KR102390048B1 - 산돌배 발효물을 유효성분으로 하는 알코올성 지방간 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효 산돌배 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 특징으로 합니다. 바람직하게는 본 발명의 발효 산돌배 추출물은 고초균을 접종하여 배양하는 1차 발효를 거친 후에, 다시 젖산균을 접종하여 배양하는 2차 발효를 실시함으로써 얻어지는 것입니다. 본 발명은 이러한 발효 산돌배 추출물을 유효성분으로 하는 알코올 지방간 예방 및 치료용 조성물과, 장내 미생물총 개선 조성물에 대해 개시합니다.

Description

산돌배 발효물을 유효성분으로 하는 알코올성 지방간 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE COMPRISING FERMENTED PYRUS USSURIENSIS EXTRACT AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 국내 임산물을 활용한 기능성 조성물 및 발효식품에 관한다.

대한민국의 알코올 중독자 수는 220만 명을 상회하는 것으로 알려져 있다. 이는 정신 질환 중에서 가장 높은 유병율인 6.6%로 세계 평균의 거의 2배에 해당하는 수치를 보이고 있으나 치료율은 1.6%로 정신 질환 중에서 가장 낮은 편이다.

간 조직 중에 지방이 차지하는 비율이 5%가 넘으면 지방간으로 분류되는데, 잦은 알코올 섭취는 간세포에 지방산이 축적하게 만든다. 이 축적된 지방산이 간세포에 혈액을 통한 산소와 영양분 공급과정을 차단하는 역할을 함으로써 간세포가 손상되기 때문에 적은 양이라도 장기간의 알코올 섭취는 필연적으로 간 손상을 일으키게 된다. 지방간의 4대 원인은 과도한 음주, 비만(복부비만), 당뇨병, 고지혈증으로 알려져 있다. 그중에서 지방간은 그 원인에 따라서 알코올성 지방간과 비알코올성 지방간으로 분류된다.

지방간은 주로 간 수치(ALT, AST)의 이상으로 확인되고 복부 초음파 검사상 지방간으로 판정받으면서 인지하게 되는 경우가 흔하다. 가끔 오른쪽 상복부의 불편감이나 둔한 통증 그리고 피로감, 무기력감, 허약, 식욕부진 등의 증상이 생길 수 있다.

알코올성 간 질환은 만성 간질환 중의 하나이며, 단순 지방축적 (steatosis)에서부터 간경화(cirrhosis)에 이르는 질환군을 의미한다. 알코올성 간질환은 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며, 알코올 관련 질환 중 가장 중요한 사망원인이지만, 이들 질환에 대한 예방적 치료적 접근법은 많지는 않다.

만성적인 알코올 섭취는 간세포 내 지방대사 불균형을 초래하여 지방간을 유발한다. 알코올의 섭취는 간세포에서 지방산 생성을 촉진시키는 sterol regulatory element-binding protein 1c (SREBP1c)의 활성이 증가하는 반면, 미토콘드리아에서 지방산 분해를 촉진시키는 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성이 감소하여 지방간을 유도한다. 만성 알코올 섭취는 시토크롬 P-450 2E1 (CYP2E1)의 생성을 유도하여 자유라디칼 생성에 의 한 산화스트레스를 일으키거나 염증반응을 유도하여 알코올성 간손상을 초래한다. 이러한 간손상 발생기전은 신체의 주요기관인 간 뿐만 아니라, 뇌, 췌장, 조혈기관, 면역계 등 체내 대사과정에 매우 치명적인 영향을 준다.

[선행기술문헌]

대한민국 공개특허공보 제10-2012-0138392호

대한민국 공개특허공보 제10-2017-0084796호

대한민국 공개특허공보 제10-2020-0055766호

대한민국 공개특허공보 제10-2010-0133079호

본 발명의 목적은 발효시킨 돌배 또는 산돌배 추출물의 알코올성 지방간에 대한 예방 및 개선 효능을 확인함으로써 우리나라의 임산물의 활용을 도모하고자 함에 있다.

돌배나무류(Pyrus spp.)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 낙엽활엽수로서, 과실, 뿌리, 수피, 줄기, 엽, 과피 등은 식용뿐만 아니라 해열, 건위, 지갈, 이뇨, 항당뇨 등의 효능이 있어 민간약으로 널리 사용되어 왔다. 산돌배나무에는 chlorogenic acid, catechin, gallocatechin, epigallocatechin, procyanidin B-3-3-O-gallate 등의 성분이 함유되어 있다고 보고된 바 있으며, 최근 많은 연구를 통해 다양한 활성 효과가 밝혀졌다. 특히 배의 과즙은 피부 보습 및 알코올 분해 활성 증진 효과가 있다고 보고되었으며, 잎 추출물은 효소 반응을 이용한 항산화 효과 및 대식세포에서의 항염증 효과가 있다는 연구 결과가 보고된 바 있다.

또한 우리나라는 국토 중 산림이 차지하는 면적이 637만 ha로, 산림 자원이 풍부하다. 이전부터 약재나 식품으로서 그 가치를 인정 받아 왔다. 근래 들어 천연신약 개발의 보고로 알려지면서 관련하여 많은 연구가 진행 중에 있다. 산림에서 생산 혹은 채취된 버섯, 수액, 나물, 견과류, 과실 등을 총칭하여 '임산물' 이라 한다. 이러한 임산물은 각 지역별로 특성을 지니며 최근 들어 이를 이용한 먹거리, 화장품 등 제품 개발이 활발히 이루어지고 있으며 따라서 임산물의 경제적 가치 또한 증가하고 있다.

새로운 물질 탐색을 통한 임산물 신소재의 확보는 세계시장에서 국가적인 경쟁력을 향상시키는 데 일조할 수 있다. 실제 수출 동향을 보면 밤, 버섯류 등 국내산 임산물의 수출이 증가하고 있음을 알 수 있으며, 이는 곧 국제 시장에서 국내 임산물의 가치가 인정받고 있음을 알려 준다.

한편, 본 발명의 명시되지 않은 또 다른 목적들은 하기의 상세한 설명 및 그 효과로부터 용이하게 추론 할 수 있는 범위 내에서 추가적으로 고려될 것이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 알코올 지방간 예방 및 치료용 조성물로서 발효 산돌배 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 어느 실시예에 따른 알코올 지방간 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 발효 산돌배 추출물은 추출물은 전구물질 MSG를 5% 첨가하고 고초균을 접종하여 배양하는 1차 발효를 거친 후에 탈지분유 3%를 첨가하여 다시 젖산균을 접종하여 배양하는 2차 발효를 실시함으로써 얻어지는 것이 좋다.

또한 본 발명의 제2국면은 발효 산돌배 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 장내 미생물총 개선 조성물을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 어느 실시예에 따른 장내 미생물총 개선 조성물에 있어서, 상기 발효 산돌배 추출물은 고초균을 접종하여 배양하는 1차 발효를 거친 후에, 다시 젖산균을 접종하여 배양하는 2차 발효를 실시함으로써 얻어지는 것이 좋다.

또한, 본 발명의 제3국면은 산돌배 추출물은 고초균을 접종하여 배양하는 1차 발효를 거친 후에, 다시 젖산균을 접종하여 배양하는 2차 발효를 실시함으로써 얻어지는 발효 산돌배 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 알코올 처리된 마우스에서 약간의 balloon degeneration 및 다량의 지방 축적이 관찰되었다. NFPUE 보다는 FPUE가 지방간 발병을 예방하는 데 효과적이었다.

본 발명에 따르면 FPUE 투여군은 NC 그룹에 비해 Aspartate Aminotransferase (AST), Alanine Aminotransferase (ALT) 및 Triglyceride (TG) 활성이 감소하였다. TC 및 LDL의 혈장 농도는 FPUE 처리된 마우스에서 유의하게 감소했으며(P <0.05), HDL은 FPUE 및 NFPUE 처리 된 마우스 혈장에서 NC에 비해 높은 비율을 보였다. 결론적으로 FPUE 투여군은 에탄올 식단에 의해 증가된 ALT, AST, TG, LDL 및 총 콜레스테롤 수치를 현저히 감소시켰다. 또한, 본 발명에 따르면 지방간 지표의 수준을 방사그림으로 비교할 때 70% 정도의 예방효과를 보였으며, 특히 에탄올로 인한 disbiosis의 개선 효과가 있음을 확인하였다.

또한 본 발명에 따르면 FPUE 및 NFPUE는 NC에 비해 CYP2E1 유전자 및 PPAR-α, FAS 및 SREBP와 같은 지방 생성과 관련된 유전자 발현 억제하였다. 특히 FPUE는 CYP2E1 효소를 억제하여 산화 스트레스를 줄이고 SOD 효소 유전자를 상향 조절함으로써 항산화 효과를 높여 간 손상을 예방할 수 있음이 드러났다. 또한, FPUE가 ADH 및 ALDH 효소의 상향 조절을 통해 알코올 대사를 증가시키고 간에서 섬유증 및 지방 축적을 예방할 수 있는 PPAR-γ, SREBP-1C 및 FAS의 하향 조절로 지방 생성을 억제할 수 있음을 발견했다.

장기 기능 장애는 주로 장기간의 과도한 음주와 관련이 있으며, 이는 지방간과 같은 초기 증상과 함께 AFLD와 같은 조직 손상 관련 상태로 이어지며 알코올성 간염, 간 섬유증 및 간경변의 발병을 일으킬 수 있다. 한편, 아커만시아는 장 장벽을 개선하는 기능의 결과로 에탄올로 인한 간 손상에서 보호 역할을 할 수 있으며 비만, 당뇨병 및 염증 상태를 개선 할 수 있음이 알려졌다. 그런데 에탄올에 노출된 간염 마우스에서 아커만시아의 어번던스가 극히 감소했다. 그러나 FPUE 처리군에서 ND 그룹보다 훨씬 더 높은 수치로 그 어번던스를 회복했다. 이를 통해서 FPUE가 간에서 지질 축적, 염증 세포 침윤 및 괴사를 완화함으로써 마우스에서 에탄올 유발 간 손상을 예방함을 증명한다. 또한 FPUE 개입이 장내 미생물 구조의 재건과 후속적인 아커만시아의 증가를 통해 에탄올 유발 간지방증을 완화함을 나타낸다. 미생물 구조가 에탄올 공급에 의해 방해 받았지만, FPUE 투여에 의해 치료되고 정상 상태로 복귀되었음을 의미하는 것이다.

한편, 여기에서 명시적으로 언급되지 않은 효과라 하더라도, 본 발명의 기술적 특징에 의해 기대되는 이하의 명세서에서 기재된 효과 및 그 잠정적인 효과는 본 발명의 명세서에 기재된 것과 같이 취급됨을 첨언한다.

도 1은 본 발명의 실험예에 따른 주요 기관의 무게 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실험예에 따른 간의 조직학적 변화를 나타내는 사진 이미지이다.
도 3은 본 발명의 실험예에 따른 ALT, AST 및 TG의 활성에 미치는 영향을 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실험예에 따른 TC, LDL 및 HDL의 혈장 농도의 결과를 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예에 따른 PPAR-α, CYP2E1, FAS, SREBP, ADH, ALDH, SOD의 유전자 발현을 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 실험예에 따른 결과로서 장내 미생물총의 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실험예에 따른 결과로서 도 3 및 도 4와 관련한 효과를 레이더 그래프로 나타낸 것이다.

돌배나무류(Pyrus spp.)는 장미과에 속하는 낙엽활엽수로서, 돌배 및 산돌배 (Pyrus spp.) 열매는 특히 한국에서 세계에서 가장 널리 섭취되는 과일 중 하나이다. 배에 대한 연구는 생물학적 효과보다는 화학적 조성에 초점을 두고 있다. 특히 β-알부틴 (4-히드록시 페닐 β-D-글루코피라노시드) 및 chlorogenic acid을 비롯한 다양한 페놀 화합물이 배 과일에 존재하는 것으로 밝혀졌다.

산돌배 추출물은 추출 방법을 불문하고 추출 대상인 돌배 또는 산돌배 열매를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 포화노말부탄올, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 물 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물과 그 추출물에서 상기 열거된 용매로 분획된 추출물을 포함할 수 있다. 추출 대상을 추출 용매에 침지시키는 단계를 통하여 추출되는 한, 추출 방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 등 임의의 방식이 모두 적용될 수 있는 것이다. 바람직하게는 본 발명의 산돌배 추출물은 산돌배나무 열매를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 것으로서, 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물을 포함한다.

한편, 본 발명의 발효 산돌배 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 식품 조성물로 실시될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다. 감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다. 풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것을 본 발명의 식품 조성물에 첨가할 수 있다. 또한 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다. 생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다. 미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. 이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다. 사용될 수 있는 보존제로서는 소듐소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 발효 산돌배 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 약제학적 조성물로 실시될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다. 상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다는 의미이다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식 염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다. 부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다

본 발명의 산돌배 추출물은 고초균을 접종하여 배양하는 1차 발효를 거친 후에, 다시 젖산균을 접종하여 배양하는 2차 발효를 실시함으로써 얻어지는 발효 산돌배 추출물을 특징으로 한다.

<발효 산돌배 추출물(FPUE)의 준비>

산돌배나무(Pyrus Ussuriensis maxim: PUE)는 한약재 국가 표준 (KHP-311)에 등재 되어 있다. 산돌배나무 열매에 증류수를 2배 가하여 블랜더를 이용해서 1회 15초 동안 분쇄하는 방법으로 10회 시행하였고 80목 거름망으로 씨와 껍질 등 불순물을 제거하여 산돌배 농축액을 제조하였다.

그다음 산돌배나무 열매 추출물(이하, '산돌배 추출물')을 다음과 같이 공동 발효하여 새로운 물질(FPUE)을 준비하였다.

산돌배 추출물을 글루코스 3% 및 모노소둠 글루타민산(MSG) 5%를 첨가한 후 멸균하였다. 이후 고초균 스타터 5%(v/v)를 산돌배 추출물에 접종하고 42℃에서 3 일 동안 진탕배양하여 점질물을 얻었다. 점질물은 50% 이상이 폴리감마글루타믹산이 혼합되어 있는 것으로 보고되고 있다.

그런 다음 산돌배 1차 발효물에 탈지유 5%를 추가로 첨가한 후 젖산균 스타터 1%(v/v)를 접종하여 30℃에서 7일간 정치 배양하여 2차 발효시켰다.

고초균에 의한 1차 발효 동안 전구물질인 모노소둠 L-글루타민산(MSG)의 변화는 거의 없어 보이나 2차 혼합발효가 시작되고 혼합발효 5일에 MSG가 감소하고 GABA가 생성되었으나 MSG가 잔존하고 있으며 혼합발효 7일 MSG는 모두 소모되어 GABA로 전화된 것을 확인하였다.

<랫드 사료 준비>

Lieber-DeCarli Ethanol Rat Diet (DYTE # 710260) 및 Lieber-DeCarli Regular Control Diet (DYTE # 710027)은 DyEts Inc. (2508 Easton ABethlehem, Pennsylvania 18017 18017)에서 구입하였다. 각 사료는 제조업체 지침에 따라 준비하였다.

<Animal Model>

수컷 C57BL/6 N CrSlc 마우스(체중 19~23 g, 생후 6주)는 중앙동물연구소(서울, 한국)에서 입수했다. 마우스는 통제된 환경 (22±2℃, 50±10% 상대습도, 12 시간 명/암주기)에서 사육하고 사료 DYTE # 710027를 공급하였다. 동물실험을 위한 프로토콜은 경북대학교 동물관리 및 사용위원회를 통해 승인되었다. 각 연구의 총 랫드 수 (n=70)는 그룹 수, α-오류 확률(0.05), 검정력(1-β 오류 확률) (0.6) 및 효과 크기(0.5)를 기반으로 하고 G*power 프로그램(Kim et al., 2017)을 사용하여 계산하였다.

<실시예와 비교예>

만성적 알코올 섭취로 간 손상에 대한 FPUE의 간 보호 효과를 평가하기 위해 마우스를 무작위로 7 개 그룹 (n=70, 그룹당 10 마리)으로 나누고 Lieber-DeCarli 에탄올(3%) 또는 대조군 식이를 28 일 동안 공급하였다. 상세하게는 아래의 표 1과 같다.

Scheme of study and daily dose (per Kg body weight) intake for each group of mice

그룹	처치 정보	랫드 수
정상 대조군(ND 그룹)	Lieber-DeCarli regular control Diet (DYET 710027)	10
음성 대조군(NC)	Lieber-DeCarli 에탄올 (3 %) Rat diet (DYET 710260)	10
양성 대조군(PC)	Hovenia dulcis(500mg/kg) +DYET 710260	10
T1(FPUE 낮은 투여군)	125mg/kg of fermented PUE + DYET 710260E	10
T2(FPUE중간 투여군)	250mg/kg of fermented PUE + DYET 710260	10
T3 (FPUE높은 투여군)	500mg/kg of fermented PUE + DYET 710260	10
NFPUE(비발효 PUE 투여군)	250mg/kg of Non-fermented PUE + DYET 710260	10

양성원료 HDE(Hovenia dulcis )는 알코올 유발 간독성 마우스에서 양성 간 보호물질로 사용되었다. 간 보호 효과를 나타내는 호베니아 둘시스 추출물은 식품의약품안전처(MFDS)에서 알코올로 인한 간 손상 예방 건강기능식품 원료로 승인받았다.

<분석실험>

FPUE 투여 24 일째에 Accu-Check Active 혈당 측정기를 사용하여 각 마우스 그룹에 대해 공복 혈당 수치를 측정하였다. 그리고 안락사 하루 전, 각 마우스에서 소변 및 혈액 샘플을 수집하였다. 소변의 생화학은 스틱 방법으로 분석하였다. 위 검사를 위한 URiSCAN® 스트립은 YD Diagnostics에서 구매하였다. 혈액의 생화학적 분석은 URIT-3000Vet Plus 자동 혈액 분석기 (URIT Medical Electronics Co., Ltd. 중국)를 사용하여 실시했다.

다음으로 QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit (퀴아젠, 한국)를 사용하여 대변샘플에서 게놈 DNA를 추출하고 정제하였다. 대변 샘플 (180-220mg)을 InhibitEX 버퍼에서 균질화하고 70℃에서 5 분 동안 배양한 후 샘플을 20,000 xg에서 원심 분리했다. 그 후, 단백질 분해 효소 K (15μL)와 상층액 200μL 혼합물에 AL 버퍼 (200μL)를 첨가하고 70℃에서 다시 10분 동안 배양하였다. 나머지 단계는 제조업체의 지침을 따랐다. 나노 드롭 분광 광도계 (U-2800 분광 광도계, Hitachi High Technologies, 일본)를 사용하여 DNA의 순도와 정량화를 평가하였다.

정상 대조군을 제외한 모든 그룹의 각 마우스에게 안락사 몇 시간 전에 에탄올 단회 경구투여를 실시했다. 그 후 마우스를 이산화탄소 흡입으로 안락사시켰다. CO₂는 분당 10~30%의 유속으로 탱크에서 전달되었고, 동물은 호흡 중단을 모니터링하고 호흡이 중단된 후 최소 1분 동안 챔버에 두었다. 심장 천자를 통해 혈액을 수집하고 (표시된 대로) 즉시 10,000RPM에서 5분 동안 원심 분리했다. 혈장은 분리하여 사용할 때까지 -70℃에서 보관했다. 또한, 조직 병리학적 분석을 위해 간 조각을 포름알데히드에 보존하고 작은 조각을 즉시 RNA 추출을 위해 처리했다. 또한 신장과 비장을 포함한 다른 주요 기관의 무게도 측정되었다.

에탄올로 유발된 간 손상에서 발효된 산돌배 나무 추출물의 보호 효과는 아스파테이트아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase: AST)와 알라닌아미노전이효소(Alanine Aminotransferase: ALT)의 활성을 측정하여 확인했다. 또한 저밀도 지단백질(LDL), 고밀도 지단백질(HDL) 및 트리글리세라이드(TG)의 혈장 수준은 제조업체의 지침에 따라 효소 결합 면역 흡착 분석 키트(Elk Biotechnology, 우한, 중국)를 사용하여 결정되었다.

또한, 알코올 및 지질 대사에 관여하는 효소의 활성을 조절하는 데 필수적인 유전자 발현에 대한 FPUE의 효과는 정량적 실시간 PCR을 실시하여 결정되었다. 이를 위해 총 100mg의 간 조직을 균질화(IKA T10 basic Homogenizer, 서울, 한국)하고 TRIzol 시약의 프로토콜에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 DEPC 처리된 물을 사용하여 2배 희석하였다. RNA의 농도(μg / mL)와 순도는 나노 드롭 분광 광도계(U-2800 분광 광도계, Hitachi High Technologies, 일본)를 사용하여 측정하였다. 프로토콜에 따라 SuperScript® III First-Strand Synthesis SuperMix (Life Technologies, Carlsbad, 캘리포니아, 미국)를 사용하여 100ng의 RNA에서 보완 DNA를 합성했다. 그 후, CFX 용 SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, 캘리포니아, 미국) 12.5μL, 표적 유전자의 정방향 및 역방향 프라이머 1μL(10pmol), DEPC 처리된 9.5μL를 포함하는 반응 혼합물 1 μL의 cDNA를 실시간 PCR 분석(CFX96 Touch TM Real-Time PCR, Bio-Rad Laboratories Inc.)에 적용했다. 표적 유전자의 발현과 이에 상응하는 어닐링 온도를 검출하는 데 사용되는 프라이머는 표 2에 나열되어 있다.

Primer information used for their respective gene target

명칭	포워드	리버스	Tm	Reference
PPAR-α	CGAAGACAAAGAGGCAGAGG	TGATGTCACAGAACGGCTTC	58	12
SREBP-1c	GTAGCGTCTGCACGCCCTA	CTTGGTTGTTGATGAGCTGGAG	57	13
FAS	GGCTCAGCATGGTCGCTT	CTCCCGCCAGCTGTCATT	57	13
ADH	GTTGGAGAAGGGGTGACTTG	AGATCGCTTCGGCTACAAAA	58	14
ALDH	GCCTCAGGTGGATGAAACTC	CGGTGGGCTGGATAAGTAG	58	14
SOD1	GGGTTCCACGTCCATCAGTA	ATTGCCCAGGTCTCCAACAT	59	15
CYP2E1	CGCATGGAACTGTTTCTGC	CAATTGTAACAGGGCTGAGGTC	59	16
β-actin	TGACAGGATGCAGAAGGAGAT	CTCCTGCTTGCTGATCCACAT	58	16

또한, 파라핀에 고정된 간 조각을 절편(두께 5 μm)한 다음 헤마톡실린과 에오신 염료로 염색하였다. 조직학적 변화는 현미경 (DIXI3000, Leica, Wetzlar, Germany)으로 관찰되었다.

<실험 결과>

1. 체중에 관한 효과

마우스의 체중 증가는 정상 대조군과 양성 대조군에서 유의하게 높았다 (P<0.01) (Figure 3.4 & Table 3.3). 마찬가지로, FPUE (500mg / Kg b.w.)로 마우스를 처리하면 에탄올 처리된 마우스에 비해 상당한 (P<0.01) 체중 증가가 발생했다. 그러나 사료 섭취량 의 차이는 군 간에 유의하지 않았다. 표 3을 보라.

[표 3] Effect of FPUE and NFPUE on body weight gain(gm/mice) and feed intake(g/mice/day) among different groups of mice

2. 주요 기관의 무게 변화

도 1에 나타난 바와 같이, 다른 투여 그룹 사이에서 간 무게가 현 저히 감소했다. 더욱이 간 무게는 ND 그룹의 마우스에 비해 에탄올을 먹인 마우스에서 상당히 증가했다. 반면, 마우스 비장과 신장 무게의 차이는 ND, NC, PC 및 치료 그룹간에 유의하지 않았다.

도 1(A)은 실시예와 비교예의 마우스의 평균 체중, (B)는 체중증가량, (C)는 간의 무게, (D)는 신장, (E)는 비장, (F)는 혈액 글루코오스 레벨을 나타낸다.

3. 혈액과 소변의 생화학적 변화

위 도 1(F)에 나타난 것처럼, 혈장 포도당 수치는 투여 4 주차에 에탄올 식단 그룹에 비해 FPUE 치료 그룹에서 현저하게 감소했다. 실험군 및 에탄올 식단 그룹을 포함한 다른 그룹의 CBC 및 소변 분석 데이터에 따르면 전체 소변 생화학적 검사는 모두 정상이었다.

4. 조직병리학적 분석결과

FPUE 투여시 간 조직학적 변화에 대한 치료 효과를 평가하고자 각각의 그룹을 비교하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 간의 HE 염색에 따르면, NFPUE 처리 된 마우스의 간과 달리 알코올 처리된 마우스에서 약간의 풍선변성(balloon degeneration) 및 다량의 지방 축적이 관찰되었다. FPUE는 NFPUE에 비해 지방간 발병을 예방하는 데 효과적임이 흥미롭게 확인되었다.

5. 혈청 생화학적 분석

FPUE 투여군에서 아스파테이트아미노전이효소(Aspartate Aminotransferase: AST), 알라닌아미노전이효소(Alanine Aminotransferase: ALT) 및 트리글리세라이드(Triglyceride: TG) 활성의 용량 의존적 감소(P<0.05)가 관찰되었다. 즉, 도 3에 나타난 바와 같이, FPUE 투여 후 처리 그룹은 ND 그룹에 비해 ALT, AST 및 TG의 활성을 감소시켰다. 또한 TC 및 LDL의 혈장 농도는 에탄올 수준에 비해 FPUE 처리된 마우스에서 유의하게 감소되었다(P<0.05). HDL은 FPUE 및 NFPUE 처리된 마우스 혈장에서 3% EtOH 공급 마우스 혈장에 비해 높은 비율로 발견되었다. 도 4를 보라.

6. 정량적 실시간 PCR 분석 (RT-PCR)

도 5에 나타난 것처럼, 알코올 분해효소인 ADH(Alcohol Dehydrogenase) 및 ALDH(Acetaldehyde Dehydrogenase)와, 항산화효소(Antioxidant Enzyme Activity)인 SOD의 활성을 조절하는 유전자의 발현은 NC 그룹에 비해 FPUE 처리 그룹에서 상향 조절되었지만 이 효과는 ADH 및 SOD에 대해서는 유의하지 않았다. 그러나 FPUE와 NFPUE는 에탄올에 비해 CYP2E1 유전자의 발현을 하향 조절했다. PPAR-α, FAS 및 SREBP와 같은 지방 생성과 관련된 유전자의 발현은 에탄올만으로 처리된 마우스에 비해 FPUE 및 NFPUE로 처리된 마우스에서 하향 조절된 것이다.

위와 같은 데이터를 통해서, 첫째, FPUE와 NFPUE는 NC에 비해 CYP2E1 유전자 및 PPAR-α, FAS 및 SREBP와 같은 지방 생성과 관련된 유전자 발현을 억제함이 드러났다. 둘째, FPUE는 CYP2E1 효소를 억제하여 산화 스트레스를 줄이고 SOD 효소 유전자를 상향 조절하여 항산화 효과를 높여 간 손상을 예방할 수 있음이 발견되었다. 셋째, FPUE가 ADH 및 ALDH 효소의 상향 조절을 통해 알코올 대사를 증가시키고 간에서 섬유증 및 지방 축적을 예방할 수 있는 PPAR-γ, SREBP-1C 및 FAS의 하향 조절로 지방 생성을 억제할 수 있음을 발견했다.

7. 장내 미생물 조절 효과

장내 미생물총은 간염의 발생과 진행에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다. FPUE를 투여시 장내 미생물총에 영향을 주는지에 대하여 지금까지 보고된 바가 없다. FPUE 투여 후 High-throughput 16S rRNA gene sequencing을 통하여 6개 시료에서 총 303,531개의 양질의 서열분석하였다. 9 개의 박테리아 문과 110 개의 속이 발견되었다. 장내 미생물총의 구조와 구성은 에탄올식이의 영향을 많이 받는 것으로 나타났다. 시료의 모든 분류학적 수준에서 가장 풍부한 OTU(Operational Taxonomic unit)의 결과는 후벽균(Firmicutes), 의간균류(Bacteroidetes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 탈철간균(Defferibacteres) 및 우미균류(Verrucomicrobia)가 가장 풍부한 문이며 아커만시아속(Akkermansia), 박테로이데스속(Bacteroides), 알로프레보텔라속(Alloprevotella), 대장균속(Escherichia), 파라박테로이데스속(Parabacteroides), 프로테우스(Proteus), 엔테로박테로이데스속(Enterobacteroides), 락토바실러스속(Lactobacillus), 엔테로박터(Enterobacter), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 빌로필라(Bilophila) 및 푸소박테륨속(Fusobacterium)은 OTU 중 가장 풍부한 속이었다.

분류학적 프로파일(Taxonomic profiles)을 통해 의간균류(Bacteroidetes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)의 비율이 유의하게 증가했으며, 에탄올 공급 그룹(NC)에서 일반 식단(ND)에 비해 후벽균(Firmicutes)이 현저하게 감소했음을 나타났다. FPUE 투여 그룹은 ND 그룹과 유사하게 이 박테리아 경향을 상당히 역전시키는 것으로 나타났다. 특히, 우미균류(Verrucomicrobia)는 NC 그룹에서 완전히 감소하였다. 속 수준에서 박테리아 분류군은 에탄올 식단의 영향을 받은 heat-maps 및 double pie chart에서 명백한 변화를 나타냈다. 아커만시아속(Akkermansia), 간균(Bacillus), 박테로이데스속(Bacteroides), 부티리키모나스(Butyricimonas), 파라박테로이데스(Parabacteroides), 빌로필라(Bilophila), 프로테우스(Proteus), 파에칼리바쿨럼(Faecalibaculum), 클로스트리듐(Clostridium) 및 락토바실러스(Lactobacillus)를 포함한 속은 일반 식이 요법과 비교하여 에탄올 공급으로 크게 전환되었으며 FPUE 처리로 반전되었다. FPUE 처리 그룹은 NC 그룹에 비해 푸소박테륨속(fusobacterial), 대?O균속(Escherichia), 락토바실러스속(Lactobacillus), 부티리키모나스(Butyricimonas), 알로프레보텔라(Alloprevotella), 빌로필라(Bilophila) 및 파라박테로이데스속(Parabacteroides) 농도를 감소시켰으며, 아커만시아(Akkermansia)의 풍부도는 NC 그룹에서 현저하게 감소하고 FPUE 처리 그룹에서 극적으로 회복되었다. FPUE로 처리하면 클로스트리듐(Clostridium)과 파에칼리바쿨럼(Faecalibaculum)이 상대적으로 증가하였다.

다음으로, FPUE 처리 유무에 관계없이 에탄올 노출에 영향을 받은 마우스의 장내 세균 군집을 분석했다. Alpha-diversity analysis은 Chao1, abundance-based coverage estimator (ACE), Jackknife, Simpson and Shannon index가 ND 그룹에 비해 NC 그룹에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다. FPUE로 처리 한 후에는 정상 그룹에 비해 감소하고 심지어 개선되었다.

8. 총론

FPUE는 CYP2E1 효소를 억제하여 산화 스트레스를 줄이고 SOD 효소 유전자를 상향 조절하여 항산화 효과를 높여 간 손상을 예방할 수 있다. 또한, FPUE가 ADH 및 ALDH 효소의 상향 조절을 통해 알코올 대사를 증가시키고 간에서 섬유증 및 지방 축적을 예방할 수 있는 PPAR-γ, SREBP-1C 및 FAS의 하향 조절로 지방 생성을 억제할 수 있음을 발견했다. 메카니즘 효과 및 바이오 마커 연구 외에도, 본 발명의 FPUE 개입이 장내 미생물 구조의 재건과 후속적인 아커만시아속(Akkermansia)의 증가를 통해 에탄올 유발 간 지방증을 완화할 수 있음을 입증했다.

장기 기능 장애는 주로 장기간의 과도한 음주와 관련이 있으며, 이는 지방간과 같은 초기 증상과 함께 AFLD와 같은 조직 손상 관련 상태로 이어지며 알코올성 간염, 간 섬유 증 및 간경변의 발병을 일으킬 수 있다. 적절한 식습관은 초기에 지방간의 병리학적 상태 를 역전시킬 수 있다. 본 발명의 FPUE는 항 염증 및 항산화 능력으로 인해 생쥐의 간염을 예방하는 것으로 입증되었다. 우리는 FPUE가 간에서 지질 축적, 염증 세포 침윤 및 괴사를 완화함으로써 마우스에서 에탄올 유발 간 손상으로부터 보호할 수 있음을 발견했다.

인간의 위장관에는 큰 미생물 생태계가 존재하며 이는 건강 및 질병 관리와 밀접하게 관련되어 있다. 장-간 순환 경로는 알코올 대사에 중요한 역할을 하며 장내 미생물에 의해 강력하게 조절된다. 장내 미생물이 간 질환의 발병 및 발병에 관여하고 있기 때문이다. 본 발명의 FPUE 보충에 의해 크게 영향을 받는 박테리아 그룹을 추가로 확인했다. 박테로이데스속(Bacteroides), 부티리키모나스(Butyricimonas), 파라박테로이데스속(Parabacteroides) 속을 포함한 여러 의간균문(Bacteroidetes)이 유의하게 증가했음을 발견했다. Bacteroidetes의 문은 일반적으로 인간과 동물의 장, 입, 상부 호흡기 및 생식기에 상주하는 세 가지 주요 부류의 그람 음성 박테리아로 구성되며 유익하고 해로운 특징을 모두 가지고 있는 것으로 설명되어 있다. Bacteroidetes는 다음과 같은 이유로 내인성 감염을 일으킬 수 있다. 미시적 생태적 불균형. 특히 Bacteroides fragilis는 동물의 대장염을 완화하기 위해 다당류 A를 생산할 수 있다. 그러나 결장 종양 형성을 유도하기 위해 전암 효과를 유발하는 독소를 생성할 수 있다. 또한 프로테오 박테리아는 염증을 일으키는 장내 미생물로서 불균형한 미생물 구성에 반응하여 장에서 증식할 수 있으며 질병 발생 및 발달과 관련이 있다. 본 발명에서 FPUE 개입은 Bacteroidetes와 Proteobacteria에서 에탄올로 인한 증가를 현저하게 역전시켜 ND 그룹 수준으로 비율을 복원하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 FPUE의 보호 효과가 항염증 활성과 관련이 있음을 나타낸다. 본 발명은 숙주 대사에 대한 아커만시아속(Akkermansia)의 유익한 효과에 주목했다. 아커만시아는 우미균문(Verrucomicrobia)에서 우세한 속이며 장 점액을 저하시켜 점액 두께를 증가시키고 장 장벽 기능을 향상시킬 수 있으며, 이는 염증 발생률 및 대사 증후군과 반비례한다. 아커만시아의 부족은 알코올로 인한 장내 디스바이오시스(dysbiosis)의 초기 지표로 결정되었다. 더욱이, 에탄올 노출은 쥐와 인간 모두에서 아커만시아를 감소시키고, AFLD(Alcoholic fatty liver disease)의 상태는 아커만시아속의 경구 보충으로 개선될 수 있으며, 이 박테리아의 보호 효과를 직접적으로 입증한다.

생균제로서 아커만시아의 어번던스(abundance)은 특정 식이 성분의 투여에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 실험예를 통해 에탄올에 노출된 간염 마우스에서 아커만시아의 어번던스는 극히 감소했다. 그러나 FPUE 투여군에서 ND 그룹보다 훨씬 더 높은 수치로 그 어번던스를 회복했다. 위 결과는 hepatosteatosis(FLD)를 가진 마우스가 아커만시아를 증가시키는 FPUE 보충의 혜택을 누릴 수 있음을 시사한다.

한편 부티리키모나스(Butyricimonas), 대장균속(Escherichia) 및 빌로필라(Bilophila)의 종은 에탄올 식이에 의해 현저하게 증가했으며 FPUE 보충에 의해 현저하게 역전되었다. FPUE 치료는 에탄올 식단에 의해 증가 된 ALT, AST, TG, LDL 및 총 콜레스테롤 수치를 현저히 감소시켰다. AFLD의 전형적인 특징은 과도한 간 지질 축적이다. 따라서 지질 대사 조절은 대사 장애의 병인에 중요한 역할을 한다. 본 발명에서 장내 미생물의 예상 대사 기능은 FPUE 치료 후 지질 대사 경로가 증가했음을 보여준다. 이는 아커만시아가 지질 대사를 촉진하고 지질 과잉 축적을 방지하는 프로바이오틱스 역할을 함을 나타낸다. 간에서 과도한 지질 축적에 대한 FPUE의 억제가 지질 대사를 촉진하는 장내 세균과 관련이 있을 수 있다. 그것은 항산화, 지방 분해 및 산화 스트레스와 관련된 조절 경로에 미치는 영향을 나타낸다. 또한, FPUE는 이종 생물 분해 및 대사 경로를 증가시켰다. 흥미롭게도 FPUE는 알코올로 인한 간염을 개선하는 데 더욱 효과적이었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 결론적으로 알코올-유도 마우스 모델에서 AST와 ALT가 100% 증가를 보인 반면, FPUE 투여로 AST는 25% 감소, ALT는 70% 의 감소를 보였다. 한편 HDL의 수준은 에탄올 투여 받지 않은 마우스와 FPUE와 유사한 수치를 보였다. 특히 TC와 TG는 FPUE 투여로 25% 증가 그리고 70%의 증가를 보였다. 전체적으로 지방간 지표의 수준을 방사그림으로 비교시 70% 정도의 예방효과를 보였고 특히 FPUE의 투여는 에탄올로 인한 dysbiosis의 개선 효과가 있다는 것을 확인하였다.

본 발명의 보호범위가 이상에서 명시적으로 설명한 실시예의 기재와 표현에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명이 속하는 기술분야에서 자명한 변경이나 치환으로 말미암아 본 발명이 보호범위가 제한될 수도 없음을 다시 한 번 첨언한다.

Claims (5)

1. 알코올 지방간 예방 및 치료용 발효 산돌배 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물로서,
   상기 발효 산돌배 추출물은,
   산돌배 추출물에 전구물질 MSG를 5% 첨가하고 멸균한 다음,
   상기 산돌배 추출물에 고초균을 접종하여 3일 동안 진탕배양하는 1차 발효를 거친 후에,
   탈지유 3%를 추가로 첨가하여 젖산균을 접종하여 7일 동안 정치배양하는 2차 발효를 실시함으로써 얻어지는 것인, 알코올 지방간 예방용 및 치료용 발효 산돌배 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
   
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