PL226113B1 - Rusztowanie do trojwymiarowej hodowli komorek neuronalnych oraz sposob wytwarzania tego rusztowania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest rusztowanie do trójwymiarowej hodowli komórek neuronalnych otrzymanych poprzez różnicowanie komórek macierzystych oraz sposób wytwarzania tego rusztowania.

Inżynieria tkankowa to dziedzina nauk technicznych, zajmująca się wykorzystaniem wiedzy medycznej oraz metod inżynierii materiałowej do wytwarzania funkcjonalnych zamienników uszkodzonych tkanek lub całych narządów. Obejmuje ona manipulacje komórkami, konstruowanie odpowiednich rusztowań do ich hodowli, wpływanie na warunki wzrostu tkanki i jej strukturę oraz utrzymanie sprzyjających temu parametrów fizykochemicznych otoczenia. W oparciu o techniki i metody inżynierii tkankowej prowadzone są farmakologiczne i toksykologiczne badania in vitro hodowli komórkowych, prowadzonych zarówno dwuwymiarowo (na powierzchni biomateriału), jak i wielowymiarowo (w całej objętości materiału). Wykazano, że istotnym czynnikiem w prowadzeniu hodowli komórkowych jest rusztowanie (podłoże, matryca). Optymalny skład, architektura i szybkość resorpcji rusztowania zależą między innymi od metody jego wytwarzania i od rodzaju zastosowanych materiałów. Rusztowania muszą charakteryzować się odpowiednią wytrzymałością mechaniczną i strukturą przestrzenną (porowatością) pozwalającą na przyleganie komórek, swobodny przepływ aktywnych biologicznie molekuł i tworzenie naczyń krwionośnych zaopatrujących nowo powstającą tkankę w tlen i odprowadzających produkty przemiany materii. Jednocześnie materiał nie powinien ulegać przedwcześnie degradacji, a produkty jego rozkładu nie powinny powodować zmian mogących prowadzić do odrzucenia implantu i nekrozy tkanki.

Jako materiał do otrzymywania rusztowań polimerowych przeznaczonych do trójwymiarowych hodowli komórkowych, a w szczególności do różnicowania komórek macierzystych oraz hodowli komórek neuronalnych, stosuje się obecnie:

- pochodne naturalnych matryc zewnątrzkomórkowych, pochodzące z komórek mysiego mięsaka EHS (Engelbreth-Holm-Swarm), występujące pod handlowymi nazwami Matrigel™ (BD Biosciences) oraz Cultrex BME (Trevigen), ujawnione w opisach patentowych US 4,829,000, US 5,158,874; rusztowania te w temperaturze pokojowej przybierają formę fizycznego żelu, na którym bądź wewnątrz którego mogą być hodowane komórki,

- inne pochodne matryc zewnątrzkomórkowych, które można wykorzystać do hodowli komórek błony śluzowej jelita, żołądka, pęcherza (opisy patentowe US 6,379,710, 6,171,344, 6,099,567, 5,554,389),

- hydrożele z polimerów naturalnych, jak fibryna stosowana, między innymi, do hodowli in vitro neuronów pierwotnych (czasopisma Biomaterials 27(36) 5990-6003, 2006; Stem Cells 25(9) 2235-2244, 2007) oraz do hodowli zarodkowych komórek macierzystych (czasopismo FASEB Journal 13, 2214-2224, 1999), kolagen (czasopismo Experimental Neurology 190(2), 276-288, 2004) czy też hydrożele z kwasu hialuronowego, dekstranu, alginianu, agarozy.

Rusztowania te nie zachowują stabilnych właściwości mechanicznych ulegając degradacji wraz z upływem czasu (czasopisma Acta Biomaterialia 3(1) 59-67, 2007; Developmental Brain Research 153(2) 163-173, 2004), co czyni je nieodpowiednimi dla długotrwałych hodowli prowadzonych w celu utworzenia przez komórki neuronalne synaptycznej sieci połączeń.

Stabilne właściwości mechaniczne wykazują rusztowania z hydrożeli z polimerów syntetycznych. Zalety wykorzystania materiałów syntetycznych na rusztowania do hodowli komórkowych to: łatwość manipulacji parametrami fizyko-chemicznymi, powtarzalność oraz łatwość procesów syntezy i przetwarzania. Znaczną większość materiałów syntetycznych, wykorzystywanych jako materiał rusztowań do hodowli komórek neuronalnych, stanowią polimery biodegradowalne, jak poli(kwas L-mlekowy) czy jego kopolimer z kwasem glikolowym (czasopismo Tissue Engineering 11(3-4) 506-512, 2005) oraz syntetyczne polimery hydrofilowe. W celu polepszenia adhezji komórek do rusztowań z tego typu materiałów, wzbogaca się je o polimery naturalne, polipeptydy bądź krótkie sekwencje aminokwasów. Na przykład jako materiał rusztowań stosuje się hydrożele oparte na poli(glikolu etylenowym) (PEG), do których, na drodze syntezy chemicznej, dołączono sekwencję aminokwasów arginina-glicyna-kwas asparginowy-seryna (RGDS). Rusztowania z takiego materiału znalazły zastosowanie do reorganizacji komórek śródbłonka w struktury naśladujące naczynia włosowate (czasopismo Tissue Engineering - Part A 15(3), 579-585, 2009).

W czasopiśmie Macromolecular Bioscience, 11, 36-49, 2011 ujawniono materiały wykorzystywane jako rusztowania do hodowli komórkowych, takie jak kolageny, laminina, fibronektyna, kwas

PL 226 113 B1 hialurowy, alginiany, dekstran - polimery naturalne, oraz poli(L-kwas mlekowy), poli(glikol etylenu), poli(e-kaprolakton) - polimery syntetyczne.

Z materiałów dydaktycznych Wydziału Chemicznego Politechniki Łódzkiej pt. „Wytwarzanie mikrożeli i badanie rozkładu ich wymiarów” jest znany hydrożel w postaci kopolimeru chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego, metakrylanu 2-hydroksyetylu oraz diakrylanu poli(glikolu etylenowego) (HEMA-MADQUAT-PEGDA).

Z opisu zgłoszenia patentowego US2012048799-A znane jest otrzymywanie kompozytowych, suchych membran filtracyjnych z polimerów HEMA, MADQUAT i PEGDA z wykorzystaniem polimeryzacji przy użyciu promieniowania jonizującego.

Rusztowanie do trójwymiarowej hodowli komórek neuronalnych otrzymanych poprzez różnicowanie komórek macierzystych, w postaci porowatego hydrożelu, z wykorzystaniem kopolimeru chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego, metakrylanu 2-hydroksyetylu oraz diakrylanu poli(glikolu etylenowego), według wynalazku stanowi kopolimer chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego, metakrylanu 2-hydroksyetylu oraz diakrylanu poli(glikolu etylenowego) zawierający 78-96%, korzystnie 86% w/w poli(metakrylanu 2-hydroksyetylu), do 10%, korzystnie 3% w/w poli(diakrylanu poli(glikolu etylenowego)) oraz 1-21%, korzystnie 11% w/w poli(chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego), o porowatości do 70% w/w w stosunku do suchej masy kopolimeru.

Sposób wytwarzania rusztowania do trójwymiarowej hodowli komórek neuronalnych otrzym a nych poprzez różnicowanie komórek macierzystych, określonego powyżej, z wykorzystaniem sposobu sporządzenia kopolimeru chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego, metakrylanu 2-hydroksyetylu oraz diakrylanu poli(glikolu etylenowego) na drodze polimeryzacji z użyciem promieniowania jonizującego, według wynalazku polega na tym, że kopolimer sporządza się w drodze przygotowania mieszaniny metakrylanu 2-hydroksyetylu z diakrylanem poli(glikolu etylowego) jako środkiem sieciującym , chlorkiem metakryloetylotrimetyloamoniowym, korzystnie w postaci roztworu wodnego, oraz porogenem w postaci sacharozy o średnicy ziaren 30-300 pm, zawierającej 75-95%, korzystnie 83% w/w metakrylanu 2-hydroksyetylu, do 10%, korzystnie 3%, w/w diakrylanu poli(glikolu etylowego), 1-20%, korzystnie 11% w/w chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego, do 24% w/v wody oraz porogenu nie więcej niż 70% całej masy mieszaniny, umieszczenia sporządzonej mieszaniny w opakowaniu i poddania jej polimeryzacji i sieciowaniu przy użyciu promieniowania jonizującego w postaci strumienia elektronów z akceleratora lub promieniowania gamma z izotopu kobaltu ⁶⁰Co, w temperaturze pokojowej aż do zaabsorbowania takiej dawki, przy której w układzie pojawi się żel, następnie wyjęcia wytworzonego materiału z opakowania, płukania go w wodzie dejonizowanej i poddania sterylizacji w autoklawie korzystnie w temperaturze 121°C, przy ciśnieniu 0,21 MPa w czasie co najmniej 15 minut.

Zgodnie z wynalazkiem otrzymuje się rusztowanie do prowadzenia hodowli komórek neuronalnych, w postaci trójwymiarowej sieci polimerowej zapewniającej optymalne warunki dla wzrostu komórek dzięki:

- zachowaniu stabilności mechanicznej przez cały czas prowadzenia hodowli;

- obecności porów w sieci polimerowej, powstałych w wyniku dodania porogenu, (substancji nierozpuszczalnej w mieszaninie monomerów, wypłukiwanej po utworzeniu sieci polimerowej), o rozmiarach zapewniających transport komórek i substancji odżywczych w całej objętości żelu oraz tworzenie przestrzeni wewnętrznych, w których mogą osadzać się komórki,

- obecności w strukturze kompozycji monomeru kationowego, wbudowanego w procesie polimeryzacji i sieciowania, który dzięki obecności ładunków dodatnich oddziałuje elektrostatycznie z hodowanymi komórkami odpowiadając za ich stabilizację w sieci polimerowej.

Rusztowanie według wynalazku umożliwia trójwymiarową hodowlę komórek neuronalnych, otrzymanych poprzez różnicowanie komórek macierzystych, z jednoczesnym utworzeniem sieci połączeń pomiędzy tymi komórkami.

Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady, z powołaniem się na rysunek przedstawiający zdjęcia przekroju hydrożeli otrzymanych w przykładach, wykonane techniką skaningowej mikroskopii elektronowej, zdjęcia przekrojów hydrożeli otrzymanych w przykładach, wykonane z użyciem mikroskopu optycznego oraz wykresy ilustrujące wyniki badań produktów otrzymanych w przykładach.

P r z y k ł a d I.

Przygotowano mieszaniny monomerów:

PL 226 113 B1

A - zawierającą 1,5% w/w 75%-owego wodnego roztworu chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego (MADQUAT), 95,5% w/w metakrylanu 2-hydroksyetylu (HEMA) i 3% w/w diakrylanu poli(glikolu etylowego) (PEGDA),

B - 4,0% w/w 75%-owego wodnego roztworu MADQUAT, 93,0% w/w HEMA i 3% w/w PEGDA, C - 14,5% w/w 75%-owego wodnego roztworu MADQUAT, 82,5% w/w HEMA i 3% w/w PEGDA. Do 4 g każdej z przygotowanych mieszanin dodano 6 g sacharozy o rozmiarze ziaren poniżej μm (otrzymane mieszaniny oznaczono jako A1, B1 i C1). Mieszaniny A1, B1 i C1 umieszczono w polipropylenowych pojemnikach i szczelnie zamknięto, tak aby zapobiec dostępowi tlenu i poddano je działaniu promieniowania gamma z izotopu kobaltu ⁶⁰Co stosując dawki 1, 1,5, 2, 6, 12, 25 kGy. Napromienianie prowadzono w temperaturze otoczenia tj. 25°C. Po zakończeniu procesu napromieniania opakowania otworzono, wyjęto wytworzony materiał i poddano analizie metodą żel-zol, w wyniku której oznaczono frakcję żelową, stopień spęcznienia oraz dawkę żelowania. Wyniki badań przedstawiono: na wykresie przedstawionym na fig. 6 rysunku ilustrującym zawartość frakcji żelowej w otrzymanych hydrożelach w funkcji dawki promieniowania, na wykresie przedstawionym na fig. 7 rysunku ilustrującym równowagowy stopień spęcznienia otrzymanych hydrożeli w funkcji dawki promieniowania, w tablicy 1 podającej dawkę żelowania w funkcji dawki promieniowania oraz na fig. A1, B1 i C1 rysunku stanowiących zdjęcia wykonane techniką skaningowej mikroskopii elektronowej, ilustrujące przekroje otrzymanych hydrożeli.

T a b l i c a 1.

Skład	A1	B1	C1
Dawka żelowania [Gy]	400	380	720

Na podstawie wyników analizy żel-zol można stwierdzić, że ilość żelu obecnego w napromienianej mieszaninie jest zależna od dawki pochłoniętej przez układ oraz składu napromienianej mieszaniny i jest równa około 90-95% dla dawek wyższych od 6 kGy. Wraz z rosnącą dawką zmniejszeniu ulega ilość wody jaką zdolny jest pochłonąć wytwarzany hydrożel, co wynika ze wzrastającej gęstości jego usieciowania. Również stosunek wagowy HEMA do MADQUAT wpływa na wartość dawki żelowania - wzrasta ona wraz ze wzrostem zawartości monomeru kationowego w napromienianej mieszaninie. Otrzymane metodą mikroskopii skaningowej obrazy powierzchni zliofilizowanych hydrożeli (fig. A1, B1 i C1) potwierdzają tworzenie się hydrożeli o porowatej strukturze.

P r z y k ł a d II.

Przygotowano mieszaninę o składzie jak mieszanina C w przykładzie I. Do 4 g tej mieszaniny dodano 6 g sacharozy o rozmiarze ziaren pomiędzy 125-250 μm. Otrzymaną mieszaninę C2 umieszczono w polipropylenowym pojemniku i szczelnie zamknięto, tak aby zapobiec dostępowi tlenu, po czym poddano działaniu promieniowania jonizującego w postaci promieniowania gamma z izotopu kobaltu ⁶⁰Co stosując dawki 1,3, 2, 2,3, 4, 7, 30 kGy. Napromienianie prowadzono w temperaturze 25°C. Po zakończeniu procesu napromieniania opakowania otworzono, wyjęto napromieniony materiał i poddano analizie metodą żel-zol, w wyniku której oznaczono ilość frakcji żelowej, równowagowy stopień spęcznienia i dawkę żelowania. Wyniki badań przedstawiono: na wykresie przedstawionym na fig. 8 rysunku ilustrującym zawartość frakcji żelowej w otrzymanym hydrożelu w funkcji dawki promieniowania, na wykresie przedstawionym na fig. 9 rysunku ilustrującym równowagowy stopień spęcznienia otrzymanego hydrożelu w funkcji dawki promieniowania oraz na fig. C2 rysunku stanowiącym zdjęcie wykonane techniką skaningowej mikroskopii elektronowej, ilustrujące przekrój otrzymanego hydrożelu.

Na podstawie analizy żel-zol można stwierdzić, że najmniejsza dawka niezbędna do powstania frakcji żelowej wynosi 1,26 kGy. Ilość żelu obecnego w napromienianej mieszaninie jest zależna od dawki pochłoniętej przez napromieniany układ i jest równa około 90-95% dla dawek wyższych od

7,5 kGy. Wartość dawki żelowania oraz dawki niezbędnej do osiągnięcia 95% frakcji żelowej dla próbki C2 są wyższe niż dla próbki C1. Wynika to z rozmiaru porogenu dodanego do napromienianej mieszaniny monomerów. Wraz z rosnącą dawką pochłoniętą przez napromieniony układ zmianie (zmniejszeniu) ulega ilość wody jaką zdolny jest pochłonąć otrzymany hydrożel, opisywana przez równowagowy stopień spęcznienia. Otrzymany metodą mikroskopii skaningowej obraz powierzchni zliofilizowanego hydrożelu wskazuje na obecność porów wynikających z dodania do napromienianej mieszaniny środka porogennego.

PL 226 113 B1

P r z y k ł a d III.

Przygotowano mieszaninę o składzie jak mieszanina C w przykładzie I. Do 4 g tej mieszaniny dodano 6 g sacharozy o rozmiarze ziaren pomiędzy 125-250 pm. Otrzymaną mieszaninę C3 umieszczono w polipropylenowych pojemnikach i szczelnie zamknięto, tak aby zapobiec dostępowi tlenu, po czym poddano działaniu promieniowania jonizującego w postaci strumienia elektronów z akceleratora, stosując dawki 2,5, 3, 4, 5, 6,5, 7,5, 8, 10, 15, 20, 25 kGy. Napromienianie prowadzono w temperaturze 25°C. Po zakończeniu procesu napromieniania opakowania otworzono, wyjęto napromieniony materiał i poddano analizie metodą żel-zol, w wyniku której oznaczono równowagową ilość frakcji żelowej, stopień spęcznienia, dawkę żelowania oraz stosunek wydajności radiacyjnej degradacji do wydajności radiacyjnej sieciowania. Wyniki badań przedstawiono: na wykresie przedstawionym na fig. 10 rysunku ilustrującym zawartość frakcji żelowej w otrzymanym hydrożelu w funkcji dawki promieniowania oraz na wykresie przedstawionym na fig. 11 rysunku ilustrującym równowagowy stopień spęcznienia otrzymanego hydrożelu w funkcji dawki promieniowania. Na podstawie analizy żel-zol można stwierdzić, że w napromienionej mieszaninie, po zaabsorbowaniu dawki 2,6 kGy, obecny jest żel. Ilość żelu obecnego w napromienianej mieszaninie jest zależna od dawki pochłoniętej przez układ i jest równa około 90-95% dla dawek wyższych od 7,5 kGy. Wraz z rosnącą dawką pochłoniętą przez napromienianą mieszaninę zmianie (zmniejszeniu) ulega ilość wody jaką zdolny jest pochłonąć otrzymany hydrożel, opisywana przez równowagowy stopień spęcznienia. Zastosowanie strumienia elektronów o dużej mocy dawki znacznie zwiększa dawkę żelowania w porównaniu do mieszanin napromienianych promieniowaniem gamma. Wynika to z różnicy w szybkości dawkowania. Uzyskane wyniki potwierdziły możliwość otrzymania porowatych hydrożeli zawierających składnik zwiększający adhezję komórek do rusztowania, poprzez napromieniowanie mieszaniny monomerów, środka sieciującego i porogenu strumieniem wysokoenergetycznych elektronów z akceleratora oraz promieniowaniem gamma z izotopu kobaltu ⁶⁰Co.

P r z y k ł a d IV.

Przeprowadzono hodowlę mysich neuronalnych korowych komórek macierzystych (Chemicon) na kompozycjach C2 i C3. Zgodnie z protokołem hodowli neuronalnych komórek macierzystych dostarczonym przez dystrybutora (Chemicon), wycinki hydrożeli C2 i C3, o średnicy 1 cm i grubości 1 mm, poddano kolejno działaniu roztworów poliornityny oraz lamininy, odpowiednio: o stężeniu 10 pg/ml przez 24 godziny w temperaturze 37°C i o stężeniu 5 pg/ml przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po tym czasie usunięto nadmiar lamininy, wycinki hydrożeli przepłukano 3-krotnie buforem PBS i pozostawiono przez 20 minut w laminarnym strumieniu powietrza. Tak przygotowane hydrożele umieszczono w naczyniu hodowlanym i na ich powierzchnie naniesiono zawiesinę neuronalnych korowych komórek macierzystych w medium hodowlanym. Po 48 godzinach, w trakcie których komórki rozprzestrzeniały się wewnątrz matrycy hydrożelowej, rozpoczęto proces różnicowania poprzez zmianę medium. Próbki hydrożelu poddano analizie spektrofluorometrycznej z wykorzystaniem testu Live/Dead wybarwiając na zielono żywe komórki neuronalne. Zdjęcia przekrojów hydrożelu C2, wykonane z użyciem mikroskopu optycznego, po 4, 12, 29, 37 i 44 dniach po rozpoczęciu procesu różnicowania przedstawiono na fig. 1, 2, 3, 4 i 5 rysunku. Otrzymane zdjęcia potwierdzają przebieg procesu zasiedlania matrycy hydrożelowej - komórki macierzyste wnikają w strukturę hydrożelu, ulegają różnicowaniu i namnażaniu - wzrastająca jasność rejestrowanych obrazów potwierdza wzrost ilości komórek neuronalnych. Zdolności do tworzenia połączeń synaptycznych pomiędzy zróżnicowanymi komórkami dowiodły przeprowadzone badania histopatologiczne. Wyniki przeprowadzonych testów na obecność synaptofizynę i paksyliny oznaczają tworzenie połączeń synaptycznych oraz matrycy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla komórek nauronalnych. Stanowi to potwierdzenie zróżnicowania komórek macierzystych do komórek neuronalnych wewnątrz rusztowań hydrożelowych.

Claims (2)

1. Rusztowanie do trójwymiarowej hodowli komórek neuronalnych otrzymanych poprzez różnicowanie komórek macierzystych, w postaci porowatego hydrożelu, z wykorzystaniem kopolimeru chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego, metakrylanu 2-hydroksyetylu oraz diakrylanu poli(glikolu etylenowego), znamienne tym, że stanowi je kopolimer chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego, metakrylanu 2-hydroksyetylu oraz diakrylanu poli(glikolu etylenowego) zawierający 78-96%, korzystnie 86% w/w poli(metakrylanu 2-hydroksyetylu), do 10%, korzystnie 3% w/w poli(diakrylanu poli(glikolu

PL 226 113 B1 etylenowego)) oraz 1-21%, korzystnie 11% w/w poli(chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego), o porowatości do 70% w/w w stosunku do suchej masy kopolimeru.

2. Sposób wytwarzania rusztowania do trójwymiarowej hodowli komórek neuronalnych otrzymanych poprzez różnicowanie komórek macierzystych, określonego zastrzeżeniem 1, z wykorzystaniem sposobu sporządzenia kopolimeru chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego, metakrylanu 2-hydroksyetylu oraz diakrylanu poli(glikolu etylenowego) na drodze polimeryzacji z użyciem promieniowania jonizującego, znamienny tym, że kopolimer sporządza się w drodze przygotowania mieszaniny metakrylanu 2-hydroksyetylu z diakrylanem poli(glikolu etylowego) jako środkiem sieciującym, chlorkiem metakryloetylotrimetyloamoniowym, korzystnie w postaci roztworu wodnego, oraz porogenem w postaci sacharozy o średnicy ziaren 30-300 pm, zawierającej 75-95%, korzystnie 83% w/w metakrylanu 2-hydroksyetylu, do 10%, korzystnie 3%, w/w diakrylanu poli(glikolu etylowego), 1-20%, korzystnie 11% w/w chlorku metakryloetylotrimetyloamoniowego, do 24% w/v wody oraz porogenu nie więcej niż 70% całej masy mieszaniny, umieszczenia sporządzonej mieszaniny w opakowaniu i poddania jej polimeryzacji i sieciowaniu przy użyciu promieniowania jonizującego w postaci strumienia elektronów z akceleratora lub promieniowania gamma z izotopu kobaltu ⁶⁰Co, w temperaturze pokojowej aż do zaabsorbowania takiej dawki, przy której w układzie pojawi się żel, następnie wyjęcia wytworzonego materiału z opakowania, płukania go w wodzie dejonizowanej i poddania sterylizacji w autoklawie korzystnie w temperaturze 121°C, przy ciśnieniu 0,21 MPa w czasie co najmniej 15 minut.