KR102375663B1 - 무손실 세포 염색 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 무손실 세포 염색 방법 및 장치에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 염색 전에 분석 대상 세포를 상전이 물질 내에 고정화시킴으로써 염색 시약 또는 세척 시약을 처리하는 과정에서 세포 손실이 일어나지 않는 세포 염색 방법 및 염색 장치에 관한 것이다. 본 발명에 따른 무손실 세포 염색 방법은 임상 진단에서 중요하게 부각되고 있는 희귀 세포(rare cells)의 염색 및 분석 과정에서 세포의 손실을 효과적으로 차단할 수 있어, 미량 시료의 경우에도 관찰, 분석 및 이를 이용한 진단을 용이하게 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 무손실 세포 염색 방법에 의해 세포를 고정시킴으로써 단일 세포의 구별 및 분리가 쉽고, 분리된 세포의 분석에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 무손실 세포 염색 방법 및 장치에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 염색 전에 분석 대상 세포를 상전이 물질 내에 고정화시킴으로써 염색 시약 또는 세척 시약을 처리하는 과정에서 세포 손실이 일어나지 않는 세포 염색 방법 및 염색 장치에 관한 것이다.
면역조직화학(immunocytochemistry, ICC) 염색은 특정 단백질 또는 세포에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 이들의 위치 및 모양을 관찰하기 위해 널리 사용되는 기술이다. 임상 진단 분야에 있어서 분석 대상 물질 또는 세포를 특이적으로 염색하는 단계는 이들의 존재 유무를 용이하게 확인하고 관찰할 수 있도록 할 뿐만 아니라, 이를 이용한 질병의 진단 및 분석을 가능하게 하는 중요한 단계이다.
특히 부유 세포(suspension cells) 시료를 염색하기 위해서는 일차적으로 관찰 슬라이드의 바닥면에 세포를 위치시키는 단계가 중요하다. 종래 세포 염색을 위한 전처리 방법은 대표적으로 원심분리를 이용하여 시료를 분리 및 위치시킨 후 염색하는 사이토스핀 방법(cytospin method), 슬라이드 글라스 위에 관찰하고자 하는 시료를 넓게 퍼뜨린 다음 건조시켜 염색하는 스미어 방법(smear method) 등이 널리 사용되고 있었다. 또한, 최근에는 큐릭스(Curiox)에서 원심분리가 필요 없는 새로운 세포 전처리 방식이 개발되기도 하였다.
그러나 종래 세포의 전처리 방법에서는 염색 시약 처리 및 세척 과정에서 시료 중 세포의 30% 이상이 손실되는 단점이 있었다. 상용화된 세포주 또는 면역 세포와 같이 다량의 시료 확보가 용이한 세포의 경우 상기와 같은 세포 손실에도 불구하여 분석 및 진단에 문제가 없으나, 혈중암세포(CTC, circulating tumor cells) 또는 태아세포와 같이 시료 내 극미량으로 존재하는 희소 세포의 경우 전처리 과정에서 위와 같은 세포의 손실은 분석 및 진단에 치명적인 문제를 일으킬 수 있으며, 나아가 어렵게 확보한 시료의 분석이 불가능한 문제가 발생하기도 한다.
그러나 현재까지 시료 중 세포의 손실을 막을 수 있는 세포 염색 방법이 거의 개발되지 않은 실정이다. 최근 논문에서 플라즈마 처리를 통해 멤브레인 표면에 분석 대상 세포를 고정시킴으로써 세포의 손실을 줄일 수 있다는 점이 발표되기도 하였다(ACS. Appl. Master. Interfaces 2014, 6, 20828-20836). 그러나 이는 고가의 장비를 필요로 할 뿐만 아니라, 세포 종류와 전하 값에 따라 재현성이 현저히 떨어지는 문제가 있어 상용화가 불가능하였다.
이에 본 발명자들은 세포의 종류에 관계 없이 상용화가 용이한 무손실 세포 염색 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 (a) 챔버 내에 상전이 물질 및 분석 대상 세포가 포함된 생체 시료를 투입하는 단계; (b) 상기 챔버 바닥면에 시료 중 부유하는 분석 대상 세포를 위치시키는 단계; (c) 상기 상전이 물질을 고체화시켜 바닥면에 세포를 고정화하는 단계; 및 (d) 상기 고정화된 세포를 염색하는 단계를 포함하는 무손실 세포 염색 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상단면이 개방된 챔버 유닛(100); 상기 챔버 유닛(100)의 내측에 설치되며 상단면 및 바닥면이 개방된 베젤 유닛(200); 및 상기 베젤 유닛(200)의 내측에 설치되며 상기 챔버 유닛(100)의 바닥면으로부터 일정 간격 이격된 상태로 구비되는 두께 조절 유닛(300)을 포함하는 무손실 세포 염색 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 챔버 내에 상전이 물질 및 분석 대상 세포가 포함된 생체 시료를 투입하는 단계; (b) 상기 챔버 바닥면에 시료 중 부유하는 분석 대상 세포를 위치시키는 단계; (c) 상기 상전이 물질을 고체화시켜 바닥면에 세포를 고정화하는 단계; (d) 상기 고정화된 세포를 염색하는 단계; 및 (e) 상기 염색된 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단일 세포 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 시료 중 분석 대상 세포를 염색 장치 바닥에 고정화시킴으로써 염색 및 세척 과정에서 세포의 손실을 차단할 수 있는 무손실 세포 염색 방법 및 이를 위한 염색 장치 등을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (a) 챔버 내에 상전이 물질 및 분석 대상 세포가 포함된 생체 시료를 투입하는 단계, (b) 상기 챔버 바닥면에 시료 중 부유하는 분석 대상 세포를 위치시키는 단계, (c) 상기 상전이 물질을 고체화시켜 바닥면에 세포를 고정화하는 단계 및 (d) 상기 고정화된 세포를 염색하는 단계를 포함하는 무손실 세포 염색 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 상전이 물질 및 생체 시료는 동시에, 혼합하여 또는 각각 투입할 수 있으며, 투입 순서는 제한되지 않는다.
바람직하게, 본 발명에 있어서 상기 (a) 단계는 시료 염색 장치 중 챔버 내에 상전이 물질을 투입하는 단계, 챔버 내부에 겔 안정화를 위한 베젤 유닛을 설치하는 단계 및 상기 분석 대상 세포가 포함된 생체 시료를 투입하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "상전이 물질"은 자외선(UV), 온도 등에 의해 물질의 상(phase)이 변하는 물질을 의미한다. 구체적으로 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 상전이 물질은 광경화 하이드로겔 또는 열경화 하이드로겔을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 광경화 하이드로겔은 자외선(UV)과 같은 일정 파장의 빛을 일정 시간 조사하였을 때 액체 또는 졸(sol) 상태에서 고체 또는 겔(gel) 상태로 전이될 수 있는 물질이다. 상기 열경화 하이드로겔은 온도의 변화에 의해 상전이 될 수 있는 물질로서, 상온에서는 액체 또는 졸 상태로 존재하나 특정 온도 이상에서 고체 또는 겔 상태로 전이될 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 상전이 물질은 폴레에틸렌글리콜 아크릴레이트 유도체(PEG acrylate derivatives), PEG 메타크릴레이트 유도체(PEG methacrylate derivatives), 폴리비닐 알코올 유도체(polyvinyl alcohol (PVA) derivatives), 히알루론산 유도체(hyaluronic acid derivatives), 덱스트란 메타크릴레이트(dextran methacrylate), 폴리 (N-이소프로필아크릴아미드) (pNiPAAm, poly (N-isopropylacrylamide)), 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol), 폴리프로필렌글리콜(PPG, Poly(propylene glycol)), 폴리메타크릴산(PMAA, Poly(methacrylic acid)), 메틸셀룰로오스(MC, Methylcellulose), 키토산(Chitosan) 또는 폴록사머(poloxamer)를 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 상전이 물질은 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA, poly ethylene glycol diacrylate)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 생체 시료는 세포 시료, 세포 배양 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈청, 혈장, 침, 눈물, 땀, 소변, 대변, 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascites), 양수(amniotic fluid), 정액 또는 유(milk)를 포함할 수 있으나, 세포 분석을 위한 생체 시료로서 당업자에게 널리 알려진 것이라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 시료 중 세포를 바닥에 위치시키는 방법으로는 원심력을 이용하는 것이 바람직하나, 당업자에게 널리 알려진 방법이라면 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계 이후에 상전이 물질의 두께를 조절할 수 있는 유닛을 추가로 설치하는 단계 및 상기 (c) 단계 이후에 상기 두께 조절 유닛을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상단면이 개방된 챔버 유닛(100); 및 상기 챔버 유닛(100)의 내측에 설치되며 상단면 및 바닥면이 개방된 베젤 유닛(200)을 포함하는 무손실 세포 염색 장치를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 무손실 세포 염색 장치는 상기 베젤 유닛(200)의 내측에 설치되는 두께 조절 유닛(300)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 챔버 유닛(100)의 바닥면은 평평한 형태로 형성되거나 복수 개의 마이크로 웰(110)이 형성되어 있을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 베젤 유닛(200)의 측면 하부 말단은 일부 또는 전부에 일정한 형상의 홈을 구비할 수 있다. 이 때, 상기 일정 형상의 홈은 단면이 'ㄱ자'형, 삼각형 또는 쐐기형으로 형성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 두께 조절 유닛(300)은 바닥면 또는 측면에 유체가 빠져 나갈 수 있는 통로(310)가 형성될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 챔버 내에 상전이 물질 및 분석 대상 세포가 포함된 생체 시료를 투입하는 단계, (b) 상기 챔버 바닥면에 시료 중 부유하는 분석 대상 세포를 위치시키는 단계, (c) 상기 상전이 물질을 고체화시켜 바닥면에 세포를 고정화하는 단계, (d) 상기 고정화된 세포를 염색하는 단계 및 (e) 상기 염색된 세포를 분리하는 단계를 포함하는 단일 세포 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 무손실 세포 염색 방법은 임상 진단에서 중요하게 부각되고 있는 희귀 세포(rare cells)의 염색 및 분석 과정에서 세포의 손실을 효과적으로 차단할 수 있어, 미량 시료의 경우에도 관찰, 분석 및 이를 이용한 진단을 용이하게 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 무손실 세포 염색 방법에 의해 세포를 고정시킴으로써 단일 세포의 구별 및 분리가 쉽고, 분리된 세포의 분석에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1 내지 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 염색 장치의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 무손실 세포 염색 방법을 단계별로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 베젤 유닛 사용에 따른 효과를 나타내는 결과이다.
도 6은 두께 조절 유닛을 사용하지 않은 경우 자외선 노출 시간에 따른 하이드로겔의 두께를 나타낸 것이다.
도 7은 두께 조절 유닛을 이용하여 하이드로겔의 두께를 정확하게 조절할 수 있음을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 세포 염색 후 세포 손실률을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분리 과정을 단계별로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분리 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 무손실 세포 염색 방법을 단계별로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 베젤 유닛 사용에 따른 효과를 나타내는 결과이다.
도 6은 두께 조절 유닛을 사용하지 않은 경우 자외선 노출 시간에 따른 하이드로겔의 두께를 나타낸 것이다.
도 7은 두께 조절 유닛을 이용하여 하이드로겔의 두께를 정확하게 조절할 수 있음을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 세포 염색 후 세포 손실률을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분리 과정을 단계별로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일 세포 분리 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다. 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
어느 하나의 실시예에 포함된 구성 요소와, 공통적인 기능을 포함하는 구성 요소는, 다른 실시예에서 동일한 명칭을 사용하여 설명하기로 한다. 반대되는 기재가 없는 이상, 어느 하나의 실시예에 기재한 설명은 다른 실시예에도 적용될 수 있으며, 중복되는 범위에서 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
도 1 내지 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 염색 장치의 구성을 도시한다.
도 1을 참조하여, 일 실시예에 따른 세포 염색 장치는 챔버 유닛(100) 및베젤 유닛(200)을 포함할 수 있다.
이때, 일 실시예에 따른 세포 염색 장치는 시료 내 분석 대상 세포를 각 세포 특이적 염색 시약으로 염색함으로써 세포의 존재 여부를 검출하고, 분석하기 위한 것으로서, 이하에서는 시료가 혈액 샘플이고 분석 대상 세포가 혈중암 세포(CTC)인 경우를 예로 들어 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 챔버 유닛(100) 분석 대상 시료 및 상전이 물질을 투입하기 위한 개방된 상단을 구비할 수 있다.
상기 챔버 유닛(100)의 소재는 상기 상전이 물질을 고체화시키는 단계를 고려하여 선택할 수 있으며, 고체화 단계를 저해하지 않는 한 특정 소재에 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 상전이 물질로서 광경화 물질을 사용하는 경우 특정 파장의 빛이 통과할 수 있는 재질이어야 하며, 상기 상전이 물질로서 열경화 물질을 사용하는 경우 원하는 온도를 달성할 수 있는 재질이어야 하나, 이와 같은 상전이 단계를 저해하지 않는다면 특정 소재에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 세포 염색 후 이미지화 및 분석이 용이하도록 바닥면이 사각형으로 형성되어 있으나, 사용자의 편의에 따라 형상은 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 챔버 유닛(100)은 바닥면에 분석 대상 물질을 고정시킨 후 관찰 및 분석을 하기 위한 플레이트의 역할을 수행한다. 특히, 도 1 내지 3을 참조하여, 챔버 유닛(100)은 평평한 형태로 형성되거나 복수 개의 마이크로 웰(110)이 형성된 바닥면을 구비할 수 있다.
상기 마이크로 웰(110)의 크기는 분석 대상 세포의 크기에 따라 1 내지 50 μm로 구비될 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 40 μm, 보다 바람직하게는 30 μm로 구비될 수 있다.
챔버 유닛(100)의 개방된 상단을 통해 혈중암세포가 포함된 혈액 샘플이 주입되는 경우 각각의 마이크로 웰에 개별 혈중암세포가 들어갈 수 있으며, 이에 따라 개별 세포의 관찰 및 분석이 용이할 수 있다.
상기 챔버 유닛(100)의 내측에는 베젤 유닛(200)이 설치될 수 있다.
본 발명의 상기 베젤 유닛(200)은 상단면 및 바닥면이 개방된 형태로서,챔버 유닛(100)에 투입된 상전이 물질이 바닥면에서 고체화되어 1 mm 두께 이하의 얇은 폴리머 겔을 형성할 때, 겔의 모양을 안정화시키는 역할을 할 수 있다. 구체적으로 베젤 유닛(200)의 측면 하부 말단 일부 또는 전부가 챔버 유닛(100)의 바닥면에 접촉된 상태로 구비되면서, 챔버 유닛(100) 바닥면에서 고체화된 겔의 모서리 부분을 일정하게 고정시킴으로써 겔이 한쪽으로 치우치거나, 모양이 변형되거나, 바닥면으로부터 분리되어 접히는 현상을 효과적으로 방지할 수 있다(도 5 참조).
특히, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 베젤 유닛(200)은 측면의 하부 말단 일부 또는 전부에 일정한 형상의 홈을 구비할 수 있다. 말단에 형성된 홈의 단면은 'ㄱ자'형이거나, 내측면이 빗면인 삼각형이거나, 양측면이 빗면인 쐐기형일 수 있다. 상기 홈은 베젤 유닛(200)의 내측 벽면에 세포 안착을 막는 역할을 수행할 수 있으며, 베젤 유닛(200) 측면 하부 말단 전체에 형성되거나, 부분적으로 형성될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 베젤 유닛(200)의 내측에는 두께 조절 유닛(300)이 추가로 설치될 수 있다.
본 발명의 두께 조절 유닛(300)은 상기 챔버 유닛(100)의 바닥면으로부터 일정 간격 이격된 상태로 구비될 수 있다. 상기 두께 조절 유닛(300)과 챔버 유닛(100) 바닥면 사이의 간격에 따라 고체화 된 상전이 물질의 두께를 실험 목적에 따라 조절할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 두께 조절 유닛(300)이 챔버 유닛(100) 바닥면으로부터 200 μm 간격으로 설치되는 경우, 상전이 물질을 고체화시키는 조건 하에서 두께가 200 μm인 폴리머 겔을 형성시킬 수 있다.
상기 두께 조절 유닛(300)의 바닥면은 완전히 막혀 있거나, 일부가 개방되어 있을 수 있다. 상기 두께 조절 유닛(300)의 아래쪽에 형성되는 상전이 물질의 고체화 두께를 조절하기 위해서는 두께 조절 유닛(300)의 바닥면이 상전이 물질의 상전이 조건에 따라 빛 또는 열을 효과적으로 차단할 수 있는 소재 및/또는 모양으로 구비될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 상전이 물질로 광경화 하이드로겔이 투입된 경우, 상기 두께 조절 유닛(300)의 바닥면의 소재 및/또는 모양에 의해 자외선(UV)을 차단할 수 있으며, 이로 인해 두께 조절 유닛(300) 바닥면의 아랫 부분에서만 상전이가 일어날 수 있다.
상기 두께 조절 유닛(300)은 사용되는 상전이 물질의 종류 및 성질에 따라 설치 여부가 결정될 수 있다. 예를 들어, 상전이 시 두께 조절이 용이한 열경화 방식의 상전이 물질을 사용하는 경우, 챔버 유닛(100) 바닥면으로부터 고체화에 필요한 열을 공급할 때 온도 및/또는 시간을 조절함으로써 고체화 두께를 제어할 수도 있으며, 이 경우 상기 두께 조절 장치(300)를 필수적으로 구비하지 않을 수 있다.
특히, 도 2를 참조하여, 상기 두께 조절 유닛(300)은 바닥면 또는 측면에 유체가 빠져 나갈 수 있는 통로(310)가 구비될 수 있다. 상기 챔버 유닛(100) 내부에 투입된 상전이 물질 및 생체 시료 중 챔버 유닛(100) 바닥면에 고정화시키고자 하는 세포 및 일정량의 상전이 물질을 제외한 나머지 유체가 두께 조절 유닛(300)에 형성된 통로(310)를 통해 빠져 나갈 수 있다.
상기 통로(310)는 두께 조절 유닛(300)의 측면의 일부 또는 전부를 개방시켜 구비될 수 있다.
또한, 상기 통로(310)는 두께 조절 유닛(300)의 바닥면에 메쉬(mesh)를 형성시켜 구비될 수 있다. 구체적으로 바닥면에 상기 통로(310)를 구비할 때 개방된 부분으로 인해 상전이 물질의 두께 조절 기능이 저해되지 않도록 개방된 부분과 폐쇄된 부분의 비율 및 크기를 조절할 수 있다. 바람직하게, 상기 두께 조절 유닛(300)의 바닥면에 형성된 메쉬의 간격은 1 mm 이내로 형성될 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 무손실 세포 염색 방법을 단계별로 도시한다.
이하에서는 생체 시료가 혈액 샘플이고 분석 대상 세포가 혈중암 세포(CTC)이며, 상전이 물질로서 광경화 하이드로겔의 일종인 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA, poly ethylene glycol diacrylate)를 사용한 경우를 예로 들어 설명하기로 한다.
먼저, 본 발명의 방법은 세포 염색을 위한 챔버 내에 상전이 물질 및 분석 대상 세포가 포함된 생체 시료를 투입한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 상전이 물질은 광경화 하이드로겔 또는 열경화 하이드로겔일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 상기 상전이 물질은 폴레에틸렌글리콜 아크릴레이트 유도체(PEG acrylate derivatives), PEG 메타크릴레이트 유도체(PEG methacrylate derivatives), 폴리비닐 알코올 유도체(polyvinyl alcohol (PVA) derivatives), 히알루론산 유도체(hyaluronic acid derivatives), 덱스트란 메타크릴레이트(dextran methacrylate), 폴리 (N-이소프로필아크릴아미드) (pNiPAAm, poly (N-isopropylacrylamide)), 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol), 폴리프로필렌글리콜(PPG, Poly(propylene glycol)), 폴리메타크릴산(PMAA, Poly(methacrylic acid)), 메틸셀룰로오스(MC, Methylcellulose), 키토산(Chitosan) 또는 폴록사머(poloxamer)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상전이 물질로서 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)를 먼저 투입한 후, 생체 시료를 투입한다.
이 때, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)가 고체화된 후 형성되는 얇은 폴리머 겔의 형태를 유지하기 위해 상기 챔버 내에 베젤 유닛(gel stabilizer)을 설치하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 베젤 유닛은 상전이 물질 및/또는 생체 시료를 챔버 내에 투입하기 전 또는 후에 설치될 수 있다.
다음으로, 상기 챔버 바닥면에 시료 중 부유하는 분석 대상 세포를 위치시킨다.
혈액 시료 중 분석하고자 하는 혈중암세포(CTC)는 극미량 존재하며, 이를 시료 중의 다른 물질 및 유체와 분리하고 챔버 바닥면에 위치시키기 위해 원심분리 방법을 이용할 수 있다.
다음으로, 상기 상전이 물질을 고체화시켜 바닥면에 세포를 고정화시킨다.
본 발명의 일 실시예에서 사용된 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)는 자외선(UV) 조사에 의해 졸 또는 액체 상태로부터 겔 또는 고체 상태로 전이가 일어나는 물질이므로, 상기 챔버 아래 부분에서 자외선을 조사함으로써 챔버 바닥면으로부터 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)가 고체화될 수 있으며, 이에 챔버 바닥면에 부착된 혈중암세포는 상전이 물질 내부에 포함된 채로 고정될 수 있다.
이 때, 상기 상전이 물질에 자외선을 조사하기 전에 상기 챔버 또는 베젤 내측에 두께 조절 장치를 설치할 수 있다. 상기 두께 조절 장치는 상전이 물질의 목적하는 두께에 따라 챔버 바닥면으로부터 일정 간격으로 이격하여 설치함으로써, 고체화 된 상전이 물질의 두께를 자유롭게 조절할 수 있다.
상기 두께 조절 장치가 설치된 상태에서 자외선을 조사하여 원하는 두께의 겔을 형성시킨 후, 두께 조절 장치를 제거한다.
다음으로, 세포가 고정화된 겔에 세포 염색 시약 및 세척 시약 등을 처리하여 세포를 염색한다.
종래 면역조직화학(ICC) 방법으로 세포를 염색하고자 할 때 여러 단계를 거쳐 시약을 투입하고 세척하는 과정에서 분석 대상 세포가 같이 씻겨 내려가는 문제점이 있으나, 본 발명에 따라 겔 내에 고정화된 세포를 염색함으로써 세포 손실을 거의 완벽히 방지할 수 있다.
도 10은 본 발명에 따른 단일 세포 분석 방법을 단계 별로 나타낸 것이다.
먼저, 단일 세포 분석을 위해 상기한 본 발명의 무손실 세포 염색 방법에 따라 분석 대상 세포를 상전이 물질 내에 고정시킨 후 면역조직화학 염색을 실시한다. 세포 염색 후 관찰 및 분석을 통해 목적하는 분석 대상 세포를 선별할 수 있다. 이에 따라 선별된 타겟 세포를 하나씩 분리한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 베젤 유닛 및 두께 조절 유닛 유무에 따른 겔 두께 변화
본 발명의 무손실 세포 염색 장치(microwell array chip)에서 베젤 유닛 및 두께 조절 유닛 유무에 따른 효과를 확인하기 위해 아래와 같은 실험을 진행하였다.
먼저, ICC를 통해 관찰하고자 하는 희귀 세포(rare cell)의 손실을 최소화 하기 위해서, PEGDA 겔을 최대한 얇게 제작하였으며, 베젤 유닛의 유무에 따라 고체화된 PEGDA 겔의 형태를 비교하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 베젤 유닛을 장착하지 않고 PEGDA를 고체화(gelation) 시킬 경우, 겔화 되는 과정에서 마이크로웰 어레이(microwell array)와 PEGDA 막이 분리되는 현상이 나타났고, 베젤 유닛을 장착하고 고체화 시킨 경우 PEGDA 필름이 마이크로 어레이와 잘 결합한 상태로 형성되는 것을 확인하였다.
이 때, PEGDA의 UV 노출 시간을 달리 함으로써 겔의 두께를 다르게 제조하였다. UV를 쪼여 준 시간에 따라 겔 두께가 증가함을 확인할 수 있었고, UV에 10초 미만 노출시킬 경우 gelation이 진행되지 않음을 확인하였다 (도 6).
아울러, 두께 조절 장치의 두께 조절 효과를 확인하기 위하여, 베젤 유닛 내부에 두께 조절 장치를 설치할 때 바닥면으로부터의 이격 간격을 100 μm, 200 μm, 300 μm가 되게 한 후 UV를 조사하여 PEGDA를 고체화 시켰다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 두께 조절 장치에 의해 원하는 두께로 PEGDA 필름을 형성시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 두께 조절 장치 유무에 따른 세포 염색 결과
PEGDA 필름의 두께에 따른 염색 품질을 확인하기 위해 두께 조절 장치의 유무에 따른 Bright field(BF)와 panCK, CD45, DAPI 의 염색 정도를 비교하였다. 그 결과, 두께 조절 장치가 없을 경우 BF 조건에서는 크게 변화가 없거나 다소 희미한 이미징을 얻는다는 것을 확인하였고, 형광 이미징에서는 매우 큰 차이를 보였다. 조절되지 않은 하이드로겔의 두께에 의해서 시약의 세포 전달이 어려워 지거나, 워싱 과정이 비효율적이라는 점 때문에 panCK와 CD45의 염색 신호의 경우 같은 이미징 조건에서 배경 신호(background signal)가 매우 강하게 보이는 등, 모든 조건에서 두께 조절 장치가 있을 때 보다 세포 염색 품질이 좋지 않음을 확인하였다(도 8).
실시예 3. 세포 손실률 향상 효과
본 발명의 무손실 세포 염색 장치를 사용해서 ICC를 진행하였을 때의 세포 손실을 확인하기 위해, 비부착세포(non-adhesion cell)에 사용하던 기존의 ICC 프로토콜을 사용하여 ICC를 진행한 경우와, 본 발명의 장치를 사용하여 ICC를 진행한 경우의 세포 회수율(cell retention rate)을 비교하였다. 구체적으로 세포를 5개, 20개, 100개, 500개씩 로딩하였을 때, 기존의 프로토콜은 모두 50% 이하의 회수율을 보인 반면, 본 발명의 방법은 모든 경우에서 90% 이상의 회수율을 나타내어, 본 발명의 방법을 이용하였을 때의 회수율이 뛰어나게 높음을 확인하였다(도 9).
또한, 한 구획에서 ICC 전과 후의 염색을 비교하였을 때, ICC 진행 전에 CD45의 발광을 확인하였고, ICC 후 동일한 위치(spot)에서 panCK의 발광을 확인함으로써 본 발명의 정밀성을 입증하였다. 이후, 본 발명의 플랫폼을 이용하였을 때와 기존 ICC 프로토콜을 이용하였을 때의 최초 세포 수(initial cell number), ICC 이전 세포 수, ICC 이후 세포수를 계수하여 세포 손실을 비교하였다. 본 발명의 플랫폼을 사용하였을 때, 모든 경우의 최초 세포 수에서 95% 이상의 회수율을 보였으며, 특히 20 cell을 제외하면 99.9% 이상의 회수율을 보이는 등 본 발명의 세포 회수율이 뛰어남을 입증하였다.
실시예 4. 단일 세포 분리 효과
본 발명의 무손실 세포 염색 장치를 사용해서 ICC를 진행한 이후, 단일 세포를 분리하기 위해 세포 수집(cell picking)을 시도해 보았다. 세포 수집을 성공적으로 수행하는데 있어서는 하이드로겔의 경도가 적당한 것이 중요한데 하이드로겔이 너무 딱딱하게 되면 세포 수집을 하기 위한 피펫이 겔을 관통하기가 어려워 지고, 때에 따라서는 단단한 정도에 따라 수집 위치가 왜곡되기 때문이다. 본 발명에서 사용된 PEGDA 에서는 10% ~ 50% 농도가 바람직했으며, 물성치로는 500 Pa ~ 10 MPa 사이가 바람직하다.
본 발명의 실시예에서는 PEGDA 20%를 사용하였으며, 피펫이 하이드로겔을 관통하여 성공적으로 세포를 분리할 수 있었다. 일반적으로 피펫을 이용하여 단일 세포를 분리하게 되면, 피펫이 세포를 분리하기 위해 필수적으로 움직이는 과정에서 유체 흐름이 생기게 되고 따라서 세포의 위치를 변경시킬 수가 있다는 문제점이 있다. 그러나 본 발명의 방법에서는 하이드로겔이 세포를 고정화하고 있기 때문에 피펫의 움직임으로 인해 세포의 위치 변경이 거의 없기 때문에 좀 더 정밀한 단일 세포 분리의 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
Claims (14)
- (a) 챔버 내에 상전이 물질 및 분석 대상 세포가 포함된 생체 시료를 투입하는 단계;
(b) 원심력을 이용하여 상기 챔버 바닥면에 시료 중 부유하는 분석 대상 세포를 위치시키는 단계;
(c) 상기 상전이 물질을 고체화시켜 바닥면에 세포를 고정화하는 단계; 및
(d) 상기 고정화된 세포를 염색하는 단계를 포함하며,
상기 고체화된 상전이 물질의 두께는 두께 조절 유닛(300)에 의해 조절되는 것인,
무손실 세포 염색 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 상전이 물질 및 생체 시료는 동시에, 혼합하여 또는 각각 투입하는 것인 무손실 세포 염색 방법. - 제1항에 있어서,
상기 상전이 물질은 광경화 하이드로겔 또는 열경화 하이드로겔인 무손실 세포 염색 방법. - 제1항에 있어서,
상기 상전이 물질은 폴레에틸렌글리콜 아크릴레이트 유도체(PEG acrylate derivatives), PEG 메타크릴레이트 유도체(PEG methacrylate derivatives), 폴리비닐 알코올 유도체(polyvinyl alcohol (PVA) derivatives), 히알루론산 유도체(hyaluronic acid derivatives), 덱스트란 메타크릴레이트(dextran methacrylate), 폴리 (N-이소프로필아크릴아미드) (pNiPAAm, poly (N-isopropylacrylamide)), 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol), 폴리프로필렌글리콜(PPG, Poly(propylene glycol)), 폴리메타크릴산(PMAA, Poly(methacrylic acid)), 메틸셀룰로오스(MC, Methylcellulose), 키토산(Chitosan) 및 폴록사머(poloxamer)로 이루어진 군에서 선택되는 물질 중 하나 이상을 포함하는 것인 무손실 세포 염색 방법. - 제1항에 있어서,
상기 상전이 물질은 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEGDA, poly ethylene glycol diacrylate)인 무손실 세포 염색 방법. - 제1항에 있어서,
상기 생체 시료는 세포 시료, 세포 배양 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈청, 혈장, 침, 눈물, 땀, 소변, 대변, 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascites), 양수(amniotic fluid), 정액 및 유(milk)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 무손실 세포 염색 방법. - 삭제
- 상단면이 개방된 챔버 유닛(100);
상기 챔버 유닛(100)의 내측에 설치되며 상단면 및 바닥면이 개방된 베젤 유닛(200); 및
상기 베젤 유닛(200)의 내측에 설치되는 두께 조절 유닛(300)을 포함하는 무손실 세포 염색 장치. - 삭제
- 제8항에 있어서,
상기 챔버 유닛(100)의 바닥면은 평평한 형태로 형성되거나 복수 개의 마이크로 웰(110)이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 무손실 세포 염색 장치. - 제8항에 있어서,
상기 베젤 유닛(200)의 측면 하부 말단은 일부 또는 전부에 일정한 형상의 홈을 구비하는 것을 특징으로 하는 무손실 세포 염색 장치. - 제11항에 있어서,
상기 일정 형상의 홈은 단면이 'ㄱ자'형, 삼각형 또는 쐐기형인 것을 특징으로 하는 무손실 세포 염색 장치. - 제8항에 있어서,
상기 두께 조절 유닛(300)은 바닥면 또는 측면에 유체가 빠져 나갈 수 있는 통로(310)가 형성된 것을 특징으로 하는 무손실 세포 염색 장치. - (a) 챔버 내에 상전이 물질 및 분석 대상 세포가 포함된 생체 시료를 투입하는 단계;
(b) 원심력을 이용하여 상기 챔버 바닥면에 시료 중 부유하는 분석 대상 세포를 위치시키는 단계;
(c) 상기 상전이 물질을 고체화시켜 바닥면에 세포를 고정화하는 단계;
(d) 상기 고정화된 세포를 염색하는 단계; 및
(e) 상기 염색된 세포를 분리하는 단계를 포함하며,
상기 고체화된 상전이 물질의 두께는 두께 조절 유닛(300)에 의해 조절되는 것인,
단일 세포 분석 방법.
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