KR102352313B1

KR102352313B1 - 신경줄기세포 추출물 유래 미백 활성을 갖는 DKK-1 (dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1)에서 유래된 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102352313B1
Application number: KR1020210059421A
Authority: KR
Inventors: 박한규; 권한진; 설기천; 김정옥; 황인식
Original assignee: (주)미래씨티
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2022-01-18

Abstract

본 발명은 신경줄기세포 추출물 유래 미백 활성을 갖는 DKK-1에서 유래된 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, DKK-1에서 유래한 서열번호 1 내지 3으로 표현되는 펩타이드를 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, DKK-1 유래 펩타이드 및 DKK-1 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공함으로써, 멜라닌 생성시 속도조절 단계에서 중요한 역할을 하는 티로시나아제 (tyrosinase)의 활성 (activity)을 억제하고, 멜라닌 생성과 관련된 효소들의 발현을 억제하여 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백에 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다.

Description

신경줄기세포 추출물 유래 미백 활성을 갖는 DKK-1 (dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1)에서 유래된 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물{PEPTIDE DERIVED FROM DKK-1 HAVING WHITENING ACTIVITY DERIVED FROM NEURAL STEM CELL EXTRACT AND COSMETIC COMPOSITION FOR SKIN WHITENING COMPRISING THE PEPTIDE AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 신경줄기세포 추출물 유래 미백 활성을 갖는 DKK-1 (dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1)에서 유래된 펩타이드 및 이를 각각 1종 또는 2종 이상을 복합적으로 함유하여 유효성분으로 하는 미백용 조성물에 관한 것이다.

Dickkorf-1 (DKK-1)은 Wnt/β-catenin 신호전달경로 (signaling pathway)의 길항인자 (inhibitors)로 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다 (The journal of Cell Biology 2004; 165:275-85, FASEB journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 2008; 22:1009-20). Wnt/β-catenin 신호전달경로는 Wnt 리간드가 리셉터에 바인딩(binding)시 β-catenin의 분해가 억제되고, 이후 세포핵 내로 이동하여 타겟 유전자인 MITF (Microphtalamia-associated transcription factor) 발현을 촉진시킨다. 또한 활성화된 MITF는 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제 (tyrosinase) 및 티로시나아제 연관 단백질 (tyrosinase-related proteins) 효소의 발현을 증가시켜 멜라닌 생합성을 조절하게 된다(Molecular and Cellular Biology 2006; 26:8914-27, Oncogene 2003; 19:617-27, Molecular and Cellular Biology 1998; 18:694-702). 그러나, Wnt 리간드가 길항인자 (inhibitors)인 DKK-1에 의해 리셉터에 바인딩하지 못할 경우 인산화(phosphorylation)로 인해 β-catenin은 분해되어 타겟 유전자의 발현도 영향을 받게 된다(The Journal of Investigative Dermatology 2007; 127:1217-25).

본 발명자들은 길항인자 DKK-1 단백질에서 일부 아미노산 서열을 토대로 펩타이드를 개발하였고, 이를 멜라닌세포에 적용하여 멜라닌 생합성이 억제됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 10-1572606 (2015.11.23) 대한민국 등록특허 10-1958207 (2019.03.08) 대한민국 공개특허 10-2016-0011299 (2016.02.01.)

1) Schepsky A et al., The microphthalamia-associated transcription factor Mitf interacts beta-catenin to determine target gene expression, Molecular and Cellular Biology 2006; 26:8914-27 2) Bellei B et al., Wnt/beta-catenin signaling is stimulated by alpha-melanocyte-stimulating hormone in melanoma and melanocyte cells: implication in cell differentiation, Pigment Cell & Melanoma Research 2011; 24:309-25 3) Yasumoto K et al., Microphtalamia-associated transcription factor interacts with LEF-1, a mediator of Wnt signaling, The EMBO Journal 2002; 21:2703-14 4) Widlund HR et al., Microphtalamia-associated trancription factor: a critical regulator of pigment cell development and survival, Oncogene 2003; 22:3035-41 5) Niida A et al., DKK1, a negative regulator of Wnt signaling, is a target of the beta-catenin/TCF pathway, Oncogene 2004; 23:8520-6

본 발명자들은 멜라닌 생성을 억제(저해)하는 3종의 펩타이드를 선별하고, 선별된 펩타이드를 유효성분으로서 각각 1종 또는 2종 이상 복합적으로 함유하는 조성물을 통해 피부 미백 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신경줄기세포 추출물 유래 미백 활성을 갖는 DKK-1 (dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1) 단백질에서 유래된 제1서열, 제2서열 및 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드의 1종 또는 2종 이상을 복합적으로 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물을 제공하여 화장품 원료 개발로 이용하는 것이다. 또한, 본 발명에서 펩타이드는 단백질 형성시 아미노산 잔기들이 결합되어 형성된 선형 분자로서, 그 크기가 피부투과도에 영향을 미친다고 알려져 있기에 크기가 작은 펩타이드를 사용하여 피부투과를 높이고자 하였다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 형태에 따라 신경줄기세포 추출물 유래 미백 활성을 갖는 DKK-1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1)에서 유래한 하기 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 어느 하나로 표현되는 DKK-1 유래 펩타이드를 제공한다.

서열번호 1: Ac-Gly-Ser-His-Gly-Leu-Glu-Ile-Phe-Gln-Arg-Cys-Tyr-OH

서열번호 2: Ac-Asp-His-His-Gln-Ala-Ser-Asn-Ser-Ser-OH

서열번호 3:

Ac-Arg-His-Ala-Met-Cys-Cys-Pro-Gly-Asn-Tyr-Cys-Lys-Asn-OH

바람직하게, 상기 DKK-1 유래 펩타이드는 Wnt/β-catenin 신호전달경로를 억제할 수 있다.

본 발명의 다른 형태에 따라, DKK-1 유래 펩타이드 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

바람직하게, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 제1항의 DKK-1 유래 펩타이드를 0.01%(v/v)-1.5%(v/v)의 양을 함유할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 신경줄기세포 추출물 유래 미백 활성을 갖는 DKK-1에서 유래된 상기 펩타이드 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 표현되는 펩타이드를 하나 이상 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물을 제공함으로써, 멜라닌 생성시 속도조절 단계에서 중요한 역할을 하는 티로시나아제 (tyrosinase)의 활성 (activity)을 억제하고, 멜라닌 생성과 관련된 효소들의 발현을 억제하여 멜라닌 생성을 억제하는 역할을 한다.

따라서 본 발명에서는 DKK-1 단백질과 유사한 또는 동등한 역할을 하는 DKK-1에서 유래된 펩타이드를 함유하는 미백용 조성물을 제공함에 있다.

도 1a 및 도1b는 본 발명에 의한 마우스 B16F10 멜라노마 세포에 각각의 펩타이드를 처리하고 72시간 배양한 후, 세포독성을 확인한 결과이다.
도 2a ~ 도 2c는 본 발명에 의한 마우스 B16F10 멜라노마 세포에 각각의 펩타이드 및 양성대조군으로서 알부틴을 넣고 72시간 배양한 후, 멜라닌 생성 억제 및 티로시나아제 활성 (activity) 억제를 확인한 도면이다.
도 3a 및 도3b는 본 발명에 의한 B16F10 멜라노마 세포에 각각의 펩타이드를 처리하고 72시간 배양한 후, 멜라닌 형성에 관여하는 효소 티로시나아제 (tyrosinase), 티로시나아제-관련 유전자 1 (tyrosinase-related protein 1) 및 티로시나아제-관련 유전자 2 (tyrosinase-related protein 2)의 발현이 억제됨을 유전자 수준 및 단백질 수준에서 확인한 도면이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명에 의한 마우스 B16F10 멜라노마 세포에 펩타이드를 2종 복합군 (각각 25㎍/㎖) 또는 3종 복합군 (각각 25㎍/㎖)으로 처리하고 72시간 배양한 후, 세포독성을 확인한 결과이다.
도 5a ~ 도 5c는 본 발명에 의한 마우스 B16F10 멜라노마 세포에 펩타이드를 2종 복합군 (각각 25㎍/㎖) 또는 3종 복합군 (각각 25㎍/㎖)으로 처리하고 72시간 배양한 후, 멜라닌 생성 억제 및 티로시나아제 활성 (activity) 억제를 확인한 도면이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명에 의한 마우스 B16F10 멜라노마 세포에 펩타이드를 2종 복합군 (각각 25㎍/㎖) 또는 3종 복합군 (각각 25㎍/㎖)으로 처리하고 72시간 배양한 후, 멜라닌 형성에 관여하는 효소 티로시나아제 (tyrosinase), 티로시나아제-관련 유전자 1 (tyrosinase-related protein 1) 및 티로시나아제-관련 유전자 2 (tyrosinase-related protein 2)의 발현이 억제됨을 유전자 수준 및 단백질 수준에서 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명에 의한 마우스 B16F10 멜라노마 세포에 펩타이드를 3종 복합군 (각각 25㎍/㎖)으로 처리하고 72시간 배양한 후, 멜라닌 형성에 관여하는 효소 티로시나아제 (tyrosinase), 티로시나아제-관련 유전자 1 (tyrosinase-related protein 1) 및 티로시나아제-관련 유전자 2 (tyrosinase-related protein 2)의 발현이 억제됨을 면역형광염색을 통해 단백질 수준에서 확인한 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 멜라닌 생성시 속도조절 단계에서 중요한 역할을 하는 티로시나아제 (tyrosinase)의 활성 (activity)을 억제하고, 멜라닌 생성과 관련된 효소 티로시나아제 (tyrosinase), 티로시나아제-관련 유전자 1 (tyrosinase-related protein 1) 및 티로시나아제-관련 유전자 2 (tyrosinase-related protein 2)의 발현을 억제를 통해서 멜라닌 생성을 억제하는 총 3종의 펩타이드로 구성된다.

서열번호 1: Ac-Gly-Ser-His-Gly-Leu-Glu-Ile-Phe-Gln-Arg-Cys-Tyr-OH

서열번호 2: Ac-Asp-His-His-Gln-Ala-Ser-Asn-Ser-Ser-OH

서열번호3:

Ac-Arg-His-Ala-Met-Cys-Cys-Pro-Gly-Asn-Tyr-Cys-Lys-Asn-OH

본 발명은 3종의 펩타이드는 아미노산 일부 부분을 선정하고 그 활성 및 안정성을 증가시키기 위해 C-말단 (C-terminal)에 amidation, AMC, NHS 등으로 변형할 수 있으며, 또한 N-말단 (N-terminal)에 acetylation, formylation, palmytolyl 등으로 변형을 가질 수 있다.

본 발명에서, 멜라닌 생합성은 멜라닌 세포내 멜라노솜 (melanosome) 아미노산 티로신 (tyrosine)은 티로시나아제의 작용으로 도파 (3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변하고, 이어서 도파옥시다아제의 산화작용 또는 티로시나아제-관련 단백질 1 또는 티로시나아제-관련 단백질 2 효소들의 촉매작용으로 도파키논 (DOPAquinone)으로 변화된다. 이후, 일련의 과정을 거치면서 멜라닌이 생합성 된다. 또한, 멜라닌세포에서 멜라닌 생성시 Wnt/β-catenin 신호전달경로 (signaling pathway)가 관여하는데, Wnt 리간드가 리셉터에 바인딩시 β-catenin의 분해가 억제되고, 이후 세포핵 내로 이동하여 타겟 유전자인 MITF (Microphtalamia-associated transcription factor) 발현을 촉진시킨다. 또한 활성화된 MITF는 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제 (tyrosinase) 및 티로시나아제 연관 단백질 (tyrosinase-related proteins) 효소의 발현을 조절하는 조절자(regulator)로 멜라닌 생성을 촉진시키게 된다. 그러나, Wnt 리간드가 길항인자 (inhibitors)인 DKK-1에 의해 리셉터에 바인딩하지 못할 경우 β-catenin은 분해되어 타겟 유전자의 발현을 감소시켜서 멜라닌 생성을 저해하게 된다. 따라서 본 발명에서는 DKK-1와 유사한 또는 동등한 역할을 하는 DKK-1에서 유래된 펩타이드를 통해서 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하고자 한다 (실시예 1 참조).

본 발명의 구체적인 실시 예에서는 마우스 B16F10 멜라노마 세포를 100mm 컬쳐디쉬 (culture dish)에서 유지하고, 계대배양중에 96-웰 플레이트(96 well plate)에 2x10³해당하는 밀도로 시딩하였다. 다음날 비접착성 세포를 제거하고 DKK-1에서 유래된 펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 각각 10, 25, 50㎍/㎖ 농도로 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후에 세포독성(cytotoxicity)을 확인하기 위해 WST-1 (4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate)을 처리하고 30분에서 1시간 반응 시킨 뒤 플레이트 리더기 (plate reader)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정한다. 또한, 세포의 모양 (morphology)을 위상차현미경으로 확인하였다 (도 1a 및 도 1b).

본 발명의 DKK-1에서 유래된 펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3이 멜라닌 생성에 억제효과를 나타내는지를 확인하기 위하여, 마우스 B16F10 멜라노마 세포를 1.5x10⁴ 의 밀도로 24-well 플레이트에 시딩(seeding)하였다. 그 다음날 미디어에 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열 각각을 10, 25, 50㎍/㎖ 농도로 처리 및 양성 대조군으로 알부틴 (200㎍/㎖)을 처리하여 72시간동안 배양하였다. 이후 세포 펠렛(pellet)을 수득하여 멜라닌을 관찰하고, 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나아제 활성을 관찰하였다 (도 2a~2c).

본 발명의 DKK-1에서 유래된 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각을 10, 25, 50㎍/㎖ 농도로 미디어에 처리하여 72시간동안 배양하였다. 이후, 세포를 수득하여 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 티로시나아제 (tyrosinase), 티로시나아제-관련 유전자 1 (tyrosinase-related protein 1, TRP-1) 및 티로시나아제-관련 유전자 2 (tyrosinase-related protein 2, TRP-2)를 RT-PCR과 웨스턴블롯(western blot)을 이용하여 유전자 수준 및 단백질 수준에서 확인하였다 (도 3a 및 도 3b).

본 발명의 DKK-1에서 유래된 펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 각각 의 농도로 적용 하였을때 멜라닌 생성 억제효과가 극대화된 25㎍/㎖ 농도를 선택하였다. 복합적으로 2종 이상 펩타이드를 각각 25㎍/㎖ 농도로 처리하여 72시간동안 배양하였다. 이후 위상차현미경으로 세포 관찰시 2종 이상 복합 처리 펩타이드군에서 독성을 보이지 않는 것을 확인하였고, 이후 세포 펠렛(pellet)을 수득하여 멜라닌 관찰하고, 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나아제 활성을 관찰하였다 (도 4a 및 도 4b).

본 발명의 DKK-1에서 유래된 펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 각각 25㎍/㎖ 농도로 2종 이상 복합적으로 처리한 후 72시간동안 배양하였다. 이후 세포 펠렛을 수득하여 멜라닌 관찰하고, 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나아제 활성을 관찰하였다 (도 5).

본 발명의 DKK-1에서 유래된 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각 25㎍/㎖ 농도로 2종 이상 복합적으로 처리한 후 72시간동안 배양하였다. 이후, 세포를 수득하여 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 티로시나아제 (tyrosinase), 티로시나아제-관련 유전자 1 (tyrosinase-related protein 1, TRP-1) 및 티로시나아제-관련 유전자 2 (tyrosinase-related protein 2, TRP-2)를 RT-PCR과 웨스턴블롯을 이용하여 유전자 수준 및 단백질 수준에서 확인하였다 (도 6a 및 도 6b).

본 발명의 DKK-1에서 유래된 펩타이드 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 각각 25㎍/㎖ 농도로 2종 이상 복합적으로 처리한 후 72시간동안 배양하였다. 이후, 세포를 수득하여 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 티로시나아제 (tyrosinase), 티로시나아제-관련 유전자 1 (tyrosinase-related protein 1) 및 티로시나아제-관련 유전자 2 (tyrosinase-related protein 2)를 면역형광염색을 이용하여 단백질 수준에서 확인하였다 (도 7).

또한, 상기 기본 조성물에는 0.01%(v/v)-1.5%(v/v)의 DKK-1에서 유래된 펩타이드를 각각 1종 내지 2종 이상 바람직하게는 복합적으로 3종을 포함하는 것이며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 마우스 B16F10 멜라노마 세포에 1종 이상의 DKK-1에서 유래된 펩타이드가 첨가된 배지를 이용하여 멜라닌 생성 저해효과를 측정하였다.

본 발명에 있어, DKK-1에서 유래된 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각 1종 또는 2종 이상 바람직하게는 3종의 펩타이드가 복합적으로 포함하는 조성물은 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물로서, 조성물의 제형 및 제품 형태는 어떠한 형태라도 가능하다. 이러한 제형의 예로 상기 조성물을 이용하여 제조된 형태는 화장수류, 크림류, 로션류, 용액, 현탁액, 유탁액, 겔, 파우더, 팩 등 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다. 본 발명의 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 조성물에 통상적으로 이용되는 유분, 보습제, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 성분등 통상적인 보조제 (예; 자외선 차단제 등)를 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명은 미백효과를 나타내는 DKK-11에서 유래된 펩타이드 각각 1종 또는 2종 이상 바람직하게는 복합적으로 3종의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예만 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. DKK1-유래 펩타이드의 합성

제1서열 (MCT-oligopeptide-W1; 제1서열이라 명명), 제2서열 (MCT-oligopeptide-W2; 제2서열이라 명명) 및 제3서열 (MCT-oligopeptide-W3; 제3서열이라 명명)을 갖는 펩타이드 제작을 위해, Rink amide AM resin (GL biochem, 1g 0.4mmol/g)을 반응용기에 넣고, N,N-Dimethylformamide (DMF)를 30ml 넣고 30분간 용매로 부풀렸다. 진공펌프 (vacuum pump)로 용매 제거 후 9-fluoreylmethoxycarbonyl (Fmoc)로 보호된 Rink amide AM resin(1g 0.4mmol/g))을 20% piperidine in DMF(200ml piperidine/ 8000ml DMF)로 Fmoc를 제거하기 위해 30분간 흔들어 주었다. 충분히 흔들어 준 후 DMF로 3회 (3분/1회), dichloromethane (DCM)로 3회 (3분/1회) 세척한 후. 용매를 다 제거한 후에 resin소량을 취하여 카이저테스트（kaiser test)를 이용하여 점검을 하였다. 제1서열의 첫 번째 아미노산인 Fmoc-arg(PBF)-OH 0..80mmol, HoBt 0.80mmol 및 PyBOP 0.80mmol을 넣은 후, 교반하여 잘 용해시켰다. 반응용기에 N,N-Diisopropyl ethylamine (DIPEA) 1.60mmol 넣고 이것을 Fmoc를 제거한 Rink amide AM resin에 가하여 2시간 짝지음(coupling) 반응을 하였다. 반응 후 DMF와 DCM으로 세척한 후 카이저테스를 하여 이용하여 점검한 결과 밝은노란색이 나왔다. 반응이 완료된 Fmoc-arg-Rink amide AM resin의 Fmoc 그룹은 20% piperidine in DMF로 30분간 제거하였다. 그리고 DMF와 DCM으로 세척한 후 카이저테스트로 점검을 하고 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 두 번째 아미노산인 Fmoc-Phe-OH, 세 번째 아미노산인 Fmoc-Cys (TRT)-OH, 네번째 아미노산인Fmoc-Tyr(tBu)-OH, 다섯번째 아미노산인 Fmoc-Ala-OH, 여섯번째 아미노산인 Fmoc-Ala-OH순으로 짝지음 반응을 시켰다. 반응이 완료된 Fmoc-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-Rink made AM resin의 Fmoc 그룹은 20% piperidine in DMF로 30분간 제거하고, DMF와 DCM으로 세척하여 질소 공기를 흘려 건조한후, 탈루용액 (Trifluoro acetic acid (TFA) 8.25ml, 증류수 0.5ml, thioanisole 0.5ml, 1,2-Ethanedithiol (EDT) 0.25ml)을 20ml 넣고 상온에서 흔들어주며 2시간동안 반응시켰다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반정도 남도록 증류하고 50ml의 차가운 에테르를 통해 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2회 반복하여 고형화된 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 칼럼을 이용하여 0.1% trifluoroacetic in 100% aceronitrile/H₂0 농도구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제를 하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 화합물Ac-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-OH 펩타이드 제1서열 4.1mg을 수득하였다 (순도 96.95%).

상기 펩타이드 제1서열 화합물과 동일한 제조방법을 이용하되 Fmoc로 보호된 아미노산의 순서를 달리하여 펩타이드 제2서열 및 제3서열을 합성하였다. 상술한 펩타이드 서열은 하기의 화합물과 같다.

실시예 2. 세포 독성 실험

마우스 B16F10 멜라노마 세포주를 96-웰플레이트(96-well plate)에 웰(well)당 1x10³ 개의 세포를 접종하고, 그 다음날 비접착성 세포를 제거하고 DKK1-유래 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각 10, 25, 50㎍/㎖ 또는 2종 내지 (각각 25㎍/㎖) 또는 3종 (각각 25㎍/㎖)을 복합적으로 처리하고 배양하였다. 72시간 후에 세포의 모양 (morphology) 관찰 및 WST-1 (4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate)을 처리하고 30분에서 1시간 반응 시킨 뒤 플레이트 리더기 (plate reader)를 이용하여450㎚에서 흡광도를 측정한다.

그 결과 도 1a ~ 도 1b에 나타난 바와 같이, 제1서열, 제2서열 및 제3서열 펩타이드에서 50㎍/㎖ 처리군까지는 세포독성이 보이지 않았으며 세포 모양의 변화도 없는 것을 확인하였다. 또한, 도 4a에 나타난 바와 같이 펩타이드 2종 또는 3종 복합처리군에서도 세포 모양의 변화는 없음을 확인하였다.

실시예 3. 펩타이드의 멜라닌 합성 억제 확인

마우스 B16F10 멜라노마 세포주를 24-웰플레이트(24-well plate)에 웰(well)당 1.5x10⁴ 개의 세포를 접종하고, 그 다음날 비접착성 세포를 제거하고 DKK1-유래 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각 10, 25, 50㎍/㎖ 또는 2종 내지 (각각 25㎍/㎖) 또는 3종 (각각 25㎍/㎖)을 복합적으로 처리 및 양성대조군으로 알부틴 (200㎍/㎖)를 각각 처리하였다. 72시간 배양 후 인산화 완충용액 (PBS)으로 씻어준 후, 트립신 (Trypsin-EDTA)로 세포를 수득하였다. 그 결과 도 2a에서와 같이 각각의 펩타이드 서열에서 농도의존적으로 멜라닌 생성 억제효과가 있었으나 특히 각각의 펩타이드 서열 25ug/ml 처리군에서 효과가 극대화됨을 육안으로 확인하였다.

또한, 회수된 세포 펠렛 (pellet)에서 멜라닌 추출을 위해 1N NaOH (50% DMSO를 첨가)을 웰(well)당 100㎕씩 첨가하여 80℃에서 세포를 용해시킨다. 96-웰플레이트(96-well plate)에 용해 시킨 상층액을 각각 옮기고 플레이트 리더기 (plate reader)를 이용하여 492㎚에서 흡광도를 측정한다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 각각의 펩타이드 서열에서 농도의존적으로 멜라닌 생성 억제효과가 있었으나 특히 각각의 펩타이드 서열 25ug/ml 처리군에서 효과가 극대화됨을 육안으로 확인하였다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 효과가 극대화된 펩타이드 (농도 25㎍/㎖)를 각각 2종 내지 또는 3종을 복합적으로 처리하고 배양시 3종의 복합 펩타이드 처리군에서 멜라닌생성 저해 효과가 가장 극대화 됨을 확인하였다.

실시예 4. 티로시나아제 활성 측정

마우스 B16F10 멜라노마 세포주를 24-웰플레이트(24-well plate)에 웰(well)당 1.5x10⁴ 개의 세포를 접종하고, 그 다음날 비접착성 세포를 제거하고 DKK-1에서 유래된 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각 10, 25, 50㎍/㎖ 또는 2종 내지 (각각 25㎍/㎖) 또는 3종 (각각 25㎍/㎖)을 복합적으로 처리 및 양성대조군으로 알부틴 (200㎍/㎖)를 각각 처리하였다. 72시간 배양 후 인산화 완충용액 (PBS)으로 씻어준 후, 트립신 (Trypsin-EDTA)로 세포를 수득하였다. 세포 펠렛 (pellet)에 1% Triton X-100이 함유된 0.1M 인산염완충용액 (sodium phosphate buffer, pH6.8) 100㎕씩 넣고 세포를 1.5ml 튜브에 모아 12000rpm에서 20분간 원심분리 후 상층액을 모았다. 이후, 96-웰플레이트(96-well plate)에 0.1M 인산염완충용액 (sodium phosphate buffer, pH6.8) 80㎕와 각각의 상층액 (세포 추출물)을 40㎕를 넣고 1500U 버섯 티로시나아제 (mushroom tyrosinase) 40㎕를 차례대로 넣고 이 용액에 10mM L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine)용액을 40㎕ 첨가하고 37℃에서 반응시키고 플레이트 리더기 (plate reader)를 이용하여 492㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 2c에 나타난 바와 같이, 각각의 펩타이드 서열에서 농도의존적으로 티로시나아제 활성이 억제됨을 확인하였고, 특히 각각의 펩타이드 서열 25ug/ml 처리군에서 효과가 극대화됨을 육안으로 확인하였다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이 효과가 극대화된 펩타이드 (농도 25㎍/㎖)를 각각 2종 내지 또는 3종을 복합적으로 처리하고 배양시 3종의 복합 펩타이드 처리군에서 티로시나아제 활성 저해 효과가 가장 극대화 됨을 확인하였다.

실시예 5. RT-PCR을 통해 멜라닌 합성에 관여하는 유전자 발현 확인

마우스 B16F10 멜라노마 세포주를 24-웰플레이트(24-well plate)에 웰(well)당 1.5x10⁴ 개의 세포를 접종하고, 그 다음날 비접착성 세포를 제거하고 DKK1-유래 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각 10, 25, 50㎍/㎖ 또는 2종 내지 (각각 25㎍/㎖) 또는 3종 (각각 25㎍/㎖)을 복합적으로 처리하였다. 72시간 배양 후 인산화 완충용액 (PBS)으로 씻어준 후, 트리졸 (Trizol reagent)를 이용ㅎ여 RNA (total RNA)를 얻고 역전사효소를 이용하여 cDNA를 제작하였다. 멜라닌 형성에 관여하는 효소 티로시나아제 (tyrosinase), 티로시나아제-관련 유전자 1 (tyrosinase-related protein 1) 및 티로시나아제-관련 유전자 2 (tyrosinase-related protein 2)를 각각의 프라이머(primer)를 이용하여 RT-PCR하고, 각각 유전자의 발현을 관찰하였다.

그 결과 도 3a에서 나타난 바와 같이 각각의 펩타이드 서열 25ug/ml 처리군에서 3가지 유전자의 발현이 가장 크게 억제됨을 확인하였다. 또한, 도 6a에서와 같이 효과가 극대화된 펩타이드 (농도 25㎍/㎖)를 각각 2종 내지 또는 3종을 복합적으로 처리하고 배양시에는 3종의 복합 펩타이드 처리군에서 멜라닌 생성에 관여하는 3가지 효소의 유전자 발현 억제 효과가 각각 1개의 펩타이드 적용시보다 더 크게 억제됨을 유전자 수준에서 확인하였다.

실시예 6. 웨스턴블롯 (Western-blot)과 면역형광염색 (immunocytochemistry)을 통해 멜라닌 합성에 관여하는 유전자들 발현 확인

실시예 3와 실시예 5에서의 펩타이드 제1서열, 제2서열 및 제3서열을 각각 10, 25, 50㎍/㎖ 또는 2종 내지 (각각 25㎍/㎖) 또는 3종 (각각 25㎍/㎖)을 복합적으로 처리을 처리하였다. 72시간 처리 후 세포를 수득하고, 프로테아제 억제제(protease inhibitor)를 넣은 50μl의 RIPA buffer 넣고, 15분동안 반응시켰다. 세포 lysate를 원심분리기 (13,000g, 4℃)로 10분간 원심분리하고 상층액(supernatant)을 얻은 후에 단백질농도를 Bradford protein assay로 측정을 하였다. 동량의 단백질(30㎍)을 웨스턴블롯으로 분석을 수행하였다. 또한 세포를 4% 포름알데히드(formaldehyde)에 상온에서 30분동안 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 5분동안 처리하고 정상당나귀혈청(nomal donkey serum)으로 10분간 블록킹(blocking)을 거치고 1차 항체를 각각 1:300으로 24시간 처리하였다. 이후 Alexa-488 2차 항체를 상온에서 1시간 처리하고 이후 DAPI염색을 5분간 진행하였다. 슬라이드에 마운팅제 (vectashield mounting medium)를 이용하여 고정시키고 공초점현미경 (confocal microscope)으로 결과를 확인하였다.

그 결과 도 3b에 나타난 바와 같이, 각각의 펩타이드 서열 25ug/ml 처리군에서 효과가 극대화됨을 확인하였다. 특히 도 6b에서와 같이 효과가 극대화된 펩타이드 (농도 25㎍/㎖)를 각각 2종 내지 또는 3종을 복합적으로 처리하고 배양시 3종의 복합 펩타이드 처리군에서 멜라닌 생성에 관여하는 3가지 유전자의 발현 억제 효과가 가장 극대화 됨을 단백질 수준에서 확인하였다. 또한, 도 7에서와 같이 3종의 복합 펩타이드 처리군에서 면역형광염색을 진행한 결과에서도 동일하게 확인되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Mirae CT Co.,Ltd <120> PEPTIDE DERIVED FROM DKK-1 HAVING WHITENING ACTIVITY DERIVED FROM NEURAL STEM CELL EXTRACT AND COSMETIC COMPOSITION FOR SKIN WHITENING COMPRISING THE PEPTIDE AS ACTIVE INGREDIENT <130> P21-E125 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Gly Ser His Gly Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Asp His His Gln Ala Ser Asn Ser Ser 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Arg His Ala Met Cys Cys Pro Gly Asn Tyr Cys Lys Asn 1 5 10

Claims

신경줄기세포 추출물 유래 DKK-1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1)에서 유래한 하기 서열번호 1 내지 3의 펩타이드를 모두 포함하는 조성물:
서열번호 1: Ac-Gly-Ser-His-Gly-Leu-Glu-Ile-Phe-Gln-Arg-Cys-Tyr-OH
서열번호 2: Ac-Asp-His-His-Gln-Ala-Ser-Asn-Ser-Ser-OH
서열번호 3: Ac-Arg-His-Ala-Met-Cys-Cys-Pro-Gly-Asn-Tyr-Cys-Lys-Asn-OH
제1항에 있어서,
상기 DKK-1 유래 펩타이드는 Wnt/β-catenin 신호전달경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 피부 미백용 화장료 조성물은 제1항의 DKK-1 유래 펩타이드를 0.01%(v/v)-1.5%(v/v)의 양을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.