KR102394484B1 - 온라인 초임계유체추출-초임계유체크로마토그래피-질량분석법을 이용한 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 온라인 초임계유체추출-초임계유체크로마토그래피-질량분석법을 이용한, 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법에 관한 것이다.

Description

온라인 초임계유체추출-초임계유체크로마토그래피-질량분석법을 이용한 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법 {METHOD FOR EXTRACTION, SEPARATION AND ANALYSIS OF NITROSAMINE COMPOUND USING ON-LINE SUPERCRITICAL FLUID EXTRACTION, SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY AND MASS SPECTROMETRY}
본 발명은 온라인 초임계유체추출-초임계유체크로마토그래피-질량분석법을 이용한 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법에 관한 것이다.
니트로사민(Nitrosamine 또는 Nitrosoamine)은 일반식 RR'N-N=O로 표시되는 화합물의 총칭으로 한 분자 내에 나이트로소기(-N=O)와 아민기(RR'N-)가 함께 있는 화합물이다. 이는 자연적으로 발생하거나 의약품 합성/제조 공정 과정 등에서 발생하기도 하는데, 니트로사민 화합물은 대부분 발암성을 가지며 간장, 식도 등에서 암을 발생시키기도 한다고 알려져 있다.
FDA에서는 의약품 내 존재할 수 있는 니트로사민 불순물 종류로 N-니트로소다이메틸아민(N-Nitrosodimethylamine; NDMA)과 N-니트로소다이에틸아민(N-Nitrosodiethylamine; NDEA)을 포함한 7가지 종류를 제시하였다. 그 중 강력한 발암 물질로 알려져 있는 NDMA와 NDEA는 국제 암 연구소(IARC)에서 2A 등급으로 분류하는 발암물질로, 물리화학적 특성과 의약품 내에 존재하는 매트릭스로 인하여 두 성분을 선택적으로 분리하여 추출하는데 어려움이 있다.
기존 니트로사민 불순물 검출 방법으로는 LC-HRMS, LC-MS/MS, GC-MS, GC-MS/MS법 등이 국내외에 알려져 있으나, NDMA 및 NDEA과 같은 니트로사민의 물리화학적 성질과 미량분석이라는 특성으로 인해, 기존의 방법으로는 의약품 내 존재하는 매트릭스와 분리하여 니트로사민을 효과적으로 검출, 분석하기 어렵다.
특히 최근에는 발사르탄을 비롯하여 라니티딘, 니자티딘, 메트포르민 등의 의약품에서 FDA 허용 기준치를 초과하는 NDMA가 검출되며 전세계적으로 합성 의약품 내 니트로사민 불순물에 대한 이슈가 있었다. 이에 따라 국내에서도 NDMA이 검출된 발사르탄, 라니티딘 및 메트포르민에 대해 잠정 제조수입판매 금지 조치가 내려진 바 있다.
이러한 이슈를 통해서도 확인할 수 있듯이, 현재 알려진 니트로사민 화합물 검출, 분석 방법은 그 정확성이 현저히 떨어진다. 뿐만 아니라, 의약품 원료나 제제 등과 같은 경우 다양한 합성, 제조 방법으로 인하여 매트릭스가 복잡, 다양하고 의약품 원료 및 제제의 종류에 따라 전처리 및 분석장비를 달리해야 하므로, 그 분석에 어려움이 있다.
또한 복용량에 따른 니트로사민 화합물 검출 기준이 상이하며, ppb(parts per billion) 수준으로 분석을 해야 하므로 일반적으로 적용할 수 있는 분석법 제시가 절실하게 요구되는 상황이다.
본 발명의 목적은 초임계유체추출-초임계유체크로마토그래피-질량분석법을 이용한, 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분석대상시료로부터 니트로사민 화합물을 간편, 정확 및 효율적으로 분석하고 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 초임계유체추출-초임계유체크로마토그래피-질량분석법을 이용하여 분석대상시료로부터 니트로사민 화합물을 추출, 분리 및 분석하는 최적의 조건을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분석대상시료로부터 니트로사민 화합물을 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 출원에서 사용한 용어는 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명은 SFE-SFC-MS/MS을 이용한, 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, 니트로사민 화합물을 초임계유체추출을 이용하여 추출하는 단계, 초임계유체크로마토그래피를 이용하여 분리하는 단계 및 질량분석법을 이용하여 분석하는 단계를 포함하는, 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 니트로사민 화합물은 N-니트로소다이메틸아민 (N-Nitrosodimethylamine; NDMA) 및 N-니트로소다이에틸아민(N-Nitrosodiethylamine; NDEA)으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 초임계유체추출은 SFE, 초임계유체크로마토그래피는 SFC, 질량분석법은 MS/MS라고 약칭할 수 있다. 또한, '초임계유체추출-초임계유체크로마토그래피-질량분석법' 시스템은, 'SFE-SFC-MS/MS'라고 약칭할 수 있다. N-니트로소다이메틸아민은 'NDMA', N-니트로소다이에틸아민 'NDEA'라고 할 수 있다. 이동상으로 사용되는 이산화탄소는 'CO2', 아세토나이트릴은 'ACN', 메탄올은 'MeOH', 에탄올은 'EtOH', 이소프로필알코올은 'IPA', 포름산은 'FA', 트리플루오로아세트산은 'TFA'로 약칭할 수 있다.
상기 시스템은 SFE, SFC 및 MS/MS를 연속적으로 실시할 수 있는 시스템으로, 일련의 과정이 자동으로 이루어지는 온라인(on-line) 시스템일 수 있다. 즉, 분석대상시료로부터 분석 물질의 추출, 분리, 분석의 각 모듈(module)이 하이픈("-")으로 연결된 연속적 과정을 진행할 수 있는 온라인 시스템으로서, 추출, 분리 및 분석을 위해 지속적인 모니터링을 수행하지 않아도 된다는 편의성을 제공할 수 있다.
상기 SFE-SFC-MS/MS 시스템은, SFE을 통해 추출된 분석 물질이 컬럼(column)에 직접 트랩(trap)되고, SFC로 분리한 뒤 MS/MS로 검출 및 정량 하는 온라인 통합 시스템(도 1)일 수 있다. 이 시스템은 빛에 민감하거나 공기 중에 노출되면 쉽게 가수분해 되는 열에 약한 시료, 휘발되거나 불안정한 화합물을 손실 없이 추출, 분리 및 분석 가능하게 할 수 있다.
또한 일련의 과정이 자동으로 이루어지므로, 추출, 분리 및 분석 과정에서 시료의 분해나 오염 등이 발생할 위험이 적고, 일반적인 용매 추출 및 분석법과 비교하여 인체에 무해한 초임계유체인 CO2를 사용하므로 유해 시약의 사용을 최소화한 친환경적인 분석법일 수 있다.
본 발명의 SFE-SFC-MS/MS 시스템은 초임계 유체를 사용하고 그 특성을 이용함으로써, 분석대상시료의 유형 또는 매트릭스의 영향을 최소화하면서 고체 시료로부터 니트로사민 화합물을 선택적으로 추출할 수 있다. 또한 용매 추출 시 동반되는 희석 과정이 없는 시스템으로서 고감도의 추출, 분리 및 분석이 가능한 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 SFE-SFC-MS/MS의 분석대상시료는 특별히 한정하지 않으며 다양한 시료가 응용 가능할 것이나, 본 발명의 일 실시예로서 분석대상시료는 의약품 원료 및 제제로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로는 메트포르민, 발사르탄, 트라마돌, 라니티딘, 니자티딘 원료 또는 이들을 포함하는 제제일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법은, 분석대상시료의 종류 등에 따라 전처리 및 분석 방법을 다르게 하지 않아도 된다는 장점을 제공할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 매트릭스가 복잡한 의약품 원료나 제제 자체의 영향을 최소화함으로써, 동일한 조건하에서 니트로사민 화합물을 추출, 분리 및 분석하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 사용하는 초임계 유체는 상응하는 용매를 가온 및 가압하여 제조할 수 있으며, 본 발명에서 초임계 유체로는 이산화탄소를 사용할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
초임계유체추출 (SFE)
본 발명의 SFE-SFC-MS/MS를 이용하는 방법에 있어서, SFE는 용매 추출과 증류의 원리가 복합적으로 적용되는 추출법으로 볼 수 있으며, 높은 용해력, 신속한 물질 및 열 이동, 저점도, 고확산계수로 인한 미세공으로의 빠른 침투성과 같은 장점을 이용하여 추출하는 방법일 수 있다.
상기 SFE는 압력, 온도의 조작에 의해 고밀도 상태의 조건 설정이 가능하기 때문에 분획, 분리 등의 선택성이 뛰어나 성분을 고순도로 얻을 수 있고, 비교적 저온에서 추출하기 때문에 열에 의한 성분의 손실을 막을 수 있는 장점을 제공할 수 있다.
즉, SFE을 통해 다양한 분석대상시료, 일례로서 의약품의 원료 또는 제제에서 손상이나 손실 없이 니트로사민 화합물을 추출하는 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 SFE-SFC-MS/MS를 이용하는 방법에 있어서, 상기 SFE는 다음의 조건으로 수행하는 것일 수 있다. 다음의 조건으로 실행하는 경우 미량으로 존재하는 니트로사민 화합물을 매트릭스의 영향을 최소화하면서 선택적으로 추출할 수 있다.
(1) 추출 용매: CO2:변형제 = 100:0 내지 95:5 (v/v), 보다 구체적으로는 CO2 100%일 수 있다.
상기 추출 용매는 CO2를 초임계 유체로 이용하고, 보조 추출용매로서 변형제(modifier)를 함께 사용할 수 있다. 상기 변형제는 ACN, MeOH, EtOH 및 IPA로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 ACN일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
이 경우 의약품 원료 및 제제 등과 같은 분석대상시료에 미량으로 존재하는 니트로사민 화합물을 매트릭스의 영향을 최소화하면서 선택적으로 추출할 수 있다.
(2) 추출 용매 유량: 1 내지 5mL/분, 보다 구체적으로는 3 내지 5mL/분, 더욱 구체적으로는 5mL/분일 수 있다.
상기 추출 용매 유량이 1mL/분 미만이면 시간 대비 효율이 떨어지고, 5mL/분을 초과하면 적절한 추출이 이루어지지 않아 수율이 떨어질 수 있다.
(3) 정적 추출(static extraction) 시간: 2 내지 7분, 보다 구체적으로는 3 내지 6분, 더욱 구체적으로는 5분일 수 있다.
상기 정적 추출 시간이 2분 미만인 경우 추출이 완전히 이루어지지 않아 추출 효율이 떨어질 수 있으며, 7분을 초과하는 경우 분석 시간 대비 추출 효율이 떨어지는 문제가 있다.
(4) 동적 추출(dynamic extraction) 시간: 1 내지 4분, 보다 구체적으로는 1 내지 3분, 더욱 구체적으로는 2분일 수 있다.
상기 동적 추출 시간이 1분 미만인 경우 추출된 성분이 컬럼에 트랩될 수 없으며, 4분을 초과하는 경우 추출된 성분이 컬럼에 트랩되는 과정에서 컬럼 내부에서 용리가 일어나 크로마토그램의 형태가 불량할 수 있다.
(5) 추출 시 압력 조절기(Back Pressure Regulator; BPR)의 압력: 15MPa 내지 18MPa, 보다 구체적으로는 16MPa 내지 18MPa, 더욱 구체적으로는 17MPa일 수 있다.
상기 압력 조절기 압력이 15MPa 미만인 경우 추출 효율이 떨어져 분석이 어려울 수 있으며, 18MPa을 초과하는 경우 미지의 피크가 NDMA 등의 니트로사민 성분 피크와 겹쳐 분석이 어려울 수 있다.
(6) 추출용 용기(vessel) 온도: 40 내지 70℃, 보다 구체적으로는 50 내지 70℃, 더욱 구체적으로는 60℃일 수 있다.
추가로, 초임계 유체가 추출용 용기 내에서 균질하게 확산되고, 시료에 고르게 침투하여 추출 효율 및 재현성을 확보할 수 있도록 추출용 용기에 탈수제(dehydrate)를 투입하는 것도 가능하다. 상기 탈수제는 분석대상시료에 수분이 존재할 경우 수분의 유출을 막아 라인의 막힘을 예방하고, 시료에 초임계 유체의 침투를 균질하고 용이하게 하여 추출 효율 향상과 재현성 확보를 위한 용도로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서 상기 탈수제(dehydrate)로 MIYAZAKI Hydro-Protect를 사용할 수 있다. 일례로서 추출용 용기에 탈수제로 MIYAZAKI Hydro-Protect와 일정량의 시료를 넣고 4N의 힘으로 상하부 캡을 조여 조립하고 rack changer에 장착할 수 있다.
용기 내 탈수제의 양은 100 내지 500mg일 수 있으며, 보다 구체적으로는 200 내지 300mg, 더욱 구체적으로는 250mg일 수 있다.
탈수제의 양이 100mg 미만인 경우, 피크 면적의 재현성이 불량할 수 있으며, 500mg을 초과하는 경우 분석하고자 하는 샘플을 투입할 공간이 부족해 탈수제나 샘플의 양을 조절할 필요가 발생할 수 있으며, 추출 용매의 흐름을 방해할 수 있다.
상기 SFE 조건은 분석대상시료 10 내지 1000mg, 보다 구체적으로는 20 내지 930mg을 기준으로 한 것일 수 있다.
초임계유체크로마토그래피 (SFC)
본 발명의 SFE-SFC-MS/MS를 이용하는 방법에 있어서, SFC는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 가스크로마토그래피(GC) 등 대비 분리 효율의 감소 없이 더 빠른 유속에서 분리가 이루어질 수 있다. 또한 초임계 유체의 낮은 점도는 컬럼 전반에 걸리는 압력을 낮아지게 하여, 상대적으로 길이가 길거나 작은 입자의 고정상이 충전된 컬럼에 높은 유속을 적용할 수 있어, 시간을 단축하면서도 정확한 고효율 분리를 실현하게 할 수 있다.
본 발명의 SFE-SFC-MS/MS를 이용하는 방법에 있어서, 상기 SFC는 다음의 조건으로 수행하는 것일 수 있다.
(1) 이동상 조성: CO2:이동상 변형제 = 95:5 내지 75:25 (v/v)일 수 있으며, 보다 구체적으로는 CO2:이동상 변형제 = 85:15 (v/v)일 수 있다.
구체적으로는, 상기 이동상으로 CO2를 초임계유체로 사용하고, 보조용매로 이동상 변형제(modifier)를 사용하는 것일 수 있다. 상기 이동상 변형제는 ACN, MeOH 및 EtOH로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 보다 구체적으로는 ACN일 수 있다.
전체 이동상 조성을 기준으로 이동상 변형제의 비율이 5% (v/v) 미만인 경우, 유지시간이 길어지고 크로마토그램의 형태가 불량할 수 있다. 이동상 변형제의 비율이 25% (v/v) 초과인 경우 니트로사민 화합물과의 분리도가 저하되어 분석이 어려울 수 있으며, 초임계 유체의 형성을 방해할 수 있다.
이동상 변형제의 종류와 구성 비율이 상기한 범위 이내인 경우 SFC-MS/MS 분석에서 니트로사민 화합물의 감도 및 분리능(resolution, Rs)을 우수하게 하고, 유지 시간(retention time, RT)을 적절하게 조절할 수 있다.
(2) 이동상 유량: 1 내지 3mL/분, 보다 구체적으로는 1mL/분일 수 있다.
(3) 컬럼 종류: 입자 사이즈는 2 내지 10㎛, 보다 구체적으로는 4 내지 6㎛, 더욱 구체적으로는 5㎛이며; 컬럼의 길이(Length; L)는 150 내지 300mm, 보다 구체적으로는 200 내지 270mm, 더욱 구체적으로는 250mm이며; 컬럼의 내경(Internal Diameter; I.D.)은 2.1 내지 10mm, 보다 구체적으로는 4mm 내지 6mm, 더욱 구체적으로는 4.6mm일 수 있다.
상기 컬럼의 작용기는 C18, C30, 아민 및 아마이드로부터 선택되는 1종일 수 있으며, 보다 구체적으로는 아민 또는 아마이드 일 수 있다. 즉, 본 발명의 SFE-SFC-MS/MS를 이용하는 방법에 있어, SFC는 C18 컬럼, C30 컬럼, 아민 컬럼 및 아마이드 컬럼으로부터 선택되는 1종으로 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로는 아민 컬럼 또는 아마이드 컬럼으로 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 아마이드 컬럼으로 SFC를 수행할 수 있다.
상기 컬럼의 충진제는 실리카(silica)일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
(4) 컬럼 온도: 40 내지 60℃, 보다 구체적으로는 50℃일 수 있다.
추가로, 본 발명의 SFE-SFC-MS/MS 시스템에서는 초임계크로마토그래피 시 보조(make up)용매를 투입하여 흘려주는 것도 가능하다. 보조용매를 사용하는 경우 이동상의 휘발에 따른 재현성 및 감도 저하를 막을 수 있다. 상기 보조용매는 ACN, TFA 및 FA로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로 100% ACN, ACN 중 0.1% TFA(0.1% TFA in ACN) 또는 ACN 중 0.1% FA(0.1% FA in ACN)일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 ACN 중 0.1% FA일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 이 때 상기 %는 v/v를 의미한다.
상기 보조용매의 유량은 0mL/분 초과 0.2mL/분 이하, 보다 구체적으로는 0.1mL/분일 수 있다. 이 경우 NDMA와 NDEA 두 성분의 바람직한 피크 면적 및 피크 형태를 얻을 수 있다.
보조용매는 BPR 전 또는 후에 흘려줄 수 있다.
상기 초임계유체크로마토그래피에서의 압력 조절기(BPR)의 압력은 당업계의 통상의 기술자가 목적 등에 따라 적절하게 조절할 수 있다. 본 발명의 일 실시예로서, SFC 시 압력 조절기(BPR)의 압력은 15MPa 내지 18MPa, 보다 구체적으로는 15MPa 내지 17MPa, 더욱 구체적으로는 15MPa일 수 으나 이에 한정하지 않는다.
질량분석법 (MS/MS)
본 발명의 SFE-SFC-MS/MS를 이용하는 방법에 있어서, MS/MS는 다음의 조건으로 수행하는 것일 수 있다.
(1) 이온화 방법: 이온화 방법으로는 대기압 화학 이온화법(APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionization)을 사용할 수 있다.
(2) 분무 기체(Nebulizing gas) 유량: 1 내지 4L/분, 보다 구체적으로 3L/분일 수 있다.
이 때 상기 분무 기체는 질소일 수 있다.
(3) 인터페이스(Interface) 온도: 200 내지 500℃, 보다 구체적으로 350℃일 수 있다.
(4) 탈 용매화 라인(Desolvation Line; DL) 온도: 100 내지 300℃, 보다 구체적으로 200℃일 수 있다.
(5) 가열 블록(Heat Block) 온도: 100 내지 300℃, 보다 구체적으로 200℃일 수 있다.
추가로, 본 발명의 SFE-SFC-MS/MS 시스템에서는 질량분석법 시 건조 기체(Drying gas)를 투입하는 것도 가능하다. 상기 건조 기체를 투입하는 경우 분석 시료의 이온화 효율을 증가시킬 수 있다. 이 때 상기 건조 기체의 유량은 0L/분 초과 10L/분 이하일 수 있으며, 보다 구체적으로는 5L/분일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서 상기 질량분석법은 이중질량분석법(Tandem Mass Spectrometry)일 수 있다.
또한, 상기 질량분석법에서 분석 물질의 정량분석은 보다 구체적으로는 질량분석기의 다중반응모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM) 모드를 사용하여 수행하는 것일 수 있다.
상기 질량분석법에서의 인터페이스 전압(Interface voltage), 탈 용매화 온도(Desolvation temperature) 및 충돌 유도 해리(Collision induced dissociation; CID) 가스 압력 등은 당업계의 통상의 기술자가 목적 등에 따라 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명의 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법의 검출 한계는 0.2ng/g일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 본 발명의 추출, 분리 및 분석 방법의 검출 한계는 니트로소다이메틸아민 및 니트로소다이에틸아민 각각에 대해 0.2ng/g일 수 있다.
본 발명의 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법의 정량 한계는 0.5ng/g일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 본 발명의 추출, 분리 및 분석 방법의 정량 한계는 니트로소다이메틸아민 및 니트로소다이에틸아민 각각에 대해 0.5ng/g일 수 있다.
본 발명의 SFE-SFC-MS/MS는 앞서 설명한 SFE, SFC 및 MS/MS의 조건을 조합하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서, 본 발명의 SFE-SFC-MS/MS는 다음의 조건으로 수행될 수 있다.
이 때 초임계유체추출(SFE)은,
(1) 추출 용매: CO2:변형제 = 100:0 내지 95:5 (v/v),
(2) 추출 용매 유량: 1 내지 5mL/분,
(3) 정적 추출(static extraction) 시간: 2 내지 7분,
(4) 동적 추출(dynamic extraction) 시간: 1 내지 4분,
(5) 추출 시 압력 조절기(BPR)의 압력: 15MPa 내지 18MPa, 및
(6) 추출용 용기(vessel) 온도: 40 내지 70℃의 조건;
이 때 초임계유체크로마토그래피(SFC)는,
(1) 이동상 조성: CO2:이동상 변형제 = 95:5 내지 75:25 (v/v),
(2) 이동상 유량: 1 내지 3mL/분,
(3) 컬럼 종류: 컬럼의 작용기가 아마이드 또는 아민인 컬럼, 및
(4) 컬럼 온도: 40 내지 60℃의 조건; 및
이 때 질량분석법(MS/MS)은,
(1) 이온화 방법: 대기압 화학 이온화법(APCI),
(2) 분무 기체 유량: 1 내지 4L/분,
(3) 인터페이스 온도: 200 내지 500℃,
(4) 탈 용매화 라인(DL) 온도: 100 내지 300℃, 및
(5) 가열 블록 온도: 100 내지 300℃의 조건으로 수행될 수 있다.
위 조건에 대해서는 앞서 설명한 내용이 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명의 분석대상시료로부터 니트로사민 화합물을 효과적으로 추출, 분리 및 분석하는 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 방법은, 니트로사민 화합물 중 NDMA 및 NDEA를 동시에 분석할 수 있으며, 특히 다양한 의약품에 적용 가능하다.
또한 본 발명은 NDMA 및 NDEA에 대한 선택성 및 감도를 우수하게 하며 두 성분을 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 초임계 유체를 이용하여 추출 및 분석에서 추출 용매 및 이동상으로 사용하는 유해한 유기 용매의 양을 최소화한 환경 친화적인 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 매트릭스의 영향을 최소화하여 의약품 원료 및 제제뿐 아니라 다양한 시료에서 미량으로 존재하는 NDMA와 NDEA 등 니트로사민 화합물의 분석에 유용하게 활용되는 방법을 제공할 수 있다.
분석대상시료의 물리 화학적 성질, 합성 방법 및 제조 방법 등으로부터 기인하는 다양한 매트릭스의 영향 등을 최소화하여 다양한 시료에 범용으로 적용 가능한 추출, 분리 및 분석 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면 기존의 방법과 동등한 수준의 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있다.
도 1은 SFE-SFC-MS/MS 시스템의 작동원리를 나타낸 도면이다.
도 2는 특이성 검체(메트포르민)의 SFE-SFC-MS/MS 크로마토그램이다.
도 3은 특이성 검체(발사르탄)의 SFE-SFC-MS/MS 크로마토그램이다.
도 4는 특이성 검체(트라마돌)의 SFE-SFC-MS/MS 크로마토그램이다.
도 5는 특이성 검체(니자티딘)의 SFE-SFC-MS/MS 크로마토그램이다.
도 6은 특이성 검체(라니티딘)의 SFE-SFC-MS/MS 크로마토그램이다.
도 7은 표준시료 농도에 따른 NDEA의 검량선(Calibration curve)이다.
도 8은 표준시료 농도에 따른 NDMA의 검량선(Calibration curve)이다.
도 9는 0.2ng/g NDMA에서의 크로마토그램 상의 S/N 비가 2.82임을 나타낸 도면이다.
도 10은 0.2ng/g NDEA에서의 크로마토그램 상의 S/N 비가 6.0임을 나타낸 도면이다.
도 11은 0.5ng/g NDMA에서의 크로마토그램 상의 S/N 비가 11.4임을 나타낸 도면이다.
도 12는 0.5ng/g NDEA에서의 크로마토그램 상의 S/N 비가 33.13임을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않으며, 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
<시약>
ACN, MeOH, FA는 Thermo Fisher Scientific사(Fair Lwan, NJ, USA)의 LC-MS급을 사용하였으며, EtOH, IPA은 Honeywell Burdick & Jackson (Muskegon, USA)의 HPLC급을 사용하였고, CO2는 Instrument grade; > 99.999 % purity인 KS Tech Co., Ltd.사(Anseong-City, Gyeonggi-Do, Korea)의 제품을 사용하였다.
표준물질로는 NDMA (순도(Purity): 100% by GC/MS, 1,002㎍/mL in MeOH), NDEA (순도: 100% by GC/MS, 1,002㎍/mL in MeOH)을 사용하였으며, 내부표준물질로는 NDMA-d6 (순도: 99.2% by GC/MS, 993㎍/mL in MeOH), NDEA-d10 (순도: 99.6% by GC/MS, 999㎍/mL in MeOH)을 AccuStandard, Inc. (New Haven, USA)에서 구입하여 사용하였다.
SFE 추출 시 첨가하는 탈수제는 Shimadzu 사의(Kyoto, Japan) MIYAZAKI Hydro-Protect®(Patent No. JP.3645552.B2)를 사용하였다.
<기기>
추출, 분리 및 분석에 Shimadzu사의 Nexera UC On-line SFE-SFC-MS/MS(Kyoto, Japan)를 사용하였고, 실험계획법의 통계 처리는 Fusion Pro Version 9.9.0 Build 690 program(S-Matrix corporation, USA)을 사용하였다. 컬럼은 Tsk-gel Amide-80(4.6mm I.D. ⅹ 250mm L, 5㎛)을 사용하였다.
제조예 1. 표준액 및 검량선용 시료의 제조
표준물질 NDMA 1,000㎍/mL와 NDEA 1,000㎍/mL를 각각 100㎕씩 정확하게 정량하고, 메탄올을 넣어 정확하게 10mL로 만들어 이를 표준원액-Ⅰ[ST Stock sol. I(10㎍/mL)]로 하였다. 이 표준원액-I 1mL에 메탄올을 넣어 정확하게 10mL로 만들고 이를 표준원액-Ⅱ[ST Stock sol. Ⅱ(1㎍/mL)]로 하였다.
내부표준물질 NDMA-d6 1,000㎍/mL와 NDEA-d10 1,000㎍/mL를 각각 500㎕씩 정확하게 정량하고, 메탄올을 넣어 정확하게 50mL로 제조하였다(10㎍/mL). 이 액 5mL에 메탄올을 넣어 정확하게 20mL로 만들고 이를 내부표준원액[I.S. Stock sol. (2.5㎍/mL)]으로 하였다.
상기 원액(표준원액-I, 표준원액-Ⅱ 및 내부표준원액)을 이용하여 하기 표 1의 조성으로 표준액(ST, No.1 내지 7)과 내부표준액(I.S.)을 제조하였다. 구체적으로, 표준액 No.1 내지 7은 NDMA 및 NDEA를 각각 5, 10, 30, 50, 100, 250 및 500ng/mL의 농도로 포함하고, NDMA-d6 및 NDEA-d10을 250ng/mL의 농도로 포함하였다. 내부표준액은 NDMA-d6 및 NDEA-d10을 250ng/mL의 농도로 포함하였다.
이 제조방법에 따라 제조한 표준액을 분석법의 검증 및 실제 분석에 사용하였다. 모든 원액은 사용 전까지 -20℃에 보관하였으며, 표준액 및 내부표준액은 분석 시 제조하고 차광 용기에 보관하였다.
[표 1]
Figure 112021073497805-pat00001
제조예 2. 분석대상시료의 준비
분석대상시료는 메트포르민(Metformin) 원료 1종 및 제제 4종, 니자티딘(Nizatidine) 원료 1종, 라니티딘(Ranitidine) 원료 및 제제 각 1종, 발사르탄(Valsartan) 원료 및 제제 각 1종, 트라마돌(Tramadol) 원료 1종 및 제제 2종을 검체로 하였다. 검체는 하기 표 2를 참고하여 해당량을 측정하여 탈수제 250mg을 넣어둔 용기에 옮기고, 여기에 250ng/mL 농도의 내부표준액을 100㎕ 넣어(25ng) 분석에 사용하였다.
[표 2]
Figure 112021073497805-pat00002
(E.R. Tab: Extended Release Tablet, I.R. Tab: Immediate Release Tablet)
한편, 추출, 분리 및 분석은 하기 표 3의 조건에서 실시하였다.
[표 3]
Figure 112021073497805-pat00003
<실험예 1> 분석방법의 검증(Validation)
확립된 분석법의 유효성과 분석결과의 신뢰성 등을 증명하기 위하여, ICH guideline Q2(R1) 'Validation of Analytical Procedure'의 규정에 따라 특이성(specificity), 직선성 및 범위(linearity and range), 검출 한계(detection limit), 정량 한계(quantitation limit), 정확성 및 정밀성(accuracy and precision) 등의 항목에 대하여 상기 [표 3]의 조건으로 본 발명의 방법을 검증(validation)하였다.
실험예 1-1. 특이성 (specificity)
분석하고자 하는 시료의 주성분과 NDMA, NDEA 성분간 간섭이 없는지 확인하고자 특이성을 확인하였다.
구체적으로 5mL 추출용 용기(vessel)에 탈수제로 MIYAZAKI Hydro-Protect® 250mg과 메트포르민 HCl 250mg, 발사르탄 160mg, 라니티딘 HCl 20mg, 니자티딘 150mg, 트라마돌 HCl 75mg을 각각 정확하게 측정하여 넣고, 표 1의 표준액 제조 방법에 따라 제조한 표준액 No.5 100㎕(NDMA 10ng, NDEA 10ng, NDMA-d6 25ng, NDEA-d10 25ng)을 각각 정확하게 첨가한 특이성 검체를 각각 제조하였다. 각각의 특이성 검체의 주성분을 MRM 방식으로 확인하였다 (도 2 내지 7).
그 결과, 상기 5종의 특이성 검체에서 NDMA와 NDEA 이외의 검체의 성분은 검출되지 않아 매트릭스의 간섭이 없다는 것을 확인하였다. 즉, 여러 주성분(메트포르민, 발사르탄, 트라마돌, 니자티딘, 라니티딘)이 포함된 시료들에 대한 특이성을 확보하였으며, 또한 본 발명의 방법이 여러 의약품 분석에 있어 범용적으로 적용이 가능하다는 것을 확인하였다.
실험예 1-2. 직선성 및 범위(linearity and range)
주어진 범위에서 검체 중 분석대상시료의 양(또는 농도)에 비례하는 분석 결과를 얻을 수 있는 능력을 확인하고자 직선성을 확인하였다.
표 1에 따라 NDMA, NDEA 표준용액을 각각 최저정량한계(LOQ) 5ng/mL부터 500ng/mL까지 제조하였으며, 5mL 추출용 용기(vessel)에 탈수제로 MIYAZAKI Hydro-Protect® 250mg과 각 표준용액 100㎕를 넣어 0.5ng 내지 50ng이 되도록 하고 표 3의 조건에 따라 3회 분석을 실시하였다. 분석 후 얻은 크로마토그램에서 내부표준용액의 피크면적에 대한 각 성분의 피크면적비를 이용하여 검량선을 작성하였고(도 7 및 8), 각 검량선의 상관계수(r2, coefficient of correlation)를 구하였다.
그 결과, NDMA의 회귀 직선은 y= 0.03249x + 0.00253 (r2= 0.99999)이고, NDEA의 회귀 직선은 y= 0.03857x + 0.00302 (r2=0.99998)으로, 0.5 내지 50ng의 범위에서 검량선의 상관계수(r2)는 모두 0.99 이상으로 우수한 직선성과 범위를 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 1-3. 검출 한계(LOD) 및 정량 한계(LOQ)
검출 한계(limit of detection, LOD)와 정량 한계(limit of quantitation, LOQ)는 검량선 식에 의해 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거한 하기 <계산식>을 이용하여 계산하였다.
<계산식>
검출 한계 (LOD)= 3.3×σ/S
정량 한계 (LOQ)= 10×σ/S
(σ: 반응의 표준편차, S: 검량선의 기울기)
검량선 식을 통해 얻어진 검출 한계는 NDMA에서 0.25ng/g, NDEA에서 0.2ng/g이고, 정량 한계는 NDMA에서 0.83ng/g, NDEA에서 0.66ng/g이다.
검량선 식을 통해 얻어진 검출 한계와 정량 한계 값을 검증하기 위해 5mL 추출용 용기에 탈수제로 MIYAZAKI Hydro-Protect® 250mg과 표 1의 표준액 제조 방법에 따라 제조한 표준액 No.1 40μL(NDMA 0.5ng, NDEA 0.5ng, NDMA-d6 25ng, NDEA-d10 25ng)를 넣어 0.2ng/g이 되도록 하고(검출 한계), 표준액 No.1 100μL(NDMA 0.5ng, NDEA 0.5ng, NDMA-d6 25ng, NDEA-d10 25ng)를 넣어 0.5ng/g이 되도록 한 뒤(정량 한계) 표 3의 조건으로 각각 3회 분석을 실시하였다. 분석 후 얻은 크로마토그램 상의 검출 신호 대 잡음 비(signal-to-noise ratio, S/N 비)를 측정하여 검출 한계와 정량 한계의 설정 타당성을 평가하였다.
그 결과, 0.2ng/g 농도에서 실제 측정된 NDMA와 NDEA의 크로마토그램의 S/N 비는 각각 2.82와 6.00으로 확인되었으며(도 9 및 10), 0.5ng/g 농도에서 측정된 NDMA와 NDEA의 크로마토그램의 S/N 비는 각각 11.4와 33.1로(도 11 및 12) 검량선 식에서 구한 검출 한계와 정량 한계 값의 타당성이 인정되는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 방법의 검출 한계는 NDMA 및 NDEA 각각에 대해 0.2ng/g이고, 정량 한계는 NDMA 및 NDEA 각각에 대해 0.5ng/g을 충족함을 확인하였다.
실험예 1-4. 정확성 및 정밀성(Accuracy and Precision)
시료에 기지 농도의 분석 대상 성분을 첨가했을 때 그 농도를 정확히 측정할 수 있는 능력(이론 값과 분석을 통해 계산된 값 사이의 근접성)을 확인하고자 정확성을, 시료를 반복하여 분석하였을 때 동일한 농도로 측정할 수 있는 능력(각각의 측정 값 사이의 근접성)을 확인하고자 정밀성을 확인하였다.
구체적으로, 정량 한계 농도(1ng), 저 농도(5ng), 중간 농도(10ng), 고 농도(25ng)의 시료를 표 2와 같이 설정된 조건으로 하루 안에 3회 추출 및 분석을 수행하여 일내(intra-day) 정확성 및 정밀성을, 3일간 3회 추출 및 분석을 수행하여 일간(inter-day) 정확성 및 정밀성을 검증하였다.
정확성은 검량선 식에서 정확성 시료의 분석 결과를 대입하여 얻은 결과를 기지의 농도 값(이론 값)으로 나눈 비의 백분율로 구한다. 정확성의 허용범위는 정량 한계 농도에서 이론 값의 ±20% 이내이고, 저, 중, 고 농도에서는 ±15% 이내이다. 정밀성은 정확성 시험을 통해서 계산된 농도의 상대표준편차(RSD %)로 확인할 때 그 허용범위는 정량 한계 농도에서는 20% 이하이고, 저, 중, 고 농도에서는 15% 이하이다.
실험예 1-4-1. 메트포르민 원료의 일내/일간 정확성 및 정밀성 검증
일내 및 일간 정밀성 실험 결과, 일내 정확성은 NDEA는 94.11 내지 100.46%, NDMA는 101.12 내지 103.88%, 일간 정확성은 NDEA는 93.45 내지 97.07%, NDMA는 99.05 내지 100.65%로 허용 범위인 정량 한계 농도에서 이론값의 ±20% 이내, 나머지 농도에서 이론값의 ±15% 이내를 만족하였다.
일내 정밀성은 NDEA는 0.27 내지 2.71%, NDMA는 0.33 내지 13.22%, 일간 정밀성은 NDEA는 2.10 내지 7.11%, NDMA는 3.05 내지 7.42%로, 허용 범위인 정량 한계 농도에서 20% 이하, 나머지 농도에서 15% 이하를 만족하였다.
즉, 메트포르민 원료에 대한 일내/일간 정확성 및 정밀성은 기준에 적합한 것을 확인하였다.
실험예 1-4-2. 메트포르민 제제의 일내 정확성 및 정밀성 검증
메트포르민 원료 및 제제(하기 P1 내지 P4)에 대해 일내 정확성 및 정밀성 시험 결과, 원료 메트포르민 HCl의 NDMA의 정확성은 101.1 내지 103.9%, 정밀성은 0.33 내지 13.21%, NDEA의 정확성은 94.1 내지 100.5%, 정밀성은 0.27 내지 2.71%로 나타났다.
제제 [P1: I.R. Tab(Metformin HCl 500mg/Glimepiride 2mg)]의 NDMA의 정확성은 97.7 내지 100%, 정밀성은 1.32 내지 9.38% 이었고, 제제 [P2: I.R. Tab(Metformin HCl 500mg)]의 NDMA의 정확성은 97.3 내지 102%, 정밀성은 2.23 내지 8.17% 이었다. 제제 [P3: E.R. Tab(Metformin HCl 500mg)]의 NDMA의 정확성은 95.4 내지 98.8%, 정밀성은 0.72 내지 5.53% 이었다. 제제 [P4: E.R. Tab(Metformin HCl 500mg/Glimepiride 2mg)]의 NDMA의 정확성은 95.1 내지 98.3%, 정밀성은 1.62 내지 13.75%, NDEA의 정확성은 86.1 내지 94.3%, 정밀성은 1.26 내지 2.72% 이었다.
따라서 메트포르민 제제 P1 내지 P3의 경우 NDMA에 대하여 정확성과 정밀성이 기준에 충족함을 확인하였고, 메트포르민 원료와 제제 P4의 경우 NDMA와 NDMA에 대한 정확성과 정밀성이 기준에 충족한 것을 확인하였다.
실험예 1-4-3. 발사르탄 원료와 제제의 일내 정확성 및 정밀성 검증
실험 결과, 발사르탄 원료의 NDMA의 정확성은 90.1 내지 96.8%, 정밀성은 0.72 내지 11.82% 이었고, NDEA의 정확성은 91.9 내지 98.2%, 정밀성은 0.68 내지 1.52% 이었다. 제제 Valsartan I.R. Tab(Valsartan 160 mg/Hydrochlorothiazide 12.5mg)]의 NDMA의 정확성은 96 내지 104.6%, 정밀성은 0.58 내지 1.48% 이었고, NDEA의 정확성은 91.3 내지 96%, 정밀성은 0.33 내지 8.57% 이었다.
따라서 발사르탄 원료 및 제제에서 NDEA와 NDMA의 정확성과 정밀성은 기준에 적합한 것을 확인하였다.
실험예 1-4-4. 트라마돌 원료와 제제의 일내 정확성 및 정밀성 검증
실험 결과, 트라마돌 HCl 원료의 NDMA의 정확성은 96.5 내지 104.6%, 정밀성은 0.32 내지 3.76% 이었고, NDEA의 정확성은 84.7 내지 90.1%, 정밀성은 0.49 내지 3.48% 이었다. 제제 [P1: E.R. Tab(Acetaminophen 300 mg, /Tramadol 75 mg)]의 NDMA의 정확성은 90.8 내지 103.7%, 정밀성은 1.45 내지 7.52% 이었다. 제제 [P2: I.R. Tab(Acetaminophen 150mg, /Tramadol HCl 37.5mg)]의 NDMA의 정확성은 87.9 내지 91.2%, 정밀성은 0.35 내지 5.15% 이었다.
따라서 트라마돌 원료에 대해서 NDEA와 NDMA의 정확성과 정밀성이 기준에 적합함을 확인하였으며, 트라마돌 제제 P1 및 P2에 대해서는 NDMA의 정확성과 정밀성이 기준에 적합한 것을 확인하였다.
<실험예 2> 실제 분석
상기 표 2의 메트포르민, 발사르탄, 라니티딘, 니자티딘, 트라마돌 5종의 원료와 8종의 제제에 대해 본 발명의 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법으로 실제로 추출, 분리 및 분석을 실시하였다.
구체적으로 5mL 추출용 용기에 표 2에 따라 탈수제로 MIYAZAKI Hydro-Protect® 250mg과 각 성분의 원료 또는 제제 각각의 해당량을 정밀하게 측정하여 넣고, 표 1의 표준액 제조 방법에 따라 제조한 내부표준물질(NDMA-d6 25ng, NDEA-d10 25ng) 100㎕를 정확하게 첨가하였다. 이후 표 3의 조건으로 분석을 실시하고 검량선식으로 NDMA 및 NDEA의 농도를 측정하였다.
그 결과, 메트포르민 원료에서 NDMA 및 NDEA는 불검출 되었고, 메트포르민 제제 P1, P2, P3, P4에서 NDMA는 각각 8.89ppb, 6.72ppb, 2.57ppb, 6.09ppb 검출되었으며, NDEA는 불검출 되었다.
발사르탄 원료에서 NDMA 및 NDEA는 불검출 되었고, 발사르탄 제제 P1에서 NDMA는 2.49ppb 검출되었으며, NDEA는 불검출 되었다.
라니티딘 원료에서 NDMA는 2178.14ppb 검출되었고, NDEA는 불검출 되었다. 또한 라니티딘 제제 P1에서 NDMA는 3272.81ppb 검출되었고, NDEA는 불검출 되었다.
니자티딘 원료에서 NDMA는 18.82ppb 검출되었고, NDEA는 불검출 되었다.
트라마돌 원료 및 제제 P1, P2에서 NDEA와 NDMA는 불검출 되었다.

Claims (18)

  1. 초임계유체추출-초임계유체크로마토그래피-질량분석법(SFE-SFC-MS/MS)을 이용한, 니트로사민 화합물의 추출, 분리 및 분석 방법으로,
    상기 초임계유체추출은
    (1) 추출 용매: CO2:변형제 = 100:0 내지 95:5 (v/v),
    (2) 추출 용매 유량: 1 내지 5mL/분,
    (3) 정적 추출(static extraction) 시간: 2 내지 7분,
    (4) 동적 추출(dynamic extraction) 시간: 1 내지 4분,
    (5) 추출 시 압력 조절기(BPR)의 압력: 15MPa 내지 18MPa, 및
    (6) 추출용 용기(vessel) 온도: 40 내지 70℃의 조건에서 수행되며;
    상기 초임계유체크로마토그래피는
    (1) 이동상 조성: CO2:이동상 변형제 = 95:5 내지 75:25 (v/v),
    (2) 이동상 유량: 1 내지 3mL/분,
    (3) 컬럼 종류: 컬럼의 작용기가 아마이드 또는 아민인 컬럼, 및
    (4) 컬럼 온도: 40 내지 60℃의 조건에서 수행되며;
    상기 질량분석법은
    (1) 이온화 방법: 대기압 화학 이온화법(APCI),
    (2) 분무 기체 유량: 1 내지 4L/분,
    (3) 인터페이스 온도: 200 내지 500℃,
    (4) 탈 용매화 라인(DL) 온도: 100 내지 300℃, 및
    (5) 가열 블록 온도: 100 내지 300℃의 조건에서 수행되는 것인,
    추출, 분리 및 분석 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 니트로사민 화합물은 니트로소다이메틸아민 및 니트로소다이에틸아민으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 추출, 분리 및 분석 방법은 온라인(on-line) 시스템인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 추출, 분리 및 분석 방법의 검출 한계는 0.2ng/g인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 추출, 분리 및 분석 방법의 정량 한계는 0.5ng/g인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 추출, 분리 및 분석 방법의 분석대상시료는 의약품 원료 및 제제로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 변형제는 아세토나이트릴, 메탄올, 에탄올 및 이소프로필알코올로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 추출, 분리 및 분석 방법은 초임계유체추출 시 추출용 용기 내 탈수제(dehydrate)를 투입하는 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 탈수제는 100 내지 500mg의 양으로 투입되는 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 이동상 변형제는 아세토나이트릴, 메탄올 및 에탄올로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 추출, 분리 및 분석 방법은 초임계유체크로마토그래피 시 보조(make up)용매를 투입하는 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 보조용매는 아세토나이트릴, 트리플루오로아세트산 및 포름산으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 보조용매의 유량은 0mL/분 초과 0.2mL/분 이하인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 추출, 분리 및 분석 방법은 질량분석 시 건조 기체(drying gas)를 투입하는 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 건조 기체의 유량은 0L/분 초과 10L/분 이하인 것인, 추출, 분리 및 분석 방법.
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