KR102295725B1

KR102295725B1 - 고구마를 주성분으로 하는 간 보호용 식사대용식 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102295725B1
Application number: KR1020190089878A
Authority: KR
Inventors: 장정수; 박혜정; 이송민; 김지윤; 김희숙; 김점두리; 이문현
Original assignee: 이문현; 이광희; 주식회사 엔젤
Priority date: 2019-07-24
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2021-09-01
Also published as: KR20210013424A

Abstract

본 발명은 고구마 및 당근을 포함하는 채소류; 및 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩을 포함하는 씨앗류;를 유효성분으로 포함하는, 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 식품 조성물에 관한 것으로, 상기 식품 조성물의 용매분획물은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 그리고 환원력 등에서 높은 항산화능을 나타내고, CCl₄또는 H₂O₂로 유도되는 간 세포 독성으로부터 높은 보호 효과를 나타내므로 간 보호용 식사 대용식품으로 활용 가능하다.

Description

고구마를 주성분으로 하는 간 보호용 식사대용식 및 이의 제조방법{Meal substitute for liver protection based on sweet potato and a method for manufacturing the same}

본 발명은 뿌리채소인 고구마와 당근에 4가지 씨앗들을 혼합하여 제조한 고구마를 주성분으로 하는 간 보호용 식사 대용식품 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

현대인의 라이프 스타일은 여성의 사회 진출과 그에 따른 외식 문화 확산, 저출산 및 1인 가구의 증가 등으로 빠르게 변하고 있다. 라이프 스타일이 바뀌게 됨에 따라 식품의 소비행태 또한 편의성과 간편성의 요구가 늘어나면서 많은 변화가 생겨나고 있다. 그뿐만 아니라 전세계적으로 노인인구가 급속하게 증가되면서 고령자의 신체 및 생리적 특성을 고려한 식단의 개발이 요구되고 있다. 고령자 특유의 문제는 노화의 진행에 따른 소화 및 흡수기능의 저하, 나이가 들어감에 따른 치아의 결손과 연하에 관련된 근력 및 반사 능력 저하 등의 문제가 있다. 구강건강상태와 음식저작상태가 나빠지면서 저작이 불편한 노인들은 씹기 편한 음식을 주로 섭취하여 식단이 단순해지며, 딱딱하거나 질긴 과일과 채소의 섭취가 떨어져 비타민과 무기질과 같은 영양소섭취 부족 등의 문제에 따른 저영양상태가 가장 심각한 문제로 지적되고 있다(Walls and Steele, 2004). 따라서 바쁜 현대인들과 고령자 모두가 간편하게 즐길 수 있는 식사대용식(Home meal replacement, HMR)의 개발이 요구된다.

또한 현대사회는 음주, 흡연 그리고 환경오염으로 증가된 독성물질의 노출 등에 의해 다양한 간질환 발병률이 증가되고 있으며 이는 세계적인 문제로 대두되고 있다(Marcellin and Kutala, 2018). 간은 체내에서 주요 영양소의 대사, 에너지 관리, 호르몬 분해와 대사, 해독작용 그리고 면역 및 살균작용 등의 중요한 역할을 담당하고 있다. 이러한 간질환에 대하여 다양한 천연물 유래의 치료약이 개발되고 있으며, 실리마린(silymarin), 안드로그라폴라이드(andrographolide) 그리고 글리시리진(glycyrrhizin)과 같은 약초로 만든 약이 간 보호제로써 사용되고 있다(Kashaw et al., 2011). 일반적으로 간 손상 치료 또는 보호 약물을 개발할 목적으로 사염화탄소(CCl₄), 디-갈락토사민(D-galactosamine) 등 화학물질을 처리하여 간손상을 유도한 실험 모델을 활용하고 있다. 특히 CCl₄는 간의 마이크로솜(liver microsome)에서 cytochrome P₄₅₀(CYP2E1) 매개된 CCl₄ 메타볼리즘(metabolism)에 의해 생성되는 trichloromethyl radical (CCl₃·)와 그것의 파생물(derivative)인 trichloromethylperoxy radical (CCl₃OO·)를 포함하는 활성형 중간체(reactive intermediates)가 생성되면서 활성화 된다(Dai et al., 2014). 생성된 자유 라디칼은 인근 지질막을 공격하여 지질의 과산화를 일으키거나, 세포내의 단백질이나 지질 등의 거대분자(macromolecules)와 결합하여, 간의 괴사, 지방 침윤(fatty infiltration), 미세소체 효소(microsomal enzyme) 활성저하 등의 간 독성을 나타내고, 알라닌 아미노기전달효소(alanine aminotransferase, ALT), 아스파테이트 아미노기전달효소(aspartate aminotransferase, AST), 알칼리성 인산 분해 효소(alkaline phosphatase, ALP), 그리고 락트산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase, LDH)와 같은 세포액효소(cytosolic enzyme)를 혈장(serum)으로 방출하여 결과적으로 세포를 죽이는 등과 같은 조직의 항산화 상태를 바꿀 수 있다(Shen et al., 2015). 또한 CCl₄로 유도되는 독성의 눈에 띄는 특징은 환자의 지방간 조직(steatotic liver tissue)과 유사하게 간에 급격한 트리글리세리드(triglyceride) 축적이 발생하는 것이다(Dai et al., 2014). 한편 이러한 활성산소에 대하여 생체 조직은 슈퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase), 글루타티온 S-전달효소(glutathione S-transferase), 카탈라아제(catalase) 등과 같은 체내방어기전과 식품류에 많은 비타민 A, C, E 그리고 플라보노이드계 색소를 포함한 폴리페놀류 등의 생리활성 물질들을 활용하여 조직손상을 방어한다. 따라서 체내 활성산소종의 제거는 간 질환을 치료하고 예방하는데 있어 매우 중요한 역할을 한다.

고구마(Ipomoea batatas L.)는 밀, 쌀 그리고 옥수수 등과 같이 세계 주요 작물로 잘 알려져 있으며, 다른 작물에 비해 척박한 땅에서도 잘 자라며 재배가 용이하고, 단위면적당 수확량이 많고 수분을 제외한 대부분은 전분으로 이루어져 쌀, 보리 등의 곡류와 함께 주요 식량자원으로 이용되어 왔다. 또한 고구마는 식이섬유와 칼슘, 철 등의 무기질, 비타민 C 및 베타카로틴(β-carotene)을 풍부하게 함유하고 있으며 높은 영양적 가치로 인해 예로부터 식사 대용으로도 많이 섭취되고 있다(Tan, 2015). 고구마를 육질색에 의해 구분할 경우 흰색인 일반고구마와 자색 및 주황색 등을 띄는 유색 고구마로 나눌 수 있으며, 베타카로틴(β-carotene)은 흰색 혹은 크림색을 띄는 일반 고구마 보다 노란색 혹은 주황색 고구마에 풍부한 것으로 알려져 있다(Mitra, 2012). 특히 주황색 고구마(Orange-flesh sweet potato)는 작은 뿌리(100-125 g) 하나만으로도 5살 이하 어린이의 1일 권장량 이상의 비타민 A를 제공할 수 있을 정도로 풍부한 베타카로틴(β-carotene)을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다(Bonsi et al., 2014). 이러한 이유로 식량 자원이 풍부하지 못한 아프리카 지역에서는 주황색 고구마를 이유식 개발에 활용하는 등 주식 혹은 보조 식량으로 활용하고 있다(Bonsi et al., 2014).

당근은 풍부한 식이섬유와 인체의 영양원으로 중요한 카로틴을 많이 함유하고 있다. 카로틴은 비타민 A의 전구체로서 항암작용, 성인병 예방 등의 기능을 가지고 있다고 알려져 있다. 카로틴은 당근의 색깔과 영양을 결정하는 주요물질로 체내에 흡수되었을 때 약 30%가 비타민 A로 전환된다. 종래 당근은 샐러드, 생식, 라면스프 등으로 많이 이용되었으나, 최근에는 주스 원료로 활용이 크게 증가하고 있는 실정이다. 특히, 식생활의 다양한 변화와 함께 바쁜 생활 속에서 야채 생즙으로 제품화된 것을 섭취하는 경우가 늘고 있으므로 이에 따른 생즙의 재료로 그 수요가 빠르게 증가하고 있다.

달맞이꽃은 바늘꽃과(Onagraceae) 식물로, 원산지는 남미 칠레 원산으로 우리나라 전역에 귀화하여 자라는 여러해살이 풀이다. 키는 사람허리 정도의 높이(약 150 cm 정도)이고, 줄기는 곧게 서며, 잎은 어긋난다. 꽃은 노란색이며, 잎겨드랑이에 한송이씩 붙고, 저녁때 피었다가 아침에는 조금 붉은빛을 띠며 진다. 달맞이꽃씨앗(evening primrose seeds)은 필수 지방산이 풍부하며. 콜레스테롤을 저하시키는 효과가 있으며 피의 흐름을 도와 준다고 알려져 있으며, 특히 달맞이꽃씨유에 함유된 필수지방산인 오메가-6는 대표적으로 여성건강에 좋으며 혈행개선에 효과가 있고, 임신 중의 고혈압을 예방하기도 하며, 각종 피부질환에도 효과가 있다고 알려져있다(Jaocs., Vol.61, March 1984).

율무(Coix lachryma-jobi L.)는 화본과(禾本科)에 속하는 1년초로서 열대, 아열대, 온대남부에서 재배된다. 율무는 다른 곡류에 비하여 고단백 및 고지방의 곡류이고 전분의 대부분이 아밀로펙틴(amylopectin)으로 되어 있으며 섬유소뿐만 아니라 Ca, Fe, Vit B1, Vit B2 등이 풍부하게 함유되어 있어 건강식품으로 각광받고 있다. 또한 혈장 콜레스테롤 및 중성지방 함량을 저하시키고 조직과 혈장 간의 콜레스테롤 재분배를 담당하는 HDL-콜레스테롤 함량을 증가시켜 전체적인 지질대사에 관여한다. 율무의 약리적인 효능으로는 자양강장제, 이뇨제, 건위제, 진통제, 소염제 및 폐결핵, 관절통 등에도 효력이 있다고 알려져 있다.

귀리(Oat)는 중앙아시아 아르메니아 지방을 원산지로 둔 벼목 화본과의 두해살이풀로 오트밀의 원료로서 쌀보다 2배 많은 단백질을 함유하였으며, 지방질과 섬유소는 현미보다도 많아 섭취시 소화가 쉽다. 또한, 다당류의 일종인 베타글루칸(β-glucan)이라는 성분이 다량 함유되어 있어 혈당과 혈액 속의 콜레스테롤 수치를 낮춰 동맥경화와 같은 심혈관계 질환 예방에도 도움을 주는 것은 물론 지질대사를 개선하여 체지방 축적을 막아준다(대한민국 공개특허 제 10-2019-0075291호).

땅콩은 식물성 오일과 단백질 자원으로 매우 중요한 유지 작물이며, 직접 식용이나 버터, 마가린, 식용유 등 다양한 방법으로 이용되고 있다(Lee et al., 2004). 땅콩은 천연 폴리페놀 화합물인 레스베라트롤이 다량 함유되어 있다고 알려져 있으며, 땅콩 새싹은 기능성 영양성분이 풍부하고 수분함량이 높고 식미가 우수하며 식품소재로서의 이용 범위가 넓은 장점을 지니고 있다. 이러한 땅콩 새싹은 암, 당뇨, 심장병 예방, 항산화 작용, 염증 억제, 노화 방지, 동맥경화, 혈중 콜레스테롤 저하 및 기억력 증진 등의 효능과 효과가 잘 알려져 있으며 특히 레스베라트롤은 적포도, 땅콩, 오디 등에 함유되어 다양한 약리효과들이 보고되고 있다.

본 발명자들은 고령자들뿐만 아니라 바쁜 현대인들 또한 간편하게 즐길 수 있고, 현대사회의 대표적인 만성질환의 원인인 간 손상을 고려해 간 건강상태 유지, 질병 예방 및 치료를 돕도록 고안된 기능성 대용식을 개발하고자 예의 노력을 기울인 결과, 식사대용으로 많이 섭취되는 고구마와 녹즙의 혼합재료로써 널리 이용되는 당근을 다양한 영양소와 기능성을 갖춘 4가지 씨앗들과 혼합하여 고구마가 첨가된 씨앗주스 대용식(Meal replacement seeds juice based on sweet potato, MRSJ)을 제조하였으며, 기능성 대용식으로써의 개발 가능성을 평가하여 바쁘고 고령화된 현대 사회에 새로운 식품형태로의 섭취를 제안하고자 하였다.

본 발명의 목적은 고구마 및 당근을 포함하는 채소류; 및 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩을 포함하는 씨앗류; 를 유효성분으로 포함하는, 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 식품 조성물을 포함하는 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 식품 조성물을 포함하는 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 식사대용식을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고구마 및 당근을 포함하는 채소류; 및 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩을 포함하는 씨앗류; 를 유효성분으로 포함하는, 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식품 조성물을 포함하는 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식품 조성물을 포함하는 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 식사대용식을 제공한다.

본 발명은 고구마 및 당근을 포함하는 채소류에 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩을 포함하는 씨앗류를 혼합하여 제조한 간세포 보호용 식품 조성물에 관한 것으로, 상기 식품 조성물의 용매분획물은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 그리고 환원력 등에서 높은 항산화능을 나타내고, CCl₄또는 H₂O₂로 유도되는 간 세포 독성으로부터 높은 보호 효과를 나타내므로 간 보호용 식사 대용식품으로 활용 가능하다.

도 1은 고구마를 주성분으로 함유하는 씨앗주스 대용식(Meal replacement seeds juice based on sweet potato, MRSJ)의 아밀라아제와 프로테아제 활성을 나타낸 도이다:
A: 전체 채소, 전체 종자 및 MRSJ의 아밀라아제 활성; 및
B: 전체 채소, 전체 종자 및 MRSJ의 프로테아제 활성.
도 2는 착즙 전후에 따른 소화 효소의 탄수화물 및 단백질 분해 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다(SP: 고구마, AE: α- 아밀라아제, CR: 당근):
A 및 B: 고구마, 당근 및 MRSJ의 α-아밀라아제 활성; 및
C 및 D: 고구마, 당근 및 MRSJ의 프로테아제 활성
(***:p<0.001, **:p<0.01)
도 3은 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물의 CCl₄및 H₂O₂로 유도된 HepG2 세포 손상에 대한 세포 보호 효과를 나타낸 도이다.
A: HepG2 세포에 20 mM CCl₄를 처리한 결과;
B: HepG2 세포에 30 mM CCl₄를 처리한 결과; 및
C: HepG2 세포에 10 mM H₂O₂를 처리한 결과
도 4는 ALT(A) 및 AST(B) 활성 조사를 통해 에틸 아세테이트 분획물의 세포 보호 효과를 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 CCl₄에 의해 손상을 입은 HepG2 세포의 DNA를 DNA 래더 분석(ladder assay)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 펜톤 반응(Fenton reaction)을 이용하여 DNA에 하이드록시 라디칼(hydroxyl radical)를 노출시킨 후, MRSJ 에틸 아세테이트 분획물의 DNA 보호 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 HepG2 세포에 CCl₄처리군,CCl₄과 실리비닌(silibinin) 처리군,CCl₄과 MRSJ 에틸아세테이트분획물 처리군을 Oil Red O 염색 용액으로 염색한 후 현미경으로 지방 축적 정도를 비교하여 관찰한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고구마 및 당근을 포함하는 채소류; 및 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩을 포함하는 씨앗류; 를 유효성분으로 포함하는, 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 식품 조성물을 제공한다.

상기 채소 및 씨앗은 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한없이 사용할 수 있다.

상기 채소류와 씨앗류의 중량비는 6 내지 10:2(w/w)인 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 채소류와 씨앗류의 중량비는 7 내지 9:2(w/w)인 것일 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 채소류와 씨앗류의 중량비는 8:2(w/w)인 것일 수 있다.

상기 산화스트레스는 CCl₄또는 H₂O₂로 유도된 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 고구마를 주성분으로 함유하는 씨앗주스 대용식(Meal replacement seeds juice based on sweet potato, MRSJ)의 일반성분 함량 분석을 수행하였으며, 그 결과, 수분이 가장 많은 함량을 차지하고, 다음으로 탄수화물, 조지방 그리고 조단백 순으로 나타났다(표 1 참조).

고구마를 주성분으로 함유하는 씨앗주스 대용식(Meal replacement seeds juice based on sweet potato, MRSJ)의 무기성분 함량 분석을 수행하였으며, 그 결과, 칼륨 (328.23 mg/100 g)과 인 (123.42 mg/100 g)이 가장 풍부하게 존재하였으며, 다음으로 마그네슘, 칼슘 순으로 나타났다. 마그네슘 또한 MRSJ 500 mL 섭취시 성인 남성의 1일 권장섭취량(350 mg/일)과 유사한 313.60 mg을 얻을 수 있는 것으로 나타났으며, 셀레늄이 풍부한 씨앗류와 함께 착즙되면서 8.0 μg/100 g으로 약 3.48배 증가된 것을 확인하였다(표 2 참조).

고구마를 주성분으로 함유하는 씨앗주스 대용식(Meal replacement seeds juice based on sweet potato, MRSJ)의 비타민 분석을 수행하였으며 그 결과, 비타민 E와 베타카로틴(β-carotene)이 각각 4.49 mg/100 g, 3.78 mg/100 g 으로 MRSJ에 가장 풍부하게 함유되어 있었다. 특히 비타민 E의 경우 고구마에는 약 1.01 mg/100 g이 함유되어 있으나 비타민 E가 풍부한 귀리와 달맞이꽃씨와 같은 유지종실류가 함께 첨가됨으로써 4.49 mg/100 g으로 약 4.45배 증가되었으며, 이는 MRSJ 300 mL 섭취만으로도 성인 남성 기준 1일 충분 섭취량인 12 mg α-TE/일을 충족시키는 함량이다. 이러한 유용 미네랄과 비타민 함량 증가는 MRSJ 섭취에 따른 우수한 항산화 활성 및 생리활성을 나타낼 수 있음을 시사한다.

고구마를 주성분으로 함유하는 씨앗주스 대용식(Meal replacement seeds juice based on sweet potato, MRSJ)의 지방산 조성 분석을 수행하였으며 그 결과, 불포화지방산이 풍부하게 함유되어 있으며 혈중 지방질 수준과 콜레스테롤을 낮추는 것으로 알려진 올레산(oleic acid)과 리놀레산(linoleic acid)이 1.52 mg/100 g, 1.54 mg/100 g으로 전체 지방산의 36.67% 및 37.08%를 차지하는 것을 확인하였다.

고구마를 주성분으로 함유하는 씨앗주스 대용식(Meal replacement seeds juice based on sweet potato, MRSJ)의 알파 아밀라아제 활성을 분석하였으며 그 결과, 고구마의 경우 양성 대조군으로 순수 아밀라아제 효소(pure amylase enzyme from Aspergillus, Sigma-Aldrich, Co., USA) 10 μg/mL 농도와 유사한 전분 분해력을 보였으며, 귀리는 순수 아밀라아제 효소(pure amylase enzyme) 5 μg/mL와 유사한 전분 분해력을 보였다. MRSJ는 순수 아밀라아제 효소(pure amylase enzyme from Bacillus sp., Sigma-Aldrich, Co., USA) 10 μg/mL 농도와 유사한 높은 전분 분해력을 보였다(도 1A 참조). 단백질을 가수분해하는 프로테아제 활성의 경우 31.28 unit/g으로 높은 소화 효소 활성이 확인되었다. 또한 고구마, 당근, 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩을 단독으로 skim milk agar plate에 올려 단백질 분해 활성을 측정한 결과, 율무에서 순수 프로테아제 효소(pure protease enzyme) 100 μg/mL 농도보다도 높은 단백질 분해 활성을 보였다. MRSJ 또한 율무와 비슷한 수준의 단백질 분해 활성을 보였다(도 1B 참조). 이는 재료간의 시너지 효과로 인해 단독 재료보다 복합 재료일 때 더 높은 전분 분해력을 보임을 시사한다.

고구마를 주성분으로 함유하는 씨앗주스 대용식(Meal replacement seeds juice based on sweet potato, MRSJ)의 착즙에 의한 소화기능 개선 효과 확인을 위하여 알파 아밀라아제와 프로테아제 활성을 분석하였으며 그 결과, 착즙하지 않은 고구마 조각 1 g에 아밀라아제를 처리하는 경우 고구마로부터 유리된 단당류의 양은 5.18 mg으로 상대적으로 전분 분해가 저조하게 나타났으나, 고구마를 착즙한 주스에 아밀라아제를 처리한 경우 유리된 단당류의 양은 29.67 mg으로 5.73배 많은 양의 단당류가 생성된 것을 확인하였다. 이는 같은 농도의 아밀라아제를 처리했을 경우 착즙되지 않은 고구마 조각보다 착즙된 주스의 소화가 훨씬 용이한 것을 나타내는 결과이다. 당근의 경우 착즙하지 않은 조각 1 g에 아밀라아제를 처리한 경우 분쇄되지 않은 당근의 소화는 거의 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면 당근 주스에 아밀라아제를 처리하는 경우 12.54 mg의 단당류가 유리되었으며 이는 아밀라아제의 가수분해 작용이 착즙액 상태에서 더 용이한 것을 나타낸다(도 2 A). 고구마와 당근조각을 각각 0.5 g씩 넣어 총량을 1 g으로 맞춘 후 아밀라아제를 처리한 결과, 유리된 단당류는 8.45 mg이었으나, 이를 주스상태로 만들면 아밀라아제에 의해 생성되는 단당류는 25.58 mg으로 3.03배 높은 활성을 보였다. 여기에 4종 씨앗이 함께 첨가되는 경우 아밀라아제에 의해 생성된 유리 단당류는 7.05 mg으로 나타났으며 씨앗이 첨가되는 경우 소화 효소의 소화 작용이 다소 떨어지는 것을 확인할 수 있으나 효소를 첨가하지 않아도 MRSJ 자체에 유리된 단당류 양이 상당히 높아 섭취시 그 자체로 흡수가 용이하다(도 2 B). 고구마와 당근 모두 조각 1 g에 프로테아제를 처리할 경우 단백질이 거의 분해되지 않는 것을 확인할 수 있다. 하지만 주스 상태에서 프로테아제를 처리하는 경우 유리된 아미노산은 고구마가 27.59 mg, 당근은 19.58 mg로 나타나면서 주스에 효소를 처리하는 경우 효소 작용이 활성화되는 것을 확인할 수 있다. 그뿐만 아니라 고구마와 당근 조각에서는 프로테아제가 가수분해 작용을 하지 못했으나, 고구마와 당근이 혼합된 주스에서는 8.44 mg의 유리된 아미노산이 생성되면서 단백질이 분해된 것을 확인할 수 있다. 또한 4종의 씨앗이 함께 착즙된 MRSJ에서도 43.73 mg의 아미노산이 유리되어 나오면서, 효소 작용이 활발하게 나타나는 것을 확인할 수 있다(도 2 C 및 D). 이러한 결과는 통채소와 통곡물의 섭취 보다는 분쇄와 착즙 과정을 거친 주스의 소화가 훨씬 용이한 것을 나타내는 지표이다. 따라서 MRSJ는 저작 작용과 소화 기능이 떨어지는 노인들 또한 부담 없이 섭취 할 수 있는 대용식으로 개발될 수 있다.

상기 유효성분은 고구마, 당근, 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩의 추출물인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 추출물은 물, 메탄올 또는 에탄올 용매로 추출되는 것이 바람직하며, 메탄올로 추출되는 것이 더욱 바람직하다.

상기 유효성분은 고구마, 당근, 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩 추출물의 분획물인 것일 수 있다.

상기 분획물은, 상기 추출물을 에틸아세테이트 또는 부탄올 용매로 분획한 분획물인 것일 수 있고, 에틸아세테이트 용매로 분획되는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명자들은 본 발명의 고구마를 주성분으로 함유하는 씨앗주스 대용식(Meal replacement seeds juice based on sweet potato, MRSJ)의 기능성을 평가하기 위하여 MRSJ 메탄올 추출물을 제조하고, 헥산(Hexane), 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol) 및 물의 5가지 용매를 이용하여 각각의 MRSJ 메탄올 추출물의 분획물을 얻었다.

상기 MRSJ 메탄올 추출물과 이의 용매분획물들의 총 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량을 분석하였으며, 그 결과, MRSJ 메탄올 추출물에는 7.10 mg/g의 폴리페놀이 함유되어 있는 것으로 나타났으며, 메탄올 추출물의 6가지 용매 분획물 중에서는 에틸 아세테이트 분획물이 180.01 mg/g으로 매우 높은 폴리페놀을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 다음으로 부탄올, 헥산, 디클로로메탄 그리고 물 순으로 나타났으나 에틸 아세테이트 분획물에 비해 낮은 함량을 보였다. 또한 MRSJ 메탄올 추출물과 각 분획물의 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과, MRSJ 메탄올 추출물의 경우 2.15 mg/g의 플라보노이드가 함유되어 있었으며, 에틸 아세테이트 분획물은 28.19 mg/g으로 다른 분획물에 비해 높은 플라보노이드를 함유하고 있는 것으로 확인되었다(표 5 참조).

MRSJ 메탄올 추출물과 이의 용매분획물들의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성을 분석하였으며, 그 결과, 에틸 아세테이트 분획물의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 IC₅₀ value는 0.09 mg/mL로, 이는 양성 대조군으로 사용된 L-아스코르브산 (IC₅₀ value=0.02 mg/mL)에 비해 크게 떨어지지 않는 결과를 보였다. 하지만 ABTS 라디칼 소거능에서는 L-아스코르브산의 IC₅₀ value가 0.05 mg/mL인 것에 비해 에틸 아세테이트 분획물이 0.34 mg/mL로 나타나, L-아스코르브산의 라디칼 소거능에 비해 다소 떨어지는 것을 확인하였다. 하지만 다른 5가지 분획물에 비해서는 높은 라디칼 소거능을 보였으며 이는 에틸 아세테이트 층에 다량 함유된 폴리페놀 및 기타 유용성분들 때문인 것으로 판단된다. 또한 디클로로메탄과 물 분획물을 제외하고는 모두 MRSJ 메탄올 추출물 보다 높은 라디칼 소거능을 보이는 것을 확인하였으며, 이는 MRSJ의 항산화 활성을 나타내는 폴리페놀을 포함하는 대부분의 유효성분들이 에틸 아세테이트, 부탄올 그리고 헥산분획물에 존재하는 것을 시사한다(표 6).

MRSJ 메탄올 추출물과 이의 용매분획물의 환원력을 측정하기 위하여 FRAP assay를 수행하였으며, 그 결과, 양성 대조군으로 사용된 L-아스코르브산의 경우 1.24 mM/g의 높은 환원력을 보였으며, 에틸 아세테이트 분획물도 1.13 mM/g으로 양성대조군과 거의 유사한 환원력을 갖는 것을 확인하였다. 라디칼 소거능과 마찬가지로 디클로로메탄 및 물 분획물은 MRSJ 메탄올 추출물 보다 낮은 환원력을 보였다(표 7 참조). 이러한 결과는 고구마가 높은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능, 지질과산화 저해활성 및 환원력을 나타낸다는 연구결과와도 일치하며, 다른 식품군과의 혼합 착즙으로 인해 보다 높은 활성을 보인 것을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 MRSJ의 간 보호 기능을 조사하기 위해, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물을 이용하여 간세포 보호 효과를 조사한 결과, 20 mM CCl₄를 HepG2 cell에 처리할 경우 도 3 A에 나타낸 것과 같이 처리 후 2시간부터 점차 세포 독성이 나타나다가 8시간 이후로는 급격한 세포사멸이 일어나는 것을 확인 할 수 있다. 양성 대조군으로는 천연물 유래의 간보호제로 사용되고 있는 실리비닌(silybinin)을 사용하였으며, 실리비닌 처리군은 6시간 까지 CCl₄에 의한 세포 독성이 나타나지 않았다. CCl₄ 처리 후 8시간이 경과했을 때 대조군의 세포 생존율이 12.96%인 것에 비해 실리비닌 처리군은 39.9%의 세포 생존율을 보이며 비교적 높은 세포 보호 효과를 보였다. MRSJ의 경우 에틸 아세테이트 분획물 또한 6시간 까지 CCl₄로부터 세포 독성이 나타나지 않아, 세포 보호 효과가 관찰되었으며 CCl₄ 처리 8시간에도 세포 생존율이 47.27%로 실리비닌 처리군 보다 높은 보호 효과를 보였다. 반면 부탄올 처리군은 대조군과 마찬가지로 CCl₄ 처리 2시간만에 독성이 나타나기 시작했으나, 8시간대에도 급격한 독성은 관찰되지 않은 것으로 보아 세포 보호 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이러한 세포 보호 효과는 CCl₄의 농도를 30 mM로 높여 HepGe2 cells에 처리하여도 유사하게 나타났다.

H₂O₂로 유도된 HepG2 세포 손상에 대한 MRSJ 에틸 아세테이트 분획물의 세포 보호 효과를 조사한 결과, 8시간 이상 10 mM H₂O₂를 처리하게되면, 대부분의 세포가 사멸하여 극히 낮은 세포 생존율을 보이는데 비해, 에틸 아세테이트 처리군은 10시간 이후에도 69.90%의 세포 생존율을 보이면서 높은 세포 보호효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 3 참조).

MRSJ 분획물 중에서 CCl₄ 및 H₂O₂로부터 가장 높은 세포보호 효과를 보였던 ethyl acetate 분획물의 간 세포 보호 효과를 평가하기 위해 CCl₄로 유도된 HepG2 cells의 apoptosis 및 지질 축적에 관한 저해 활성을 조사한 결과, CCl₄처리에 의해 HepG2 cells 배양액 내에 존재하는 ALT와 AST 활성을 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였으며, 양성 대조군인 실리비닌과 에틸 아세테이트 처리에 따라 세포 배양액 내의 ALT 및 AST 활성이 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 4 C 및 D 참조). 또한, CCl₄에 의해 손상을 입은 HepG2 cell의 DNA는 CCl₄를 처리하지 않은 대조군에 비해 DNA ladder 현상이 뚜렷하게 나타났으며, 에틸 아세테이트 분획물 처리군은 농도가 증가함에 따라 DNA ladder 현상이 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 5 참조).

펜톤 반응(Fenton's reaction)을 통해 생성된 하이드록시 라디칼(hydroxyl radical)에 의한 DNA 산화반응을 확인한 결과, DNA의 산화적 손상으로 인해 대부분의 DNA가 분해(degradation)되는 것이 관찰되었으며, MRSJ 에틸 아세테이트 분획물을 처리하는 경우 높은 DNA 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 6 참조).

또한, 본 발명은 상기 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 주스 형태인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 건강기능식품은 상기 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 식품 조성물을 포함하되, 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제, 액제 제형 등으로 제형화된 것일 수도 있다. 이들은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 제형화될 수 있다.

본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제(치즈, 초콜렛 등), 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 산화스트레스로부터의 간세포 보호용 식품 조성물을 포함하는 식사대용식을 제공한다. 이때, 상기 식품 조성물의 조성비는 일 측면에서 고구마 40%(w/w), 당근 40%(w/w), 달맞이꽃씨 5%(w/w), 율무 5%(w/w), 귀리 5%(w/w), 땅콩 5%(w/w)일 수 있다.

이하, 본 발명은 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 고구마를 주성분으로 하는 씨앗주스 대용식(MRSJ)의 제조

채소류인 호박 고구마, 당근과 씨앗류인 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩은 지역 농산물 시장(부산, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다. 구입한 채소와 씨앗류는 깨끗이 세척하여 82 rpm의 저속 녹즙기(Angelia 8000, Angel Co., 부산, 대한민국)로 착즙하였다. 채소류와 씨앗류는 8:2의 비율로 혼합하여 착즙되었으며, 5배의 증류수를 이용하여 2시간 동안 상온에서 추출하여 실험에 사용하였다.

<실험예 1> MRSJ의 영양성분의 분석

<1-1> MRSJ의 일반성분의 분석

상기 <실시예 1>에서 제조한 MRSJ의 일반성분 분석은 대한식품공전(Korean Food Standards Codex)의 방법에 따라서 분석하였다. 구체적으로, 수분함량은 105°C 상압가열건조법, 조단백질 함량은 자동질소 정량분석기(Kjeltec Auto 2300, Foss, Hilleroed, Denmark)를 이용한 마이크로켈달(micro-Kjeldahl)법, 조지방 함량은 산분해법, 조회분 함량은 직접회화법으로 각각 분석하였다.

구성		단위	MRSJ
일반성분	Carbohydrate	g/100 g	20.26±0.05
	Crude protein	g/100 g	3.96±0.01
	Crude lipid	g/100 g	4.58±0.01
	Crude ash	%	0.95±0.02
	Moisture	%	70.24±0.03
	Calorie	kcal/100 g	138.16±0.02

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 수분이 가장 많은 함량을 차지하고, 다음으로 탄수화물, 조지방 그리고 조단백 순으로 나타났다.

<1-2> MRSJ의 무기질 함량 분석

무기질 함량은 대한식품공전의 방법에 따라 MRSJ 1 g과 HNO₃용액 10 mL를 혼합하여 마이크로파(Multiwave 3000, Anton Paar Gmbh, Graz, Austria)로 190°C에서 35분간 온도를 높이면서 용매를 완전히 없앤 다음 방랭을 시킨 후 분석하였다. 무기질 분석은 ICP-OES (Optima 8300, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하였으며, 셀레늄의 분석은 ICP-MS (DRC-e, PerkinElmer, USA)를 이용한 분광분석법으로 분석하였다.

구성		단위	MRSJ
무기성분	Phosphorus	mg/100 g	123.42±0.76
	Magnesium	mg/100 g	62.72±0.41
	Calcium	mg/100 g	36.42±0.86
	Potassium	mg/100g	328.23±1.71
	Zinc	mg/100g	0.75±0.01
	Manganese	mg/100g	1.12±0.01
	Iron	mg/100g	1.15±0.02
	Sodium	mg/100g	32.69±1.63
	Copper	mg/100g	0.43±0.04
	Selenium	mg/kg	0.08±0.02

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 칼륨 (328.23 mg/100 g)과 인 (123.42 mg/100 g)이 가장 풍부하게 존재하였으며, 다음으로 마그네슘, 칼슘 순으로 나타났다. 이러한 결과는 고구마에 칼륨이 가장 풍부하게 존재하고, 다음으로 인, 칼슘 그리고 마그네슘이 풍부하게 존재한다고 나타낸 (Tan, 2015)과 (Bovell-Benjamin, 2007)의 연구 결과와도 유사하게 나타났다. MRSJ를 하루에 500 mL 섭취할 경우 인 617.10 mg 을 주스로부터 얻을 수 있으며 이는 성인 남성(19-29)의 1일 권장섭취량 700 mg/일과 비슷한 수준인 것으로 확인되었다. 그뿐만 아니라 마그네슘 또한 MRSJ 500 mL 섭취시 성인 남성의 1일 권장섭취량(350 mg/일)과 유사한 313.60 mg을 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 착즙 과정을 통해 불용성 찌꺼기를 제거하는 과정을 거쳤음에도 불구하고 고구마에 있는 미네랄들의 함량은 크게 감소되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 그뿐만 아니라 항산화 효소인 글루타티온 과산화효소의 성분으로 작용하고, 유리 라디칼의 작용을 억제하는 강한 항산화 작용을 통해 세포의 산화적 손상을 보호하며, 암, 심장질환, 면역질환, 염증질환에 효능을 나타내는 것으로 알려진 셀레늄(Burk, 2002; Kieliszek and Blazejak, 2016)의 경우 고구마에 약 2.3 μg/100 g이 함유되어 있으나, 셀레늄이 풍부한 씨앗류와 함께 착즙되면서 8.0 μg/100 g으로 약 3.48배 증가된 것을 확인하였다. 이는 MRSJ를 500 mL 섭취시 성인 남성의 1일 권장섭취량인 60 μg/일 66.67%에 해당한다. 곡류와 같은 씨앗류는 육류 및 어류와 같은 동물성 식품군을 제외한 녹색 채소류, 뿌리 채소류 그리고 과일과 같은 식물성 식품군 중에서 셀레늄 함량이 가장 높은 것으로 알려져 있다. Slavin Joanne et al., (2001)은 통씨앗에 함유된 셀레늄과 비타민E가 식품내 존재하는 파이토케미컬(phytochemicals) 및 항산화제(antioxidants), 페놀류(phenols)와 시너지 효과를 나타내 다양한 질병으로부터 보호효과를 나타낼 수 있을 것이라고 보고했다. 따라서 씨앗류와의 복합 섭취는 뿌리 채소에는 부족한 셀레늄 같은 영양성분을 보충해 줄 수 있어, 보다 영양적 가치를 높일 수 있는 방법이 될 수 있다.

<1-3> MRSJ의 비타민 함량 분석

비타민 A는 MRSJ 0.1 mg에 에탄올 30 mL 및 10% pyrogallol-ethanol 1 mL를 혼합 후 KOH 용액 3 mL를 가해 95℃에서 30분간 비누화시켰다. 실온까지 냉각 한 후 분액깔때기를 이용하여 석유에테르로 물층과 분리를 한 뒤 석유에테르층을 취하여 무수황산나트륨을 가해 탈수하였다. 이후 40℃에서 감압농축하고, 감압건조물에 isopropyl alcohol 10 mL로 용해를 시킨 후, 여과(0.20 μm)하여 분석하였다. 또한, 비타민 E를 분석하기 위한 시료 전처리는 비타민 A를 분석하기 위한 시료 전처리와 동일하게 진행하였으나, 감압농축 후 최종 용매를 hexane 10 mL를 가해 용해시킨 후, 여과하여 분석하였다. 비타민 B군의 경우 MRSJ 1 g에 75 mM Ammonium formate 20 mL을 넣고 10분간 sonication한 후 1시간 동안 shaking을 거쳐 추출하였다. 추출액을 2,012 x g, 15분간 원심분리하여 상층액을 여과한 뒤 이동상(A:B = 9:1)으로 희석하여 시험용액으로 사용하였다. 비타민 분석은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, Agilent 1200, Agilent, USA)를 이용하여 분석하였다.

구성		단위	MRSJ
비타민	β-Carotene	mg/100 g	3.78±0.02
	Vitamin B1	mg/100 g	0.04±0.06
	Vitamin B2	mg/100 g	0.03±0.00
	Vitamin B3	mg/100 g	N.D.
	Vitamin B5	mg/100g	N.D.
	Vitamin B6	mg/100g	0.09±0.00
	Vitamin E	mg/100 g	4.49±0.06

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 비타민 E와 베타카로틴(β-carotene)이 각각 4.49 mg/100 g, 3.78 mg/100 g 으로 MRSJ에 가장 풍부하게 함유되어 있었다. 특히 비타민 E의 경우 고구마에는 약 1.01 mg/100 g이 함유되어 있으나 비타민 E가 풍부한 귀리와 달맞이꽃씨와 같은 씨앗이 함께 첨가됨으로써 4.49 mg/100 g으로 약 4.45배 증가되었으며, 이는 MRSJ 300 mL 섭취만으로도 성인 남성 기준 1일 충분 섭취량인 12 mg α-TE/1일을 충족시키는 함량이다. 이러한 유용 미네랄과 비타민 함량 증가는 MRSJ 섭취에 따른 우수한 항산화 활성 및 생리활성을 나타낼 수 있음을 시사한다.

<1-4> MRSJ의 지방산 조성 분석

지방산 분석은 대한식품공전의 방법에 따라 추출 및 정제를 하였고, 7% BF₃-methanol 용액 (Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA)을 사용하여 메틸화(methylation)시켜 이것을 가스크로마토그래피(Gas chromatography, GC-7890, Agilent Co., Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

구성		단위	MRSJ
지방산	Palmitoleic acid (C16:1)	g/100 g	0.005±0.01
	Oleic acid (C18:1)	g/100 g	1.523±1.52
	Linoleic acid (C18:2)	g/100 g	1.540±1.54
	Linolenic acid (C18:3n-3)	g/100 g	0.017±0.02
	Gadoleic acid (C20:1)	g/100 g	0.033±0.03
	Eicosadienoic acid (C20:2)	g/100 g	0.004±0.00
	Erucic acid (C22:1n-9)	g/100 g	0.002±0.00

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 MRSJ에는 불포화지방산이 풍부하게 함유되어 있으며 혈중 지방질 수준과 콜레스테롤을 낮추는 것으로 알려진 올레산(oleic acid)과 리놀레산(linoleic acid)이 1.52 mg/100 g, 1.54 mg/100 g으로 전체 지방산의 36.67% 및 37.08%를 차지하는 것을 확인하였다. 고구마와 당근에는 미량의 지방이 함유되어 있으나, 달맞이꽃씨의 지방(Evening primrose seed oil, EPO) 함량은 약 14%로, 필수 지방산(essential fatty acids, EFAs)인 리놀레산(linoleic acid)이 65%-75% 그리고 감마 리놀렌산(γ-linolenic acid, GLA)이 7%-10%를 차지한다(Stonemetz, 2008). 이러한 필수지방산은 정상적인 원활한 체내 기능을 위해 필수적이며, 내생적으로(endogenously) 생성되지 않기 때문에 반드시 식품을 통한 섭취가 요구되고 있다. 귀리 또한 다른 곡류에 비해 지방 함량이 높으며, 특히 팔미톨레인산(palmitoleic acid), 올레산(oleic acid) 및 리놀레산(linoleic acid) 등의 불포화 지방산을 풍부하게 함유하고 있다(Sangwan et al., 2014). 따라서 지방이 극히 적게 함유되어있는 고구마와 당근을 견과 종실류와 함께 착즙함으로써 에센셜 오일(essential oil) 함량이 증가되었다. 이러한 불포화지방산이 풍부한 MRSJ의 섭취는 혈장 콜레스테롤과 고혈압, 그리고 동맥경화증과 같은 콜레스테롤에 의한 질환을 예방하는데 효과적이다. 따라서 본 연구에서는 고구마 및 당근에 씨앗류를 함께 넣어 착즙함으로써 셀레늄, 비타민E 및 불포화 지방산을 포함하는 에센셜 오일(essential oil) 등이 보충되어 보다 풍부한 영양소 제공이 가능한 것을 확인하였다.

<실험예 2> MRSJ의 소화기능 개선 효과 확인

<2-1> 채소, 씨앗 및 MRSJ의 알파-아밀라아제 및 프로테아제 활성 확인

MRSJ의 알파 아밀라아제(α-amylase) 활성은 수정된 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법(Doehlert and Duke, 1983)을 이용하여 수행되었다. 효소활성의 1 unit은 분당 1 μmol의 maltose를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 프로테아제(protease) 활성은 카제인(casein)을 기질로 사용하여 측정되었다. 1 unit는 분당 1 μg의 L-tyrosine을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 통채소와 통씨앗 그리고 착즙 주스의 amylase 활성을 비교하기 위해, 1 % starch agar plate와 1% skim milk agar plate를 제조하여 각 시료의 물추출물을 paper disk에 가하여 37℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 아밀라아제 활성은 아이오딘 염색이 되지 않은 영역의 크기를 측정하여 평가하였다. 양성 대조군으로는 순수 아밀라아제 효소(pure amylase enzyme from Aspergillus, Sigma-Aldrich, Co., USA) 10, 5, 1 μg/mL를 사용하였다. 프로테아제 활성은 skim milk가 분해되어 투명하게 나타나는 영역의 크기를 측정하여 평가하였다. 양성 대조군으로는 순수 프로테아제 효소(Pure protease enzyme from Bacillus sp., Sigma-Aldrich, Co., USA) 100, 50, 10 μg/mL를 사용하였다.

그 결과 전분(starch)의 α-1,4-glycoside 결합을 가수분해함으로써 탄수화물의 소화에 관여하는 알파 아밀라아제(α-amylase)활성은 36.45unit/g로 나타났다. 고구마, 당근, 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩을 단독으로 starch agar plate에 올려 전분 분해 활성을 측정한 결과, 귀리와 고구마에서 전분 분해 활성을 보였다. 고구마의 경우 양성 대조군으로 순수 아밀라아제 효소(pure amylase enzyme) 10 μg/mL 농도와 유사한 전분 분해력을 보였으며, 귀리는 순수 아밀라아제 효소(pure amylase enzyme) 5 μg/mL와 유사한 전분 분해력을 보였다. MRSJ는 순수 아밀라아제 효소(pure amylase enzyme) 10 μg/mL 농도와 유사한 높은 전분 분해력을 보였다(도 1 A 참조).

단백질을 가수분해하는 프로테아제 활성의 경우 31.28 unit/g으로 높은 소화 효소 활성이 확인되었다. 또한 고구마, 당근, 달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩을 단독으로 skim milk agar plate에 올려 단백질 분해 활성을 측정한 결과, 율무에서 순수 프로테아제 효소(pure protease enzyme) 100μg/mL 농도보다도 높은 단백질 분해 활성을 보였다. MRSJ 또한 율무와 비슷한 수준의 단백질 분해 활성을 보였다(도 1 B 참조).

이는 재료간의 시너지 효과로 인해 단독 재료보다 복합 재료일 때 더 높은 전분 분해력을 보임을 시사한다.

<2-2> 착즙의 소화작용 개선 효과 확인

착즙주스의 소화작용 개선효과를 조사하기 위해, 소화효소(α-amylase and protease)를 통채소 조각, 통씨앗 그리고 주스 1 g에 각각 처리하였다. 소화 효소 활성은 <실험예 2-1>에 나타낸 DNS 방법과 카제인 방법을 통해 측정되었다.

도 2(A)에 나타낸 바와 같이, 착즙하지 않은 고구마 조각 1 g에 아밀라아제를 처리하는 경우 고구마로부터 유리된 단당류의 양은 5.18 mg으로 상대적으로 전분 분해가 저조하게 나타났으나, 고구마를 착즙한 주스에 아밀라아제를 처리한 경우 유리된 단당류의 양은 29.67 mg으로 5.73배 많은 양의 단당류가 생성된 것을 확인하였다. 이는 같은 농도의 아밀라아제를 처리했을 경우 착즙되지 않은 고구마 조각보다 착즙된 주스의 소화가 훨씬 용이한 것을 나타내는 결과이다. 당근의 경우 착즙하지 않은 조각 1 g에 아밀라아제를 처리한 경우 분쇄되지 않은 당근의 소화는 거의 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면 당근 주스에 아밀라아제를 처리하는 경우 12.54 mg의 단당류가 유리되었으며 이는 아밀라아제의 가수분해 작용이 착즙액 상태에서 더 용이한 것을 나타낸다(도 2 A). 고구마와 당근조각을 각각 0.5 g씩 넣어 총량을 1 g으로 맞춘 후 아밀라아제를 처리한 결과, 유리된 단당류는 8.45 mg이었으나, 이를 주스상태로 만들면 아밀라아제에 의해 생성되는 단당류는 25.58 mg으로 3.03배 높은 활성을 보였다. 여기에 4종 씨앗이 함께 첨가되는 경우 아밀라아제에 의해 생성된 유리 단당류는 7.05 mg으로 나타났으며 씨앗이 첨가되는 경우 소화 효소의 소화 작용이 다소 떨어지는 것을 확인할 수 있으나 효소를 첨가하지 않아도 MRSJ 자체에 유리된 단당류 양이 상당히 높아 섭취시 그 자체로 흡수가 용이하다(도 2 B).

다음으로 착즙에 의한 단백질 분해 작용 개선효과를 측정하였다. 그 결과 고구마와 당근 모두 조각 1 g에 프로테아제를 처리할 경우 단백질이 거의 분해되지 않는 것을 확인할 수 있다. 하지만 주스 상태에서 프로테아제를 처리하는 경우 유리된 아미노산은 고구마가 27.59 mg, 당근은 19.58 mg로 나타나면서 주스에 효소를 처리하는 경우 효소 작용이 활성화되는 것을 확인할 수 있다. 그뿐만 아니라 고구마와 당근 조각에서는 프로테아제가 가수분해 작용을 하지 못했으나, 고구마와 당근이 혼합된 주스에서는 8.44 mg의 유리된 아미노산이 생성되면서 단백질이 분해된 것을 확인할 수 있다. 또한 4종의 씨앗이 함께 착즙된 MRSJ에서도 43.73 mg의 아미노산이 유리되어 나오면서, 효소 작용이 활발하게 나타나는 것을 확인할 수 있다(도 2 C 및 D).

이러한 결과는 통채소와 통곡물의 섭취 보다는 분쇄와 착즙 과정을 거친 주스의 소화가 훨씬 용이한 것을 나타내는 지표이다. 따라서 MRSJ는 저작 작용과 소화 기능이 떨어지는 노인들 또한 부담 없이 섭취 할 수 있는 대용식으로 개발될 수 있다.

<실험예 3> MRSJ 용매분획물의 활성 확인

<3-1> MRSJ 메탄올 추출물과 이의 용매분획물 제조

MRSJ의 기능성을 평가하기 위해, MRSJ 메탄올 추출물의 용매분획을 진행하였다. MRSJ 메탄올 추출물 100g에 증류수 500mL와 헥산(Hexane) 500mL를 가하고 분액깔대기로 옮겨 추출과 정치과정을 3회 반복하였다. 헥산층만 취하고 남아있는 증류수에 디클로로메탄(dichloromethane)을 500mL 가하여 위의 과정을 반복하였다. 나머지 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)에 대해서도 동일한 과정을 반복하였으며 최종적으로 헥산, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물의 5가지 용매를 이용하여 각각의 분획물을 얻었다.

<3-2> MRSJ 메탄올 추출물과 이의 용매분획물의 총 폴리페놀 및 플로보노이드 함량 분석

상기 <실험예3-1>에서 제조한 MRSJ 메탄올 추출물과 이의 용매분획물의 총 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량을 분석하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. 총 폴리페놀 함량(TPC)과 총 플라보노이드 함량(TFC)은 (Folin and Denis, 1912)과 (Davis, 1947) 방법을 이용하여 측정하였다. 갈산(Gallic acid)과 나린진(Naringin)으로 동일하게 분석하여 작성한 검량선으로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였으며, 실험은 3회 반복 수행하여 평균값으로 표시하였다.

용매분획물	총페놀	총플라보노이드
MeOH extracts	7.10±0.13 mg GAE/g	2.15±0.41 mg NE/g
Hexane	8.06±0.18 mg GAE/g	8.40±0.72 mg NE/g
CH₂Cl₂	5.91±0.07 mg GAE/g	0.68±0.33 mg NE/g
EtOAc	180.01±9.08 mg GAE/g	28.19±1.43 mg NE/g
BuOH	15.64±0.70 mg GAE/g	7.86±0.40 mg NE/g
Water	5.28±0.04 mg GAE/g	0.81±0.01 mg NE/g

MRSJ 메탄올 추출물과 각 용매분획물의 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과 MRSJ 메탄올 추출물에는 7.10 mg/g의 폴리페놀이 함유되어 있는 것으로 나타났으며, 메탄올 추출물의 6가지 용매 분획물 중에서는 에틸 아세테이트 분획물이 180.01 mg/g으로 매우 높은 폴리페놀을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 다음으로 부탄올, 헥산, 디클로로메탄 그리고 물 순으로 나타났으나 에틸 아세테이트 분획물에 비해 낮은 함량을 보였다. 또한 MRSJ 메탄올 추출물과 각 분획물의 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과, MRSJ 메탄올 추출물의 경우 2.15 mg/g의 플라보노이드가 함유되어 있었으며, 에틸 아세테이트 분획물은 28.19 mg/g으로 다른 분획물에 비해 높은 플라보노이드를 함유하고 있는 것으로 확인되었다(표 5 참조).

<3-3> DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 및 ABTS 라디칼 소거능의 측정

상기 <실험예3-1>에서 제조한 MRSJ 메탄올 추출물과 이의 용매분획물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성을 분석하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. DPPH 라디칼 소거능은 Blois의 방법(Blois, 1958)을 이용하여 측정하였다. DPPH solution을 MRSJ 추출물에 가하고 37°C에서 30분 동안 암반응 시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 양이온 라디칼 용액은 734 nm에서 흡광도가 0.70±0.01가 되도록 물로 희석하여 제조하였다. 희석된 ABTS 용액을 각 MRSJ 메탄올 추출물 및 이의 용매분획물에 가하고 1시간 동안 암실에서 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. L-Ascorbic acid는 양성 대조군으로 사용되었다.

용매분획물	라디칼소거능(IC₅₀)
용매분획물	DPPH	ABTS
L-Ascorbic acid	0.02±0.00 mg/mL	0.05±0.00 mg/mL
MeOH extracts	4.12±0.40 mg/mL	10.34±0.32 mg/mL
Hexane	1.59±0.02 mg/mL	6.49±0.12 mg/mL
CH₂Cl₂	9.30±0.80 mg/mL	14.47±0.37 mg/mL
EtOAc	0.09±0.02 mg/mL	0.34±0.11 mg/mL
BuOH	1.06±0.12 mg/mL	4.47±0.29 mg/mL
Water	16.83±3.69 mg/mL	2.17±0.89 mg/mL

표 6에 나타낸 바와 같이 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 월등하게 높게 나타난 에틸 아세테이트 분획물에서 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 또한 높은 것으로 확인되었다. 에틸 아세테이트 분획물의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 IC₅₀ value는 0.09 mg/mL로, 이는 양성 대조군으로 사용된 L-아스코르브산 (IC₅₀ value=0.02 mg/mL)에 비해 크게 떨어지지 않는 결과를 보였다. 하지만 ABTS 라디칼 소거능에서는 L-아스코르브산의 IC₅₀ value가 0.05 mg/mL인 것에 비해 에틸 아세테이트 분획물이 0.34 mg/mL로 나타나, L-아스코르브산의 라디칼 소거능에 비해 다소 떨어지는 것을 확인하였다. 하지만 다른 5가지 분획물에 비해서는 높은 라디칼 소거능을 보였으며 이는 에틸 아세테이트 층에 다량 함유된 폴리페놀 및 기타 유용성분들 때문이다. 또한 디클로로메탄과 물 분획물을 제외하고는 모두 MRSJ 메탄올 추출물 보다 높은 라디칼 소거능을 보이는 것을 확인하였으며, 이는 MRSJ의 항산화 활성을 나타내는 폴리페놀을 포함하는 대부분의 유효성분들이 에틸 아세테이트, 부탄올 그리고 헥산분획물에 존재하는 것을 시사한다(표 6).

<3-4> FRAP assay를 이용한 환원력 측정

상기 <실험예3-1>에서 제조한 MRSJ 메탄올 추출물과 이의 용매분획물의 환원력을 측정하기 위하여 하기와 같은 FRAP assay(Benzie and Strain, 1996)를 수행하였다. 실험 전에 FRAP reagent를 만들어 사용하였으며 FRAP reagent는 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해시킨 10 mM TPTZ(Sigma-Aldrich Co.), 20 mM iron(II) chloride hexahydrate (FeCl₃·6H₂O, Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Japan)를 10:1:1(v/v/v)로 혼합하여 제조하였다. 시료 250 μL와 FRAP reagent 750 μL를 혼합하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 분광광도계로 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 황산철(ferrous sulfate; FeSO₄·7H₂O, Junsei Chemical Co., Ltd.)을 사용하여 검량선을 작성하였으며, μM FeSO₄equivalent/g로 표시하였다.

용매분획물	환원력(FRAP)
L-Ascorbic acid	1235.95±0.00 μM/g
MeOH extracts	102.40±1.33 μM/g
Hexane	202.41±4.82 μM/g
CH₂Cl₂	35.01±0.32 μM/g
EtOAc	1129.98±1.35 μM/g
BuOH	294.14±10.56 μM/g
Water	31.62±1.60 μM/g

그 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이 양성 대조군으로 사용된 L-아스코르브산의 경우 1.24 mM/g의 높은 환원력을 보였으며, 에틸 아세테이트 분획물도 1.13 mM/g으로 양성대조군과 거의 유사한 환원력을 갖는 것을 확인하였다. 라디칼 소거능과 마찬가지로 디클로로메탄 및 물 분획물은 MRSJ 메탄올 추출물 보다 낮은 환원력을 보였다. 이러한 결과는 고구마가 높은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능, 지질과산화 저해활성 및 환원력을 나타낸다는 연구결과와도 일치하며, 다른 식품군과의 혼합 착즙으로 인해 보다 높은 활성을 보인 것을 확인하였다.

기존 연구에서 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 항산화 활성은 높은 양의 상관관계를 갖는다고 나타내고 있으며, 본 실험 결과에서도 총 폴리페놀 함량과 ABTS 라디칼 소거능, 환원력 간의 상관관계는 각각 r²=0.91 그리고 0.80으로 높은 양의 상관관계를 갖는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 MRSJ에 함유되어 있는 풍부한 셀레늄 등의 미네랄과 비타민, 불포화지방산과 같은 에센셜 오일(essential oil)뿐만 아니라 폴리페놀 및 플라보노이드로 인해 우수한 라디칼 소거능 및 환원력을 나타내고 체내에 축적된 유해 활성 산소종을 유의적으로 제거하여 이들로부터 야기되는 산화적 손상으로부터 보호효과를 나타낼 수 있다고 제시한다.

<실시예 2> HepG2 세포의 배양

HepG2 세포는(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)는 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 μg/mL penicillin-streptomycin을 함유하는 DMEM에 5% CO₂와 95% 혹은 그 이상의 습도로 유지되는 세포 배양기(MCO-15AC, SANYO Electric Co., Ltd., Gunma, Japan)로 37°C에서 배양하였다.

<실험예 4> MRSJ 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물의 간 보호 효과 확인

MRSJ의 간 보호 기능을 조사하기 위해, 높은 폴리페놀 함량을 나타내고, 우수한 항산화 활성을 가진 에틸 아세테이트 및 부탄올 분획물을 이용하여 간세포 보호 효과를 조사하였다. HepG2 세포는 24-well plate에 24시간 동안 배양한 후 배양액을 모두 제거하였다. MRSJ가 처리된 무혈청 배지로 교체하여 1시간동안 방치하고, 초음파분산처리를 통해 DMEM 배지에 분산된 CCl₄와 DMSO를 함유한 독소 용액을 10시간 동안 처리하였다. 각 상등액을 모두 제거한 뒤, HepG2 세포에 대한 세포독성을 (Hansen et al., 1989)의 방법에 따라 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 세포 생존율은 대조군과 비교하여 퍼센트(%)로 계산하였으며(시험군의 흡광도/대조군의 흡광도Х 100) MRSJ 용매분획물의 농도에 따라 계산하였다.

그 결과, 20 mM CCl₄를 HepG2 cell에 처리할 경우 도 3 A에 나타낸 것과 같이 처리 후 2시간부터 점차 세포 독성이 나타나다가 8시간 이후로는 급격한 세포사멸이 일어나는 것을 확인 할 수 있다. 양성 대조군으로는 천연물 유래의 간보호제로 사용되고 있는 실리비닌(silybinin)을 사용하였으며, 실리비닌 처리군은 6시간 까지 CCl₄에 의한 세포 독성이 나타나지 않았다. CCl₄ 처리 후 8시간이 경과했을 때 대조군의 세포 생존율이 12.96%인 것에 비해 실리비닌 처리군은 39.9%의 세포 생존율을 보이며 비교적 높은 세포 보호 효과를 보였다. MRSJ의 경우 에틸 아세테이트 분획물 또한 6시간 까지 CCl₄로부터 세포 독성이 나타나지 않아, 세포 보호 효과가 관찰되었으며 CCl₄ 처리 8시간에도 세포 생존율이 47.27%로 실리비닌 처리군 보다 높은 보호 효과를 보였다. 반면 부탄올 처리군은 대조군과 마찬가지로 CCl₄ 처리 2시간만에 독성이 나타나기 시작했으나, 8시간대에도 급격한 독성은 관찰되지 않은 것으로 보아 세포 보호 효과가 있는 것으로 확인되었다.

이러한 세포 보호 효과는 CCl₄의 농도를 30 mM로 높여 HepGe2 cells에 처리하여도 유사하게 나타났다. 도 3 B에 나타낸 것과 같이, 30 mM CCl₄ 처리 후 2시간부터 약 20 %의 세포가 사멸하였고, 4시간이 경과한 뒤로 세포 생존율이 67.02%로 크게 감소되면서 6시간 이상부터는 대부분의 세포가 사멸하는 것을 확인하였다. 반면 양성 대조군인 실리비닌을 처리하는 경우 4시간 까지도 세포 독성이 관찰되지 않았으나 6시간부터 급격한 독성을 나타내는 것은 공시험군과 유사했다. MRSJ 에틸 아세테이트 분획물의 경우 CCl₄ 처리 후 4시간까지 세포 생존율의 감소는 보이지만 음성대조군과 비교해 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다. 또한 6시간 이후부터 대부분의 세포가 사멸하였지만, 대조군과 실리비닌에 비해서는 비교적 높은 생존율을 보이는 것을 확인하였다. 부탄올 분획물의 경우 CCl₄ 처리 후 2시간에서부터 세포 독성이 나타나면서 대조군과 유사하게 나타났다.

다음으로 H₂O₂로 유도된 HepG2 세포 손상에 대한 MRSJ 에틸 아세테이트 분획물의 세포 보호 효과를 조사하였다. HepG2 세포에 10 mM H₂O₂를 시간별로 처리하여 세포 독성을 유발한 결과, 처리 후 2시간부터 세포 사멸이 시작되고, 6시간이 지나면 세포 생존율은 57.10%로 크게 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 양성 대조군으로 사용된 실리비닌은 H₂O₂로부터 유도되는 세포독성에는 큰 효과를 나타나지 못하였으나, MRSJ의 에틸 아세테이트 분획물의 경우 CCl₄로 유도된 세포독성보다 더 높은 보호효과를 나타냈다. 8시간 이상 10 mM H₂O₂를 처리하게되면, 대부분의 세포가 사멸하여 극히 낮은 세포 생존율을 보이는데 비해, 에틸 아세테이트 처리군은 10시간 이후에도 69.90%의 세포 생존율을 보이면서 높은 세포 보호효과를 나타내는 것을 확인하였다. MRSJ 에틸 아세테이트 분획물의 우수한 간 세포 보호 효과는 CCl₄보다는 H₂O₂ 처리로 인해 발생하는 유해 활성산소종에 대해 더 높은 효과를 보였다. 이는 에틸 아세테이트 분획물이 나타내는 우수한 항산화 활성과도 관련이 있다. 따라서 MRSJ 에틸 아세테이트 분획물의 간 보호 효과는 MRSJ에 풍부하게 함유되어 있는 셀레늄, 비타민, 불포화지방산과 같은 에센셜 오일(essential oils) 그리고 폴리페놀로 인해 라디칼 소거능 및 환원력 등의 우수한 항산화 활성을 나타냄으로써 다양한 원인에 의해 초래되는 간 세포 독성과 그로 인해 손상된 간 세포의 항산화 상태를 조절하여 우수한 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

<실시예 5> MRSJ 에틸아세테이트 분획물의 간 세포 보호 효과 확인

MRSJ 분획물 중에서 CCl₄ 및 H₂O₂로부터 가장 높은 세포보호 효과를 보였던 ethyl acetate 분획물의 간 세포 보호 효과를 평가하기 위해 CCl₄로 유도된 HepG2 cells의 apoptosis 및 지질 축적에 관한 저해 활성을 조사하였다.

<5-1> ALT 및 AST 활성 평가

ALT와 AST 등의 효소 활성도 측정은 간 독성 연구에 있어서 가장 유용한 방법 중의 하나로, 간세포 변성과 괴사, 간 조직의 파괴가 진행됨에 따라 세포가 손상되어 혈중으로 유리되어 높은 활성을 나타내게 된다. ALT 및 AST 활성 조사를 통해 에틸 아세테이트 분획물의 세포 보호 효과를 조사하기 위해서 20 mM CCl₄를 6시간 동안 세포에 노출시킨 뒤 colorimetric assay kit (AST; #K753-100, ALT; #K752-100, Biovision Co., CA, USA)를 이용하여 상등액의 ALT와 AST 활성을 측정하였다.

그 결과, CCl₄처리에 의해 HepG2 cells 배양액 내에 존재하는 ALT와 AST 활성을 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였으며, 양성 대조군인 실리비닌과 에틸 아세테이트 처리에 따라 세포 배양액 내의 ALT 및 AST 활성이 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 4 C 및 D 참조). 이는 CCl₄로 인해 야기되는 간세포의 변성, 괴사 및 파괴가 유의적으로 억제되어 세포액효소의 분비가 줄어들었기 때문이다. 특히 에틸 아세테이트 처리군은 실리비닌보다 낮은 ALT 및 AST 활성을 보여 우수한 간 세포 보호 효과를 보였다.

<5-2> DNA 래더 분석(ladder assay)

DNA ladder 현상을 측정하기 위해, ethyl acetate 분획물을 24시간 동안 농도별로 세포에 처리하고 DNA를 다음과 같은 방법으로 분리하였다. 세포는 PBS로 2회 세척하고, 용해완충액(10 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 8.0, 0.5% Triton X-100)에 재분산시켜 50℃에서 1시간 동안 방치시켰다. 그 후 RNase A를 0.5 mg/ml 농도가 되도록 처리하고 다시 50℃에서 1시간 동안 방치시켰다. DNA는 phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1)로 추출하였으며, 큰 분자량의 DNA는 13,000 x g에서 10분동안 원심분리하여 침전시키고, 저분자 DNA는 2배의 차가운 에탄올을 가하여 -70℃에서 overnight하여 침전시켰다.

그 결과, CCl₄에 의해 손상을 입은 HepG2 cell의 DNA는 CCl₄를 처리하지 않은 대조군에 비해 DNA ladder 현상이 뚜렷하게 나타났다. 하지만 양성 대조군인 실리비닌을 처리하는 경우 DNA ladder 현상이 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있다. 또한, 에틸 아세테이트 분획물 처리군 또한 농도가 증가함에 따라 DNA ladder 현상이 유의적으로 감소되는 것을 확인 할 수 있다. 이는 CCl₄로부터 유도되는 DNA 손상으로부터 높은 보호 효과를 보여주는 결과로써, 에틸 아세테이트 분획물에서 나타난 세포 보호 효과와도 일치하는 결과이다(도 5 참조).

<5-3> 하이드록시 라디칼(hydroxyl radical)로부터 DNA 보호 효과 확인

펜톤 반응(Fenton's reaction)을 통해 생성된 하이드록시 라디칼(hydroxyl radical)에 의한 DNA 산화는 (Oyaizu, 1986)의 방법에 따라 수행되었다. 100 μL의 DNA 반응 혼합물은 분석시료 100 μg/mL, 3.5 mM FeSO₄와 2 mM H₂O₂를 가하여 총 DNA 농도가 50 μg/mL이 되도록 제조하였다. 30분 동안 상온에서 반응시킨 뒤, 10 mM EDTA를 가하여 반응을 중지시켰다. 반응물은 1 % 아가로스 젤(agarose gel)을 이용해 100V에서 30분간 전기영동하였다. DNA는 DAVINCH-Chemi Imaging System (CAS-400SM, Corebiosystem, Seoul, Korea)를 이용해 UV로 관찰하였다.

그 결과, DNA의 산화적 손상으로 인해 대부분의 DNA가 분해(degradation)되는 것이 관찰되었으며, MRSJ 에틸 아세테이트 분획물을 처리하는 경우 높은 DNA 보호 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 6 참조). 이는 양성대조군으로 사용된 L-아스코르브산과 유사한 활성을 보이면서 MRSJ가 높은 항산화 활성을 갖는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 하이드록시 라디칼(hydroxyl radical)로부터 유도된 DNA 손상으로부터 고구마에 함유되어 있는 다양한 효소들이 보호 효과를 나타낸다는 연구결과와도 일치한다(Wang et al., 2016).

<5-4> 오일 레드 오 염색

24시간동안 10 mM CCl₄처리된 HepG2 세포를 PBS를 이용해 2회 세척하였다. 세포는 Oil Red O 염색 용액을 이용하여 18-20°C에서 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 현미경을 이용하여 촬영하였다.

그 결과, HepG2 cell에 CCl₄를 처리한 경우 간세포에 지방 세포가 과도하게 축적되는 것을 확인하였다. 반면 실리비닌과 에틸 아세테이트를 처리한 경우에는 지방 축적 정도가 공시험군과 유사한 수준으로 감소하였다(도 7 참조).

통계분석

모든 분석은 3회 이상 수행하였으며, 평균표준편차(mean ± SD)로 표현하였다. 평균값의 유의한 차이는 SPSS(version 20.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 이용한 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)의 Duncan's multiple comparisons를 사용하였으며, 두 가지 시험군들 간의 활성 평균값은 Turkey's multiple comparison test로 분석하였다. 유의성 검증은 신뢰구간 p < 0.001, p < 0.01 및 p < 0.05에서 각각 분석하였다.

Claims

고구마 및 당근으로 구성된 채소류; 및
달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩으로 구성된 씨앗류를 6 내지 10:2(w/w)중량부로 혼합하고 착즙하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 주스 형태의 식사 대용식.
삭제
제1항에 있어서,
상기 채소류와 씨앗류의 중량비는 7 내지 9:2(w/w)인 것을 특징으로 하는, 식사 대용식.
삭제
고구마 및 당근으로 구성된 채소류; 및
달맞이꽃씨, 율무, 귀리 및 땅콩으로 구성된 씨앗류를 6 내지 10:2(w/w)중량부로 혼합하여 착즙하여 주스를 얻고, 상기 주스를 물, 메탄올 또는 에탄올로 추출하여 추출물을 얻고, 이 추출물을 에틸 아세테이트로 분획하여 얻는 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간 보호용 건강기능성식품.
삭제
제5항에 있어서,
간 보호는 산화 스트레스로부터의 간 보호인 것을 특징으로 하는 간 보호용 건강기능성식품.
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