KR102311743B1 - Identification method of triploid abalone, Haliotis discus hannai using genetic marker - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 유전자 마커를 이용한 참전복 삼배체 판별 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for discriminating abalone triploids using a genetic marker.
전복(abalone)은 미역, 다시마, 감태 등의 해조류를 먹고사는 패류로 맛이 달고 자양강장에 좋아 예로부터 우리나라 및 동아시아 국가들에서 중요시되는 고가의 양식품목이다. 최근 중국의 고급 수산물에 대한 소비 증가와 함께 세계 전복 시장의 규모는 지속적으로 증가하고 있다. 우리나라는 세계 2위의 전복 양식생산국으로 그 생산량은 2001년 29 톤에서 2010년 약 7,000 톤으로 비약적인 증가추세를 보였으며, 2018년에는 20,122 톤까지 증가하였다. 총 생산금액 역시 2018년 약 6,000 억 원의 규모로 패류 양식 산업의 대표적인 품종으로 중요한 위치를 차지하고 있다. Abalone is a shellfish that feeds on seaweed, such as seaweed, kelp, and kelp, and is an expensive aquaculture item that has been valued in Korea and East Asian countries since ancient times. The size of the global abalone market is continuously increasing with the recent increase in China's consumption of high-quality seafood. Korea is the world's second-largest abalone aquaculture producer, and its production has dramatically increased from 29 tons in 2001 to about 7,000 tons in 2010, and increased to 20,122 tons in 2018. The total production amount was also about 600 billion won in 2018, occupying an important position as a representative variety in the shellfish aquaculture industry.
우리나라 전복 생산량의 대부분을 차지하는 품종인 참전복(Haliotis discus hannai)은 한류계 전복으로 패각(shell)은 얇고 긴 타원형으로서 껍질 바깥쪽은 암녹색 내지 갈색을 띄고 내면에는 진주 광택을 띄며, 전복이 호흡을 하고 알과 정자를 방출하는 구멍인 호수공(호흡공, 흡수공 또는 출수공)은 3-4개 정도 열려 있다. 참전복은 우리나라 삼면에 널리 분포 서식하고 있으며, 1960년대부터 양식에 관한 연구가 이루어져 1970년대에 전복 종자의 대량생산체제 기술을 확립되었다. 이전까지는 양식 기술 개발에 전복양식 연구가 집중되어 있었지만 2000년대에 들어 생산성 향상에 목표를 두고 양식 경쟁력 강화를 위해 우수한 품종 개발과 육종연구에 역점을 두게 되었다. Haliotis discus hannai , the variety that accounts for most of Korea's abalone production, is Hallyu abalone with a thin and long oval shell, dark green to brown on the outside and pearly luster on the inside. And about 3 or 4 lake holes (respiration holes, absorption holes, or exit holes), which are holes for releasing eggs and sperm, are open. Abalone is widely distributed and inhabited in three sides of Korea, and research on aquaculture has been conducted since the 1960s, and the mass production system technology for abalone seeds was established in the 1970s. Previously, research on abalone culture had been focused on the development of aquaculture technology, but in the 2000s, with the goal of improving productivity, emphasis was placed on the development of excellent varieties and breeding research to strengthen the competitiveness of aquaculture.
전복 육종기술개발은 우리나라를 비롯하여 중국, 호주, 남아공 등의 전복양식 생산국에서 활발히 수행되고 있으며 각국에서 서식하고 있는 주요 양식전복 종을 대상으로 육종연구를 수행하고 있다. 우리나라의 전복 육종기술개발 연구로는 전복 3배체(triploid) 생산연구, 전복 교잡 육종연구 등이 있다. 전복의 경우 3배체는 인공산란으로 얻어진 전복의 정충과 난을 인공수정시키고 그 수정란에 물리적 또는 화학적 자극을 주어 제1 또는 제2극체의 방출을 억제하여 생산할 수 있다. 이렇게 염색체 조작을 통해 생산된 3배체 전복은 생식에 사용할 대사에너지가 체성장에 사용되어 일반 2배체(diploid) 전복에 비해 빠른 성장속도를 나타내고 있어 높은 생산성과 수익성을 기대할 수 있다. 그 예로 3배체 버지니아 굴과 가리비에 대한 연구에서 3배체가 2배체보다 높은 육중량 및 좋은 육질을 얻을 수 있고, 환경 변화에 대한 저항성도 가지는 것으로 보고되고 있다. Abalone breeding technology development is being actively carried out in abalone production countries such as China, Australia, and South Africa, as well as Korea, and breeding research is being conducted targeting major aquacultured abalone species inhabiting each country. Research on abalone breeding technology development in Korea includes abalone triploid production research and abalone hybrid breeding research. In the case of abalone, triploidy can be produced by artificially fertilizing spermatozoa and eggs of abalone obtained by artificial spawning, and by giving physical or chemical stimulation to the fertilized egg to suppress the release of the first or second polar body. In this way, triploid abalone produced through chromosomal manipulation has a faster growth rate than normal diploid abalone because the metabolic energy to be used for reproduction is used for body growth, so high productivity and profitability can be expected. For example, in a study on triploid Virginia oysters and scallops, it is reported that triploids can obtain higher meat weight and better meat quality than diploids, and have resistance to environmental changes.
종래에는 다양한 방법(세포분석기, 염색체 검사 및 입자크기 분석)을 이용해 배수성을 확인하여 왔다(Harrell, R. M. et al., Aquaculture 137: 159-160, 1995; Gallardo-Escarate, C. et al., Journal of Shellfish Research 23(1): 205-209, 2004). 그러나 상기의 방법으로 배수성을 평가하는 것은 대략적인 예측 수준에 그치고 종묘나 유생단계의 작은 시료에서는 분석이 어려웠으며, 많은 시간과 노동력이 소요되었다(Slabbert, R. et al., African J. Marine Science 32(2): 259-264. 2010). 이러한 관점에서 육안으로 구별할 수도 없고 종래의 다양한 방법으로도 정확한 배수성을 확인할 수 없기에 발생단계 초기에 전복의 배수성을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하는 것이 요구되고 있다. Conventionally, ploidy has been confirmed using various methods (cytometry, chromosome analysis, and particle size analysis) (Harrell, RM et al ., Aquaculture 137: 159-160, 1995; Gallardo-Escarate, C. et al. , Journal). of Shellfish Research 23(1): 205-209, 2004). However, evaluating ploidy by the above method is only at an approximate level of prediction, and analysis is difficult in small samples at the seedling or larval stage, and it takes a lot of time and labor (Slabbert, R. et al ., African J. Marine Science). 32(2): 259-264. 2010). From this point of view, it is impossible to distinguish with the naked eye, and since accurate drainage cannot be confirmed even by various conventional methods, it is required to develop a method that can quickly and accurately determine the drainage of abalone in the early stage of development.
유전자 기반의 분석 기술의 핵심인 DNA 마커는 생물 종에 대한 유전적인 특성을 분석할 수 있는 기술로 유전자원 보존을 위한 평가 연구에 활용될 수 있다. 초기의 DNA 마커는 다수의 유전자좌를 용이하게 확인할 수 있는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), ISSR(inter-simple sequence repeat) 등의 우성 마커(dominant marker)가 주로 이용되었다. 그러나 RAPD와 ISSR의 경우 재현성이 떨어질 뿐만 아니라 우성 마커의 특성상 2배체에서 우성 동형접합체(homozygote)와 이형접합체(heterozygote) 유전자형의 구분이 불가능한 단점이 있다. 최근에는 이러한 단점을 극복할 수 있으며 생물체 게놈(genome)상에 존재하는 2 ~ 8 bp의 염기서열이 반복되는 구조로 염기서열의 반복 횟수의 차이로 인해 다형성(polymorphism)이 나타나는 SSR(simple sequence repeat) 부분을 이용한 마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커를 활용하여 생물종의 유전적 다양성과 유연관계를 평가하고 있다. 마이크로새틀라이트(microsatellite) 유전자 마커는 공우성 마커(co-dominant marker)로서 멘델의 유전방식을 따르고 있으며, 대립유전자의 다양성, 전체 게놈상에 균등한 분포, 작은 유전자좌 크기, 그리고 높은 다형성을 가지고 있다. 이 유전자 마커의 유용성은 암컷 내에 존재하는 이형접합성(heterozygosity) 유전자좌 및 2개의 암컷 대립유전자와 크기가 다른 수컷으로부터 유전되는 유전자 좌위에 근거한다. 다양한 수의 유전자 좌위는 개체의 3배체 특성을 판별하는데 더욱 유용하게 적용될 수 있다(Magoulas, A. et al., AnimalGenetics, 29: 69-70, 1998; Li, G. et al., Molecular Ecology Notes, 3: 228-232, 2003; Sekino, M. etal., Mar. Biotechnol., 5: 227-233, 2003).DNA markers, which are the core of gene-based analysis technology, are a technology that can analyze the genetic characteristics of biological species and can be used in evaluation studies for the conservation of genetic resources. As early DNA markers, dominant markers such as randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and inter-simple sequence repeat (ISSR), which can easily identify multiple loci, were mainly used. However, in the case of RAPD and ISSR, not only reproducibility is low, but due to the characteristics of the dominant marker, it is impossible to distinguish between the dominant homozygote and heterozygote genotypes in the diploid. Recently, this disadvantage can be overcome, and a simple sequence repeat (SSR) in which a polymorphism occurs due to a difference in the number of repetitions of a nucleotide sequence is a structure in which a nucleotide sequence of 2 to 8 bp is repeated in the genome of an organism. ) is used to evaluate the genetic diversity and kinship of biological species using microsatellite markers. Microsatellite genetic markers are co-dominant markers that follow Mendelian inheritance methods, and have allele diversity, uniform distribution over the entire genome, small loci size, and high polymorphism. . The usefulness of this genetic marker is based on a heterozygosity locus present in females and a locus inherited from a male that differs in size from the two female alleles. A variable number of loci can be more usefully applied to determine the triplet characteristics of an individual (Magoulas, A. et al., AnimalGenetics, 29: 69-70, 1998; Li, G. et al., Molecular Ecology Notes). , 3: 228-232, 2003; Sekino, M. et al., Mar. Biotechnol., 5: 227-233, 2003).
한편, 대한민국 공개특허 제10-2019-0047826호에서는 전복의 핵형 분석 방법을 이용하여 전복의 배수성 확인하는 방법이 개시되어 있는데, 이는 최적의 전복 외투막 조직의 배양 기간, 외투막의 분석 부위 및 배양 배지 조성을 제공함으로써 전복을 희생시키지 않고도 효과적으로 2배체 또는 3배체를 분석하고, 2배체인 개체를 판별하여 이를 전복의 모패(parent shellfish)로서 이용 가능함을 확인하였다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1437381호는 참굴 삼배체 판별용 유전자 키트 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것으로 굴의 배수성을 효과적으로 판별할 수 있는 방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 마이크로새틀라이트 유전자 마커를 이용한 참전복 배수체 판별 방법에 대해서는 밝혀진 바가 없다.On the other hand, Korean Patent Laid-Open No. 10-2019-0047826 discloses a method for confirming the ploidy of abalone using the karyotype analysis method of abalone, which provides an optimal culture period of abalone mantle tissue, analysis site of abalone mantle and culture medium composition. By providing, it was confirmed that diploid or triploidy was effectively analyzed without sacrificing the abalone, and the diploid individual was identified and used as the parent shellfish of abalone. In addition, Korean Patent Registration No. 10-1437381 relates to a gene kit for discriminating oyster triploids and a discriminating method using the same, and discloses a method for effectively discriminating the ploidy of oysters, but using the microsatellite gene marker of the present invention. There is nothing known about the method of identifying abalone polyploids.
이에 본 발명자들은 반복염기서열을 가진 유전자좌를 선별하고 마이크로새틀라이트 유전자 마커를 이용하여 분석효율성이 높은 멀티플랙스 PCR 디자인을 하였으며, 멀티플랙스 PCR 반응조건을 확립하여 발생단계 초기에 신속하게 참전복의 3배체 여부를 판별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. Therefore, the present inventors selected a locus with a repeating nucleotide sequence and designed a multiplex PCR design with high analysis efficiency using a microsatellite gene marker. The present invention was completed by confirming that it was possible to determine whether a diploid or not.
본 발명의 목적은 참전복의 2배체 또는 3배체 여부를 판별할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커를 이용한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 참전복의 배수체 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 참전복 배수성 판별용 키트 및 참전복 배수성 판별 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is a primer set using a microsatellite marker capable of discriminating whether diploid or triploidy of abalone, a composition for determining polyploidy of abalone comprising the primer set, and abalone ploidy comprising the composition It is to provide a kit for discrimination and a method for discriminating abalone ploidy.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 3로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 5로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 7로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 9로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머세트; 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 참전복 배수성 판별용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 2; a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a reverse primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 4; a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a reverse primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a reverse primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; And a primer set consisting of a forward primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a reverse primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 10; It provides a primer set for determining abalone ploidy, characterized in that it comprises one or more primer sets selected from the group consisting of.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 참전복 배수성 판별용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for discriminating abalone ploidy, comprising the primer set.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 또는 상기 조성물을 포함하는 참전복 배수성 판별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for determining abalone ploidy comprising the primer set or the composition.
또한, 본 발명은 참전복으로부터 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제 1항 또는 제 3항의 참전복 배수성 판별용 프라이머 세트로 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 참전복의 배수성을 분석하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 참전복 배수성 판별 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of isolating DNA from abalone; using the isolated DNA as a template, and amplifying the DNA with the primer set for determining the abalone ploidy of claim 1 or 3; and analyzing the ploidy of abalone with respect to the amplified DNA product; It provides a method for determining abalone multiples, characterized in that it comprises a.
본 발명은 참전복의 배수성 판별할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 참전복의 2배체 또는 3배체 여부를 확인한 것인 바, 이를 이용한 참전복의 배수성 판별용 조성물은 신속하고, 재현성이 있게 배수체 판별을 가능하게 하여 배수성 연구에 활용될 수 있고, 좋은 육질을 가진 우수한 품종의 참전복을 얻을 수 있게 함으로써 마이크로새틀라이트 유전자 마커(microsatellite genetic maker)로서 유용하게 이용될 수 있다.The present invention confirms whether diploid or triploidy of abalone using a primer set capable of discriminating the ploidy of abalone. It can be used for ploidy research by making it possible, and it can be usefully used as a microsatellite genetic maker by making it possible to obtain excellent varieties of abalone with good meat quality.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자연산 참전복의 멀티플렉스 PCR 키트에 포함된 5개의 유전자좌위의 대립유전자를 나타내는 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 삼배체 참전복의 멀티플렉스 PCR 키트에 포함된 5개의 유전자좌위의 대립유전자를 나타내는 전기영동 결과를 나타낸 것이다.1 shows the electrophoresis results showing alleles of five loci included in the multiplex PCR kit of wild abalone according to an embodiment of the present invention.
2 shows electrophoresis results showing alleles of five loci included in the multiplex PCR kit of triploid abalone according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 사용되는 용어 "3배체"는 일반적인 2배체보다 1개의 반수체(haploid) 염색체 세트(chromosome-set)를 부가적으로 더 보유한 생물체를 일컫는데, 3배체들은 3개의 상동염색체(homologous chromosomes)를 갖기 때문에 감수분열 중기에서 상동염색체간 짝짓기(pairing) 및 균등 분리(equivalent segregation)가 원활하게 일어나지 못하게 되며, 이로 인해 성 성숙(sexual maturation) 및 생식소 발달이 지연되거나 불임성을 띄게 된다(Arai et al., 2001; Piferrer et al., 2009; Dheilly et al., 2014). 이에 다양한 양식 어패류 종들을 대상으로 불임 형질이 탑재된 3배체를 인위적으로 유도함으로써 성 성숙에 사용되는 에너지가 체성장으로 전환될 수 있도록 유도하거나, 성 성숙에 의해 야기되는 양식 상품의 질 저하를 방지하기 위한 육종 방법으로 활용되고 있다(Rasmussen and Morrissey, 2007). 뿐만 아니라, 3배체 기술은 인위적으로 육성된 양식 계통의 비의도적인 생식 방지를 위한 생식학적 격리 기법(reproductive confinement)으로 중요시된다(Rasmussen and Morrissey, 2007; Piferrer et al., 2009; Wadsworth et al., 2019). 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 방법을 적용하여 3배체 참전복 개발에 적용할 수 있다.As used herein, the term "triploid" refers to an organism that additionally has one more haploid chromosome-set than a general diploid, and triploids are three homologous chromosomes. Pairing and equivalent segregation between homologous chromosomes do not occur smoothly in the middle stage of meiosis, which leads to delayed sexual maturation and gonad development or infertility (Arai et al. ., 2001; Piferrer et al., 2009; Dheilly et al., 2014). Therefore, by artificially inducing triploids loaded with infertility traits for a variety of cultured fish and shellfish species, it induces energy used for sexual maturation to be converted into body growth, or prevents deterioration of aquaculture products caused by sexual maturation. It is being used as a breeding method for In addition, triploid technology is important as reproductive confinement for the prevention of unintentional reproduction of artificially bred cultured lines (Rasmussen and Morrissey, 2007; Piferrer et al., 2009; Wadsworth et al. , 2019). Therefore, by applying the method according to an embodiment of the present invention, it can be applied to the development of triploid abalone.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 3로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 5로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 7로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 9로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머세트; 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 참전복 배수성 판별용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention provides a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 2; a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a reverse primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 4; a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a reverse primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a reverse primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; And a primer set consisting of a forward primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a reverse primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 10; It provides a primer set for determining abalone ploidy, characterized in that it comprises one or more primer sets selected from the group consisting of.
본 발명에 사용되는 용어 "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 본 발명의 프라이머 길이는 15 내지 30 bp일 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 26 bp 일 수 있다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. As used herein, the term "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be amplified, and can serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should allow synthesis of the extension product to begin. The primer length of the present invention may be 15 to 30 bp, preferably 20 to 26 bp. The specific length and sequence of the primer will depend on the conditions of use of the primer, such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the desired DNA or RNA target.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.In the present invention, the oligonucleotide used as a primer may also contain a nucleotide analogue, for example, a phosphorothioate, an alkylphosphorothioate or a peptide nucleic acid or An intercalating agent may be included.
본 발명의 프라이머 세트는 마이크로새틀라이트 마커를 증폭할 수 있다. 마이크로새틀라이트 마커는 1 내지 5개의 염기쌍이 반복되는 반복염기서열을 포함할 수 있으며, 이러한 반복서열은 마이크로새틀라이트(microcetellite) 영역 또는 SSR(simple sequencerepeat) 영역이고 한다. 이러한 반복염기서열을 포함하는 마이크로새틀라이트 마커는 2개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 디마이크로새틀라이트 마커(dimicrocetellite marker), 3개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 마커를 트리마이크로새틀라이트 마커(trimicrocetellite marker), 4개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 마커를 테트라마이크로새틀라이트 마커(tetramicrocetellite marker), 5개의 염기쌍이 반복되는 서열을 포함할 경우 마커를 펜타마이크로새틀라이트 마커(pentamicrocetellite marker)일 수 있다. 본 발명에서 사용한 프라이머로 증폭할 수 있는 마이크로새틀라이트 마커는 1개 내지 2개의 디마이크로새틀라이트 마커, 1개의 트리마이크로새틀라이트 마커, 1개 내지 2개의 테트라마이크로새틀라이트 마커, 1개의 펜타마이크로새틀라이트마커를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트로 증폭되는 마이크로새틀라이트 마커에서 반복되는 염기서열은 ATC, GT, TAGA, GTGAG, CGCA 및 CA 중에 서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 마커 내에서 5 내지 50회 반복되어 나타날 수 있고, 바람직하게는 마커 내에서 5 내지 20회 반복되어 나타날 수 있다.The primer set of the present invention can amplify microsatellite markers. The microsatellite marker may include a repeating nucleotide sequence in which 1 to 5 base pairs are repeated, and this repeating sequence is referred to as a microsatellite region or a simple sequence repeat (SSR) region. A microsatellite marker including such a repeating nucleotide sequence is a dimicrosatellite marker when it contains a sequence with repeating 2 base pairs, and a trimicrosatellite marker when it contains a sequence with repeating 3 base pairs. A trimicrocetellite marker is a tetramicrocetellite marker when it contains a sequence with repeating 4 base pairs, and a pentamicrocetellite marker when it contains a sequence with a repeat of 5 base pairs. ) can be The microsatellite markers that can be amplified with the primers used in the present invention include 1 to 2 dimicrosatellite markers, 1 trimicrosatellite marker, 1 to 2 tetramicrosatellite markers, and 1 pentamicrosatellite marker. Light markers may be included. In addition, the nucleotide sequence repeated in the microsatellite marker amplified with the primer set of the present invention may include one or more sequences selected from ATC, GT, TAGA, GTGAG, CGCA and CA. Such sequences may appear 5 to 50 repetitions within the marker, preferably 5 to 20 repetitions within the marker.
본 발명의 프라이머 세트에서 상기 각 프라이머는 PCR을 통해 증폭된 증폭산물의 검출을 용이하게 하기 위해 통상적인 형광물질로 표지될 수 있다. 형광물질은 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 크기, 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등을 의미하며, FAM(6-carboxyfluorescein), PET(photoinduced electron transfer), TET(Tetrachloro-Fluorescein), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), VIC, JOE(4,5-dichloro-dimethoxy-fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 시아닌 (cyanine), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), RED610, 텍사스 레드(TEXAS RED), RED670 및 TYE563 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 형광물질은 프라이머의 5' 쪽에 부착하여 PCR 시 증폭산물의 크기가 중복될 경우 색으로 이를 구별하게 할 수 있다.In the primer set of the present invention, each of the primers may be labeled with a conventional fluorescent material to facilitate detection of the amplified product through PCR. Fluorescent material refers to a compound, biomolecule or biomolecule analog, etc. that can be checked for size, density, concentration, amount, etc. in a conventional manner by linking, binding, or attaching to a primer, and includes FAM (6-carboxyfluorescein), PET ( photoinduced electron transfer), Tetrachloro-Fluorescein (TET), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), VIC, JOE (4,5-dichloro-dimethoxy-fluorescein), HEX (2',4',5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), cyanine, ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine), RED610, Texas Red (TEXAS RED), RED670 and TYE563, etc. may be used, It is not limited thereto. Fluorescent material is attached to the 5' side of the primer, so that when the size of the amplification product overlaps during PCR, it can be distinguished by color.
또한, 본 발명은 상기 참전복 배수성 판별용 프라이머 세트를 포함하는 참전복 배수성 판별용 마이크로새틀라이트 마커 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a microsatellite marker composition for abalone ploidy discrimination comprising the primer set for abalone ploidy discrimination.
본 발명의 조성물에는 상기와 같은 프라이머 세트 이외에도 PCR 반응 또는 PCR 증폭산물 검출에 필요한 시약이 더 포함될 수 있다. 예를 들어 DNA 중합효소, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자 등이 포함될 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머 세트와 같이 참전복의 배수성을 판별하기 위한 다른 프라이머를 더 포함할 수도 있다.In addition to the primer set as described above, the composition of the present invention may further include reagents necessary for PCR reaction or detection of PCR amplification products. For example, a DNA polymerase, a dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), a PCR buffer, and a DNA polymerase cofactor may be included. In addition, like the primer set of the present invention, it may further include other primers for determining the ploidy of abalone.
또한 본 발명은 상기 참전복 배수성 판별용 프라이머 세트 또는 상기 조성물을 포함하는 참전복 배수성 판별용 키트를 제공한다.The present invention also provides a primer set for determining abalone ploidy or a kit for determining abalone ploidy comprising the composition.
본 발명의 키트에는 상기와 같은 프라이머 세트 또는 조성물 이외에도 PCR 반응 또는 PCR 증폭산물 검출에 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다. 시약의 경우 예를 들어, DNA 중합효소, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 Mg2+와 같은 DNA 중합 효소 조인자 등이 별도로 포함될 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.The kit of the present invention may further include tools or reagents necessary for PCR reaction or PCR amplification product detection in addition to the primer set or composition as described above. For reagents, for example, DNA polymerase, a dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP and dTTP), a PCR buffer, and a DNA polymerase cofactor such as Mg 2+ may be separately included. Various DNA polymerases can be used in the amplification step of the present invention, including Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase, and bacteriophage T7 DNA polymerase. Preferably, the polymerase is a thermostable DNA polymerase obtainable from a variety of bacterial species. Most of the polymerases can be isolated from the bacteria themselves or can be purchased commercially.
또한, 본 발명은 참전복으로부터 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 참전복 배수성 판별용 프라이머 세트로 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 참전복의 배수성을 분석하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 참전복 배수성 판별 방법을 제공한다. In addition, the present invention comprises the steps of isolating DNA from abalone; using the isolated DNA as a template and amplifying the DNA with the primer set for determining the abalone ploidy; and analyzing the ploidy of abalone with respect to the amplified DNA product; It provides a method for determining abalone multiples, characterized in that it comprises a.
참전복의 외투막에서 DNA를 분리하는 방법은 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 용어 "외투막(mantle)"은 전복을 포함한 복족류에서는 내장낭 표면으로부터 발의 바깥쪽에 걸쳐 원통상으로 나와 신장하는 근육질의 막을 의미한다. 상기 외투막은 가장자리 구역(marginal zone), 반-가장자리구역(sub-marginal zone) 및 중앙 구역(central zone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종이나, 바람직하게는 가장자리 구역의 세포를 이용하여 DNA 추출을 수행하나 DNA 추출의 목적 달성을 위해서라면, 이에 제한되지 않는다. A method known to those skilled in the art may be used for a method for isolating DNA from the abalone mantle. As used herein, the term “mantle” refers to a muscular membrane extending cylindrically from the surface of the visceral sac to the outside of the foot in gastropods including abalone. The mantle membrane is one selected from the group consisting of a marginal zone, a sub-marginal zone and a central zone, but preferably, DNA extraction is performed using cells in the marginal zone. However, if it is to achieve the purpose of DNA extraction, it is not limited thereto.
상기 단계의 DNA를 증폭시키는 당업자에게 공지된 어떠한 방법이든 사용가능하다. Any method known to those skilled in the art for amplifying the DNA of the above step may be used.
본 발명의 참전복 배수성 판별 방법에서 다중중합효소연쇄반응은 95℃로 10분간 개시변성(initial denaturation)하는 단계를 거친 후, 95℃로 20초간 변성(denaturation), 55℃에 결합(annealing) 및 72℃로 1분간 연장(extension)을 35회 반복하는 단계를 거치고, 72℃로 1분간 최종연장(final extension)하는 단계의 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따르면 표적부위의 정확한 증폭이 가능하며 전기영동 이후 EtBr 염색 등의 방법을 통해서도 육안으로 확인할 수 있는 정도의 농도로 증폭이 가능하다.In the method for determining abalone ploidy of the present invention, the multipolymerase chain reaction is subjected to a step of initial denaturation at 95 ° C. for 10 minutes, denaturation at 95 ° C. for 20 seconds, binding at 55 ° C. (annealing) and It is preferable to use a program of the step of repeating the extension (extension) for 1 minute at 72°C 35 times, and finally extending it for 1 minute at 72°C. According to this, accurate amplification of the target site is possible, and after electrophoresis, it is possible to amplify to a concentration that can be confirmed with the naked eye through methods such as EtBr staining.
본 발명의 프라이머 세트에 의해 증폭된 마이크로새틀라이트 DNA 단편은 유전자형 분석기를 통하여 분석할 수 있고, 분석 후에 피크 정보를 이용하여 유전자형을 분석할 수 있다. 참전복의 배수성에 따라 서로 다른 DNA증폭 양상을 나타나는데, 증폭산물의 생성 여부 및 크기를 통해 배수성을 판별할 수 있으며, 이는 DNA 또 는 RNA의 분자량을 측정하거나 서열을 규명하는데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 확인할 수 있다. The microsatellite DNA fragment amplified by the primer set of the present invention can be analyzed through a genotype analyzer, and after analysis, the genotype can be analyzed using peak information. Different DNA amplification patterns appear depending on the ploidy of abalone, and the ploidy can be determined through the generation and size of the amplification product, which is known in the art used to measure the molecular weight of DNA or RNA or to identify the sequence. can be checked in a variety of ways.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples and Experimental Examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.However, the following Examples and Experimental Examples only illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following Examples and Experimental Examples.
<실시예 1> 참전복 분석시료 확보<Example 1> Secured abalone analysis sample
분석에 사용한 시료 중 2배체 참전복은 경상남도 거제지역에서 해녀가 채집한 자연산 참전복(n=48) 이며, 3배체 참전복은 국립수산과학원 육종연구센터에서 GSP(Golden Seed Project)과제수행으로 생산한 3배체 참전복(n=14)이다. 모든 개체의 전체 genomic DNA는 전복 외투막의 조직 일부를 절제하여 킬레이팅 수지법(chelating resin method)을 이용하여 추출하였다. 구체적으로, 외투막 조직의 일부를 200㎕ PCR 튜브에 넣고 잘게 자른 후 5%-Chelex®100 Resin(Bio-Rad, USA) 수용액 150㎕와 proteinase K 3㎕를 넣어 흔들어서 섞은 후에 1200rpm에서 40초간 원심분리하였다. 이 튜브를 PCR 기기에 넣고 55℃에 1시간, 100℃에 10분 처리한 후 냉장보관하였고, 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리시켜 최종적으로 DNA 시료를 추출하였다. Among the samples used for the analysis, diploid abalone was wild abalone (n=48) collected by haenyeo in Geoje, Gyeongsangnam-do, and triploid abalone was produced by the GSP (Golden Seed Project) project at the National Institute of Fisheries Science and Fisheries Breeding Research Center. One triploid abalone (n=14). The total genomic DNA of all individuals was extracted using the chelating resin method by excising a part of the tissue of the abalone mantle. Specifically, a part of the mantle tissue is put into a 200 μl PCR tube, cut into small pieces, and 150 μl of 5%-Chelex ® 100 Resin (Bio-Rad, USA) aqueous solution and 3 μl of proteinase K are added and mixed by shaking, followed by centrifugation at 1200 rpm for 40 seconds. did. This tube was placed in a PCR machine, treated at 55° C. for 1 hour, and 100° C. for 10 minutes, then stored refrigerated, and the supernatant was separated using a centrifuge to finally extract a DNA sample.
<실시예 2> 마이크로새틀라이트(microsatellite) 유전자좌의 선별<Example 2> Selection of microsatellite loci
실시예 1에 따라 추출한 DNA에 대한 RAW data를 합성하기 위하여 NGS(Next Generation Sequencing) 분석을 수행하였다. Next Generation Sequencing (NGS) analysis was performed to synthesize RAW data for the DNA extracted according to Example 1.
본 발명에 사용한 마이크로새틀라이트(microsatellite) 유전자좌는 PCR 진행중에 발생하는 미끄러짐 합성(slippage synthesis) 문제를 해결하기 위하여 가능한 2개 이상의 반복염기서열을 가진 트리뉴클레오타이드(trinucleotide), 테트라뉴클레오타이드(tetra nucleotide) 또는 펜타뉴클레오타이드(pentanucleotide)인 유전자좌를 선별하였으며, 높은 대립유전자수, 55~58℃의 어닐링(annealing) 온도, PCR 증폭범위, 하디-바인베르크 평형(HWE)에 적합한지를 기준으로 선별하였다. 그 결과, 최종적으로 5개의 유전자좌를 선별하였고, 각각의 마이크로새틀라이트 마커는 2 내지 5 bp의 반복염기서열이 5 내지 20회 정도 반복되는 것을 확인하였다(표 1).The microsatellite locus used in the present invention is a trinucleotide, tetranucleotide or The locus, which is a pentanucleotide, was selected based on a high allele number, an annealing temperature of 55 to 58°C, a PCR amplification range, and whether it was suitable for Hardy-Weinberg equilibrium (HWE). As a result, 5 loci were finally selected, and it was confirmed that the repeating nucleotide sequence of 2 to 5 bp was repeated 5 to 20 times for each microsatellite marker (Table 1).
HDSC8054
<실시예 3> 마이크로새틀라이트(microsatellite) 유전자좌의 증폭범위의 확인 <Example 3> Confirmation of the amplification range of the microsatellite locus
분석효율성을 높이기 위한 멀티플랙스 PCR 디자인을 위하여 표 1에 나타낸 5개의 마이크로새틀라이트 프라이머 세트를 이용하여 증폭범위를 확인하였다. PCR 증폭은 킬레이팅 수지법으로 얻어진 DNA시료 10 ng, 10 mM Tris-Hcl (pH 8.8), 0.1% Triton X-100, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5U f-Taq DNA polymerase (Solgent), 0.5 pmol 마이크로새틀라이트 프라이머 세트를 혼합하여 사용하였으며, PTC-200 Thermocylcer (MJ Research, Waltham, MA, USA) 를 이용하여 95℃에서 10분간 개시변성(initial denaturation) 시킨 후, 95℃에 20초, 55℃에 40초, 72℃에 1분으로 35회 반복하여 반응시킨 다음 72℃에 30분간 최종연장(final extention)시켜 PCR 반응을 마쳤다. PCR에 의해 증폭된 마이크로새틀라이트 DNA 단편은 표준크기(size standard)로 GeneScan 400HD ROX (ABI, USA), HiDi formamide와 혼합한 후 유전자형 분석기 (3500 genetic analyzer; ABI, USA)를 통하여 분석을 하였으며 분석 후에 나타난 피크 정보를 GeneMapper v3.7 software를 이용하여 유전자형을 분석하여 각 마이크로새틀라이트 유전자좌의 증폭범위를 확인하였다.For multiplex PCR design to increase analysis efficiency, the amplification range was confirmed using the five microsatellite primer sets shown in Table 1. PCR amplification was performed using 10 ng of the DNA sample obtained by the chelating resin method, 10 mM Tris-Hcl (pH 8.8), 0.1% Triton X-100, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5U f-Taq DNA polymerase (Solgent), 0.5 pmol microsatellite primer set was mixed and used, and after initial denaturation at 95°C for 10 minutes using PTC-200 Thermocylcer (MJ Research, Waltham, MA, USA), 95°C The reaction was repeated 35 times for 20 seconds at 55°C, 40 seconds at 55°C, and 1 minute at 72°C, followed by final extension at 72°C for 30 minutes to complete the PCR reaction. The microsatellite DNA fragment amplified by PCR was mixed with GeneScan 400HD ROX (ABI, USA) and HiDi formamide as a size standard and analyzed through a genotype analyzer (3500 genetic analyzer; ABI, USA). The peak information shown later was genotyped using GeneMapper v3.7 software to confirm the amplification range of each microsatellite locus.
그 결과, HDSC8054의 증폭범위는 257-299bp으로 나타났으며, HDSC0615는 145-163bp, EAngs4-14는 221-269bp, EAngs5-70는 282-342bp, Hd601는 152-196bp으로 나타났다(표 2). As a result, the amplification range of HDSC8054 was 257-299bp, HDSC0615 was 145-163bp, EAngs4-14 was 221-269bp, EAngs5-70 was 282-342bp, and Hd601 was 152-196bp (Table 2).
<실시예 4> 멀티플랙스(multiplex) PCR반응 조건 확립<Example 4> Establishment of multiplex PCR reaction conditions
5개의 마이크로새틀라이트 유전자좌의 증폭범위를 확인하고 증폭범위의 중복유무에 따라 Applied Biosystems(ABI, USA)의 4가지 형광표식 (6-FAM, PET, NED and VIC)을 붙였다. 멀티플랙스 디자인(multiplex design)을 위하여 기본적으로 증폭범위가 중복되지 않은 유전자좌(locus)는 같은 형광염료(fluorescent dye)를 사용하였으며, 반면에 같은 증폭범위를 나타낸 유전자좌(locus)는 서로 다른 형광염료(fluorescent dye)를 사용하여 실험하였다.The amplification ranges of 5 microsatellite loci were confirmed, and 4 types of fluorescent labels (6-FAM, PET, NED and VIC) from Applied Biosystems (ABI, USA) were attached according to the overlap of the amplification ranges. For multiplex design, basically, the same fluorescent dye was used for locus that did not overlap the amplification range, whereas the locus showing the same amplification range had different fluorescent dyes (locus). Fluorescent dye) was used.
상기 각 유전자 좌위에 대한 정방향 프라이머는 각각의 다른 형광라벨을 이용하여 표지하였다. HDSC8054는 PET, HDSC0615 및 EAngs4-14는 중복범위가 없어 같은 6FAM로 표지되었으며, EAngs5-70는 NED로 표지되었으며, Hd601는 VIC로 표지되었다. PCR증폭온도는 55℃로 하였으며, 프라이머 농도는 0.5pmol를 기준으로하여 각 프라이머 세트의 피크가 증폭시 비슷한 수준으로 나타나도록 농도를 조절하여 최적화 하였다(표 2).Forward primers for each locus were labeled using different fluorescent labels. HDSC8054, PET, HDSC0615 and EAngs4-14 were labeled with the same 6FAM as there was no overlapping range, EAngs5-70 was labeled with NED, and Hd601 was labeled with VIC. The PCR amplification temperature was set to 55°C, and the primer concentration was optimized by adjusting the concentration so that the peak of each primer set appeared at a similar level during amplification based on 0.5 pmol (Table 2).
PCR 증폭은 킬레이팅 수지법으로 얻어진 DNA시료 10 ng, 10 mM Tris-Hcl (pH 8.8), 0.1% Triton X-100, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5U f-Taq DNA polymerase (Solgent), 각각의 프라이머 농도는 표 2에 나타낸 것과 같이 5개를 혼합하여 사용하였으며, PTC-200 Thermocylcer (MJ Research, Waltham, MA, USA) 를 이용하여 95℃에서 10분간 개시변성(initial denaturation) 시킨 후, 95℃에 20초, 55℃에 40초, 72℃에 1분으로 35회 반복하여 반응시킨 다음 72℃에 30분간 최종 연장(final extension) 시켜 PCR 반응을 마쳤다. PCR에 의해 증폭된 마이크로새틀라이트 DNA 단편은 표준 크기(size standard)로 GeneScan 400HD ROX (ABI, USA), HiDi formamide와 혼합한 후 유전자형 분석기 (3500 genetic analyzer; ABI, USA)를 통하여 분석을 하였으며 분석 후에 나타난 피크 정보를 GeneMapper v3.7 software를 이용하여 유전자형을 분석하였다. 그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이 1회의 PCR을 통하여 5개의 유전자좌를 분석할 수 있었다. 이는 경제적 효율성이 매우 높은 방법으로 1회의 PCR 증폭의 작업 및 경제적 비용으로 5회의 PCR 결과를 얻을수 있는 방법이다.PCR amplification was performed with 10 ng of the DNA sample obtained by the chelating resin method, 10 mM Tris-Hcl (pH 8.8), 0.1% Triton X-100, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0.5U f-Taq DNA polymerase (Solgent), each primer concentration was used as a mixture of 5 as shown in Table 2, using a PTC-200 Thermocylcer (MJ Research, Waltham, MA, USA) at 95 ℃ 10 minutes initial denaturation (initial denaturation) ), the reaction was repeated 35 times for 20 seconds at 95°C, 40 seconds at 55°C, and 1 minute at 72°C, followed by final extension at 72°C for 30 minutes to complete the PCR reaction. The microsatellite DNA fragment amplified by PCR was mixed with GeneScan 400HD ROX (ABI, USA) and HiDi formamide in a standard size and analyzed through a genotype analyzer (3500 genetic analyzer; ABI, USA). The peak information shown later was genotyped using GeneMapper v3.7 software. As a result, as shown in FIG. 1, five loci could be analyzed through one PCR. This is a method with very high economic efficiency, and it is a method that can obtain PCR results 5 times with the operation and economic cost of one PCR amplification.
거제지역에서 해녀가 채집한 자연산 참전복(2배체)의 유전자좌의 분석 결과는 도 1에 나타나있으며, 전복 생산시 암컷과 수컷의 각 유전자좌의 유전자형이 같으면 피크는 1개, 다르면 2개의 피크를 나타낸다.The analysis result of the locus of wild abalone (diploid) collected by haenyeo in Geoje area is shown in FIG. .
<실험예 1> 멀티플랙스(multiplex) PCR법을 이용한 배수체 참전복 분석<Experimental Example 1> Analysis of polyploid abalone using multiplex PCR method
상기 실시예 1에서 국립수산과학원 육종연구센터에서 생산한 배수체 참전복(n=14)을 상기 실시예 4의 멀티플랙스 PCR 키트를 이용하여 3배체 여부를 판별하였다. 3배체 개체에 대한 유전자형 판별 전기영동분석 결과를 도 2 및 표 3에 나타냈다. 그 결과 100%(n=14) 모두 3배체의 여부를 판단할수 있었다. 3개의 대립유전자를 가지고 있는 하나의 유전자좌위만으로도 다형성을 충분히 판별할 수 있었다. 단일 유전자좌로 분석할 경우 HDSC8054는 78.6%, HDSC0615 및 EAngs4-14는 50.0%, EAngs5-70은 57.1%, Hd601는 21.4% 비율로 배수체를 확인할 수 있으나, 이를 5개를 조합하여 분석할 경우 100%의 높은 비율로 배수체 판별이 가능하였다. In Example 1, the polyploid abalone (n = 14) produced at the National Institute of Fisheries Science and Technology Breeding Research Center was determined to be triploid using the multiplex PCR kit of Example 4. The results of genotyping electrophoresis analysis for triploid individuals are shown in FIGS. 2 and 3 . As a result, 100% (n=14) were all able to determine whether they were triploid or not. Only one locus with three alleles was sufficient to discriminate polymorphisms. When analyzed as a single locus, polyploidy can be identified at a rate of 78.6% for HDSC8054, 50.0% for HDSC0615 and EAngs4-14, 57.1% for EAngs5-70, and 21.4% for Hd601. It was possible to discriminate polyploids with a high ratio of
<110> REPUBLIC OF KOREA(National Institute of Fisheries Science) <120> Identification method of triploid abalone, Haliotis discus hannai using genetic marker <130> 2020P-11-067 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDSC8054 forward primer <400> 1 cggtcgcagt cagcaatttt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDSC8054 reverse primer <400> 2 aatagcacca ctgccaacct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDSC0615 foward primer <400> 3 acactttcgc ctttgtccac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDSC0615 reverse primer <400> 4 tggggacttt tcggaacaga 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAngs4-14 forward primer <400> 5 attaggggtg gatggataga gg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAngs4-14 reverse primer <400> 6 ttgacgaaca gtcattttac gg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAngs5-70 forward primer <400> 7 agagcatcaa tcagttgctg tg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAngs5-70 reverse primer <400> 8 tgacttgatt acgtatgggc ag 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hd601 forward primer <400> 9 ttgctcccaa aggaaagaac 20 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hd601 reverse primer <400> 10 atgtttacaa ttctgtatgt tcagct 26 <110> REPUBLIC OF KOREA (National Institute of Fisheries Science) <120> Identification method of triploid abalone, Haliotis discus hannai using genetic markers <130> 2020P-11-067 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDSC8054 forward primer <400> 1 cggtcgcagt cagcaatttt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDSC8054 reverse primer <400> 2 aatagcacca ctgccaacct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDSC0615 forward primer <400> 3 acactttcgc ctttgtccac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDSC0615 reverse primer <400> 4 tggggacttt tcggaacaga 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAngs4-14 forward primer <400> 5 attaggggtg gatggataga gg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAngs4-14 reverse primer <400> 6 ttgacgaaca gtcattttac gg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAngs5-70 forward primer <400> 7 agagcatcaa tcagttgctg tg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAngs5-70 reverse primer <400> 8 tgacttgatt acgtatgggc ag 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hd601 forward primer <400> 9 ttgctcccaa aggaaagaac 20 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hd601 reverse primer <400> 10 atgtttacaa ttctgtatgt tcagct 26
Claims (12)
서열번호 3로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 ;
서열번호 5로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트 ;
서열번호 7로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 8로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트; 및
서열번호 9로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 10으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머세트;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 참전복 배수성 판별용 프라이머 세트 조성물.
a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 2;
a primer set comprising a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a reverse primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 4;
a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a reverse primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
a primer set consisting of a forward primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a reverse primer having a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; and
a primer set consisting of a forward primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a reverse primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 10;
A primer set composition for determining abalone ploidy, characterized in that it comprises a.
The primer set composition for determining abalone ploidy according to claim 1, wherein the primer set is for amplifying a microsatellite marker.
The primer set composition for determining abalone ploidy according to claim 1, wherein in the primer set, at least one oligonucleotide is labeled with a fluorescent material.
A kit for determining abalone ploidy, comprising the primer set composition of any one of claims 1 to 3.
The kit of claim 5, wherein the kit for determining the abalone ploidy is a multiplex kit.
분리된 상기 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 참전복 배수성 판별용 프라이머 세트 조성물로 DNA를 증폭하는 단계; 및
증폭된 DNA 산물에 대하여 참전복의 배수성을 분석하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 참전복 배수성 판별 방법.
isolating DNA from abalone;
Using the isolated DNA as a template, and amplifying the DNA with the primer set composition for determining the abalone ploidy of any one of claims 1 to 3; and
analyzing the ploidy of abalone for the amplified DNA product; A method for determining abalone multiples, characterized in that it comprises a.
The method of claim 7, wherein the DNA is derived from the mantle of abalone.
The method of claim 7, wherein the amplification of the DNA is a multiplex PCR.
95℃로 10분간 개시변성(initial denaturation)하는 단계;
95℃로 20초 변성(denaturation), 55로 40초 결합(annealing) 및 72℃로 1분간 연장(extension)하는 과정을 35회 반복하는 단계;
72℃로 30분간 최종 연장(final extension)하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 참전복 배수성 판별 방법.
The method of claim 9, wherein the multiplex PCR is
Initial denaturation (initial denaturation) for 10 minutes at 95 ℃;
repeating the process of denaturation at 95° C. for 20 seconds, annealing at 55° C. for 40 seconds and extension at 72° C. for 1 minute 35 times;
The step of final extension (final extension) for 30 minutes at 72 ℃; characterized in that it comprises, abalone ploidy determination method.
The method of claim 7, wherein the analysis of the amplified DNA product is performed through electrophoresis analysis.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102433906B1 (en) * | 2021-12-02 | 2022-08-22 | 대한민국 | Selective Breeding method for genetically improved Pacific abalone, Haliotis discus hannai which grows faster |
| KR102499499B1 (en) * | 2022-11-29 | 2023-02-13 | 한국수산자원공단 | Analysis sample collection method to reduce abalone mortality and gene analysis method using this method |
Citations (2)
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| KR101437381B1 (en) * | 2013-08-21 | 2014-09-11 | 대한민국 | Method for triploid verification of Pacific oyster |
| KR20190047826A (en) * | 2017-10-30 | 2019-05-09 | 부경대학교 산학협력단 | Method for karyotype analysis of abalone |
-
2020
- 2020-12-10 KR KR1020200172136A patent/KR102311743B1/en active IP Right Grant
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