및 아토피피부염로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 알레르기 질환이고, 가장 구체적으로는 아토피피부염이다.As used herein, the term “allergic disease” is meant to encompass all types of immunological hypersensitivity reactions to specific antigens and side effects, pathological conditions, and complications that occur as a result of harm to the individual. Specifically, the allergic disease of the present invention is a type 1 allergic disease caused by an IgE mediated acute reaction mechanism, and more specifically, asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, urticaria, food and/or drugs At least one allergic disease selected from the group consisting of allergy, allergic otitis media, anaphylactic shock and atopic dermatitis, and most specifically, atopic dermatitis.

본 명세서에서 용어“면역 치료”는 알레르기 항원, 즉 알레르겐을 소량으로부터 단계적으로 증량하면서 반복적으로 투여하여 항원에 대한 감작(sensitization)을 유도하고 알레르겐에 대한 과민반응을 감소시킴으로써 알레르기 질환의 장기적인 호전을 유도하는 치료 방법을 의미한다. 따라서, 용어“면역 치료”는“알레르겐 특이 면역치료(allergen specific immunotherapy: AIT)”로 표현될 수도 있다. As used herein, the term “immunotherapy” refers to an allergen, i.e., by repeatedly administering an allergen from a small amount to a step-by-step increase to induce sensitization to the antigen and reduce hypersensitivity to the allergen, thereby inducing long-term improvement of allergic disease. means a treatment method. Accordingly, the term “immunotherapy” may also be expressed as “allergen specific immunotherapy (AIT)”.

알레르겐의 투여에 의해 감작이 일어나면, 면역 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 면역억제성 세포인 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)가 활성화되어 면역 관용(Immune tolerance)이 일어나게 된다. 용어“알레르겐(allergen)”은 알레르기를 유발하는 항원, 또는 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원을 의미하는 것으로, 알레르겐 물질을 포함하는 특정 외부 물질과의 접촉으로 인해 생체 내 B 세포에 의해 IgE 항체가 만들어지면, 같은 물질의 재접촉 시 항원-항체 반응이 일어난다. 면역 치료에 적용될 수 있는 알레르겐은 예를 들어 꽃가루(잔디, 자작나무, Parietaria, 돼지풀), 집먼지진드기, 곰팡이(alternaria, cladosporium) 및 동물 알레르겐(개, 고양이 등의 털)을 포함하나, 이에 제한되지 않고 알레르기성 질환의 원인이 되는 항원으로서 반복 투여를 통해 개체 내에서 감작 반응을 일으킬 수 있는 항원이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로는, 집먼지진드기(house dust mite: HDM)가 사용될 수 있다. HDM은 전세계적으로 실내에서 가장 일반적으로 발견되는 흡입성 알레르겐(aeroallergen)로서, HDM에 의한 감작은 알레르기성 비염(allergic rhinitis: AR), 알레르기성 천식(allergic asthma: AA) 및 아토피성피부염을 포함하는 다양한 알레르기 질환을 유발한다.When sensitization occurs by the administration of an allergen, regulatory T cells (Tregs), which are immunosuppressive cells that play an important role in maintaining immune homeostasis, are activated, resulting in immune tolerance. The term “allergen” refers to an antigen that causes an allergy or an antigen that causes an allergic disease, and the IgE antibody is produced by B cells in vivo due to contact with a specific foreign substance including an allergen substance. Once made, an antigen-antibody reaction occurs upon re-contact of the same substance. Allergens that can be applied to immunotherapy include, but are not limited to, for example, pollen (grass, birch, Parietaria , ragweed), house dust mites, mold ( alternaria, cladosporium ) and animal allergens (hair of dogs, cats, etc.) It can be used without limitation as long as it is an antigen that can cause a sensitization reaction in an individual through repeated administration as an antigen that causes allergic diseases. Specifically, house dust mite (HDM) may be used. HDM is the most commonly found indoor allergen worldwide, and sensitization by HDM includes allergic rhinitis (AR), allergic asthma (AA) and atopic dermatitis. It causes a variety of allergic diseases.

본 명세서에서 용어“면역 치료에 대한 반응성 예측용 조성물”은 대상체가 면역 치료에 대한 치료 반응성을 가지는지를 예측하기 위해 APO-AIV 단백질 또는 APO-AIV 유전자의 발현량 측정수단을 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“면역 치료에 대한 반응성 예측용 키트”로 표현될 수도 있다.As used herein, the term “composition for predicting responsiveness to immunotherapy ” refers to an integrated mixture ( mixture) or device, which can also be expressed as “a kit for predicting responsiveness to immunotherapy”.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 아포지단백질-AIV는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 가진다. According to a specific embodiment of the present invention, the apolipoprotein-AIV has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 .

본 명세서에서 용어 "단백질"은 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 APO-AIV 단백질은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함한다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 최소 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 최소 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다. As used herein, the term “protein” refers to a linear molecule formed by bonding amino acid residues to each other by peptide bonds. The APO-AIV protein of the present invention also includes an amino acid sequence showing substantial identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 . The substantial identity is at least 70% when the above-described amino acid sequence of the present invention and any other sequences are aligned as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. of homology, specifically, at least 80% homology, more specifically at least 90% homology, and most specifically, at least 95% homology.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 아포지단백질-AIV를 인코딩하는 유전자는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 가진다. According to a specific embodiment of the present invention, the gene encoding the apolipoprotein-AIV has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 .

본 명세서에서 용어“뉴클레오타이드”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 본 발명에서 발현량을 측정하고자 하는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다. 뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있는데, 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈, 코돈의 축퇴성에 의해 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 가지는 핵산분자를 모두 포괄한다. As used herein, the term “nucleotide” has a meaning comprehensively including DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic structural units in nucleic acid molecules, include natural nucleotides as well as analogs with modified sugar or base sites. (analogue) is also included. It is clear to those skilled in the art that the nucleotide sequence whose expression level is to be measured in the present invention is not limited to the nucleotide sequence described in the accompanying sequence list. A mutation in a nucleotide does not result in a change in a protein. Such a nucleic acid has a functionally equivalent codon, a codon encoding the same amino acid due to codon degeneracy, or a nucleic acid having a codon encoding a biologically equivalent amino acid. encompasses all molecules.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 발현량을 측정하고자 하는 뉴클레오타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 95%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. Considering the mutation having the above-described biological equivalent activity, it is construed that the nucleotide whose expression level is to be measured in the present invention includes a sequence showing substantial identity to the sequence listed in the sequence listing. The substantial identity is at least 70% when the above-described sequence of the present invention and any other sequences are aligned as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence that exhibits homology, specifically 80% homology, more specifically 90% homology, and most specifically 95% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994). The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990)) is accessible from the National Center for Biological Information (NBCI), etc. It can be used in conjunction with sequencing programs such as blastx, tblastn and tblastx.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 아포지단백질-AIV의 발현량을 측정하는 제제는 상기 아포지단백질-AIV에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 상기 아포지단백질-AIV에 특이적으로 결합하는 앱타머이다. According to a specific embodiment of the present invention, the agent for measuring the expression level of the apolipoprotein-AIV is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the apolipoprotein-AIV; or an aptamer that specifically binds to the apolipoprotein-AIV.

본 발명에 따르면, 본 발명의 APO-AIV 단백질을 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 개체의 면역 치료 반응성 또는 알레르기 질환의 중증도를 분석하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 ELISA, 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, 면역화학조직염색을 비롯한 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. According to the present invention, the APO-AIV protein of the present invention can be detected according to an immunoassay method using an antigen-antibody reaction and used to analyze an individual's immunotherapy responsiveness or the severity of an allergic disease. Such immunoassay may be performed according to various immunoassays or immunostaining protocols developed in the prior art, including ELISA, western blotting, magnetic bead-antibody immunoprecipitation, and immunochemical tissue staining.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 표지된 항체가 이용될 수 있다. 본 발명에서 APO-AIV 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.For example, when the method of the present invention is performed according to a radioimmunoassay method, antibodies labeled with radioisotopes (eg, C ¹⁴ , I ¹²⁵ , P ³² and S ³⁵ ) may be used. In the present invention, the antibody specifically recognizing the APO-AIV protein is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다. Antibodies of the present invention can be prepared by methods commonly practiced in the art, for example, fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6:511-519 (1976)), recombinant DNA methods (U.S. Patent No. 4,816,567). ) or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature , 352:624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol. , 222:58, 1-597 (1991)). . General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; and Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques , CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 강도를 분석함으로써, 질환의 진행 정도 또는 면역 치료에 의한 면역 관용의 달성 여부를 예측할 수 있다. 즉, 개체의 시료에서 APO-AIV 단백질에 대한 시그널이 대조군 시료 보다 강하게 검출되는 경우 개체가 면역 치료에 유의하게 반응한 것으로 판단된다.By analyzing the intensity of the final signal by the above-described immunoassay process, it is possible to predict the degree of disease progression or whether immune tolerance is achieved by immunotherapy. That is, when the signal for the APO-AIV protein is detected more strongly in the subject's sample than in the control sample, it is determined that the subject has significantly responded to the immunotherapy.

본 명세서에서 용어“항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. As used herein, the term “antigen binding fragment” refers to a portion of a polypeptide capable of binding an antigen in the entire immunoglobulin structure, for example, F(ab')2, Fab', Fab, Fv and scFvs, but are not limited thereto.

본 명세서에서 용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 은 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.As used herein, the term "specifically binding" has the same meaning as "specifically recognizing", and an antigen and an antibody (or a fragment thereof) interact specifically through an immunological reaction. means to do

본 발명은 항체 대신 APO-AIV 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.The present invention may use an aptamer that specifically binds to the APO-AIV protein instead of the antibody. As used herein, the term “aptamer” refers to a single-stranded nucleic acid (RNA or DNA) molecule or peptide molecule that binds to a specific target material with high affinity and specificity. For general information on aptamers, see Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7 (1998).

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 아포지단백질-AIV를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이다. According to a specific embodiment of the present invention, the agent for measuring the expression level of the apolipoprotein-AIV encoding gene is a primer or probe that specifically binds to the nucleic acid molecule of the gene.

본 명세서에서 용어“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term “nucleic acid molecule” has a meaning comprehensively including DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic structural units in nucleic acid molecules, include natural nucleotides as well as analogs with modified sugar or base sites. (analogue) (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90:543-584 (1990)).

본 명세서에서 용어“프라이머”는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.As used herein, the term “primer” refers to a condition in which the synthesis of a primer extension product complementary to a nucleic acid strand (template) is induced, that is, the presence of a polymerization agent such as nucleotides and DNA polymerase, and the initiation of synthesis under conditions of suitable temperature and pH. It refers to an oligonucleotide that acts as a starting point. Specifically, the primer is a single-stranded deoxyribonucleotide. The primer used in the present invention may include naturally occurring dNMP (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides, and may also include ribonucleotides.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.The primer of the present invention may be an extension primer that is annealed to a target nucleic acid to form a sequence complementary to the target nucleic acid by a template-dependent nucleic acid polymerase, which is extended to the position where the immobilized probe is annealed so that the probe is It occupies the annealed area.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산, 예를 들어 APO-AIV 유전자의 특정 염기서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 경우 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 경우를 모두 포괄하는 의미이며, 구체적으로는 완전히 상보적인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.The extension primer used in the present invention includes a hybridization nucleotide sequence complementary to a specific nucleotide sequence of a target nucleic acid, for example, an APO-AIV gene. The term “complementary” means that a primer or probe is sufficiently complementary to selectively hybridize to a target nucleic acid sequence under certain annealing or hybridization conditions, and when substantially complementary and perfectly complementary ), and specifically means a completely complementary case. As used herein, the term "substantially complementary sequence" is meant to include not only a completely identical sequence, but also a sequence that is partially mismatched with a sequence to be compared within a range that can function as a primer by annealing to a specific sequence.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, pH 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 이러한 프라이머의 설계는 타겟 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.The primer should be long enough to prime the synthesis of the extension product in the presence of a polymerizer. A suitable length of a primer depends on a number of factors, such as temperature, pH and source of the primer, but is typically 15-30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form sufficiently stable hybrid complexes with the template. The design of such a primer can be easily performed by those skilled in the art with reference to the target nucleotide sequence, for example, using a primer design program (eg, PRIMER 3 program).

본 명세서에서 용어“프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 더욱 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 APO-AIV 유전자의 특정 염기서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 타겟 서열의 3’-말단 또는 5’-말단에 상보적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. As used herein, the term “probe” refers to a natural or modified monomer including deoxyribonucleotides and ribonucleotides capable of hybridizing to a specific nucleotide sequence or a linear oligomer having a bond. Specifically, the probe is single-stranded for maximum efficiency in hybridization, more specifically deoxyribonucleotides. As the probe used in the present invention, a sequence that is perfectly complementary to a specific nucleotide sequence of the APO-AIV gene may be used, but a sequence that is substantially complementary within a range that does not interfere with specific hybridization This may also be used. In general, since the stability of the duplex formed by hybridization tends to be determined by the match of the sequences at the ends, it is preferable to use a probe complementary to the 3'-end or 5'-end of the target sequence. do.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. Suitable conditions for hybridization are Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington , DC (1985) can be determined with reference to the disclosure.

본 명세서에서 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 발현 억제용 핵산 분자가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 서열 특이적인 혼성화가 일어날 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.As used herein, the term “complementary” means that a nucleic acid molecule for expression inhibition is sufficiently complementary to selectively hybridize to a target nucleic acid sequence under predetermined annealing or hybridization conditions, and is substantially complementary and completely complementary. (Perfectly complementary) has a meaning encompassing all, and preferably means completely complementary. As used herein, the term “substantially complementary sequence” includes not only a completely identical sequence, but also a sequence that is partially mismatched with the sequence to be compared within the range in which sequence-specific hybridization can occur by annealing to a specific sequence. to be.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아포지단백질-AIV 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 알레르기 질환 환자에서의 면역 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method of providing information for predicting responsiveness to immunotherapy in allergic disease patients, comprising measuring the expression level of apolipoprotein-AIV or a gene encoding the same to provide.

본 발명의 APO-AIV 단백질, 이를 인코딩하는 유전자 및 이들의 발현을 측정하는 일반적인 방법에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 이를 생략한다.Since the APO-AIV protein of the present invention, a gene encoding it, and a general method for measuring their expression have already been described above, they are omitted to avoid excessive duplication.

본 발명의 방법에 따르면, APO-AIV의 단백질 수준의 측정은 상술한 항체를 이용한 면역학적 방법 또는 앱타머를 이용한 방법 외에도 분석하고자 하는 시료 내 APO-AIV 단백질 또는 이의 생체 내 활성형(active form)에 해당하는 질량과 동일한 질량을 가지는 단백질의 존재 여부를 분석하는 질량분석방법을 통해 이루어질 수 도 있다. 이러한 질량 분석은 예를 들어 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight) 질량분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight) 질량분석, ESI-TOF(Electrospray ionisation time-of-flight) 질량분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 및 LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to the method of the present invention, the measurement of the protein level of APO-AIV is performed by using the above-described immunological method using the antibody or the method using an aptamer, as well as the APO-AIV protein in the sample to be analyzed or an active form thereof in vivo. It can also be done through a mass spectrometry method that analyzes the presence or absence of a protein having the same mass as the corresponding mass. Such mass spectrometry is, for example, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry, Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight (SELDI-TOF) mass spectrometry, Electrospray ionisation time-of-flight (ESI-TOF) mass spectrometry of-flight mass spectrometry, liquid chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), and liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (LC-MS/MS).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아포지단백질-AIV(APO-AIV) 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 진단용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for diagnosis of atopic dermatitis comprising, as an active ingredient, an agent for measuring the expression level of apolipoprotein-AIV (APO-AIV) or a gene encoding the same.

본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다. As used herein, the term “diagnosis” includes determination of an individual's susceptibility to a specific disease, determination of whether an individual currently has a specific disease, and determination of the prognosis of an individual with a specific disease. .

본 발명에 따르면, APO-AIV는 면역 관용의 달성 여부에 대한 정확한 표지자로서 기능하므로, 검사 시점 당시의 개체 내 아토피피부염을 비롯한 알레르기 질환이 존재하는지 여부에 대한 신뢰도 높은 바이오마커로 기능할 수도 있다. According to the present invention, since APO-AIV functions as an accurate marker for achieving immune tolerance, it can also function as a highly reliable biomarker for whether allergic diseases including atopic dermatitis exist in the subject at the time of the test.

본 명세서에서 용어“진단용 조성물”은 대상체의 알레르기 질환 발병 여부, 중증도, 호전 정도를 판단하거나 재발 가능성을 예측하기 위해 APO-AIV 단백질 또는 APO-AIV 유전자의 발현량 측정수단을 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“진단용 키트”로 표현될 수도 있다.As used herein, the term “diagnostic composition” refers to an integrated mixture comprising a means for measuring the expression level of APO-AIV protein or APO-AIV gene in order to determine whether or not the subject has an allergic disease, the severity, the degree of improvement or predict the possibility of recurrence ( mixture) or device, which can also be expressed as “diagnostic kit”.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아포지단백질-AIV(APO-AIV) 또는 이를 인코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 치료 보조제 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides an adjuvant composition for the treatment of atopic dermatitis comprising apolipoprotein-AIV (APO-AIV) or a gene encoding the same as an active ingredient.

본 명세서에서 용어“치료 보조제(adjuvant)”는 주된 약리성분과 함께 사용할 경우 해당 약리활성을 강화하거나, 지속시간을 연장하거나 또는 상승효과를 발휘하도록 하는 성분을 의미한다. 본 발명에 따르면, APO-AIV는 면역 치료용 알레르겐과 함께 투여될 경우 대상체의 치료 반응성을 증가시켜 면역 관용 달성 효과를 현저히 개선시키는 역할을 한다. As used herein, the term “adjuvant treatment (adjuvant)” refers to a component that enhances the corresponding pharmacological activity, prolongs the duration, or exerts a synergistic effect when used together with a main pharmacological component. According to the present invention, APO-AIV serves to significantly improve the effect of achieving immune tolerance by increasing the therapeutic responsiveness of a subject when administered together with an allergen for immunotherapy.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 보조제 조성물은 면역 치료용 알레르겐과 병용 투여된다. 병용투여는 하나의 제형에 본 발명의 보조제와 알레르겐이 모두 포함된 채로, 또는 각각의 조성물에 별도로 포함된 채로 동시에 투여되거나 또는 임의의 순서로 적절한 시간 차를 두고 순차적으로 투여될 수 있다. According to a specific embodiment of the present invention, the therapeutic adjuvant composition of the present invention is administered in combination with an allergen for immunotherapy. Co-administration may be administered simultaneously with both the adjuvant and the allergen of the present invention included in one formulation or separately included in each composition, or may be administered sequentially with an appropriate time difference in any order.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 아토피피부염을 비롯한 알레르기 질환 환자에서의 면역 치료에 대한 반응성 예측용 조성물 및 진단용 조성물을 제공한다.(a) The present invention provides a composition for predicting responsiveness to immunotherapy in patients with allergic diseases including atopic dermatitis and a composition for diagnosis.

(b) 본 발명은 아토피피부염의 발병 여부, 중증도, 완치 여부 및 특정 치료제의 반응성에 대한 신뢰도 높은 정보를 제공함으로써, 장기적인 치료를 요하는 만성 질환인 아토피피부염에 대한 합리적 치료 전략을 조기에 수립하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.(b) The present invention provides reliable information on whether atopic dermatitis occurs, severity, cure, and reactivity of a specific therapeutic agent, thereby establishing a rational treatment strategy for atopic dermatitis, a chronic disease requiring long-term treatment, at an early stage. can be usefully used for

도 1은 종래의 치료제를 투여한 군, 면역치료 반응성이 없는 군 및 면역치료 반응성을 보이는 군에서 치료제 투여 전후의 조절 T 세포(regulatory T cell) 발현 변화를 관찰한 결과이다.
도 2는 종래의 치료제를 투여한 군, 면역치료 반응성이 없는 군 및 면역치료 반응성을 보이는 군에서 각각 치료 12개월 후 조절 T 세포의 RNA에서 문헌조사를 통해 확인된 Th1, Th2, Th17 및 조절 T 세포 관련 유전자들의 발현 정도를 열지도(heatmap)를 통해 시각적으로 비교분석한 결과이다.
도 3은 치료 전, 치료 3개월 후, 9개월 후, 12개월 후의 종래 치료제를 투여한 군, 면역치료 반응성이 없는 군 및 면역치료 반응성을 보이는 군의 조절 T 세포의 RNA에서 문헌조사를 통해 확인된 관련 유전자들의 발현 정도를 시각적으로 비교분석하기 위해 열지도 분석을 진행한 결과를 도시하는 도면이다.
도 4는 치료 12개월 후 종래 치료제를 투여한 군, 면역치료 반응성이 없는 군 및 면역치료 반응성을 보이는 군의 혈청을 각각 이용하여 TMT(Tandem Mass Tags) 분석을 수행한 결과이다.
도 5는 치료 전과 치료 12개월 후 종래 치료제를 투여한 군, 면역치료 반응성이 없는 군 및 면역치료 반응성을 보이는 군의 혈청에서 각각 APO-AⅣ를 검출한결과를 보여주는 표이다.
도 6은 아토피피부염 환자의 조절 T 세포에 APO-AIV 단백질 처리 후 조절 T 세포의 생존율을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.1 is a result of observing changes in expression of regulatory T cells before and after administration of a therapeutic agent in a group administered with a conventional therapeutic agent, a group without immunotherapy responsiveness, and a group showing immunotherapy responsiveness.
Figure 2 is Th1, Th2, Th17 and regulatory T confirmed through literature search in the RNA of regulatory T cells after 12 months of treatment in a group administered with a conventional therapeutic agent, a group without immunotherapy responsiveness, and a group showing immunotherapy responsiveness, respectively. This is the result of visually comparing and analyzing the expression levels of cell-related genes through a heatmap.
3 is confirmed through literature search on RNA of regulatory T cells before treatment, 3 months after treatment, 9 months, and 12 months after administration of the conventional therapeutic agent, the group without immunotherapy responsiveness, and the group showing immunotherapy responsiveness It is a diagram showing the results of heat map analysis to visually compare and analyze the expression levels of related genes.
Figure 4 shows the results of TMT (Tandem Mass Tags) analysis using the sera of the group to which the conventional treatment was administered, the group not responding to the immunotherapy, and the group showing the responsiveness to the immunotherapy, respectively, after 12 months of treatment.
5 is a table showing the results of detection of APO-AIV in the serum of a group administered with a conventional therapeutic agent, a group without immunotherapy responsiveness, and a group showing immunotherapy responsiveness before and after 12 months of treatment.
6 is a diagram showing the results of measuring the survival rate of regulatory T cells after APO-AIV protein treatment on regulatory T cells of atopic dermatitis patients.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예Example

실험방법Experimental method

혈액채취 및 PBMC(말초혈액단핵구) 분리Blood collection and PBMC (peripheral blood mononuclear) isolation

아토피피부염 환자 중 종래에 보고된 방법(Jungsoo Lee et al., Yonsei Med J 57(2):393-398 (2016))에 따라 집먼지진드기(house dust mite: HDM)를 이용한 알레르겐 특이 면역치료(allergen specific immunotherapy: AIT)를 시행한 시험군 29명과, 알레르겐 특이 면역치료를 시행하지 않은 대조군 4명의 치료 전, 치료 3개월, 치료 9개월, 치료 12개월 째의 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 EDTA-코팅된 튜브와 일반 튜브에 각각 분리하여 보관하고, EDTA-코팅된 튜브에 담긴 혈액은 Ficoll을 이용하여 PBMC를 분리하였으며, 일반 튜브에 담긴 혈액은 1,500 rpm으로 15분간 원심분리를 하여 혈청을 분리하였다.Allergen-specific immunotherapy using house dust mite (HDM) according to a previously reported method among patients with atopic dermatitis (Jungsoo Lee et al., Yonsei Med J 57(2):393-398 (2016)) Blood samples were collected before, 3 months, 9 months, and 12 months after treatment from 29 subjects in the test group who received specific immunotherapy (AIT) and 4 in the control group who did not receive allergen-specific immunotherapy. The collected blood was stored separately in EDTA-coated tubes and regular tubes, and PBMCs were separated from the blood in EDTA-coated tubes using Ficoll, and the blood in a general tube was centrifuged at 1,500 rpm for 15 minutes. to separate the serum.

시험군 분류Classification of test groups

알레르겐 특이 면역치료가 아닌 종래 치료제, 즉 사이클로스포린을 복용한 아토피피부염 환자는 대조군으로 분류하였다. 또한, 알레르겐 특이 면역치료를 시행한 아토피피부염 환자 중 피부과 전문의의 소견을 통해 아토피피부염이 호전된 환자는 면역치료에 효과가 있는 군(Respond)으로 분류하였으며, 호전되지 않은 환자는 면역치료에 효과가 없는 군(Non-respond)으로 분류하였다.Patients with atopic dermatitis who took conventional treatment, that is, cyclosporine, rather than allergen-specific immunotherapy, were classified as a control group. In addition, among atopic dermatitis patients who underwent allergen-specific immunotherapy, those whose atopic dermatitis improved through the opinion of a dermatologist were classified into a group that was effective for immunotherapy (respond), and patients who did not improve were not effective for immunotherapy. It was classified as a non-respond group.

FACS(유세포분석) 및 Treg 세포 분류FACS (flow cytometry) and Treg cell sorting

아토피피부염 환자의 면역치료 기전에서의 조절 T(Treg) 세포의 역할을 조사하기 위해 다음의 실험을 진행하였다: 대조군 및 시험군의 치료 전, 치료 3개월, 9개월 및 12개월 째의 혈액에서 분리한 PBMC에 인간 Treg 세포 마커인 CD4, CD25 및 CD127을 형광 항체로 염색하고, BD LSRFortessa 장비로 형광 항체가 염색된 세포를 읽어준 뒤 CD4⁺CD25⁺CD127^-세포를 측정함으로써 각 군의 Treg 세포의 변화를 확인하였다. 조절 T 세포의 분리를 위해, 상술한 방법으로 각 군의 PBMC에 형광 항체를 염색한 다음, BD LSR Ⅱ 장비를 이용하여 형광 항체가 염색된 세포를 읽어준 뒤 CD4⁺CD25⁺CD127^-부분을 선택하고 장비를 작동하였고, 이후 전체 PBMC 세포에서 선택된 부분의 세포만 분류되어 Treg 세포를 추출하였다.In order to investigate the role of regulatory T (Treg) cells in the immunotherapy mechanism of atopic dermatitis patients, the following experiments were conducted: Isolation from the blood of control and test groups before treatment, 3 months, 9 months, and 12 months of treatment One PBMC was stained with human Treg cell markers CD4, CD25 and CD127 with a fluorescent antibody, the fluorescent antibody-stained cells were read with a BD LSRFortessa instrument, and CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127 ^- cells were measured by measuring Treg cells of each group. Change was confirmed. For the isolation of regulatory T cells, the PBMCs of each group were stained with a fluorescent antibody as described above, and then the cells stained with the fluorescent antibody were read using the BD LSR Ⅱ equipment, and then the CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127 ^- portion was selected. Then, the equipment was operated, and then, only the cells of a selected part of the total PBMC cells were sorted and Treg cells were extracted.

Treg 세포로부터 RNA의 채취, 마이크로어레이 및 전사체 분석Collection of RNA from Treg cells, microarray and transcriptome analysis

상술한 Treg 세포 분류 방법으로 추출된 Treg 세포에서 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)을 이용하여 고순도의 RNA를 추출하였다. 다음으로, NanoDrop 장비와 2100 Bioanalyzer 장비를 이용하여 RNA 샘플의 QC(quality control)를 확인한 후 RNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다. High-purity RNA was extracted from the Treg cells extracted by the Treg cell sorting method described above using the RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen). Next, RNA microarray analysis was performed after confirming the quality control (QC) of the RNA sample using the NanoDrop equipment and the 2100 Bioanalyzer equipment.

Affymetrix® Power Tools (APT)의 Robust Multi-Average (RMA) 방법을 통해 전체 데이터를 요약 및 정규화 하였고, 유전자 수준으로 결과를 정리하고 차별발현 유전자(DEG) 분석을 수행하였다. 데이터의 통계적 유의성은 독립 t-검정과 배수 변화를 이용하여 분석하였고, 거짓 발견율(False discovery rate, FDR)은 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p 값을 조정하였으며, DEG 세트는 연관(linkage)과 유클리디안 거리를 사용하여 계층적 군집화 분석을 수행하였다. 또한, 각 군 간의 유전자 발현의 차이를 확인하기 위한 열지도 분석 등 모든 데이터 분석과 시각화 작업은 R 4.0.0 프로그램을 사용하여 수행하였다.Overall data were summarized and normalized through the Robust Multi-Average (RMA) method of Affymetrix® Power Tools (APT), the results were organized at the gene level, and differential expression gene (DEG) analysis was performed. The statistical significance of the data was analyzed using an independent t -test and fold change, the false discovery rate (FDR) was adjusted for p value using the Benjamini-Hochberg algorithm, and the DEG set was related to linkage and significance. Hierarchical clustering analysis was performed using the Clinian distance. In addition, all data analysis and visualization work, such as heat map analysis to confirm the difference in gene expression between each group, was performed using the R 4.0.0 program.

TMT(Tandem Mass Tags) 분석Tandem Mass Tags (TMT) analysis

면역치료를 시행하지 않는 대조군이나 면역치료 시행 후 반응이 없는 시험대상자에 비해 면역치료 시행 후 반응이 있는 아토피피부염 환자의 혈청에서 특이적으로 발현하는 단백질을 선별하고 이 중 유의한 바이오마커를 발굴하기 위해 하기의 실험을 진행하였다. To select a protein specifically expressed in the serum of atopic dermatitis patients who have a response after immunotherapy compared to a control group that does not undergo immunotherapy or a test subject who does not respond to immunotherapy, and to discover significant biomarkers among them. For this purpose, the following experiment was conducted.

대조군 및 시험군의 치료 전, 치료 3개월, 9개월 및 12개월 째의 혈액에서 분리한 혈청을 이용하여 프로테오믹스(proteomics) 기법 중 하나인 TMT 분석을 진행하였다. 각 그룹별 4 ml의 혈청을 알킬화 및 환원 과정을 거쳐 단백질을 정량하고, 6개의 정량화된 단백질 100 ㎍을 트립신 5 ㎍으로 분해하여 16시간 반응시켰으며, 6개의 분해 시료 각각 100 ㎍을 TMT 표지를 하였다. TMT 표지 시료 30 ㎕를 LC-분획한 뒤 질랭 분석을 진행하였고, 최종 농도가 0.4-0.6 (㎍/㎕)이 되도록 준비하였으며, 증가한 단백질을 선택하여 분석하였다. 본 분석을 통해 대조군에 비해 면역치료 반응성이 있는 아토피피부염 환자의 혈청에서 유의적으로 증가 혹은 감소되는 특정 단백질의 발현을 선별하였으며, 이를 바이오마커로 선정하였다.TMT analysis, one of proteomics techniques, was performed using serum isolated from blood at 3 months, 9 months, and 12 months of treatment before treatment in the control and test groups. Proteins were quantified through alkylation and reduction of 4 ml of serum for each group, 100 μg of six quantified proteins were digested with 5 μg of trypsin and reacted for 16 hours, and 100 μg of each of the six digested samples was labeled with TMT. did. After LC-fractionation of 30 μl of the TMT label sample, vaginal analysis was performed, and the final concentration was prepared to be 0.4-0.6 (μg/μl), and the increased protein was selected and analyzed. Through this analysis, the expression of a specific protein that was significantly increased or decreased in the serum of atopic dermatitis patients with immunotherapy responsiveness compared to the control group was selected, and this was selected as a biomarker.

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

상기에서 선별된 아토피피부염 면역치료 바이오마커를 검증하기 위해 하기의 시험을 진행하였다. The following tests were performed to verify the atopic dermatitis immunotherapy biomarkers selected above.

종래의 치료를 진행한 아토피피부염 환자, 면역치료 시행 후 반응이 없는 아토피피부염 환자 및 면역치료 시행 후 반응이 있는 아토피피부염 환자의 치료 전, 치료 3개월, 치료 9개월 및 치료 12개월 째의 혈액을 채취하였고, 혈액에서 분리된 혈청을 이용하여 ELISA 실험을 진행하였다. Human Apilipoprotein-AⅣ ELISA 키트(BioVendor Laboratorni Medicina, Modrice, Cezech Republic)를 사용하여 혈청 내의 APO-AⅣ 발현량을 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. Blood samples from patients with atopic dermatitis who have undergone conventional treatment, patients with atopic dermatitis who do not respond after immunotherapy, and patients with atopic dermatitis who have had a response after immunotherapy are treated before, 3 months, 9 months, and 12 months after treatment. It was collected, and an ELISA experiment was performed using the serum isolated from the blood. APO-AIV expression level in serum was measured according to the manufacturer's protocol using the Human Apilipoprotein-AIV ELISA kit (BioVendor Laboratorni Medicina, Modrice, Cezech Republic).

1:1000으로 희석한 각 그룹(정상군, 반응군, 미반응군)의 혈청을 100 ㎕씩 ELISA 플레이트에 넣고 실온에서 1시간 동안 처치하고, 세척 완충액으로 3회 세척한 후 결합 용액(conjugate solution)을 실온에서 1시간 동안 처리한 뒤 세척 완충액으로 다시 3회 세척하였다. 기질 용액(Substrate solution) 100 ㎕를 넣고 실온에서 10분 간 반응시킨 후 종결 용액(stop solution)을 넣고 반응을 중지하였다. VersaMax ELISA 마이크로 플레이트 리더기(Molecular Devices, Sunnyvale. CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성 대조군을 통해 확인한 관계식에 따라 흡광도를 대입하여 APO-AIV를 정량화하였다.100 μl of serum from each group (normal group, responder group, non-reactive group) diluted 1:1000 was put into an ELISA plate, treated at room temperature for 1 hour, washed 3 times with wash buffer, and then the conjugate solution (conjugate solution) ) was treated at room temperature for 1 hour and then washed 3 times again with wash buffer. 100 μl of the substrate solution was added and reacted at room temperature for 10 minutes, and then a stop solution was added to stop the reaction. Absorbance was measured at 450 nm using a VersaMax ELISA microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale. CA, USA), and APO-AIV was quantified by substituting the absorbance according to the relational expression confirmed through the positive control.

AD Treg 세포 생존 시험AD Treg cell viability test

상기에서 선별된 아토피피부염 면역치료 바이오마커가 면역치료 시 중요한 역할을 하는 Treg 세포에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 Treg 세포의 생존율을 측정하였다. 요약하면, 아토피피부염 환자의 혈액에서 상술한 방법으로 PBMC를 추출하고 Treg 세포를 분리하였다. 이후, 아무것도 처리하지 않은 음성대조군, APO-AIV 재조합 단백질 1 μg을 처리한 군 및 APO-AIV 재조합 단백질 5 μg을 처리한 군으로 나누어 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 450를 염색하고 BD LSRFortessa 장비를 이용하여 세포 생존율을 관찰하였다.The survival rate of Treg cells was measured to determine how the atopic dermatitis immunotherapy biomarker selected above affects Treg cells, which play an important role in immunotherapy. In summary, PBMCs were extracted from the blood of atopic dermatitis patients by the method described above and Treg cells were isolated. Thereafter, the group was divided into a negative control untreated, a group treated with 1 μg of APO-AIV recombinant protein, and a group treated with 5 μg of APO-AIV recombinant protein, and cultured for 48 hours. Cells after culture were stained with eBioscience™ Fixable Viability Dye eFluor™ 450, and cell viability was observed using BD LSRFortessa equipment.

실험결과Experiment result

면역치료 반응성에 따른 조절 T 세포의 발현 변화 Changes in expression of regulatory T cells according to immunotherapy responsiveness

가슴샘과 말초에서 생성되는 조절 T 세포(Treg cell)는 다른 T 세포 등을 억제하여 면역 관용(Immune tolerance) 반응을 유도하게 되는데, 아토피피부염 환자에 면역치료를 시행하면 면역 관용 반응에 의해 Treg 세포의 발현이 증가하면서 치료에 반응이 나타나고 증상이 호전되게 된다. 이처럼 아토피피부염 환자의 면역치료 기전에 Treg 세포의 역할이 중요함을 입증하기 위해, 종래의 치료를 시행한 아토피피부염 환자와 면역치료를 시행한 아토피피부염 환자의 치료 전과 치료 12개월 후의 PBMC에서 Treg 세포의 발현 변화를 FACS 실험을 통해 확인하였다.Regulatory T cells (Treg cells) generated in the thymus gland and the periphery induce an immune tolerance response by suppressing other T cells. As the expression increases, response to treatment appears and symptoms improve. In order to prove the importance of the role of Treg cells in the immunotherapy mechanism of patients with atopic dermatitis, Treg cells in PBMCs before and 12 months after treatment in patients with atopic dermatitis who received conventional treatment and patients with atopic dermatitis who received immunotherapy The expression change of was confirmed through FACS experiment.

그 결과, 종래의 치료를 시행한 아토피피부염 환자군(CT)과 면역치료 시행 후 반응이 없는 아토피피부염 환자군(IT (NR))에서는 치료 전이나 치료 12개월 후에 Treg 세포(CD4⁺CD25⁺CD127^-) 발현의 변화가 미미함에 반하여, 면역치료 시행 후 반응이 있는 아토피피부염 환자군(IT (R))에서는 치료 전에 비해 치료 12개월 후에 Treg 세포의 발현이 특이적으로 증가되어 있음을 확인하였다(도 1a 및 1b).As a result, Treg cells (CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127 ^- ) before or after 12 months of treatment in the atopic dermatitis patient group (CT) treated with conventional treatment and the atopic dermatitis patient group (IT (NR)) without a response after immunotherapy. In contrast to the insignificant change in expression, it was confirmed that the expression of Treg cells was specifically increased after 12 months of treatment compared to before treatment in the atopic dermatitis patient group (IT (R)), which had a response after immunotherapy (Fig. 1a and 1b).

이를 통해 면역치료 시행 시 효과가 있는 아토피피부염 환자에서는 Treg 세포의 증가로 인하여 치료 반응성이 나타남을 확인하였으며, 면역치료의 치료 기작에 Treg 세포가 주요하게 관여되어 있음을 알 수 있었다.Through this, it was confirmed that treatment responsiveness appeared due to the increase of Treg cells in patients with atopic dermatitis, which is effective during immunotherapy, and it was confirmed that Treg cells are mainly involved in the treatment mechanism of immunotherapy.

면역치료 반응성에 따른 면역반응 관련 유전자의 발현 변화 Changes in expression of immune response-related genes according to immunotherapy responsiveness

치료 12개월 후, 종래의 치료제를 투여한 군(After CT)과 면역치료 반응성이 없는 군(After IT(NR))에 비해 면역치료 반응성이 있는 군(After IT (R))에서 Th1, Th2, Th17 및 Treg 세포 등 면역반응에 관여하는 유전자 발현의 변화를 확인하고자, 각 군의 혈액에서 PBMC를 채취한 후 FACS로 Treg 세포를 분리하였고, 여기서 추출한 RNA를 이용하여 마이크로어레이를 진행하였다.After 12 months of treatment, Th1, Th2, Th1, Th2, and In order to check the changes in the expression of genes involved in the immune response, such as Th17 and Treg cells, PBMCs were collected from the blood of each group, Treg cells were isolated by FACS, and microarray was performed using the extracted RNA.

RNA 마이크로어레이 시험 진행 후 각 군의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 열지도 분석을 시행하였고, 문헌조사를 통해 Th1, Th2, Th17 및 Treg 관련 유전자를 조사하였다. 열지도 분석은 다양한 정보를 색으로 표현하여 도면으로 나타내는 방법으로, 본 명세서에 기재한 열지도 분석에서는 빨간색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 커지는 것을 의미하고, 파란색으로 나타낼수록 유전자의 발현값이 작아지는 것을 의미한다.In order to confirm the difference in gene expression in each group after the RNA microarray test, heat map analysis was performed using the R 4.0.0 program, and Th1, Th2, Th17 and Treg-related genes were investigated through literature review. Heat map analysis is a method of expressing various information in colors and showing them in drawings. In the heat map analysis described in this specification, red means that the expression value of a gene increases, and the more it is displayed in blue, the less the expression value of a gene. means to lose

분석 결과, 치료 12개월 후 종래의 치료제를 투여한 군과 면역치료 반응성이 없는 군에 비해 면역치료 반응성이 있는 군에서 Th1, Th2 및 Th17 관련 유전자들의 발현이 파란색으로 감소되어 있음을 확인하였으며, Treg 세포 관련 유전자의 발현은 빨간색으로 매우 높아져 있음을 확인하였다(도 2). As a result of the analysis, it was confirmed that the expression of Th1, Th2 and Th17-related genes was reduced in blue in the group with immunotherapy responsiveness compared to the group administered with the conventional therapeutic agent and the group without immunotherapy responsiveness after 12 months of treatment. It was confirmed that the expression of cell-related genes was very high in red (FIG. 2).

이를 통해, 아토피피부염 환자에 면역치료 시행 시 Treg 세포 생성 및 이와 관련된 유전자의 발현이 증가하고, 이를 통해 아토피피부염 환자의 과도한 면역반응을 조절함으로써 증상을 호전시킴을 알 수 있었다.Through this, it was found that Treg cell generation and related gene expression were increased when immunotherapy was administered to atopic dermatitis patients, and through this, symptoms were improved by controlling the excessive immune response of atopic dermatitis patients.

시간 경과에 따른 Treg 세포 관련 유전자의 발현 변화 Changes in expression of Treg cell-related genes over time

본 발명자들은 치료 후 시간 경과에 따른 유전자 발현의 연속적인 변화를 확인하고자, 종래 치료제 투여 군(CT), 면역치료 반응성이 없는 군(SCIT (NR)) 및 면역치료 반응성이 있는 군(SCIT (R))의 혈액을 각각 치료 3개월 후, 9개월 후 및 12개월 후에 채취하여 PBMC를 수집한 후 FACS로 Treg 세포를 분리한 뒤 RNA 마이크로어레이를 진행하였다. RNA 마이크로어레이 진행 후 각 군의 유전자 발현 차이를 확인하기 위해, R 4.0.0 프로그램을 이용하여 열지도 분석을 시행하였고, 문헌조사를 통해 Treg 관련 유전자를 조사하여 분석하였다. In order to confirm the continuous change in gene expression over time after treatment, the present inventors have prepared a conventional treatment group (CT), a group without immunotherapy responsiveness (SCIT (NR)), and a group with immunotherapy responsiveness (SCIT (R) )) blood was collected 3 months, 9 months, and 12 months after treatment, respectively, and PBMCs were collected, Treg cells were isolated by FACS, and then RNA microarray was performed. To confirm the difference in gene expression in each group after RNA microarray, heat map analysis was performed using the R 4.0.0 program, and Treg-related genes were investigated and analyzed through literature search.

그 결과, 종래 치료제를 투여 군과 면역치료 반응성이 없는 군에서는 Treg 관련 유전자들의 유의한 변화나 연속적인 패턴이 확인되지 않은 반면, 면역치료 반응성이 있는 군에서는 치료 12개월 후의 시점으로 갈수록 Treg 관련 유전자의 발현이 현저히 증가하면서 열지도 상에서 빨간색의 빈도가 크게 늘어났다(도 3).As a result, no significant change or continuous pattern of Treg-related genes was confirmed in the group administered with the conventional treatment and the group not responsive to immunotherapy, whereas in the group with immunotherapy responsiveness, Treg-related genes increased as the time point after 12 months of treatment As the expression of was significantly increased, the frequency of red on the heat map increased significantly ( FIG. 3 ).

이를 통해, 면역치료 시행 시 증상에 호전이 있는 아토피피부염 환자의 경우 Treg 관련 유전자의 발현이 매우 증가하고, 이는 치료 12개월 이후부터 증가함을 확인하였다. 이를 통해 면역치료 기전에 Treg 세포가 매우 핵심적인 역할을 한다는 사실을 다시 한번 확인하였다.Through this, it was confirmed that, in the case of atopic dermatitis patients whose symptoms improved during immunotherapy, the expression of Treg-related genes was greatly increased, which increased after 12 months of treatment. Through this, it was confirmed once again that Treg cells play a very key role in the mechanism of immunotherapy.

바이오마커의 선정Selection of biomarkers

상기의 결과를 통해 면역치료의 기전에 있어 Treg 세포가 핵심 역할을 하며, 아토피피부염에 대한 면역치료는 12개월 이상 지속되어야 효과적임이 확인되었으나, 이러한 면역치료의 종료 시점을 결정하기 위한 바이오마커는 현재까지 개발된 바가 없다. 이에, 치료가 완료되었는지 여부의 표지자를 발굴하기 위해, 치료 12개월 후의 종래의 치료제를 투여한 군(CON) 및 면역치료 반응성이 있는 군(A.R)의 혈액에서 채취한 혈청을 이용하여 단백체 분석을 진행하였다. Through the above results, it was confirmed that Treg cells play a key role in the mechanism of immunotherapy and that immunotherapy for atopic dermatitis is effective only if it lasts for more than 12 months. has not been developed until now. Therefore, in order to discover a marker of whether or not treatment is complete, proteomic analysis was performed using serum collected from the blood of the group administered with the conventional treatment (CON) and the group with immunotherapy responsiveness (A.R) 12 months after treatment. proceeded.

그 결과, 치료 12개월 후 종래의 치료제를 투여한 군에 비해 면역치료 반응성이 있는 군의 혈청에서 아포지단백질-AIV(APO-AIV)의 발현이 3배 이상 높게 발현되어(도 4), APO-AIV 단백질이 아토피피부염의 발병 여부 및 환자의 면역치료 반응성을 예측할 수 있는 유용한 바이오마커임을 확인하였다.As a result, after 12 months of treatment, the expression of apolipoprotein-AIV (APO-AIV) in the serum of the immunotherapy responsive group was more than three times higher than in the group administered with the conventional therapeutic agent (FIG. 4), and APO- It was confirmed that the AIV protein is a useful biomarker that can predict the onset of atopic dermatitis and the patient's immunotherapy responsiveness.

면역치료 반응성에 따른 APO-AIV 단백질의 발현 변화 검증Verification of expression change of APO-AIV protein according to immunotherapy responsiveness

본 발명자들은 발굴된 바이오마커인 APO-AIV 단백질이 실제 면역치료 반응성이 있는 환자의 혈청에서 농도 변화가 있는지를 검증하고자, 치료 전(Pre-SCIT)과 치료 12개월 후(Post-SCIT)의 종래 치료제 투여군(CONn, 초록색), 면역치료 반응성이 없는 군(NRn, 파란색) 및 면역치료 반응성이 있는 군(Rn, 빨간색)의 혈액에서 채취한 혈청을 이용하여 APO-AIV ELISA 시험을 진행하였다(도 5). In order to verify whether there is a change in the concentration of the discovered biomarker, APO-AIV protein, in the serum of a patient with actual immunotherapy responsiveness, the present inventors conducted conventional methods before treatment (Pre-SCIT) and 12 months after treatment (Post-SCIT). The APO-AIV ELISA test was performed using serum collected from the blood of the treatment group (CONn, green), the group not responsive to immunotherapy (NRn, blue), and the group with immunotherapy responsiveness (Rn, red) (Fig. 5).

그 결과, 면역치료 반응성이 있는 군에서 치료 전에 비해 치료 12개월 후에 APO-AIV의 발현이 높아지는 경향을 나타냈고, 종래의 치료제 투여군이나 면역치료 반응성이 없는 군은 치료 전이나 치료 12개월 후에 APO-AIV의 발현이 뚜렷한 차이를 보이지 않았다.As a result, the expression of APO-AIV was higher after 12 months of treatment compared to before treatment in the immunotherapy responsive group, and the conventional treatment group or the non-immunotherapy unresponsive group showed a tendency to increase APO-AIV expression before or after 12 months of treatment. There was no significant difference in the expression of AIV.

이를 통해 APO-AIV 단백질이 아토피피부염의 호전을 확인하기에 유용한 바이오마커임을 검증하였고, 이를 이용하여 실제 면역치료를 시행하고 있는 아토피피부염 환자에서 치료의 종료시점을 결정하는 데에 중요한 단서를 제공할 수 있다.Through this, it was verified that the APO-AIV protein is a useful biomarker for confirming the improvement of atopic dermatitis, and using this, it will provide important clues in determining the end point of treatment in atopic dermatitis patients who are actually undergoing immunotherapy. can

APO-AIV 단백질이 Treg 세포 생존에 미치는 영향 Effect of APO-AIV protein on Treg cell survival

본 발명자들은 APO-AIV 단백질이 면역치료 기전에 중요한 역할을 하는 Treg 세포에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하고자, 아토피피부염 환자의 PBMC에서 분리된 Treg 세포에 APO-AIV 재조합 단백질 1 μg 및 5 μg을 각각 처리하여 48시간 동안 배양한 뒤 사멸된 세포를 특이적으로 염색하는 되는 eFluor™ 450으로 염색하였다.In order to determine how the APO-AIV protein affects Treg cells that play an important role in the immunotherapy mechanism, the present inventors applied 1 μg and 5 μg of APO-AIV recombinant protein to Treg cells isolated from PBMCs of patients with atopic dermatitis, respectively. After treatment and incubation for 48 hours, the dead cells were stained with eFluor™ 450, which specifically stains the cells.

도 6은 FACS를 통해 수득한 히스토그램으로 왼쪽의 피크는 살아있는 세포를, 오른쪽의 피크는 사멸한 세포를 각각 나타낸다. 도 6에서 보는 바와 같이, APO-AⅣ 처리하지 않은 음성대조군(CON)에서는 59.2%의 생존율을 보였고, APO-AⅣ 1 μg 및 5 μg을 처리한 군에서는 각각 66.7% 및 72.9%의 생존율을 보여, APO-AⅣ가 Treg 세포의 생존율을 증가시킴을 확인할 수 있었다. 6 is a histogram obtained through FACS. The peak on the left indicates live cells, and the peak on the right indicates dead cells, respectively. As shown in Figure 6, the APO-AIV untreated negative control group (CON) showed a survival rate of 59.2%, and the group treated with APO-AIV 1 μg and 5 μg showed a survival rate of 66.7% and 72.9%, respectively, It was confirmed that APO-AIV increased the survival rate of Treg cells.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the present invention, for those of ordinary skill in the art, this specific description is only a preferred embodiment, and it is clear that the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> A Novel Biomarker for Atopic Dermatitis <130> HPC-9471 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Leu 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gln Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Ser Thr Gln Ala Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 165 170 175 Ala Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe 195 200 205 Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Thr Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Thr Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile 245 250 255 Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu 260 265 270 Asp Val Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Lys Thr Leu 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Leu Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln 370 375 380 Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser 385 390 395 <210> 2 <211> 1471 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agttcccact gcagcgcagg tgagctctcc tgaggacctc tctgtcagct cccctgattg 60 tagggaggat ccagtgtggc aagaaactcc tccagcccag caagcagctc aggatgttcc 120 tgaaggccgt ggtcctgacc ctggccctgg tggctgtcgc cggagccagg gctgaggtca 180 gtgctgacca ggtggccacg gtgatgtggg actacttcag ccagctgagc aacaatgcca 240 aggaggccgt ggaacatctc cagaaatctg aactcaccca gcaactcaat gccctcttcc 300 aggacaaact tggagaagtg aacacttacg caggtgacct gcagaagaag ctggtgccct 360 ttgccaccga gctgcatgaa cgcctggcca aggactcgga gaaactgaag gaggagattg 420 ggaaggagct ggaggagctg agggcccggc tgctgcccca tgccaatgag gtgagccaga 480 agatcgggga caacctgcga gagcttcagc agcgcctgga gccctacgcg gaccagctgc 540 gcacccaggt cagcacgcag gccgagcagc tgcggcgcca gctgaccccc tacgcacagc 600 gcatggagag agtgctgcgg gagaacgccg acagcctgca ggcctcgctg aggccccacg 660 ccgacgagct caaggccaag atcgaccaga acgtggagga gctcaaggga cgccttacgc 720 cctacgctga cgaattcaaa gtcaagattg accagaccgt ggaggagctg cgccgcagcc 780 tggctcccta tgctcaggac acgcaggaga agctcaacca ccagcttgag ggcctgacct 840 tccagatgaa gaagaacgcc gaggagctca aggccaggat ctcggccagt gccgaggagc 900 tgcggcagag gctggcgccc ttggccgagg acgtgcgtgg caacctgagg ggcaacaccg 960 aggggctgca gaagtcactg gcagagctgg gtgggcacct ggaccagcag gtggaggagt 1020 tccgacgccg ggtggagccc tacggggaaa acttcaacaa agccctggtg cagcagatgg 1080 aacagctcag gcagaaactg ggcccccatg cgggggacgt ggaaggccac ttgagcttcc 1140 tggagaagga cctgagggac aaggtcaact ccttcttcag caccttcaag gagaaagaga 1200 gccaggacaa gactctctcc ctccctgagc tggagcaaca gcaggaacag cagcaggagc 1260 agcagcagga gcaggtgcag atgctggccc ctttggagag ctgagctgcc cctggtgcac 1320 tggccccacc ctcgtggaca cctgccctgc cctgccacct gtctgtctgt ctgtcccaaa 1380 gaagttctgg tatgaacttg aggacacatg tccagtggga ggtgagacca cctctcaata 1440 ttcaataaag ctgctgagaa tctagcctca a 1471 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> A Novel Biomarker for Atopic Dermatitis <130> HPC-9471 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Leu 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gln Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Ser Thr Gln Ala Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 165 170 175 Ala Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe 195 200 205 Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Thr Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Thr Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile 245 250 255 Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu 260 265 270 Asp Val Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Lys Thr Leu 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Leu Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln 370 375 380 Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser 385 390 395 <210> 2 <211> 1471 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agttcccact gcagcgcagg tgagctctcc tgaggacctc tctgtcagct cccctgattg 60 tagggaggat ccagtgtggc aagaaactcc tccagcccag caagcagctc aggatgttcc 120 tgaaggccgt ggtcctgacc ctggccctgg tggctgtcgc cggagccagg gctgaggtca 180 gtgctgacca ggtggccacg gtgatgtggg actacttcag ccagctgagc aacaatgcca 240 aggaggccgt ggaacatctc cagaaatctg aactcaccca gcaactcaat gccctcttcc 300 aggacaaact tggagaagtg aacacttacg caggtgacct gcagaagaag ctggtgccct 360 ttgccaccga gctgcatgaa cgcctggcca aggactcgga gaaactgaag gaggagattg 420 ggaaggagct ggaggagctg agggcccggc tgctgcccca tgccaatgag gtgagccaga 480 agatcgggga caacctgcga gagcttcagc agcgcctgga gccctacgcg gaccagctgc 540 gcacccaggt cagcaccgcag gccgagcagc tgcggcgcca gctgaccccc tacgcacagc 600 gcatggagag agtgctgcgg gagaacgccg acagcctgca ggcctcgctg aggccccacg 660 ccgacgagct caaggccaag atcgaccaga acgtggagga gctcaaggga cgccttacgc 720 cctacgctga cgaattcaaa gtcaagatg accagaccgt ggaggagctg cgccgcagcc 780 tggctcccta tgctcaggac acgcaggaga agctcaacca ccagcttgag ggcctgacct 840 tccagatgaa gaagaacgcc gaggagctca aggccaggat ctcggccagt gccgaggagc 900 tgcggcagag gctggcgccc ttggccgagg acgtgcgtgg caacctgagg ggcaacaccg 960 aggggctgca gaagtcactg gcagagctgg gtgggcacct ggaccagcag gtggaggagt 1020 tccgacgccg ggtggagccc tacggggaaa acttcaacaa agccctggtg cagcagatgg 1080 aacagctcag gcagaaactg ggcccccatg cgggggacgt ggaaggccac ttgagcttcc 1140 tggagaagga cctgagggac aaggtcaact ccttcttcag caccttcaag gagaaagaga 1200 gccaggacaa gactctctcc ctccctgagc tggagcaaca gcaggaacag cagcaggagc 1260 agcagcagga gcaggtgcag atgctggccc ctttggagag ctgagctgcc cctggtgcac 1320 tggccccacc ctcgtggaca cctgccctgc cctgccacct gtctgtctgt ctgtcccaaa 1380 gaagttctgg tatgaacttg aggacacatg tccagtggga ggtgagacca cctctcaata 1440 ttcaataaag ctgctgagaa tctagcctca a 1471

Claims

A composition for predicting responsiveness to immunotherapy in atopic dermatitis patients, comprising as an active ingredient apolipoprotein-AIV (APO-AIV) or an agent for measuring the expression level of a gene encoding the same.

The composition of claim 1, wherein the apolipoprotein-AIV has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

The composition according to claim 1, wherein the gene encoding the apolipoprotein-AIV has the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2.

According to claim 1, wherein the agent for measuring the expression level of the apolipoprotein-AIV is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the apolipoprotein-AIV; Or the apolipoprotein-a composition characterized in that it is an aptamer that specifically binds to AIV.

The composition according to claim 1, wherein the agent for measuring the expression level of the apolipoprotein-AIV-encoding gene is a primer or probe that specifically binds to the nucleic acid molecule of the gene.

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