KR102404828B1 - 미분화 만능 줄기세포로부터 유전자 편집된 세포의 선별 방법 - Google Patents

미분화 만능 줄기세포로부터 유전자 편집된 세포의 선별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)로부터 유전자 편집된 세포의 선별 방법에 관한 것으로서, 상기 미분화 만능 줄기세포에서 siRNA에 의한 SLC35F2의 일시적인 녹다운에 의해 유도된 YM155 저항성을 이용하여 유전자 편집된 세포를 농축 선별할 수 있으므로, 이를 효과적으로 유전자 편집된 세포의 선별에 이용할 수 있다.

Description

미분화 만능 줄기세포로부터 유전자 편집된 세포의 선별 방법{Methods for selecting genetically modified cells from undifferentiated pluripotent stem cells}
본 발명은 미분화 만능 줄기세포로부터 유전자 편집된 세포의 선별 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 siRNA에 의한 SLC35F2의 일시적인 녹다운에 의해 유도된 YM155 저항성을 이용하여 유전자 편집된 세포를 농축 선별할 수 있는 방법에 관한 것이다.
인간 다능성 줄기세포(human pluripotent stem cells; 이하 hPSCs)의 최근 진보와 함께, hPSCs의 유전자 기술은 재생 의학의 맥락에서 유전자 보정에 대한 큰 가능성을 보여주었다. 유전 질환 환자로부터 유래된 hPSCs의 사용은 병리를 모방한 특정 유형의 세포(즉, 질병 모델링)의 지속적인 공급을 가능하게 하여 약물 스크리닝 및 기초 연구 모두에 가치 있는 기여를 할 수 있다.
그러나 환자 유래의 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; 이하 iPSCs)는 관련 없는 hPSC 계통 사이의 변동성 영향을 최소화하기 위해 많은 수의 케이스 및 제어 iPSC를 필요로 한다.
대조적으로, 유전자 편집 hPSC는 대조군과 질병 모델 세포의 동등한 쌍을 제공하여 엄격한 비교를 가능하게 한다. hPSCs의 유전자 기술의 잠재력에도 불구하고 영양계 선발(clonal selection)에 필요한 시간은 소모적이고, 이 과정의 힘든 과정과 극히 낮은 효율은 마우스 배아 줄기세포(Embryonic Stem Cell; 이하 ESC)에서의 풀링된 sgRNA 스크리닝 수행과 같은 광범위한 응용에 있어 중요한 장애물로 남아있다.
기술적 장벽에 기여하는 또 다른 요소는 hPSCs에서의 Cas9 활성이 낮다는 사실이다; 또한 Cas9의 효과에 의해 DNA 손상에 대한 반응으로 세포가 대량의 p53 의존성 세포 사멸을 겪는다.
hPSC(뿐만 아니라 다른 체세포 모델)에서 유전자 편집의 낮은 효율을 다루기 위한 여러 전략이 개발되었다: 유도성 Cas9 시스템, 퓨로마이신(puromycin) 선택, 자기복제형 에피소말 벡터 등이 있다. 대안으로, 타겟 편집 클론 중 일부의 농축 선별은 타겟 편집 클론이 약물 감수성을 담당하는 유전자의 녹아웃(knockout)에 의해 유도된 획득 저항을 통해 생존할 수 있게 하는 '공동 표적화(co-targeting)'접근법에 의해 시도되었다.
그러나 추가적으로 제조되는 원치 않는 부작용을 최소화하기 위해, 영구적인 '흉터'를 만들거나 외래 유전자(예: 약물 저항 유도에 관여하는 유전자 조작)없이 표적 편집 클론의 '흉터 없는 농축'을 달성하는 것이 바람직하다.
미분화 hPSCs의 의도하지 않은 이식으로 인한 기형종 형성은 hPSC 기반 세포 치료의 심각한 위험이다. 이러한 위험을 해결하기 위해, 잔여 hPSC를 선택적으로 제거하기 위한 몇 가지 접근법이 개발되었다. 예를 들어, 항암제로 개발된 서바이빈(survivin) 억제제인 YM155가 미분화된 hPSC에 대해 선택적으로 세포 독성을 가지며 기형종 형성을 억제한다고 보고된 바 있는데, 이 발견은 몇몇 독립적인 연구에서 재현되었다. 그러나 그 당시에는 YM155에 대한 hPSC의 높은 감수성의 기초가 되는 분자 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았다.
국내등록특허 제10-2002443호
본 발명자들은 SLC35F2의 일시적인 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA; 이하 siRNA) 매개 녹다운과 병행하여, 목적 유전자를 표적으로 하는 유전자 편집 단일 가이드 RNA(single guide RNA; 이하 sgRNA)의 도입을 통해, 유도된 YM155 저항성을 통한 유전자-편집된 hPSCs의 농축 선별을 효율적으로 달성하였다. 고효율의 농축 선별에 대한 이 흉터 없는 접근 방식은 번거로운 클론 선별을 필요로 하지 않아, 최소 3주 내에 단일 클론을 얻을 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 유전자 편집된 세포의 선별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 미분화 만능 줄기세포에서 유래된 분화세포에 YM155 처리 시, SLC35F2의 발현량이 증가하면 YM155에 대한 세포 독성이 발생하는 것으로 예측하는 단계를 포함하는, YM155의 세포 독성 확인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SLC35F2 유전자의 발현이 억제된 미분화 다능성 줄기세포에 있어서, 유전자 편집이 이루어지지 않은 세포에 대하여 선택적으로 세포 사멸을 유도하는 YM155의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)로부터 유전자 편집된 세포의 선별 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 siRNA에 의한 SLC35F2의 일시적인 녹다운에 의해 유도된 YM155(CAS 781661-94-7) 저항성을 이용하여 유전자 편집된 세포를 농축 선별할 수 있는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 유전자 편집된 세포의 선별 방법에 관한 것이다:
미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)에서 SLC35F2 유전자를 표적화하여 유전자 편집을 진행하는 유전자 편집 단계로, 상기 유전자 편집은 SLC35F2 유전자의 발현을 억제하는 것인, 유전자 편집 단계; 및
YM155(CAS 781661-94-7)를 처리하여 SLC35F2 유전자의 발현이 억제되지 않은 세포를 선택적으로 사멸시키는 세포 사멸 유도 단계.
본 명세서에서 "YM155"는 서바이빈(Survivin) 억제제로, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미한다(CAS No. 781661-94-7).
[화학식 1]
Figure 112020000628125-pat00001
본 발명에 따르면, 다른 화학 물질 기반의 선별 접근법과는 달리, SLC35F2는 YM155에 대한 약물-특이적 막 수송체로서, SLC35F2 유전자의 발현을 억제하면 YM155의 세포 흡수를 차단할 수 있고, 이로 인하여 세포에 YM155에 대한 저항성이 유도될 수 있다.
본 발명의 유전자 편집된 세포의 선별 방법에 의해 선별된 세포는, 상기 SLC35F2 유전자 외에 추가적으로 1종 이상의 관심 유전자(gene of interest; GOI)를 표적화하여 유전자 편집된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "유전자 편집"은, 특별한 언급이 없는 한, 표적 유전자의 표적 부위에서의 절단에 의한 핵산 분자(하나 이상, 예컨대 1-100,000bp, 1-10,000bp, 1-1000bp, 1-100bp, 1-70bp, 1-50bp, 1-30bp, 1-20bp 또는 1-10bp)의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 상실, 변경, 및/또는 회복(수정)시키는 것을 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "CRISPR/Cas9" 또는 "CRISPR/Cas9 시스템"은, 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라 불리는 게놈 편집 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 RNA(gRNA)와 특정한 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9 단백질로 구성된다.
본 명세서에서 용어 "Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질"은, CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)를 형성한다.
이하, 본 발명의 유전자 편집된 세포의 선별 방법에 대하여 상세히 설명한다.
유전자 편집 단계
본 단계는 미분화 만능 줄기세포에서 SLC35F2 유전자에 대하여 유전자 편집을 수행하는 과정이다.
일 구현예에 따르면, 본 과정에 의해 녹아웃(knock-out)에 따른 SLC35F2 유전자의 발현 억제가 달성될 수 있다.
구체적으로, 상기 유전자 편집은 SLC35F2 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드(antisense nucleotide), 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 세포에 도입하여 SLC35F2 유전자의 발현 억제가 달성되는 것일 수 있고, 예를 들어, siRNA를 도입하여 달성되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 siRNA는 서열번호 6의 서열을 갖는 핵산일 수 있다.
또한, 본 단계는 미분화 만능 줄기세포에서 상기 SLC35F2 유전자 외에, 추가적인 1종 이상의 관심 유전자에 대하여 유전자 편집을 수행하는 과정을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 과정에 의해 관심 유전자에서 녹아웃(knock-out)에 따른 서열 변이가 발생할 수 있다.
구체적으로, 상기 유전자 편집은 관심 유전자에 특이적으로 결합하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA)를 세포에 도입하여 관심 유전자의 서열 변이가 달성되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이에 따라, 본 단계는 상기 관심 유전자에 서열 변이가 발생하면 발현되는 리포터 유전자를 관심 유전자의 다운스트림에 작동가능하게 연결하는 것일 수 있고, 상기 서열 변이는 프레임 이동 돌연변이(frame shift mutation)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 리포터 유전자는 업스트림에 전사 종결 구조를 형성하는 핵산 서열이 삽입된 것일 수 있다.
상기 관심 유전자에서 프레임 이동 돌연변이가 발생하는 경우, 그 다운스트림에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자가 발현된다. 리포터 유전자는 업스트림에 전사 종결 구조를 형성하는 핵산 서열이 삽입되어 있기 때문에 발현되지 않도록 구성되어 있으나, 프레임 이동 돌연변이가 발생하면 전사 종결 구조를 형성할 수 없으므로 리포터 유전자가 발현된다. 리포터 유전자가 형광 단백질을 코딩하는 경우, 관심 유전자에서 발생한 프레임 이동 돌연변이로 인하여 형광 발광이 관찰되므로 형질전환 세포를 용이하게 확인할 수 있다.
상기 리포터 유전자는 형광 단백질, 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마아제(β-lactamase), TEV-프로테아제(TEV-protease), 디히드로엽산환원효소(Dihydrofolate reductase), 루시퍼라제(luciferase), 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase), 선택마커(selection marker), 표면 마커 유전자(surface marker gene) 및 항생제 저항성 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것일 수 있고, 예를 들어, 형광 단백질을 코딩하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 일 구현예에 따르면, 본 과정에 의해 관심 유전자에서 녹인(knock-in)에 따른 서열 변이가 발생할 수 있다.
구체적으로, 상기 유전자 편집은 관심 유전자에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(single stranded oligodeoxynucleotides; ssODN)를 세포에 도입하여 관심 유전자의 서열 변이가 달성되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 ssODN은 한 가닥의 DNA로 구성되어 있고, 특정 염기(base)를 다른 염기로 교체하기 위하여 관심 유전자의 공여자(donor)로 사용된다.
상기 ssODN은 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 갖는 핵산일 수 있다.
상기 ssODN은 표적 부위에 상보적으로 결합함으로써, 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 관심 유전자의 서열 변이를 유도할 수 있다.
상기 표적 부위는 관심 유전자 상의 특정 유전자좌일 수 있고, 상기 서열 변이는 치환 돌연변이(substitution mutation)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미분화 만능 줄기세포는 배아 줄기세포(Embryonic Stem Cell; 이하 ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; 이하 iPSCs), 배아 생식세포, 배아 종양세포 및 성체 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, ESC인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세포 사멸 유도 단계
상기 YM155의 농도는 5 내지 2000 nM, 5 내지 1000 nM, 5 내지 500 nM, 5 내지 200 nM, 5 내지 100 nM, 5 내지 50 nM, 5 내지 20 nM, 10 내지 2000 nM, 10 내지 1000 nM, 10 내지 500 nM, 10 내지 200 nM, 10 내지 100 nM 또는 10 내지 50 nM, 예를 들어, 10 내지 20 nM인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 유전자 편집된 세포의 선별 방법에 의해 선별된, 유전자 편집된 세포에 관한 것이다:
미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)에서 SLC35F2 유전자를 표적화하여 유전자 편집을 진행하는 유전자 편집 단계로, 상기 유전자 편집은 SLC35F2 유전자의 발현을 억제하는 것인, 유전자 편집 단계; 및
YM155(CAS 781661-94-7)를 처리하여 SLC35F2 유전자의 발현이 억제되지 않은 세포를 선택적으로 사멸시키는 세포 사멸 유도 단계.
본 발명의 다른 양태는 미분화 만능 줄기세포에서 유래된 분화세포에 YM155처리 시, SLC35F2의 발현량이 증가하면 YM155에 대한 세포 독성이 발생하는 것으로 예측하는 단계를 포함하는, YM155의 세포 독성 확인 방법이다.
본 발명은 미분화 만능 줄기세포로부터 유전자 편집된 세포의 선별 방법에 관한 것으로서, 상기 미분화 만능 줄기세포에서 siRNA에 의한 SLC35F2의 일시적인 녹다운에 의해 유도된 YM155 저항성을 이용하여 유전자 편집된 세포를 농축 선별할 수 있으므로, 이를 효과적으로 유전자 편집된 세포의 선별에 이용할 수 있다.
도 1a는 농축 분석을 수행하여 666개의 인간 암 세포에 대한 인간 다능성 줄기세포(hPSCs) 점수를 계산한 결과이다.
도 1b는 543가지 화합물에 대한 각 세포주의 민감도를 연관시켜 높은 hPSC 점수를 가진 세포에서 가장 효과적인 약물로 YM155를 확인한 결과이다.
도 1c는 인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cells; 이하 hESCs)에서의 SLC35F2 발현 수준을 암 세포주와 비교한 그래프이다.
도 1d는 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblasts; 이하 hDF), hESC-MSCs(Mesenchymal stem cells) 및 hESCs에서의 SLC35F2 및 POU5F1의 mRNA 발현을 나타낸 그래프이다.
도 1e는 hESC-MSCs, hCHA3, H9 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; 이하 iPSCs: SES8)에서의 SLC35F2 및 POU5F1의 mRNA 발현을 나타낸 그래프이다.
도 1f는 YM155 처리 후 γH2AX로 염색된 H9의 형광 이미지를 나타낸 사진이다.
도 1g는 YM155 처리 후 pH2AX(Ser 139) 및 절단된 케스페이즈 3(cleaved Caspase; c-Casp 3) 수준을 검출하기 위해 hESC-MSC와 hESC 사이의 면역 블로팅 분석을 수행한 결과이다.
도 1h는 LC-MS/MS 분석을 수행하여 hDF와 hESC 사이의 세포 내 흡수된 YM155 양을 정량화한 결과이다.
도 2a는 SLC35F2 녹아웃을 위한 타겟으로 엑손 7을 선택하였음을 나타내는 모식도이다.
도 2b는 SLC35F2 녹아웃 된 SLC35F2 KO hESC에 YM155를 처리함에 따른 세포 사멸 여부를 나타낸 세포 계측 결과 및 현미경 사진이다.
도 2c는 Cas9 및 SLC35F2에 대한 sgRNA의 도입 후, YM155의 존재 하에서 생존하는 클론에 대한 삽입/결실(indel) 빈도를 나타낸 T7E1 분석 결과이다.
도 2d는 SLC35F2 및 Cas9에 대한 sgRNA의 도입 후, YM155의 존재 하에서 생존하는 클론에 대하여 차세대염기서열(Next-generation sequencing; 이하 NGS) 분석법을 통한 인델(indel) 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 2e는 야생형 hESC(NC)와 대비하여 YM155R의 단일 클론이 동형 접합체 복대립형(homozygous bi-allelic) SLC35F2 KO임을 나타내는 서열 정보이다.
도 2f는 YM155 처리 후 SLC35F2 KO #1 hESC에서의 세포 사멸 정도를 유동 세포 계측을 통해 나타낸 결과이다.
도 2g는 YM155 처리 후 SLC35F2 KO #1 hESC에서의 SLC35F2의 발현량을 나타낸 결과이다.
도 2h는 YM155 처리 후 SLC35F2 KO #1 hESC에서의 DNA 손상 여부를 나타낸 사진이다.
도 3a는 SLC35F2 KO #1 hESC에서 다능성 마커인 NANOG, SOX2 및 POU5F1의 발현 수준을 확인한 그래프이다.
도 3b는 SLC35F2 KO #1 hESC에서 다능성 마커인 SOX2 및 OCT4와 같은 단백질 수준을 확인한 면역 블로킹 분석 사진이다.
도 3c는 대조군(NC) 및 SLC35F2 KO #1 hESC의 알칼리성 인산가수분해효소(phosphathase)분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 3d는 대조군(NC) 및 SLC35F2 KO #1 hESC의 세포 성장 속도를 나타낸 그래프이다.
도 3e는 녹색 형광 단백질을 발현하는 야생형 hESCs(EGFP-hESCs)와의 공배양을 통한 세포 성장 경쟁도를 유세포 계측법으로 확인한 결과이다.
도 3f는 SLC35F2 KO #1 hESC으로부터의 체세포 분화 후 내배엽, 중배엽 및 외배엽 특정 유전자(내배엽: SOX17, GATA6, 중배엽: MSX1 및 외배엽: NESTIN)의 mRNA 발현을 상대적 수준으로 나타낸 그래프이다.
도 3g는 SLC35F2 KO hESCs를 이용하여 형성한 기형종의 사진이다.
도 3h는 SLC35F2 KO #1 hESC에서 다능성 마커 유전자(POU5F1, SOX2, NANOG, Lin28A)의 전체 유전자 산란 플롯을 나타낸 전사체 데이터이다.
도 4a는 HEK293T 세포(GOI: 관심 유전자)에서 YM155 매개 농축 선별 접근법에 대해 나타낸 모식도이다.
도 4b는 SLC35F2 KO HEK293T 세포에서 효소 처리 후 절단된 밴드(별표)에 대하여 T7E1 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 4c는 야생형 대조군 및 다양한 SLC35F2 KO HEK293T 세포의 NGS 데이터를 나타낸 그림이다.
도 4d는 CCR5를 표적화하기 위한 녹색형광 단백질 발현 시스템의 모식도이다.
도 4e는 SLC35F2와 CCR5를 공동 표적화하고 GFP 양성 세포의 비율 확인을 통해 CRISPR/Cas9 표적화 효율을 확인한 사진이다.
도 4f는 SLC35F2와 CCR5를 공동 표적화하고 GFP 양성 세포의 비율 확인을 통해 CRISPR/Cas9 표적화 효율을 확인한 그래프이다.
도 4g는 SLC35F2와 CCR5를 공동 표적화하고 GFP 양성 세포의 비율 확인을 통해 CRISPR/Cas9 표적화 효율을 확인한 T7E1 분석 결과이다.
도 5a는 CCR5(C) 및 SLC35F2(S)를 표적으로 하여 sgRNA를 CCR5 및 SLC35F2를 표적으로 하는 2가지의 상이한 비율로 조합하여 적용한 각 클론에서 CCR5 및 SLC35F2에 대한 T7E1 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 5b는 대조군(WT) 및 #1에 해당하는 클론(C:S = 1:1) 선택 후 차세대염기서열분석(NGS) 분석한 결과이다.
도 5c는 전체 유전자, hPSC 시그니처 유전자 및 세포 전이 금속 이온 항상성 (GO: 0046916) 유전자의 발현에 기초한 t-분포 확률적 이웃 삽입(t-distributed stochastic neighbor embedding; t-SNE)을 이용한 RNA-seq 샘플의 클러스터링 결과 그래프이다.
도 6a는 CCR5 표적 sgRNA 및 SLC35F2를 표적으로 한 siRNA의 도입에 의한 YES-접근 방식을 나타낸 모식도이다.
도 6b는 hESCs에서 siRNA 형질도입 후 표시된 경과일에 따라 SLC35F2의 mRNA 발현을 상대적 수준으로 나타낸 그래프이다.
도 6c는 SLC35F2를 표적으로 한 siRNA의 형질도입 후 2일째 및 5일째를 비교하여 세포 사멸을 확인한 아넥신 V/7-AAD(Annexin-V/7-AAD)염색 및 유동 세포 계측법 확인 결과이다.
도 6d는 YM155 처리 용량을 달리하여 각각 YES-접근법 수행 후 CCR5의 표적 효율로서 인델 비율의 평균을 나타낸 그래프이다.
도 6e는 YM155 처리 용량을 달리하여 각각 YES-접근법 수행 후 CCR5 KO 클론의 시퀀싱 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6f는 CCR5 표적 서열, sgRNA 표적 및 PAM 서열에 대한 NGS 분석 결과이다.
도 6g는 WT 또는 CCR5 KO hESC에서 YM155의 처리용량을 달리하고 아넥신 V/7-AAD로 염색하여 유동 세포 계측법으로 나타낸 결과이다.
도 7a는 CCR5, HEK2 및 HEK3 유전자좌를 표적으로 한 YES-접근법 유무에 따른 T7E1 분석 결과이다(*, T7E1 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 예상 DNA 밴드).
도 7b는 딥 시퀀싱에 의해 결정된, 대조군(Cont) 또는 YES-접근법(YES)에 의한 CCR5, HEK2 및 HEK3의 삽입 빈도를 나타낸 그래프이다(*, p<0.05; **, p<0.01).
도 7c는 Cas9-EGFP #1 hESC 클론(스케일 바 = 100 μm)의 대표적인 위상차(상단) 및 EGFP(하단) 이미지, 및 야생형 hESCs(대조군)에 대한 Cas9-EGFP #1의 Cas9 및 EGFP의 상대적 mRNA 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 7d는 Cas9(Cas9-EGFP #1) 시스템을 발현하는 GFP 리포터 hESC에 의해 목표 효율을 결정하기 위한 그래픽 다이어그램이다.
도 7e는 표지 조건에서의 EGFP 양성 및 음성 집단의 유세포 분석 결과이다(검은색 화살표는 EGFP 표적 집단을 나타냄).
도 7f는 유세포 분석에 의해 결정된 EGFP 양성(EGFP+) 및 EGFP 음성(EGFP-) 집단을 나타낸 그래프이다.
도 8a는 EYA4, TMEM67 및 SLC6A5 유전자좌에서의 녹인(knock-in; KI) 표적을 나타내는 그래픽 다이어그램으로, ssODN에는 각각의 KI를 인지할 수 있는 HDR 마커 서열(빨간색 대문자)이 삽입되었다.
도 8b는 흉터 없는 YES-접근법 유무에 따른 지시 유전자의 인델(KO: Open bar, KI: Red bar) 효율을 나타낸 결과이다.
도 8c 내지 8e는 3개의 서로 다른 대상(EYA4, TMEM67 및 SLC6A5 유전자)에 대한 딥 시퀀싱 분석을 기반으로 한 인델 비율의 HDR 프리퀀시를 나타낸 것으로, 각각 8c는 EYA4, 8d는 TMEM67, 및 8e는 SLC6A5에 대한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 세포의 준비
인간 배아 줄기세포(WA09, WiCell Research Institute; 이하 hESC)를 mTeSRTM-E8TM 배양액(STEMCELL technologies) 및 50 ug/ml 젠타마이신(Gentamicin, Life Technologies)이 첨가된 StemMACSTM 배지(Miltenyi-Biotec)가 공급된 마트리겔(Matrigel, BD Biosciences) 코팅 플레이트에서 배양되었다. 세포는 5 내지 6일마다 배양되었고 배지는 매일 교체하였다.
hESC를 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척하고 디스페이즈(Dispase, Gibco)에 노출시켜 박리시켰다. 분리된 세포를 DMEM/F-12(Gibco) 배지로 세척하고 마트리겔 코팅 플레이트 상에 플레이팅하였다. 필요 시 세포 부착을 위해 10 uM의 Y27632(Gibco)를 첨가하였다.
HEK293T(Human embryonic kidney 293 cells) 세포를 10% FBS(Gibco) 및 50 ug/ml 젠타마이신이 첨가된 DMEM(Gibco)이 공급된 배양 접시(Falcon)에서 배양하였다. 트랜스퍼 시, HEK293T 세포를 DPBS로 세척하고 0.25% 트립신으로 효소적으로 분리하였다. 트립신은 10% FBS를 함유하는 DMEM을 첨가하여 불활성화시키고 적정량의 세포를 접시에 뿌렸다.
실시예 2: hPSCs에서의 YM155의 세포 내 흡수로 인한 SLC35F2 의 높은 발현 확인
YM155에 의한 인간 다능성 줄기세포(hPSCs)에서의 세포 사멸의 선택적 유도는 DNA 손상 반응과 관련이 있다. YM155의 세포 독성은 BIRC5(서바이빈을 코딩함)의 억제에 의해 완전히 예방될 수는 없다. 따라서, hPSCs의 선택적 세포 사멸의 기전을 규명하고자 하였다. 이를 위해 암세포 백과 사전(Cancer Cell Line Encyclopedia; 이하 CCLE)과 암 치료제 반응 포털(Cancer Therapeutics Response Portal; 이하 CTRP)의 고형암 세포주 유전자 발현 데이터와 약물 반응 데이터를 각각 활용하였다.
유전자 발현 옴니버스(gene expression omnibus; 이하 GEO)의 데이터를 사용하여 hPSC 시그니쳐(signiture), 즉 그들의 차별화된 대응물과 비교하여 hPSC에서 상이하게 발현되는 유전자 세트를 확인하였다.
약물유전체학(Pharmacogenomics) 데이터 세트 기초 수준의 세포주 mRNA 발현 데이터는 데이터 포털(Cancer Cell Line Encyclopedia; CCLE, https://portals.broadinstitute.org/ccle/data)에서 얻은 것이다. Raw Affymetrix CEL 파일은 Robust Multi-Array Average(RMA) 방법을 사용하여 각 유전자 프로브 세트에 대한 실제 발현 값을 정상화하도록 변환되었다.
프로브를 유전자로 붕괴시킬 때, 유전자 당 다수의 프로브의 발현 값의 최대 값을 유전자의 대표적인 발현 값으로 삼았다. 총 886 개의 세포주 중에서 혈액 계통, 비인간 및 모호한 조직 유형을 제외하고 본 분석에서는 약물 감수성 데이터와 함께 666개의 암 세포주를 사용하였다. 세포주 약물 반응 데이터는 Cancer Therapeutics Response Portal(https://ocg.cancer.gov/programs/ctd2/data-portal)에서 다운로드 되었다.
도 1a과 같이 hPSC 시그니처를 사용하여, 콜모고로프 스미르노프 검정(Kolmogorov-Smirnov; 이하 KS)을 통한 단일 시료의 농축 분석을 수행하여 666개의 인간 암 세포에 대한 hPSC 점수를 계산하였다.
구체적으로, hPSC 점수와 543가지 화합물 각각에 대한 세포주 약물 반응(area under the fitted curve; 이하 AUC)과 화합물 각각에 대한 세포 라인 hPSC 점수를 각 세포주의 민감도로 연관시켰다.
세포 생존력 값을 0 내지 100%의 범위로 조정하고 4-매개 변수 로지스틱 회귀 분석으로 조절하였다. AUC(fit curve 아래의 면적)를 계산하기 위해 각 화합물에 대해 가장 많은 세포를 테스트한 특이적인 농도 범위를 선택하였다. AUC는 주어진 농도 범위에서 0% 성장 억제라고 가정된 최대 AUC에 의해 0 내지 1의 범위로 정규화되었다.
정량적 데이터는 평균값±표준 오차(SEM)로 표현된다. 각 반응 변수의 통계적 유의미성을 분석하기 위해 학생의 paired t-test 또는 one-way ANOVA를 수행하였다. SPSS 프로그램(사회 과학 통계 패키지, 버전 17)을 사용하여 Tukey's post hoctest을 통해 그룹 간에 미리 지정된 비교가 수행되었다(적절한 경우). 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
도 1b 좌측에서 확인할 수 있듯이, AUC와 hPSC 점수를 비교한 543가지 화합물의 상관 강도(z-scored Pearson correlation coefficient; z-점수 피어슨 상관 계수)가 높은 hPSC 점수(hPSC 유사 세포)를 갖는 세포는 YM155에 선택적으로 민감한 것으로 나타났다.
각 유전자의 발현값을 YM155의 AUC와 비교하여 18,858개 유전자의 상관 관계의 강도를 나타내었다.
도 1b 우측에서 확인할 수 있듯이, ATP1B1 및 SLC35F2는 YM155 저항성 및 민감성 세포에서 각각 고도로 발현되었고, 이는 높은 hPSC 점수를 가진 세포가 YM155에 대하여 선택적으로 민감하다는 것을 의미한다.
도 1a의 약물 및 유전자 발현 시그니처의 상관 관계에 기초하여, YM155에 대한 감수성과 높은 상관 관계가 있는 유전자가 이전에 기술된 바와 같이 확인되었다. 막 수송체인 SLC35F2는 YM155 감수성과 가장 관련이 있는 전사물이었고(도 1b, 왼쪽 패널), SLC35F2에 의한 YM155의 세포 내 도입이 hPSCs에서 약물의 고도의 선택적 세포 독성을 일으킨다는 것을 암시한다. 이것은 암 모델의 이전 보고서와 일치한다.
유전자 발현 프로파일 데이터베이스(http://nextbio.com)를 사용하여 24개의 인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cells; 이하 hESCs)와 다양한 암 세포주 사이의 상대적 SLC35F2 발현을 비교하였다. 인간 전립선 암 세포주인 PC-3(prostate cancer cell)를 SLC35F2의 발현이 높은 양성 대조군(P.C.)으로 사용하였다.
도 1c에서 확인할 수 듯이, hESC 표면 마커 단백질을 동정한 이전 연구와 일치하는 모든 hESCs(이 연구에서 주로 사용된 H9 포함)는 다른 암 세포주보다 높은 수준의 SLC35F2를 발현하였다.
한편, 도 1d 및 1e에서 확인할 수 있듯이, YM155 처리에 대해 저항성이 강한 hESCs에서 유래한 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells)(hESC-MSCs) 및 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblasts; 이하 hDFs)는, 두 개의 독립적인 hESC 계열(H9 및 hCHA3) 및 다능성 줄기세포(iPSCs: SES8)보다 낮은 수준의 SLC35F2를 발현하였다. POU5F1는 다능성 마커로서 확인하였다. 이로부터, hESCs의 SLC35F2 발현량이 다른 세포들에 비해 월등히 높음을 확인할 수 있었다.
SLC35F2는 YM155의 세포 내로의 흡수를 담당하는 막 수송체로서 DNA 손상을 일으킨다. 도 1f 및 1g에서 확인할 수 있듯이, YM155 처리 후에 hESC에서는 뚜렷한 DNA 손상이 발견되었지만 hESC-MSC에서는 검출되지 않았으므로 이를 확인할 수 있다(DAPI로 핵 대조 염색, 스케일 바 = 10 um, α-tubulin은 내부 통제에 사용).
LC-MS/MS 분석을 수행하기 위해 HEK293T 및 H9 세포를 1 uM YM155에 1시간 동안 노출시켰고, 세포는 1x106으로 계수하였다. 수확된 세포를 80% 메탄올로 용해시키고 얼음에서 1시간 더 배양하였다. 13,000 rpm으로 20분 동안 스핀 다운한 후, 상등액을 수집하고 용매가 더 이상 남아 있지 않을 때까지 N2 가스로 증발시켰다. 샘플 잔류물을 50% 메탄올 100 uL로 재현탁하고, 10초 초음파 처리, 5초 보텍스, 스핀-다운 및 0.2 um 멤브레인 필터로 여과하였다. 컬럼(ACQUITY UPLC BEH C18, 50 x 2.1 mm, 1.7 mm, 30℃)을 사용하여 UHPLC/Q-TOF MS(Waters, Milford, MA, USA)에 총 5 uL의 용매를 주입하였다. 시료를 0.2 mL/min 유속으로 판독하였고, YM155에 대한 추정 피크는 4.32 내지 4.90 분이었다.
도 1h에서 확인할 수 있듯이, hDF에 비해 hESCs에서 YM155의 세포 내 수준이 더 높게 나타났다. 이는 hPSCs에서의 높은 SLC35F2 발현이 hPSCs에서 이 약물 선택적 세포 독성을 초래한다는 것을 분명히 나타낸다.
따라서, YM155에 의한 hPSCs의 세포 사멸의 선택적 유도가 SLC35F2의 높은 발현으로 인한 약물의 선택적 세포 흡수로 인한 것임을 입증하였다.
실시예 3: hPSCs에서 YM155에 의해 유발되고 SLC35F2 가 매개하는 선택적 세포 사멸 확인
hPSCs(EC50: 10 nM)에서의 YM155의 선택적 세포 독성과 이들 세포에서의 SLC35F2의 높은 발현 사이의 연결을 확인하기 위해, 엑손 7을 표적화하는 CRISPR/Cas9를 사용하여 hESCs에서 SLC35F2를 녹아웃시켰다(도 2a 참조).
구체적으로, hESCs에 Cas9와 함께 SLC35F2에 대한 단일 가이드 RNA(single guide RNA; 이하 sgRNA)를 도입한 후, YM155로 세포를 처리하여 편집되지 않은 야생형 hESC를 제거하였다. 살아남은 콜로니 중 하나(YM155R)를 선택하고 유지하였다.
서열번호 명칭 서열
1 sgRNA가 특이적으로 결합하는 SLC35F2 엑손 7의 핵산 서열 AGTGCCACTTCCGTCAACCT
2 SLC35F2 엑손 7을 표적화하는 sgRNA의 핵산 서열 TGACATCAATTATTATACATCGG
그 다음, Annexin V의 유동 세포 계측법 및 hESCs의 현미경 이미지(빨간색 화살표는 YM155 저항성 클론: YM155R, 스케일 바 = 500 nm)를 이용하여, YM155 처리 전과 후(YM155R)를 비교하였다.
구체적으로, 세포를 AccutaseTM(561527, BD Biosciences)로 분리하고 DPBS로 3회 세척한 다음, 세포 사멸 검출을 위해 FITC Annexin-V(556419, BD Biosciences) 및 7-AAD(559925, BD Biosciences)로 염색하였다. 희석된 1X Annexin V 결합 완충액(556454, BD Biosciences)을 염색용 용매로 사용하였다. BD Biosciences 및 Cell Quest 소프트웨어의 FACS calibur를 FACS 분석에 사용하였다.
도 2b 좌측(적색 화살표)에서 확인할 수 있듯이, YM155 처리 후 소수의 콜로니가 생존한 반면, 대부분의 세포는 세포 사멸을 경험하였다.
또한, 도 2b 우측에서 확인할 수 있듯이, 저항성 클론 YM155R은 추가적인 YM155 처리에 매우 저항성이 있었다.
다음으로, SLC35F2 및 Cas9 형질 감염된 hESCs의 sgRNA의 도입 후, YM155R에 대하여 YM155의 용량을 0, 25, 50 및 100 uM로 달리하여 처리하고, 생존한 클론에 대한 T7E1 분석 및 인델(Indel) 백분율을 확인하기 위한 차세대염기서열분석법(NGS) 분석을 수행하였다.
구체적으로, T7E1 분석에 있어서, PCR은 SolgTM Taq DNA 중합효소(STD16-R500, SolGent)를 사용하여 시료 당 총 부피가 10 ul 인 공급 업체의 지침에 따라 수행되었다. 제1 PCR은 각 유전자에 대해 프라이머 F1 및 프라이머 R로 수행되었다. 제1 PCR 산물은 190 ul의 DW로 희석되었다. 제2 PCR은 각 유전자에 대해 프라이머 F2와 프라이머 R을 사용하여 희석된 제1 PCR 산물 1 ul로 수행되었다. 제2 PCR 생성물을 동일한 부피의 2X NEBuffer2(B7002S, New England BioLabs)와 혼합하고 하이브리드화시켰다. 3 단위의 T7E1 엔도뉴클레이즈(M0302S, New England BioLabs)를 하이브리드화된 제2 PCR 산물 10 ul에 처리하였다. 37℃의 수조에서 40분 동안 효소 반응을 수행하였다.
도 2c에서 확인할 수 있듯이, SLC35F2 에 대한 Cas9 및 sgRNA의 도입 후, 삽입/결실(indel) 빈도가 농도 의존적으로 증가하여 유전자 편집 여부를 확인할 수 있었다.
도 2d에서 확인할 수 있듯이, 100 nM YM155의 존재 하에서 생존하는 클론은 거의 100%로 유전자-편집된 hESC(100% indel)였으며, 이는 SLC35F2 녹아웃(SLC35F2 KO) hESC 집단이 용량 의존적 방식으로 농축됨으로써 긍정 오류(false positive)(즉, 야생형 SLC35F2로 남은 hESC)를 효과적으로 제거한다는 것을 시사한다.
도 2e와 같이 YM155R 클론(KO #1), sgRNA 표적 서열 및 PAM 서열로부터의 서열 정보는 각각 녹색 및 오렌지색으로 나타내었고, 상기 YM155 처리하에 유지된 YM155R의 단일 클론은 동형 접합체 복대립형(homozygous bi-allelic) SLC35F2 KO로 밝혀졌다.
다음으로, 0, 5 및 25 uM의 YM155 처리 후, 야생형(NC) 및 SLC35F2 KO #1 hESC에서의 세포 사멸 분석을 유동 세포 계측을 통해 수행하였다.
도 2f에서 확인할 수 있듯이, 저항성 클론(SLC35F2 KO hESCs: KO #1)은 YM155에 의해 유도된 세포 사멸에 매우 강한 것으로 나타났다.
SLC35F2 KO hESCs에서 획득한 저항성은 YM155 처리에 의해 나타나는 SLC35F2의 발현량 및 DNA의 손상 정도를 통해 확인할 수 있었다.
도 2g에서 확인할 수 있듯이, YM155 처리(1 및 2 uM)에 의한 SLC35F2의 발현은 야생형 hESCs(NC)에서는 용량의존적으로 증가한 반면 SLC35F2 KO hESCs에서는 거의 발현되지 않았다.
도 2h에서 확인할 수 있듯이, γH2AX로 염색하여 형광 현미경 이미지로 분석한 결과 YM155 처리(20 nM)에 의한 DNA 손상이 야생형 hESCs에서만 확인되고 SLC35F2 KO hESCs에서는 거의 나타나지 않았다(DAPI로 핵 대조 염색, scale bar = 10 μm).
따라서, SLC35F2 KO hESCs에서는 YM155 처리로 인한 SLC35F2 매개의 세포 사멸이 거의 나타나지 않았다.
실시예 4: SLC35F2 KO hESCs의 세포 기능 유지 확인
상기 실시예 3의 결과에 기초하여, SLC35F2 KO hESCs를 특성화하기 위해, 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblasts; 이하 hDF), 야생형 hESCs(NC) 및 SLC35F2 KO hESCs에서 NANOG, SOX2 및 POU5F1과 같은 전형적인 다능성 마커의 발현 수준을 모니터링하였다.
SLC35F2 KO hESCs에 대하여, 도 3a에서 전형적인 다능성 마커의 상대적인 mRNA 발현 정도를 확인하고, 도 3b에서 면역 블로킹 분석을 통한 SOX2 및 OCT4와 같은 단백질 수준을 확인함으로써 알 수 있듯이(β-액틴은 로딩 대조군으로 사용), SLC35F2의 유전자 결손이 배아줄기세포의 자기-재생산(self-renewal) 과정에 미치는 영향이 없음을 확인할 수 있었다. 또한, SLC35F2 KO hESCs에서 대표적인 콜로니를 확대하였을 때의 알칼리성 인산가수분해효소(phosphathase) 활성(도 3c), 및 SLC35F2 KO #1 hESC의 세포 성장 속도의 실측 정도(도 3d)로부터도 동일한 결과를 도출하였다.
다음으로, SLC35F2 KO #1 hESC와 녹색 형광 단백질을 발현하는 대조군인 정상 hESCs(EGFP-hESCs)의 공배양 후, 시간에 따른 비율을 유세포 계측법으로 확인하였다.
도 3e에서 확인할 수 있듯이, 공배양 과정에서 두 세포의 비율이 크게 변화하지 않는 것으로 보아, SLC35F2의 유전자 결손이 hESCs의 성장에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
이어서, SLC35F2 KO #1 hESC에서의 전형적인 계통 특정 유전자(내배엽: SOX17, GATA6, 중배엽: MSX1 및 외배엽: NESTIN)의 mRNA 발현을 상대적 수준으로 나타내었다. 측정 결과는 체세포 분화 후 2일 단위로 측정한 값을 경과일 단위로 표시하였다.
구체적으로, SLC35F2 KO #1 hESC으로부터의 체세포 분화 후 내배엽, 중배엽 및 외배엽 특정 유전자들의 in vitro에서 자발적 분화를 유도하고, 각 배엽의 특이적인 mRNA 발현량을 대조군(NC)과 비교하였다. in vitro 자발적 분화 과정에서 내배엽성 세포(GATA6 유전자 발현으로 확인할 수 있는) 분화와 중배엽성 세포(MSX1 유전자 발현으로 확인할 수 있는)로의 분화가 감소함을 확인하였다.
도 3f에서 확인할 수 있듯이, in vitro의 자발적 분화 결과로는 SLC35F2 유전자의 결손이 내배엽과 중배엽 분화를 억제하는 것으로 확인되었다.
다음으로, 각 세포의 생체 내 다분화능을 조사하기 위해, 마우스(Balb/C Nude, 수컷 4주령)를 마취시킨 후, NC, SLC35F2 KO hESCs를 직접 고환에 주사하였다.
구체적으로, 각 NC(n = 3) 및 SLC35F2 KO(n = 3) hESC의 5x106 세포를 4주령 마우스에 피하 및 피부 접종하였다. 마우스는 각각의 WT 및 SLC35F2 KO hESC 접종 후 2개월 후 안락사시켰다. 이 동물 실험은 서울대학교 동물 보호 및 사용위원회(허가 번호: SNU-180810-1)의 허가 하에 수행되었다.
도 3g에서 확인할 수 있듯이, H&E, Masson trichrome, Alcian Blue로 염색한 결과, 기형종에서 전형적인 세 계층의 이미지를 확인할 수 있었다(눈금 막대는 50 mm). in vivo에서의 자발적인 분화를 기형종 형성을 통해 확인하였을 때 외배엽성 조직인 Nerual rosette, 중배엽성 조직인 cartilage, 및 내배엽성 조직인 Gut-like 조직이 발견되는 것으로 보아, SLC35F2 유전자 결손이 in vivo 자발적인 3배엽성 분화에 큰 영향이 없음을 알 수 있었다.
끝으로, SLC35F2 KO #1 hESC에서 다능성 마커 유전자(POU5F1, SOX2, NANOG 및 Lin28A)의 전체 유전자 산란 플롯을 나타내었으며, 각 유전자를 빨간색 원으로 표시하였다.
도 3h에서 확인할 수 있듯이, SLC35F2 KO #1 hESC에서 다능성 마커 유전자(POU5F1, SOX2, NANOG 및 Lin28A)의 발현 수준은 야생형 hESC에 대비하여 변화가 없음을 알 수 있었다.
따라서, YM155로 인한 높은 세포 독성은 SLC35F2의 녹아웃에 의해 완전히 없어졌음을 알 수 있었다.
실시예 5: 공동 표적 선정을 통한 YM155 매개의 세포 농축 선별
SLC35F2 KO hESC의 농축 선택이 YM155 처리에 의해 달성될 수 있다는 점으로부터(도 4a 참조), SLC35F2가 관심 유전자(gene of interest; GOI)와 함께 표적화된 경우 YM155에 대한 유도된 저항성이 유전자 편집된 hPSC를 선별하는 데 유용할 수 있음을 예측할 수 있다.
가설의 증명을 위해, 상대적으로 높은 수준의 SLC35F2를 나타내는 HEK293T 세포를 활용하여 YM155 치료 후 용량-의존적 세포 사멸을 유도하였다(hESC보다 10 배 높은 EC50). 구체적으로, Cas9와 함께 SLC35F2를 표적으로 하는 sgRNA의 간단한 도입에 이은 YM155 처리를 통해, 88.4%의 효율로 유전자 편집 집단을 만들었다(도 4b 및 4c 참조).
다음으로, CCR5(C-C motif Chemokine Receptor)와 함께 SLC35F2의 공동 표적을 시도했다. CCR5 대용 리포터(surrogate reporter) 시스템을 활용하여 CCR5 타겟팅의 효율성을 모니터링하였다. 이 시스템에서, 적색 형광 단백질(monomeric red fluorescent protein; mRFP)은 기본적으로 발현되는 반면, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP)의 발현은 CCR5가 Cas9 발현에 의해 표적화된 후에만 개시된다(도 4d 참조). 따라서, SLC35F2와 CCR5를 공동 표적화하고 GFP 양성 세포의 비율 확인을 통해 CRISPR/Cas9 표적화 효율의 실시간 모니터링을 가능하게 하였다.
서열번호 명칭 서열
3 sgRNA가 특이적으로 결합하는 CCR5 표적화 부위의 핵산 서열 TGACATCAATTATTATACAT
4 CCR5를 표적화하는 sgRNA의 핵산 서열 TGACATCAATTATTATACATCGG
구체적으로, YM155 처리 유무에 관계 없이 CCR5만 또는 CCR5/SLC35F2의 sgRNA 형질전환 후 대용 리포터를 발현하는 HEK293T 세포의 형광 현미경 이미지를 mRFP 양성 군에 대비하여 GFP 비율로 나타내었다. CCR5 및 SLC35F2에 대한 표지 조건(TS: 대용 리포터만, C: CCR5에 대한 sgRNA, S: SLC35F2에 대한 sgRNA, CCR5+SLC35F2: CCR5 및 SLC35F2 모두에 대한 sgRNA)에서 mRFP 양성 집단 대비 평균 GFP 비율을 그래프로 나타내었다.
도 4e에서 확인할 수 있듯이, YM155를 처리하여 GFP 양성 집단의 유의한 증가를 관찰할 수 있었다.
또한, 도 4f 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, 대용 리포터 시스템이 유전자 편집군의 3분의 1 밖에 되지 않는다는 점을 고려할 때, YM155 선택에 따른 25% 이하의 GFP 양성 결과군은 80%의 높은 확률로 유전자가 편집된 군임을 암시하였다.
TS C S Cont YM155
GFP 발현 세포
(%)		 0.465 6.885 0.615 6.665 23.750
다음으로, CCR5 및 SLC35F2의 동시 표적화와 YM155 처리에 의한 CCR5 KO의 농축을 확인하기 위해, CCR5에 대한 T7E1 분석을 수행하였다.
도 4g에서 확인할 수 있듯이, 상대적인 밴드의 밀도를 측정하여 비교한 결과 KO 효율이 뚜렷하게 증가하였다.
결과적으로, SLC35F2의 녹아웃에 의한 YM155 내성의 유도는 유전자 편집 클론의 농축 선별에 유용하였다.
실시예 6: YM155 처리에 의한 유전자 편집 hESCs의 항상성 확인
상기 실시예 5의 결과에 기초하여, HEK293T 세포에서 이 접근법(YM155에 기반한 CRISPR 공동 타겟팅의 농축 선별((YM155-based Enriched Selection of CRISPR Co-15 target), 이하 'YES 접근법')을 시험한 후, 이를 YM155에 보다 민감한 인간 다능성 줄기세포(hPSCs)에 적용하였다. YES-접근법의 개념 증명을 위해 CCR5-표적 hESCs의 생산을 시도하였다.
본 발명자들은 다음과 같은 이유로 이 유전자를 선택하였다.
(i) CCR5(a genomic safe harbor)의 파괴는 hPSC의 다능성에 거의 영향을 미치지 않는다; 및
(ii) 상기 세포가 HIV-1 연구, 예를 들어 CCR5가 고갈된 CD4+ T 세포의 생산에 있어서의 미래 응용 가능성을 가질 수 있다.
이 실험에서, YM155 처리 하에서 여전히 생존할 수 있는 긍정 오류 클론(예: CCR5WT/SLC35F2KO)의 선택을 최소화하기 위해, CCR5 및 SLC35F2를 표적으로 하는 2 가지의 상이한 sgRNA 비율을 사용하였다. CCR5(C) 및 SLC35F2(S)를 표적으로 하는 sgRNA를 이용한 YES-접근법을 통해 7개(C:S = 1:1 비율) 또는 4개(C:S = 2:1) 콜로니가 생존하여 분리되었다.
도 5a 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, CCR5 및 SLC35F2를 표적으로 하는 sgRNA의 상이한 투여율에 따라, 그 중 3개의 클론과 1개의 클론이 각각 CCR5 표적 hESC(25 % 이상의 효율)로 나타났으며, 각각의 KO 클론 수를 요약하여 표기하였다.
C:S 1:1 2:1
CCR5 KO 3/7 1/4
SLC35F2 KO 5/7 4/4
CCR5 KO (%) 42.9 25
다음으로, 대조군(WT) 및 #1에 해당하는 클론(C:S = 1:1)을 선택하여 차세대염기서열분석(NGS)을 수행하였다(도 5b 참조).
구체적으로, Easy-BLUETM RNA 분리 키트(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 세포에서 총 RNA를 추출하고 품질 관리를 수행하였다. 검증된 샘플은 라이브러리 구축에 활용된다. 시퀀싱 라이브러리는 DNA 또는 cDNA 샘플의 무작위 단편화와 5' 및 3' 어댑터 결찰에 의해 준비된다. 원시 RNA-seq 파일(FASTQ)의 리드(read) 품질은 FastQC(v0.11.7)를 사용하여 확인되었으며, 리드의 어댑터 시퀀스는 cutadapt(v1.8.1)를 사용하여 제거되었다. 손질된 FASTQ 파일을 STAR aligner(v2.6.0a)를 사용하여 GRCh38 게놈에 맞춘 다음, Gencode v22 annotation GTF(https://www.gencodegenes.org/human/release_22.html)와 함께 HTseq(v0.11.0)를 사용하여 유전자에 대한 리드 카운트(read count)를 획득하였다.
그 결과, 단일 클론은 85.5% 인델로 나타났으며, 이는 살아남은 클론이 원하는 방식으로 성공적으로 유전자 편집되었음을 의미한다. sgRNA 타겟 서열은 녹색, PAM 서열은 적색으로 표시하였다.
야생형 hESC 대비 SLC35F2 KO hESCs에서 전체 유전자 발현과 다능성 유전자의 발현은 변화하지 않았지만, hESCs에서 SLC35F2의 영구 KO 효과를 배제할 수 없었다. 따라서, SLC35F2 KO 세포에서 발현이 변화된 유전자를 면밀히 검토하기 위해, t-분포 확률적 이웃 삽입(t-distributed stochastic neighbor embedding; t-SNE)을 이용한 RNA-seq 샘플의 클러스터링을 수행하였다.
도 5c에서 확인할 수 있듯이, 비록 전체 전사와 hPSC 신호 모두에서 야생형(NC #1과 NC #2)과 KO 세포(KO #1과 KO #2) 사이에서는 사소한 차이점을 발견하였을 뿐이나, SLC35F2의 원래의 기능과 관련되어 있는 '세포질 전이 금속 이온 항상성(homeostasis)'이 크게 변화되었다.
따라서, SLC35F2의 영구적인 녹아웃으로 인해 발생할 수 있는 바람직하지 않은 편향을 고려하여. SLC35F2의 일시적 녹다운에 의해 일시적으로만 YM155 내성을 유도할 필요가 있음을 확인하였다.
실시예 7: CCR5 표적 hESCs의 확립을 위한 흉터 없는 YES 접근법
YES-접근법은 관심 유전자(GOI) 표적 hESC를 확립하는 데 효과적이었지만, YM155 내성을 유도하기 위한 SLC35F2의 영구 KO는 SLC35F2가 무기 또는 이온 항상성에 미치는 영향이 동종 질병 모델링의 관점에서 문제가 될 수 있다는 점을 배제할 수 없었다.
이 문제를 해결하기 위해, GOI(이 경우, CCR5)를 표적으로 하는 sgRNA 및 SLC35F2를 표적으로 한 siRNA의 도입에 따라, SLC35F2의 고갈에 의해 매개되는 일시적으로 유도된 YM155 저항성이 달성되었다(도 6a 참조).
서열번호 명칭 서열
5 siRNA가 특이적으로 결합되는 SLC35F2 표적화 부위의 핵산 서열 cagatgttgtccttgtgta
6 SLC35F2 표적화 siRNA 핵산 서열 cagauguuguccuugugua
도 6b에서 확인할 수 있듯이, 예상대로 SLC35F2의 고갈은 siRNA 형질도입 5 일 후에 완전히 회복되었다.
또한, 아넥신 V/7-AAD 염색으로 확인한 결과, SLC35F2를 표적으로 한 siRNA의 형질도입 후 도 6c의 왼쪽 패널과 같이 2일째에는 농축 선별이 가능하였으나, 도 6c의 오른쪽 패널과 같이 5일째에는 유도되었던 YM155 저항성이 사라졌다.
이러한 관찰은, SLC35F2를 표적으로 한 siRNA에 의해 유도된 YM155 저항성이 영구적인 흉터 없이 일시적으로만 발생함을 시사하였다.
도 6d에 도시된 바와 같이, CCR5 표적 효율은 YM155 용량 의존적인 방식으로 개선되었다.
도 6e에서 확인할 수 있듯이, 유전자 편집 집단의 돌연변이 패턴은 20 nM YM155 처리에 의해 단순화되었으며, 20 nM 처리 후 생존한 콜로니는 거의 없었다.
도 6f에서 확인할 수 있듯이, YES-접근법에서 얻은 클론 중 하나는 정확하게 CCR5를 표적으로 삼았다.
도 6g에서 확인할 수 있듯이, SLC35F2 발현의 회복과 함께 YM155의 세포 독성은 완전히 회복되었으며, 이는 SLC35F2의 기능 회복을 시사한다.
실시예 8: hESCs에서 유전자 녹아웃(knockout)을 위한 흉터 없는 YES 접근법의 적용 확대
hESC에서 게놈 편집을 위한 흉터 없는 YES 접근법의 높은 효율을 검증하고 일반화하기 위해, 공지된 HEK2 및 HEK3 유전자(GOI)가 추가로 표적화되었다. 이때, HEK2 및 HEK3 표적화 siRNA 핵산 서열은 상기 실시예 7에서 사용한 서열과 동일하며, sgRNA가 특이적으로 결합하는 CCR5 표적화 부위의 핵산 서열 및 CCR5를 표적화하는 sgRNA의 핵산 서열은 상기 실시예 5에서 사용한 서열과 동일하다.
서열번호 명칭 서열
7 siRNA가 특이적으로 결합되는 HEK2 표적화 부위의 핵산 서열 GAACACAAAGCATAGACTGCGGG
8 siRNA가 특이적으로 결합되는 HEK3 표적화 부위의 핵산 서열 GGCCCAGACTGAGCACGTGATGG
도 7a 및 7b에서 확인할 수 있듯이, CCR5, HEK2 및 HEK3의 인델 빈도는 일관성 있게 YES-접근법에 의해 크게 개선되었다.
또한, 게놈 편집 효율을 쉽게 정량화하기 위해, Cas9(Cas9-EGFP #1)를 안정적으로 발현하는 녹색 형광 단백질(EGFP) 리포터 hESC를 추가로 확립하였다(도 7c 참조). EGFP에 sgRNA를 도입한 후에는 EGFP 음성 집단을 측정하여 EGFP 목표 효율을 간단히 결정하였다(도 7d 참조).
구체적으로, H9 세포(hESCs)에 PiggyBac 시스템을 이용하여 Cas9-2A-EGFP 유전자(플라스미드 벡터)를 임의로 도입하고, 유세포 분석(FACS)을 통해 EGFP가 발현되는 세포들을 수집하였다. 그 다음, 단일 세포에서 유래한 각각의 콜로니들의 염기 서열을 분석하여 실제로 Cas9 및 EGFP가 발현되는 클론을 확립하였다.
도 7e 및 7f에서 확인할 수 있듯이, EGFP 음성 집단은 흉터 없는 YES-접근법에 의해 뚜렷하게 증가하였다. 구체적으로, sgRNA만 처리했을 경우의 타겟팅 효율(도 7e의 빨간색 히스토그램)과 비교했을 때, YES-접근법(SLC35F2의 siRNA 처리 후 YM155 선별)으로 선별한 세포들의 타겟팅 효율(도 7e의 주황색 히스토그램)이 월등히 증가하였다.
실시예 9: ssODN을 이용한 유전자 녹인(knock-in)에의 적용
한편, hESC에서의 유전자 녹인(Knock-in; KI)은 환자 iPSC의 유전자 교정뿐만 아니라 동종 질병 모델링을 위한 높은 수요에도 불구하고, 극히 낮은 효율이 중요한 기술적 장애물로 남아있다.
따라서, 흉터 없는 YES-접근법을 유전자 녹인(KI)에도 적용할 수 있는지 조사하였다. 내부(In house)에서 보유하고 있는 서로 다른 세 종류의 유전자(EYA4, TMEM67 또는 SLC6A5)의 인트론 부위(sgRNA 표적화에 의한 유전자 기능 손실을 방지)를 sgRNA로 타겟 후, 동시에, 전기천공법(electroporation)으로 EYA4, TMEM67 또는 SLC6A5 유전자좌에 각각을 표적화하는 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(single stranded oligodeoxynucleotides; ssODN)를 전달하여 흉터 없는 YES-접근법의 유무에 따른 상동성-지정 복구(homology-directed repair; HDR)-매개 KI(도 8a) 적용 가능성을 확인하였다. 이때, siRNA가 특이적으로 결합하는 SLC35F2 표적화 부위의 핵산 서열은 상기 실시예 7에서 사용한 서열과 동일하다.
서열번호 명칭 서열
9 EYA4를 표적화하는 ssODN의 핵산 서열
 cttgtcctgcttcagttccttttcccaactacttagctagttcCAGCTGcaggctatccaaactctcaccGGGcaatgatttcatcaataataacttatg
10 TMEM67을 표적화하는 ssODN의 핵산 서열 ctattactataaagctgaggactctcaaaggcccttcagagCAGCTGtattgacaagaacgtgaactctgGGGtcaggctgcctgagttccaattccagt
11 SLC6A5를 표적화하는 ssODN의 핵산 서열 gtggagtctgctgtaatttagcttgcaaagaatgccttcaccCAGCTGtgggtgctttagggaggcagctgaaatggaagcagactgaatattttgaaat
서열번호 명칭 서열(PAM 서열 제외)
12 EYA4를 표적화하는 sgRNA의 핵산 서열
(sgRNA가 특이적으로 결합하는 EYA4 표적화 부위의 핵산 서열)		 agagtttggatagcctgtat
13 TMEM67을 표적화하는 sgRNA의 핵산 서열
(sgRNA가 특이적으로 결합하는 TMEM67 표적화 부위의 핵산 서열)		 gttcacgttcttgtcaatag
14 SLC6A5를 표적화하는 sgRNA의 핵산 서열(sgRNA가 특이적으로 결합하는 SLC6A5 표적화 부위의 핵산 서열) ttgcaaagaatgccttcacc
구체적으로, 인간 배아 줄기세포(hESCs)를 단일 세포로 분리한 후 1x106의 세포를 카운팅하였다. 그 다음, 전기천공법(electroporation)을 이용하여 Cas9 벡터 2ug, sgRNA 2ug, ssODN 5ug 및 siRNA 2ug을 세포 내부로 전달하였다. 벡터 형질주입(transfection) 2일 후, YM155 20nM을 6시간 동안 처리한 후 세척(wash-off)하여 YES-선별하였다. 4-5일 후, 선별된 세포로부터 gDNA을 추출하여 차세대염기서열(NGS) 분석을 진행하였다.
도 8a 및 8b에서 확인할 수 있듯이, KO 뿐만 아니라 KI의 유전자 편집 효율은 YES-접근법에 의해 12.5%까지 현저히 증가하였다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Methods for selecting genetically modified cells from undifferentiated pluripotent stem cells <130> PN190024P <150> KR 10-2019-0056334 <151> 2019-05-14 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agtgccactt ccgtcaacct 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC35F2 sgRNA <400> 2 tgacatcaat tattatacat cgg 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 tgacatcaat tattatacat 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR5 sgRNA <400> 4 tgacatcaat tattatacat cgg 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 5 cagatgttgt ccttgtgta 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC35F2 siRNA <400> 6 cagauguugu ccuugugua 19 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 7 gaacacaaag catagactgc ggg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 8 ggcccagact gagcacgtga tgg 23 <210> 9 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EYA4 ssODN <400> 9 cttgtcctgc ttcagttcct tttcccaact acttagctag ttccagctgc aggctatcca 60 aactctcacc gggcaatgat ttcatcaata ataacttatg 100 <210> 10 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMEM67 ssODN <400> 10 ctattactat aaagctgagg actctcaaag gcccttcaga gcagctgtat tgacaagaac 60 gtgaactctg gggtcaggct gcctgagttc caattccagt 100 <210> 11 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A5 ssODN <400> 11 gtggagtctg ctgtaattta gcttgcaaag aatgccttca cccagctgtg ggtgctttag 60 ggaggcagct gaaatggaag cagactgaat attttgaaat 100 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EYA4 sgRNA <400> 12 agagtttgga tagcctgtat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMEM67 sgRNA <400> 13 gttcacgttc ttgtcaatag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC6A5 sgRNA <400> 14 ttgcaaagaa tgccttcacc 20

Claims (12)

  1. 다음의 단계를 포함하는 유전자 편집된 세포의 선별 방법:
    미분화 만능 줄기세포(undifferentiated pluripotent stem cells)에서 SLC35F2 유전자를 표적화하여 유전자 편집을 진행하는 유전자 편집 단계로, 상기 유전자 편집은 서열번호 6의 서열을 갖는 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)를 세포에 도입하여 SLC35F2 유전자의 발현을 억제하는 것인, 유전자 편집 단계; 및
    YM155(CAS 781661-94-7)를 처리하여 SLC35F2 유전자의 발현이 억제되지 않은 세포를 선택적으로 사멸시키는 세포 사멸 유도 단계.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 방법에 의해 선별된 세포는 1종 이상의 관심 유전자(gene of interest; GOI)를 표적화하여 유전자 편집된 세포를 포함하는 것인, 유전자 편집된 세포의 선별 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 유전자 편집은 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA) 및 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(single stranded oligodeoxynucleotides; ssODN)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 추가로 세포에 도입하여 수행되는 것인, 유전자 편집된 세포의 선별 방법.
  4. 삭제
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 ssODN은 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 핵산인, 유전자 편집된 세포의 선별 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 관심 유전자는 상기 관심 유전자에 서열 변이가 발생하면 발현되는 리포터 유전자가 상기 관심 유전자의 다운스트림에 작동가능하게 연결된 것인, 유전자 편집된 세포의 선별 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 서열 변이는 프레임 이동 돌연변이(frame shift mutation)인, 유전자 편집된 세포의 선별 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 리포터 유전자는 업스트림에 전사 종결 구조를 형성하는 핵산 서열이 삽입된 것인, 유전자 편집된 세포의 선별 방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 리포터 유전자는 형광 단백질, 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마아제(β-lactamase), TEV-프로테아제(TEV-protease), 디히드로엽산환원효소(Dihydrofolate reductase), 루시퍼라제(luciferase), 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase), 선택마커(selection marker), 표면 마커 유전자(surface marker gene) 및 항생제 저항성 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것인, 유전자 편집된 세포의 선별 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 미분화 만능 줄기세포는 배아 줄기세포(Embryonic Stem Cell; 이하 ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; 이하 iPSCs), 배아 생식세포, 배아 종양세포 및 성체 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 유전자 편집된 세포의 선별 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 YM155의 농도는 10 내지 2000 nM인 것인, 유전자 편집된 세포의 선별 방법.
  12. 삭제
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