KR102306094B1

KR102306094B1 - 프로스타좀 분비 조절용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102306094B1
Application number: KR1020190005801A
Authority: KR
Inventors: 박광현; 오윤화; 김우현; 최선은
Original assignee: 남부대학교산학협력단; 전북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2019-01-16
Publication date: 2021-09-28
Also published as: KR20190088895A; US20190298745A1

Abstract

본 발명은 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 2차 전령 (second messenger) 또는 이의 조절제를 포함하는 프로스타좀 분비 조절용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프로스타좀 분비 촉진 및 조절 기술은 전립선 세포 내 신호전달 기전에 기반한 엑소좀 분비 조절 기술을 제공한다는 것에 가장 큰 특징이 있다. 특히, 정자에 운동성을 부여하는 프로스타좀의 분비를 직접적으로 조절할 수 있다는 점에서, 불임 진단 또는 치료 시 시행되는 정자 운동성의 검증에 활용될 수 있고, 수정능 향상 목적 및 피임 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

프로스타좀 분비 조절용 조성물 및 이의 용도{COMPOSITION FOR CONTROLLING SECRETION OF PROSTASOMES AND USE THEREOF}

본 발명은 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 2차 전령 (second messenger) 또는 이의 조절제를 포함하는 프로스타좀 분비 조절용 조성물에 관한 것이다.

정자의 운동성을 결정하는 것은 내재적으로는 고환으로부터 생성된 후 보유하게 되는 운동성을 들 수 있으나, 실제로 난자로의 주화성 (chemotaxis) 및 활발한 운동성 (motility) 등을 확보하기 위한 다양한 분자가 요구된다. 이러한 다양한 분자의 공급은 전립선에서 분비되는 엑소좀 (exosome)인 프로스타좀 (prostasomes)에 의해 공급받는 것으로 보고된 바 있다 (Park 등. Sci Signal. 4(173):ra31 (2011)).

프로스타좀은 수백나노미터 (평균 150 나노미터) 크기를 가지고 있는 것으로 보고되고 있으며, 단백질체 분석 연구 등을 통해 수백 가지의 단백질이 동정된바 있다. 기존에는 이러한 결과를 다양한 질병의 진단과 치료기술 개발, 예후 판단을 위해 활용하고자 노력하여왔다 (Tavoosidana 등. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(21):8809-14 (2011), Fabiani 등, Hum. Reprod. 9, 1485-1489 (1994); Arienti 등, Biol. Cell 91, 51-54 (1999)). 프로스타좀은 여성의 질 내부의 조건과 유사한 약산성 조건에서 정자와 특이적으로 결합하여 구조적 또는 기능적 변화를 가져오게 되어 수정능에 절대적인 영향을 미치게 된다 (Ronquist와 Brody, Biochim. Biophys. Acta 822, 203-218 (1985); Arienti 등, Membr. Biol. 155, 89-94 (1997); Publicover 등, Nat. Cell Biol. 9, 235-242 (2007); Burden 등, Hum. Reprod. Update 12, 283-292 (2006)).

한편, 프로스타좀의 분비의 활성화 및 조절에 관한 기술에 있어서 세포막의 콜레스테롤의 조절 기술 (Llorente et al., 2007) 과 같은 세포내 신호전달 기전을 규명하여 산업에 응용하기 위한 기술 개발이 시도되었던 바 있다. 그러나, 세포내부 및 외부의 칼슘 신호 전달 기전 조절에 의한 프로스타좀의 분비 증가 및 감소 기술을 통한 임신의 촉진 및 억제에 관한 기술은 아직까지 개발된 적이 없다.

이에, 본 발명은 프로스타좀의 분비 촉진 및 억제에 있어서 세포 내 칼슘 신호 전달 기전에 기반한 프로스타좀 분비 조절 방법을 제공함으로서 궁극적으로 임신 가능성을 향상시키거나 피임 목적을 달성하는 방법을 제공한다.

이에, 본 발명자들은 세포 내 칼슘 신호 전달 기전에 기반하여 프로스타좀 분비 촉진 및 억제가 가능함을 확인하고, 궁극적으로 이를 임신 가능성을 향상시키거나 피임 목적을 달성하는 데에 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 2차 전령 (second messenger) 또는 이의 조절제를 포함하는 프로스타좀 분비 조절용 조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 세포내부 및 외부의 칼슘 신호전달 기전을 조절하는 기술을 활용하여 프로스타좀의 분비를 활성화시키거나 제어함으로서 정자 운동성을 향상시키거나 감소시키는 기술을 제공하는 데에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 2차 전령 (second messenger) 또는 이의 조절제를 포함하는 프로스타좀 분비 조절용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 (in vitro) 본 발명에 따른 프로스타좀 분비 조절용 조성물을 전립선 세포에 처리하는 단계를 포함하는 프로스타좀 분비 조절 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 (in vitro) 상기 조성물을 전립선 세포에 처리하는 단계를 포함하는 정자 운동성 향상 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 (in vitro) 후보물질을 전립선 세포에 처리하는 단계; 상기 전립선 세포 내 칼슘 농도를 측정하는 단계; 및 상기 칼슘 농도 측정 결과 전립선 세포 내 칼슘 농도가 후보물질 처리 전보다 증가한 경우, 상기 후보물질은 프로스타좀 분비 증진물질 또는 정자 운동성 증진물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 프로스타좀 분비 증진물질 또는 정자 운동성 증진물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 프로스타좀 분비 촉진 및 조절 기술은 전립선 세포 내 신호전달 기전에 기반한 엑소좀 분비 조절 기술을 제공한다는 것에 가장 큰 특징이 있다. 특히, 정자에 운동성을 부여하는 프로스타좀의 분비를 직접적으로 조절할 수 있다는 점에서, 불임 진단 또는 치료 시 시행되는 정자 운동성의 검증에 활용될 수 있고, 수정능 향상 목적 및 피임 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 전립선 세포주의 세포막 탈분극에 의한 프로스타좀 분비 증가 검증을 위한 웨스턴블롯팅 결과로, 대표적인 표지분자인 HSP70, Rab5 및 LAMP1의 KCl 처리에 의한 농도 의존적(A) 또는 시간 의존적(B) 프로스타좀 분비 증가 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 세포 내 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제의 전처리에 의한 전립선 세포주의 세포막 탈분극에 의한 프로스타좀 분비에 관여하는 칼슘 신호 변화를 나타낸 것이다: (A) KCl 처리에 의한 세포막 탈분극으로 유도된 칼슘신호, (B) Xestospongin C (IP3 수용체 길항제) 전처리, (C) 8-Br-cADPR (cyclic ADPR 길항제) 전처리, (D) Ned-19 (nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate 길항제) 전처리 후 KCl 처리에 의한 세포막 탈분극으로 유도된 칼슘신호의 제어 변화.
도 3은 전립선 세포주의 세포막 탈분극에 의한 세포 내 칼슘 이동 및 2차 전령 (Second messengers) 조절제의 변경에 의한 조절 작용의 웨스턴블롯팅 결과를 나타낸 것이다 (heparin: IP3 수용체 길항제, 8-Br-cADPR; cyclic ADPR 길항제, Ned-19: nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate 길항제).
도 4는 전립선 세포주의 캡사이신 등에 의한 프로스타좀 분비능 증가 검증을 위한 웨스턴블롯팅 결과로, 프로스타좀을 포함하는 엑소좀의 대표적인 표지분자인 HSP70, ßLAMP1의 캡사이신 처리에 의한 (A) 농도 의존적 (B) 시간 의존적 엑소좀 분비 증가 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 세포 내 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제 처리 또는 세포막 탈분극에 의한 프로스타좀 분비 증대와 정자와의 반응에 의한 정자 운동성 실험 결과를 나타낸 것이다 (D-myo-IP3: D-myo-Inositol 1,4,5-triphosphate, KCl: photassion phosphate; *P<0.05, **P<0.001 vs. no fusion group; #P<0.05 vs. PPECs-derived prostasome fused group).
도 6는 세포 내 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제 처리에 의한 프로스타좀 분비 증대와 정자와의 반응에 의한 수정능 제어 결과를 나타낸 것이다 (XeC: Xestospongin C, *P<0.001 vs. no prostasome incubated group; ##P<0.05 vs. prostasome incubated group). 삽도는 수정된 난자를 나타낸 것이며, 확대 비율은 x40이다.
도 7은 프로스타좀의 분비능을 촉진하는 캡사이신의 투여에 의한 마우스의 산자수 (pups)의 증가 결과를 나타낸 것이다. (Normal: 무처리군, Solvent: DMSO-PBS 투여군, Capsaicin: 50 mg/kg 캡사이신 투여군. 결과는 평균±표준편차 (Mean ± SD)로 나타내었다 (*P<0.05 vs Normal group).

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 명세서에서, 용어 “프로스타좀”은 전립선에서 분비되는 수십 내지 수백 나노미터의 직경을 갖는 과립으로, 여성의 질 내부와 같은 약산성 조건에서 정자와 특이적으로 결합하는 물질이다. 상기 프로스타좀은 정상 전립선 세포주 또는 전립선 암 세포주에서 분리할 수 있으며, 상기 전립선 암 세포주는 DU-145, LnCaP 또는 PC-3일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 DU-145 세포주를 이용하여 프로스타좀을 분리하고 있다.

본 명세서에서, 용어 “2차 전령”은 생물의 신호전달 경로에 관여하는 물질, 특히 세포가 외부의 신호를 수용했을 때 내부로 2차적으로 신호를 전달, 증폭하기 위해 만드는 작은 수용성 물질들을 의미한다.

칼슘은 여러 효소의 활성 및 억제에 관여하여 세포 내 생리 균형을 유지시키는 다기능성이온 (mutifunctional ion)으로, 안정한 상태에서 세포 내 칼슘농도는 10^-7M 정도로 유지된다.

본 발명에 있어서, 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호를 조절하는 칼슘 신호전달 2차 전령은 세포 내부 및 외부의 칼슘 농도를 변화시킴으로서 세포에서 상응하는 반응을 일으키는 물질을 의미하며, 바람직하게는 사이클릭 에이디피 라이보스 (cyclic ADP-ribose, cADPR) 또는 이노시톨 삼인산 (Inositol 1,4,5-trisphosphate, IP₃) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

IP₃는 IP₃ 수용체에 결합하여 세포 소기관인 소포체 (endoplasmic reticulum, ER)로부터 칼슘의 유리를 일으킨다. 다른 이차전령인 NAD와 NADP는 NAD glycohydrolase (NADase)에 의해 각각 cyclic ADP-ribose (cADPR)와 NAADP (nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate)로 대사된다. NAADP는 라이소좀 (lysosome)-유사 소기관으로부터 칼슘 유리를 일으키는 반면, cADPR은 CICR(calcium-induced calcium release) 기전에 의해 소포체 (ER)/근소포체 (sarcoplasmic reticulum, SR)로부터 칼슘을 유리시킨다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 나열한 각각의 세포 내 칼슘 신호전달 2차 전령에 대한 길항제를 전처리하여 세포 내 칼슘 신호전달 양상을 분석하고, 그 결과 프로스타좀 분비를 위한 칼슘 신호전달 기전은 IP₃와 cADPR을 경유하는 기전을 거치나, NAADP 신호를 경유하지는 않음을 확인하고 있다.

또한, 상기 칼슘 신호전달 2차 전령은 사이클릭 에이디피 라이보스 (cyclic ADP-ribose), 이노시톨 삼인산 (Inositol 1,4,5-trisphosphate) 또는 각각의 유도체일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 세포 내 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제로 D-myo-IP₃(D-myo-Inositol 1,4,5-triphosphate)을 사용하여 세포 내 IP₃ 농도를 직접적으로 상승시킴으로써, 세포 내 칼슘 농도 증가 및 전립선 세포로부터 프로스타좀 분비가 증가됨을 확인하고 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 전립선 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 기전을 조절함으로써 프로스타좀 분비를 증진시키는 물질로 캡사이신 (capsaicin)을 사용하고 있다. 상기 캡사이신은 TRPV1 와 같은 이온채널 등을 경유하여 세포 신호전달을 유도하는 물질로서, 특정 목적으로 FDA에서 승인된 바 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로스타좀 분비 조절은 프로스타좀의 분비가 억제 또는 촉진되는 것일 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 프로스타좀 분비 조절용 조성물을 사용하는 목적에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 2차 전령에 대한 길항제는 프로스타좀 분비를 억제시킬 수 있고, 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 2차 전령에 대한 유도제는 프로스타좀 분비를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 다양한 일반적인 의약품 제제의 형태로 제제화될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제는 하나 이상의 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 또는 락토오스(lactose)또는 젤라틴 등을 섞어 제형화될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크와 같은 활택제를 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제에는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 포함되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제가 포함된다. 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 또는 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1~1000 ㎎/일이며, 바람직하게는 1~500 ㎎/일이며, 가장 바람직하게는 0.7~3.5 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 (in vitro) 본 발명에 따른 프로스타좀 분비 조절용 조성물을 전립선 세포에 처리하는 단계를 포함하는 정자 운동성 향상 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 프로스타좀 분비 조절용 조성물로서 D-myo-IP₃(D-myo-Inositol 1,4,5-triphosphate)를 사용하여, 세포 내 칼슘 신호전달 2차 전령인 IP3의 농도를 직접적으로 상승시킬 수 있는 D-myo-IP3 처리 시 전립선 세포의 프로스타좀 방출이 효과적으로 유도되며, 그 결과 정자 운동속도가 두 배 가까이 증가함을 확인하고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 정자 운동성 향상 방법은 상기 전립선 세포에서 수득한 프로스타좀에 분리된 정자를 결합시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 (in vitro) 후보물질을 전립선 세포에 처리하는 단계; 상기 전립선 세포 내 칼슘 농도를 측정하는 단계; 및 상기 칼슘 농도 측정 결과 전립선 세포 내 칼슘 농도가 후보물질 처리 전보다 증가한 경우, 상기 후보물질은 프로스타좀 분비 증진물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 프로스타좀 분비 증진물질의 스크리닝 방법 을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 (in vitro) 후보물질을 전립선 세포에 처리하는 단계; 및 상기 전립선 세포 내 칼슘 농도를 측정하는 단계; 및 상기 칼슘 농도 측정 결과 전립선 세포 내 칼슘 농도가 후보물질 처리 전보다 증가한 경우, 상기 후보물질은 정자 운동성 증진물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 정자 운동성 증진물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실험예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 프로스타좀의 분리

인간 전립선 암세포주 배양액으로부터 프로스타좀을 분리하였다. 프로스타좀의 분리는 Palmerini 등의 방법을 수정하여 사용하였다 (Palmerini 등, Fertil. Steril. 80, 1181-1184 (2003)).

구체적으로, 상기 전립선 암세포주 DU-145를 exosome free 10% FBS (GIBCO/Invitrogen, USA)와 1% antibotics-antimycotic (GIBCO/Invitrogen, USA)이 첨가된 DMEM (GIBCO/Invitrogen, USA)을 배지로 하여 37℃5% CO₂ 조건하에 배양하고, 세포 배양액을 취하여 3,000rpm으로 30분간 원심분리하여 상청액을 분리하였다. 상기 상청액을 Beckman 사의 고속 원심분리기를 이용하여 15,000 xg로 20분간 원심분리한 후 다시 상청액을 분리하였고, 초고속 원심분리기를 이용하여 105,000 xg로 2시간 동안 원심분리한 후 침강물을 획득하였다. 회수된 침강물을 동일 완충액으로 재부유시키고 sephadex G-200(시그마사, 미국)을 이용하여 제일 먼저 용출되는 분획을 취하여 재차 원심분리한 후 부유시켜 사용하였다.

마우스의 프로스타좀의 분리는 마우스 복강을 절개하여 개복하고 방광 하단에 존재하는 전립선을 미세 수술을 통하여 획득하였다 (Drost 등, 2016, Nat Protoc. 11(2): 347-358). 그 후, 압착 방법을 통해 전립선으로부터 용출액을 회수하고 BWW (Bigger, Whitten, and Whittingham) 배지 [10 mM Hepes, 20 mM sodium lactate, 5 mM glucose, 0.25 mM sodium pyruvate, penicillin G (80 mg/L), streptomycin sulfate (50 mg/L), 95 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.3 mM CaCl₂, 1.2 mM KH₂PO₄, and 1.2 mM MgSO₄ in 25 mM NaHCO₃ buffer, pH 7.4])로 희석하였다. 부유액은 상기에 서술한 방법과 동일한 방법을 통해 프로스타좀을 회수하는데 이용하였다.

실험예 2. 정자의 분리

프로스타좀이 결합되지 않은 마우스 정자를 수집하기 위하여, 수컷 마우스의 부고환 (epididymis)을 외과적으로 분리하고, 혈액과 지방 조직은 안과용 가위를 사용하여 제거하였다. 상기 부고환은 30게이지의 멸균주사바늘로 구멍을 뚫고, 많은 양의 정자가 방출되도록 핀셋으로 압박하였다. 정자 부유액은 즉시 37℃로 예열된 1%의 우혈청 알부민 (BSA)이 함유된 BWW (Bigger, Whitten, and Whittingham) 배지 [10 mM Hepes, 20 mM sodium lactate, 5 mM glucose, 0.25 mM sodium pyruvate, penicillin G (80 mg/L), streptomycin sulfate (50 mg/L), 95 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.3 mM CaCl₂, 1.2 mM KH₂PO₄, and 1.2 mM MgSO₄ in 25 mM NaHCO₃ buffer, pH 7.4])로 20배 희석하여 실온에서 900 xg로 5분간 원심분리 하여 침전물을 동일 완충액으로 2회 세척하여 사용하였다.

실험예 3. 웨스턴 블롯

단백질 20μg을 5×sample buffer에 넣고 100℃에서 5분간 불활성화 시킨 후 10% SDS 폴리아크릴아마이드 젤 (polyacrylamide gel)에 전기영동하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후 2% BSA에서 90분 동안 블로킹 하였다. HSP70, βRab5, LAMP1 항체는 각각 1:1000의 비율로 4℃에서 하룻밤 둔 후 tris-buffered saline Tween-20(TBST) 버퍼로 10분간 3회 세척하였고 2차 항체는 1:1,000의 비율로 희석하여 2시간 상온에서 부착시켰다. TBST 버퍼로 15분간 3회 세척한 막에 ECL (Bio-Rad, USA)을 처리하여 LAS-500 (GE Healthcare Life Science, USA)으로 단백질 발현량을 측정하였다.

실시예 1. 세포 내 칼슘 신호전달 조절이 프로스타좀 생성 및 분비에 미치는 영향

1-1. KCl 처리에 따른 프로스타좀 관련 단백질 발현 분석

세포막 탈분극 (cell membrane depolarization)을 유도하는 KCl을 사용하여, 전립선 암세포주인 DU-145에서 KCl 처리에 따른 프로스타좀 관련 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 구체적으로, 세포를 1시간 동안 다양한 농도 (0, 5, 10, 25, 50, 100 mM)의 KCl과 함께 배양하고, 실험예 1에 기재한 방법으로 배양 상등액으로부터 프로스타좀을 준비하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 또한, 세포를 25 mM KCl과 함께 다양한 시간 (0, 10, 30, 60, 120, 180분) 동안 배양하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 A에 나타낸 바와 같이, KCl 처리에 따라 인간 전립선 암 세포주인 DU-145에서 전형적인 엑소좀 마커인 HSP70, Rab5 및 LAMP1의 단백질 발현이 농도 의존적으로 증가되었음을 확인하였다. 또한, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, HSP70 및 LAMP1의 단백질 발현은 시간 의존적으로도 증가됨을 확인하였다. 상기 결과를 통해, KCl의 처리에 따라 막 탈분극의 유도로 프로스타좀이 방출되며, 상기 엑소좀 마커의 발현량 증가로부터 프로스타좀 방출 증가 정도를 결정할 수 있음을 확인하였다.

1-2. 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제 처리에 따른 세포 내 칼슘 신호전달 분석

인간 전립선 암세포주 DU-145에 세포 내 칼슘 (Ca² ⁺) 신호전달 2차 전령 조절제를 전처리하여 세포 내 칼슘 신호전달 양상을 분석하였다. 세포 내 칼슘 농도는 다음과 같은 방법으로 측정하였다: poly-L-lysine (sigma-aldrich, 미국)이 코팅된 공초점용 디쉬 (SPL, 서울, 대한민국)에 fluo-3 (molecular probe, 미국)가 전처리된 세포 부유액을 적정하고 CO₂ 배양기에서 20분간 반응시켜 세포를 부착시켰다. 그 후, Nikon 사의 공초점 현미경 시스템을 사용하여 Tsien 등 (Tsien 등, Nature 295, 68-71 (1982))에 의한 방법으로 세포내 칼슘 양을 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2의 A에 나타낸 바와 같이, 세포에 120 μM의 KCl을 처리한 결과, 세포 내 칼슘 ([Ca² ⁺]_i)의 급격한 증가 및 지속적인 칼슘 증가가 유도됨을 확인하였다. 이와 같은 모델에서, 경쟁적 IP₃ 수용체 길항제인 Xestospongin C로 전처리 시, KCl 처리에 의한 지속적인 [Ca² ⁺]_i의 증가가 억제됨을 확인하였다 (도 2의 B). 마찬가지로, cADPR의 길항제인 8-br-cADPR의 전처리 시에도, 지속적인 [Ca² ⁺]_i의 증가가 억제됨을 확인하였다 (도 2의 C). 반면, NAADP 길항제인 Ned-19를 이용한 전처리 시에는 지속적인 [Ca² ⁺]_i 방출이 억제되지 않음을 확인하였다 (도 2의 D). 상기 결과를 통해, KCl은 세포 내 칼슘 농도를 증가시키고, 프로스타좀의 형성 및 분비를 증가시키며, 상기 프로스타좀 분비를 위한 칼슘 신호전달 기전은 IP₃와 cADPR을 경유하는 기전을 거치나, NAADP 신호를 경유하지는 않음을 확인하였다.

1-3. 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제 처리에 따른 프로스타좀 관련 단백질 발현 분석

나아가, 인간 전립선 암세포주 DU-145에 세포 내 칼슘 (Ca² ⁺) 신호전달 2차 전령 조절제를 전처리하여 프로스타좀 관련 단백질 발현 변화를 분석하였다. 구체적으로, 25 mM KCl과 함께 100 μg/ml 헤파린 (Heparin, 선택적 IP₃ 수용체 저해제), 50 μM 8-Br-cADPR (cADPR 길항제) 및 1 μM NED-19 (NAADP 길항제)와 같은 다양한 길항제 (세포 내 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제)를 DU-145 세포에 처리하고, 실험예 1에 기재한 방법으로 배양 상등액으로부터 프로스타좀을 준비하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 모든 길항제는 KCl 처리 전 30분 동안 미리 배양하였으며, KCl 처리 후 세포를 추가로 1시간 동안 배양하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 길항제 없이 KCl만 단독으로 처리된 그룹에서는 HSP70의 발현이 증가하였으나, 길항제와 KCl이 함께 처리된 그룹에서는 KCl로 인해 증가된 HSP70의 발현이 억제됨을 확인하였다. 반면, Ned-19를 처리한 그룹에서는 HSP70 발현 억제 효과가 나타나지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, KCl로 인해 발현이 증가된 HSP70은 IP₃와 cADPR에 대한 길항제 (칼슘 신호전달 2차 전령 억제제)와 함께 처리되는 경우 감소됨을 확인하였다. 나아가, 상기 HSP70은 전립선 암 세포주 유래 프로스타좀 내 단백질 마커라는 점에서, 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제 처리시 프로스타좀 분비가 감소됨을 확인하였다.

1-4. 캡사이신 처리에 따른 프로스타좀 관련 단백질 발현 분석

세포 내 칼슘 신호전달을 유도하는 캡사이신 (Sigma aldrich, MO, USA)을 사용하여, 인간 전립선 암세포주인 DU-145에서 캡사이신 처리에 따른 프로스타좀 관련 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 구체적으로, 세포를 3시간 동안 다양한 농도 (0, 12.5, 25, 50, 100, 200 μM)의 캡사이신과 함께 배양하고, 실시예 2에 기재한 방법으로 배양 상등액으로부터 프로스타좀을 준비하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 또한, 세포를 50 μM 캡사이신과 함께 다양한 시간 (0, 10, 30, 60, 91, 120, 180분) 동안 배양하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 A에 나타낸 바와 같이, 캡사이신 처리에 따라 인간 전립선 암 세포주인 DU-145에서 전형적인 엑소좀 마커인 HSP70의 단백질 발현이 농도 의존적으로 증가되었음을 확인하였다. 또한, 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, HSP70, LAMP1 및 Rab5의 단백질 발현은 시간 의존적으로도 증가됨을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 캡사이신의 처리에 따라 막 탈분극의 유도로 프로스타좀이 방출되며, 상기 엑소좀 마커의 발현량 증가로부터 프로스타좀 방출 증가 정도를 결정할 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. 프로스타좀에 의한 정자의 운동성 시험

상기 실험예 1 및 2와 동일한 방법으로 마우스 정상 전립선 세포주 (PPECs)에서 프로스타좀과 정자를 수득하고, 프로스타좀이 정자에 결합하였을 때 정자 운동성에 미치는 영향을 확인하였다. 프로스타좀과 결합시키지 않은 대조군 외, 다음의 3개 실험군으로 나누어 실험하였다: 프로스타좀 결합된 정자 (PPECs-Derived prostasome fused), D-myo-IP₃(D-myo-Inositol 1,4,5-triphosphate) 전처리한 마우스 정상 전립선 세포주 유래 프로스타좀과 결합된 정자 (D-myo-IP₃+ PPECs-Derived prostasome fused), KCl 전처리한 마우스 정상 전립선 세포주 유래 프로스타좀과 결합된 정자 (KCl+ PPECs-Derived prostasome fused).

구체적으로, 분리된 정자를 0.32 M sucrose가 포함된 약알칼리성 완충액 또는 결합 버퍼 (150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM glucose with 2 mM Hepes (pH 8.0)/20 mM MES (pH 5.0, 결합 버퍼))로 희석한 후 프로스타좀 대 정자 단백질 비율이 2:1이 되게 혼합하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응물은 600 xg에서 10분간 원심분리한 후 침전물을 회수하여 BWW 완충액 등에 재부유시켜 시험에 이용하였다. 정자의 운동속도를 측정하기 위하여 CASA (computer assisted sperm analysis) 기기를 이용하였다 (IVOS, Hamilton Thorne Biosciences, 미국). 정자 부유액을 20 마이크론 깊이의 정자 분석용 슬라이드 (2X-CEL, Hamilton Thorne Biosciences, 미국)에 적정하고 4배율의 렌즈를 통해 자동촬영 및 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 프로스타좀을 결합시키지 않은 정자의 경우보다 결합시킨 정자의 운동성은 오차 범위 내에서 증가하는 패턴을 보였으나 유의하지는 않았고 여기에 세포 내 칼슘 신호전달 2차 전령인 IP₃의 농도를 직접적으로 상승시킬 수 있는 D-myo-IP₃ 처리 시 정자 운동속도가 두 배 가까이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 곡선거리 속도 (VCL: velocity of curvilinear), 직선거리 속도 (VSL: velocity of straight-line), 평균거리 속도 (VAP: velocity of average path), 그리고 과다활성화 운동성 (hyperactivation)을 측정한 결과들에서 동일하게 확인되었다. 상기 결과를 통해, 대표적인 IP₃ 유도체인 D-myo-IP₃가 세포 내 칼슘 유입을 증가시킴으로써 전립선 세포의 프로스타좀 방출을 효과적으로 유도함을 확인하였다. 특히, 상기 D-myo-IP₃는 일반적으로 세포 비투과성으로 알려져 있으나, 본 발명자들은 상기 결과를 통해 IP₃의 세포 투과성, 그로 인한 세포 내 칼슘신호 유도 및 세포 내 칼슘신호 증가를 통한 프로스타좀 분비 증가능을 확인하였다.

실시예 3. 시험관내 수정능 시험 ( In vitro fertilization)

시험관내 수정능 시험을 실시하기 위하여 Ren 등의 방법을 수정하여 사용하였다 (Ren 등, Nature 413, 603-609 (2001)). 10-12주령 된 암컷 마우스에 혈청성생식선자극호르몬 (pregnant mare serum gonadotropin, PMSG) (5 IU; Sigma-Aldrich)을 주사하고 48시간 후 인간 융모성 생식선 자극호르몬 (human chorionic gonadotropin, hCG) (5 IU; Sigma-Aldrich)을 주사하였다. 마지막 주사 14시간 후 자궁관을 적출하여 IVF 배지 (Medicult, 미국)로 관류하고 흘러나온 난자를 저배율 현미경을 이용하여 수집하였다.

수집된 난자를 IVF 배지에 재부유하고, 세포 내 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제의 존재 또는 미존재 상태에서 획득한 프로스타좀을 함께 배양하여 수정 반응을 유도하였다. 외부 공기 차단을 위해 가온한 미네랄오일을 배지상부에 중첩시켰다. 배양 시작 36시간 후 현미경하에서 배양액에 포함된 총 난자수를 계수하고 그 중 2세포기 (two cell stage) 이상의 세포를 계수하여 하기 공식을 이용하여 수정율을 계산하였다. 프로스타좀을 처리하지 않고 동일한 결합 (fusion) 과정을 거친 정자를 15개 가량의 난자와 배양한 경우를 100%로 하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

수정율 (%) = 2세포기 이상의 수정란 수 (개) ÷전체 난자수 (개) x 100

도 6에 나타낸 바와 같이, 마우스 정상 전립선 세포로부터 유래한 프로스타좀을 결합시킨 정자를 난자와 반응시켰을 때 수정능이 약 2배 가량 증가함을 확인하였다. 반면, 선택적 IP₃ 수용체 저해제인 Xestospongin C (XeC) 및 헤파린을 전처리하여 획득한 프로스타좀을 결합시킨 정자의 경우 수정능이 음성 대조군과 유사한 수준으로 감소함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 프로스타좀의 분비는 칼슘 신호전달 경로 중 IP₃ 수용체를 경유하며, 프로스타좀 분비능 조절을 통해 수정능을 효과적으로 조절할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 마우스에서의 번식 시험 (Reproduction tests)

마우스 번식과정에서 산자 (pups) 수를 측정하여 프로스타좀의 분비 촉진에 따른 번식능 증가를 확인하였다 (남부대학교 동물실험 승인번호 #201604). 7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 그룹당 6마리를 무작위로 세그룹으로 분류하여 사육조건에 적응시켰다. 각 그룹은 무처리군, 용매 처리군, 캡사이신 처리군으로 구분하였다. 캡사이신은 DMSO에 고농도 (100배)로 만든 후 인산완충용액 (PBS, pH 7.2)으로 희석하여 주사액으로 사용하였다. 용매 처리군은 동일한 용량의 DMSO가 희석된 PBS (200 μl)를 투여하였다. 1일 2회씩 캡사이신 (50 mg/kg) 및 위약을 각 시험군에 2주간 복강주사하였다. 그 후, 각 마우스를 동일한 사육조건에 적응된 암컷 C57BL/6 마우스와 48시간동안 케이지를 구분하여 1:1로 교배를 실시하였다. 교배는 저녁 6시부터 시작하였으며, 오전 9시경 질입구에 플라그가 형성된 것을 확인함으로서 교미 성공여부를 판단하였으나, 조기 탈락의 가능성을 고려하여 48시간은 그대로 유지하였다. 그 후, 각 케이지에서 암컷만을 분리하여 그룹별로 별도 사육을 실시하였고, 임신기간 (약 21일)이 지나고 분만 후 산자수 (pups)를 계수하였다. 결과는 student t-test를 실시하여 유의성을 평가하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 캡사이신 처리군에서 산자 수가 증가함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 캡사이신 처리에 따른 프로스타좀 분비 촉진에 의해 마우스 번식능이 증가함을 확인하였다.

상기 실시예에서 확인한 바와 같이, 본 발명자들은 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제를 이용하여 세포 안팎의 칼슘 신호전달 경로를 조절함으로써 전립선 세포의 프로스타좀 형성 및 분비를 제어하고, 이를 통해 효과적인 임신 조절이 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 프로스타좀 분비 촉진 및 조절 기술은 수정능 향상 목적 및 피임 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 기술적 범위는 전술한 실시예에 한정되지 않고 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 이때, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 고려해야 할 것이다.

Claims

삭제
세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 2차 전령 (second messenger) 또는 이의 조절제를 포함하며, 상기 2차 전령은 사이클릭 에이디피 라이보스 (cyclic ADP-ribose) 또는 이노시톨 삼인산 (Inositol 1,4,5-trisphosphate)인, 프로스타좀 분비 조절용 시약 조성물.
제2항에 있어서, 상기 세포 내부 및 외부의 칼슘 신호전달 2차 전령 조절제는 D-myo-IP₃(D-myo-Inositol 1,4,5-triphosphate) 또는 캡사이신인 것을 특징으로 하는, 프로스타좀 분비 조절용 시약 조성물.
제3항에 있어서, 상기 프로스타좀 분비 조절은 프로스타좀의 분비가 촉진되는 것인, 프로스타좀 분비 조절용 시약 조성물.
시험관 내에서 (in vitro) 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 전립선 세포에 처리하는 단계를 포함하는 프로스타좀 분비 조절 방법.
삭제
삭제
시험관 내에서 (in vitro) 후보물질을 전립선 세포에 처리하는 단계;
상기 전립선 세포 내 칼슘 농도를 측정하는 단계; 및
상기 칼슘 농도 측정 결과 전립선 세포 내 칼슘 농도가 후보물질 처리 전보다 증가한 경우, 상기 후보물질은 프로스타좀 분비 증진물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 프로스타좀 분비 증진물질의 스크리닝 방법.
삭제