KR102386652B1 - 가수분해 활성을 갖는 금속 나노자임을 이용한 바이오센서 - Google Patents

가수분해 활성을 갖는 금속 나노자임을 이용한 바이오센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가수분해 활성을 갖은 금속 나노자임(nanozyme)을 표지로 이용한 바이오센서에 관한 것으로 환원제 존재 하에서 표지에 의해 기질이 가수분해되어 형성된 생성물의 전기화학 신호, 형광 신호, 또는 흡광도 신호를 측정하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 바이오센서는 가수분해되어 형성된 생성물이 전기화학적-화학적 산화환원 순환과 전기화학적-나노촉매적 산화환원 순환에 의해 추가적으로 신호 증폭을 얻을 수 있다.

Description

가수분해 활성을 갖는 금속 나노자임을 이용한 바이오센서{Biosensors Using Metal Nanozyme with Hydrolysis Activity}
본 발명은 가수분해 활성을 가지는 금속 나노자임을 표지로 이용하여 신호를 증폭하는 바이오센서에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생체특이적 결합, 지지체, 표지, 환원제, 기질, 신호 증폭을 포함하는 바이오센서이다.
나노자임(nanozyme)을 효소 대신에 활성이 높고 선택적인 촉매로 사용하기 위해 많이 연구가 진행되었다(Huang, Y.; Ren, J.; Qu, X. Chem. Rev. 2019, 119, 4357). 나노자임의 선택적인 반응에도 불구하고 천연 효소만큼의 반응 속도를 달성하는 것은 어려운 일이다. 따라서, 단순한 산화환원 반응과 가수분해 반응을 모방할 수 있는 나노자임이 주로 개발되었다(Wu, J.; Wang, X.; Wang, Q.; Lou, Z.; Li, S.; Zhu, Y.; Qin, L.; Wei, H. Chem. Soc. Rev. 2019, 48, 1004). 많은 금속산화물 나노물질과 금속 나노물질은 산화제(H2O2, O2 등)의 존재 하에서 퍼옥시데이즈(peroxidase)와 옥시데이즈(oxidase) 효소와 유사한 나노자임으로 작용한다. 일부 금속산화물 나노물질은 표면의 금속산화물과 하이드록사이드(hydroxide) 작용기의 협력 촉매 작용을 통해 에스터레이즈(esterase)와 포스파테이즈(phosphatase) 효소와 유사한 나노자임으로 작용한다.
금 나노입자와 같은 금속 나노물질이 에스터레이즈와 포스파테이즈 효소와 유사한 나노자임으로 사용되고는 있으나, 금속 나노물질의 표면이 촉매로 사용된 것은 아니다(Mancin, F.; Prins, L. J.; Scrimin, P. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 2013, 18, 61). 대신에 '금속 나노입자 표면을 둘러싼 유기 물질 층'에 존재하는 작용기에 의해 촉매적 가수분해가 일어난다. 게다가, 빠른 가수분해 반응을 얻기 위해서는 불안정한 기질이 필요하다. 빠른 가수분해 반응을 불안정한 기질의 사용이 없이도 금속 표면에서 얻는 것은 여전히 어려운 과제이다.
생명체 내의 촉매적 가수분해는 에스터레이즈뿐만 아니라 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (reduced β-nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)의 존재 하에서 일부 디하이드로지네이즈(dehydrogenase) 에 의해서 일어난다 (Field, M. J.; Wymore, T. W. Phys. Scr. 2014, 89, 108004.; Loomes, K. M.; Kitson. K. M. Biochem. J. 1986, 238, 617). 특히, DT-다이아포레이즈(DT-diaphorase, DT-D)는 NADH의 존재 하에서 높은 가수분해 활성을 갖는다(Nandhakumar, P.; Ichzan, A. M.; Lee, N.-S.; Yoon, Y. H.; Ma, S.; Kim, S.; Yang, H. ACS Sens. 2019, 4, 2966). 산화환원 반응이 아닌 에스테르 가수분해는 환원제인 NADH 존재 하에서 일어난다. 니트로(nitro) 및 니트로소(nitroso) 작용기의 환원은 DT-D와 NADH의 존재 하에서 뿐만 아니라 금속 나노입자와 암포니아-보레인(ammonia-borane)의 존재 하에서도 일어난다. 암포니아-보레인의 존재 하에서 금속 나노입자에 금속 하이드라이드(hydride)의 생성은 신속한 촉매 환원을 가능하게 한다(Vasilikogiannaki, E.; Titilas, I.; Vassilikogiannakis, G.; Stratakis, M. Chem. Commun. 2015, 51, 2384). 본 발명에서는 금속 나노입자에 생성된 금속 하이드라이드가 가수분해 반응에 기여함을 이용한다.
본 발명은 생체특이적 결합, 지지체, 표지, 환원제, 기질, 신호 증폭을 포함하는 바이오센서로 환원제 존재 하에서 표지에 의해 기질이 가수분해되어 형성된 생성물의 전기화학 신호, 형광 신호, 또는 흡광도 신호를 측정하는 바이오센서를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 생체특이적 결합을 통해 분석물질과 표지가 지지체에 고정되고, 환원제 존재 하에서 표지에 의한 기질의 가수분해 반응에 의해 신호를 증폭하여 분석물질을 검출하는 바이오센서가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 바이오센서의 표지는 가수분해 반응의 촉매인 금속 나노입자일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 바이오센서의 표지로 사용되는 금속 나노자임은 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 이리듐 나노입자, 팔라듐 나노입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 바이오센서의 기질은 표지물질과 반응 후 전기화학 신호를 발생시키는 것을 특징으로 하는 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate), 아미노페닐 포스페이트(aminophenyl phosphate), 아스코르브산 포스페이트(ascorbic acid phosphate), 아미노나프틸 포스페이트(animo-naphthyl phosphate), 니트로페닐 아세테이트(nitrophenyl acetate), 니트로나프틸 아세테이트(nitronaphthyl acetate), 하이드록시페닐 아세테이트(hydroxyphenyl acetate), 하이드록시메틸나프틸 아세테이트(hydroxy-methyl-naphthyl acetate), 아미노나프탈레닐 아세테이트(aminonaphthalenyl acetate), 하이드록시나프틸 아세트아미드(hydroxynaphthyl acetamide), 하이드록시나프탈레닐 아세테이트(hydroxynaphthalenyl acetate), 하이드록시페닐 프로피오네이트(hydroxyphenyl propionate), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 아미노페놀(aminophenol), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 아미노나프톨(aminonaphthol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이거나,
흡광도 신호를 발생하는 것을 특징으로 하는 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate), 브로모클로로인도실 포스페이트(bromochloroindoxyl phosphate), 니트로페닐 아세테이트(nitrophenyl acetate), 니트로나프틸 아세테이트(nitronaphthyl acetate), 브로모클로로인도실 부티레이트(bromochloroindoxyl butyrate), 브로모클로로인도실 카프리레이트(bromochloroindoxyl caprylate), 니트로페닐 펩타이드(nitrophenyl peptide) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며,
형광 신호를 발생하는 것을 특징으로 하는 4-MU 포스페이트(4-Methylumbelliferone phosphate), 레조루핀 포스페이트(resorufin phosphate), 4-MU 부티레이트(4-Methylumbelliferone butyrate), 레조루핀 부티레이트(resorufin butyrate), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 니트로페놀(nitrophenol), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 rhodamine110, 아미노산 및 펩타이드가 결합된 AMC(7-amino-4-methylcoumarin), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 AFC(7-amino-4-tryfluoromethyl coumarinie), 카복시플루오레세인 디아세테이트 유도체(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate derivative), 벤족사졸릴 엄벨리페릴 아세테이트 유도체(3-(2-Benzoxazolyl)umbelliferyl acetate derivative) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 바이오센서의 가수분해반응의 환원제는 NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide), NADPH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 암모니아-보레인 (ammonia borane, H3N-BH3), 하이드라진 (hydrazine, H2NNH2), 트리스(2-카르복시에틸포스핀) (tris(2-carboxyethylphosphine)), 트리에탄올아민 (triethanolamine), NaBH3CN 및 디싸이오트레이톨(dithiothreitol) 중 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 바이오센서의 신호 증폭 방법은 신호발생 물질의 직접적인 산화환원 반응 또는 산화환원 순환반응을 이용하는 것을 특징으로 하는 전기화학적으로 분석물질을 검출하는 방법 및 신호발생 물질의 형광 신호 혹은 흡광도 신호로부터 분석물질을 검출하는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명은 가수분해를 이용한 바이오센서에 관한 것으로, 금속 나노자임 표지에 의해 기질이 가수분해된 생성물의 전기화학적 신호, 형광 신호, 또는 흡광도 신호를 이용한다. 전기화학 신호를 얻을 때는 환원제에 의한 산화환원 순환에 의해 더 큰 신호 증폭을 얻는다. 본 발명에 따른 바이오센서는 표지물질에 의한 1차적 신호 증폭과, 검출신호의 2차적 증폭을 동시에 이용하여 목적 생체분자를 고감도로 검출할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
도 1 은 환원제 존재 하에서 표지에 의한 가수분해 반응에 의해 전기화학 신호, 형광 신호, 또는 흡광도 신호를 얻는 것을 나타낸 도면이다.
도 2 는 환원제 존재 하에서 표지에 의한 기질의 가수분해 반응을 이용하여 분석물질을 검출하는 샌드위치 바이오센서를 나타낸 도면이다.
도 3 은 환원제 존재 하에서 표지에 의한 기질의 가수분해 반응을 이용하여 분석물질을 검출하는 경쟁적 바이오센서를 나타낸 도면이다.
도 4 는 포스페이트(phosphate), 에스터(ester) 및 아마이드(amide) 결합 중 하나를 가지는 기질의 가수분해 반응을 나타낸 도면이다.
도 5 는 가수분해 반응에 사용되는 환원제의 분자구조를 나타낸 도면이다.
도 6 은 도 5 에 해당하는 환원제의 명칭을 나타낸 도면이다.
도 7 은 가수분해 반응 후 전기화학 신호를 발생시키는 기질의 분자구조를 나타낸 도면이다.
도 8 은 도 7 에 해당하는 기질의 명칭을 나타낸 도면이다.
도 9 는 가수분해 반응 후 흡광도 신호를 발생시키는 기질의 분자구조를 나타낸 도면이다.
도 10 은 도 9 에 해당하는 기질의 명칭을 나타낸 도면이다.
도 11 은 가수분해 반응 후 형광 신호를 발생시키는 기질의 분자구조를 나타낸 도면이다.
도 12 는 도 11 에 해당하는 기질의 명칭을 나타낸 도면이다.
도 13 은 가수분해 반응과 산화환원 순환을 이용한 바이오센서를 나타낸 도면이다.
도 14 는 본 발명의 일 실시예에 따른 금속 나노입자의 에스터 가수분해 반응을 이용하여 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 검출을 위한 바이오센서를 나타낸 도면이다.
도 15 는 본 발명의 일 실시예에 따른 에스터 가수분해 반응을 이용하여 기질인 아미노나프탈레닐 아세테이트(4-aminonaphthalene-1-yl acetate, 1)가 암모니아-보레인(AB) 및 백금 나노입자(PtNP)와 반응하여 얻어지는 전기화학 신호를 나타내는 순환전압전류도(cyclic voltammogram)을 나타낸 도면이다.
도 16 은 본 발명의 일 실시예에 따른 에스터 가수분해 반응을 이용하는 나이트로페닐 아세테이트(4-nitrophenyl acetate, 6), 암모니아-보레인(AB) 및 백금 나노입자(PtNP) 반응을 나타낸 도면이다.
도 17 은 도 16 의 에스터 가수분해 반응에 의한 흡광도 신호 변화를 나타낸 도면이다.
도 18 은 본 발명의 일 실시예에 따른 TSH 검출 센서의 인공 혈청에서 TSH를 검출에 대한 시간 대 전하도(chronocoulometry)를 나타낸 도면이다.
도 19 은 도 18 의 시간 대 전하도에서 100 초일 때의 TSH 농도에 따른 보정된 전하를 나타내는 도면이다.
도 20 은 20 개의 실제 환자 혈청에서 TSH를 상용화 장비로 검출한 결과와 본 발명의 일 실시예에 따른 TSH 검출 센서로 검출한 결과를 비교한 도면이다.
본 발명의 일 측면에 따르면,
지지체, 표지, 환원제 및 기질를 포함하는 바이오센서에 있어서, 상기 지지체는 전극을 포함하고, 상기 표지는 금속 나노자임을 포함하며, 상기 금속 나노자임과 환원제가 존재하는 상태에서 기질의 가수분해가 일어나고, 상기 가수분해에 의해 신호를 내는 산물이 지속적으로 만들어짐으로써 신호가 증폭되며, 생체특이적 결합을 이용하여 분석물질을 검출하는, 바이오센서를 제공한다.
이 때, 본 발명의 일 측면에 따라 제공되는 상기 금속 나노자임은, 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 이리듐 나노입자, 팔라듐 나노입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
나아가, 상기 생체특이적 결합은, 포획 프로브(probe)가 지지체에 고정되고, 검출 프로브가 표지와 연결되어, 포획 프로브와 검출 프로브가 분석물질을 사이에 두고 샌드위치 형태로 특이적 결합하는 것일 수 있다.
또는, 포획 프로브가 지지체에 고정되고, 분석물질과 표지가 결합된 것 및 분석물질이 포획 프로브에 경쟁적으로 결합하는 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 일 측면에 따라 제공되는 분석물질 검출 바이오센서에 있어서, 상기 기질은 가수분해 반응 후에 전기화학 신호, 형광 신호, 또는 흡광도 신호를 발생하는 상기 산물을 만들어낼 수 있다.
이러한 상기 신호들을 만들어내는 기질들은 전기화학 신호, 형광 신호, 또는 흡광도 신호 등의 신호의 종류에 따라, 기질의 종류가 상이할 수 있으며, 상기 전기화학 신호를 발생시키는 기질의 예로서, 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate), 아미노페닐 포스페이트(aminophenyl phosphate), 아스코르브산 포스페이트(ascorbic acid phosphate), 아미노나프틸 포스페이트(animo-naphthyl phosphate), 니트로페닐 아세테이트(nitrophenyl acetate), 니트로나프틸 아세테이트(nitronaphthyl acetate), 하이드록시페닐 아세테이트(hydroxyphenyl acetate), 하이드록시메틸나프틸 아세테이트(hydroxy-methyl-naphthyl acetate), 아미노나프탈레닐 아세테이트(aminonaphthalenyl acetate), 하이드록시나프틸 아세트아미드(hydroxynaphthyl acetamide), 하이드록시나프탈레닐 아세테이트(hydroxynaphthalenyl acetate), 하이드록시페닐 프로피오네이트(hydroxyphenyl propionate), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 아미노페놀(aminophenol), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 아미노나프톨(aminonaphthol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
구체적으로는, 도 7 에 기재된 화학식의 기질일 수 있으며, 그 구체적인 명칭에 대해서는 도 8 에 나타낸다.
또한, 상기 흡광도 신호를 발생시키는 상기 기질의 예로는, 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate), 브로모클로로인도실 포스페이트(bromochloroindoxyl phosphate), 니트로페닐 아세테이트(nitrophenyl acetate), 니트로나프틸 아세테이트(nitronaphthyl acetate), 브로모클로로인도실 부티레이트(bromochloroindoxyl butyrate), 브로모클로로인도실 카프리레이트(bromochloroindoxyl caprylate), 니트로페닐 펩타이드 (nitrophenyl peptide) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
구체적으로는, 도 9 에 기재된 화학식의 기질일 수 있으며, 그 구체적인 명칭에 대해서는, 도 10 에 나타낸다.
나아가, 상기 형광 신호를 발생시키는 상기 기질의 예로는, 4-MU 포스페이트(4-Methylumbelliferone phosphate), 레조루핀 포스페이트(resorufin phosphate), 4-MU 부티레이트(4-Methylumbelliferone butyrate), 레조루핀 부티레이트(resorufin butyrate), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 니트로페놀(nitrophenol), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 rhodamine110, 아미노산 및 펩타이드가 결합된 AMC(7-amino-4-methylcoumarin), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 AFC(7-amino-4-tryfluoromethyl coumarinie), 카복시플루오레세인 디아세테이트 유도체(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate derivative), 벤족사졸릴 엄벨리페릴 아세테이트 유도체(3-(2-Benzoxazolyl)umbelliferyl acetate derivative) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
구체적으로는, 도 11 에 기재된 화학식의 기질일 수 있으며, 그 구체적인 명칭에 대해서는 도 12 에 나타낸다.
한편, 본 발명의 일 측면에 따라 제공되는 분석물질 검출 바이오센서에 있어서, 상기 환원제는, NADH, NADPH, AB(H3N-BH3), H2NNH2, 트리스(2-카르복시에틸포스핀)(tris(2-carboxyethylphosphine)), 트리에탄올아민(triethanolamine), NaBH3CN 및 디싸이오트레이톨(dithiothreitol)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
구체적으로는, 도 5 에 기재된 화학식의 환원제일 수 있으며, 그 구체적인 명칭에 대해서는 도 6 에 나타낸다.
아울러, 본 발명의 일 측면에 따라 제공되는 분석물질 검출 바이오센서로 검출하는 분석물질은 DNA, RNA, 대사산물(metabolite), 단백질, 동식물 세포, 및 미생물 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 해당할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 측면에 따라 제공되는 분석물질 검출 바이오센서에 있어서, 금속 나노자임과 환원제가 존재하는 상태에서 일어나는 기질의 가수분해에 의해 전기화학 신호를 발생하는 산물이 만들어지고, 상기 산물이 전기화학적으로 산화된 후, 상기 환원제에 의해 환원이 되어 산화환원 순환이 일어나고, 상기 산화환원 순환에 의해 전기화학 신호가 추가적으로 증폭될 수 있다. 이를 통해, 기존의 바이오센서에 비해 더 큰 신호 증폭을 얻을 수 있는바, 목적 생체분자를 고감도로 검출할 수 있는 효과가 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출방법은, 생체특이적 결합에 의해 분석물질과 표지가 지지체에 고정되고, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 표지물질과 기질의 가수분해에 의한 1차적 신호 증폭과 또 다른 2차적 신호 증폭을 이용한다. 상기 표지물질은 가수분해반응의 촉매인 금속 나노입자일 수 있고, 상기 가수분해반응에 의한 1차적 신호 증폭으로 전기화학 신호거나 색깔 또는 형광 신호가 얻어지고, 상기 2차적 신호 증폭은 1차적 신호 증폭의 전기화학 신호거나 색깔 또는 형광 신호에 따라 결정되며, 상기 분석물질을 검출하는 단계는, (a) 분석물질만을 선택적으로 결합하는 단백질의 특이적 결합으로 분석물질과 표지물질이 지지체에 결합하는 단계; 및 (b) 상기 표지물질과 기질의 가수분해 반응과 신호 증폭으로 분석물질을 검출하는 단계; 를 포함한다.
분석물질의 종류와 특성에 따라 다양한 종류의 생체특이적 결합이 사용될 수 있다. 일례로, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 샌드위치 바이오센서에서는, 검출 프로브(detection probe)와 포획 프로브(capture probe)가 사용될 수 있다. 이 경우, 포획 프로브는 지지체에 고정되고 검출 프로브는 표지와 연결된다. 또한, 포획 프로브와 검출 프로브는 분석물질을 사이에 두고 샌드위치 형태로 특이적 결합을 한다. 즉, 본 발명에 포함되는 생체특이적 결합의 종류는 한정되어 있는 것이 아니라 검출하고자 하는 분석물질의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또한, 분석물질의 검출 방식에 따라, 2종 이상의 생체특이적 결합이 함께 사용될 수도 있다. 상기 분석물질은 DNA, RNA, 대사 산물(metabolite), 단백질, 동식물 세포 및 미생물 중 어느 하나 이상일 수 있다.
또 다른 예로, 도 3에 나타낸 바와 같이, 경쟁적 바이오센서에 사용될 수 있다. 이 경우, 포획 프로브는 지지체에 고정되고, 분석물질은 '분석물질과 표지가 결합된 것'과 함께 고정된 포획 프로브에 경쟁적으로 결합한다. 분석물질의 농도가 높으면 '분석물질과 표지물질이 접합된 것'이 포획 프로브에 결합한 비율이 낮아지므로 표지물질에 의한 신호가 작게 나타난다. 포획 프로브는 분석물질과 특이적 결합이 가능한 물질로 대체될 수 있으며, 상기 분석물질은 DNA, RNA, 대사 산물(metabolite), 단백질, 동식물 세포 및 미생물 중 어느 하나 이상일 수 있다.
도 4에 나타낸 것과 같이, 기질은 포스페이트, 에스터 및 아마이드 결합 중 하나를 가지고 있고, 환원제와 표지 존재 하에서 가수분해 반응에 의해 포스페이트, 에스터 및 아마이드 결합이 분리되어 전기화학 신호, 형광 신호, 또는 흡광도 신호를 나타내는 물질로 변환된다. 도 5에 나타낸 것과 같은 NADH(β-Nicotinamide adenine dinucleotide), NADPH(β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), 암모니아-보레인(ammonia borane, H3N-BH3), 하이드라진(hydrazine, H2NNH2), 트리스(2-카르복시에틸포스핀)(tris(2-carboxyethylphosphine)), 트리에탄올아민(triethanolamine), NaBH3CN 및 디싸이오트레이톨(dithiothreitol) 중 적어도 하나를 환원제로 사용한다. 즉, 계속적인 기질의 가수분해 반응으로 1차적인 신호 증폭을 얻을 수 있도록 한다. 도 5 에 나타낸 각각의 환원제는 도 6 에 기재된 명칭과 대응한다.
일 측에 따르면, 표지물질은 금속 나노입자를 이용한 나노자임이 될 수 있다. 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 이리듐 나노입자, 팔라듐 나노입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
2차적 신호 증폭은 가수분해 반응 후 생성물질이 나타내는 신호에 따라 달라질 수 있다. 전기화학 신호를 발생시킬 경우, 도 7 과 도 8 에 나타낸 것과 같은 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate), 아미노페닐 포스페이트(aminophenyl phosphate), 아스코르브산 포스페이트(ascorbic acid phosphate), 아미노나프틸 포스페이트(animo-naphthyl phosphate), 니트로페닐 아세테이트(nitrophenyl acetate), 니트로나프틸 아세테이트(nitronaphthyl acetate), 하이드록시페닐 아세테이트(hydroxyphenyl acetate), 하이드록시메틸나프틸 아세테이트(hydroxy-methyl-naphthyl acetate), 아미노나프탈레닐 아세테이트(aminonaphthalenyl acetate), 하이드록시나프틸 아세트아미드(hydroxynaphthyl acetamide), 하이드록시나프탈레닐 아세테이트(hydroxynaphthalenyl acetate), 하이드록시페닐 프로피오네이트(hydroxyphenyl propionate), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 아미노페놀(aminophenol), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 아미노나프톨(aminonaphthol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 2차적 신호증폭은 전기화학적-화학적 산화환원 순환, 전기화학적-나노촉매적 산화환원 순환 중 하나 이상 일 수 있다. 상기 가수분해 반응을 통해 전기화학 신호를 발생시킬 수 있는 물질로 변화된 생성물질은 전극에서 산화되어 전기화학 신호가 발생되고, 산화된 생성물질은 환원제에 다시 생성물질이 되어 전극에서 산화되어 전기화학 신호가 증가하여, 산화환원 순환으로 2차적 신호 증폭이 가능한 것을 포함한다.
흡광도 신호를 발생시키는 것을 특징으로 하는 경우, 도 9 와 도 10 에 나타낸 것과 같이 가수분해 반응 후에 흡광도 신호를 나타내는 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate), 브로모클로로인도실 포스페이트(bromochloroindoxyl phosphate), 니트로페닐 아세테이트(nitrophenyl acetate), 니트로나프틸 아세테이트(nitronaphthyl acetate), 브로모클로로인도실 부티레이트(bromochloroindoxyl butyrate), 브로모클로로인도실 카프리레이트(bromochloroindoxyl caprylate), 니트로페닐 펩타이드 (nitrophenyl peptide) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고,
도 11 과 도 12 에 나타낸 것과 같이 가수분해 반응 후에 형광 신호를 나타내는 4-MU 포스페이트(4-Methylumbelliferone phosphate), 레조루핀 포스페이트(resorufin phosphate), 4-MU 부티레이트(4-Methylumbelliferone butyrate), 레조루핀 부티레이트(resorufin butyrate), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 니트로페놀(nitrophenol), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 rhodamine110, 아미노산 및 펩타이드가 결합된 AMC(7-amino-4-methylcoumarin), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 AFC(7-amino-4-tryfluoromethyl coumarinie), 카복시플루오레세인 디아세테이트 유도체(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate derivative), 벤족사졸릴 엄벨리페릴 아세테이트 유도체(3-(2-Benzoxazolyl)umbelliferyl acetate derivative) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
도 13 은 전기화학 신호를 내는 생성물질의 산화에 의한 1차적 신호 증폭과 산화환원 순환에 의한 2차적 신호 증폭을 이용한 바이오센서를 나타낸 것이다.
일 측에 따른, 바이오센서는 앞서 설명된 분석물질 검출방법을 이용한 것일 수 있다. 이 경우, 바이오센서는 전술된 내용에 따라 적합한 물질로 구성되는 것이 바람직하다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예 들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
또한, 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
어느 하나의 실시예에 포함된 구성요소와, 공통적인 기능을 포함하는 구성요소는, 다른 실시예에서 동일한 명칭을 사용하여 설명하기로 한다. 반대되는 기재가 없는 이상, 어느 하나의 실시예에 기재한 설명은 다른 실시 예에도 적용될 수 있으며, 중복되는 범위에서 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
다음은 본 발명의 일 실시예에 따른 가수분해를 이용한 바이오센서를 도면을 첨부하여 설명한 것이다.
- 실시예. 백금 나노입자, 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트, 및 암모니아-보레인을 이용한 갑상선 자극 호르몬(TSH)의 검출 및 특성 평가
도 14 는 금속 나노입자와 암모니아-보레인을 사용한 에스터 가수분해 반응을 이용하여 갑상선 자극 호르몬(TSH) 검출을 위한 전기화학 바이오센서를 개략적으로 도시한 것이다.
도 14 에서, 갑상선 자극 호르몬을 검출하기 위한 금속 나노입자를 표지로 사용한 샌드위치 타입의 바이오센서에서 갑상선 자극 호르몬과 특이적으로 결합하는 검출 프로브와 포획 프로브를 사용하고, 비오틴이 접합된 포획 프로브를 사용하고, 표지인 백금 나노입자와 접합된 검출 프로브를 사용하며, 비오틴과 친화도가 높은 아비딘으로 도포된 ITO 전극을 사용하였다. 기질로는 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트를, 환원제로는 암모니아-보레인을 사용하였다.
도 14 에서 도시한 바에 따른 아세테이트 가수분해 반응을 이용한 갑상선 자극 호르몬의 검출 방법은 다음과 같다. 갑상선 자극 호르몬이 먼저 비오틴이 접합된 포획 프로브와 아비딘으로 도포된 ITO 전극에 도포되고 고정된다. 이어 백금 나노입자가 접합된 검출 프로브가 상기 고정된 갑상선 자극 호르몬에 도포된다. 변형된 ITO 전극을 상온에서 10분 반응시키는 동안 백금 나노입자는 기질인 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트를 4-아미노-1-나프톨로 변환한다. 4-아미노-1-나프톨은 전기화학적으로 나프토키논이민으로 산화된다. 이어서, 나프토키논이민은 i) 암모니아-보레인에 의한 화학적 환원 및 ii) 백금 나노입자와 암모니아-보레인에 의한 나노촉매적 환원에 의해 4-아미노-1-나프톨로 환원된다. 재생성된 4-아미노-1-나프톨은 다시 전기화학적으로 산화된다. 결과적으로, ITO 전극, 4-아미노-1-나프톨 및 암모니아-보레인을 포함하는 전기화학적-화학적 산화환원 순환과 ITO 전극, 4-아미노-1-나프톨, 백금 나노입자 및 암모니아-보레인을 포함한 전기화학적-나노촉매적 산화환원 순환, 2 개의 산화환원 순환이 일어난다.
위와 같은 원리로 아세테이트 에스터 가수분해 반응을 이용한 갑상선 자극 호르몬의 검출 실험은 하기와 같이 진행되었다.
1. 비오틴-접합된 anti-TSH IgG의 제조
비오틴- anti-TSH IgG 접합체는 종래에 보고된 절차에 따라 제조되었다. 10 mM EZ-link sulfo-NHS-LC-LC-비오틴 용액 1.33 μL와 100 μg/mL anti-TSH IgG가 포함된 PBS 완충액 1 mL를 혼합하고 22 ± 2 °C에서 30분 동안 배양했다. 그 결과액을 12,000 rpm에서 20분 동안 원심 분리 필터로 여과하고, 여과 액을 1 mL의 PBSB 완충액에 용해시켰다.
2. 백금 나노입자와 anti-TSH IgG 접합체의 제조
5 μg/mL 농도의 백금 나노입자를 함유한 1 mL의 5 mM 탄산염 완충용액 (carbonate buffer, pH 8.5)를 최종 농도 10 μg/mL 농도의 anti-TSH IgG를 함유 한 30 μL의 5 mM 탄산염 완충용액 (carbonate buffer, pH 8.5)이 담긴 유리 튜브에 천천히 첨가한다. 그 후, 50 μL의 PBSB를 3 분 동안 교반 하면서 첨가하였다. 혼합물을 PBSB-처리된 튜브를 사용하여 4 ℃에서 1 시간 동안 20000g에서 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상층액을 버리고 침전물을 1 mL의 5 mM 탄산염 완충용액(carbonate buffer, pH 8.5)에 희석시킨다. 백금 나노입자와 anti-TSH IgG 접합체의 용액을 15 분 동안 교반하고 4 ℃에서 유리 바이알에 저장하였다. 백금 나노입자와 anti-TSH IgG 접합체의 용액을 추가 희석없이 사용하였고 감지 실험을 수행하기 전에 매일 새로 제조하였다.
3. TSH 면역 감지 전극의 제조 및 측정
ITO 전극을 70 ℃에서 1 시간 동안 H2O, H2O2 (30 %) 및 NH4OH (5 %)의 5:1:1 용액으로 전처리 하였다. 아비딘으로 개질 된 ITO 전극을 얻기 위해, 10 μg/mL 아비딘을 함유하는 70 μL의 50 mM 탄산염 완충 용액 (carbonate buffer, pH 9.6)을 ITO 전극에 떨어뜨려 20 ℃ 에서 2 시간 동안 배양하였다. 다음으로, 70 μL의 PBSB 용액을 아비딘으로 개질된 ITO 전극에 떨어뜨려 아비딘 및 BSA으로 개질된 ITO 전극을 제작하였다. 개질된 ITO 전극 상에 10 ㎍/mL 비오틴이 접합된 anti-TSH IgG를 함유하는 70 μL의 PBSB 용액을 떨어뜨리고, 감지 전극을 4 ℃ 에서 30 분 동안 처리된 상태로 유지시켰다. 상이한 농도의 TSH (또는 임상 혈청 샘플) (70 μL)를 함유하는 인공 혈청을 감지 전극에 떨어뜨리고 4 ℃ 에서 30 분 동안 배양한 후, 감지 전극을 헹굼 완충액으로 세척하였다. 이어서, 10 μg/mL 백금 나노입자와 anti-TSH IgG 접합체를 함유하는 70 μL의 PBSB를 전극에 떨어뜨리고 4 ℃ 에서 30 분 동안 배양한 후, 헹굼 완충액으로 세척하였다. 2.0 mM 암모니아-보레인과 0.2 mM 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트가 포함된 1 mL의 트리스(tris) 완충액 (pH 9.0)을 면역 센싱 전극, Ag/AgCl (3M NaCl) 기준 전극, 백금 카운터 전극이 조립된 전기화학적 셀에 주입한다. 각 ITO 전극의 노출된 영역은 약 0.28 cm2였다. 전기화학적 셀에 주입된 용액을 10 분간 상온에서 배양한 뒤, CHI 708C system (CH instruments, Austin, TX, USA)를 이용하여 전기화학적 측정을 시행한다.
도 15 는 전기화학 신호를 나타내는 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트를 기질로 이용하여 백금 나노입자의 에스터 가수분해 반응의 특징을 실험한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 15 의 (i), (ii), (iii), (iv) 는 각각, (i) 0.2 mM 4-아미노나프탈레닐-1- 아세테이트, (ii) 0.2 mM 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트 및 2.0 mM 암모니아-보레인, (iii) 0.2 mM 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트 및 3 μg/mL 백금 나노입자, (iv) 0.2 mM 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트, 2.0 mM 암모니아-보레인, 및 3 μg/mL 백금 나노입자를 함유하는 수용액이 공급된 경우로, 순환전압전류법으로 전기화학 신호를 나타낸 것이다.
도 15 에서는 백금 나노입자의 가수분해 반응에 대한 활성을 확인하기 위해, -0.2 ~ 0.4 V 전압 범위에서 20 mV/s의 속도로 얻은 전류 신호를 나타낸다. (i), (ii), (iii) 를 이용한 측정에서는 전류의 증가가 나타나지 않았지만, 0.2 mM 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트, 2.0 mM 암모니아-보레인, 3 μg/mL 백금 나노입자를 모두 함유하는 (iv) 만이 전류의 증가를 나타냈다. 이 결과는 백금 나노입자가 에스터 가수분해 반응에 촉매 활성을 갖고, 4-아미노나프탈레닐-1-아세테이트의 에스터를 에스터 가수분해한다는 것을 확인시킨다.
도 16 은 색깔 신호를 나타내는 4-나이트로페닐 아세테이트를 기질로 이용하여 백금 나노입자의 에스터 가수분해 반응을 설명하는 개념도이다. 백금 나노입자와 암모니아-보레인으로 인해 무색인 4-나이트로페닐 아세테이트의 에스터 가수분해 반응으로 노란색인 4-나이트로페놀로 변한다.
도 17 에서 (i), (ii), (iii), (iv) 는 각각, (i) 50 μM 4-나이트로페닐 아세테이트, (ii) 50 μM 4-나이트로페닐 아세테이트 및 1.0 mM 암모니아-보레인, (iii) 50 μM 4-나이트로페닐 아세테이트 및 1 μg/mL 백금 나노입자, (iv) 50 μM 4-나이트로페닐 아세테이트, 1.0 mM 암모니아-보레인, 및 1 μg/mL 백금 나노입자를 함유하는 수용액이 공급된 경우로, 흡광도 신호의 변화를 나타낸 것이다.
도 17 에서는 백금 나노입자의 환원가수분해 반응의 활성을 확인하기 위해, 300 ~ 600 nm 파장 범위에서 얻은 흡광도를 나타낸다. (i) 과 (iii) 를 이용한 측정에서는 400 nm 파장의 흡광도 증가가 나타나지 않았지만, (ii) 를 이용한 측정에서는 약간의 흡광도가 증가했다. 그리고 50 μM 4-나이트로페닐 아세테이트, 1.0 mM 암모니아-보레인, 및 1 μg/mL 백금 나노입자를 모두 함유하는 (iv) 만이 400 nm 파장에서 상당한 흡광도의 증가가 나타났다. 이 결과는 백금 나노입자가 에스터 가수분해 반응에 대한 촉매 활성을 갖고, 4-나이트로페닐 아세테이트를 에스터 가수분해한다는 것을 확인시킨다.
도 18 은 갑상선 자극 호르몬의 다양한 농도에서 갑상선 자극 호르몬 검출을 수행한 결과를 시간 대 전하도(chronocoulogram)로 나타낸다. 인가 전위는 0.1 V였고, 그래프의 기울기는 인공 혈청에서 갑상선 자극 호르몬의 농도가 증가함에 따라 증가했다.
도 19 는 도 18 의 시간 대 전하도에서 100 초에 측정된 전하 값을 사용하여 얻은 캘리브레이션 플롯(calibration plot)이다. 갑상선 자극 호르몬의 계산된 검출 한계는 약 0.8 pg/mL이었으며, 이는 갑상선 자극 호르몬이 고감도로 검출 가능함을 나타낸다.
도 20 은 본 실시예에서 개발된 갑상선 자극 호르몬 검출법의 성능을 조사하기 위해, 20 개의 임상 혈청 샘플에서 갑상선 자극 호르몬 농도를 검출하였다. 계산된 갑상선 자극 호르몬의 농도는 상업용 계측기를 사용하여 측정한 농도와 잘 일치하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (12)

  1. 지지체, 표지, 환원제 및 기질을 포함하는 바이오센서에 있어서,
    상기 지지체 표면에서 생체특이적 결합이 일어나고,
    상기 표지는 금속 나노자임을 포함하며,
    상기 금속 나노자임과 환원제가 존재하는 상태에서 금속 표면에서 기질의 가수분해가 일어나고,
    상기 가수분해에 의해 신호를 내는 산물이 지속적으로 만들어짐으로써 신호가 증폭되며,
    상기 생체특이적 결합을 이용하여 분석물질을 검출하고,
    상기 금속 나노자임은 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 이리듐 나노입자, 팔라듐 나노입자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며,
    상기 환원제는, NADH, NADPH, AB(H3N-BH3), H2NNH2, 트리스(2-카르복시에틸포스핀)(tris(2-carboxyethylphosphine)), 트리에탄올아민(triethanolamine), NaBH3CN 및 디싸이오트레이톨(dithiothreitol)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생체특이적 결합은, 포획 프로브(probe)가 지지체에 고정되고, 검출 프로브가 표지와 연결되어,
    포획 프로브와 검출 브로브가 분석물질을 사이에 두고 샌드위치 형태로 특이적 결합을 하는 것인, 바이오센서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생체특이적 결합은, 포획 프로브가 지지체에 고정되고, 분석물질과 표지가 결합된 것 및 분석물질이 포획 프로브에 경쟁적으로 결합하는 것인, 바이오센서.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 기질은 가수분해 반응 후에 전기화학 신호, 형광 신호, 또는 흡광도 신호를 발생하는 상기 산물을 만들어내는 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 전기화학 신호를 발생시키는 상기 기질은, 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate), 아미노페닐 포스페이트(aminophenyl phosphate), 아스코르브산 포스페이트(ascorbic acid phosphate), 아미노나프틸 포스페이트(animo-naphthyl phosphate), 니트로페닐 아세테이트(nitrophenyl acetate), 니트로나프틸 아세테이트(nitronaphthyl acetate), 하이드록시페닐 아세테이트(hydroxyphenyl acetate), 하이드록시메틸나프틸 아세테이트(hydroxy-methyl-naphthyl acetate), 아미노나프탈레닐 아세테이트(aminonaphthalenyl acetate), 하이드록시나프틸 아세트아미드(hydroxynaphthyl acetamide), 하이드록시나프탈레닐 아세테이트(hydroxynaphthalenyl acetate), 하이드록시페닐 프로피오네이트(hydroxyphenyl propionate), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 아미노페놀(aminophenol), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 아미노나프톨(aminonaphthol) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 흡광도 신호를 발생시키는 상기 기질은, 니트로페닐 포스페이트(nitrophenyl phosphate), 브로모클로로인도실 포스페이트(bromochloroindoxyl phosphate), 니트로페닐 아세테이트(nitrophenyl acetate), 니트로나프틸 아세테이트(nitronaphthyl acetate), 브로모클로로인도실 부티레이트(bromochloroindoxyl butyrate), 브로모클로로인도실 카프리레이트(bromochloroindoxyl caprylate), 니트로페닐 펩타이드 (nitrophenyl peptide) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 형광 신호를 발생시키는 상기 기질은, 4-MU 포스페이트(4-Methylumbelliferone phosphate), 레조루핀 포스페이트(resorufin phosphate), 4-MU 부티레이트(4-Methylumbelliferone butyrate), 레조루핀 부티레이트(resorufin butyrate), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 니트로페놀(nitrophenol), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 rhodamine110, 아미노산 및 펩타이드가 결합된 AMC(7-amino-4-methylcoumarin), 아미노산 및 펩타이드가 결합된 AFC(7-amino-4-tryfluoromethyl coumarinie), 카복시플루오레세인 디아세테이트 유도체(5(6)-Carboxyfluorescein diacetate derivative), 벤족사졸릴 엄벨리페릴 아세테이트 유도체(3-(2-Benzoxazolyl)umbelliferyl acetate derivative) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 분석물질은, DNA, RNA, 대사산물(metabolite), 단백질, 동식물 세포, 및 미생물 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 센서.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 신호를 발생하는 산물이 산화된 후, 상기 환원제에 의해 환원이 되어 산화환원 순환이 일어나는 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 산화환원 순환에 의해 신호가 추가적으로 증폭되는 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
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