KR102493640B1 - Peptide for diagnosis of Brucellosis and uses thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 브루셀라 감염증 진단용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드는 소 브루셀라병에 대한 음성 또는 양성 반응을 진단할 수 있고, 소 브루셀라병 유사 질병에 대해 교차면역반응성이 없으므로 브루셀라 감염증의 진단에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a peptide for diagnosing brucellosis infection and its use, wherein the GNU-B1 and GNU-B2 peptides of the present invention can diagnose a negative or positive reaction to bovine brucellosis, and cross-immunize against bovine brucellosis-like diseases Since it is not reactive, it will be useful for the diagnosis of brucellosis infection.

Description

브루셀라 감염증 진단용 펩타이드 및 이의 용도{Peptide for diagnosis of Brucellosis and uses thereof}Peptide for diagnosis of Brucellosis and uses thereof {Peptide for diagnosis of Brucellosis and uses thereof}

본 발명은 브루셀라 감염증 진단용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a peptide for diagnosing Brucella infection and its use.

브루셀라 감염증은 브루셀라균의 감염으로 발생되는 인수 공통 전염병으로 소 브루셀라균(Brucella abortus), 산양 브루셀라균(B. melitensis), 돼지 브루셀라균(B. suis) 등이 원인체이며, 국내에서는 브루셀라 어보투스가 높은 비율을 차지하는 것으로 알려져 있다. 브루셀라균에 감염된 가축의 경우 암컷의 생식기관과 태막(胎膜)에 염증을 수반하여 태반염, 자궁 내막염 등으로 인한 유산과 불임증이 유발될 수 있고, 수컷에서는 고환염, 기형 정자 등으로 인한 불임이 유발될 수 있다. 사람에게 브루셀라균이 감염되면 3주 정도의 잠복기를 거쳐 부정형의 발열, 피로, 권태감, 두통 등의 전신 증세가 나타난다. 우리나라에서도 사람에게 브루셀라병이 발생한 바 있으며 주로 경구 및 접촉 감염으로 전파되었고, 멸균처리하지 않은 유제품을 섭취하여 전염된 사례가 있다. 브루셀라병의 효과적인 치료법은 없고 백신 접종으로 예방이 가능하나, 일단 감염된 가축이 발견되면 법에 따라 도살처분해야 한다. 사람의 경우 테트라사이클린(tetracycline), 스트렙토마이신(streptomycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 등이 쓰일 수 있으나, 약제 투여를 중지하면 재발 가능성이 높고 내균성이 나타나기 때문에 치료가 쉽지 않다. 치사율은 2% 이하이지만 치료하지 않고 방치할 경우에는 척추염, 골수염 등이 유발될 수 있다.Brucella infection is a zoonotic infectious disease caused by infection with Brucella, which is caused by bovine Brucella ( Brucella abortus ), goat Brucella ( B. melitensis ), and pig Brucella ( B. suis ). It is known that a high percentage of In the case of cattle infected with Brucella, inflammation of the reproductive organs and fetal membranes of females may occur, resulting in miscarriage and infertility due to placenta, endometritis, etc., and infertility due to orchitis and deformed sperm in males. can be induced When a person is infected with Brucella bacteria, after an incubation period of about 3 weeks, systemic symptoms such as irregular fever, fatigue, malaise, and headache appear. In Korea, brucellosis has occurred in humans, and it is mainly transmitted by oral and contact infection, and there are cases of transmission by ingestion of unsterilized dairy products. There is no effective treatment for brucellosis and it can be prevented by vaccination, but once infected livestock are found, they must be slaughtered according to the law. In the case of humans, tetracycline, streptomycin, chloramphenicol, etc. can be used, but treatment is not easy because the possibility of recurrence is high and resistance to bacteria appears when drug administration is stopped. The mortality rate is less than 2%, but if left untreated, spondylitis and osteomyelitis can occur.

소에서 브루셀라 감염증이 발병된 경우 소의 신체 각 부위(특히 간, 비장, 임파절, 혈액 등)에서 브루셀라균이 높은 농도로 존재하게 되며, 우리나라의 식문화 특성상 육회, 간, 비장, 위 등을 날것으로 섭취하는 경향이 높아 브루셀라균에 대하여 심각하게 노출될 수 있으므로, 이에 대한 국가적 대책 마련이 시급한 실정이다. 그러나, 브루셀라균에 감염된 소에서는 특별한 증상이 나타나지 않아 장기간 동안 보균우로 유지하면서 지속적으로 브루셀라균을 외부로 배출하기 때문에 조기진단에 어려움이 있을 뿐만 아니라, 브루셀라균의 세포 내 탐식 기전 및 세포 내 증식 기전에 대한 연구결과가 많지 않아 상기 질환의 근절이 어렵다는 문제가 있다. 또한, 브루셀라균이 체내에 감염된 경우에도 면역원성이 낮아서 면역세포가 형성되기 어렵기 때문에 백신 개발에 대한 연구도 성과가 미미한 실정이다. In case of brucellosis infection in a cow, high concentrations of brucellosis are present in each part of the cow's body (especially liver, spleen, lymph node, blood, etc.), and raw meat, liver, spleen, stomach, etc. Since there is a high tendency to be exposed to brucellosis, it is urgent to prepare national countermeasures for this. However, cows infected with Brucella do not show any specific symptoms, so they are maintained as carriers for a long period of time and continuously discharge Brucella to the outside, making it difficult to diagnose early. There are not many research results on it, so there is a problem that it is difficult to eradicate the disease. In addition, even when Brucella is infected in the body, immunogenicity is low, so it is difficult to form immune cells, so research on vaccine development is also insignificant.

한편, 한국등록특허 제1795784호에 '브루셀라 어보투스 균주 유래의 다중 재조합 외막단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 조성물 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2020-0004500호에 '브루셀라 어보투스 유래의 재조합 Ohr 단백질을 유효성분으로 포함하는 브루셀라 감염증 진단용 조성물 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 브루셀라 감염증 진단용 펩타이드 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.On the other hand, Korean Patent No. 1795784 discloses 'a composition for diagnosis of Brucellosis infection containing multiple recombinant outer membrane proteins derived from a Brucella abotus strain as an active ingredient and its use', and Korean Patent Publication No. 2020-0004500 discloses 'Brussels disease A composition for diagnosing brucellosis infection containing a recombinant Ohr protein derived from Abbotus as an active ingredient and its use' has been disclosed, but the peptide for diagnosing brucellosis infection and its use have not been described.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 브루셀라 감염증에 대해 음성(negative) 또는 양성(positive) 반응을 보이는 소 혈청 시료 간에 뚜렷한 함량 차이를 보이는 대사물질 GNU-1 내지 GNU-10을 분리한 후, 상기 대사물질들이 브루셀라 감염증에서 음성 반응을 보이는 소 혈청 시료 보다 양성 반응을 나타내는 소 혈청 시료에서 높은 함량으로 존재하는 것을 확인하였고, 기존의 브루셀라병 혈청학적 진단법으로 사용되고 있는 STAT, C-ELISA 또는 I-ELISA에 비해 브루셀라 감염에 대한 음성 또는 양성 반응을 더 효율적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 대사물질 중 GNU-5, GNU-7 및 GNU-10은 1,596 kDa의 단일 펩타이드에서 유래된 물질이고, GNU-3, GNU-6 및 GNU-9는 1.509 kDa의 단일 펩타이드에서 유래된 물질임을 확인한 후 상기 단일 펩타이드를 각각 GNU-B1 및 GNU-B2로 분리·동정하였고, 상기 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드가 소 브루셀라병과 유사한 병증을 유발하는 결핵균(Mycobacterium bovis), 대장균(E. coli) 및 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica 09) 병원균과의 교차면역반응성이 없음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above needs, and the inventors of the present invention found metabolites GNU-1 to GNU-10 that showed a clear difference in content between bovine serum samples that showed a negative or positive reaction to Brucellosis infection. After isolating, it was confirmed that the above metabolites were present in a higher content in bovine serum samples positive than in bovine serum samples negative in brucellosis infection, and STAT, C, which are used as conventional brucellosis serological diagnostic methods - It was confirmed that a negative or positive reaction to Brucella infection could be diagnosed more efficiently than ELISA or I-ELISA. In addition, among the above metabolites, GNU-5, GNU-7 and GNU-10 are substances derived from a single peptide of 1,596 kDa, and GNU-3, GNU-6 and GNU-9 are substances derived from a single peptide of 1.509 kDa After confirming that the single peptide was isolated and identified as GNU-B1 and GNU-B2, respectively, the GNU-B1 and GNU-B2 peptides caused symptoms similar to bovine brucellosis, Mycobacterium bovis , E. coli ) and Yersinia enterocolitica ( Yersinia enterocolitica 09) By confirming that there is no cross-immunoreactivity with the pathogen, the present invention was completed.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 GNU-B1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 브루셀라 감염증(Brucellosis) 진단용 조성물을 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention is for diagnosis of Brucellosis infection (Brucellosis) comprising an agent for measuring the expression level of the GNU-B1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the GNU-B2 peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 composition is provided.

또한, 본 발명은 (1) 브루셀라 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 측정된 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준보다 높을 경우에 브루셀라 감염증으로 판단하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 감염증을 진단하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes (1) measuring the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in a biological sample isolated from an individual suspected of being infected with Brucella; (2) comparing the measured expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide with the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in a normal control sample; and (3) judging as Brucella infection when the measured expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide is higher than the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in the normal control sample. Provides methods for diagnosing infections.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 GNU-B1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GNU-B2 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 브루셀라 감염증 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for diagnosing brucellosis infection containing GNU-B1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or GNU-B2 peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.

본 발명의 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드는 소 브루셀라병에 대한 음성 또는 양성 반응을 진단할 수 있고, 소 브루셀라병 유사 질병에 대해 교차면역반응성이 없으므로 브루셀라 감염증의 진단에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.The GNU-B1 and GNU-B2 peptides of the present invention can diagnose negative or positive reactions to bovine brucellosis, and have no cross-immunoreactivity to bovine brucellosis-like diseases, so they can be usefully used in the diagnosis of brucellosis infection. will be.

도 1A는 브루셀라 감염증에 대해 음성(negative) 또는 양성(positive) 반응을 보이는 소 혈청의 추출물을 대상으로 UPLC-Q-TOF MS(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry) 분석을 수행한 결과이고, 도 1B는 상기 MS 데이터를 다변량 통계분석(multivariate statistical analysis)하여 시각화한 PLS-DA(Partial least squares discriminant analysis) 스코어 플롯이다. 도 1A에서 빨간색 네모는 소의 혈청 내 대사물질 GNU-1 내지 GNU-10을 의미한다.
도 2 및 도 3은 브루셀라 감염증에 대해 음성(negative, NEG) 또는 양성(positive, POS) 반응을 보이는 소 혈청의 추출물을 대상으로 UPLC-Q-TOF-MS를 수행하여 얻어진 크로마토그램에서 GNU-1 내지 GNU-10의 피크(peak) 강도(intensity)를 나타낸 막대 그래프(도 2) 및 박스 플롯(box plot; 도 3)이다.
도 4는 브루셀라 감염증에 대해 음성 또는 양성 반응을 보이는 소 혈청의 추출물을 대상으로 UPLC-Q-TOF-MS 분석을 수행하여, 브루셀라 음성군 또는 양성군 간에 뚜렷한 함량 차이를 보이는 GNU-1 내지 GNU-10의 질량 대 전하의 비(m/z)를 측정한 결과이다.
도 5는 브루셀라 감염증에 대해 음성 또는 양성 반응을 보이는 소의 혈청 내 대사물질 GNU-2, GNU-3, GNU-4, GNU-5, GNU-6, GNU-7, GNU-8 및 GNU-10의 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 후보 지표물질(GNU-4, GNU-5, GNU-7, GNU-8 및 GNU-10) 함량 측정 방법과 종래의 브루셀라 감염증 진단방법인 RBT(Rose-bengal test), STAT(Standard tube agglutination test), C-ELISA(competitive-enzyme linked immunosorbent assay) 및 I-ELISA(Indirect--ELISA)을 수행한 결과이다. +: 양성 반응, -: 음성반응.
도 7은 소 혈청 추출물을 이용하여 TOF MS 분석을 통해 펩타이드 피크를 확인한 후 펩타이드 질량 데이터를 이용하여 De novo 시퀀싱을 수행을 통해 GNU-B1(A) 및 GNU-B2(B) 펩타이드를 동정한 결과이다. A는 각각 4가, 3가, 2가 전하를 띤 분자량 1,596 kDa의 GNU-5, GNU-7 및 GNU-10로부터 동정 및 합성된 GNU-B1 펩타이드이고, B는 각각 4가, 3가, 2가 전하를 띤 분자량 1,509 kDa의 GNU-3, GNU-6 및 GNU-9로부터 동정 및 합성된 GNU-B2 펩타이드이다.
도 8은 합성된 GNU-B1 펩타이드(standard)와 소 혈청 시료(serum sample)를 이용하여 UPLC-Q-TOF MS를 수행한 결과이다.
도 9는 브루셀라(Brucella abortus), 결핵(Mycobacterium bovis), 대장균(E. coli) 또는 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica 09)에 감염된 소 혈청을 대상으로 본 발명의 GNU-B1 및 B2 펩타이드의 함량(intensity)을 측정하여 교차반응성을 평가한 결과이다. Figure 1A is a UPLC-Q-TOF MS (ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry) analysis of extracts of bovine serum negative or positive for brucellosis infection. , and FIG. 1B is a partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) score plot visualized by performing multivariate statistical analysis on the MS data. In Fig. 1A, red squares indicate metabolites GNU-1 to GNU-10 in bovine serum.
2 and 3 show GNU-1 in chromatograms obtained by performing UPLC-Q-TOF-MS on extracts of bovine serum showing negative (NEG) or positive (POS) reactions for Brucellosis infection. to GNU-10.
Figure 4 is a UPLC-Q-TOF-MS analysis of extracts of bovine serum negative or positive for Brucellosis infection, and GNU-1 to GNU-10 showing a clear difference in content between the Brucella negative and positive groups. This is the result of measuring the mass-to-charge ratio (m/z) of
Figure 5 shows the metabolites GNU-2, GNU-3, GNU-4, GNU-5, GNU-6, GNU-7, GNU-8 and GNU-10 in the serum of cattle showing negative or positive reactions to Brucellosis infection. This is the result of measuring the content.
Figure 6 shows the method for measuring the content of candidate indicators (GNU-4, GNU-5, GNU-7, GNU-8 and GNU-10) of the present invention and the conventional method for diagnosing brucellosis infection, RBT (Rose-bengal test), STAT (Standard tube agglutination test), C-ELISA (competitive-enzyme linked immunosorbent assay), and I-ELISA (Indirect-ELISA) results. +: Positive reaction, -: Negative reaction.
7 is a result of identifying the GNU-B1 (A) and GNU-B2 (B) peptides by performing de novo sequencing using the peptide mass data after confirming the peptide peak through TOF MS analysis using bovine serum extract am. A is a GNU-B1 peptide identified and synthesized from GNU-5, GNU-7 and GNU-10 with a molecular weight of 1,596 kDa with tetravalent, trivalent and divalent charges, respectively, and B is tetravalent, trivalent and divalent, respectively is a GNU-B2 peptide identified and synthesized from GNU-3, GNU-6 and GNU-9 with a molecular weight of 1,509 kDa and a charge of .
8 is a result of performing UPLC-Q-TOF MS using the synthesized GNU-B1 peptide (standard) and bovine serum sample.
Figure 9 is Brucella ( Brucella abortus ), tuberculosis ( Mycobacterium bovis ), Escherichia coli ( E. coli ) Alternatively, the cross-reactivity was evaluated by measuring the intensity of the GNU-B1 and B2 peptides of the present invention in bovine serum infected with Yersinia enterocolitica 09.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 GNU-B1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 브루셀라 감염증(Brucellosis) 진단용 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention is a method for determining the expression level of GNU-B1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or GNU-B2 peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; ) provides a composition for diagnosis.

본 발명에서, 용어 '브루셀라 감염증'은 다양한 브루셀라균의 감염에 의하여 발병되는 전염병을 의미하며, 용어 '진단(diagnosis)'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 브루셀라 감염증의 발병 여부를 확인하는 것이다.In the present invention, the term 'brucellosis infection' means an infectious disease caused by infection with various brucellosis bacteria, and the term 'diagnosis' means confirming the presence or characteristics of a pathological state. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether a brucellosis infection has occurred.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 브루셀라 감염증은 브루셀라 아보투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(B. melitensis), 브루셀라 카니스(B. canis), 브루셀라 오비스(B. ovis), 브루셀라 수이스(B. suis) 또는 브루셀라 핀니페디알리스(B. pinnipedialis) 균주에 의해 유발되는 것일 수 있고, 바람직하게는 브루셀라 아보투스에 의해 유발되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the composition of the present invention, the brucellosis infection is Brucella abortus ( Brucella abortus ), Brucella melitensis ( B. melitensis ), Brucella canis ( B. canis ), Brucella ovis ( B. ovis ), Brucella suis ( B. suis ) or Brucella pinnipedialis ( B. pinnipedialis ) It may be caused by a strain, preferably it may be caused by Brucella abotus, but is not limited thereto.

본 발명에서 '단백질의 발현 수준 측정'은, 브루셀라 감염증 진단을 위해 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서의 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 정도를 확인하는 과정으로, 이를 위한 분석 방법으로는 질량 분석법(Mass spectrometry), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 웨스턴 블랏(Western blot), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, 'measurement of protein expression level' is a process of confirming the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in a biological sample isolated from a suspected subject for diagnosis of Brucellosis infection. Mass spectrometry, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), Western blot, Radioimmunoassay (RIA), Radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion method, rocket ) immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) and protein chip, but are not limited thereto.

본 발명에서 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머일 수 있다.In the present invention, the agent for measuring the expression level of the peptide is not limited thereto, but preferably may be an antibody or an aptamer specifically binding to the GNU-B1 or GNU-B2 peptide.

본 발명에서, 용어 '항체'는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드 코딩 유전자의 전장 혹은 일부를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드 코딩 유전자의 전장 혹은 일부에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질을 면역원(항원)으로 사용하여 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 기능적인 단편도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 ScFv 등이 있다.In the present invention, the term 'antibody' is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to the GNU-B1 or GNU-B2 peptide of the present invention, and such an antibody contains the full length or part of the gene encoding the GNU-B1 or GNU-B2 peptide. Cloning into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the full length or part of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide coding gene, and using the obtained protein as an immunogen (antigen) to prepare by a conventional method can The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, or functional fragments having antigen-binding properties are also included in the antibodies of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included. Functional fragments of the antibody molecule refer to fragments having at least an antigen-binding function, and include Fab, F(ab'), F(ab')2, and ScFv.

본 발명에서, 용어 '압타머(aptamer)'는 안정된 삼차구조를 유지하면서 특정 분자에 특이적으로 강하게 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 특이적 결합을 하는 기능 때문에 항체와 비교되며 항체의 대체 기술로 평가되고 있다.In the present invention, the term 'aptamer' refers to a nucleic acid that can specifically and strongly bind to a specific molecule while maintaining a stable tertiary structure. Because of its specific binding function, it is compared with antibodies and is being evaluated as an alternative technology for antibodies.

본 발명은 또한, The present invention also

(1) 브루셀라 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 단계;(1) measuring the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in a biological sample isolated from an individual suspected of being infected with Brucella;

(2) 상기 측정된 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (2) comparing the measured expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide with the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in a normal control sample; and

(3) 상기 측정된 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준보다 높을 경우에 브루셀라 감염증으로 판단하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 감염증을 진단하는 방법을 제공한다.(3) determining that it is a brucellosis infection when the measured expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide is higher than the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in the normal control sample; provides a method for diagnosing

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, the GNU-B1 and GNU-B2 peptides may consist of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively, but are not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료로부터 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 방법으로는, 질량 분석법, 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이 또는 전자현미경법(electron microscopy) 등일 수 있고, 바람직하게는 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS) 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, as a method for measuring the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide from the biological sample, mass spectrometry, protein chip, immunoprecipitation, microarray or electron microscopy ( electron microscopy) and the like, and preferably may be a liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) method, but is not limited thereto.

본 발명에서, 용어 '생물학적 시료'란 혈청, 혈장, 뇨, 흉수 또는 타액와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 상기 생물학적 시료는 조작하거나 조작하지 않은 상태로 사용될 수 있다.In the present invention, the term 'biological sample' includes samples such as serum, plasma, urine, pleural fluid or saliva, but is not limited thereto, and the biological samples may be used with or without manipulation.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 GNU-B1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 GNU-B2 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 브루셀라 감염증 진단용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for diagnosing brucellosis infection containing GNU-B1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or GNU-B2 peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described in detail. However, the following examples are only to illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.

재료 및 방법Materials and Methods

1. 소 혈청 및 물질 추출1. Bovine Serum and Material Extraction

브루셀라 감염증에 대해 음성(negative) 또는 양성(positive) 반응을 나타내는 소의 혈청을 농림축산검역본부에서 제공받아 실험에 사용하였다. 소 혈청 200 ㎕에 차가운 메탄올 400 ㎕를 혼합한 후 4℃에서 30분간 방치한 후 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 수득하여 소 혈청 추출물로 사용하였다. Serum of cattle showing a negative or positive reaction to Brucella infection was provided by the Agriculture, Forestry and Livestock Quarantine Service and used in the experiment. 200 μl of bovine serum was mixed with 400 μl of cold methanol, left at 4° C. for 30 minutes, centrifuged at 14,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was obtained and used as a bovine serum extract.

2. 대사체 분석2. Metabolome analysis

소 혈청 추출물은 Waters Acquity UPLC-Q-TOF-MS(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry)를 이용하여 분석하였다. 구체적으로 추출물은 BioResolveTM RP mAb Polyphenyl 컬럼(450Å, 2.1 mm×100 mm, 2.7 im; Waters)에 주입하였으며 이동상은 0.1% 포름산(formic acid)을 함유하고 있는 물(A)과 0.1% 포름산을 함유하고 있는 아세토나이트릴(acetonitrile, B)로 유속은 0.4 mL/min이며 컬럼온도는 40℃이다. 컬럼으로 통과하여 나온 용리제(eluent)는 ESI(positive electrospray ionization) 모드를 갖고 있는 Q-TOF MS로 분석하였다. TOF MS 데이터의 스캔 범위(scan range)는 100~4,000 m/z(질량 대 전하비), 스캔 시간(scan time)은 0.2 s, 모세관(capillary)과 샘플의 콘 전압(sampling cone voltages)은 3 kV와 30 V, 탈용매화 유속(desolvation flow rate)은 800 L/h, desolvation 온도는 400℃, source 온도는 100℃이다. 로이신-엔케팔린(Leucine-enkephalin [M+H] = 556.2771)은 록 매스(lock mass)를 위한 표준 물질(reference compound)로 사용되었으며 10 s 당 분석되었다. 모든 시료들을 혼합하여 만들어진 QC(quality control) 시료는 매 5개 분석하였다. MS/MS 스펙트라는 collision energy ramp(10 to 30 eV), m/z 100-4,000 조건하에서 얻었다. m/z, 보유 시간(retention time), 이온 신호세기(ion intensity)를 포함하는 질량 분석 데이터(mass spectrometry data) 프로세싱은 MakerLynx software (Waters)을 사용하여 진행하였다. UPLC-Q-TOF MS를 이용하여 얻어진 LC-MS data의 collection, normalization, alignment는 UNIFI version 1.8.2 프로그램(Waters)을 이용하여 진행하였다. Peak-to-peak baseline noise (1), noise elimination (6), peak-width(5% height of 1 s), intensity threshold(10,000)를 이용하여 피크를 얻었으며 mass window(0.05 Da)와 retention time window(0.2 min)를 이용하여 대사체 데이터(tabolite data)를 정렬하였다. 모든 데이터는 표준물질을 이용하여 정규화하였다. 대사물질들은 UNIFI version 1.8.2.169(Waters), ChemSpider(www.chemspider.com), human metabolome databases(www.hmdb.ca), METLIN database(metlin.scripps.edu)을 사용하여 동정하였다. SIMCA-P+ version 12.0.1(Umetrics, Umea, Sweden)는 UNIFI를 통해 프로세싱된 LC/MS 데이터의 통계분석을 위해 사용되었다. 특히 PLS-DA(Partial least squares discriminant analysis)는 분석한 결과를 시각화하기 위하여 사용되었다. Bovine serum extracts were analyzed using Waters Acquity UPLC-Q-TOF-MS (ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry). Specifically, the extract was injected into a BioResolve TM RP mAb Polyphenyl column (450Å, 2.1 mm × 100 mm, 2.7 im; Waters), and the mobile phase was water (A) containing 0.1% formic acid and 0.1% formic acid. The flow rate is 0.4 mL/min with acetonitrile (B), and the column temperature is 40 °C. The eluent passed through the column was analyzed by Q-TOF MS with positive electrospray ionization (ESI) mode. The scan range of the TOF MS data was 100 to 4,000 m/z (mass-to-charge ratio), the scan time was 0.2 s, and the sampling cone voltages of the capillary and sample were 3 kV and 30 V, the desolvation flow rate is 800 L/h, the desolvation temperature is 400 °C, and the source temperature is 100 °C. Leucine-enkephalin (M+H] = 556.2771) was used as a reference compound for the lock mass and was analyzed per 10 s. QC (quality control) samples made by mixing all samples were analyzed every 5 samples. MS/MS spectra were obtained under conditions of collision energy ramp (10 to 30 eV) and m/z 100-4,000. Processing of mass spectrometry data including m/z, retention time, and ion intensity was performed using MakerLynx software (Waters). Collection, normalization, and alignment of LC-MS data obtained using UPLC-Q-TOF MS were performed using the UNIFI version 1.8.2 program (Waters). Peaks were obtained using peak-to-peak baseline noise (1), noise elimination (6), peak-width (5% height of 1 s), intensity threshold (10,000), and mass window (0.05 Da) and retention time Metabolite data were aligned using window (0.2 min). All data were normalized using standards. Metabolites were identified using UNIFI version 1.8.2.169 (Waters), ChemSpider (www.chemspider.com), human metabolome databases (www.hmdb.ca), and METLIN database (metlin.scripps.edu). SIMCA-P+ version 12.0.1 (Umetrics, Umea, Sweden) was used for statistical analysis of LC/MS data processed through UNIFI. In particular, PLS-DA (Partial least squares discriminant analysis) was used to visualize the analyzed results.

3. 펩타이드 드 노보 시퀀싱(3. Peptide de novo sequencing ( de novo de novo sequencing)sequencing)

펩타이드 de novo sequencing을 위해 소 혈청 추출물을 대상으로 위에서 언급한 UPLC-Xevo-Q-TOF MS(CID mode) 방법 및 UPLC-SYNAPT G2-Si-Q-TOF MS(ETD mode) 방법을 이용하여 펩타이드 피크(peptide peak)를 확보하였다. TOF MS 분석 조건은 위에서 언급한 대사체 분석 조건과 유사하며 다음 조건만 다르다. 사용한 컬럼은 ACQUITY® BEH300 C18 Column(1.7 νm, 2.1×100 mm)이며 TOF MS 데이터의 scan range는 50-15000 m/z, scan time은 0.2 s, capillary와 sampling cone voltages는 2.5 kV와 40 V, desolvation flow rate은 800 L/h, cone gas flow는 50L/h, desolvation 온도는 600°C, source 온도는 120℃이다. MS 데이터는 MassLynx를 이용하여 펩타이드 Mass data를 수집하였으며 펩타이드 de novo 시퀀싱은 BioLynx를 사용하여 수행하였다. Peptide peak using the UPLC-Xevo-Q-TOF MS (CID mode) method and UPLC-SYNAPT G2-Si-Q-TOF MS (ETD mode) method mentioned above for bovine serum extract for peptide de novo sequencing (peptide peak) was obtained. The TOF MS analysis conditions are similar to the above-mentioned metabolomic analysis conditions, with only the following conditions being different. The column used was ACQUITY ® BEH300 C18 Column (1.7 νm, 2.1×100 mm), the scan range of TOF MS data was 50-15000 m/z, the scan time was 0.2 s, the capillary and sampling cone voltages were 2.5 kV and 40 V, The desolvation flow rate is 800 L/h, the cone gas flow is 50 L/h, the desolvation temperature is 600°C, and the source temperature is 120°C. For MS data, peptide mass data was collected using MassLynx, and peptide de novo sequencing was performed using BioLynx.

4. 펩타이드 합성 및 확인4. Peptide Synthesis and Identification

펩타이드 합성은 펩트론에 의뢰하여 수행하였으며, 합성된 펩타이드는 상기 UPLC-Q-TOF MS 조건으로 분석하여 mass spectrum, retention time, spike test를 이용하여 확인하였다.Peptide synthesis was performed by requesting Peptron, and the synthesized peptide was analyzed under the above UPLC-Q-TOF MS conditions and confirmed using mass spectrum, retention time, and spike test.

실시예 1. 소 혈청 유래 대사체 분석Example 1. Analysis of metabolites derived from bovine serum

브루셀라 감염증에 대해 음성(negative) 또는 양성(positive) 반응을 보이는 소 혈청의 추출물을 대상으로 UPLC-Q-TOF MS로 블라인드 테스트한 후 상기 MS 데이터(도 1A)를 다변량 통계분석(multivariate statistical analysis)하여 나타낸 PLS-DA 스코어 스캐터 플롯 상에서 음성 실험군과 양성 실험군 간의 대사 물질의 함량을 확인한 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이 t(1)과 t(2)를 기준으로 음성군과 양성군 간의 대사 물질이 뚜렷하게 구별되는 것을 확인하였다. 상기 분석된 대사 물질들 중에서 브루셀라 감염증의 음성군과 양성군 간에 뚜렷한 차이를 보이는 10개의 후보 지표물질을 선별하여 각각 GNU-1 내지 GNU-10으로 명명하였다.After a blind test with UPLC-Q-TOF MS for extracts of bovine serum showing a negative or positive reaction to Brucella infection, the MS data (Fig. 1A) was subjected to multivariate statistical analysis As a result of confirming the content of metabolites between the negative and positive experimental groups on the PLS-DA score scatter plot shown by, as shown in FIG. 1B, the metabolites between the negative and positive groups based on t (1) and t (2) It was confirmed that they were clearly differentiated. Among the analyzed metabolites, 10 candidate markers showing clear differences between the negative and positive groups of brucellosis infection were selected and named as GNU-1 to GNU-10, respectively.

또한, 브루셀라 감염증에 대해 음성 또는 양성 반응을 보이는 소 혈청의 추출물 내 GNU-1 내지 GNU-10의 함량을 측정한 결과, 평균적으로 음성 시료에 비해 양성 시료에서 GNU-1 내지 GNU-10의 함량이 더 높게 나타났으며, 특히 GNU-4, GNU-5, GNU-7, GNU-8 및 GNU-10은 브루셀라 음성 시료에 비해 양성 시료에서 약 10배 이상의 높은 함량을 보여 브루셀라 감염증의 지표물질로 사용될 수 있을 것으로 예상되었다(도 2 및 도 3). In addition, as a result of measuring the contents of GNU-1 to GNU-10 in the extracts of bovine serum negative or positive for brucellosis, the content of GNU-1 to GNU-10 in positive samples was on average higher than that in negative samples. In particular, GNU-4, GNU-5, GNU-7, GNU-8, and GNU-10 showed about 10 times higher content in positive samples than in negative Brucellosis samples, which can be used as indicators of Brucellosis infection. It was expected to be possible (Figs. 2 and 3).

또한, 상기 GNU-1 내지 GNU-10의 m/z(질량 대 전하비)를 분석한 결과, GNU-1은 m/z 369, GNU-2은 m/z 373, GNU-3은 m/z 378, GNU-4은 m/z 391, GNU-5은 m/z 399, GNU-6은 m/z 503, GNU-7은 m/z 532, GNU-8은 m/z 561, GNU-9은 m/z 755, GNU-10은 m/z 798인 것으로 확인되었다(도 4).In addition, as a result of analyzing the m/z (mass-to-charge ratio) of GNU-1 to GNU-10, GNU-1 has m/z 369, GNU-2 has m/z 373, and GNU-3 has m/z 378, GNU-4 is m/z 391, GNU-5 is m/z 399, GNU-6 is m/z 503, GNU-7 is m/z 532, GNU-8 is m/z 561, GNU-9 was confirmed to be m/z 755, and m/z 798 for GNU-10 (FIG. 4).

실시예 2. 브루셀라 감염증 진단을 위한 후보 지표물질을 이용한 브루셀라 감염증에 대한 음성 및 양성 반응 분석Example 2. Analysis of negative and positive reactions for brucellosis infection using candidate markers for diagnosis of brucellosis infection

브루셀라 음성 또는 양성을 보이는 소 혈청의 추출물을 대상으로 후보 지표물질의 함량을 측정한 결과, 음성 시료에 비해 양성 시료에서 후보 물질의 함량이 현저히 높음을 확인하였고, 특히 대부분의 양성 시료에서 GNU-2(m/z 373), GNU-3(m/z 378), GNU-4(m/z 391), GNU-5(m/z 399), GNU-6(m/z 503) 및 GNU-7(m/z 532)의 함량은 음성 시료 보다 약 2배 이상인 것을 확인하였다(도 5). As a result of measuring the content of candidate marker substances in extracts of bovine serum showing negative or positive Brucellosis, it was confirmed that the content of the candidate marker substance was significantly higher in the positive samples than in the negative samples. In particular, in most of the positive samples, GNU-2 (m/z 373), GNU-3 (m/z 378), GNU-4 (m/z 391), GNU-5 (m/z 399), GNU-6 (m/z 503) and GNU-7 (m/z 532) was confirmed to be about twice as high as that of the negative sample (FIG. 5).

실시예 3. 기존의 브루셀라 감염증 진단 방법과의 비교Example 3. Comparison with existing methods for diagnosing brucellosis infection

기존 브루셀라병 혈청학적 진단법에는 1차 검사법으로 RBT 등이 이용되고 있고, 2차 검사법으로 STAT 또는 ELISA 등이 이용되고 있다(Korean J Vet Serv, 2013, 35(4), 269-273). 이에 본 발명에서는 브루셀라 감염증에 대해 음성 또는 양성을 나타내는 소 혈청을 대상으로 RBT(Rose-bengal test), STAT(Standard tube agglutination test), C-ELISA(competitive-enzyme linked immunosorbent assay) 및 I-ELISA(Indirect--ELISA)를 수행하였고, 각 시료에서 본 발명의 후보 지표물질(GNU-4, GNU-5, GNU-7, GNU-8 및 GNU-10)의 함량을 측정하였다.In existing brucellosis serological diagnosis methods, RBT and the like are used as a primary test method, and STAT or ELISA are used as a secondary test method ( Korean J Vet Serv , 2013, 35(4), 269-273). Accordingly, in the present invention, RBT (Rose-bengal test), STAT (Standard tube agglutination test), C-ELISA (competitive-enzyme linked immunosorbent assay) and I-ELISA ( Indirect--ELISA) was performed, and the contents of candidate indicators (GNU-4, GNU-5, GNU-7, GNU-8 and GNU-10) of the present invention were measured in each sample.

그 결과, RBT 방법을 이용한 경우에는 브루셀라 감염증의 음성 또는 양성 시료를 정확하게 진단할 수 있었으나, STAT 또는 ELISA 방법을 이용한 경우에는 일부 양성 시료에서 정확하게 진단되지 않음을 확인하였다. 반면, 본 발명의 후보 지표물질들은 브루셀라 감염증의 음성 시료에 비해 모든 양성 시료에서 현저히 높은 함량을 나타냄으로써, 기존 진단방법으로도 진단하지 못하였던 양성 시료도 정확하게 판별할 수 있음을 확인하였다(도 6). 이를 통해, 본 발명의 후보 지표물질들이 기존의 브루셀라 감염증 진단방법에 비해 더 효율적으로 브루셀라 감염증을 진단하기 위해 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.As a result, it was confirmed that negative or positive samples of brucellosis could be accurately diagnosed when the RBT method was used, but not accurately diagnosed in some positive samples when the STAT or ELISA method was used. On the other hand, the candidate indicators of the present invention showed a significantly higher content in all positive samples than in the negative samples for brucellosis infection, confirming that even positive samples that could not be diagnosed with the existing diagnostic method could be accurately identified (FIG. 6). ). Through this, it was expected that the candidate indicators of the present invention could be used to diagnose brucellosis infection more efficiently than conventional methods for diagnosing brucellosis infection.

실시예 4. 브루셀라 감염증 진단을 위한 후보 지표물질의 동정 및 합성Example 4. Identification and synthesis of candidate markers for diagnosis of Brucellosis infection

소 혈청 추출물을 대상으로 UPLC-Q-TOF MS 분석을 통해 확인된 브루셀라 감염증 진단을 위한 후보 지표물질인 GNU-1 내지 GNU-10 중에서, 소 혈청 추출물 내 함량이 높은 GNU-5(m/z 399), GNU-7(m/z 532) 및 GNU-10(m/z 798)은 각각 4가, 3가, 2가 전하를 띤 분자량 1,596 kDa의 단일 펩타이드에서 유래된 물질인 것으로 확인되었다. 또한 GNU-3(m/z 378), GNU-6(m/z 503) 및 GNU-9(m/z 755)도 각각 4가, 3가, 2가 전하를 띤 분자량 1,509 kDa의 단일 펩타이드에서 유래된 물질인 것으로 확인되었으며(Nat Protoc., 2008, 3(11), 1709-1717), 이들 펩타이드를 각각 GNU-B1과 GNU-B2로 명명하였다. Among GNU-1 to GNU-10, which are candidate markers for the diagnosis of brucellosis identified through UPLC-Q-TOF MS analysis of bovine serum extracts, GNU-5 (m/z 399 with high content in bovine serum extracts) ), GNU-7 (m/z 532), and GNU-10 (m/z 798) were identified as being derived from a single peptide with a molecular weight of 1,596 kDa carrying tetravalent, trivalent, and divalent charges, respectively. In addition, GNU-3 (m/z 378), GNU-6 (m/z 503), and GNU-9 (m/z 755) were also found in a single peptide with a molecular weight of 1,509 kDa with tetravalent, trivalent, and divalent charges, respectively. (Nat Protoc., 2008, 3(11), 1709-1717), and these peptides were named GNU-B1 and GNU-B2, respectively.

상기 GNU-B1과 GNU-B2를 Waters Xevo CID와 Waters SYNAPT G2-Si ETD를 이용하여 분석한 후 BioLynx를 이용하여 De novo 시퀀싱한 결과, GNU-B1 펩타이드는 13개의 아미노산(서열번호 1-SEETKENERFTVK; Ser-Glu-Glu-Thr-Lys-Glu-Asn-Glu-Arg-Phe-Thr-Val-Lys)이 결합한 올리고펩타이드(1,596 kDa)인 것으로 동정되었다(도 7A). After analyzing the GNU-B1 and GNU-B2 using Waters Xevo CID and Waters SYNAPT G2-Si ETD, and then de novo sequencing using BioLynx, the GNU-B1 peptide contained 13 amino acids (SEQ ID NO: 1-SEETKENERFTVK; Ser-Glu-Glu-Thr-Lys-Glu-Asn-Glu-Arg-Phe-Thr-Val-Lys) was identified as an oligopeptide (1,596 kDa) (FIG. 7A).

또한, GNU-B2 펩타이드는 GNU-B1의 아미노산 서열에서 첫번째 Ser이 떨어져나간 12개의 아미노산(서열번호 2-EETKENERFTVK; Glu-Glu-Thr-Lys-Glu-Asn-Glu-Arg-Phe-Thr-Val-Lys)이 결합한 올리고펩타이드(1,509 kDa)인 것으로 동정되었다(도 7B). NCBI Blast에서 확인한 결과, 본 발명의 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드는 소의 간과 혈액에 있는 Chanin A, Complement component 3 단백질에서 유래된 것임을 알 수 있었다.In addition, the GNU-B2 peptide consists of 12 amino acids (SEQ ID NO: 2-EETKENERFTVK; Glu-Glu-Thr-Lys-Glu-Asn-Glu-Arg-Phe-Thr-Val) in which the first Ser is removed from the amino acid sequence of GNU-B1. -Lys) was identified as an oligopeptide (1,509 kDa) bound (FIG. 7B). As a result of confirmation in NCBI Blast, it was found that the GNU-B1 and GNU-B2 peptides of the present invention were derived from Chanin A and Complement component 3 proteins in the liver and blood of cattle.

게다가, 상기 동정된 펩타이드들 중 GNU-B1을 합성한 후 UPLC-Q-TOF MS로 분석한 결과, GNU-B1 펩타이드가 m/z 399(4가 전하), m/z 32(3가 전하), m/z 798(2가 전하)를 갖는 분자량 1,596 kDa의 올리고펩타이드인 것을 확인하였고(도 8A), GNU-B1 펩타이드(standard)와 소 혈청 시료(serum sample)가 동일한 시간에서 분리되어 나오는 것을 확인하였다(도 8B). 이를 통해, 동정된 GNU-B1 펩타이드가 분자량 1,596 kDa의 올리고펩타이드인 것을 최종적으로 확인하였다.In addition, as a result of synthesizing GNU-B1 among the identified peptides and analyzing it by UPLC-Q-TOF MS, the GNU-B1 peptide has m/z 399 (quadrate charge) and m/z 32 (trivalent charge) , it was confirmed that it was an oligopeptide with a molecular weight of 1,596 kDa and m/z 798 (bivalent charge) (Fig. 8A), and that the GNU-B1 peptide (standard) and bovine serum sample were separated at the same time confirmed (FIG. 8B). Through this, it was finally confirmed that the identified GNU-B1 peptide was an oligopeptide with a molecular weight of 1,596 kDa.

실시예 5. GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드의 민감도, 특이도 및 정확도 분석Example 5. Sensitivity, specificity and accuracy analysis of GNU-B1 and GNU-B2 peptides

본 발명의 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드를 이용하여 브루셀라 감염증의 양성 또는 음성 시료를 대상으로 RBT(Rose-bengal test) 및 STAT(Standard tube agglutination test)를 수행하여 민감도(sensitivity), 특이도(specificity) 및 정확도(accuracy)를 분석하였다. 이때, 브루셀라 감염증의 양성 또는 음성 시료는 소 혈청 추출물 내 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드 함량을 측정하여 평균 음성값의 3배보다 높으면 브루셀라 감염증에 대한 양성으로 판단하였고, 평균 음성값의 3배보다 낮으면 브루셀라 감염증에 대한 음성으로 판단하였다. 평균 음성값은 LC-MS 분석을 통해 확인된 음성 시료들의 펩타이드 인텐시티(intensity) 값들의 평균을 의미한다.Using the GNU-B1 and GNU-B2 peptides of the present invention, RBT (Rose-bengal test) and STAT (Standard tube agglutination test) were performed on positive or negative samples of brucellosis infection to determine the sensitivity and specificity ( specificity) and accuracy were analyzed. At this time, samples positive or negative for brucellosis were determined to be positive for brucellosis if the contents of GNU-B1 and GNU-B2 peptides in the bovine serum extract were higher than 3 times the average negative value, and more than 3 times the average negative value. If low, it was judged as negative for brucellosis infection. The average negative value means the average of peptide intensities of negative samples identified through LC-MS analysis.

그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이 GNU-B1 펩타이드의 경우 GNU-5, GNU-7 및 GNU-1의 민감도, 특이도, 정확도 값이 모두 100%로 매우 높은 것을 확인하였다. 또한, GNU-B2 펩타이드인 경우 GNU-6의 민감도, 특이도 및 정확도가 각각 100%, 91.43%, 96.88%로 높게 나타났기 때문에 본 발명의 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드 모두 진단키트 기준을 충분히 넘는 것으로 확인되었다.As a result, as shown in Table 1 below, in the case of the GNU-B1 peptide, it was confirmed that the sensitivity, specificity, and accuracy values of GNU-5, GNU-7, and GNU-1 were all very high at 100%. In addition, in the case of the GNU-B2 peptide, the sensitivity, specificity, and accuracy of GNU-6 were 100%, 91.43%, and 96.88%, respectively, so both the GNU-B1 and GNU-B2 peptides of the present invention sufficiently exceeded the diagnostic kit standards. confirmed to be

GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드의 민감도, 특이도 및 정확도 분석Sensitivity, specificity and accuracy analysis of GNU-B1 and GNU-B2 peptides 펩타이드peptide 반응성reactivity Rose Bengal(No.)Rose Bengal (No.) STAT(No.)STAT(No.) 민감도responsiveness 특이도specificity 정확도accuracy 양성(61)Positive (61) 음성(35)voice(35) 양성(61)Positive (61) 음성(35)voice(35) GNU-B1GNU-B1 양성positivity 6161 00 6161 00 100%100% 100%100% 100%100% 음성voice 00 3535 00 3535 GNU-B2GNU-B2 양성positivity 6161 33 6161 33 100%100% 91.43%91.43% 96.88%96.88% 음성voice 00 3232 00 3232

민감도=TP(True Positive)/{TP+FN(False Negative)}Sensitivity=TP(True Positive)/{TP+FN(False Negative)}

특이도=TN(True Negative)/{FP(False Positive)+TN}Specificity=TN(True Negative)/{FP(False Positive)+TN}

정확도=(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN)Accuracy = (TP+TN)/(TP+TN+FP+FN)

실시예 6. GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드의 교차반응 검증Example 6. Verification of cross-reaction of GNU-B1 and GNU-B2 peptides

본 발명의 GNU-B1 및 B2 펩타이드를 대상으로 다른 질병균과의 교차반응성 평가를 위해서 결핵균(Mycobacterium bovis), 대장균(E. coli) 및 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica 09)에 감염된 소 혈청 내 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드의 함량을 측정하였다.Bovine serum infected with Mycobacterium bovis , E. coli and Yersinia enterocolitica 09 for cross-reactivity evaluation of the GNU-B1 and B2 peptides of the present invention with other pathogens The contents of GNU-B1 and GNU-B2 peptides were measured.

그 결과, 결핵, 대장균 또는 예르시니아에 감염된 소 혈청에서는 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드의 함량이 정상 대조군(브루셀라 음성)과 큰 차이가 없는 반면, 브루셀라가 감염된 소의 혈청에서는 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드의 함량이 결핵, E. coli 또는 Yersinia에 감염된 소 혈청에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다(도 9). As a result, the content of GNU-B1 and GNU-B2 peptides in the serum of cattle infected with tuberculosis, Escherichia coli, or Yersinia was not significantly different from that of the normal control group (Brussels-negative), whereas the serum of cattle infected with Brucella showed no significant difference between GNU-B1 and GNU-B2. It was confirmed that the content of the -B2 peptide was significantly higher than that of bovine serum infected with tuberculosis, E. coli or Yersinia (FIG. 9).

이를 통해, 본 발명의 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드는 소 브루셀라 감염증 진단을 위한 지표물질로 사용될 수 있으므로, 상기 펩타이드를 활용하여 항원-항체를 이용한 진단키트 개발 및 PCR 분석이 가능할 것으로 사료되었다.Through this, since the GNU-B1 and GNU-B2 peptides of the present invention can be used as indicators for diagnosing bovine brucellosis infection, it was thought that the antigen-antibody diagnostic kit development and PCR analysis using the peptides would be possible.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Peptide for diagnosis of Brucellosis and uses thereof <130> PN20257 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GNU-B1 <400> 1 Ser Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Thr Val Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GNU-B2 <400> 2 Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Thr Val Lys 1 5 10 <110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY REPUBLIC OF KOREA (Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Peptide for diagnosis of Brucellosis and its use <130> PN20257 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GNU-B1 <400> 1 Ser Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Thr Val Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GNU-B2 <400> 2 Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Thr Val Lys 1 5 10

Claims (7)

삭제delete 삭제delete (1) 브루셀라 감염 의심 소 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 측정된 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(3) 상기 측정된 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준보다 높을 경우에 브루셀라 감염증으로 판단하는 단계;를 포함하는, 소의 브루셀라 감염증(Brucellosis)을 진단하는 방법.(1) measuring the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in a biological sample isolated from a cattle subject suspected of being infected with Brucella;
(2) comparing the measured expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide with the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in a normal control sample; and
(3) judging as Brucella infection when the measured expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide is higher than the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide in the normal control sample; How to Diagnose Brucellosis. 제3항에 있어서, 상기 GNU-B1 및 GNU-B2 펩타이드는 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.4. The method according to claim 3, wherein the GNU-B1 and GNU-B2 peptides consist of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. 제3항에 있어서, 상기 GNU-B1 또는 GNU-B2 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 단계는 질량 분석법(mass spectrometry), 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunisorbent Assay), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이 또는 전자현미경법(electron microscopy)을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 3, wherein the step of measuring the expression level of the GNU-B1 or GNU-B2 peptide is performed by mass spectrometry, enzyme-linked immunosorbent assay, protein chip, immunoprecipitation, micro A method characterized by performing via an array or electron microscopy. 제3항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈청, 혈장, 뇨, 흉수 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 3, wherein the biological sample is any one selected from the group consisting of serum, plasma, urine, pleural fluid and saliva. 삭제delete
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