KR102349029B1 - 자극 반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 블럭 공중합체, 이의 고분자 브러쉬, 이의 초분자 자가조립 나노구조체, 이의 제조 방법 및 이의 응용 - Google Patents

자극 반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 블럭 공중합체, 이의 고분자 브러쉬, 이의 초분자 자가조립 나노구조체, 이의 제조 방법 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자극 반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 블럭 공중합체, 이의 고분자 브러쉬, 이의 초분자 자가조립 나노구조체, 이의 제조 방법 및 이의 응용에 관한 것으로, 본 발명의 자극 반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 블럭 공중합체와 이의 고분자 브러쉬를 이용하면, 온도 자극에 따라 가역적인 변화가 가능한, 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀과 고분자 전해질 복합체 베지클을 형성할 수 있다. 본 발명의 상기 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀과 고분자 전해질 복합체 베지클은 pH 민감성 약물 전달체로 활용될 수 있다.

Description

자극 반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 블럭 공중합체, 이의 고분자 브러쉬, 이의 초분자 자가조립 나노구조체, 이의 제조 방법 및 이의 응용 {Amphiphilic norbornene-based block copolymers and their molecular brushes with stimuli-responsiveness, their supramolecularly self-assembled nanostructures, and their preparation method and use thereof}
본 발명은 자극 반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 블럭 공중합체, 이의 고분자 브러쉬, 이의 초분자 자가조립 나노구조체, 이의 제조 방법 및 이의 응용에 관한 것이다.
선형 주쇄와 빽빽하게 그래프트된 고분자 곁사슬로 구성된 고분자 브러쉬는 주쇄에 부착되는 다양한 종류의 곁사슬을 선택하거나, 그래프팅 밀도와 주쇄 및 곁사슬의 사슬 길이를 조절함으로써 그들의 화학적 조성과 자가조립성이 조절될 수 있기 때문에 큰 관심을 받아왔다. 곁사슬이 충분한 밀도로 그래프트되어 발생한 입체 반발력(steric repulsion)은 선형 블럭 공중합체(linear block copolymers)와 달리 중합체의 확장된 형태를 유도했다. 고분자 브러쉬는 실린더 형태나 곤충과 같은 독특한 고분자 구조를 갖기 때문에 무기입자(inorganic prticles), 광자결정(photonic crystals), 전자재료(electronic materials), 및 약물 전달체(drug delivery carriers)와 같은 많은 분야에 응용될 수 있는 잠재력이 있다. 또한, 고분자 브러쉬는 마이셀, 베지클, 및 다른 용액 내 거대 구조물을 포함한 초분자 나노구조체의 빌딩 블럭으로 사용될 수 있다(Fenyves, R. et al, Journal of the American Chemical Society 2014, 136 (21), 7762-7770).
고분자 브러쉬의 합성은 하기 세 개의 그래프트 단계를 통해 이루어진다; (1) grafting-from, (2) grafting-to, (3) grafting-through. 이 중, Grafting-from 방법은 초기 기능을 포함하는 중합체 주쇄로부터 나온 단량체의 중합으로 시작된다. 이 방법으로 상대적으로 높은 분자량을 갖는 고분자 브러쉬가 합성될 수 있으며, 작용기의 보호/탈보호(protection/deprotection)와 같은 복잡한 합성 과정에 대해서는 추가적인 단계가 필수적이다. Grafting-to 방법은 기능적인 중합체 주쇄와 곁사슬 각각에 대한 준비와 이후 이어지는 그들 간의 커플링 반응(Couling reaction)을 포함한다. 그러나, 인접한 곁사슬 간의 입체적 상호작용은 곁사슬의 충분한 결합(incorporation)을 위해 그래프트 과정을 제한한다. 반면, Grafting-through 방법은 거대단량체로서 반응성이 높은 고분자 곁사슬의 순차적인 중합에 의해 준비된 고분자 브러쉬의 그래프팅 밀도를 최대화하도록 이끈다. 거대단량체는 먼저 원자 이동 라디칼 중합법(atom transfer radical polymerization, ATRP), 나이트록사이드 매개 라디칼 중합법(nitroxide mediated radical polymerization, NMRP) 및 가역적 첨가-단편화 사슬 이동(reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT) 중합법과 같은 세 가지 주요한 활성 라디칼 중합법에 의해 준비된다. 거대단량체는 그후 최종적인 고분자 브러쉬에 도달하는 추가적인 중합반응에 의해 중합된다. 특히, 노보넨 기반 거대단량체(norbornene-based macromonomers)의 고리 열림 복분해 중합법(ring-opening metathesis polymerization, ROMP)은 grafting-through 방법에서 널리 사용되었는데, 이는 Grubbs 촉매와 거대단량체의 상대적 비율을 바꿈으로써 중합체 주쇄의 길이가 쉽게 조절될 수 있기 때문이다. 뿐만 아니라, 여러 종류의 곁사슬을 가진 고분자 브러쉬는 블럭 공중합체, 랜덤(random), 및 코어-쉘(core-shell) 형태를 형성하기 위해 두 개 이상의 단량체 단위가 결합됨으로써 합성될 수 있다.
선형 블럭 공중합체, 별 형상 중합체, 및 고분자 브러쉬와 같은 거대고분자 구조는 그들의 화학, 부피비, 및 각 블럭의 소수성/친수성에 따른 분자내 상호작용을 통해 자가조립 나노구조체를 형성할 수 있다. 그 중에서, 곁사슬로 선형의 양친성 블럭 공중합체를 가지는 고분자 브러쉬는 다양한 용액 내에서 자가조립되어 베지클 또는 실린더 형태의 마이셀을 형성할 수 있다. 이들의 나노구조체는 약물 캡슐화와 전달자(delivery vehicles)로 이용되기 위해 주쇄와 곁사슬 내 작용기를 바꾼다는 점에서 특히 약물 전달 응용분야에서 유용하다. 구체적으로, 매우 확장된 형태인 실린더 형태의 마이셀은 곁사슬간의 입체 반발력 때문에 형성될 수 있으며, 주쇄를 확장시키고, 얽힘(Entanglements)의 밀도를 감소시킨다. 그들의 실린더 형태는 계면 안정화(interfacial stabilization)의 효율성 증가, 더 높은 약제 부하(drug loadings), 보유량 및 세포내 흡수 증가와 같은 여러 장점을 가지고 있다. 고분자 브러쉬가 선형 블럭 공중합체보다 임계 마이셀 농도(critical micelle concentration)가 더 낮기 때문에, 고분자 브러쉬는 묽은 농도 조건을 요구하는 생리학적 환경 하에서 탐지, 감지 및 약물 방출을 포함하여 잠재적으로 응용분야가 상당하다. 더욱이, 그들의 자가조립 나노구조체는 상반된 전하를 가진 공중합체 사이에서 고분자 전해질 착물화를 통해 안정화될 수 있으므로, 바이오 의학분야에서 유용하게 활용될 것이다.
최근, 자극 반응성 고분자 브러쉬(molecular brushes with stimuli-responsiveness)는, 그들의 자가조립성이 외부 자극에 반응하는 자극 반응성 공중합체 사슬의 부피 상전이에 크게 영향을 받아서 치료 약물의 캡슐화와 약물의 조절된 방출을 가능하게 하기 때문에, 매우 큰 관심을 받고 있다. 용매, pH, 빛, 그리고 온도와 같은 외부요인에 의한 작은 환경적 변화는 고분자 사슬의 형태나 마이셀이나 베지클로의 가역적인 자가 형태 전이(self-shape transitions)와 같은 특정 성질을 바꿀 수 있다. 자극 반응성 중합체가 고분자 브러쉬의 곁사슬로서 소개되었을 때, 고분자 브러쉬는 자극에 따른 가역적인 탈수/수화반응을 통해 형태 변화를 유도함으로써 자극 반응성을 갖게 된다. 보고된 바와 같이, 열에 민감하고 자외선 교차결합가능한(UV-crosslinkable) 헤테로-그래프트 고분자 브러쉬(hetero-grafted molecular brushes)는 온도 변화에 대응하여 수용액 조건에서 벌레 형태(worm-like form)에서 구형으로 전이한다고 알려져 있다. 전이 온도 이상인 경우, 친수성 블럭은 분자내 상호작용을 방지하면서 주쇄에 있는 열에 민감한 곁사슬을 안정화했고, 그에 따라 약물 전달, 감지 및 표면과학(surface science)에 있어 자극 반응성 연질재료(stimuli-responsive soft materials)로서 유용한 '벌레 형태의 마이셀 (worm-like micelle)에서 구형의 마이셀(spherical micelle)로의 가역적인 형태전이'를 유도했다. 따라서, 선형 양친성 블럭 공중합체와 '자극 반응성이 있고, 상반된 전하를 띠는 고분자 브러쉬'간의 자가조립 나노구조체는 초분자 상호작용을 통해 형성되고, 수용액 환경에서 고분자 전해질 착물화에 의해 안정되므로, 첨단 약물 전달체로서 유용하다.
본 발명의 목적은 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체와 이의 고분자 브러쉬, 이의 초분자 자가조립 나노구조체, 이들의 제조방법과, 이들의 용도를 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 i) 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭; ii) 자극반응성 고분자 블럭; 및 iii) 전하성 고분자 블럭으로 구성된, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 주쇄인 폴리노보넨; 및 상기 주쇄에 결합된 곁사슬인 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체로 구성된, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자 브러쉬를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 전하성 고분자 블럭은 양전하성 고분자 블럭 또는 음전하성 블럭인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 소수성 고분자 블럭은 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methymethacrylate)), 폴리N-터트부틸아크릴아마이드(poly(N-tert-butylacrylamide)) 및 폴리옥타데실아크릴아마이드 (B-poly(N-octadecylacrylamide) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로, 상기 자극반응성 고분자 블럭은, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide)], 폴리(N-디에틸 아크릴아마이드)[poly (N,N'-diethyl acrylamide)], 폴리(N-하이드록시메틸 프로필 메타아크릴아마이드)[poly (N-(L)-(1-hydroxymethyl) propyl methacrylamide)], 폴리[올리고(에틸렌글리콜)메틸에테르메타크릴레이트] [Poly[oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate]], 폴리(2-비닐 피리딘)[poly(2-vinyl pyridine)], 및 폴리(4-비닐 피리딘) [poly(4-vinyl pyridine)] 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로, 상기 양전하성 고분자 블럭은 2-디메틸아미노에틸메타크릴레이트(2-(dimethyl amino)ethylmethacrylate), 알릴아민(allylamine), 에틸렌이민(ethyleneimine), 비닐아민(vinyl amine), 2-비닐피리딘(2-vinyl pyridine), 및 4-비닐피리딘(4-vinyl pyridine) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것이고, 상기 음전하성 고분자 블럭은 아크릴릭 액시드(acrylic acid), 메타크릴릭 액시드 (metacrylic acid), 이타코닉 액시드(itaconic acid), 및 말레익 액시드(maleic acid) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체가 자가조립되어 형성되고; 소수성 고분자 블럭이 코어(core)를, 자극반응성 고분자 블럭 및 전하성 고분자 블럭이 쉘(shell)을 구성하는 구형 마이셀 나노구조체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자브러쉬가 자가조립되어 형성되고; 소수성 고분자 블럭이 코어(core)를, 자극반응성 고분자 블럭 및 전하성 고분자 블럭이 쉘(shell)을 구성하는 실린더형 마이셀 나노구조체를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 나노구조체는 동일한 전하성 고분자 블럭끼리 결합되어 자가조립된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, i) 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭; ii) 자극반응성 고분자 블럭; 및 iii) 양전하성 고분자 블럭으로 구성된, 자극반응성 및 양전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 선형 블럭 공중합체와;
i) 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭; ii) 자극반응성 고분자 블럭; 및 iii) 음전하성 고분자 블럭으로 구성된, 자극반응성 및 음전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 선형 블럭 공중합체를 혼합하여 전해질 복합체를 형성함으로써 제조된, 고분자 전해질 복합체 베지클을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 베지클을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
본 발명은 또한, 주쇄인 폴리노보넨; 및 상기 주쇄에 결합된 곁사슬인 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-양전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체로 구성된, 자극반응성 및 양전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 고분자브러쉬와,
주쇄인 폴리노보넨; 및 상기 주쇄에 결합된 곁사슬인 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-음전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체로 구성된, 자극반응성 및 음전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 고분자브러쉬를 혼합하여 전해질 복합체를 형성함으로써 제조된, 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀을 제공한다.
본 발명은 또한, 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀을 포함하는, 약물 전달체를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 약물 전달체는 pH 민감성인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, ROMP (ring-opening metathesis polymerization) 활성이 있고 노보넨 작용기로 기능화된 RAFT 연쇄이동반응제와 소수성 분자를 이용하여 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭을 제조하는 단계;
상기 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭에, 자극반응성 분자 및 개시제를 첨가하고 중합을 진행하여 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭-자극반응성 블럭의 이중블럭 공중합체를 제조하는 단계; 및
상기 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭-자극반응성 블럭의 이중블럭 공중합체에, 전하성 분자를 첨가하여, 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭-자극반응성 블럭-전하성 블럭으로 구성된 선형 블럭 공중합체를 제조하는 단계;를 포함하는, 자극반응성을 가지는 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 선형 블럭 공중합체를 제조하는 단계에서, 상기 노보넨기가 링 오프닝 되면서 중합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체를 준비하는 단계; 및
상기 선형 삼중블럭 공중합체에 3세대 Grubbs 촉매를 첨가하고 ROMP(ring-opening metathesis polymerization)를 통해 폴리노보넨을 주쇄로, 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-전하성 고분자 블럭으로 구성된 삼중블럭 공중합체를 곁사슬로 가지는 고분자 브러쉬를 제조하는 단계;를 포함하는, 고분자 브러쉬 제조방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명은 노보넨 기반 양친성 블럭 공중합체와, 상기 공중합체로 구성된 고분자 브러쉬에 대한 것으로, 상기 공중합체와 고분자 브러쉬는 자가조립되어 마이셀 나노구조체로 형성되고, 상기 마이셀 구조체가 베지클을 형성하거나, 상기 공중합체 및 고분자 브러쉬가 전해질 복합체를 형성하여 베지클을 형성한다. 상기 베지클은 pH 민감성 약물전달체로서 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 공중합체와 상기 공중합체들의 자가조립체로부터 나노 구조체로 형성되는 과정을 나타낸 것으로, 도 1a는 수용액 상태에서 비공유 결합을 통해 선형 양친성 블럭 공중합체와 그들의 자가조립체로부터 ROMP에 의해 양전하(또는 음전하)와 자극반응성을 가지는 두 가지 종류의 고분자 브러쉬 합성방법을 나타낸 것으로, 두 종류의 고분자 브러쉬, PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)는 전하를 띠고, 열 반응성이 있고, 소수성인 블럭으로 구성되었으며, 선형 양친성 블럭 공중합체로부터 ROMP에 의해 형성되는 것을 나타낸 것이다. 상기 거대단량체인 선형 양친성 블럭 공중합체, NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc와 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA는 RAFT 중합법에 의해 제조된 것으로, TEM 이미지는 구형(Ⅰ)/실린더(Ⅱ) 형태의 마이셀로부터 베지클로의 나노구조의 변형을 100nm(위 이미지), 500nm(아래 이미지)의 크기로 보여준다.
도 1b는 상반된 전하를 가진 양친성 블럭 공중합체로부터 고분자 전해질 착물(PEC)의 베지클를 제조하는 것을 나타낸 것이다.
도 1c는 상반된 전하를 가진 고분자 브러쉬로부터 고분자 전해질 착물(PEC)의 실린더 형태의 마이셀을 제조한 것을 나타낸 것이다. TEM 이미지는 PEC 베지클과 실린더 형태의 마이셀을 1μm(위 이미지), 100nm(아래 이미지)의 크기로 보여준다.
도 2는 (a) 노보넨 기능화된 NB-CDTPA와 (b) 순차적 RAFT 중합법과 ROMP의 조합을 통해 (-)으로 하전된 또는 (+)으로 하전된 고분자 브러쉬를 제조한 과정을 나타낸 것으로, PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)의 합성을 위한 반응식을 도시하였고, 상기 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)는 PtBA 블럭의 가수분해로 제조된 것을 나타낸다.
도 3은 (a) NB-PS, NB-PS-b-PNIPAM, NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA 와 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA의 GPC 분석 결과, (b) NB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PtBA)와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)의 GPC 분석 결과, (c) NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA의 1H NMR 스펙트럼, (d) NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로, GPC는 유체상태에서 THF를 이용하여 수행되었으며, 모든 1H NMR 스펙트럼은 CDCl3에서 측정되었다.
도 4는 (a) 온도의 변화에 따른 pH 7.4, 10mM PBS에서 선형 양친성 블럭 공중합체와 그들의 고분자 브러쉬의 UV-Vis 흡수 스펙트럼, (b) 선형 양친성 블럭 공중합체의 열전이 거동, (c) 상기 고분자 브러쉬의 열 전이 거동을 나타낸 것이고(25℃, 37℃에서 유체역학적 반경을 측정), (d-ⅰ) NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc와 (e-ⅰ) NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA의 25℃에서 구형 코어-쉘 마이셀의 TEM 이미지, (d-ⅱ) NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc와 (e-ⅱ) NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA의 37℃에서 열 유도 변형 이후 베지클 나노구조체의 TEM 이미지, (f-ⅰ, f-ⅱ) PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)와 (g-ⅰ, g-ⅱ) PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)의 실린더 형태의 마이셀과 베지클의 TEM 이미지((f-ⅰ, g-ⅰ)는 25℃, (f-ⅱ, g-ⅱ)는 37℃를 나타낸 것으로, (d-ⅰ, e-ⅰ)는 20nm, (d-ⅱ, e-ⅱ)는 200nm, (f-, g-)는 100nm, (f-, g-)는 500nm와 100nm의 크기로 삽입되었다.
도 5는 온도의 변화에 따른 pH7.4, 10mM PBS에서 선형 양친성 블럭 공중합체와 고분자 브러쉬의 (a) UV -Vis 흡수 스펙트럼 (b) PEC의 유체역학적 반경을 나타낸 것으로, DLS는 25℃와 37℃에서 PEC 베지클과 실린더 형태의 마이셀의 평균 크기를 결정하는데 사용되었다. 상기 두개의 다른 선형 양친성 블럭 공중합체와 고분자 브러쉬를 각각 혼합하여 형성된 (c) PEC 베지클과 (d) 실린더 형태의 마이셀의 TEM 이미지를 나타내었다. 상기 TEM 이미지에서 (c) 1 μm, (d) 50nm와 내부사진은 100nm의 크기로 삽입되었다. (e)는 25℃, PBS에서 NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc 와 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA의 로다민 b-컨쥬게이션된 PEC 베지클의 여러 배율의 CLSM 이미지를 나타낸 것으로, (i) 8 μm, (ii) 4 μm, (iii) 2 μm의 크기로 삽입되었다.
도 6은 (a) BMPH가교제를 사용하여 독소루비신에 공중합체 내 말단 티올기를 결합하는 반응식을 나타낸 것으로, 산에 의해 유발되는 히드라존 링커의 분해에 따른 (b) PEC 베지클과 (c) 실린더 형태의 마이셀로부터 독소루비신 방출법을 보여준다. (d) PEC 베지클과 (f) 실린더 형태의 마이셀로부터 pH5.6과 7.4일 때 10mM 인산 완충액에서 시간, pH 의존적인 독소루비신 방출 프로파일을 나타내었다.
도 7은 (a) NB-C3OH, (b) NB-CDTPA, (c) NB-PS, (d) NB-PS-b-PNIPAM, (e) PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc) 및 (f) PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로, CDCl3에서 측정되었다.
도 8은 티올-말단의 (a)NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc, (b) PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc), (c) NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA 및 (d) PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA) 합성을 위한 반응식을 나타낸 것으로, PtBA 블럭은 양 공중합체로부터 PAAc 블럭을 얻기 위해 TFA에 의해 가수분해되었다.
본 발명은 양친성 블럭 공중합체의 자가조립과, 상반된 전하를 띠는 그들의 고분자 곁사슬, 그리고 분자간, 분자 내 상호작용을 통한 자극 반응성을 이용하여 약물 전달과 같은 응용 분야에서 유용하게 사용될 수 있는 나노 구조체를 제공하는 것이다.
본 발명에서 거대단량체(macromonomers)로서 선형 양친성 블럭 공중합체는 전하를 띠고, 열에 반응하며, 소수성인 블럭과 노보넨 말단기로 구성되며, 순차적이고 가역적인 첨가-단편화 사슬 이동(addition-fragmentation chain transfer, RAFT) 중합법에 의해 합성되었고, 수용액 상태에서 구형 마이셀(Micelles)로 자가조립되었다.
또한, 그들의 고분자 브러쉬는 주쇄인 폴리(노보넨) 블럭과 곁사슬인 양친성 블럭 공중합체로 구성되며, 고리 열림 복분해 중합법(Ring-opening metathesis polymerization, ROMP)에 의해 합성되었고, 실린더 형태의 마이셀(Cylindrical micelle)로 자가조립되었다. 선형 양친성 블럭 공중합체와 그들의 고분자 브러쉬의 이러한 자가조립 나노구조체(Self-assembled nanostructures)는 물리화학적 성질의 명확한 차이에 기인한 초분자 상호작용을 통해 상이한 형태를 나타냈다. 더욱이, 그들은 온도에 반응하여 공중합체의 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)(poly(N-isopropylacrylamide)) 블럭의 열적으로 유도된 형태학적 변화를 통한 베지클(vesicles)로의 열 유도 변형 거동(Thermal-induced transformation behavior)을 보여주었다. 상반된 전하를 띠는 양친성 블럭 공중합체 또는 고분자 브러쉬가 정전기적 상호작용을 통해 혼합되면, 그들은 각각 실린더 형태의 마이셀과 베지클을 형성하는 것이 확인되었다.
이러한 나노구조체가 고분자 전해질 착물화(polyelectrolyte complexation)에 의해 안정될 때, 그들은 약물 전달체(Drug delivery carriers)로 사용될 수 있고, 나노구조체의 형태와 산분해성 링커(acid-labile linker)의 절단을 위한 용액의 pH에 따라 상이한 약물 방출 동역학(Drug release kinetics)이 관찰되었다. 결론적으로, 본 발명에서 제공하는 상반된 전하를 띠는 양친성 블럭 공중합체와 그들의 고분자 브러쉬는 기능성 나노물질로서 유용한 활용 가능성을 가지는 빌딩 블럭(building block)의 역할을 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명은 i) 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭; ii) 자극반응성 고분자 블럭; 및 iii) 전하성 고분자 블럭으로 구성된, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 주쇄인 폴리노보넨; 및 상기 주쇄에 결합된 곁사슬인 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-전하성 고분자 블럭으로 구성된, 선형 삼중블럭 공중합체로 구성된, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자 브러쉬를 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 "고분자 브러쉬"란 주 사슬을 중심으로 여러 고분자체가 부착된 형태의 고분자로서, 곁가지의 밀도가 높으며, 분포가 균일한 특징을 가진 고분자를 의미한다.
본 발명에서 전하성 고분자 블럭은 양전하성 고분자 블럭 또는 음전하성 고분자 블럭일 수 있다. 본 발명의 삼중블럭 공중합체와 고분자 브러쉬는, 상기와 같이 양전하성 고분자 블럭과 음전하성 고분자 블럭이, 동일한 전하를 갖는 블럭끼리만 결합하여 정전기적 상호작용에 의해 소수성 고분자가 코어를, 자극반응성 고분자 블럭 및 전하성 고분자 블럭이 쉘(shell)을 구성하여 마이셀을 형성하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 소수성 고분자 블럭은 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methymethacrylate)), 폴리N-터트부틸아크릴아마이드(poly(N-tert-butylacrylamide)) 및 폴리옥타데실아크릴아마이드 (B-poly(N-octadecylacrylamide) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것일 수 있으나, 소수성을 갖는 고분자 단량체라면 이에 제한되지 않고 사용 가능하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "자극 반응성 고분자 블럭"은 자극에 반응하여 그 특성이 변화되는 구획으로서, 상기 자극은 바람직하게 온도 또는 산화-환원 조건이며, 자극에 의해 변화되는 특성은 온도에 의한 겔화 (gelatioin) 또는 기계적 강도의 변화, 환원 조건하에서의 분해를 의미한다. 즉, 하한 임계 온도(LCST) 이상의 조건에서 수축 또는 파괴되어 공중합체의 구조 및 고분자브러쉬의 특성을 변화시킬 수 있다. 본 발명에서 상기 자극반응성 고분자 블럭은, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide)], 폴리(N-디에틸 아크릴아마이드)[poly (N,N'-diethyl acrylamide)], 폴리(N-하이드록시메틸 프로필 메타아크릴아마이드)[poly (N-(L)-(1-hydroxymethyl) propyl methacrylamide)], 폴리[올리고(에틸렌글리콜)메틸에테르메타크릴레이트] [Poly[oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate]], 폴리(2-비닐 피리딘)[poly(2-vinyl pyridine)], 및 폴리(4-비닐 피리딘) [poly(4-vinyl pyridine)] 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 양전하성 고분자 블럭은 2-디메틸아미노에틸메타크릴레이트(2-(dimethyl amino)ethylmethacrylate), 알릴아민(allylamine), 에틸렌이민(ethyleneimine), 비닐아민(vinyl amine), 2-비닐피리딘(2-vinyl pyridine), 및 4-비닐피리딘(4-vinyl pyridine) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것이고, 상기 음전하성 고분자 블럭은 아크릴릭 액시드(acrylic acid), 메타크릴릭 액시드 (metacrylic acid), 이타코닉 액시드(itaconic acid), 및 말레익 액시드(maleic acid) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것일 수 있다.
이에 본 발명은 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체가 자가조립되어 형성되고; 소수성 고분자 블럭이 코어(core)를, 자극반응성 고분자 블럭 및 전하성 고분자 블럭이 쉘(shell)을 구성하는 구형 마이셀 나노구조체를 제공할 수 있고, 상기 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자브러쉬가 자가조립되어 형성되고; 소수성 고분자 블럭이 코어(core)를, 자극반응성 고분자 블럭 및 전하성 고분자 블럭이 쉘(shell)을 구성하는 실린더형 마이셀 나노구조체를 제공할 수 있다.
상기 구형 마이셀은, 온도가 하한임계온도(lower critical solution temperature: LCST) 이상에서 자극반응성 고분자 블럭이 친수성에서 소수성으로 변화하면서 소수성 고분자 블럭의 비율이 높아져서 소수성 특징이 강화되어 구조가 변하여 베지클을 형성할 수 있고, 상기 실린더형 마이셀 역시, 온도가 하한임계온도 이상이 되면 주쇄인 폴리노보넨이 유연해지고 자극반응성 고분자 블럭이 친수성에서 소수성으로 변화하면서 소수성 특징이 강화되어 구조가 변하여 베지클을 형성할 수 있다. 상기 하한 임계 용액 온도는 바람직하게 체내 온도 부근일 수 있으며, 예시적으로 32 내지 37℃일 수 있다.
이에 본 발명은 i) 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭; ii) 자극반응성 고분자 블럭; 및 iii) 양전하성 고분자 블럭으로 구성된, 자극반응성 및 양전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 선형 블럭 공중합체와; i) 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭; ii) 자극반응성 고분자 블럭; 및 iii) 음전하성 고분자 블럭으로 구성된, 자극반응성 및 음전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 선형 블럭 공중합체를 혼합하여 전해질 복합체를 형성함으로써 제조된, 고분자 전해질 복합체 베지클을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 주쇄인 폴리노보넨; 및 상기 주쇄에 결합된 곁사슬인 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-양전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체로 구성된, 자극반응성 및 양전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 고분자브러쉬와, 주쇄인 폴리노보넨; 및 상기 주쇄에 결합된 곁사슬인 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-음전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체로 구성된, 자극반응성 및 음전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 고분자브러쉬를 혼합하여 전해질 복합체를 형성함으로써 제조된, 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀을 제공할 수 있다.
본 발명에서 베지클은, 노보넨 말단기를 가진 소수성 PS와 이온결합된 양전하성 및 음전하성 블록은 막을 형성하고, 루프 형태의 자극반응성 PNIPAM 블록은 내부 및 외부의 쉘을 형성하는 것이다(베지클 내부에는 수용액 상태인 구조). 또한 본 발명의 실린더형 마이셀은, PNB 주쇄, PS 블록 및 이온결합된 블록은 코어를 형성, 자극반응성 PNIPAM 블록은 쉘을 형성하는 것이다(즉, PNB 주쇄에 그래프트된 곁사슬로 존재하는 삼중 블록 공중합체 사이의 입체 반발력으로 인해 확장된 형태의 나노구조체가 형성되고, 마이셀 내부에 소수성 분자 모이어티 (moieties)들이 소수성 상호작용에 의해 응집되어 있는 구조).
상기 고분자 전해질 복합체 베지클과 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀은 온도가 상승하면 자극반응성 고분자 블럭의 소수성 특징이 강화되면서, 자극반응성 고분자 블럭이 수축하면서 구조가 변화할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 고분자 전해질 복합체 베지클과 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀을 포함하는 약물 전달체를 제공할 수 있다. 상기 약물 전달체는, 히드라존 링커에 의해 결합되어 있던 약물이, pH의 변화에 의해 상기 히드라존 링커에 의한 결합이 약해지면서 약물이 방출되는 것이다. 따라서 본 발명의 약물 전달체들은 pH 민감성인 특징이 있다. 상기 약물은 pH 5 내지 7에서 방출될 수 있으나, 사용하는 약물 및 개체의 특성에 따라 상기 pH의 범위는 변경 가능하다.
본 발명에 따른 상기 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 항암제, 화학물질, 소분자, 펩타이드 또는 단백질 의약품, 핵산, 바이러스, 항균제, 또는 항염증제 등을 포함한다.
상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 독소루비신을 예시로서 사용하였다.
상기 소분자는 예를 들어, 조영제(예컨대, T1 조영제, 초상자성 물질과 같은 T2 조영제, 방사성 동위 원소 등), 형광 마커, 염색 물질 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄 항체, 결합단백질 또는 그 결합 도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는, 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor;FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론류, 인터루킨류, 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스타틴, 엔도스타틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 단일 항체, 백신류 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 핵산은 예컨대, RNA, DNA 또는 cDNA가 될 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)이 될 수 있다.
상기 바이러스는 바이러스 전체 또는 바이러스의 핵산을 포함하는 바이러스 코어(즉, 바이러스의 엔빌로프 없이 패키지된 바이러스의 핵산)가 될 수 있다. 운반될 수 있는 바이러스 및 바이러스 코어의 예로는 파필로마 바이러스, 아데노 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로 바이러스 코어 및 세밀키 바이러스 코어 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항균제는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항염증제는 아세트아미노펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 ROMP (ring-opening metathesis polymerization) 활성이 있고 노보넨 작용기로 기능화된 RAFT 연쇄이동반응제와 소수성 분자를 이용하여 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭을 제조하는 단계;
상기 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭에, 자극반응성 분자 및 개시제를 첨가하고 중합을 진행하여 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭-자극반응성 블럭의 이중블럭 공중합체를 제조하는 단계; 및
상기 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭-자극반응성 블럭의 이중블럭 공중합체에, 전하성 분자를 첨가하여, 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭-자극반응성 블럭-전하성 블럭으로 구성된 선형 블럭 공중합체를 제조하는 단계; 를 포함하는, 자극반응성을 가지는 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 개시제는 azobisisobutyronitrile (AIBN)으로 잘 알려진 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile)가 이용될 수 있다.
상기 선형 블럭 공중합체를 제조하는 단계에서, 상기 노보넨기가 링 오프닝 되면서 중합되는 것이다.
아울러, 본 발명은 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체를 준비하는 단계;
상기 선형 삼중블럭 공중합체에 3세대 Grubbs 촉매를 첨가하고 ROMP(ring-opening metathesis polymerization)를 통해 폴리노보넨을 주쇄로, 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-전하성 고분자 블럭으로 구성된 삼중블럭 공중합체를 곁사슬로 가지는 고분자 브러쉬를 제조하는 단계; 를 포함하는, 고분자 브러쉬 제조방법을 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 실험 재료 준비
Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)로부터 얻은 Styrene, tert-butyl acrylate (tBA) 및 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate (DMAEMA)는 사용 전에 감소된 압력에서 증류시켰다. Tokyo Chemical Industry Co. Ltd (TCI, Japan)로 부터 얻은 NIPAM (N-isopropylacrylamide) 97% 는 n-hexane으로부터 재결정화함으로써 정제했다. 열 조건 라디칼 개시제로 사용되는 azobisisobutyronitrile (AIBN)으로 잘 알려진 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile)는 Acros (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로부터 얻었다. 3-amino-1-propanol, 4-cyano-4-[(dodecylsulfanylthiocarbonyl) sulfanyl]pentanoic acid (CDTPA), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 4-(dimethylamino)pyridine (DMAP), 3세대 Grubbs 촉매, ethyl vinyl ether, trifluoroacetic acid (TFA), rhodamine b, 1-(2-aminoethyl)maleimide hydrochloride, sulfo-N-hydroxysuccinimide ester (sulfo-NHS), phosphotungstic acid (PTA), methyl-methanethiosulfonate, triethylamine, hexylamine, tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), toluene, dichloromethane (DCM), methanol, n-hexane, 1,4-dioxane, diethyl ether, ethyl acetate, sodium phosphate dibasic heptahydrate, sodium phosphate monobasic monohydrate 및 phosphate buffered saline (PBS)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구매했다. Cis-5-norbornene-exo-2,3,-dicarboxylic anhydride는 Tokyo Chemical Industry Co. Ltd (TCI, Japan)에서 얻었다. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 및 n-ß-maleimidopropionic acid hydrazide (BMPH)는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구매했다. Doxorubicin (Dox)은 the European Pharmacopoeia (Strasbourg, France)에서 얻었다. Milli-Q (Millipore Water Purification Systems; EMD Millipore, Bedford, MA, USA)에서 정제한 탈이온수는 모든 실험에 사용되었다.
실시예 2. 측정 방법
1H NMR 스펙트럼은 Bruker Avance III 400 MHz NMR 분광계를 이용하여 CDCl3 용액에서 검출되었고(Bruker BioSpin AG, Fallanden, Switzerland), 용매를 기준으로 하여 분석되었다. 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography, SEC) 분석은 고성능액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC) 1260 series instrument를 통해 수행되었으며(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), Shodex GPC column KF-803와 함께 굴절률 탐지기를 사용했다(Shodex GPC system-21; Showa Denko Co., Tokyo, Japan). THF는 유동률 1.0 mL/min에서 용리제(eluent)로 사용되었으며, polystyrene standards는 1,270 내지 139,000 g/mol 범위에서 캘리브레이션(calibration)을 위해 사용되었다. UV-Vis 측정은 Peltier 온도조절기와 함께 UV-Vis spectrometer (Cary-100 Bio; Varian Biotech, US)를 이용하여 350 nm의 파장에서 측정되었다. 공중합체는 PBS 내 20°C to 70°C의 온도, 1°C/minute의 가열속도에서 UV-Vis를 흡수했다. 공중합체의 낮은 임계 용해 온도(Lower critical solution temperature, LCST)는 0.025 w/v % solutions의 흡수 변화로부터 결정되었다. 동적광산란(Dynamic light scattering, DLS)는 Malvern Zetasizer nanoZS instrument (Malvern Instruments, Malvern, UK))를 이용하여 25℃, 산란각 173°에서 얻었다. 헬륨/네온과 아르곤 레이저(Leica TCS SP)를 갖춘 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scanning microscopy, CLSM; Leica TCS SP, Leica, Germany)이 형광 및 밝은 모드에서 자가조립 나노구조체의 이미지를 찍기 위해 사용되었다. 헬륨/네온과 아르곤 레이저는 각각 488nm와 543nm로 들뜨게(excitation) 하기 위해 사용되었다. 방출 스펙트럼은 592nm부터 647nm의 파장으로 조정되었다. 투과 전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM) 측정은 가속전압 200kV에서 JEM-2100F FE-STEM (JEOL, Germany)로 수행되었다. 샘플은 울트라틴 무정형 탄소막(ultrathin amorphous carbon film (Ted Pella, Inc. U.S.))으로 코팅된 400 메쉬 구리 격자판에 중합체 용액을 떨어뜨린 후 공기에 건조시켜 준비했다. 이 때, 격자판은 0.1% PTA 용액으로 착색되었다.
실시예 3. exo -N-(3-hydroxypropyl)-5-norbornene-2,3-dicarboximide (NB-C3OH)의 합성
NB-C3OH는　문헌 방법에 따라　합성되었다(Johnson, J. A.; Lu, Y. Y.; Burts, A. O.; Lim, Y.-H.; Finn, M.; Koberstein, J. T.; Turro, N. J.; Tirrell, D. A.; Grubbs, R. H., Core-clickable PEG-branch-azide bivalent-bottle-brush polymers by ROMP: grafting-through and clicking-to. Journal of the American Chemical Society 2010, 133 (3), 559-566.). 전형적인 실험에서,　cis-5-norbornene-exo-2,3,-dicarboxylic anhydride (2.5 g, 9.6 mmol)는 Dean-Stark trap과 함께 150mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가되며, 이후 3-amino-1-propanol (1.224 mL, 16.0 mmol)과 톨루엔(25mL)이 첨가되었다. 반응 플라스크를　140　℃에서　16　시간　동안 기계식 교반 하에　오일 욕조에 두었다. 이후 원료는 10% 에틸아세테이트가 함유된 헥산(10% EtOAc/hexane)이 처리된 실리카겔에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(Flash column chromatography)하고, 10%부터 50%까지 EtOAc/hexane의 농도를 높이며 용출시켰다. 분석적인 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC)가 50% EtOAC/hexane내에서 상업용 0.25nm실리카 겔(Merck, 60 F 254)에서 수행되었고, 과망간산 칼륨(Potassium permanganate, KMnO4) 착색약에 의해 시각화되었다. (Rf=0.3) 용매는 회전식 증발에 의해 제거되어 무색의 오일로서 NB-C3OH가 산출되었다.
실시예 4. NB-C3OH를　사용한　RAFT 연쇄이동반응제(NB-CDTPA)의 합성
ROMP활성이 있고, 노보넨 작용기로 기능화된 RAFT 연쇄이동반응제(Chain transfer agent)　(NB-CDTPA)는 이전에 보고된 바와 같이 DCC/DMAP 커플링반응을 통해 합성되었다(Li, Z.; Zhang, K.; Ma, J.; Cheng, C.; Wooley, K. L., Facile syntheses of cylindrical molecular brushes by a sequential RAFT and ROMP "grafting-through" methodology. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 2009, 47 (20), 5557-5563.). 교반 막대와 함께 100mL 플라스크에, CDTPA (5.0 g, 12.4 mmol), NB-C3OH (3.5 g, 15.8 mmol), DCC (3.5 g, 17.0 mmol)와 DMAP (0.6 g, 4.9 mmol)를 첨가하고, 건조 DCM(170mL)에서 용해시켰다. 반응물은 상온에서 60시간, 즉 알코올이 NB-C3OH로 완전히 전환되었음을 TLC가 알려주는 시간동안 교반되었다. 백색 침전물은 희석 여과지(fluted filter paper, Whatman® qualitative filter paper grade 1)를 통해 여과되어 제거되었으며, 여과액은 회전 증발기에 의해 농축되었다. 이후 10% EtOAc/hexane에서 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 용출과정을 거쳐 오렌지 색의 오일로서 NB-CDTPA가 산출되었다.
실시예 5. α-norbornenyl poly(styrene)- block -poly(N-isopropylacrylamide) (NB-PS- b -PNIPAM)의 합성
α-norbornenyl poly(styrene) (NB-PS)는 NB-CTA(NB-CDTPA)와 AIBN을 개시제로 하여 RAFT 중합법으로 제조되었으며, 이는 이전에 보고된 방법이나 본 연구에서는 약간의 변형을 가하였다(Li, Z.; Ma, J.; Cheng, C.; Zhang, K.; Wooley, K. L., Synthesis of hetero-grafted amphiphilic diblock molecular brushes and their self-assembly in aqueous medium. Macromolecules 2010, 43 (3), 1182-1184). 전형적인 예로서, 250mL의 투-네크 플라스크에 NB-CTA (0.27g, 0.43 mmol)와 스티렌(5.00 mL, 43.64 mmol)를 첨가했고, 이후 THF(5mL)를 첨가했다. 자기 교반 막대를 사용하여 교반한 후, AIBN　개시제(7.20mg, 0.044mmol)　를 첨가하고, 생성된 용액을 질소 기체로 30분 동안 정화하여 용존 산소를 제거 하였다.　　AIBN 대비 스티렌과 NB-CTA의 몰수비는 1000:10:1로 유지했다. 밀봉된 플라스크를 75°　C 수조에 침지시키고, 계속 교반하면서 2시간 동안 중합하였다. NB-PS 중합 시 공기에 노출하고, 바로 얼음물에 냉각시키는 퀀칭(quenching) 과정을 수행했고, 이후 메탄올에서 3회 침전시켜 분리하였다. 생성물은 최종 수집되고 진공 속에서 건조되어 노랑색 고체형태의 NB-PS가 산출되었다.
NB-PS-b-PNIPAM, 이중블럭을 합성하기 위해 NB-PS 가 매크로분자 RAFT 반응제(macromolecular RAFT agent)로 사용되었다. 투-네크 둥근 바닥 플라스크에, NIPAM (1.30g, 11.50 mmol), NB-PS (0.23g, 0.15 mmol)와 AIBN (1.80 mg, 0.011 mmol)를 1,4-dioxane (10 mL)에 용해시키고, 30분간 질소가스를 첨가하여 정화시켰다. 이 때, [monomer]0/[macro-RAFT]0/[AIBN]0의 비는 1000/10/1로 유지했다. 플라스크를70 °C 수조에 두고, 8.5시간동안 중합을 진행했다. 중합동안, 소량의 중합용액을 회수하여 단량체의　전환율을 측정하였다. 중합 시, 냉각하고 공기에 노출시켜 퀀칭하였다. 이후 다이에틸에테르에서 침전시키고, 상온, 진공 속에 건조시켜 NB-PS-b-PNIPAM를 얻었다.
실시예 6. α-norbornenyl poly(styrene)- block -poly(N-isopropylacrylamide)- block -poly( tert -butyl acrylate) (NB-PS- b -PNIPAM- b -P t BA)의 합성
RAFT 중합에 의해 2가지 유형의 선형 양친성 블럭 공중합체가 제조되었다.　 삼중블럭 공중합체인 NB-PS-b-PNIPAM-b-PtB는 매크로 RAFT 중합반응제인 NB-PS-b-PNIPAM와 유사한 절차로 합성되었다.　 전형적인 실험으로서, 교반 막대와 함께 250mL 투-네크 둥근 바닥 플라스크에서, 1,4-dioxane (8mL)에 tBA (0.28 g, 2.20 mmol), NB-PS-b-PNIPAM (0.52 g, 0.088 mmol)와 AIBN (1.45 mg, 8.80 μmol)를 첨가했다. 이후 질소 기체에서 30분간 정화했다. [monomer]0/[macro-RAFT]0/[AIBN]0의 몰수비는 250/10/1로 유지했다. 이후 플라스크를 60℃에서 4시간 동안　수조에　침지시키고, 공기에 노출시키고 용액을 냉각시키는 퀀칭 후에 반응을 종결했다.　　마지막으로, 다이에틸에테르에서 침전된 후 진공에서 건조되어 삼중블럭 NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA 공중합체가 산출되었다.
실시예 7. α-norbornenyl poly(styrene)- block -poly(N-isopropylacrylamide)- block -poly(2-Dimethylaminoethyl) methacrylate) (NB-PS- b -PNIPAM- b -PDMAEMA)의 합성
삼중블럭 공중합체인 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA는 60 °C, 1, 4-dioxane (8mL)에서 매크로 RAFT 반응제로서 NB-PS-b-PNIPAM (0.52 g, 0.088 mmol)와 AIBN(4.82 mg, 29.33 μmol) 및 DMAEMA (0.46g, 2.93 mmol) 혼합물의 중합으로 합성되었다. 이 때 [monomer]0/[macro-RAFT]0/[AIBN]0의 몰수비는 100/3/1이었다. 플라스크는 고무 격막으로 밀봉되어 질소 기체에서 30분간 정화되었다. 중합물은 4시간 뒤에 급냉하고 공기 노출하는 퀀칭의 단계를 거쳐 다이에틸에테르에 침전되어 산출되었다.
실시예8. poly(norbornene)- graft -(poly(styrene)- block -poly(N-isopropylacrylamide)- block -poly( tert -butyl acrylate)) (PNB- g -(PS- b -PNIPAM- b -P t BA))의 고분자 브러쉬 합성
질소 환경에서 교반 막대를 포함한 3mL 바이알에 NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA (50mg, 6.94 μmol)와 DCM (1mL)를 첨가했다. ROMP를 위한 거대단량체로서 NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA의 용해 후에, 3세대 Grubbs 촉매용액을 [macromonomer]:[catalyst] = 10:1의 비율로 첨가했다. 1시간 후 중합액에 에틸비닐에테르를 살짝 떨어뜨려 퀀칭하고, 바이알 내 용액에 과량의 다이에틸에테르에 첨가하여 poly(norbornene)-graft-(poly(styrene)-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(tert-butyl acrylate)) (PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PtBA))를 침전시켰다. 진공에서 건조시켜 고분자 브러쉬를 산출했다. 이 반응은 노보넨기가 링 오프닝되면서 폴리노보넨(주쇄)을 형성하고, 곁사슬로 삼중 블럭 공중합체가 붙는 것이다.
실시예 9. poly(norbornene)- graft - (poly(styrene)- block -poly(N-isopropylacrylamide)- block -poly(2-dimethylaminoethyl) methacrylate) (PNB- g -(PS- b -PNIPAM- b -PDMAEMA))의 고분자 브러쉬 합성
poly(norbornene)-graft-(poly(styrene)-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(2-dimethylaminoethyl) methacrylate) (PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA))를 합성하기 위해, 거대단량체로서 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA (50mg, 5.74 μmol)가 사용되었다. 거대단량체는 DCM (1mL)에서 용해되었고, 혼합물 용액은 질소 가스로 정화시켰다. [macromonomer]:[catalyst]가 10:1이 되도록 주사기를 이용하여 3세대 Grubbs 촉매를 첨가하였고, 1시간 후에 에틸비닐에테르 몇 방울을 살짝 떨어뜨려 퀀칭 후, 다이에틸에테르에 혼합물을 침전시켰다. 이 반응은 노보넨기가 링 오프닝되면서 폴리노보넨(주쇄)을 형성하고, 곁사슬로 삼중 블럭 공중합체가 붙는 것이다.
실시예 10. α-norbornenyl poly(styrene)- block -poly(N-isopropylacrylamide)- block -poly(acrylic acid) (NB-PS- b -PNIPAM- b -PAAc) 합성 및 이의 고분자 브러쉬(PNB- g -(PS- b -PNIPAM- b -PAAc))의 합성
NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PtBA)를 각각 준비하였다. NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PtBA) 각각의 에스테르기는 DCM 내에서 TFA를 사용하여 가수분해했다. NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA와 DCM, PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PtBA)와 DCM을, 각각50mg/mL 농도로 바이알에 첨가했다. 용해 후, 각각의 중합체의 PtBA 블럭의 400배 몰수의 TFA를 바이알에 첨가하면, 용액은 매우 점성이 된다. 교반하면서 밤새 반응을 진행시킨 결과, 용액으로부터 연갈색의 젤라틴 덩어리가 형성되었다. 용액을 증발시킨 후, 잔류 물질을 THF에 용해시켰다.　생성된 용액을　투석 튜브(MWCO = 3,000)　로 옮기고　탈이온수로 투석한 후, 동결 건조기 MCFD8508 (Ilshin lab co., Ltd., Korea)을 사용하여 진공하에　동결 건조시켰다. α-norbornenyl poly(styrene)-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(acrylic acid) (NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc)을 얻었고, 이와 별도로 폴리노보넨 주쇄를 가지는 고분자 브러쉬(PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc))를 얻었다.
실시예 11. 선형 양친성 블럭 공중합체와 이의 고분자 브러쉬의 아미노 분해
NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA의 말단 트리티오탄산염기(trithiocarbonate group)를 다음 프로토콜에 따라 제거하였다. 5mL THF에 용해된 공중합체(0.01mmol)를 고무 격막을 포함한 20mL 바이알에 담았다. Methyl-methanethiosulfonate (0.2 mmol)를 첨가한 후 15분간 교반시켰고, hexylamine (2 mmol)과 trimethylamine (2 mmol)를 첨가하였다. 실온에서 교반하면서 1일동안 반응을 진행시키고, 생성된 용액을 다이에틸에테르에 부어 반응되지 않은 시약을 제거하였다. 메틸다이설파이드를 포함한 공중합체를 진공하에 건조시켰다. 즉, NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA의 말단 트리티오탄산염기를 먼저 제거하고, NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA를 TFA에 의해 가수분해하여, 메틸다이설파이드를 포함한 NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc를 제조했다.
실시예 12. 로다민 b-컨쥬게이션된 나노구조체(rhodamine b-conjugated nanostructures)의　제조
티올-말레이미드 클릭 화학(thiol-maleimide click chemistry)을 통해 로다민(rhodamine)과 티올-말단기의 공중합체(thiol-terminated copolymers)의 컨쥬게이션을 위해, 말레이미드기가 EDC/NHS 커플링을 통해 로다민 b로 도입되었다. 로다민b(0.01 g, 0.021 mmol)는 탈이온화수 10ml에 용해되었고, 로다민 b의 카복실기는 EDC (0.004 g)와 sulfo-NHS (0.0045 g)의 첨가에 의해 활성화되었다. 30분 후, 1-(2-aminoethyl) maleimide hydrochloride (0.0053g, 0.021 mmol)를 용액에 첨가했고, 교반하면서 1시간동안 반응을 진행시켰다. 이후 진공하에서 건조시켜 말레이미드 기능적인 로다민 b(maleimide-functionalized rhodamine b)를 얻었다.
α-노보넨 삼중블럭 공중합체와 그들의 고분자 브러쉬의 말단 메틸설파이드기는 말단 티올기를 갖기 위해 TCEP로 제거되었다. 이후 각각의　공중 합체를 THF에 10mg/ml로 용해시켰고, 용액을 pH 7에서　10 mM　Tris 완충액에　대해 투석시켰다.　　 10　몰 과량의 TCEP를 용액에 첨가하고, 1시간 동안 교반한 후, 말레이미드-티올 커플링을 위해 말레이미드 기능적인 로다민 b를 첨가하였다.　 반응되지 않은 로다민 b는 탈이온수에 의해 제거되고, 로다민-컨쥬게이션된 공중합체는 CLSM을 이용하여 공중합체의 자가조합 나노구조체를 분석하기 위해 동결건조되었다.
실시예 13. 선형 양친성 블럭 공중합체와 그들의 고분자 브러쉬간의 자가조립 나노구조체의 제조
상반된 전하를 갖는 선형 양친성 블럭 공중합체 또는 그들의 고분자 브러쉬를 1mg/mL 농도로 1mL THF에 용해시켰다. 용액을 3.5 KDA의 분자량 제한이 있는 투석 튜브로 옮긴 다음, 탈이온수 및 PBS에 대해 2 일 동안 투석하여 THF 및 불순물을 제거하였다.　물은 매일 3 번 교체되었다.　또한, 고분자 전해질 착물 베지클 또는 실린더 형태의 마이셀은 1mg/mL 농도로 THF에서 반대로 하전된 양친성 블럭 공중합체 또는 고분자 브러쉬가 혼합되고, 탈이온수 또는 PBS에 대해 투석함으로써 형성되었다. 마찬가지로 로다민-컨쥬게이션된 공중합체로부터 자가조립된 나노구조체도 제조되었다.
실시예 14. PEC　나노 구조체에서의　약물 활용 및 방출
티올-말단기를 가진 양친성 블럭 공중합체 및 그들의 고분자 브러쉬와 공유결합된 독소루비신은 BMPH를　사용하여　히드라존 링커를 제공한다. 대표적인 프로토콜에 따라, 독소루비신(25 mg, 4.31 μmol)와 BMPH(26 mg, 8.62 μmol)를 TFA 15μL를 포함한 무수메탄올(15mL)에 용해시켰다. 이후 암흑, 20 ℃조건에서 16 시간 동안 교반하였다.　　탈이온수에서 활성화된　독소루비신을 1:1몰비율로 천천히 각각의 공중합체 용액에 첨가하고, 암흑, 20 ℃조건에서 16 시간 동안 교반하였다. 이후 얻어진 용액을 pH 8에서 탈이온수에 대해 투석시키고, 독소루비신-컨쥬게이션된 공중합체를 건조시켰다.
PEC 베지클 및 실린더 형태의 마이셀로부터 독소루비신의 방출 동역학을 조사하기 위해, 독소루비신-컨쥬게이션된 PEC 나노구조체를 제조하였다. 독소루비신　분자는 pH 5.5 또는 7.4, 10mM의 인산 완충액 내, 37℃의 조건에서 pH-조절하는 히드라존 링커의 제거에 의해 방출되었다. 산에 의해 히드라존 링커가 제거되자마자, 방출된 독소루비신은 microplate reader (SynergyMx Monochromator-Based Multi-Mode Microplate Reader, BIOTek®, Winooski, VT, USA)에 의해 정량화되었다.
　
실시예 15. 실험 결과 분석
도1(a)는 상반된 전하를 가지고 자극반응성인 두 종류의 고분자 브러쉬 합성방법을 묘사한다. 이는 수용액 조건에서 선형 양친성 블럭 공중합체와 그들의 비공유결합 상호작용을 통한 자가조립의 고리 열림 복분해 중합법(ROMP)에 의한 것이다. 본 발명은 양친성 블럭 공중합체와 이러한 블럭 공중합체를 곁사슬로 가지고 있는 고분자 브러쉬가 구형 마이셀, 베지클, 및 실린더 형태의 마이셀과 같은 다양한 나노구조체로 자가조립되어, 바이오의학 분야에서 유용하게 활용될 수 구조체를 제공하는 것이다. 선형 양친성 블럭 공중합체는 거대단량체로서 전하를 띠고, 열에 반응하며, 소수성인 블럭과 노보넨 말단기로 구성되었다: (1) NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc (2) NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA 특히, 두 종류의 고분자 브러쉬는 폴리(노보넨) 주쇄 및 선형 양친성 블럭 공중합체 곁사슬로 구성되었으며, 3세대 Grubbs 촉매를 사용하여 ROMP에 의해 준비되었다: (1) 음전하성:PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc) (2) 양전하성: PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)의 선형 양친성 블럭 공중합체와 고분자 브러쉬는, 각각, 수용액 내에서 비공유 상호작용을 통해 각각 구형 마이셀과 실린더 형태의 마이셀로 자가조립했다. NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc 및 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA 모두 구형 마이셀로 자가 조립했으며, 이 때 소수성인 PS 블럭이 중심부를, 전하를 띠고 자극반응성인 블럭이 껍질부분을 구성했다. 반대로, 고분자 브러쉬, PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc) 및 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)는 실린더 형태의 마이셀을 형성했으며, PNB 주쇄와 PS 블럭이 중심부를, 전하를 띠며 자극반응성인 블럭이 껍질부분을 구성했다. 그들의 확장된 형태는 PNB 주쇄에 그래프트된 곁사슬 간의 입체 반발력에 기인한 것이며 얽힘의 정도를 감소시켰다. 더욱이, 열에 반응하는 PNIPAM 블럭이 각각의 공중합체와 결합되었기 때문에, 그들의 나노구조체는 PNIPAM 블럭의 온도 의존적 형태 전이를 통해 구형/실린더형 마이셀로 변형되었다. 온도를 증가시킴에 따라, PNIPAM 블럭은 수축했으며, 공중합체 간의 소수성, 친수성 상호작용은 삽입된 TEM 이미지에서 보여준 것과 같이 나노구조의 변형을 유도했다. 그래서, 이온적으로 교차결합된 고분자 나노구조체(ionically crosslinked polymeric nanostructures)는 온도에 대응하는 자가조립 나노구조체의 형태학적 변형을 피하기 위해 반대로 하전된 공중합체 간의 고분자 전해질 착물화를 통해 준비되었다.
도1(b)와 (c)는 '고분자 전해질 착물 베지클(PEC vesicles)'와 '반대로 하전된 양친성 블럭 공중합체와 고분자 브러쉬로부터 형성된 실린더 형태의 마이셀'의 제조 방법을 보여준다. (-)으로 하전된 NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc와 (+)으로 하전된 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA가 정전기적 상호작용을 통해 착물화될 때, PEC 베지클은 TEM 관찰을 통해 확인되었다. 상반된 전하를 가져 이온적으로 짝지어진 블럭과 소수성 PS 블럭은 베지클 막 내에 위치한 반면, 루프(loop) 형태의 PNIPAM 블럭은 PEC 베지클의 껍질을 형성했다. 온도가 LCST　이상으로 상승하면,　PNIPAM 블럭은 탈수되고 수축했다.　 또한, (-)으로 하전된 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)와 (+)으로 하전된 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)은 PEC 실린더 형태의 마이셀 형성을 유도했고, 이 마이셀은 삽입된 TEM 이미지에서 보여지는 것과 같이 PNB 주쇄, 중심부로서 PS 블럭과 이온결합 블럭, 껍질부분으로서 루프형태의 PNIPAM으로 구성되었다. 온도가 낮은 임계 용해 온도보다 높아짐에 따라, 고분자 브러쉬의 루프형태의 PNIPAM 블럭은 탈수된다. 마찬가지로 이러한 PEC 나노구조체는 공중합체의 하전된 블럭간의 이온 교차결합에 의해 안정화되며, 첨단 약물 전달체로서 유용하게 이용될 것이다.
도 2(a)는 노보넨 작용기로 기능화된 RAFT 연쇄이동반응제(Norbornene-functionalized RAFT chain transfer agent, NB-CDTPA)의 합성을 위한 반응식을 보여준다. 첫째, NB 단량체가 3-amino-1-propanol와 반응하여 exo-N-(3-hydroxypropyl)-5-norbornene-2,3-dicarboximide (NB-C3OH)로 전환된다. CDCl3에서 NB-C3OH의 1H NMR 스펙트럼을　측정한 결과,　도　7(a)에　나타낸 바와 같이　6.23 ppm에서 NB알케닐 양성자가,　3.74ppm　및　1.76ppm에서 말단 히드록실기에 인접한 2개의 CH2기가 나타났다.　　둘째, DCB 및 촉매 DMAP의 존재 하　NB-C3OH 및 CDTPA의　에스테르화에 의해　NB-CDTPA를 제조하였다. 노보넨 모이어티(Norbornene moiety)와 CDTPA 사이의 3-탄소 스페이서(3-carbon spacer)가 폴리(노보넨) 주쇄가 성장함에 따른 인접한 곁사슬 간의 입체 장애 효과를 감소시키기 위해 도입되었다. 도 7(b)의 NB-CDTPA의 1H NMR 스펙트럼 결과, 0.87ppm에서 말단 -CH3기, 1.26ppm에서 CTA기의 -CH2기, 그리고 4.13ppm에서 에스테르 결합에 인접한 메틸렌 양성자가 나타났다.
도 2(b)는　RAFT 중합법 및　ROMP의 조합을　통한　(-) 또는 (+)으로　하전된 고분자 브러쉬의　합성을 위한 반응식을　보여준다.　NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA및 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA는 St, NIPAM및, tBA 또는 DMAEMA의 순차적 RAFT 중합법을 통해 NB-CDTPA로부터 처음 성장했다. 반응온도, 시간, 용매, 및 라디칼 개시제의 낮은 몰 비율([NB-CTA]:[AIBN]=10:1)과 같은 많은 반응 파라미터들은 다양한 RAFT 중합법에서 신중히 고려되어야 하는데, 이는 NB groups가 ROMP를 방해하여 고분자 브러쉬로의 전환을 느리게 하기 때문에 RAFT 중합법 내에서 NB groups의 관여를 제재하기 위함이다. 즉, NB-PS의 RAFT 중합법은 [monomer]/[NB-CTA]/[initiator]=1000/10/1의 몰비율로 75℃에서 2시간동안 수행되었다. 중합반응동안 NB groups의 부반응은 거의 관찰되지 않았으며, 말단 NB-PS 내 메틸렌 양성자 대비 NB 알케닐 양성자의 통합 면적의 비가 도 7(c)에 보여지는 것과 같이 NB-CDTPA의 1H NMR의 피크의 것과 일치했다.
또한,　NB-PS의　1H NMR 분광법은 6.36-7.50 ppm에서 PS 그룹의 방향족 양성자의 새로운 공명 피크를 보여주었고,　CTA로부터의 말단 양성자에 대한　그것의 통합 면적 비율　은 수-평균 분자량(MnNMR)을 추정하기 위해 계산되었다(1,520g/mol).　도 3(a)는 NB-PS의 GPC 추적을 보여주었으며, Mn을 포함하는 NB-PS의 monomodal형의 분자량 분포는 1,390g/mol, 다분산도 지수(Polydispersity index, PDI)는 1.13으로 1H NMR 분석에서 얻은 Mn과 일치했다.
얻어진　NB-PS는 NIPAM 단량체의 중합을 위한 고분자-RAFT 반응제로 사용되었으며, [NIPAM]:[NB-PS]:[AIBN]=1000:10:1의 비율로 NB-PS-b-PNIPAM이 합성되었다. 중합반응시간(Polymerization duration)은 NB group이 급진적으로 중합반응에 참여하는 것을 억제하기 위해 최적화되었다. 도 3 (a)는 Mn을 포함하는 NB-PS-b-PNIPAM의 GPC 추적결과(4,740g/mol), PDI 결과(1.24)를 보여준다. 0.87ppm에서 말단 메틸 양성자에 대해3.9ppm에서 PNIPAM 블럭의 아이소프로필기의 메틴 양성자(methine proton)의 면적 비율은 MnNMR 측정(4,950g/mol)을 위해 계산되었다(도 7 (d)). 8.5시간 이상 중합반응이 진행되면, NB-PS-b-PNIPAM의 bimodal형 분자량 분포가 나타나며, 이는 RAFT 중합반응동안 NB group의 결합 때문이며, ROMP의 불완전한 전환을 야기하는 것으로 보인다. 따라서, NIPAM 단량체의 중합반응은 상대적으로 낮은 전환율을 보이며 종결된다.
얻어진 NB-PS-b-PNIPAM는 tBA를 순차적으로 NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA로 중합하기 위한 매크로 RAFT 반응제로 사용되었다. 한편, NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA는 수용액에서 (-)으로 하전된 NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc을 생성하기 위해 TFA에 의해 가수분해되었다. 즉, tBA의 RAFT 중합법은 [tBA]:[NB-PS-b-PNIPAM]:[AIBN]=250:10:1의 비율로 60　°C에서 4시간 동안 수행되었다. 도 3 (c)는 NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA의 1H NMR 스펙트럼을 나타내며, 이 때 1.45ppm에서 메틸에스터 양성자가 포함되었다. NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA의 MnNMR은 1H NMR 분석에서 6,220 g/mol로 추정되었다. 도 3 (a)에서 GPC로 분석된 바와 같이, NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA는 monomodal형 분자량 분포 결과 Mn=5,630 g/mol, PDI 결과 1.28를 나타냈다. PtBA 블럭의 탈보호는 1H NMR 스펙트럼 1.45ppm에서 tert-butyl기의 양성자가 완전히 사라지는 모습을 관찰함으로써 확인되었다. 마찬가지로, NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA는 [DMAEMA]:[NB-PS-b-PNIPAM]:[AIBN]=100:3:1의 비율로 합성되었으며, 이 때, DMAEMA는 PAAc in NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc와 비교하여 유사한 전하군 밀도에 맞추기 위해 낮은 몰비율을 갖는다. 도 3 (a)와 (d)에 1H NMR와 GPC 추적이 분석된 바와 같이, NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA는 6,550 g/mol의 MnNMR 와 8,710 g/mol의 Mn, 그리고 1.24의 PDI 결과를 갖는다.
일련의 고분자 브러쉬는 3세대 Grubbs 촉매를 이용하여 α-norbornenyl-functionalized macromonomers의 ROMP에 의해 합성되었다. 도 2 (b)와 같이 폴리(노보넨) 주쇄와 선형 양친성 블럭 공중합체 곁사슬로 구성된PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PtBA)와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)를 합성하기 위해 ROMP반응을 [macromonomer]/[catalyst] ratio of 10:1의 비율로 개시했다. 중합반응은 상온에서 1시간동안 DCM하에서 수행되었으며, 에틸비닐에테르를 첨가함으로써 퀀칭하였다. 특히, PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PtBA)는 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)의 합성을 위해 TFA에 의해 가수분해되었다. 도 7(e)와 (f)는 6.30~6.20ppm에서 고분자 브러쉬의 NB group의 알케닐 양성자가 사라진 것을 보여주는데, 이는 NB group이 완전히 소모되었음을 가리킨다. 도 3(b)의 GPC 추적은 거대단량체의 ROMP 이후 낮은 보유시간에 피크의 이동이 있었음을 보여주는데, 이는 거대단량체의 고분자 브러쉬로의 높은 전환율을 의미한다. 9.0~10.0분의 피크는 잔류 거대단량체를 가리키며, 이는 중합에 필요한 NB 사슬 말단이 부족하기 때문일 것으로 추측된다. 두 유형의 고분자 브러쉬 중 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PtBA)는 30,210 g/mol의 Mn, 1.19의 PDI를 가지며, PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)는 22,510 g/mol의 Mn, 1.31의 PDI를 가진다. 하기 표 1은 노보넨 기반 블럭 공중합체와 그들의 고분자 브러쉬의 분자량 분석결과를 보여준다. 각 블럭의 중합 정도는 1H NMR 분석에 의해 계산되었다.
Figure 112020039634696-pat00001
13세대 Grubbs 촉매에 대해 거대단량체의 몰비율. 2CDCl3 하에서 1H NMR 스펙트럼에 의해 결정된 수평균분자량. 3수평균 분자량, 3무게 평균 분자량과 3다분산도 지수는 유체상태에서 THF를 이용하여 GPC 분석을 통해 산출되었다.
도 4 (a)-(c)는　온도의 함수로서　pH 7.4,　10 mM PBS에서　UV 흡광도　및 유체 역학적 반경을 측정하여　선형 양친성 블럭 공중합체　및　고분자 브러쉬의 열 전이 거동(Thermal transition behavior)을　보여준다.　이들 PNIPAM-　기반 블럭 공중합체는　낮은 임계 용해　온도(LCST)미만에서　가용성이고, 소수성 상호작용을 통한 폴리(NIPAM) 사슬의 수축으로 인해 LCST 초과 온도에서 불용성이며, 이는 급격한 상 전이를　초래한다. 　LCST보다 높은 온도인 경우, 공중합체의 PNIPAM 사슬은 수축되며, LCST에서 UV 흡광도의 전이를 야기한다. 그들의 LCST 값은 온도의 함수로서 처음 UV 흡수에서 파생된 최댓값으로 결정되었다. 도 4 (a)에 나타난 바와 같이, NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc및　PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)는 각각 33.9℃　및 34.5℃에서 열적으로 유발되는 상전이 거동을 나타낸다. 이는 친수성인 PAAc 블럭의 결합 때문이며, 32.4℃에서 상전이 거동을 나타내는 NB-PS-b-PNIPAM보다 높은 수치이다. NB-　PS-　b-　PNIPAM-　b-　PDMAEMA와 PNB-　g-　(PS-　b-　PNIPAM-　b-　PDMAEMA)는　각각　34.1℃및 31.2℃에서 LCST 값을　가졌다.　　NB-　PS-　b-　PNIPAM-　b-　PDMAEMA의　ROMP는　LCST의 감소 및 LCST 이하 온도에서는 UV- 흡광도의 증가를 이끌었는데, 이는 소수성의 증가와 관련이 있었다.　또한, PDMAEMA가 열 반응성 중합체로서 전이 온도가 50℃ 이상이므로, 공중합체와 고분자 브러쉬의 PDMAEMA 블럭이 두번째로 전이될 때, 추가적인 UV-흡광도 증가를 관찰할 수 있었다. NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc, NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA, PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)의 자가조립 나노구조체는 이들 공중합체를 THF에 용해시킨 후 0.05 w/v %의 농도로 PBS에서 투석하였다. 도 4 (b)는 다른 온도에서 DLS를 사용하여 특정된 NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)의　유체역학적 반경을 보여준다.　PS 블럭의 소수성 사슬은 중심부와 먼저 결부되었으며, 친수성인 PNIPAM-과 PAAc 블럭은 껍질을 형성하여, 25℃, PBS에서 NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc의 15.8　±　4.0nm의 유체역학적 반경을 가지는 구형 마이셀을 형성하였다. 또한, 공중합체의 반경은 37℃에서 229.1±19.5 nm까지 상승하였으며, 이는 LCST보다 높은 온도에서 30분 내로 PNIPAM 사슬의 변형이 일어나 구형 마이셀에서 베지클로 열 유도 전환이 일어나기 때문인 것으로 생각된다. 이 빠른 전이 공정은 중합도가 낮은 PS 블럭의 코어와 관련이 있다. 온도가 25℃에서 37℃로 증가함에 따라 NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc의 PNIPAM 블럭은 탈수, 수축되고, (-)으로 하전된 PAAc 블럭은 여전히 탈수되며, 자가조립된 마이셀이 침전되는 것을 막는다. 도 4 (d-ⅰ), (d-ⅱ)에서 도시된 바와 같이, 빌딩 블럭으로서 구형 마이셀은 서로 결합되고, 최종 표면 에너지의 최소화를 통해 베지클 나노구조체로 재배열되었다. NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc의 TEM 이미지에서 측정된 베지클 형태의 전체적인 직경은 37℃에서 116.5±32.3nm였다. 마찬가지로 도4 (b), (e-ⅰ), (e-ⅱ)에 도시된 바와 같이, NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA는 PBS에서 25℃와 37℃에서 각각 구형 마이셀과 베지클로 자가조립했다. 이들 나노구조체의 유체역학적 반경은 25℃와 37℃에서 각각 17.4±5.6 nm와 170.6±19.7 nm이며, DLS에 의해 측정되었다. 한편, TEM 이미지의 분석으로 결정된 평균 크기는 37℃에서 182.1±36.5 nm였다.
도　4　(c)　및 (f-ⅰ)　은 (-)으로 하전된 고분자 폴리머인 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)가 수용액 상태에서 LCST보다 낮은 온도에서 분자간, 분자내 상호작용을 통해 실린더 형태의 마이셀로 자가조립한 것을 보여주며, 이는 양친성 곁사슬간의 입체 상호작용 때문이다. PNB 주쇄와 PS 블럭은 실린더 형태의 마이셀 내부에 소수성 중심부를 형성했으며, PNIPAM과 PAAc 블럭은 바깥 친수성 껍질을 형성했다. PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)의 유체역학적 반경과 길이는 PBS에서 25℃에서 각각 28.0±5.5 nm과 105.1±10.2이며, DLS로 측정되었다. 온도가 증가함에 따라, 실린더 형태의 마이셀은 베지클 형태로 전이되며, 이는 DLS 측정과 도 4 (f-ⅱ)에 37℃의 TEM 이미지로 확인할 수 있다. PNIPAM 블럭이 탈수되고 주쇄 사슬 말단간의 분자내 상호작용이 높은 온도에 의해 약해질 때, 친수성-소수성 균형이 바뀌어, PBS에서 37℃에서 베지클의 반경은 200.5±21.1 nm로 재배열된다. 37℃에서 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)의 평균적인 베지클의 크기는 159.4±67.9였으며, TEM 이미지로부터 결정되었다. 마찬가지로, (+)으로 하전된 고분자 폴리머인 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)는 도 4 (c)에 도시된 바와 같이, 유체역학적 반경은 25.4±8.4 nm, PBS에서 25℃에서는 126.3±11.7 nm의 길이를 가진 것으로 나타났다. 37℃에서 재배열된 베지클의 평균적인 반경은 235.0±20.8 nm였다. PDMAEMA 기반한 공중합체의 자가조립 나노구조체는 가장 큰 크기로 측정되었는데, 이는 PAAc 기반한 것과 비교하여 높은 분자량과 하전된 블럭 간의 반발력을 통한 사슬 연장(chain extension) 때문이었다. 이러한 크기 차이는 하기 표 2에 도시된 바와 같이 25℃, 탈이온수에서 측정된 ζ-포텐셜 수치와 관련이 있었다. (NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc는 8.7±0.1 mV와 -18.5±0.6 mV, NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA는 12.7±1.5 mV와 23.4±0.5 mV) 도 4 (g-ⅰ) 및 (g-ⅱ)는 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)의 25℃, 37℃에서의 자가조립 나노구조체의 TEM 이미지를 보여주며, 이는 DLS 자료와 일치했다. TEM 이미지에서 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)의 평균적인 베지클의 반경은 216.6±72.3 nm였다.
Figure 112020039634696-pat00002
1pH7.4, 10mM PBS에서선형 양친성 블럭 공중합체와 고분자 브러쉬의 LCST. 2평균적인 공중합체의 유체역학적 반경은 10mM PBS에서 측정되었고, 최종 농도는 0.05w/v%였다. 3공중합체의 자가조립 마이셀의 ζ-potential는 탈이온수에서 측정되었고, 최종 농도는 0.1w/v%였다.
상기 표 2에서는 반대로 하전된 선형 양친성 블럭 공중합체와 고분자 브러쉬의 LCST, 25℃(LCST미만), 37℃(LCST초과)에서 평균적인 공중합체의 유체역학적 반경, 자가조립 나노구조체의 ζ-potential. 세 개의 다른 집단에서 측정되었다(N=3).
두 개의 상반된 전하를 띠는 양친성 블럭 공중합체 또는 고분자 브러쉬는 수용액 상태에서 정전기적 상호작용을 통해 각각 PEC 베지클 또는 실린더 형태의 마이셀을 형성했다. 각각의 PEC 나노구조체는 두 종류의 선형 양친성 블럭 공중합체와 이들의 고분자 브러쉬를 THF에서 혼합함으로써 형성되었다. 이러한 혼합은 수용액 조건에서 PAAc와 PDMAEMA 블럭의 강한 결합에 따라 이온적으로 교차결합된 PEC 나노구조체를 형성했다. 도 5 (a)는 온도의 함수로서 UV 흡광도를 특징으로 하는 PEC 나노구조체의 열 전이 거동을 나타낸다. 흡광도는, 온도가 증가하면서 PNIPAM 블럭이 소수성이 될 때, 이온결합된 공중합체의 급격한 상전이 없이 점진적으로 증가했다. 더욱이, LCST보다 높은 온도, 수용액 조건에서 공중합체의 응집 내지 침전이 관찰되지 않았으며, 이는 공중합체의 전하를 띠는 블럭들의 이온화 정도가 상이하다는 점에서 기인한 것이다. 이러한 결과는 25℃, 탈이온수에서 PEC- 베지클과 실린더 형태의 마이셀의 ζ-포텐셜 값이 각각 24.1±0.5 mV와 34.3±0.5 mV라는 점과 일치한다. 도 5 (b)는 PEC 베지클의 유체역학적 반경이 25℃에서 339.0±46.5 nm, 37℃에서 228.6±13.2인 것을 보여준다. 소수성 PS-와 이온결합된 블럭은 막을 형성했으며, 루프 형태의 PNIPAM 블럭은 PEC 베지클의 내부 및 외부 껍질을 형성했다. 온도가 25℃에서 37℃로 증가할 때, PNIPAM 블럭은 탈수, 수축되었으며, 크기는 감소했다. 또한, PEC 실린더 형태의 마이셀의 평균적인 반경과 길이는 25℃에서 62.7±7.0 nm와 272.3±19.5 nm, 37℃에서 47.0±4.1와 209.9±22.3 nm였다. 수용액 조건에서, 소수성 PNB 주쇄, PS 블럭, 그리고 이온결합된 블럭은 PEC 실린더 형태의 마이셀의 중심부를 형성했으며, 루프 형태의 PNIPAM 블럭은 껍질을 형성했다. 온도의 증가와 함께 PEC 나노구조체의 평균적인 크기는 PNIPAM 사슬의 수축으로 인해 감소했다. 고분자 브러쉬의 베지클의 실린더 형태의 마이셀과 비교하여, 소수성 PS-, 그리고 이온결합된 하전 블럭의 단단한 결합 때문에 PEC 나노구조체의 형태 재배열은 관찰되지 않았다. 표 2는 열 전이 특성과 선형 양친성 블럭 공중합체와 이들의 고분자 브러쉬, 고분자 전해질 착물화 공중합체의 ζ-포텐셜 값을 정리한 것이다. 도 5 (c) 및 (d)는 두개의 다른 선형 양친성 블럭 공중합체와 고분자 브러쉬를 혼합하여 형성된 PEC 베지클과 실린더 형태의 마이셀의 TEM 이미지를 나타낸 것이다. 평균적인 PEC 베지클의 반경은 337.0±62.4 nm이며, TEM 이미지의 분석에 의해 결정되었다. 더욱이, 도 5 (e)에 도시된 바와 같이, 25℃, PBS에서 베지클 막을 명확하게 시각화하도록 로다민 b-컨쥬게이션된 PEC 베지클의 CLSM 촬영이 진행되었다. 먼저, 말레이미드-기능화된 로다민 b를 말레이미드-티올 커플링을 통해 각각의 티올-말단 공중합체와 결합시켰다. 공중합체의 말단 티올기는 NB-PS-b-PNIPAM-b-PtBA와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PtBA)의 말단 트리티오탄산염기를 제거하여 제조되었다. 이는 도 8 (a) 및 (b)에 도시된 바와 같이, methyl-methanethiosulfonate를 이용하여 아미노분해(aminolysis)한 후 TCEP를 이용하여 제거하는 과정으로 이루어졌다. 두 공중합체의 PtBA는 TFA에 의해 가수분해되어 NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAAc)를 제조했다. 마찬가지로 도 8(c) 및 (d)에 도시된 바와 같이, 티올을 포함한 말단기를 가진 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA와 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)도 제조되었다. 그 후 로다민 b-컨쥬게이션된 NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc와 PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA를 THF에 용해하고, PBS에 투석하여, 두 상반된 고분자 전해질간의 분자내 상호작용으로 자가조립 PEC 베지클을 형성했다. 적색 형광은 25℃, PEC 베지클에서 1.80±0.26 μm의 평균적인 직경을 갖는 막 속에서 로다민 b 분자의 균일 결합을 나타낸다. DLS 및 TEM 이미지로 결정된 로다민 b 컨쥬게이션 없이 반대로 하전된 양친성 블럭 공중합체로부터 형성된 PEC 베지클의 것과 비교했을 때, 소수성의 형광 염색약이 베지클 막과 결합했기 때문에 평균적인 직경은 로다민 b 컨쥬게이션 이후 매우 증가했다.
PEC 나노구조체가 공중합체의 하전된 블럭간의 이온 교차결합에 의해 안정화되었기 때문에, 이는 첨단 약물 전달체로서 유용할 것이다. 모델 약물인 독소루비신은, 히드라존 링커를 제공하는BMPH를 이용하여 티올 말단을 가지는 양친성 블럭 공중합체와 그들의 고분자 브러쉬와 공유결합했다. 도 6 (a)는 독소루비신이 BMPH 가교제를 이용하여 공중합체의 말단티올기와 결합하기 위한 반응식을 보여준다. 간단히 말해, 독소루비신의 케톤기와 BMPH의 히드라지드기(hydrazide group)는 반응하여 산분해성 히드라존 결합을 형성한다. 이후 BMPH-컨쥬게이션된 독소루비신의 말레이미드기는 티오에테르 결합을 통해 공중합체의 말단 티올기와 반응하며, 이는 독소루비신-컨쥬게이션된 양친성 블럭 공중합체와 고분자 브러쉬의 형성을 이끈다. 결과적으로, 도 6 (b) 및 (c)에 각각 도시된 바와 같이, 독소루비신-컨쥬게이션된 PEC 베지클과 실린더 형태의 마이셀은 (1) NB-PS-b-PNIPAM-b-PAAc 및 NB-PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA (2) PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PAA) 및 PNB-g-(PS-b-PNIPAM-b-PDMAEMA)의 자가조합에 의해 제조되었다. 37℃에서 산에 의한 히드라존 링커의 제거에 따라 독소루비신은 이러한 PEC 나노구조체로부터 방출되었으며, 이 때의 형광 정도는 pH조건을 달리하여 인산 완충액 내에서 독소루비신 방출을 정량화하기 위해 측정되었다. 도 6 (d) 및 (e)는 PEC 베지클과 실린더 형태의 마이셀 각각으로부터 시간과 pH 의존적인 독소루비신의 방출을 나타냈다. 히드라존 링커가 가수분해하자마자, 컨쥬게이션된 독소루비신의 빠른 방출이 처음 6시간 pH 5.6에서 관찰되었으며, 독소루비신의 방출률은 PEC 베지클의 경우 ~30%, 실린더 형태의 마이셀의 경우 ~25%의 안정적 상태에 도달할 때까지 감소한다. PEC 나노구조체에 따른 누적 방출 프로파일(Cumulative release profiles)의 차이는 독소루비신의 확산 동역학에 영향을 주는 표면적, 온도-반응성에 기인한 것으로 보인다. 더욱이, pH 5.6에서 산분해성 링커의 완전한 가수분해가 일어나지 않았으며, 이는 독소루비신을 PEC 베지클의 소수성 막과 PEC 실린더 형태의 마이셀의 중심부에 각각 가두게 된다. 특히, 가수분해는 pH 5.6보다 pH 7.4에서 더 느려졌으며, 수용액 상태에서 히드라존 링커의 제거의 효율이 낮기 때문에 24시간 뒤에는 약의 방출 정도가 심지어5%보다 낮았다. 본 발명의 일 실시예는 독소루비신-컨쥬게이션된 PEC 나노구조체가 산에 민감한 히드라존 결합의 제거를 통해 낮은 pH에서도 pH에 의해 유발되는 독소루비신의 방출을 일으켜 효율적인 분자내 약물 전달을 가능하게 한다는 점을 보여준다.
　
결론
본 발명은, 순차적 RAFT 중합법　및 ROMP에　의해 전하를 띠고, 온도에 반응성이 있고 소수성인 블럭으로 구성된 두 종류의 선형 양친성 블럭 공중합체와 고분자 브러쉬를 제공한다. 이들은 수용액 상태에서 구형 마이셀과 실린더 형태의 마이셀로 비공유결합을 통해 자가조립하며, LCST보다 높은 온도에서 열에 의한 PNIPAM 사슬의 형태 변화를 통해 베지클로의 변형이 유도된다. 더욱이, PEC 베지클과 실린더 형태의 마이셀은 반대로 하전된 양친성 블럭 공중합체 또는 고분자 브러쉬 간의 정전기적 상호작용에 의해 형성되었고, 온도 변화에 따라 이들의 나노구조체의 차원이 변한다. 본 발명은 또한 서로 다른 pH에서 산에 의해 촉발되는 히드라존 분해에 의존하여 PEC 나노구조체로부터 독소루비신이 서로 다르게 방출됨을 보여주었다. 본 발명은 다음 세대의 약물 전달 시스템을 제공하는 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. i) 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭; ii) 자극반응성 고분자 블럭; 및 iii) 전하성 고분자 블럭으로 구성된, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체로서,
    상기 삼중블럭 공중합체가 자가조립되어 형성된 나노구조체는 하한 임계 온도(LCST) 이상에서 상기 자극반응성 고분자 블럭이 친수성에서 소수성이 되어 베지클을 형성하는 것을 특징으로 하는, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 전하성 고분자 블럭은 양전하성 고분자 블럭 또는 음전하성 블럭인, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 소수성 고분자 블럭은 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methymethacrylate)), 폴리N-터트부틸아크릴아마이드(poly(N-tert-butylacrylamide)) 및 폴리옥타데실아크릴아마이드 (B-poly(N-octadecylacrylamide) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것인, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 자극반응성 고분자 블럭은, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide)], 폴리(N-디에틸 아크릴아마이드)[poly (N,N'-diethyl acrylamide)], 폴리(N-하이드록시메틸 프로필 메타아크릴아마이드)[poly (N-(L)-(1-hydroxymethyl) propyl methacrylamide)], 폴리[올리고(에틸렌글리콜)메틸에테르메타크릴레이트] [Poly[oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate]], 폴리(2-비닐 피리딘)[poly(2-vinyl pyridine)], 및 폴리(4-비닐 피리딘) [poly(4-vinyl pyridine)] 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것인, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 양전하성 고분자 블럭은 2-디메틸아미노에틸메타크릴레이트(2-(dimethyl amino)ethylmethacrylate), 알릴아민(allylamine), 에틸렌이민(ethyleneimine), 비닐아민(vinyl amine), 2-비닐피리딘(2-vinyl pyridine), 및 4-비닐피리딘(4-vinyl pyridine) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것이고,
    상기 음전하성 고분자 블럭은 아크릴릭 액시드(acrylic acid), 메타크릴릭 액시드 (metacrylic acid), 이타코닉 액시드(itaconic acid), 및 말레익 액시드(maleic acid) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것인, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체.
  6. 주쇄인 폴리노보넨; 및 상기 주쇄에 결합된 곁사슬인 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체로 구성된, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자 브러쉬로서,
    상기 고분자 브러쉬가 자가조립되어 형성된 나노구조체는 하한 임계 온도(LCST) 이상에서 상기 자극반응성 고분자 블럭이 친수성에서 소수성이 되어 베지클을 형성하는 것을 특징으로 하는, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자 브러쉬.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 전하성 고분자 블럭은 양전하성 고분자 블럭 또는 음전하성 블럭인, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자 브러쉬.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 소수성 고분자 블럭은 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methymethacrylate)), 폴리N-터트부틸아크릴아마이드(poly(N-tert-butylacrylamide)) 및 폴리옥타데실아크릴아마이드 B-poly(N-octadecylacrylamide) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것인, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자 브러쉬.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 자극반응성 고분자 블럭은, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)[poly(N-isopropylacrylamide)], 폴리(N-디에틸 아크릴아마이드)[poly (N,N'-diethyl acrylamide)], 폴리(N-하이드록시메틸 프로필 메타아크릴아마이드)[poly (N-(L)-(1-hydroxymethyl) propyl methacrylamide)], 폴리[올리고(에틸렌글리콜)메틸에테르메타크릴레이트] [Poly[oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate]], 폴리(2-비닐 피리딘)[poly(2-vinyl pyridine)], 및 폴리(4-비닐 피리딘) [poly(4-vinyl pyridine)] 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것인, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자 브러쉬.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 양전하성 고분자 블럭은 2-디메틸아미노에틸메타크릴레이트(2-(dimethyl amino)ethylmethacrylate), 알릴아민(allylamine), 에틸렌이민(ethyleneimine), 비닐아민(vinyl amine), 2-비닐피리딘(2-vinyl pyridine), 및 4-비닐피리딘(4-vinyl pyridine) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것이고,
    상기 음전하성 고분자 블럭은 아크릴릭 액시드(acrylic acid), 메타크릴릭 액시드 (metacrylic acid), 이타코닉 액시드(itaconic acid), 및 말레익 액시드(maleic acid) 중 1 이상의 단량체를 포함하는 것인, 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자 브러쉬.
  11. 제 1 항의 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체가 자가조립되어 형성되고; 소수성 고분자 블럭이 코어(core)를, 자극반응성 고분자 블럭 및 전하성 고분자 블럭이 쉘(shell)을 구성하는 구형 마이셀 나노구조체.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 나노구조체는 동일한 전하성 고분자 블럭끼리 결합되어 자가조립된 것인, 구형 마이셀 나노구조체.
  13. 제 6 항의 자극반응성을 가진 양친성 노보넨 기반 고분자브러쉬가 자가조립되어 형성되고; 소수성 고분자 블럭이 코어(core)를, 자극반응성 고분자 블럭 및 전하성 고분자 블럭이 쉘(shell)을 구성하는 실린더형 마이셀 나노구조체.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 나노구조체는 동일한 전하성 고분자 블럭끼리 결합되어 자가조립된 것인, 실린더형 마이셀 나노구조체.
  15. i) 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭; ii) 자극반응성 고분자 블럭; 및 iii) 양전하성 고분자 블럭으로 구성된, 자극반응성 및 양전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 선형 블럭 공중합체와;
    i) 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭; ii) 자극반응성 고분자 블럭; 및 iii) 음전하성 고분자 블럭으로 구성된, 자극반응성 및 음전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 선형 블럭 공중합체를 혼합하여 전해질 복합체를 형성함으로써 제조된, 고분자 전해질 복합체 베지클로서,
    상기 베지클은 하한 임계 온도(LCST) 이상에서 상기 자극반응성 고분자 블럭이 친수성에서 소수성이 되어 형성된 것을 특징으로 하는, 고분자 전해질 복합체 베지클.
  16. 제 15 항의 베지클을 포함하는, 약물 전달체.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 pH 민감성인 것인, 약물 전달체.
  18. 주쇄인 폴리노보넨; 및 상기 주쇄에 결합된 곁사슬인 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-양전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체로 구성된, 자극반응성 및 양전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 고분자브러쉬와,
    주쇄인 폴리노보넨; 및 상기 주쇄에 결합된 곁사슬인 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-음전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체로 구성된, 자극반응성 및 음전하를 가지는 양친성 노보넨 기반 고분자브러쉬를 혼합하여 전해질 복합체를 형성함으로써 제조된, 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀로서,
    상기 마이셀은 하한 임계 온도(LCST) 이상에서 상기 자극반응성 고분자 블럭이 친수성에서 소수성이 되어 형성된 것을 특징으로 하는, 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀.
  19. 제 18 항의 고분자 전해질 복합체 실린더형 마이셀을 포함하는, 약물 전달체.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 pH 민감성인 것인, 약물 전달체.
  21. ROMP (ring-opening metathesis polymerization) 활성이 있고 노보넨 작용기로 기능화된 RAFT 연쇄이동반응제와 소수성 분자를 이용하여 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭을 제조하는 단계;
    상기 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭에, 자극반응성 분자 및 개시제를 첨가하고 중합을 진행하여 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭-자극반응성 블럭의 이중블럭 공중합체를 제조하는 단계; 및
    상기 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭-자극반응성 블럭의 이중블럭 공중합체에, 전하성 분자를 첨가하여, 노보넨 말단기를 가진 소수성 블럭-자극반응성 블럭-전하성 블럭으로 구성된 선형 블럭 공중합체를 제조하는 단계;
    를 포함하는, 자극반응성을 가지는 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체의 제조방법으로서,
    상기 삼중블럭 공중합체가 자가조립되어 형성된 나노구조체는 하한 임계 온도(LCST) 이상에서 상기 자극반응성 고분자 블럭이 친수성에서 소수성이 되어 베지클을 형성하는 것을 특징으로 하는, 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체의 제조방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 선형 블럭 공중합체를 제조하는 단계에서, 상기 노보넨기가 링 오프닝 되면서 중합되는 것인, 양친성 노보넨 기반 삼중블럭 공중합체의 제조방법.
  23. 노보넨 말단기를 가진 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-전하성 고분자 블럭으로 구성된 선형 삼중블럭 공중합체를 준비하는 단계; 및
    상기 선형 삼중블럭 공중합체에 3세대 Grubbs 촉매를 첨가하고 ROMP(ring-opening metathesis polymerization)를 통해 폴리노보넨을 주쇄로, 소수성 고분자 블럭-자극반응성 고분자 블럭-전하성 고분자 블럭으로 구성된 삼중블럭 공중합체를 곁사슬로 가지는 고분자 브러쉬를 제조하는 단계;
    를 포함하는, 고분자 브러쉬 제조방법으로서,
    상기 고분자 브러쉬가 자가조립되어 형성된 나노구조체는 하한 임계 온도(LCST) 이상에서 상기 자극반응성 고분자 블럭이 친수성에서 소수성이 되어 베지클을 형성하는 것을 특징으로 하는, 고분자 브러쉬의 제조방법.
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