KR102319190B1 - 신장 질환 진단용 바이오 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소변에 포함된 cMet 단백질 수준으로부터 피험체의 신장 질환을 진단하거나, 예후를 예측할 수 있는, 조성물, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다.

Description

신장 질환 진단용 바이오 마커 {Biomarkers for predicting prognosis of kidney disease}

본 발명은 신장 질환 예후(prognosis)를 예측할 수 있는 바이오 마커에 관한 것이다.

소변에서 알부민과 같은 과량의 단백질이 발견되는 것은 신장 질환이 있음을 나타내는 표지이다.당뇨병성 신장 질환은 이러한 질환 중 하나이다. 과량의 알부민이 검출된 시점부터, 신장 질환은 비가역적이고 치료 효과가 낮아지는 단계까지 진행될 수 있다. 따라서 공지된 방사선면역검정보다 더 빠르고 정확한 검사 방법을 개발하여 질환 초기에 진단하여 예방하거나 치료를 시작할 수 있도록 하는 것이 중요하다. 알부민이 포함된 소변과 같은 단백뇨는 신장 질환, 예를 들어, 당뇨병성 신증, 박테리아성 당뇨병성 신증 및 바이러스성 당뇨병성 신증, IgA 신장염, 헤노호 쉬라인 자반증 (Henoch-Schonlein Purpura), 박증식성 사구체 신염(membranoproliferative glomerulonephritis), 막성 사구체 신염(membranous nephropathy), 쇼그렌 증후군 (Sj

gren's syndrome), 신증후군, 급성 신부전, 급성 세뇨관 간질성 신염, 급성 신우신염, 임신중독증, 신장 이식 거부, 나병, 역행성 신증(reflux nephropathy), 신장결석, 수신 낭성 신증, 다낭포성 신장 질환, 상염색체우성 다낭신장병, 상염색체열성 다낭신장병, 결절성 경화증, 폰합펠-린다우 병(von Hippel-Lindau disease), 박사구체 기저막 질환(familial thin-glomerular basement membrane disease), 콜라겐 III 사구체병증, 섬유소 신전 사구체 병증, 알포트 증후군(Alport's syndrome), 파브리병(Fabry's disease), 조슬개골 증후군(Nail-Patella syndromee), 선천성 비뇨기과 이상, 다발성 골수종, 아밀로이드증, 단일 클론성 모 병증, 가족성 메디테란열, HIV 감염(AIDS), 전신성 혈관염, 결절성 다발동맥염, 베게너 육아종증, 다동맥염, 괴사 및 초승달성 사구체 신염, 다발성 근염 - 피부염, 췌장염, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 통풍, 주머니 세포 질환, 혈전증, 자반성구강내막, 용혈뇨 증후군, 급성 코르티콜 괴사, 신장 혈전 색전증, 신장샘암종, 흑색종, 림프관 종양, 다발성 골수종, 심근 경색, 심장 마비, 말초 혈관 질환, 고혈압, 관상 동맥 심장 질환, 비-죽상 경화성 심혈관 질환, 죽상 경화성 심혈관 질환, 건선, 전신 경화증, COPD, 폐쇄성 수면 무호흡증, 고지대 저산소증, 선단 비대증, 당뇨병, 및 요붕증을 포함하는 질환 마커이다. 신장 질환은 세균 감염, 알레르기, 선천성 결함, 돌, 항생제, 면역 억제제, 항암제, 비 스테로이드 항염증제, 진통제, 중금속, 종양, 화학 물질로 인해 발생할 수 있다

알부민을 측정하기 위한 방법으로는 비색법으로서 HABA법 또는 BCG법, 및 침전법으로서 염석법이 있다. 비색법은 알부민이 HABA 또는 BCG 색소와 결합하는 성질을 이용하여 측정하는 방법이나, HABA법은 용혈이나 혼탁한 혈청은 부정확하고, 감도가 좋지 않으며, 온도에 의한 정색이 불안정하며, pH에 민감하다는 단점이 있고, BCG법 역시 용혈이나 혼탁한 혈청은 부정확하고, 감도가 좋지않으며, 온도 및 pH에 민감하다는 단점이 있다. 또한 염석법은 다른 단백질과 공전물이 함께 침전되기 쉬워 분별이 예민하지 않고, 단백질의 농도가 높아야하며, 탈염조작이 필요하다는 단점이 있다.

한편 LI Xing et al., “Expression of c-met Stimulated by High Glucose in Human Renal Tubular Epithelial Cells and Its Implication”, Journal of Huazhong University of Science and Technology, 27 (2): 161-163, 2007에서는 cMet이 당뇨병성 신장 질환의 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 기재한다. 또한, Youhua Liu, et al., “In vivo and in vitro evidence for increased expression of HGF receptor in kidney of diabetic rat”, American Journal of Physiology: Renal Physiology, 271(6): F1202-F1210, 1996에서는 당뇨병 쥐의 신장에서 cMet의 발현이 증가됨을 확인하였다. 이러한 c-Met과 당뇨병성 신장 질환의 관련성에 관하여는 이미 연구가 이루어진 바 있으나, 종래의 연구는 신장 조직에서 cMet에 관한 것이어서, 조직검사를 수행하지 않고서는 이용하기 어려운 바이오마커였다.

또한, 사구체 신염 등의 정확한 진단을 위하여 신장 조직검사가 이용되지만, 신장주위 혈종, 육안적 혈뇨, 감염, 및 동정맥루와 같은 조직검사에 의한 합병증 발생의 위험이 존재하며, 이러한 합병증을 치료하기 위하여서는 카테터 삽입 등 수술적 처치가 필수적이라는 점에서, 간편하게 신장 기능을 확인할 수 있는 검정법이 필요한 실정이다.

LI Xing et al., "Expression of c-met Stimulated by High Glucose in Human Renal Tubular Epithelial Cells and Its Implication", Journal of Huazhong University of Science and Technology, 27 (2): 161-163, 2007. Youhua Liu, et al., "In vivo and in vitro evidence for increased expression of HGF receptor in kidney of diabetic rat", American Journal of Physiology: Renal Physiology, 271(6): F1202-F1210, 1996

본 발명은 신장 조직 검사를 이용하지 않고 신장 질환을 진단하거나 예후를 예측할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 소변에 포함된 cMet 단백질에 특이적으로 결합하는 결합분자를 포함하는, 소변으로부터 신장 질환을 진단하거나 신장 질환의 예후를 예측하기 위한 키트.

2. 항목 1에 있어서, 상기 결합분자는 항-cMet 항체인, 키트.

3. 항목 1에 있어서, 상기 신장질환은 급성 신손상, 말기 신장 질환(end-stage kidney disease; ESKD), 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병성 신장 질환 (DN), IgA 신장염 (IgAN), HIV- 관련 신증, 비 당뇨병성 만성 신장질환, 국소분절사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), 미세변화형 신증후군 (MCD), 및 크산틴 옥시다아제 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 질환인, 키트.

4. 소변에 포함된 cMet 단백질에 특이적으로 결합하는 결합분자를 포함하는, 소변으로부터 신장 질환을 진단하거나 신장 질환의 예후를 예측하기 위한 조성물.

5. 피험체로부터 수득한 소변 시료에 포함된 cMet 단백질 수준을 측정하는 제1 측정 단계; 소정의 시간 후에 동일한 피험체로부터 수득한 소변 시료에 포함된 cMet 단백질 수준을 측정하는 제2 측정 단계; 및 상기 제1 측정 단계의 cMet 단백질 수준 및 상기 제2 측정 단계의 cMet 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 신장 질환을 진단하거나 신장 질환의 예후를 예측하기 위한 방법.

6. 항목 5에 있어서, 상기 제2 측정 단계의 cMet 단백질 수준이 상기 제1 측정 단계의 cMet 단백질 수준보다 높은 경우 신장 질환이 있는 것으로 진단하거나, 신장 질환의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는, 방법.

7. 항목 5 또는 6에 있어서, cMet 단백질 수준은 cMet에 특이적으로 결합하는 결합분자를 이용하여 측정되는, 방법.

8. 항목 7에 있어서, 상기 결합분자는 항-cMet 항체인, 방법.

9. 항목 5 또는 6에 있어서, 상기 소정의 시간은 적어도 3개월인, 방법.

10. 항목 5 또는 6에 있어서, 상기 신장질환은 급성 신손상, 말기 신장 질환(end-stage kidney disease; ESKD), 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병성 신장 질환 (DN), IgA 신장염 (IgAN), HIV- 관련 신증, 비 당뇨병성 만성 신장질환, 국소분절사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), 미세변화형 신증후군 (MCD), 및 크산틴 옥시다아제 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 질환인, 방법.

11. 피검체의 소변에서 cMet 단백질 수준을 측정하는 제1 측정 단계; 피검체에 분석 대상 시료를 주입하는 단계; 및 피검체의 소변에서 cMet 단백질 수준을 측정하는 제2 측정 단계를 포함하고, 제2 측정 단계의 cMet 단백질 수준이 제1 측정 단계의 cMet 단백질 수준보다 낮은 경우 상기 분석 대상 시료는 신장 질환 치료용 물질이고, 상기 피검체는 인간을 제외한 포유류인, 신장 질환 치료용 물질의 스크리닝 방법.

본 발명에 따른 인간의 소변으로부터 신장 질환을 진단하거나 예후를 예측할 수 있는 조성물, 키트, 및 방법은 비침습적이고 저렴하다는 장점이 있다.

본 발명에 따른 인간의 소변으로부터 신장 질환을 진단하거나 예후를 예측할 수 있는 방법은 의사의 임상적 소견 없이도 시간의 흐름에 따른 변화량을 비교함으로써 신장 질환을 진단하거나 예후를 예측할 수 있다.

도 1은 cMet 수준과 신장 기능의 관련성을 나타낸 것이다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 2 소변의 cMet 수준을 신장 기능 (A) 및 소변의 단백뇨 (B)에 의해 계층화한 것이다. **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 3은 ESRD(A), 모든 원인의 사망(B) 및 복합 결과 (C)에 관한 Kaplan-Meier 환자 생존률 곡선이다.
도 4A는 건강한 인간 사구체의 사구체 내피 세포, 발세포 (podocytes), 혈관사이세포, 및 근위 세뇨관 세포(proximal tubular epithelial cell; PTEC)에 대한 면역형광 분석한 결과이고 (DAPI (파랑), cMet (녹색), CD31, 네프린, 데스민, 및 AQP1 (빨강)); 도 4B는 정상 대조 피험체와 비교하여 당뇨병성 신장 질환 환자로부터의 사구체에서는 인산화된 cMet의 수준이 증가됨을 보여주는 결과이다 (DAPI (파랑), 인산화된-cMet (빨강)).
도 5는 IgA 신장염 환자들 중 소변의 cMet 농도가 중앙값 이상인 환자군(파랑)과 중앙값 미만인 환자군(초록)의 생존 기간을 표시한 Kaplan-Meier 생존 곡선이다.

이제 본 발명은 첨부된 도를 참조로 하기에서 더욱 충분히 기술될 것이며, 그러나 본 발명의 전부가 아닌 단지 일부의 구체예가 예시된다. 실제로, 이들 발명은 많은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에 제시된 구체예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수 형태는 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수한 대상을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서 소변에 포함된 cMet 단백질에 특이적으로 결합하는 결합분자를 포함하는, 소변으로부터 신장 질환을 진단하기 위한 조성물 및/또는 키트를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 결합분자는 항체 또는 이의 변이체일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서, 시료에 포함된 cMet 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 신장 질환의 예후를 예측하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 소변인 것이 바람직하다. 소정의 시간 간격으로, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회 또는 적어도 5회 이상 소변에 포함된 cMet 단백질의 수준을 측정하고, 시간이 지남에 따라 상기 cMet 단백질 수준이 증가하거나, 증가하는 경향으로 나타나는 경우, 피험체는 신장 질환을 가진 것으로 진단할 수 있거나, 신장 질환의 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소정의 시간은 임상적으로 의미 있는 것으로 여겨지는 시간 간격으로서, 예를 들어, 3개월 이상일 수 있다.

건강한 피검체의 사구체에서는 cMet이 발현된다 (도 4A). 한편, 본 발명에서는 신장 질환을 갖는 환자에서 예후가 좋지 않을수록 소변에서 검출되는 수용성 cMet의 농도 또는 cMet/Cr 수준이 증가됨을 확인하였다. cMet 발현이 인간 사구체 내피 세포(glomerular epithelial cell; GEC)에서 증가되므로, 소변에서 발견되는 수용성 cMet은 신장으로부터 유래된 것임을 알 수 있다 (Li, J. et al. Blockade of endothelial-mesenchymal transition by a Smad3 inhibitor delays the early development of streptozotocininduced diabetic nephropathy. Diabetes 59, 2612-2624 (2010)), (Wajih, N., Walter, J. & Sane, D. C. Vascular origin of a soluble truncated form of the hepatocyte growth factor receptor (c-met). CircRes 90, 46-52 (2002).).

본 발명에서, 당뇨병성 신장 질환 진단 시점에 소변의 cMet/Cr 수준은 UPCR(urine protein-to-creatinine ratio)과 유의적으로 관련되어 있고, eGFR(estimated GFR)과는 역상관되어 있다. 그러나 cMet/Cr은 만성 신장 질환 (chronic kidney disease; CKD) 단계 V 환자에서 주로 증가되었다. 이러한 결과는 cMet 여과는 신장 기능이 악화될 때 증가됨을 의미한다.

혈청 크레아티닌 및 UPCR과 같은 통상의 진단 마커들과 비교했을 때, cMet 단독으로도 ROC 분석에서 바이오마커로서 활용성을 보여준다. 말기 신장 질환 (End stage renal disease; ESRD) 예측력을 확인하기 위하여, 당뇨병성 신장 질환의 진단 시, 소변의 cMet/Cr의 부가적인 예측 수행을 평가하였다. ESRD를 가진 환자들은 상대적으로 높은 수준의 소변 수용성 cMet/Cr을 보였다.

소변은 비침습적인 방법으로 수득할 수 있으므로, 바이오마커 분석을 위한 단백질의 유용한 원천이다. 따라서, 신규한 바이오마커를 확인하기 위해 소변 시료를 사용하는 것은 임상적으로 의미가 있다. 그러나 소변 시료는 부피, 단백질 농도, 총 단백질 양, 및 pH가 다양하고, 저장 시 부패될 수 있다. 이러한 문제점을 고려하여, LLOQ, 희석 선형성, 및 대구법(parallelism)과 같은 몇몇 지표로 cMet ELISA 키트를 평가하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 소변 중에 포함된 cMet 단백질의 수준에 기반한 예측 또는 진단 모델이 제공된다. 모델은 소프트웨어 코드의 형태, 컴퓨터 판독가능한 포맷 또는 바이오마커의 상대 발현을 평가하기 위한 서면 지시서의 형태일 수 있다.

발명의 용어 “신장 질환”은 신장의 손상을 야기하는 질환을 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 급성 신손상, ESKD, 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병성 신장 질환 (diabetic nephropathy, DN; 또는 diabetes mellitus nephropathy, DMN), IgA 신장염 (IgAN), HIV- 관련 신증, 비 당뇨병성 만성 신장질환, 국소분절사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), 미세변화형 신증후군 (MCD), 및 크산틴 옥시다아제 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 질환을 포함한다.

급성 신손상은 신기능의 급격한 저하를 특징으로 하는 질환으로, 신기능의 작은 변화부터, 신대체 요법을 요하는 단계의 신부전까지를 모두 포함한다. 혈청 크레아티닌 수준 및 소변량의 변화에 따라 “Risk”, “Injury” 및 “Failure”의 3단계로 구분하며, 신손상의 최종 결과에 따라 “Loss”와 End-Stage Kidney Disease”의 범주가 포함된다. 각각의 범주는 하기와 같이 구분된다:

Risk: 크레아티닌 수준 1.5배 증가 또는 사구체 여과율 (glomerular filtration rate; GFR) 25% 초과 감소, 및 소변량 0.5mL/kg/h X 6 hr 미만;

Injury: 크레아티닌 수준 2배 증가 또는 GFR 50% 초과 감소, 및 소변량 0.5mL/kg/h X 12 hr 미만;

Failure: 크레아티닌 수준 3배 증가 또는 GFR 75% 초과 감소, 및 소변량 0.3mL/kg/h X 24 hr 미만 또는 12시간 무뇨;

Loss: 지속된 급성 신부전 = 4개월 초과 동안 신장 기능의 완전한 상실

ESKD: 3개월 초과 동안 말기 신장 질환 (Bellomo R, et al., Acute Dialysis Quality Initiative workgroup. Acute renal failure - definition, outcome measures, animal models, fluid therapy and information technology needs: the Second International Consensus Conference of the Acute Dialysis Quality Initiative (ADQI) Group. Crit Care 2004;8:R204-R212.).

피험자가 3개월 이상 신장 기능 또는 구조에 문제가 있는 경우, 만성 신장 질환 (chronic kidney disease; CKD)를 갖는 것으로 진단한다. CKD는 기본적으로 신장의 기능이 잘 작동되는지 여부를 기준으로 I 단계부터 V 단계로 구분된다. 초기 단계 (I 단계)에서는 신장은 여전히 혈액으로부터 노폐물을 여과할 수 있지만, 말기 단계(V 단계)에서는 여과 기능을 수행할 수 없고, 작동을 거의 멈추게 된다. 각 단계는 GFR 수준에 따라 하기와 같이 구분된다:

단계 I: GFR ≥ 90;

단계 II: 60 ≤ GFR < 90;

단계 IIIa: 45 ≤ GFR < 60;

단계 IIIb: 30 ≤ GFR < 45;

단계 IV: 15 ≤ GFR < 30;

단계 V: GFR < 15.

GFR은 단위 시간당 여과되는 체액의 양을 나타낸다. eGFR (estimated GFR)은 혈중 크레아티닌 농도, 나이, 성별 및 인종을 변수로 하여 계산될 수 있다.

크레아티닌(creatinine, Cr)은 근육 대사의 부산물로서, 건강한 신장은 크레아티닌을 혈액으로부터 제거하고 소변으로 몸에서 배출시킨다. 하루 중 실질적으로 일정한 양이 소변에 배출되는 특징을 갖는다. 피험자의 단백뇨 측정을 위하여 24시간 동안의 소변 검사가 가장 정확할 것이나, 현실적인 어려움으로 인하여, 소변에 포함된 특정 단백질과 크레아티닌의 비율을 측정함으로써, 시간에 구애 받지 않고, 신장 기능을 확인하는 데에 이용된다. 소변 중 크레아티닌의 농도는, 예를 들어, Jaffe 법, 액체 크로마토그래피, 질량분석, 또는 ELISA를 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 분야에서 널리 알려진 방법에 따라 측정이 가능하다.

cMet(NP_000236, NP_001120972, NP_001311330, 또는 NP_001311331)은 타이로신-단백질 키나아제 Met 또는 간세포 성장 인자 수용체 (hepatocyte growth factor receptor; HGFR)로서 알려져 있으며, 인간에서 MET 유전자에 의해서 인코딩되는 단백질이다. 타이로신 키나아제 활성을 가지며, 배아 발달, 기관형성, 및 상처 치료에 필수적인 역할을 한다. 간세포 성장 인자 및 이의 절단된 동형 단백질 NK1, 및 NK2는 MET 수용체의 리간드이다. HGF와 cMet은 모두 다양한 세포에서 발현한다고 알려져 있다. HGF-cMet 신호 전달 과정은 다양한 종류의 암, 신경 퇴행성 질환, 말초 혈관 질환등과 연관되어 있는 것으로 알려졌으며, 이에 따라, HGF-MET 신호 전달 과정을 활성화시키거나 억제하는 다양한 종류의 제재가 치료제로서 개발되고 있다.

콕스 비례 위험 모델(Cox proportional hazards model)은 시간-사망 데이터의 예측 모형을 만드는 통계분석 모형이다. 관측치(observations)는 독립이어야 하며 위험 비율은 시간에 관계없이 일정하다는 '비례 위험 가정'이 필요하다. 콕스 모델은 여러 가지 교란변수(confounding variable)를 통제한 상태에서 집단들 간의 생존율을 비교하는 경우, 혹은 여러 변수들이 동시에 생존 기간에 미치는 영향을 알아보고자 할 때 널리 쓰이는 다변량 분석 방법이다.

Kaplan-Meier 생존 곡선은 사망 시점마다 구간생존율을 구하여 이들의 누적으로서 누적생존율을 추정하는 방식이다. Kaplan-Meier 생존분석은 누적-한계 추정법(product-limit method)이라고도 불린다. 관찰기간의 순서대로 관찰 대상 수 중 생존자수의 분율로 구간생존율(P(t))를 계산한다. 누적생존율(S(t))은 각 구간별 구간생존율을 차례로 곱함으로써 추정할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 “신장 질환의 진단용 키트”는 신장 질환의 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 상기 키트는 키트를 사용하기 위한 방법이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 “바이오 마커”, “단백질 마커”, "진단용 마커”, “진단하기 위한 마커” 또는 “진단 마커”는 상호 교환적으로 사용 가능하고, 생체 내에 존재하는 생물학적 표지물질로써 질병의 진단, 예후, 치료에 대한 반응 등을 나타내거나 예측할 수 있는 물질을 의미하고, 저위험군 신장 질환 환자 유래 세포에 비하여 고위험군 신장 질환 환자 유래 세포에서 증가 양상을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들어, DNA, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 신장 질환 진단 마커는 소변에서 발견되는 cMet 단백질로서, 고위험군 신장 질환 환자 유래 세포에서 증가된 발현 양을 보인다.

본 발명의 용어 "측정"은 시료 중 마커의 존재 또는 부재를 검출하는 것, 시료 중 마커의 양을 정량하는 것, 및/또는 바이오마커의 유형을 확인하는 것을 포함하는 방법을 의미한다. 측정은 당 분야에 공지된 방법 및 본원에 추가로 기재된 방법에 의해 수행될 수 있고, 비제한적으로 SELDI 및 면역검정을 포함한다. 본원에 개시된 마커 중 하나 이상을 검출하고 측정하기 위해 어떠한 적합한 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법으로는, 비제한적으로, ELISA, 웨스턴블랏, 질량 분광분석법 (예컨대, 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법), 형광 (예컨대, 샌드위치 면역 검정), 표면 플라즈몬 공명, 타원계측법 및 원자력 현미경이 있다.

당업자는 본 명세서에 기재되고 청구된 대로 시료 중 바이오마커의 수준을 측정하기 위해 광범위하게 다양한 분석적 기법이 이용될 수 있음을 인지할 것이다. 당업자가 이용 가능한 다른 유형의 결합 시약을 샘플 중 지시된 분석물의 수준을 측정하는데 활용할 수 있다. 예를 들어, 주어진 분석물의 수준을 평가하기에 적절한 다양한 결합제 또는 결합 시약은 과학 문헌에서 용이하게 확인할 수 있다. 일반적으로, 적절한 결합제는 분석물에 특이적으로 결합할 것이고, 바꾸어 말해, 이것은 분석물과 검출 가능한 수준으로 반응하지만 그 밖의 분석물 또는 관련이 없는 분석물과는 검출가능하게 반응하지 않는다 (또는 제한된 교차-반응성으로 반응한다). 적절한 결합제는 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 앱타머, RNA 분자 등을 포함하는 것으로 고려된다. 면역형광법, 질량분석 법, 핵자기공명 및 광학 분광학 방법을 포함하는 분광학적 방법을 또한 이용하여 분석물의 수준을 측정할 수 있다. 활용되는 결합제에 따라, 샘플을, 예를 들어 희석, 정제, 변성, 분해, 단편화 등에 의해 가공시킨 후 당업자에게 공지된 대로 분석할 수 있다.

확인된 바이오마커는 면역검정을 위해 다수의 에피토프 및/또는 결합제의 다른 유형에 대한 결합 부위를 지닐 수 있는 것으로 또한 고려된다. 따라서, 확인된 바이오마커의 펩티드 단편 또는 다른 에피토프, 특수한 단백질 의 아이소형 및 심지어 생물학적 경로의 상류 또는 하류에 있거나 번역후 변형된 화합물은 관련 및 상대 화학량론이 적절하게 고려되는 한 확인된 분석물 또는 바이오마커를 대신할 수 있는 것으로 고려된다. 당업자는 대안적인 항체 및 결합제의 다양한 특이성 및 결합 친화성이 분석에 감안되는 한, 임의의 특정 분석물의 수준을 측정 하기 위해 대안적인 항체 및 결합제가 사용될 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명의 방법 및 시험 키트에 이용된 분석물 또는 바이오마커의 발현 수준을 측정 또는 결정하기 위해 다양한 알고리즘을 이용할 수 있다. 그러한 알고리즘은 단순한 컷-오프 값의 측정을 넘어선 분석물 수준을 측정할 수 있을 것으로 일반적으로 고려된다. 따라서, 그러한 알고리즘의 결과는 일반적으로 미국 식품의약국에 의한 다지표 검사로서 분류될 것으로 고려된다. 특수한 유형의 알고리즘은, 예를 들어, 지식 발견 엔진(KDE™회귀 분석, 판별 분석, 분류 트리 분석, 랜덤 포리스트, ProteomeQuest®서포트 벡터 머신, One R, kNN 및 휴 리스틱 나이브 베이즈 분석, 신경망 및 이들의 변형을 포함한다.

본 발명에서 "항체" 또는 “결합 단백질”이란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 전체 항체 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 본 발명에서, 상기 항체는 미소입자와 접합된 항체일 수 있다. 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다. 본 발명에서, 상기 항체는 상기 서술한 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있고, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 키트는 면역분석용 키트이고, 일 실시예에서 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.

상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트는 본 발명에 따른 단백질 마커에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.

본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, ELISA 키트, 또는 면역학적 도트 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 복합 마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 신장 질환 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

단백질 발현수준 측정은 ELISA법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 신장 질환 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 신장 질환 발병 여부를 확인할 수 있다.

상기 신장 질환 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기 영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 신장 질환 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 단백질의 양과 신장 질환이 발병한 환자로부터 수득된 시료에서의 마커 단백질의 양을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

상기 신장 질환 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 신장 질환신장 질환 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 용어 "발현"은 코딩 서열에 의해 코딩된 생성물의 생물학적 생산을 지칭한다. 대부분의 경우에서, 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열은 전사되어 메신저-RNA(mRNA)를 형성한다. 이어서, 상기 메신저 RNA는 번역되어 관련 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 생성물을 형성한다. 또한, 발현 과정은 RNA 전사 생성물에 대한 추가 가공 단계(예를 들면, 인트론을 제거하기 위한 스플라이싱), 및/또는 폴리펩티드 생성물의 번역-후 가공을 포함할 수 있다.

본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 소변을 의미한다.

생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있으며, 본 발명에서 마커로 사용되는 단백질 서열은, 이들 서열과 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

아미노산 서열에 대해, 용어 "동일한"은 최적으로 정렬되고, 적절한 삽입 또는 결실과 함께 비교되는 경우 2개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다.

2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 개수 / 위치의 전체 개수 × 100)이다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적인 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 이용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 문헌[Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.

예로서, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 참조 서열과 동일, 즉, 100% 동일할 수 있거나, 이는 % 동일성이 100% 미만이 되도록 참조 서열에 비해 특정 정수 개수 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은 적어도 하나의 아미노산 결실, 보존성 및 비-보존성 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 변경은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 또는 카르복시-말단 위치, 또는 참조 서열 내의 아미노산 중 개별적으로 산재된 상기 말단 위치 사이 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적 군 내에 어디에서도 발생할 수 있다. 제공된 동일성 %에 대한 아미노산 변경의 개수는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체 수에 (100으로 나누어진) 각각의 동일성 퍼센트의 숫자상 퍼센트를 곱한 후, 폴리펩티드 참조 서열 내의 아미노산의 상기 전체 수로부터 상기 곱을 공제하거나, 하기 식에 의해 결정된다:

n_a≤x_a - (x_a·y).

상기 식에서, n_a는 아미노산 변경의 개수이고, x_a는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체 수이고, y는, 예를 들어, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85 등이고, x_a 및 y의 임의의 비-정수 곱은 x_a로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서, 피검체의 소변에서 cMet 단백질 수준을 측정하는 제1 측정 단계; 피검체에 분석 대상 시료를 주입하는 단계; 및 피검체의 소변에서 cMet 단백질 수준을 측정하는 제2 측정 단계를 포함하고, 제2 측정 단계의 cMet 단백질 수준이 제1 측정 단계의 cMet 단백질 수준과 같거나 낮은 경우 상기 분석 대상 시료는 신장 질환 치료용 물질이고, 상기 피검체는 인간을 제외한 포유류인, 신장 질환 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 용어 "또는 이의 조합"은 이 용어 앞에 나열된 아이템의 모든 순열 및 조합을 나타낸다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 및 특정 상황에서 순서가 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중 하나 이상을 포함한다.

하기 실시예는 오직 예시목적으로 의도되며, 어떠한 식이든 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예

통계 분석

ROC 곡선으로부터 계산된, 소변에서 2.9ng/ml cMet 컷오프 또는 4.9 ng/mg cMet/Cr 컷오프를 사용하여 환자를 2개의 군으로 나누었다. ESRD 및 사망에 대한 소변의 cMet 또는 cMet/Cr 수준의 영향을 확인하기 위하여, 소변의 cMet 또는 cMet/Cr 수준에 의해 계층화된 Kaplan-Meier 생존 곡선을 로그 순위 검정(log-rank tests)과 비교하였다.

당뇨병성 신장 질환 진단 시점에 시간-고정 소변의 cMet 또는 cMet/Cr 수준의 콕스 비례 위험 모델(Cox proportional hazard models)을 다변량 생존 분석(multivariate survival analyses)에 사용하였다. 단변량 분석(univariate analysis)에서 확인된 중요한 공변량(covariates) 및 임상적으로 중요한 공변량을 최후의 다변수 분석(multivariable-adjusted analysis)에 포함시켰고, 이는 후진 단계별(backward stepwise) 방식으로 수행하였다. 각 모델에 대한 적용된 공변수는 하기와 같다: 모델 1, 연령, 성별, 고혈압, Hb, 알부민, AST, ALT, 요산, 콜레스테롤, Ca, 및 P; 및 모델 2, 연령, 성별, 고혈압, Hb, 알부민, AST, ALT, 요산, 콜레스테롤, Ca, P, GFR, 및 PCR.

소변의 수용성 cMet 수준을 혈청 크레아티닌 및 UPCR(urine protein-to-creatinine ratio)과 같은 공지의 변수들에 포함시키기 전 및 후의 증가된 예후 값을 시험하기 위하여, 두 가지의 ROC 곡선 아래 면적 (AUC) 사이의 차이의 통계학적 유의성을 공지의 방법(DeLong, E. R., DeLong, et al., Biometrics 44, 837-845 (1988))에 따라 계산하였다. 추가적으로, 모델의 예측 정확성의 변화를 Pencina, M. J., et al., Stat Med 27, 157-172, discussion 207-112 (2008)에 따라 상대적 IDI 및 cfNRI로 계산하였다.

모든 통계적 분석은 SPSS 버전 22 (IBM, Chicago, Illinois, United States) 및 R (version 3.2.5; The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)로 수행하였다. P 값이 0.05 미만인 경우, 통계적으로 유의함을 나타낸다.

실시예 1. 만성 신장 질환 환자에서 기저 특성 및 소변의 수용성 cMet

본 발명에서 당뇨병성 신장 질환(diabetic nephropathy; DN)으로 임상적으로 진단받은 환자 218명 중 20명의 환자는 생검으로 확진되었으며, 신장 이식 예정인 환자 또는 18세 미만의 환자는 제외되었다.

진단 시의 연령, 성별, BMI (body mass index), 수축기 및 팽창기의 혈압, 및 예를 들어, 고혈합 및 당뇨병과 같은 동반 질환의 인구통계학적 및 임상적 정보를 의료 기록으로부터 확보하였다.

CBC(complete blood cell counts), 헤모글로빈 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(Aspartate aminotransferase; AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(alanine aminotransferase; ALT), 알부민, 요소, 크레아티닌, 칼슘, 인, 콜레스테롤, 글루코오스, 및 HbA1c의 의 혈청 수준을 포함한 실험 값을 수집하였다. 소변에 포함된 단백질 및 크레아티닌 수준을 측정하였고, 소변에 포함된 단백질 대 크레아티닌 비(protein-to-creatinine ratio; UPCR)를 계산하였다.

실험 값은 ISE900 모듈을 갖는 Modular D2400 분석기 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japan) 및 Cobas 8000 Modular 분석기 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. eGFR은 CKD-EPI 크레아티닌 식을 통해 계산하였다.

참가자의 기저 특성은 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표에서 각 수치는 전체 환자에 대한 카테고리에 속한 환자의 비율(%)을 나타낸 것이고, 1열의 1 내지 5는 각각 CKD의 I 내지 V 단계를 나타내며, 각 수치는 평균±표준편차로 기재하였다. 각 약어는 하기와 같다: BMI: 체질량지수(body mass index); SBP: 수축기 혈압(systolic blood pressure); DBP, 확장기 혈압(diastolic blood pressure); eGFR, 평가된 사구체 여과율(estimated glomerular filtration rate) (CKD-EPI 크레아티닌 방정식에 의함); PCR, 단백질-대-크레아티닌 비(protein-to-creatinine ratio).

연령의 중앙값은 61.3세였고, 138명의 환자는 남성이었다. 혈청 크레아티닌은 3.09 ± 2.40 mg/dl였고, CKD-EPI 크레아티닌 방정식에 따라 계산하였을 때, 추정된 사구체 여과율(glomerular filtration rate; GFR)은 33.9 ± 28.1 ml/min/1.73 m²였다.

CKD 단계가 I 에서 V로 진행될수록, UPCR, 소변의 cMet, 및 cMet/Cr 수준이 높아짐을 확인할 수 있다.

실시예 2. ELISA를 이용한 소변의 cMet의 수준 측정

수용성 cMet ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA), Lot nos: 1696848A2 및 1877133A)는 생산자가 제공한 설명서에 따라 수행하였다. 수용성 cMet에 대한 최소 정량한계(Lower Limit of Quantification; LLOQ)는 0.78 ng/ml 였다. 인간 소변 시료에서 발견된 유의한 매트릭스 효과(matrix effect)는 없었다.

ELISA로 측정된 소변의 수용성 cMet 수준은 만성 신장 질환 단계 I, II, III, 또는 IV 환자에 비하여 만성 신장 질환 단계 V 환자에서 유의적으로 높았다(P < 0.001). 이러한 경향은 소변의 수용성 cMet 수준을 소변의 크레아티닌에 따라 조정한 후에도 변하지 않았다 (도 1 및 표 1).

또한, 소변의 cMet 수준은 eGFR이 30 ml/min/1.73 m²이상인, 상대적으로 신장 기능이 보존된 환자 (1.86 ± 4.77 ng/ml, P = 0.001) 에 비하여 eGFR이 30 ml/min/1.73 m²미만인, 신장 기능이 떨어진 환자(5.25 ± 9.62 ng/ml, P = 0.001)에서 더 높게 나타났다 (도 2A). 또한 소변의 cMet 수준은 부-신증성 단백뇨(sub-nephrotic proteinuria) 환자(1.15 ± 2.28 ng/ml, P < 0.001)에 비하여 신증성 단백뇨(nephrotic proteinuria)를 가진 환자(7.58 ± 11.28 ng/ml, P < 0.001)에서 더 높게 나타났다(도 2B).

또한, 미세변화형 신증후군 (minimal change disease; MCD), 국소분절사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), IgA 신장염(IgA nephropathy; IgAN), 및 당뇨병성 신장 질환(DN) 환자로부터 수득한 혈청 및 소변 시료에서도 cMet 농도를 측정하였다 (표 2). 표 2의 각 범주에 기재된 값은 중앙값(최소값, 최대값) 형식으로 기재하였으며, 신장 생검 시의 혈액 검사 시점 (Blood test at the time of kidney biopsy)과 각 질환별로 49.8 ± 19.6 개월 동안 적절한 치료를 진행한 후의 시점으로 구분하여 기재하였다.

실시예 3. 소변의 수용성 cMet 및 임상적 결과의 관련성

사용된 임상 결과는 ESRD, 모든 원인에 의한 사망률(all-cause mortality) 및 두 개의 조합이었다. ESRD는 신장 투석을 시작할 필요가 있거나 신장 이식이 필요한, 신장 기능의 비가역적 손상으로 정의하였다. 추적 검사를 지속하지 못한 환자들의 사망률 데이터는 통계청 데이터베이스로부터 수득하였다. 49.8 ± 19.6 개월 동안의 추적관찰 동안, 101명의 환자(46.1%)가 ESRD로 진단되었고, 65명의 환자(29.7%)가 사망하였다. 소변의 수용성 cMet 농도와 ESRD 또는 사망 간의 관련성을 확인하기 위하여, Kaplan-Meier 생존 분석을 수행하였다.

더 낮은 수준의 소변 cMet/Cr을 가진 당뇨병성 신장 질환 환자에 비하여 더 높은 cMet/Cr 수준의 당뇨병성 신장 질환 환자에서 ESRD의 위험 (도 3A), 및 모든 원인의 사망 (도 3B), 및 복합 평가 결과 (도 3C)가 높게 나타났다 (P < 0.001).

하기 표 3은 소변의 수용성 cMet 수준과 이식 실패 및 사망률과의 관련성을 통상의 콕스 비례 위험 모델을 이용하여 확인하였다.

상기 표 3는 통상의 콕스 비례 위험 모델을 이용한, 소변의 수용성 cMet 수준과 이식 실패 및 사망의 관련성을 보여준다. 모델 1은 연령, 성별, 고혈압, Hb, 알부민, AST, ALT, 요산, 콜레스테롤, Ca, 및 P로 조정되었고, 모델 2는 연령, 성별, 고혈압, Hb, 알부민, AST, ALT, 요산, 콜레스테롤, Ca, P, GFR, 및 PCR로 조정되었다. 분석은 ROC 커브의 소변의 수용성 cMet 및 cMet/Cr 소정의 컷오프 값을 포함시킴으로써 계산하였고, 사망 및 ESRD에 대한 컷오프 값은 각각 2.9 ng/ml 및 4.9 ng/mg였다. 상기 HR은 위험비(hazard ratio)이고, CI는 신뢰 구간(confidence interval)을 나타낸다.

증가된 cMet 값은 ESRD 와 관련된 독립적 변수 (위험비(hazard ratio; HR) 2.33, 95% 신뢰구간(confidence interval; CI) 1.19-4.57, P = 0.014) 또는 연령, 성별, 헤모글로빈, 알부민, AST, ALT, 요산, 콜레스테롤, Ca, P, 예측된 GFR(eGFR), 및 UPCR을 포함하는 혼재 변수(confounding variable)를 적용시킨 후의 복합 평가 결과(HR 2.14, 95% CI 1.18-3.86, P = 0.012) 및 사망(HR 1.88, 95% CI 0.81-4.39, P = 0.142)에서도 유지되었다.

실시예 4. 부정적 결과를 예측하는 것에서 소변의 수용성 cMet/Cr

소변의 수용성 cMet/Cr이 혈청 크레아티닌 및 UPCR에 비하여 더 나은 ESRD에 대한 지표인지를 ROC 곡선, IDI(integrated discrimination improvement) 인덱스 및 cfNRI (category-free net reclassification improvement) 인덱스를 비교함으로써 확인하였다. Cr (모델 1), Cr + UPCR (모델 2) 및 Cr + UPCR + cMet (모델 3)의 AUC (95% CI)는 각각 0.858 (0.808-0.907), 0.889 (0.846-0.931), 및 0.890 (0.848-0.933)이었다. 혈청 Cr 또는 혈청 Cr + UPCR에 소변의 수용성 cMet/Cr을 추가하는 것은, 사망을 제외하고, ESRD, 복합 평가 결과에 대한 예측 값을 통계적으로 개선하였다 (표 4).

ESRD를 예측하기 위한 IDI 및 cfNRI (모델 1 vs 모델 3)은 각각 6.76% (95% CI 3.38-10.15, P = 0.0001) 및 82.64% (95% CI 59.07-106.22, P < 0.0001)이었으며, 소변의 수용성 cMet을 측정하는 것은 실질적으로 부정적 결과에 대한 예측 값을 증가시킴을 알 수 있다. 상기 표에서 Cr은 크레아티닌, UPCR은 소변의 단백질-대-크레아티닌 비율, CI는 신뢰 구간, IDI는 일체화 판정 개선(integrated discriminatory improvement); 및 NRI는 순재분류개선(net reclassification improvement)을 의미한다.

실시예 5. 환자 유래 신장의 조직학적 검사를 통한 cMet의 발현 양상 확인

신장 암 환자에서 콩팥 전절제술로 절제된 신장 중 종양 조직이 아닌 부분을 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 파라핀으로 포매(embedding) 후, 4μm로 잘라서 염색하였다. 자일렌에서 상기 절편으로부터 파라핀을 제거하고 일련의 에탄올로 점진적으로 재수화시켰다. 실온에서 30분 동안 메탄올 중의 0.3% 하이드로겐 퍼옥시다아제로 내인성 퍼옥시다아제 활성을 막았다. 절편을 30분 동안 항원 언마스킹 용액으로 극초단파 처리하여 항원을 회복시켰다. 실온의 10% 염소 혈청에서 1시간동안 절편을 배양한 후, 4℃에서 항-Met(cMet) 항체(Abcam, Cambridge, UK) 및 항-Met (cMet) (phospho Y1349) 항체 (Abcam)와 밤새 반응시켰다. 조직을 PBS (phosphate-buffered saline)로 수회 세척하고 Alexa Fluor-융합된 2차 항체 (Molecular Probes, Eugene, OR)와 40분 동안 배양하였다. DAPI (4′, Molecular Probes)로 핵을 대비염색 하였다. 음성 대조군 절편은 1차 항체들을 생략한 것을 제외하고 동일하게 처리하였다. Leica TCS SP8 STED CW 공초점 현미경으로 절편을 관찰하였다.

건강한 인간 사구체 세포, 발세포 (podocytes), 혈관사이세포, 및 근위 세뇨관 세포(proximal tubular epithelial cell; PTEC)에서 DAPI (파랑), cMet (녹색), 및 CD31, Nephrin, Desmin 또는 AQP1 (빨강)에 대한 형광을 확인하였다 (도 4A).

HGF/Met 경로가 당뇨병성 신장 질환 환자에서 신장 섬유증에 관련되었는지를, 활성화된 cMet을 확인하기 위한 인산화-특이적 cMet 항체를 이용한 면역 형광 염색법을 사용하여 확인하였다. 인산화된 cMet의 수준은 정상 대조군과 비교하여 당뇨병성 신장 질환을 가진 환자로부터의 사구체에서 더 높게 나타났으며, 이를 통해 cMet은 당뇨병성 신장 질환 환자에서 활성화 되었음을 알 수 있다 (도 4B).

실시예 6. IgA 신장 질환과 소변의 수용성 cMet 수준의 관계

IgA 신장 질환 환자 104명을 UPCR 수준에 따라 세가지 군으로 분류하였다 (UPCR ≤ 1.0; 1.0 < UPCR < 3.5; 및 UPCR ≥ 3.5). 35개월동안 추적 관찰하였으며, 각 군의 평균 연령은 각각 33.0, 41.0 및 55.5세였다. UPCR 수준이 높을수록 cMet/Cr 값이 높게 나타나는 경향을 보였으며, cMet/Cr 값이 높은 환자일수록 ESRD로 진행된 경우가 많았으며, 예후가 좋지 않았음을 확인하였다 (표 5).

	Group 1 (n=33) (UPCR = 1.0)	Group 2 (n=43) (1.0 < UPCR < 3.5)	Group 3 (n=28) (UPCR = 3.5)	P value
Age	33.0 (19.5, 45.0)	41.0 (30.0, 52.0)	55.5 (37.3, 70.0)	<0.001
Male gender	26 (78.8)	23 (53.5)	12 (42.9)	0.012
Smoking history	4 (12.1)	11 (25.6)	7 (25.0)	0.306
Diabetes	0 (0.0)	0 (0.0)	3 (10.7)	0.016
Hypertension	14 (42.4)	29 (67.4)	24 (85.7)	0.002
SBP	127.0 (116.5, 138.5)	135.0 (123.0, 149.0)	140.0 (131.5, 150.0)	0.002
DBP	79.0 (71.5, 85.5)	86.0 (79.0, 97.0)	92.0 (81.5, 97.8)	0.002
BMI	23.8 (21.4, 26.0)	23.8 (21.7, 26.1)	24.4 (21.3, 26.4)	0.563
Microscopic hematuria	29 (87.9)	38 (88.4)	25 (89.3)	0.866
SMK grade				<0.001
I	4 (13.3)	0 (0.0)	0 (0.0)
II	19 (63.3)	13 (38.2)	5 (21.7)
III	7 (23.3)	13 (38.2)	7 (30.4)
IV	0 (0.0)	5 (14.7)	7 (30.4)
V	0 (0.0)	3 (8.8)	4 (17.4)
Haas Class				0.001
I	3 (10.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
II	3 (10.0)	0 (0.0)	2 (8.7)
III	17 (56.7)	13 (38.2)	3 (13.0)
IV	6 (20.0)	15 (44.1)	10 (43.5)
V	0 (0.0)	6 (17.6)	8 (34.8)
VI	1 (3.3)	0 (0.0)	0 (0.0)
Mesangial hypercellularity	32 (97.0)	37 (86.0)	27 (96.4)	0.854
Interstitial fibrosis/tubular atrophy
Moderate to severe	4 (12.1)	10 (23.3)	13 (50.0)	0.014
Interstitial inflammation
Moderate to severe	2 (6.2)	8 (18.6)	11 (42.3)	0.003
Vessel
Fibrointimal thickening	8 (24.2)	17 (39.5)	18 (64.3)	0.006
Hyaline arteriolosclerosis	1 (3.0)	9 (20.9)	9 (32.1)	0.011
Global sclerosis (%)	5.6 (0.0, 15.2)	25.0 (3.3, 50.0)	32.9 (17.2, 63.2)	<0.001
Segmental sclerosis (%)	0.0 (0.0, 7.0)	4.3 (0.0, 12.0)	9.7 (0.0, 16.6)	0.006
Crescent (%)	0.0 (0.0, 0.0)	0.0 (0.0, 0.0)	0.0 (0.0, 2.4)	0.054
sCr_baseline	0.85 (0.74, 1.00)	1.10 (0.79, 1.60)	1.50 (1.05, 2.25)	<0.001
eGFR_baseline	107.3 (81.2, 117.3)	62.2 (46.1, 87.6)	42.0 (26.4, 61.7)	<0.001
UPCR_baseline	0.31 (0.17, 0.69)	2.02 (1.40, 2.57)	4.64 (3.97, 6.13)	<0.001
IgA_baseline	354.5 (245.3, 441.8)	340.0 (276.5, 441.3)	346.0 (251.0, 462.0)	0.755
Albumin_baseline	4.1 (3.8, 4.2)	3.7 (3.4, 4.0)	3.3 (2.9, 3.5)	<0.001
hsCRP_baseline	0.16 (0.04, 0.34)	0.12 (0.07, 0.40)	0.31 (0.10, 0.58)	0.048
T.chol_baseline	162.0 (146.5, 183.5)	173.0 (155.0, 205.0)	212.0 (194.3, 229.8)	<0.001
Uric acid_baseline	6.0 (4.7, 6.8)	6.5 (5.2, 7.6)	6.9 (5.7, 8.1)	0.021
Urine cMet	0.94 (0.26, 1.73)	0.94 (0.32, 1.97)	1.97 (0.68, 4.04)	0.008
Urine cMet/Cr	0.007 (0.003, 0.018)	0.015 (0.003, 0.027)	0.030 (0.012, 0.060)	<0.001
Ln_urine cMet/Cr	-4.9 (-5.9, -4.1)	-4.1 (-5.7, -3.6)	-3.5 (-4.4, -2.8)	<0.001
Treated with RAS blockade	21 (63.3)	34 (79.1)	26 (92.9)	0.023
Treated with statin	6 (18.2)	19 (44.2)	14 (50.0)	0.019
Treated with immunosuppressive agents	1 (3.0)	11 (25.6)	13 (46.4)	<0.001
eGFR_final	100.7 (83.0, 113.3)	59.0 (33.9, 100.4)	36.7 (12.7, 48.8)	<0.001
UPCR_final	0.28 (0.09, 0.60)	0.95 (0.51, 1.75)	1.24 (0.31, 1.76)	0.005
Complete remission	17 (51.5)	7 (16.3)	5 (17.9)	0.001
Progression to ESRD	0 (0.0)	5 (11.6)	9 (32.1)	0.001

또한, IgA 신장 질환 환자에서 소변 수용성 cMet의 농도가 높은 환자들일수록 단백뇨가 50% 이상 증가하는 환자 비율이 높음을 KM 곡선(Kaplan, E. L.; Meier, P. (1958). "Nonparametric estimation from incomplete observations". J. Amer. Statist. Assoc. 53 (282): 457-481. doi:10.2307/2281868. JSTOR 2281868.; Kaplan, E.L. in a retrospective on the seminal paper in "This week's citation classic". Current Contents 24, 14 (1983).)으로 확인하였다 (도 5). KM 곡선에 사용된 각 변수는 하기 표 6과 같다.

	B	SE	Wald	df	Sig.	Exp(B)	95.0% CI for Exp(B)
							Lower	Upper
Ln_UcMet_Cr	-.365	.179	4.160	1	.041	.694	.489	.986

본 발명은 신장 질환 환자의 소변에서 수용성 cMet의 수준이 증가되는 것과 신장 기능의 관련성을 최초로 발견한 것이다. 특히, 소변의 수용성 cMet 수준이 증가되는 현상은 신장의 생존 및 죽음과 유의하게 관련됨을 확인하였다. 완전히 적응된 ESRD 모델에서 소변의 수용성 cMet이 포함되는 것은 세가지 상이한 통계적 방법 (C-statistics, IDI and NRI)에서 예측력을 개선시켰다. 따라서, 진단 시 소변의 수용성 cMet 수준은 당뇨병성 신장 질환에서 신장의 예후를 예측하는 신규한 바이오마커로서 이용될 수 있다.

예를 들어, 청구항 구성 목적을 위해, 이하 기재되는 청구항은 어떤 식으로든 이의 문자 그대로의 언어보다 좁게 해석되어선 안 되고, 따라서 명세서로부터의 예시적 구현예가 청구항으로 읽혀서는 안 된다. 따라서, 본 발명은 예시로서 기재되었고, 청구항의 범위에 대한 제한이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 발행된 특허, 특허 출원, 서적 및 저널 논문은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 각각 포함된다.

Claims (11)

1. 소변에 포함된 cMet 단백질에 특이적으로 결합하는 결합분자를 포함하는, 소변으로부터 신장 질환을 진단하거나 신장 질환의 예후를 예측하기 위한 키트로서,
   정상 군에 비하여 소변 내 cMet 단백질 수준이 높은 경우, 신장 질환이 있는 것으로 진단하거나, 신장 질환의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하기 위한, 키트.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 결합분자는 항-cMet 항체인, 키트.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 신장질환은 급성 신손상, 말기 신장 질환(end-stage kidney disease; ESKD), 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병성 신장 질환 (DN), IgA 신장염 (IgAN), HIV-관련 신증, 비 당뇨병성 만성 신장질환, 국소분절사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), 미세변화형 신증후군 (MCD), 및 크산틴 옥시다아제 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 질환인, 키트.
4. 청구항 1에 있어서, 크레아티닌에 특이적으로 결합하는 결합분자를 더 포함하는, 키트.
5. 소변에 포함된 cMet 단백질에 특이적으로 결합하는 결합분자를 포함하는, 소변으로부터 신장 질환을 진단하거나 신장 질환의 예후를 예측하기 위한 조성물로서,
   정상 군에 비하여 cMet 단백질 수준이 높은 경우, 신장 질환이 있는 것으로 진단하거나, 신장 질환의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하기 위한, 조성물.
6. 피험체로부터 수득한 소변 시료에 포함된 cMet 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
   상기 cMet 단백질 수준이 정상 군에 비하여 높은 경우 상기 피험체가 신장 질환을 가진다는 정보를 제공하거나 신장 질환의 예후가 좋지 않는다는 정보를 제공하는 단계를 포함하는,
   신장 질환의 진단 또는 신장 질환의 예후 예측을 위한 정보를 제공하기 위한 방법.
   
7. 청구항 6에 있어서, cMet 단백질 수준은 cMet에 특이적으로 결합하는 결합분자를 이용하여 측정되는, 방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 결합분자는 항-cMet 항체인, 방법.
9. 청구항 6에 있어서, 상기 정상 군은 신장 질환을 갖지 않는 대상체인, 방법.
10. 청구항 6에 있어서, 상기 신장질환은 급성 신장 질환, 말기 신장 질환(end-stage kidney disease; ESKD), 전신성 홍반성 루푸스, 당뇨병성 신장 질환 (DN), IgA 신장염 (IgAN), HIV-관련 신증, 비 당뇨병성 만성 신장질환, 국소분절사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis; FSGS), 미세변화형 신증후군 (MCD), 및 크산틴 옥시다아제 결핍증으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 질환인, 방법.
11. 청구항 6에 있어서, 소변의 크레아티닌 농도, 소변의 총단백질 농도, 또는 소변의 크레아티닌 농도 및 총단백질 농도를 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
    

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