KR102368890B1 - 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포의 기능성 네트워크를 형성하기 위한 방법 - Google Patents

인간 뉴런 세포 및 신경교 세포의 기능성 네트워크를 형성하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포의 기능성 네트워크를 형성하기 위한 방법에 관한 것으로, 이때 세포는 성분인 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 헤파린을 함유하는 합성 하이드로겔 시스템 내로 도입되고, 그 내부에서 배양된다. 3차원 하이드로겔의 형성 도중에 세포가 하이드로겔 시스템에 이미 위치하도록 세포가 이전에 세포가 혼합되어 있던 겔 성분들 중 하나인 PEG 또는 헤파린과 함께 PEG-헤파린 하이드로겔 시스템에 도입된다.

Description

인간 뉴런 세포 및 신경교 세포의 기능성 네트워크를 형성하기 위한 방법
본 발명은 이하에서 뉴런 네트워크로도 지칭되는 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포의 기능성 네트워크를 형성하기 위한 방법에 관한 것이다. 방법은 뉴런 네트워크의 형성을 모니터링하기 위해 사용될 수 있으며, 이와 관련하여 특히 인간의 뇌에서 뉴런 및/또는 뉴런 네트워크의 형성에 영향을 미치는 질병의 모델링을 위해 사용될 수 있다.
김(D.Y. Kim) 등(문헌[D.Y. Kim et. al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease, Nature 2014, 515, 274~278])에 의한 최근 연구에 따르면 0.3 ㎜ 이하의 전체 축면을 갖는 3차원 박층 배양물을 제공하기 위해 BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)사의 매트리겔®(Matrigel®)에 포매(embedding)되어 있는 유전적으로 변형된 인간 세포가 개시되어 있다. 분화된 뉴런은 4주 내지 12주 동안 생존 가능하고 기능을 하였다. 다와이 쟝(Dawai Zhang) 등(문헌[A 3D Alzheimer's disease culture model and the induction of P21-activated kinase mediated sensing in iPSC derived neurons, Biomatrials 2014 Feb; 35 (5), 1420~1428])에 의한 유사한 연구에 따르면 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래하는 신경 상피 줄기 세포주(It-NES)인 AF22 세포주의 사용 및 신경 세포주로의 이들의 분화가 보고된 바가 있다. 또한, BD 바이오사이언시스사의 푸라매트릭스®(PuraMatrix®)로부터 제조되고 10 ㎍/㎖의 라미닌에 의해 변형되는 하이드로겔이 사용되었다. 이러한 배양 시스템은 자가 조립형 아르기닌-알라닌-아스파르트산-알라닌(단일 문자 코드: RADA) 펩티드에 의한 비공유결합성 상호작용에 의해 가교 결합되는 하이드로겔 시스템에 기반을 두고 있다. 하이드로겔의 기계적 특성은 비교적 약한 비공유결합성 상호작용으로 인해 제한적인 범위까지만 조절 가능하고, 또한 특정 효소에 대해 민감한 절단 부위(cleavage site)가 존재하지 않는다. BD 푸라매트릭스®에서 세포의 분리 불가능성(nonseparability)으로 인해, 이러한 배양 시스템은 세포 반응성 미세환경을 제공하지 못한다. 포매된 세포의 성장에 필요한 하이드로겔 복원은 펩티드의 비특이적 분해에 의해, 그 결과 하이드로겔 기질 전체의 분해에 의해서만 달성될 수 있다. 따라서, 쟝 등에 의한 연구에 따르면, 세포의 3D 배양은 매우 짧은 기간, 예를 들어 2 내지 4일에 걸쳐서만 수행될 수 있다. 쟝에 의한 문헌에서, "장기간 배양은 재료의 낮은 강성(stiffness)으로 인해 기술적으로 어렵다"는 것이 명백히 지적되어 있다. 게다가, 동물 공급원으로부터 수득된 라미닌의 혼합 결과로서, 불순물 또는 제품 품질에서의 배치 의존성 변화에 대한 위험성이 있는 부실하게 정의된 단백질은 제제의 재현성에 대한 심각한 의심을 불러일으킬 수 있는 검정(방법)의 요소이다. 또한, 포매된 세포의 국부 디믹싱 효과(local demixing effect) 및 불균질성이 재료의 긴 겔화 시간(겔 형성 시간)(20 내지 30분)의 결과로서 발생할 수 있다.
S. 카우트소파울로스(S. Koutsopoulos) 등(문헌[Long-term three-dimensional neural tissue cultures in functionalized self-assembling peptide hydrogels, Matrigel and Collagen I, Acta Biomater. 2013, Feb; 9 (2); 5162~5169])은 푸라매트릭스®와 유사한 비세포 반응성의 자가 조직화 펩티드의 제조에 관해 개시하며, 이때 뉴런 마우스 세포가 배양된다. 상(J.Y. Sang)(문헌[Simple and Novel Three Dimensional Neuronal Cell Culture Using a Micro Mesh Scaffold, Exp Neurobiol. 2011 Jun; 20 (2); 110~115])에 의한 연구에 따르면 스캐폴드(scaffold)로서 합성된 나일론 섬유를 사용하는 3차원 뉴런 배양을 개시한다. 뉴런 세포를 아가로오스와 혼합한 후, 나일론 직물 상에 도포한다. 이 같은 기술은 발달 중인 뇌의 생체 내(in vivo) 환경을 재현하기에 적합하지 않는 세포 반응성 환경에서 세포가 캡슐화되는 인공적인 환경을 제공한다.
US 6 306 922 A 및 US 6 602 975 A에는 생분해성인 광중합된 하이드로겔이 개시되어 있다. 그러나 UV 스펙트럼에 근접한 파장에서의 중합은 유리 라디칼의 형성으로 인해 세포 배양 시스템에서 세포 사멸 및 DNA 돌연변이를 야기할 수 있다. UV 파장에 의해 야기되는 세포 손상은 중합이 정상적인 실험실 조건 하에서 UV광의 부재 하에 수행되므로 본 발명에 따른 시스템에서는 예상되지 않는다. 또한, UV 유발 광중합이 생략되기 때문에 고도로 전문화된 실험실 밖에서 본원에 개시된 하이드로겔 시스템을 사용하는 것이 중합을 야기하는 특수 장비가 필요하지 않으므로 실질적으로 보다 용이하다.
본 발명의 목적은 인간 기원의 세포를 이용하는 모듈식의 시험관 내(in vitro) 시스템 또는 방법을 개발하는 것이며, 여기서 이러한 시스템 또는 방법은 상술한 선행 문헌에 비해 실질적으로 개선되고, 이러한 시스템 또는 방법은 3차원 기질 내에 기능성 뉴런 네트워크를 형성한다. 이 같은 시스템에 대해 가장 중요한 평가 기준은 뉴런 네트워크의 품질이며, 이는 가능한 한 멀리 떨어져서 중추 신경계의 뉴런 조직 내의 생체 내 상황을 재현하기 위한 것이다. 더욱이, 이 시스템은 다루기 쉽고, 고도로 전문화된 실험실 없이 사용하기 위해, 예를 들어 이식 과정에도 보다 확실한 가능성을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적은 제1항에 청구된 바와 같은 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포의 기능성 네트워크를 형성하기 위한 방법의 형태로 달성된다. 추가의 전개는 종속항에 명시되어 있다. 추가의 청구범위는 방법의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포의 기능성 네트워크를 형성하기 위한 방법에서, 세포는 성분인 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 헤파린을 함유하는 합성 하이드로겔 시스템 내로 도입되고, 그 내부에서 배양된다. 이와 관련하여, 세포는 이전에 세포가 혼합되어 있던 겔 성분들 중 하나인 PEG 또는 헤파린과 함께 PEG-헤파린 하이드로겔 시스템에 도입되고, 이는 3차원 하이드로겔의 형성 중에 세포가 하이드로겔 시스템 내에 이미 존재한다는 결과를 초래한다.
유리하게는, 방법에서, 인간 뉴런 세포는 신경교 세포와 동시 배양되며, 이때 인간 뉴런 세포는 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포이거나, 인간 불멸성 뉴런 전구 세포주에서 유래하거나, 중뇌로부터 수득되는 일차 인간 뉴런 전구 세포이다.
유리한 실시형태에 따르면, 인간 뉴런 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래하는 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포이거나, 일차 인간 피질 세포로부터 유래한다.
형성된 네트워크의 기능성은 특히 성숙한 뉴런 피질 마커의 발현, 예를 들어 칼슘 유입 형태에서의 신경 전달 물질에 대한 반응성의 측면, 및 전기 생리학적 활성의 측면에서 설명 가능하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, PEG-헤파린 하이드로겔 시스템은 다중-암 폴리에틸렌글리콜(star-PEG) 함유 star-PEG-헤파린 하이드로겔 시스템으로서, 효소적으로 절단 가능한 펩티드 서열, 바람직하게는 기질 금속 단백질 분해효소(matrix metalloproteinase)에 의해 절단 가능한 펩티드 서열(MMP 펩티드)을 통해 가교 결합되며, 그 결과로 star-PEG-헤파린 하이드로겔 시스템이 절단 가능하고, 국부적으로 복원 가능하게 된다. 4-암 폴리에틸렌글리콜(4-암 star-PEG)은 다중-암 폴리에틸렌글리콜로서 특히 바람직하다.
하나의 실시형태에서, 하이드로겔의 하이드로겔 기질은 말레이미드, 바람직하게는 4개 내지 6개의 말레이미드기에 의해 기능화된 헤파린과 티올 말단형 star-PEG-펩티드 접합체의 공유결합성 가교 결합에 의해 형성된다. 이와 관련하여, 하이드로겔 기질은 마이클 첨가(Michael addition)를 통해 가교 결합된다.
대안적으로, star-PEG-헤파린 하이드로겔 시스템의 하이드로겔 기질은 자가 조직화(self-organization)에 의해 헤파린 및 공유결합성 star-PEG-펩티드 접합체로부터 비공유결합적으로 형성된다. 이와 관련하여, star-PEG-펩티드 접합체는 중합체 사슬에 결합되는 2개 이상의 펩티드의 접합체를 포함한다. 펩티드 서열은 반복 디펩티드 모티프 (BA)n을 함유하며, 여기서 B는 양으로 하전된 곁사슬을 갖는 아미노산이고, A는 알라닌이고, n은 5 내지 20, 바람직하게는 5 또는 7의 수이다.
본 발명의 특히 유리한 실시형태에 따르면, 하이드로겔은 저장 탄성률을 특징으로 하는 가변적인 기계적 특성을 갖는다. 바람직하게는, 저장 탄성률은 300 내지 600 파스칼의 범위 내에서 가변적이다. 저장 탄성률의 범위는, 예를 들어 2개의 물질 성분의 혼합비를 조절함으로써, 즉 가교 결합도를 변경하거나(헤파린에 대한 PEG의 몰비를 변경하는 것과는 동일한 의미임) 물질 성분의 고형분 함량, 즉 중합체성 출발 물질의 농도를 변경함으로써 변경될 수 있으며, 바람직하게는 진동 유동측정법(oscillatory rheometry)에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, PEG-헤파린 하이드로겔 시스템은 신호전달 분자에 의해 변형되고/되거나, 세포 외 기질(ECM)의 단백질에서 유래하는 기능성 펩티드 단위, 바람직하게는 부착 펩티드에 의해 변형된다.
본 발명의 추가의 실시형태에 따르면, 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포는 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포와 공존하는 인간 중간엽 간질 세포 및 내피 세포와 함께 동시 배양된다.
방법에서, 유전적으로 변형되지 않은 인간 뉴런 줄기 세포를 이용하는 것이 유리하게도 가능하다. 세포는 하이드로겔, 바람직하게는 star-PEG-헤파린 하이드로겔에서 자연적으로 성숙하여 CTIP2+, SATB2+ 및 TAU+와 같은 뉴런 마커 단백질에 대해 양성인 완전 분화된 뉴런 아형(neuronal subtype)을 형성한다. 또한, 배양물은 PEG-헤파린 하이드로겔을 사용한 경우에 10주 이상 동안 생존할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 신속한 하이드로겔 형성, 즉 30초 내지 최대 2분의 하이드로겔 형성은 불리한 국부 디믹싱 효과 및 불균질성을 방지한다. 신속하고 강력한 하이드로겔 형성은 본 발명에 따른 방법의 주요 이점이다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 방법에서 수득 가능한 인간 뉴런의 3차원 기능성 네트워크에 관한 것이다. 방법을 사용한 결과로서, 개개의 뉴런은 3차원 네트워크로 연결될 수 있으며, 생리학적으로 적절한 세포 기능을 나타냈다. 예를 들어, 0.18 ㎣의 부피에서는 200개 초과의 서브 네트워크가 발달하였으며, 이어서 이들은 서로 연결되었다. 이와 관련하여, 각각의 서브 네트워크는 총 12,000개 초과의 분지 기수를 가졌다. 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 시스템에서, 예시적인 실시형태에서 보다 상세하게 후술되는 바와 같이, 다양한 유형의 분화된 뉴런 및 공존하는 신경교 세포를 이용하여 강력한 네트워크 형성 및 뉴런 분지를 검출하는 것이 가능하였다.
하이드로겔 시스템을 이용하는 본 발명에 따른 방법은 하기를 가능케 한다:
· 인간 3차원 네트워크 구조 및 인간 뉴런 네트워크의 기능성의 재현, 특히 형태, 세포 유형 및 분화와 관련한 재현,
· 세포 배양물의 안정성 보장, 이는 세포 배양물이 보다 긴 배양 시간 동안 생존하고 특히 장기간 분석 도중에 안정하게 잔류한다는 결과를 야기함,
· 하이드로겔 기질, 생체 분자 조성 및 물리적 특성(예를 들어, 저장 탄성률)의 정밀한 조절 또는 맞춤(tailoring), 이는 다양한 외생성 세포-지시적 신호 및 신호 전달 물질, 예를 들어 가용성 인자, 세포 외 기질의 성분 및 기계적 특성이 뉴런 발달 및 질병의 모델링에 대해 시험될 수 있는 결과를 야기함,
· 생체 내 조건 하에서와 유사한 활성 성분에 대한 형성된 뉴런 네트워크의 반응, 및 그 결과로서의 비용 집약적인 동물 실험 모델을 대체하고, 또한 보다 신뢰 가능한 검정 방법에 치료용 활성 성분을 제공할 가능성의 제공,
· 뉴런 세포의 전기 생리학적 활성 및 막-채널 활성의 확인,
· 3차원 뉴런 네트워크에서 신호전달 라인(signaling line) 및 신경 회로를 조사할 수 있도록 하기 위해, 예를 들어 고해상도 이미지 및 기록 기법을 이용한 개별 세포의 분석,
· 특히 뉴런 네트워크의 발달 과정에 대한 실시간 분석,
· 장기 모방체(organ mimetic)를 개발하기 위해, 예를 들어 프린팅 및 구역 이질성(zonal heterogeneity)과 같은 배열 기법,
· 환자에서 기원하는 세포를 이용한 개인 맞춤 의료(personalized medicine)의 이용 가능성,
· 생체 내 유사 조건 하에 뉴런 네트워크 형성과 혈관 형성의 상호작용을 조사하기 위해 내피 세포와 동시 배양하기,
· 단세포 검정, 시험관 내 세포 증식, 및 이식 목적에 필요한 개별 세포의 제거,
· 비독성 및 생분해성 물질의 이식;
· 10주 초과의 장기간의 배양;
· 뉴런 네트워크의 변화 및 돌기의 정량화 및 세포수의 정량화.
본 발명의 추가의 양태는 뉴런 네트워크의 형성을 모니터링하기 위한 본 발명에 따른 방법의 용도에 관한 것이다. 따라서 뉴런 네트워크 형성의 실시간 모니터링은 특히 3차원 하이드로겔 시스템에서 세포 배양물의 투명성으로 인해 가능하다.
본 발명에 따른 방법을 이용하는 네트워크 형성의 모니터링에 의해 뉴런 네트워크 내의 뉴런 세포의 세포 성장, 길이, 분지 개수 및 밀도 및/또는 연결성 및/또는 전기 생리학적 활성에 대한 정량적 분석이 가능하다.
이는 인간의 뇌에서 뉴런 및 뉴런 네트워크의 형성에 영향을 미치는 질병, 신경계의 발달 장애, 또는 신경 퇴행성 질환의 모델링이 또한 가능하다는 것을 의미한다.
이와 관련하여, 방법의 특히 유리한 용도는 신경 독성의 모델링, 및/또는 질병 관련 단백질 집성체, 예를 들어 아밀로이드 β 42에 의해 야기되는 뉴런 줄기 세포 형성성(neuronal stem-cell plasticity)의 변화에 있다.
또한 본 발명에 따른 방법을 이용하는 네트워크 형성의 모니터링은 뉴런 활성 및/또는 네트워크 형성에 영향을 미치는 분자 및/또는 활성 성분 또는 약제를 시험하기에 적합하다.
본 발명의 실시형태에 대한 추가의 세부사항, 특징 및 이점은 첨부된 도면을 참고하여 예시적인 실시형태의 하기 설명에 의해 개시된다. 도면에서,
도 1은 하이드로겔의 제조를 위한 하나의 예시적인 실시형태에 대한 도표를 나타내고;
도 2는 3주의 기간 동안의 뉴런 네트워크의 성숙에 대한 현미경 사진을 나타내고;
도 3은 고밀도의 뉴런 및 신경교 네트워크를 함유하는 3주령의 겔에 대한 광범위한 3차원 도면을 나타내고;
도 4는 시냅토파이신(Syn) 및 아세틸화 튜뷸린(aTub)에 대한 캡슐화된 뉴런의 면역 반응성을 보여주고;
도 5는 신경 전달 물질인 글루탐산염의 첨가 이전 및 이후에 총 형광 강도에 대한 측정치를 보여주고;
도 6은 다양한 마커/염료를 사용하여 3주령의 세포를 함유하는 하이드로겔의 3중 염색을 보여주고;
도 7은 세포 배양을 시작한 지 1주일 후 합성 뉴클레오시드 브로모데옥시우리딘(BrdU)과 함께 포매된 세포의 배양 결과를 보여주고;
도 8은 새로 형성된 뉴런으로부터 다양한 뉴런 아형의 형성을 보여주고;
도 9는 3주 이후의 하이드로겔에 포매되고 증식으로 인해 새로 형성되는 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포를 보여주고;
도 10은 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)의 성숙한 분화 상태에 대한 부가적인 증거로서 신경 미세섬유의 발현을 나타내고;
도 11은 일차 인간 피질 세포(PHCC)에서의 아밀로이드 β 42 펩티드의 영향을 조사하기 위한 PEG-헤파린 하이드로겔의 제조에 대한 도면을 나타내고;
도 12는 뉴런 세포질 마커 단백질로서의 아세틸화 튜뷸린에 대한 항체, 펩티드 응집용 마커로서의 Aβ42, 및 신경교 세포용 세포질 마커로서의 GFAP에 의한 하이드로겔의 3중 면역 염색을 보여주고;
도 13은 Aβ42의 부재(A) 및 세포 내 Aβ42의 존재(A') 및 세포 외 Aβ42의 존재(A") 하에 하이드로겔에서 골격화된 연결형 뉴런 경로의 최대 강도 투영을 보여주고;
도 14는 항체를 이용한 아세틸화 튜뷸린(Acet. 튜뷸린, 이미지 A/B) 및 GFAP(이미지 A"/B")에 대한 이중 면역 염색 및 하이드로겔 중의 (A) 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 및 (B) 일차 인간 피질 세포(PHCC)에서 유래하는 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)의 핵 염색(DAPI, 이미지 A'/B')을 보여주고;
도 15는 현미경 사진에 의해, 그리고 정략적 평가로서, iPSC(A) 또는 PHCC(B)에서 유래하는 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)의 뉴런 돌기의 최대 강도 투영을 비교한 것을 보여주고;
도 16은 인터류킨 4가 Aβ42 독성에 미치는 영향을 조사하기 위한 star-PEG-HEP 겔 및 그 내부에 포매된 PHCC에 대한 비교용 현미경 사진을 보여주고;
도 17은 신경교 세포 개체군(GFAP), 뉴런 네트워크 형성 (Acet. 튜뷸린) 및 줄기 세포 개체군(SOX2) 및 신경 형성 능력을 비교하기 위해 포매된 PHCC를 함유하는 매트리겔 및 star-PEG-헤파린 하이드로겔에 대한 현미경 사진을 보여준다.
도 1은 하이드로겔의 제조를 위한 하나의 예시적인 실시형태에 대한 개략적인 도표를 나타낸다. 상기 도표에 따르면, 일차 인간 피질 세포(PHCC)가 사용된다. 이들은 먼저 인산 완충 식염수(PBS)에서 헤파린과 함께 접촉한다. 헤파린을 제외한 하이드로겔의 추가의 성분으로서, 상기 도표에서 사용된 것은 4-암 폴리에틸렌글리콜(star-PEG)과 효소적으로 절단 가능한 펩티드의 접합체이며, 여기서 PEG는 각각의 암(arm)에서 펩티드 분자와 접합한다. 상기 성분은 인산 완충 식염수(PBS)에서 헤파린 및 세포와 함께 접촉한다. 하이드로겔의 하이드로겔 기질은 티올 말단형(시스테인 곁사슬: 약어로 cys) star-PEG-펩티드 접합체 및 말레이미드-기능화 헤파린의 공유결합성 가교 결합에 의해 형성되며, 여기서 하이드로겔 기질은 마이클 첨가를 통해 가교 결합된다.
몇몇 하기 도면은 각각 현미경 이미지를 보여주며, 상기 이미지 상에서 각각의 경우에 우측 하단부에 있는 부호를 확인하는 것이 가능하다. 상기 부호는 상부 또는 측면으로부터 실린더형 하이드로겔을 보고 있는 시각이다.
상부로부터 보고 있는 시각은 이것에 의해 표지된 이미지가 z축 상의 일련의 이미지 중 최대 강도 투영을 갖는 이미지라는 것을 의미한다.
측면으로부터 보고 있는 시각은 이것에 의해 표지된 이미지가 x축 상의 일련의 이미지 중 최대 강도 투영을 갖는 이미지라는 것을 의미한다.
도 2는 3주의 기간 동안의 뉴런 네트워크의 성숙을 보여준다. 세포질성 신경교 세포 마커 GFAP("신경교 섬유질 산성 단백질"라는 명칭으로부터 유래함)의 염색에 의해 신경교 세포의 세포질이 표지되며, 이때 세포질은 뉴런에 비해 증가를 나타낸다. 뉴런의 세포질은 아세틸화 튜뷸린(aTub)에 의해 염색된다. 이미지 A 내지 A"는 각각 포매 1주 이후 포매된 세포 상태의 z축을 가로지르는 최대 강도 투영에 대한 전형적인 이미지를 나타낸다. 이미지 B 내지 B"는 각각 포매 2주 이후 포매된 세포 상태의 z축을 가로지르는 최대 강도 투영에 대한 전형적인 이미지를 나타낸다. 이미지 C 내지 C"는 각각 포매 3주 이후 포매된 세포 상태의 z축을 가로지르는 최대 강도 투영에 대한 전형적인 이미지를 나타낸다. 제1행에서 관측될 수 있는 것은 GFAP 및 aTub 양성 세포의 복합 염색이다. 제2행 및 제3행에서 관측될 수 있는 것은 세포가 각각의 경우에 마커인 aTub 및 GFAP에 양성 반응한다는 것이다.
도 3은 고밀도의 뉴런 및 신경교 네트워크를 함유하는 3주령의 겔에 대한 광범위한 3차원 도면을 나타낸다. GFAP에 의해 염색되는 신경교 세포는 아세틸화 튜뷸린(aTub)에 의해 염색되는 뉴런과 밀접한 상호 작용을 하며, 이러한 현상은 생체 내 상황에서 발생한다. DAPI로 약칭되는 세포핵 염료인 4',6-디아미디노-2-페닐인돌은 이중 가닥 핵 DNA를 표지한다. DAPI-표지된 세포는 평가용 샘플을 고정할 때 살아 있었다. 도 3의 이미지 A는 aTub 및 DAPI에 대해 이중 양성인 뉴런의 포괄적 네트워크를 나타낸다. 이미지 B는 GFAP 및 DAPI에 대해 이중 양성인 신경교 세포의 포괄적 네트워크를 나타낸다.
도 4는 기능성 뉴런에서 생체 내에서도 발생하는 바와 같이, 포매된 뉴런의 세포 접합 및 시냅스 부톤(synaptic bouton)에서 명백히 집중된 면역 반응성을 나타낸다. 이와 관련하여, 이미지 A-A' 및 B-B'는 아세틸화 튜뷸린(aTub) 및 시냅토파이신(Syn)에 의해 이중으로 염색되는 세포를 나타낸다. DAPI는 세포핵을 염색한다. 이미지 A에 도시된 바와 같이, aTub는 뉴런 1 및 2의 돌기를 염색하며, 여기서 뉴런은 화살표로 강조되어 있는 반면, 원은 뉴런 1 및 2의 접합을 나타낸다. 이미지 A'에서, 시냅토파이신(Syn) 염색은 이미지 A에서 표지되어 있는 뉴런 1 및 2의 연결부에서 복수의 시냅스 지점(synaptic point)으로서 나타난다. 이미지 B는 시냅스 부톤에 인접해 있는 고배율의 뉴런 돌기를 나타낸다. 이미지 B'는 이미지 B의 시냅스 부톤이 어떻게 시냅토파이신(Syn)과 양성 반응하는지를 보여준다.
도 5는 신경 전달 물질인 글루탐산염을 첨가한 경우에 총 형광 강도를 측정한 결과를 보여준다. 이와 관련하여, 이미지 A1은 이미지 A(A2)의 세포 1, 2 및 3 에 의해 방출될 때 신경 전달 물질인 글루탐산염의 첨가 이전(-글루탐산염) 및 이후(+글루탐산염)에 총 형광 강도를 측정한 결과를 보여준다. 이미지 A2의 세포 1, 2 및 3은 칼슘 센서인 Gcampf6에 의해 형질 감염되었으며, 상기 칼슘 센서는 세포가 첨가된 글루탐산염에 대한 반응으로서 세포 내 칼슘 유입을 나타내는 경우에 강력한 형광 신호를 생성한다. 이로 인해, 형광 신호의 증가가 A1의 그래프 상에 관찰될 수 있으며, 이는, 생체 내 상황에서도 발생하는 바와 같이, 형질 감염된 세포가 신경 전달 물질의 부재 하에 반응한다는 것을 의미한다. 이미지 A2에서의 세포는 신경 전달 물질인 글루탐산염을 첨가하기 전에 EG-헤파린 하이드로겔 시스템에 포매된다. 이미지 A3 및 A4는 PEG-헤파린 하이드로겔 시스템에 포매되는 Gcampf6-형질 감염 세포를 고배율로 나타낸다. 이미지 A3은 글루탐산염의 첨가 이전의 세포를 나타낸다. 이미지 A4는 글루탐산염의 첨가 이후에 칼슘 이온의 유입으로 인해 강력한 신호가 측정된다는 것을 보여준다.
도 6은 3주령의 세포를 함유하는 하이드로겔에 대한 3중 염색을 나타내며, 이때 상기 하이드로겔은 뉴런 세포질 마커인 β-III-튜뷸린(TUBB3), 세포질성 신경교 세포 마커인 GFAP 및 DNA 염료인 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)에 대해 면역 반응성을 갖는다. 다발을 형성한 세포, 즉 이미지의 좌측 상부에 있는 뚜렷이 배향된 세포 돌기 및 좌측 중앙에 있는 신경교 세포와 혼합된 격자형의 뉴런 네트워크의 다양한 형태적 특성을 확인하는 것이 가능하다. 이미지 A' 내지 A"'는 TUBB3, GFAP 및 DAPI에 대한 광학 채널의 개별 이미지를 나타낸다.
PEG-헤파린 겔에 포매된 세포 배양을 시작한 지 1주 후, 상기 세포는 3시간 동안 합성 뉴클레오시드 브로모데옥시우리딘(BrdU)과 함께 배양하였다. 그 결과는 도 7에서 확인할 수 있으며, 여기서 화살표 각각은 염색된 세포를 나타낸다. 이미지 A는 항-BrdU 항체로 염색되는 세포(세포핵의 염색)을 나타낸다. 이미지 A'는 항-BrdU 항체에 의해 염색되는 세포가 또한 세포질성 뉴런 마커 단백질인 아세틸화 튜뷸린(aTub)에 대해 양성임을 보여준다. 도 7은 BrdU 염색을 통해 하이드로겔에 포매된 세포가 증식하고 뉴런 동일성(neuronal identity)을 갖는다(Acet. Tub.로 염색된 세포)는 것을 보여준다.
도 8은 하이드로겔에 포매되고 그 내부에서 새로 형성되는 뉴런으로부터 다양한 뉴런 아형이 형성된다는 것을 보여주며, 이때 이들 아형은 뉴런 세포 분화 과정에 생체 내에서도 형성되는 이들 세포 유형과 닮아 있다. 이와 관련하여, 이미지 A는 하이드로겔 시스템 중의 세포가 뉴런 전구 세포 마커인 MASH1("아캐트-스큐트과(Achaete-scute family) bHLH 전사 인자 1"(ASCL1)이란 명칭 하에 또한 공지됨) 및 더블코르틴(doublecortin)/DCX에 대 이중 양성임을 보여준다. 이미지 A' 및 A"는 DCX 및 MASH1 염색을 위한 개개의 광학 채널을 나타낸다.
도 9는 하이드로겔에 포매되고 증식으로 인해 새로 형성되는 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포가 성숙한 피질 뉴런용 마커 단백질, 예를 들어 CTIP2 및 SATB2를 발현하는 세포를 형성하기 위해 3주 이내에 성숙한다는 것을 보여준다.
이와 관련하여, 이미지 A는 하이드로겔 시스템 내의 세포가 핵 피질 마커인 CTIP2("B 세포 CLL/림프종 11B"(BCL11b)이란 명칭 하에 또한 공지됨) 및 뉴런 세포질 마커인 TUBB3에 대해 이중 양성임을 보여준다.
이와 관련하여, 이미지 A'의 화살표는 TUBB3 양성 뉴런의 CTIP2 양성 세포핵을 나타낸다. 이미지 B는 세포가 핵 피질 마커인 SATB2 및 뉴런 세포질 마커인 TUBB3에 대해 이중 양성임을 보여주며, 여기서 SATB2의 명칭은 "특수 AT 풍부 서열-결합 단백질 2"란 명칭의 약어이다. 이미지 B'에서, 화살표는 TUBB3 양성 뉴런의 SATB2 양성 세포핵을 나타낸다.
도 10은 세포가 세포핵 염료인 DAPI 및 성숙한 뉴런에서 발현되는 세포질성 뉴런 단백질 신경 미세섬유에 대해 이중 양성임을 보여준다. 이와 관련하여, 이미지 A'는 이미지 A에서의 DAPI 염색을 위한 광학 채널을 보여준다. 신경 미세섬유의 발현은 PEG-헤파린 하이드로겔에서의 이들의 포매 및 성숙 이후에 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)의 성숙한 분화 상태에 대한 부가적인 증거이다.
도 11은 일차 인간 피질 세포에서 아밀로이드 β 42 펩티드(Aβ42)의 영향을 조사하기 위한 PEG-헤파린 하이드로겔의 제조에 대한 도표를 나타낸다. 단계 1에서 2회 계대 배양된 세포를 5 x 103/㎠의 밀도로 페트리 접시 상에 놓는다. Aβ42 신경 독성 모델을 위해, 2회 계대 배양된 세포를 유사하게 5 x 103/㎠의 밀도로 페트리 접시 상에 놓고, 2 μM Aβ42와 함께 48시간 동안 배양하였다(단계 1').
48시간 후, 단계 2에서는 세포를 수확하고, 인산 완충 식염수(PBS)에서 8 x 106개의 세포/㎖의 농도로 재현탁하였다. 이어서 단계 3에서는 동일한 부피의 헤파린 용액(PBS 중의 45 ㎍/㎕)을 첨가하고, 이들 둘을 혼합하여 4 x 106개의 세포/㎖의 최종 농도를 얻었다. PEG-헤파린 하이드로겔 시스템에 포매된 세포의 세포 외 환경을 Aβ42로 코팅하는 경우, 단계 3'에서는 40 μM의 농도의 Aβ42 펩티드의 혼합물을 첨가하였다.
겔을 캐스팅하기 위해, 단계 3에서 세포 용액, PBS 및 헤파린을 동일한 부피의 star-PEG와 혼합하였다. 이 단계에서, 단계 3'에 따라 캐스팅된 겔은 20 μM의 농도의 세포 외 Aβ42를 갖는다. 모든 하이드로겔 중의 세포의 농도는 2 x 106개의 세포/㎖이다. 겔 형성을 위한 반응은 2분 동안 지속된다. 캐스팅 이후, 겔을 24-웰 배양 플레이트에 넣었으며, 이때 각각의 웰에는 배양 배지가 담겨 있다. 겔을 배양하기 위해, 37℃에서 5% CO2/95% 공기의 비율이 사용되었다. 겔은 목적하는 시점까지 배양될 수 있다.
도 12는 뉴런 세포질 마커 단백질로서의 아세틸화 튜뷸린에 대한 항체, 펩티드 응집용 마커로서의 Aβ42, 및 신경교 세포용 세포질 마커로서의 GFAP에 의한 하이드로겔의 3중 면역 염색을 보여준다. 도 12는 이미지 A 내지 A"에서 Aβ42 부재, 이미지 B 내지 B"에서 세포 내 Aβ42의 존재, 및 이미지 C 내지 C"에서 세포 외 Aβ42의 존재 하에 3주령 겔의 y축을 가로지르는 최대 강도 투영에 대한 이미지를 나타낸다. 이미지의 첫 번째 행, 즉 이미지 A-C은 형성된 뉴런 네트워크를 강조하는 아세틸화 튜뷸린에 의한 염색을 위한 채널을 나타낸다. 이미지의 두 번째 행(A'-C')은 1행의 뉴런 네트워크뿐만 아니라, 겔의 전체 부피 내에 분포하고 있는 형성된 Aβ42 아밀로이드 집성체를 나타낸다. 유익한 것은, Aβ42 집성체를 함유하지 않은 샘플(도면 A' 참조)과 비교하여 Aβ42 집성체(이미지 B' 및 C' 참조)의 존재 하에서의 뉴런 네트워크의 손실이다. 3행은 GFAP 염색용 채널을 나타낸다. Aβ42 집성체로 인한 세포 손실 및 뉴런 네트워크의 손실의 정량화는 하기 도 13에 도시되어 있다.
도 13은 Aβ42의 부재(A) 및 세포 내 Aβ42의 존재(A') 및 세포 외 Aβ42의 존재(A") 하의 겔에서 골격화된 연결형 뉴런 경로의 최대 강도 투영을 보여준다.
이미지 A 내지 A"는 모든 경우, 즉 도 12에서 대조군으로서 Aβ42의 부재(A), 세포 내 Aβ42의 존재(A') 및 세포 외 Aβ42의 존재(A")의 경우에 aTub 양성 세포에 대한 채널을 보여준다. 도 13의 이미지 B는 Aβ42의 부재, 세포 내 Aβ42의 존재 및 세포 외 Aβ42의 존재 하에 겔 내의 평균 세포 계수에 대한 정량화를 나타낸다. 이미지 C는 Aβ42의 부재, 세포 내 Aβ42의 존재 및 세포 외 Aβ42의 존재 하에 겔 내의 네트워크의 평균 개수에 대한 정량화를 나타낸다. 이미지 D는 Aβ42의 부재, 세포 내 Aβ42의 존재 및 세포 외 Aβ42의 존재 하에 하이드로겔 내의 네트워크 당 분지의 평균 개수에 대한 정량화를 나타낸다.
뉴런 네트워크가 인간 신경 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)에 의해 형성되는 배양 조건은 MMP-절단 가능한 부위를 함유하는 3차원 PEG-헤파린 하이드로겔을 생성함으로써 만들어졌다. 이러한 변형으로 인해 세포는 이들의 환경을 재구성하게 된다. 하이드로겔 합성은 문헌[Tsurkan M.V. et al. Defined Polymer-Peptide Conjugates to Form Cell-Instructive starPEG-Heparin Matrices In Situ. Advanced Materials (2013)]에 개시되어 있다.
세포가 중합 단계 도중에 상기 PEG-헤파린 하이드로겔 내로 도입되는 경우, 놀랍게도 세포를 도입한지 단지 1주일 후에 겔은 3D 분지 형태를 갖는 드물게 분포한 GFAP 양성 신경교 세포를 함유하는 것으로 관찰된다. 세포 배양 2주 후, 아세틸화 튜뷸린에 대해 양성인 뉴런의 확산 및 배열은 다발로 관찰된다. 배양 3주 후, 세포 배양물은 신경교 세포가 산재되어 있는 뉴런의 광범위하고 복잡한 네트워크를 나타낸다. 또한 NSPC의 3D 배양물은 뉴런 노드(neuronal node) 및 절점(nodal point)에서 축적되는 시냅스 마커 시냅토파이신에 의해 염색 가능하며, 이는 2D 배양물과 비교하여 보다 성숙한 시냅스 연결을 나타낸다. 이에 반해, 뉴런 세포 및 신경교 세포를 갖는 2D 배양물에서, 시냅스 다발에서 시냅토파이신 염색을 관찰하는 것은 불가능하다.
3D 하이드로겔 내의 뉴런은 또한 글루탐산염과 같은 신경 전달 물질에 대해 반응성이며, 이는 세포 내 칼슘 수준에서의 증가에 의해 증명될 수 있으며, 이러한 세포 내 칼슘 수준은 CMV 프로모터 구동 칼슘 센서를 함유하는 GCamP6f 발현 플라스미드의 형질 전환에 의해 확인된다. 이들 결과에 따르면 NSPC의 3D 배양물은 3차원 배열에서 뉴런 세포 및 신경교 세포의 포괄적 네트워크를 생성할 수 있다. 또한 CTIP2 및 SATB2와 같은 보다 오래된 피질 아형 마커, 전신경 마커(proneural marker)인 Mash1 및 DCX, 및 성숙한 뉴런 마커 신경 미세섬유(분화된 뉴런용 마커 단백질)이 NSPC 배양물에서 발현되며, 이는 3D 배양물에 존재하는 뉴런 세포가 성숙한 뉴런을 형성하기에 우세한 조건 하에 발생한다는 것을 나타낸다.
알츠하이머병과 관련된 잘못 접힌 단백질(misfolded protein)인 아밀로이드 β 42 펩티드는 또한 이의 독성 및 뉴런 네트워크에 미치는 이의 영향을 모델링하기 위해 사용되었다. 이렇게 하여, 배양을 위해 3차원 하이드로겔 시스템을 사용하는 본 발명에 따른 방법은 또한 신경 퇴행성 질환용 모델로서 사용될 수 있다. 아밀로이드 베타 42의 축적은 생체 내 및 시험관 내에서 뉴런 네트워크 형성 및 뉴런 연결성을 손상시킨다는 것을 보여주는 것이 가능하였다. 아밀로이드 β 42(Aβ42)가 뉴런 네트워크에 영향을 미치는지를 조사하기 위해, 하이드로겔 시스템 내로의 도입 이전의 Aβ42(세포 내 Aβ42)로 세포를 처리하거나 세포의 도입 이전의 Aβ42(세포 외 Aβ42)와 함께 하이드로겔을 배양함으로써 배양물을 생성하였다. 광범위한 네트워크 형태의 형성을 관찰하는 것이 가능한 대조군 겔과 비교하여, 세포 내 및 세포 외 Aβ42에 의한 네트워크 형성에 대해 유의한 손상이 있었다. 대조군 겔과 비교하여, Aβ42-처리 겔은 유의하게 감소된 개수의 세포 및 네트워크를 함유한다. 게다가, 일부 네트워크가 Aβ42-처리 겔에 형성되는 경우에도 상기 네트워크는 네트워크 당 유의하게 낮은 개수의 분지를 함유한다는 것이 관찰될 수 있다. 또한 Aβ42 처리는 인간의 뇌에서와 같이 액손 위축증(dystrophy of axon)을 초래하는 것으로 밝혀져 있다. 이들 결과에 따르면 3D 겔은 뉴런 줄기 세포 또는 전구체 세포의 신경원성 능력(neurogenic capacity)과는 무관하게 뉴런 네트워크의 형성에 독성 효과를 미치는 Aβ42의 인간 병태생리(pathophysiology)를 요약할 수 있는 것으로 나타나 있다. 또한, 3차원 하이드로겔 시스템은 Aβ42의 존재 하에도 인간 줄기 세포의 신경원성 능력 및 뉴런 네트워크의 형성을 회복할 수 있는 화합물을 시험하기 위한 실제 선별 플랫폼(screening platform)으로서 사용될 수 있다.
선행 기술의 추가의 발전에서, 모듈식의 용이하게 제어 가능한 하이드로겔 물질 시스템이 사용되며, 이는 천연 세포 환경(소위 세포 외 기질(ECM))에서 발생하는 세포-지시적 신호를 독립적으로 조절하는 것이 가능하지만, 문헌[Tsurkan M.V. et al. Defined Polymer-Peptide Conjugates to Form Cell-Instructive starPEG-Heparin Matrices In Situ. Advanced Materials (2013)]에 공지된 바와 같이 특히 물리적 네트워크 특성(200 Pa 내지 최고 6 kPa 범위 이내의 하이드로겔의 강성), 분해성 및 생체 분자 조성물(부착 및 신호전달 펩티드, 가용성 사이토카인 및 성장 인자에 의한 기능화)을 독립적으로 조절하는 것이 가능하다. 따라서 다수의 매개변수를 물성 범위 내에서 시스템적으로(그리고 서로에 대해 독립적으로) 시험하는 것이 가능하다. 또한, 하이드로겔은 온건하고 세포 친화적인 조건 하에 가교 결합되어 세포의 높은 생존력을 가능케 한다. 또한 세포는 양호한 생존력을 갖는 구역 분화된 구조를 생성하기 위해 구역 이질성을 갖는 기질 내에서 프린팅될 수 있다.
사용된 3차원 배양물은, 예를 들어 CTIP2 및 SATB2와 같은 성숙한 뉴런을 갖는 마커 단백질에 대해 양성인 뉴런 세포를 함유한다. 이는 배양 시에 형성되고 생체 내 조건과 매우 유사한 방식으로 세포 분화를 나타내는 성숙한 피질 뉴런의 지표이다. 또한 배양된 세포에서 전기 생리학적 활성 및 막-채널 활성을 3D로 측정하는 것이 가능하였으며, 이의 기능은 마찬가지로 본 발명에 따라 사용되는 시스템의 생체 내 유형의 특징을 나타낸다.
광범위한 뉴런 네트워크를 함유하는 배양물은 3주 이내에 생성될 수 있고, 적어도 10주 동안 생존할 수 있다. 신속한 생성 및 배양 조건으로 인해, 예를 들어 임상적 치료에 앞서 환자의 세포에 미치는 다양한 활성 성분의 영향을 시험하기 위해 임의의 뇌 질환 동안에 iPS 기반 개인 맞춤 의료를 위해 하이드로겔 3D 배양물을 이용하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 신경교 및 뉴런 전구체 개체군의 신속한 증식을 조장하며, 다수의 세포가 요구되는 세포 기반 요법에 사용될 수 있다.
본원에 최초로 개시된 3D 하이드로겔 세포 배양 시스템의 추가적인 주요 이점은 세포를 봉입하는 겔 물질의 투명성이다. 분석 목적을 위해, 3D 배양물은 투명하고, 현미경적 실시간 기록, 및 조직의 양호한 투명성이 요구되는 기타 분석용으로 사용될 수 있다. 따라서 3D 배양물은 광학 및 현미경적 방법을 통해 네트워크 형성 및 뉴런 분지의 정량적 측정을 가능케 하며, 이때 배양 기간 전체에 걸쳐 네트워크의 형성을 관찰하는 것이 가능하다. 앞서 언급된 바와 같이, 시스템은 또한 개개의 뉴런 및 신경 회로의 전기 생리학적 활성 및 막-채널 활성의 측정을 가능케 한다. 또한 겔에서 세포 연결을 추적하고 통계 결과를 정량적으로 설명하기 위해 알고리즘을 개발하였다.
현재 이용 가능한 정보에 의하면, 바람직하게 사용되는, 일차 인간 피질 세포를 함유하는 star-PEG-헤파린 배양 시스템은 정량 가능하고 포괄적인 뉴런 네트워크를 제공하는 뉴런 세포용의 유일한 3D 배양 시스템이다.
김(Kim) 등의 시스템에서, 뉴런 네트워크는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 가능하고 본 발명에 따라 사용되는 PEG-헤파린 하이드로겔에 의해 제공되는 전체 배양 공간에 걸쳐 확장되는 훨씬 더 큰 뉴런 네트워크와 비교하여 명백하게 보다 더 낮은 품질을 갖는다. 카우트소파울로스 S. 등에 따른 시스템에서, 낮은 세포 생존 가능성이 밝혀졌고, 네트워크의 품질도 세포 반응성 star-PEG-헤파린 시스템에 의해 제공되는 것보다 명백히 더 심각하다.
더욱이, 2개의 시스템(김/카우트소파울로스 등)은 엔젤브레스-홀름-스웜(Engelbreth-Holm-Swarm; EHS) 마우스 육종, 종양 조직에서 추출되는 세포 외 기질인 BD 매트리겔에 기반을 두고 있다. 매트리겔에 대해 알려져 있고 결과의 재현성을 복잡하게 만드는 높은 배치간 편차(batch-to-batch variation) 이외에도, 이 같은 제품에 담겨 있는 종양에 전형적인 신호 전달 물질 및 세포 성분은 세포에 대한 정상적인 분자 신호의 전달을 변경한다. 따라서 이 같은 제품은 뇌 발달에 관한 조사에 적합하지 않으며, 이식 및/또는 신경 퇴행성 과정의 조사에 적합하지 않는데, 이는 분자 과정이 생체 내에서는 종양 조직에 존재하는 환경과 크게 다르기 때문이다. 본 발명에 따라 사용되는 하이드로겔 시스템은 합성 PEG, 및 생물학적으로 유도체화되지만 정제된 헤파린에 기반을 두고 있으며, 이때 헤파린은 분자량 분포 및 기능성과 같은 널리 공지된 분자 특성을 가지며, 이들 특성은 사용 이전에 항상 시험된다. 따라서 본 시스템은 또한 재현성에 문제점을 나타내지 않으며, 또한 면역원성 반응을 나타내지 않는다.
더욱이, 다와이 쟝(Dawai Zhang) 및 카우트소파울루스(Koutsopoulus) 등은 세포의 배양을 위해 자가 조직화 펩티드 하이드로겔 및 I형 콜라겐 겔을 사용하였다. 콜라겐의 경우, 매트리겔의 경우에서와 같이, 배치마다 편차가 존재한다. 본원에서 사용되는 모든 기타 하이드로겔 시스템(예를 들어, 푸라매트릭스, 자가 조직화 펩티드, I형 콜라겐 및 매트리겔)의 경우, 오히려 물리적 특성은 뚜렷하지 않고, 매우 가변적이며, 생체 분자 조성물과 무관하게는 변경될 수 없다. 따라서 이와 관련하여 사용되는 물질은 기계적 및 생체 분자 자극의 영향으로부터 독립적으로는 조사가 불가능하며, 재현성이 떨어지게 된다.
세포 외 기질(ECM)의 조성 및 배열에서 발생하는 다양한 이들 자극이 줄기 세포 활성의 영향 및 새로운 조직 형성을 위한 주요 매개변수이기 때문에, 선행 기술분야에 공지된 시스템은 기계적 및 생체 분자 신호를 서로 독립적으로 조사하는 것을 불가능하게 한다. 이와 반대로, 시험관 내 검정은 세포 외 기질 유래 신호의 다양성 및 이들의 다형질 발현 효과(pleiotropic effect)들 사이의 복잡한 상호작용으로 인해 조직 구조화에 대한 외부 자극의 기능을 확인하는데 있어 하나의 도전이다.
이와 같이, 본원에서 사용되는 명확하고 모듈식으로 맞춤 가능한 PEG-헤파린 하이드로겔은 기계적 및 생체 분자 신호를 서로 독립적으로 조절하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 하이드로겔의 조성을 독립적으로 설정하는 것이 가능하기 때문이다(문헌[Tsurkan M.V. et al. Defined Polymer-Peptide Conjugates to Form Cell-Instructive starPEG-Heparin Matrices In Situ. Advanced Materials (2013)]). 게다가, 본 발명에 따른 3D 하이드로겔 시스템은 또한, 예를 들어 MMP-절단 가능한 부위에 의해 세포 반응성을 나타나며, 이는, 예를 들어 뇌 조직에서 생체 내 상태와 보다 큰 유사성을 달성하기 위해 세포 유발 복원 과정 및 이들 자신의 기질에 의한 치환을 가능케 한다. 앞서 개시된 3차원 뉴런 네트워크에 대한 공지의 방법에는 3D 하이드로겔에서 세포 외 기질의 세포 의존성 재조직화뿐만 아니라 3D 배양 시스템의 기계적 및 생체 분자 특성에 대한 구체적인 조절을 가능케 하는 소정의 조성물이 존재하지 않는다.
따라서 사용된 3D 세포 배양 플랫폼은 줄기 세포 활성 및 분화에서의 기질 특성의 역할을 명확히 하기 위한 유리한 세포 배양 시스템으로서 작용할 수 있으며, 단 세포로 덮인 세포 외 기질을 생성하기 위해 세포가 하이드로겔 시스템과 동역학적으로 상호 작용을 한다. 게다가, 사용된 3D 하이드로겔 시스템은 부착 또는 신호전달 분자로 공유결합적으로 코팅되거나, 헤파린 결합 신호전달 분자로 비공유결합적으로 코팅될 수 있다. 전반적으로, 다수의 세포-지시적 외생성 신호의 영향은 인간 뉴런 줄기 세포 및/ 전구체 세포의 세포 증식에 대해, 그리고 뉴런 네트워크 형성에 대해 체계적으로 조사될 수 있다.
오가노이드(organoid)를 비롯한 다수의 3D 시스템은 크기 및 형태가 재현 가능한 구조를 형성할 수 없다. 본 발명에 따른 3D 배양물은 이들 2개의 매개변수에 대해 조절되고 구체적으로 제어될 수 있으며, 따라서 3D 세포 배양물을 위한 실질적으로 보다 명확한 조건을 제공할 수 있다.
US 6,306,922 A 및 US 6,602,975 A에 개시되어 있는 생분해성 하이드로겔은 광중합된 하이드로겔이다. 이는 특정 전자기 조건 하에서의 중합 및 겔 형성을 위해 상기 하이드로겔은 자외선(UV선)을 방출하는 특수 장비가 요구된다는 것을 의미한다. UV선은 포매된 세포에서 유리 라디칼의 생성을 야기하고, 세포 자멸적 신호전달 경로의 유도를 야기하며, 이는 세포 사멸을 초래하고 세포 생존에 악영향을 미칠 수 있다. 게다가, UV선은 DNA 돌연변이, 및 포매된 세포 의 세포성 DNA에 대한 손상을 야기한다. 이에 반해, 본원에 개시된 획기적인 3D 하이드로겔 시스템에서, 기질은 실온에서 UV선의 사용 없이 중합된다. 이러한 방식으로, DNA 손상 및 세포에 대한 돌연변이가 발생하지 않으며, 그 결과 세포 기능이 보다 양호하게 유지된다. 또한 UV 유발 중합을 생략하면 고가의 장비의 사용 없이 3D 하이드로겔 시스템의 사용이 가능하게 된다. 이러한 이점으로 인해 시스템이 사용자 친화적이 되며, 따라서 고도로 전문화된 실험실 밖에서 사용하는데 이상적이게 된다.
또한, 본 시스템은 플라스미드를 사용하여 유전자의 기능적 버전을 과발현시키기(기능 향상) 위해, 또는 예를 들어 siRNA(짧은 간섭 RNA) 또는 유전자의 비기능성 우성-음성 변이체를 사용하여 유전자를 하향 조절하기(기능 감쇠 및 손실) 위해 특정 유전자의 오발현(misexpression)을 허용하는 유일한 시스템이다.
플라스미드 발현 시스템에 의해 구동되는 칼슘 센서(GcaMP)의 사용이 개시된 바 있다. 오발현 시스템은 3D 겔에 맞춘 플라스미드 형질 감염 방법에 기반을 두고 있다.
매트리겔을 사용하는 3D 배양물에서 알츠하이머병(AD)의 모델링에 대한 이전 보고서와 비교하여, PEG-헤파린 3D 겔은 상당히 더 신속한 네트워크의 발달을 가능케 하며, 이는 예를 들어 활성 성분의 대용량 선별 플랫폼에 사용하는데 있어 이점을 제공한다.
지금까지, 인간 뉴런을 사용하여 3D 겔 시스템에서의 포괄적 네트워크 형성을 나타내는 것은 불가능하였다. 이전의 3D 배양물은 유동 또는 매트리겔-포매된 시스템을 사용하였으며, 변형되지 않은 세포를 사용한다.
이전의 3D 배양물에서, 네트워크의 형성을 정량화하는 것이 불가능하였기 때문에 네트워크 형성의 품질을 조사하는 것이 불가능하였다. 본 발명에 따른 방법에 의해 수득 가능한 3차원 배양물은 네트워크 형성에 대한 정량적 측정, 예를 들어 액손 및 신경 돌기(neurite)의 길이 및 개수, 분지 및 연결점의 개수 및 뉴런 분지의 개수에 대한 정량적 측정을 가능케 한다. 이는 지금까지는 불가능하였다. 또한 본 발명에 따라 사용되는 시스템은 세포 배양 기간 동안에 포매된 세포의 실시간 기록 및 모니터링을 가능케 한다.
성숙한 피질 뉴런용 3D 배양물은, 예를 들어 CTIP2 및 SATB2와 같은 피질 마커를 발현한다.
배양된 세포에서, 플라스미드 벡터를 사용하는 유전자의 형질 감염을 이용함으로써 전기 생리학적 활성 및 막-채널 활성을 3D로 측정하는 것이 가능하였다. 스캐폴드에서 또는 오가노이드로서 3D 배양물을 이용한 초기 연구의 경우, 세포의 게놈을 조작하는 것이 필수적이었다. 가능한 형질 감염 방법에 따르면, 세포 자체의 유전적 변형 없이 또는 바이러스의 사용 없이 오발현을 수행하는 것이 가능하다.
확장된 뉴런 네트워크를 함유하는 배양물은 3주 이내에 생성될 수 있으며, 16주를 초과하여 살아 있을 수 있다. 신속한 생성 및 배양 조건으로 인해, 임상적 치료에 앞서 다양한 활성 성분이 환자 및 환자 자신의 세포에 미치는 영향을 시험하기 위해 임의의 뇌 질병 도중에 iPS 기반 개인 맞춤 의료용 3D 배양물을 사용하는 것이 또한 가능하다.
배양물은 광학으로 투명하고, 실시간 기록, 및 조직의 투명한 가시성(clear visibility)을 요구하는 기타 분석에 사용될 수 있다. 이는 이전에 공지된 3D-스캐폴드 기반 또는 오가노이드 기반 시스템의 경우에는 해당되지 않는다.
3D 네트워크를 형성하기 위해 세포를 유전적으로 변형할 필요가 없다.
하이드로겔 시스템을 이용한 본 발명에 따른 방법은 신경교 세포 및 뉴런 전구 세포 개체군의 가장 신속한 증식을 가능케 하고, 다량의 세포가 요구되는 세포 기반 요법에 사용될 수 있다.
기술적 세부사항
실시예 1
실시예 1에서, 일차 인간 피질 세포(PHCC)를 사용하였다.
PHCC는 임신 21주차 태아로부터 기부된 조직에서 유래하는 대뇌 피질로부터 단리되었으며, 사이언셀 리서치 래보러토리(ScienCell Research Laboratory; SRL)에서 첫 번째 계대 배양에서 냉동 상태로 구입하였다(SRL카탈로그 번호: 1800). 세포는 HIV-1, HBV, HCV, 마이코플라스마, 박테리아, 효모 및 균류와 관련하여 음성인 것으로 확인되었다. PHCC를 통상적인 T75 플라스크 또는 24-웰 플레이트에 넣고, 5% 소 태아 혈청(SRL 카탈로그 번호: 0010), 1%의 성상세포 성장 촉진제(SRL 카탈로그 번호: 1852) 및 1%의 페니실린/스트렙토마이신 용액(SRL 카탈로그 번호: 0503)이 보충된 성상세포 배지(SRL 카탈로그 번호: 1801)를 이용하여 5% CO2/95% 공기의 분위기를 갖는 배양기에서 37℃에서 배양하였다.
하기의 변경과 함께 문헌[Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606~2610]에 개시된 바와 같이 PEG-헤파린 하이드로겔을 제조하였다: PHCC를 세포 부착 배지로서 아큐타제®(Accutase®; 인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여 배양 용기로부터 수집하였다. 10분 동안 분 당 12,000회의 회전으로 원심분리한 후, 인산 완충 식염수(PBS)에서 세포를 8 x 106개의 세포/㎖의 농도로 재현탁하였다. 하이드로겔 제조를 위한 중합체성 출발 물질(전구체)은, 문헌[Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606~2610]에 개시된 바와 같이, 15,000 g/몰의 분자량을 갖는, 6개의 말레이미드기(HEP-HM6)에 의해 기능화된 헤파린, 및 15,500 g/몰의 총 몰 질량을 갖는, 각각의 암에서 효소적으로 절단 가능한 펩티드 서열에 의해 기능화된 4-암 starPEG(starPEG-MMP)로 이루어져 있다. 하이드로겔은 3.9%의 총 고형분 함량에서 1몰의 HEP-HM6에 대한 0.75몰의 starPEG-MMP의 몰비(0.75의 가교 결합도에 상응함)로 출발 물질을 혼합함으로써 형성되었다. 이를 위해, 각각의 하이드로겔에 있어서 세포는 먼저 5마이크로리터(㎕)의 PBS에서 재현탁한 후, 문헌[Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606~2610]에 개시된 바와 같이 5 ㎕의 HEP-HM6 용액(5 ㎕의 PBS에 용해된 0.448 ㎎의 HEP-HM6) 및 10 ㎕의 starPEG-MMP 용액(10 ㎕의 PBS에 용해된 0.347 ㎎의 starPEG-MMP)을 첨가하고, 수초 이내에 격렬하게 혼합하였으며, 그 결과 2 x 106개의 세포/㎖의 세포 농도를 갖는 최종 부피가 20 ㎕인 하이드로겔을 생성하였다. 바로 직후에 20 ㎕의 방울을 파라필름(Parafilm) 시트에 도포한 후, 겔 형성이 완료될 때까지 추가의 2분 동안 기다렸다. 이어서 겔을 24-웰 배양 플레이트에 넣었으며, 이때 각각의 웰에는 20 ㎕의 하이드로겔 한 방울 및 1 ㎖의 부피의 배양 배지가 담겨 있었다. 이어서 하이드로겔을 목적하는 시점이 될 때까지 5% CO2/95% 공기 하에 37℃에서 웰 내에서 배양하였다. 겔 형성 후, 얻어진 하이드로겔은 450 ± 150 Pa 범위 이내의 저장 탄성률을 가졌으며, 이는 회전 유동측정계(rotational rheometer: ARES LN2; 독일 에쉬본 소재의 TA 인스트루먼츠(TA Instruments))를 사용함으로써 실온에서 PBS에서 팽창된 하이드로겔 슬라이스의 진동 유동측정에 의해 측정되었으며, 이때 상기 회전 유동측정계는 2%의 변형 진폭으로 10-1 내지 102 rad·s-1의 전단 주파수 범위 내에서 25℃에서의 주파수 의존적 측정을 통해 25 ㎜의 플레이트 직경에서 플레이트-플레이트 측정 배열을 갖는다.
실시예 2
PEG-헤파린의 형성 및 세포의 포매:
문헌[Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606~2610]에 개시된 바와 같이 PEG-헤파린 하이드로겔을 제조하되, 하기와 같이 변경하였다:
2회 계대 배양된 PHCC를 세포 부착 배지로서 아큐타제®(인비트로젠)를 사용하여 배양 용기로부터 수집하였다. 10분 동안 분 당 12,000회의 회전으로 원심분리한 후, 인산 완충 식염수(PBS)에서 PHCC를 8 x 106개의 세포/㎖의 농도로 재현탁하였다. 하이드로겔 제조용 중합체성 출발 물질은, 문헌[Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606~2610]에 개시된 바와 같이, 15,000 g/몰의 분자량을 갖는, 6개의 말레이미드기(HEP-HM6)에 의해 기능화된 헤파린, 및 15,500 g/몰의 총 몰 질량을 갖는, 각각의 암에서 효소적으로 절단 가능한 펩티드 서열에 의해 기능화된 4-암 starPEG(starPEG-MMP)로 이루어져 있다. 하이드로겔은 3.9%의 총 고형분 함량에서 1몰의 HEP-HM6에 대한 0.75몰의 starPEG-MMP의 몰비(0.75의 가교 결합도에 상응함)로 출발 물질을 혼합함으로써 형성되었다. 이를 위해, 총 부피가 20 ㎕인 각각의 하이드로겔에 있어서 세포는 먼저 5마이크로리터(㎕)의 PBS에서 재현탁한 후, 문헌[Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606~2610]에 개시된 바와 같이 5 ㎕의 HEP-HM6 용액(5 ㎕의 PBS에 용해된 0.448 ㎎의 HEP-HM6) 및 10 ㎕의 starPEG-MMP 용액(10 ㎕의 PBS에 용해된 0.347 ㎎의 starPEG-MMP)을 첨가하고, 수초 이내에 격렬하게 혼합하였으며, 그 결과 2 x 106개의 세포/㎖의 세포 농도를 갖는 최종 부피가 20 ㎕인 하이드로겔을 생성하였다. 바로 직후에 20 ㎕의 방울을 파라필름 시트에 도포한 후, 겔 형성이 완료될 때까지 추가의 2분 동안 기다렸다. 이어서 겔을 24-웰 배양 플레이트에 넣었으며, 이때 각각의 웰에는 20 ㎕의 하이드로겔 한 방울, 및 1 ㎖의 부피의 배양 배지가 담겨 있었다. 사용된 배양 조건은 37℃에서 5% CO2/95% 공기였다. 이어서 하이드로겔을 목적하는 시점이 될 때까지 웰 내에서 배양하였다. 겔 형성 후, 얻어진 하이드로겔은 450 ± 150 Pa 범위 이내의 저장 탄성률을 가졌으며, 이는 회전 유동측정계(ARES LN2; 독일 에쉬본 소재의 TA 인스트루먼츠)를 사용함으로써 실온에서 PBS에서 팽창된 하이드로겔 슬라이스의 진동 유동측정에 의해 측정되었으며, 이때 상기 회전 유동측정계는 2%의 변형 진폭으로 10-1 내지 102 rad·s-1의 전단 주파수 범위 내에서 25℃에서의 주파수 의존적 측정을 통해 25 ㎜의 플레이트 직경에서 플레이트-플레이트 측정 배열을 갖는다.
아밀로이드 β 42(Aβ42)로 예비 처리된 겔을 사용하기 위해, 배양 용기로부터 세포의 수집 이전 및 하이드로겔에서 세포의 포매 이전에 세포를 48시간 동안 2 μM Aβ42와 함께 배양하였다. Aβ42를 함유하는 겔 환경을 만들기 위해, 먼저 세포를 PBS 중의 4 ㎕의 100 μM Aβ42 펩티드에 용해하였다. 6 ㎕의 헤파린 용액(5 ㎕의 PBS에 용해된 0.448 ㎎의 HEP-HM6) 및 10 ㎕의 starPEG-MMP 용액(10 ㎕의 PBS에 용해된 0.347 ㎎의 starPEG-MMP)을 첨가하고, 상술한 바와 같이 혼합하였다. 이러한 겔 혼합물에서, Aβ42의 농도는 20 μM이고, 세포의 농도는 2 x 106개의 세포/㎖이다.
실시예 3
아밀로이드 β 42(Aβ42)로 예비 처리된 겔을 사용하기 위해, 배양 용기로부터 세포의 수집 이전 및 하이드로겔에서 세포의 포매 이전에 세포를 48시간 동안 2 μM Aβ42와 함께 배양하였다.
면역 세포 화학:
모든 하이드로겔을 빙냉된 파라포름알데히드로 고정시키고, 실온에서 1.5시간 동안 배양한 후, 4℃에서 PBS에서 하룻밤 동안 세척하였다. 면역 세포 화학에 있어서, PBS 중에 10% 정상적인 염소 혈청, 1% 소 혈청 알부민, 0.1% 트리톤-X로 이루어진 차단 용액에서 하이드로겔을 하룻밤 동안 4시간 동안 차단하였다. 연속 2일 동안 겔을 4℃에서 세척하였으며, 가끔씩 PBS를 교체하였다. 세척 이후, 겔을 실온에서 6시간 동안 이차 항체와 함께 배양하였다(차단 용액 중의 1:500). 2시간의 세척 단계를 3회 실시한 후, 각각의 경우에 DAPI 염색을 수행하였다(PBS 중의 1:3000, 실온에서 2시간).
형광 기록
하이드로겔에 있어서, 레이카 SP5(Leica SP5) 도립 공초점 및 다광자 현미경을 이용하여 형광 기록을 수행하였다. 하이드로겔을 유리 바닥 페트리 접시에 넣었다. 건조를 예방하기 위해 60 ㎕의 PBS를 하이드로겔의 상측에 첨가하였다. Z-스택(Z-stack)을 수침 렌즈(water immersion lens; 25x)를 이용하여 캡쳐하였다. 각각의 Z-스택은 500 ㎛의 z 거리를 갖는다.
star-PEG-헤파린 하이드로겔에서의 일차 인간 피질 세포(PHCC) 및 iPSC 유래 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)의 발달에 대한 비교
도 14는 star-PEG-헤파린 하이드로겔에서 뉴런 네트워크를 형성하는 포매된 PHCC 및 iPSC 유래 NSPC의 능력과 관련하여 이들의 비교를 가능케 하는 현미경 사진을 보여준다. 이와 관련하여, 이미지 A 내지 A"는 RGD 펩티드로 변형된 star-PEG-헤파린 하이드로겔에 포매되고, 아세틸화 튜뷸린(Acet. 튜뷸린; 이미지 A 참조)에 대해 염색되고, DAPI(이미지 A')로 염색되고, GFAP(이미지 A")에 의해 염색되는 iPSC 유래 NSPC의 500 ㎛ 두께의 Z-스택에 대한 최대 강도 투영을 보여준다. 이미지 B 내지 B"는 star-PEG-헤파린 하이드로겔에 포매되고, 아세틸화 튜뷸린(이미지 B)에 대해 염색되고, DAPI(이미지 B')로 염색되고, GFAP 항체(이미지 B")로 염색되는 PHCC의 500 ㎛ 두께의 Z-스택에 대한 최대 강도 투영을 보여준다.
도 15는 이미지 A에서 TUBB3 염색 이후에 인간 피질 NSPC의 뉴런 돌기에 대한 최대 강도 투영을 보여준다. 도 15의 이미지 B는 TUBB3 염색 이후에 iPSC 유래 NSPC의 뉴런 돌기에 대한 최대 강도 투영을 보여준다. 이미지 C는 그래프에서 이미지 A 및 B의 뉴런 네트워크 특성을 정량화하고 대조하는 것을 보여준다.
본 발명에 따라 사용되는 하이드로겔은 RGD(Arg-Gly-Asp)와 같은 다양한 기질 유래 펩티드에 의해 공유결합적으로 변형될 수 있거나, 가용성 신호전달 분자의 효과적인 투여를 위해 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구체 세포의 증식 및 뉴런 네트워크의 형성에 미치는 외생성 신호의 영향은 개별적으로 시험될 수 있다. 이러한 star-PEG-헤파린 하이드로겔 시스템이 다수의 상이한 분자에 의해 변형될 수 있다는 사실로 인해 사용자에게 맞춤형 환경을 형성할 가능성이 제공된다. 예를 들어, RGD 펩티드에 의한 PEG-HEP 스캐폴드의 조절은 도 14에 도시된 바와 같이 인간 iPSC 유래 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)를 배양하는 것을 가능하게 한다. 이 같은 방법은 RGD 변형 없이는 불가능하다. 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 먼저 뉴런 네트워크를 형성하는 일차 인간 피질 세포(PHCC)의 능력 및 다음으로 iPSC 유래 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)의 능력을 비교할 때 사용되는 하이드로겔 시스템 간 차이는 없었다. 도 15의 이미지에서 특별히 예시된 바와 같이, 네트워크의 개수 및 분지의 개수 및 길이는 유사하였다. 일차 인간 피질 세포(PHCC) 유래 세포와 비교하여 인간 iPSC 유래 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)의 매우 유사한 발달은 상술한 하이드로겔 시스템이 광범위한 사용 스펙트럼에서 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 하이드로겔 시스템의 가장 유망한 용도는 개인 맞춤 의료 분야에서 예상된다. 특히, 수정 가능성, (예를 들어, 인터류킨 4(IL-4)에 의한) 치료에 대한 반응성, 및 또한 비교적 짧은 시간 내에 대량의 star-PEG-헤파린 하이드로겔을 생산하는 능력이 이를 시사한다. 환자에서 유래한 iPSC 유래 뉴런을 배양함으로써, 상이한 뉴런 발달 장애를 보다 잘 이해하는 것이 가능하다. 그러나 생성된 하이드로겔은 또한 치료 전략을 찾기 위해 사용될 수 있다.
iPSC 유래 신경 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)를 이용한 PEG-헤파린 겔의 제조
HIPTM(BC1 라인)으로 명명된 iPSC에서 유래한 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포(NSPC)는 암비오(Amsbio; 카탈로그 번호: GSC-4311)로부터 구매하였다. 이들 NSC를 제조사가 규정한 바와 같이 녹이고, 젤트렉스(Geltrex)-코팅 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 세포의 증식 및 추가적인 배양을 위해, 제조사의 지침서에 따라 증식 배지를 사용하였다. NeuralXTM NSC 배지는 하기조성을 갖는다: 2% GS22TM 뉴런 보충물, 10; 1x 비필수 아미노산, 2 mM L-알라닌/L-글루타민; 20 ng/㎖ FGF2. 아큐타제(인비트로젠)를 이용하여 HIPTM NSC를 세포 배양 플라스크에서 탈착시켰다. 10분 동안 12,000 rpm로 원심 분리한 후, HIPTM NSC를 8 x 106개의 세포/㎖의 밀도로 PBS에서 재현탁하였다. 각각의 하이드로겔에 있어서, 먼저 세포를 5 마이크로리터(㎕)의 PBS에 재현탁한 후, 철저한 볼텍싱(vortexing)에 의해 PBS에 용해된 5 ㎕의 헤파린 용액(PBS 중의 45 ㎍/㎕) 및 RGD 펩티드로서의 2 M 인테그린 리간드로 재현탁하고(문헌[Tsurkan, Chwalek et al., 2011, Maitz, Freudenberg et al., 2013, Tsurkan, Chwalek et al. 2013, Wieduwild, Tsurkan et al. 2013]), 10 ㎕의 PEG를 첨가하여 2 x 106개의 세포/㎖를 함유하는 20 ㎕의 최종 부피를 얻었다. 20 ㎕의 방물을 파라필름 시트에 도포하였다. 겔 형성에는 2분이 소요되었다. 겔을 24-웰 배양 플레이트에 넣었으며, 각 웰에는 1 ㎖의 부피의 HIP-증식 배지가 담겨 있었다. 겔을 37℃에서 5% CO2/95% 공기를 이용함으로써 배양하였다. 이어서 겔을 목적하는 시점이 될 때까지 배양하였다.
신경원성 형성성 및 Aβ42 매개 독성에 미치는 개개의 인자의 영향을 분석하기 위한 PEG-HEP 하이드로겔의 용도
도 16은 Aβ42이 없는 대조군(A-D), Aβ42이 존재하는 대조군(A'-D') 및 Aβ42 및 인터류킨 4(IL-4)이 존재하는 배양물(A" 내지 D")에서 유래하는 포매된 PHCC를 함유하는 star-PEG-HEP 겔에 대한 현미경 사진을 보여주며, 이들 각각은 항-Aβ42 항체에 의한 염색(이미지 A 내지 A") 이후, DAPI에 의한 염색(이미지 B 내지 B") 및 항-GFAP 항체에 의한 염색(이미지 C 내지 C") 이후, 및 항-SOX2 항체에 의한 염색(이미지 D-D") 이후에 사진이다.
예를 들어, 앞서 제브라피시(zebrafish) 조사에서 확인할 수 있었던 바와 유사한 방식으로 IL-4가 인간에서 작용하는지의 여부를 시험하기 위해, PHCC를 함유하는 상술한 star-PEG-HEP 하이드로겔을 사용하였다. 이를 위해, 포매된 PHCC를 함유하는 하이드로겔을 준비하고, 이들은 이미 개시된 바와 같이 Aβ42와 함께 배양하였다. 각각의 시험 설정(test setup)에는 Aβ42 및 IL-4를 포함하는 실험군뿐만 아니라 양성 대조군(Aβ42 존재) 및 음성 대조군(Aβ42 부재)가 포함되었다. 실험군에서, 포매된 PHCC를 함유하는 star-PEG-HEP 겔을 Aβ42와 함께 배양하고, 동시에 배지 내에 100 ng/㎖의 IL-4의 존재 하에 배양하였다. 3주간의 배양 단계 이후, 샘플을 고정시키고, 신경 줄기 세포 및 전구 세포에 미치는 IL-4의 영향을 조사하기 위해 GFAP 및 SOX2에 대해 면역 염색하였다. 전세포를 보여주기 위해 핵 염료 DAPI를 사용하였다. Aβ42-처리 세포 배양물에서, 미처리 대조군 배양물과 비교하여 세포수에서 큰 감소를 관찰하는 것이 가능하였으며, 이때 GFAP 양성 신경교 세포 및 SOX2 양성 뉴런은 둘 모두 손상되었다. Aβ42로 처리되고 동시에 IL-4로 처리된 배양물에서, 세포수는 Aβ42로 처리되지 않은 대조군 배양물과 전적으로 비교할만하다. 그 결과에 따르면 IL-4에 의한 처리는 Aβ42의 신경 독성 효과를 없앨 수 있는 것으로 나타나 있다. 인터류킨 4에 의한 처리는 증식과 관련하여 GFAP 양성 세포를 자극하여 보다 많은 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포를 형성한다는 결론을 내릴 수 있다. 따라서 IL-4는 신경 독성 Aβ42의 존재에도 불구하고 포매된 PHCC의 신경 형성성(neuroplasticity)을 증가시킨다. 종합하면, 상기 데이터에 따르면, 제브라피시 모델에서 나타낸 바와 같이, IL-4에 의한 처리는 인간 뉴런 줄기 세포의 증식을 활성화시키는 것으로 나타나 있다. 따라서 IL-4는 Aβ42 매개 신경 퇴행에 대한 미래의 요법에 대한 중요한 후보물질이다. 본 발명의 하이드로겔 기반 3D 배양물에 대한 세포 투과성 서열을 갖는 특정 Aβ42 펩티드의 투여에 따르면 본원에서 사용된 세포 배양 방법은 인간 Aβ42 독성의 병태생리를 재현할 수 있고, star-PEG-HEP 하이드로겔 시스템에서 신경 보호 효과를 또한 조사할 수 있는 것으로 나타나 있다.
star-PEG-HEP 하이드로겔 시스템과 3D 세포 배양물을 제조하기 위한 통상적인 방법의 비교
도 17은 각각의 경우 일차 인간 피질 세포(PHCC)가 포매되어 있는 매트리겔과 star-PEG-헤파린 하이드로겔의 비교를 위해 GFAP, SOX2 및 아세틸화 튜뷸린에 대한 면역 염색 이후의 현미경 사진을 보여준다. 이와 관련하여, 이미지 A 내지 A"'는 매트리겔에 포매된 PHCC를 보여준다. 이에 반해, 이미지 B-B"'는 star-PEG-헤파린 하이드로겔에 포매된 PHCC를 보여준다. 이미지 A 및 B는 각각 신경교 세포 개체군을 확인하기 위해 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP)에 대해 염색된다. 이미지 A' 및 B'는 각각 뉴런 네트워크 형성을 보여주기 위해 아세틸화 튜뷸린(Acet. 튜뷸린)에 대해 염색된다. 이미지 A" 및 B"는 전세포를 표지하기 위해 DAPI 염색을 포함한다. 마지막으로, 이미지 A"' 및 B"'의 대립 배치는 SOX2 염색에 의한 줄기 세포 개체군의 범위 및 신경 형성 능력의 범위에 대한 비교를 가능케 한다.
유기체에서 3차원 위상 조직화(topological organization)는 조직에 구조, 계통 사양(lineage specification) 및 공간적 상호작용과 같은 특성을 부여하며, 이는 통상적인 2차원(2D) 세포 배양물에서는 재현될 수 없다. 그 결과, 3차원(3D) 세포 배양 시스템은 특유의 이점을 가지며, 광범위하게 사용된다. 매트리겔 기반 3D 세포 배양은 현재 이 같은 기법의 바람직한 표준이며, 이때 뉴런 세포는 콜라겐 및 라미닌과 같은 세포 외 기질(ECM) 단백질이 포매되는 점성 겔 물질에서 성장한다. 그러나 매트리겔 기반 제품은 화학적으로 명확하지 않았으며, 이들 조성이 불균일하며, 강성, 스캐폴드 조성 또는 생물학적 반응성과 같은 다양한 특성의 변경이 불가능하다. 이는 결과에 대해 해석을 복잡하게 하며, 세포 발생에 미치는 다양한 외생성 및 측분비성 신호(paracrine signal)의 영향을 정밀하게 분석하는 것을 불가능하게 한다. 이에 반해, 본 발명에 따라 사용되고 헤파린 및 PEG에 기반을 둔 하이드로겔 시스템은 생물 물리학적 신호 및 생체 분자 기질 신호의 독립적인 조절을 가능케 함으로써 유용한 이점을 제공한다. 도 17에서 매트리겔 시스템과 본 발명에 따라 사용되는 시스템의 직접적인 비교에서, 신경교 세포의 세포 조성은 기질 시스템 둘 모두에서 매우 유사하지만, 신경원성 능력 및 뉴런 네트워크를 형성하는 인간 줄기 세포의 능력은 매트리겔 기질에서보다 star-PEG-헤파린 하이드로겔에서 훨씬 크다는 것을 용이하게 관찰할 수 있다. 이때, 배양 시스템 둘 모두는 추가의 첨가제 없이 동일한 성장 배지에서 3주의 동일한 기간 동안 배양되었다는 것을 언급해야 한다. 뉴런 네트워크가 star-PEG-헤파린 하이드로겔에서는 관찰되었으나 매트리겔 시스템에서는 관찰되지 않았다는 점은, 매트리겔 시스템에서는 뉴런 사이의 성숙한 시냅스 연결을 확인하는 것이 거의 불가능했다는 사실에 의해 확인된다. 이에 반해, star-PEG-헤파린 하이드로겔 내의 뉴런은 뉴런 네트워크를 형성하였다. 매트리겔 시스템 내의 NSPC가 이들의 신경원성 특성을 나타내지 않고 네트워크를 형성하지 않는 이유는 상흔 조직에서 유사하게 작용하는 고도로 비조직화된 ECM 환경에서 기인하는 것으로 보인다.
매트리겔 3D 배양물의 제조
매트리겔 세포 배양물의 경우, BD 바이오사이언시스(카탈로그 번호: 356234)사의 매트리겔을 사용하였다. 각각의 세포 배양 과정 및 매트리겔의 사용 이전에 피펫 팁(pipette tip) 및 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)를 "진한 겔 방법(thick gel method)"에 대한 제조사의 지침서에 따라 -20℃에서 냉동시켰다. 매트리겔을 얼음 상에서 4℃ 하룻밤 동안 녹였다. 아큐타제(인비트로젠)를 이용하여 2회 계대 배양된 PHCC를 세포 배양 플라스크에서 탈착시켰다. 원심 분리(10분 동안 12,000 rpm) 이후, BD 매트리겔에서 PHCC를 2 x 106개의 세포/㎖의 밀도로 재현탁하였다. 37℃에서의 응결을 위해 세포/매트리겔 혼합물의 액적(droplet)을 생성하였다. 그 이후, 세포 배양 배지(SRL 카탈로그 번호: 1801)을 첨가하고, 겔을 3주 동안 배양하였다. 이와 관련하여, 세포/매트리겔 혼합물을 제조한 다음 날에 세포 배양 배지를 교체한 후, 이틀마다 세포 배양 배지를 교체하였다.
약어의 목록
Aβ42: 아밀로이드 β 42
Acet.Tub: 아세틸화 튜뷸린
aTub: 아세틸화 튜뷸린
BrdU: 브로모데옥시우리딘
CTIP2: "B 세포 CLL/림프종 11B"(BCL11b)라는 명칭으로도 공지되어 있는 성숙한 피질 뉴런용 마커 단백질
DAPI: 세포핵 염료인 4',6-디아미디노-2-페닐인돌
GFAP: 신경교 세포용 세포질 마커인 신경교 섬유질 산성 단백질
Gcamp: 칼슘 센서
HEP-HM6: 6개의 말레이미드기가 접합된 헤파린
IL-4: 인터류킨 4
iPSC: 유도 만능 줄기 세포
MMP: 기질 금속 단백질 분해효소
NSPC: 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포; 신경 줄기 세포 및 전구 세포란 용어의 약어
PBS: 인산 완충 식염수
PEG: 폴리에틸렌글리콜
PHCCs: 일차 인간 피질 세포; 일차 인간 피질 세포란 용어의 약어
HEP: 헤파린
SATB2: "특수 AT 풍부 서열-결합 단백질 2"란 용어의 약어인 성숙한 피질 뉴런용 마커 단백질
SOX2: "성 결정 영역 Y 박스 2"에 대한 약어인 전사 인자
StarPEG-MMP: 효소적으로(기질 금속 단백질 분해효소) 절단 가능한 펩티드 링커에 의해 말단 기능화된 성상(4-암) 폴리에틸렌글리콜
Syn: 시냅토파이신
TUBB3: 뉴런 세포질 마커인 베타-III-튜뷸린

Claims (18)

  1. 성숙한 뉴런 피질 마커의 발현, 신경 전달 물질에 대한 반응성, 및 전기 생리학적 활성을 보이는, 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포의 기능성 네트워크를 형성하기 위한 방법으로서,
    상기 세포를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 헤파린 성분을 함유하는 합성 하이드로겔 시스템 내로 도입하는 단계로서, 상기 합성 하이드로겔 시스템은 3차원 하이드로겔의 형성을 위한 것인 단계; 및
    상기 합성 하이드로겔 시스템에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 세포는 상기 합성 하이드로겔 성분들 중 하나인 PEG 또는 헤파린과 함께 미리 혼합되어, 상기 합성 하이드로겔 성분들 중 하나인 PEG 또는 헤파린과 함께 상기 합성 하이드로겔 시스템에 도입되고, 그 결과 3차원 하이드로겔의 형성 중에 상기 세포가 상기 합성 하이드로겔 시스템에 이미 존재하게 되는 것인,
    인간 뉴런 세포 및 신경교 세포의 기능성 네트워크를 형성하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 뉴런 세포는 신경교 세포와 동시 배양되고, 상기 인간 뉴런 세포는 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포의 조합이거나, 인간 불멸성 뉴런 전구 세포주에서 유래하거나, 중뇌로부터 수득되는 일차 인간 뉴런 전구 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인간 뉴런 세포는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래하는 인간 뉴런 줄기 세포 및 전구 세포의 조합이거나, 일차 인간 피질 세포에서 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 합성 하이드로겔 시스템은 효소적으로 절단 가능한 펩티드 서열을 통해 가교 결합되는 다중-암 폴리에틸렌글리콜(star-PEG) 함유 star-PEG-헤파린 하이드로겔 시스템이며, 그 결과 상기 star-PEG-헤파린 하이드로겔 시스템이 절단 가능하고 국부적으로 복원 가능한 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하이드로겔의 하이드로겔 기질은 티올 말단형 star-PEG-펩티드 접합체, 및 말레이미드에 의해 기능화되는 헤파린의 공유결합성 가교 결합에 의해 형성되며, 이때 상기 하이드로겔 기질은 마이클 첨가(Michael addition)를 통해 가교 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 star-PEG-헤파린 하이드로겔 시스템의 하이드로겔 기질은 자가 조직화(self-organization)에 의해 헤파린 및 공유결합성 star-PEG-펩티드 접합체로부터 비공유결합적으로 형성되며, 이때 상기 star-PEG-펩티드 접합체는 중합체 사슬에 결합되는 2개 이상의 펩티드의 집합체를 포함하고, 상기 펩티드의 서열은 반복 디펩티드 모티프(repeating dipeptide motif; (BA)n)를 함유하며, 여기서 B는 양으로 하전된 곁사슬을 갖는 아미노산이고, A는 알라닌이고, n은 5 내지 20의 수인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 저장 탄성률을 특징으로 하는 가변적인 기계적 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 저장 탄성률은 300 내지 600 파스칼 범위 내인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 PEG-헤파린 하이드로겔 시스템은 신호전달 분자에 의해 변형되고/되거나, 세포 외 기질(ECM)의 단백질에서 유래하는 기능성 펩티드 단위에 의해 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포는 인간 뉴런 세포 및 신경교 세포와 공존하는 인간 중간엽 간질 세포 및 내피 세포와 함께 동시 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 인간 뉴런의 3차원 기능성 네트워크.
  13. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 뉴런 네트워크의 형성을 모니터링하기 위해 사용되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 뉴런 네트워크의 형성을 실시간으로 모니터링하기 위해 사용되는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 뉴런 네트워크 내의 뉴런 세포의
    - 세포 성장, 길이, 분지 개수 및 밀도, 또는
    - 연결성, 또는
    - 뉴런 세포의 전기 생리학적 활성에 대한 정량적 분석이 수행되거나, 또는
    상기 뉴런 네트워크 내의 상가 세가지 타입의 분석 중 적어도 2개의 조합이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 방법은 인간의 뇌에서 뉴런, 뉴런 네트워크, 또는 이들 모두의 형성에 영향을 미치는 질병의 모델링을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법은 신경 독성(neurotoxicity), 질병 관련 단백질 집성체에 의해 야기되는 뉴런 줄기 세포 형성성(neuronal stem-cell plasticity)의 변화, 또는 이들 모두의 모델링을 위해 사용되는 것인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 방법은 뉴런 활성, 네트워크 형성, 또는 이들 모두에 영향을 미치는 분자, 활성 성분, 또는 이들 모두를 시험하기 위해 사용되는 것인 방법.
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