KR102275731B1 - 흰점박이꽃무지 발효물을 포함하는 미생물의 성장 촉진용 조성물 - Google Patents
흰점박이꽃무지 발효물을 포함하는 미생물의 성장 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 흰점박이꽃무지를 원료로 제조된 유산균 발효물로서 1, 4-디히드록시-2-나프토산(1, 4-dihydroxy-2-naphthoic acid; DHNA)을 포함하는 비피도박테리움의 성장 및/또는 증식 촉진용 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명이 제공하는 유산균 발효물은 장내 유익균인 비피도바이러스의 증식 및/또는 성장을 촉진하여 건강기능식품 또는 동물의 장내 환경 개선을 위한 사료 첨가제로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하며, 상기 발효물은 1, 4-디히드록시-2-나프토산(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid; DHNA)를 포함하는 것인, 비피도박테리움 속 균주의 성장 촉진용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
보다 상세하게는 흰점박이꽃무지의 용매 추출물 및/또는 흰점박이꽃무지 진액 배합물을 원료로 사용한 유산균 발효물로서 DHNA를 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 건강기능식품 조성물, 및 상기 DHNA의 제조방법에 관한 것이다.
유산균을 포함하는 프로바이오틱스(Probiotics)는 인체 장내에서 다양한 효능과 기능을 가지는데 대표적인 기능으로는 장내병원성 미생물 억제, 설사 및 변비 예방, 면역증강, 항암 활성, 혈중 콜레스테롤 저하, 비타민 합성 등이 있다. 특히 장내미생물과 인체 생리와의 상관관계가 과학적으로 규명되면서 비만을 비롯하여 다양한 대사질환의 원인을 장내미생물 균총과 연계하는 연구들이 진행되고 있다. 따라서 최근 예방적 혹은 치료적 접근방법으로 장내 환경을 개선할 수 있는 프로바이오틱스 균주의 효과적인 적용을 위해 장내 유익균을 증식시키는 방법이 활발히 연구되고 있다. 이를 위해 유산균과 같은 유익균을 꾸준히 섭취하거나 장내에 이미 정착되어 있는 유익균을 선택적으로 증식시켜주는 방법들이 활용될 수 있다.
한편 이미 정착되어 있는 유익균 증식을 위하여 프리바이오틱스(Prebiotics) 제품들이 상업화 되어 있는데 주로 올리고당(Oligosaccharide)나 식이섬유(fiber)와 같이 인체 소화효소에 의해 분해되지 않는 불용성의 탄수화물이 주를 이루고 있다. 프리바이오틱스는 아니지만 장내 유익균의 증식에 도움을 주는 미생물 대사산물의 대표적인 것은 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid(DHNA)인데 일본에서 DHNA가 비피도박테리아(Bifidobacteria)에 대한 증식효과가 있음을 밝힌 바 있다.
비피도박테리아는 인간뿐만 아니라 강아지나 고양이 등 동물의 장내에 서식하는 유익균이다. 유산균은 유제품이나 발효식품 등 음식을 통해 서식이 가능하지만 비피더스균은 산소가 없는 대장에서만 존재하고 락토바실러스(Lactobacillus) 등은 소장에 존재한다. 비피더스균은 비타민B1, B6, B12, 엽산 등을 생성하고 칼슘흡수를 촉진하고 배변활동을 원활하게 하는 효과가 있다. 비피도박테리아 중 비피도박테리움 롱검(Bifidoacterium longum)은 인체의 장내 유산균의 90%로 유해균에 대한 항균 및 면역력 향상 염증억제 등의 기능이 있다. 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)은 여성질환 예방, 장내유해균 사멸, 백혈구 증식, 면역력 개선 등에 효능이 있고 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve)는 대장균 억제, 세균성 설사 억제 효능이 있다. 이 외의 비피도박테리움 균주는 비피도박테리움 어돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobactrium animalis), 비피도박테리움 아스테로이즈(Bifidobacterium asteroids), 비피도도박테리엄 카테눌라팀(Bifidobacterium catenulatu), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락틱스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 수도카테눌라텀(Bifidobacterium pseudocaenulatu) 등이 있다. 또한 DHNA는 염증성 장질환에 있어서 점막의 염증상태를 개선하고 우유불내성 환자의 우유 섭취시 복부 불쾌 증상을 저감하고, 대사성 골질환의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
곤충은 단백질 함량이 높을 뿐만이 아니라 필수아미노산의 조성도 우수한 양질의 단백질 공급원으로, 육류와 어류를 대체할 미래 식품으로 떠오르고 있으며, 이러한 곤충의 영양적 우수성은 최근 대중에게도 인식되고 있다. 또한 곤충에 함유된 지방은 육류에 비해 불포화지방산 함량이 상당히 높고, 곤충 표피의 키틴질로부터 유래되는 식이성섬유, 칼슘이나 철과 같은 무기질함량과 비타민에 이르기까지 곤충의 영양기능 가치가 높다. 식용곤충의 영양학적 가치를 활용하기 위해서는 외형적 특성에서 오는 부정적인 영향은 없애고, 영양성분의 우수성은 유지하는 기술이 중요하다. 식용곤충의 핵심 영양분은 단백질을 추출해 다양한 식품과 혼합하거나 유지 또한 곤충의 주요성분으로 에너지, 필수지방산 섭취가 유효하다. 흰점박이꽃무지 유충, 갈색거저리 유충, 쌍별 귀뚜라미, 장수풍뎅이 유충 등의 식용곤충 단백질 성분은 필수 아미노산 함량이 높다.
최근 소재로부터 DHNA 생산 기능을 가진 물질과 유산균을 탐색하여, 식품에 적용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 아직까지 GRAS(Generally recognized as safe)로 분리된 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)을 식용곤충에 적용하여 발효한 예는 없다.
본 발명자들은 흰점박이꽃무지의 추출물에서 유산균을 호기상태의 저온 배양하여 얻은 발효물에 높은 함량의 DHNA(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid)을 포함하며, 상기 발효물은 미생물, 예를 들면 장내의 비피도박테리움 속 균주 등에 대한 증식 또는 성장 촉진 효과 등을 나타낼 수 있어 미생물 생장 촉진용 조성물, 항산화용 조성물 또는 염증성 질환 치료용 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 유산균을 이용한 바이오컨버젼(bioconversion)기술로 비피도박테리움 속 균주의 증식(성장) 촉진, 염증성 장질환 개선, 대사성 골질환 예방 및 락토오즈 불내증(intolerance) 등에 유용한 DHNA을 생산하고 이를 식용곤충 추출물과 진액에 응용하여 DHNA 효능이 부가된 식용곤충 추출발효물 또는 진액 발효물을 제조하고, 유산균 자체의 분해효소로 아미노산, 펩타이드화, 지방, 탄수화물 등을 분해하여 체내 흡수율과 기능성을 높인 식용곤충 추출물의 발효물을 제공한다.
본 발명의 목적은, 흰점박이꽃무지의 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하며, 상기 발효물은 DHNA를 포함하는것인, 비피도박테리움 속 균주의 성장 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 유산균을 접종 및 배양하는 단계를 포함하는, DHNA의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 예는, DHNA를 포함하는 흰점박이꽃무지 추출물의 발효물을 포함하는, 비피도박테리움 속 균주의 성장 촉진용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 흰점박이꽃무지를 포함하는 원료에 유산균을 접종 및 배양하는 단계를 포함하는, DHNA의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는, 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 유산균을 접종하여 제조된 유산균 발효물, 또는 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 비피도박테리움속(Bifidobacterium sp.) 균주의 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 흰점박이꽃무지는 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)의 알, 유충, 번데기 또는 성충일 수 있으며, 일 예에서 번데기를 형성하기 전의 유충, 구체적인 일 예에서 3령 유충일 수 있다. 상기 흰점박이꽃무지의 유충은 꽃벵이 또는 굼벵이로 불리우며, 고단백, 고영양 식품으로 각광받고 있다.
상기 흰점박이꽃무지 유충은 분말화 이전에 1일 내지 5일간 또는 3일 내지 5일간 절식을 수행할 수 있다. 상기 절식 단계는 흰점박이꽃무지 유충에게 식이를 급여하지 않는 방법 또는 찹쌀가루만을 급여하는 방법으로 수행될 수 있다. 상기 절식 단계를 거침으로써 흰점박이꽃무지 유충의 장내 이물질을 제거할 수 있다. 절식 기간이 1일 미만인 경우 장내 잔여 이물질이 충분히 제거되지 않을 수 있으며, 5일 이상 절식이 수행되는 경우 유충이 사망 또는 영양상태가 불량하게 될 수 있다.
상기 유산균 발효물 제조를 위한, 흰점박이꽃무지의 용매 추출물은, 흰점박이꽃무지 유충, 이의 건조물 또는 분쇄물을 추출 용매로 추출하여 제조된 것이다. 상기 용매 추출물의 제조에 사용되는 흰점박이꽃무지는, 흰점박이꽃무지 유충을 열풍건조, 마이크로웨이브, 동결건조 등의 방법으로 건조한 후, 분쇄기로 분말화한 분말일 수 있다. 이때 분말의 입자 크기에 대한 제한은 없으며, 일반 분쇄기 또는 식품용 믹서기로 1분간 강한 열이 발생하지 않도록 처리하여 제조한 분말일 수 있다. 또는 상기 흰점박이꽃무지 유충을 동결한 후, 버퍼와 함께 마쇄한 분말을 사용할 수 있다. 상기 제조한 분말을 추출물 제조에 바로 사용할 수도 있고, -20℃내지 -70℃조건에서 6개월 내지 1년간 보관한 흰점박이꽃무지 분말을 사용할 수 있다. 또는, 흰점박이꽃무지 유충을 건조하지 않고 -70℃에서 냉동보관한 후, 물을 넣고 분쇄한 생체를 사용할 수도 있다.
상기 추출용매는 물, 탄소수 1(C1) 내지 및 해양심층수 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 물, 탄소수 1(C1) 등의 수용액일 수 있다. 상기 용매 추출방법은 통상의 추출법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 추출 용매에 의한 추출, 초임계 유체 추출, 초음파 추출, 열수 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 열수 추출방법을 사용할 수 있다. 상기 용매추출 시간은 4 내지 6시간, 또는 5 내지 6시간일 수 있다.
상기 용매 추출시의 추출온도는 10 내지 90℃, 20℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃ 또는 30℃ 내지 60℃일 수 있다. 예컨대 상기 용매가 물인 경우, 추출온도는 40 내지 80℃, 50 내지 70℃,또는 55 내지 65℃, 예를 들어 60℃일 수 있다.
구체적인 일 예로서, 상기 추출용매는 물을 이용하여 추출온도 30℃내지 80℃에서 수행한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물은 흰점박이꽃무지 열수 추출물(Hotwater Extract of Protaetia brevitarsis, HePb)이다.
상기 흰점박이꽃무지 열수 추출물은 흰점박이꽃무지 유충 분말 (Protaetia brevitarsis Powder, Pb) 100 g에 물 900 mL (w/v) 을 1 : 9의 비율로 혼합한 후, 초음파 및/또는 볼텍스 챔버 등을 이용해 혼합하고, 60℃온도로 4 내지 6 시간 진탕 배양하여 추출물을 얻고 원심분리한 후 진공 여과(vacuum filter)하여 얻은 약 700 ~ 800 ml(70 ~ 80 %) 의 흰점박이꽃무지 열수추출물(Hotwater Extract of Protaetia brevitarsis, HePb)일 수 있다. 본 발명의 상기 제조방법으로 제조된 흰점박이꽃무지 열수 추출물은 액상 상태 그대로를 사용할 수도 있다.
본 발명의 흰점박이꽃무지 용매 추출물 및/또는 흰점박이꽃무지 진액 배합물의 발효물은, 흰점박이꽃무지 용매 추출물 그 자체 또는 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 조성물을 발효 원료로 하여 제조되는 것일 수 있다.
상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 조성물을 발효 원료로 사용하는 경우, 탄소원, 식물의 세포벽 성분인 셀룰로오스(Cellulose), 수용성 식이섬유(다당류) 및 기타 당류(예를 들어, 엿당, 설탕, 포도당, 과당, 및 프락토올리고당으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 당류)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 기타 당류는 유산균에 영양을 공급하고 미생물 대사과정에 있어 단쇄지방산(short chain lipid, SCL)을 생산할 수 있도록 한다. 상기 단쇄지방산은 염증억제, 염증 개선 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 일 예에서, 상기 조성물은 흰점박이꽃무지 용매 추출물 및 탄소원을 필수적으로 포함하고, 식물의 세포벽 성분인 셀루로스, 수용성 식이섬유(다당류) 및 기타 당류(예를 들어, 엿당, 설탕, 포도당, 과당, 및 프락토올리고당으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 당류)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가물을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 탄소원은 예를 들어, 덱스트로스(dextrose), 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 갈락토오스(galactose), 및 전분(starch)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 이들의 조합으로 구성된 탄소원일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, DHNA 생산 목적 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 일 예에서, 상기 탄소원은 덱스트로스 및 녹말로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 흰점박이꽃무지 용매 추출물에 덱스트로스, 수크로오스, 말토오스를 2 질량% 또는 전분 1 질량%를 첨가하여 발효 원료로 이용한 결과, 덱스트로스 등의 탄소원가 첨가되지 않은 발효 원료를 이용한 경우에 비해 유산균의 생장이 현저히 증가하였다.
본 발명의 일 예에서, 상기 탄소원은 전체 발효원료를 100 중량부로 두었을 때 0.5 내지 5 중량부, 0.5 내지 3 중량부, 0.5 내지 2 중량부, 1 내지 5 중량부, 1 내지 3 중량부, 또는 1 내지 2 중량부일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 탄소원의 종류와 DHNA 생산 목적 범위 내에서 적절히 변형하여 사용될 수 있다. 일 예에서 발효원료 내 상기 탄소원 함량은 전체 발효원료 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 1 중량부일 수 있다. 상기 탄소원의 함량 범위 내에서 유산균의 생장이 적절히 촉진될 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 상기 발효 원료는 식물의 추출물을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 식물은 당귀, 천궁, 황기, 숙지황, 작약, 백출, 백봉령, 건강, 대추, 인진쑥, 헛개나무 열매, 계피, 감초로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 식물일 수 있다. 상기 식물 추출물은 상기 식물을 열수 추출하여 제조된 추출물, 상기 추출물의 농축물 및/또는 상기 추출물의 분말일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 식물 추출물은 발효 원료 전체를 100 중량부로 두었을 때 10 내지 90 중량부, 20 내지 90 중량부, 30 내지 90 중량부, 40 내지 90 중량부, 50 내지 90 중량부, 60 내지 90 중량부, 10 내지 80 중량부, 20 내지 80 중량부, 30 내지 80 중량부, 40 내지 80 중량부, 50 내지 80 중량부, 60 내지 80 중량부, 10 내지 75 중량부, 20 내지 75 중량부, 30 내지 75 중량부, 40 내지 75 중량부, 50 내지 75 중량부, 60 내지 75 중량부 또는 65 내지 75 중량부의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시예에서, 상기 식물 추출물은 발효 원료 전체 100 중량부에 대해 72.12 중량부로 포함되었다.
본 발명의 일 예에서, 상기 발효 원료는 다당류, 이당류 및/또는 단당류, 예를 들어 프락토올리고당, 엿당, 과당, 설탕, 포도당, 및 녹말로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 당류를 포함할 수 있다. 상기 당류는 유산균에 영양을 공급하고 미생물 대사과정에 있어 단쇄지방산(short chain lipid, SCL)을 생산할 수 있도록 한다. 상기 단쇄지방산은 염증억제, 염증 개선 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 일 예에서, 상기 발효 원료로 사용되는 조성물은 흰점박이꽃무지 진액 배합물일 수 있다.
본 명세서에서, "흰점박이꽃무지 진액 배합물"은 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물, 식물 추출물 및 당류를 포함하는 혼합물의 추출물 및/또는 상기 추출물의 농축물을 의미한다.
상기 진액 배합물은, 흰점박이꽃무지 용매 추출물, 상기 식물 추출물, 및 (프락토올리고당)의 혼합물의 추출물일 수 있다. 상기 진액 배합물의 추출 원료로서 상기 식물 추출물, 및 프락토올리고당의 함량은 상술한 바와 같다. 상기 진액 배합물은 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물, 상기 식물 추출물 및/또는 당류의 혼합물을 50 내지 120℃ 온도 조건에서 6시간 이상 추출하여 제조되는 것일 수 있으며, 상기 제조된 추출물의 여과 및/또는 이취 제거 단계를 추가로 수행하여 제조되는 것일 수 있다. 상기 이취 제거 단계는 60 내지 120℃, 80 내지 110℃, 또는 90 내지 100℃의 온도 조건에서 탈기하여 수행되는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 진액 배합물은 흰점박이꽃무지 열수추출물 20 중량부, 상기 식물추출물 72.1 중량부 및, 프락토올리고당 7.88 중량부의 혼합물의 열수추출하여 제조되었다. 일 예에서 상기 진액 배합물의 당도는 10 내지 20 brix, 12 내지 15 brix 또는 13 brix, 염도는 10%(w/v) 이하, 5%(w/v) 이하, 3%(w/v) 이하, 1%(w/v) 이하, 또는 0.1 %(w/v)일 수 있고, pH는 4.5 내지 8.0, 4.5 내지 7.0, 4.5 내지 6.0 또는 5.0일 수 있다.
본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지 용매 추출물 및/또는 흰점박이꽃무지 진액 배합물 의 유산균 발효물에 있어서, 상기 유산균은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 범위에서 제한 없이 선택하여 사용 가능하며, 예를 들어, 락토바실러스 플란터룸(Lactobacillus plantarum, ATCC 10241, NCTC7220), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactics, ATCC 11454, NCIC 8586), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei, ATCC 31063, ATCC 15521), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum, ATCC14931, NCDO 1750), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus, ATCC7469, KCTC3326), 락토바시러러스 브레비스(Lactobacillus brevis, ATCC15521), 락토바실러스 그라미니스(Lactobacillus graminis, ATACC 51150), 락토바실러스 덱스트린쿠스(Lactobacillus dextrinicus, ATCC 33087), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae, ATCC11454, LMG 8162), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium, ATCC 19634), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis, ATCC6057), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum, ATCC 49370), 웨이셀라 헬레니카(Weissella hellenica, ATCC 51523), 웨이셀라 파라메센테로이드(Weissella paramesenteroides, ATCC 33313), 페디오코쿠스 에시디락틱시(Pediococcus acidilactici, ATCC33314), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus, ATCC 33316), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis, ATCC 27672) 및 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis, ATCC15697) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 균들은 한국생명공학연구원의 생물자원센터 또는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 분양 받아 이용할 수 있다. 일 구체예에서, 락토바실러스 플란터룸(KCCM 12299P), 웨이셀라 파라메센테로이드 (KCCM 12300P), 및 웨이셀라 파라메센테로이드 KCCM 12301P로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 또는 세 종류의 유산균 균주를 사용할 수 있다.
상기 락토바실러스 플란터룸 균주는, 서열번호 6의 염기서열과 99% 이상, 99.5%이상 또는 99.9% 이상의 서열 상동성(sequence identity)을 가지는 16S rRNA 유전자를 포함하는 균주일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 16S rRNA 서열을 포함하는 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2018년 8월 10일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁된 수탁번호 KCCM12299P 균주일 수 있다.
상기 웨이셀라 파라메센테로이드 균주는, 서열번호 7 및/또는 서열번호 8의 염기서열과 99% 이상, 99.5% 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 가지는 16S rRNA 유전자 염기서열을 포함하는 균주일 수 있으며, 서열번호 7 및/또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 16S rRNA 유전자를 포함하는 균주일 수 있으며, 바람직하게는 2018년 8월 10일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁된 수탁번호 KCCM12300P 및/또는 KCCM12301P 균주일 수 있다.
상기 유산균은 발효물 제조를 위해, 상기 발효 원료와 함께 12 내지 95시간, 18 내지 95시간, 24 내지 95시간, 12 내지 84시간, 18 내지 84시간, 24 내지 84시간, 12 내지 72시간, 18 내지 72시간, 또는 24 내지 72시간동안 20 내지 40℃, 25 내지 35℃, 또는 26 내지 30℃의 혐기 조건에서 배양될 수 있으나, 상기 조건에 제한되지 않으며, 필요에 따라 적절히 발효 조건을 조절할 수 있다. 온도와 배양시간이 상기 범위 외일 경우, 유산균이 기능성이 유지될 수 있을 정도의 유산균의 생균수가 유지되지 않고, 사균 발생의 우려가 있는 바, 상기 조건에서 발효 배양하는 것이 바람직하다.
일 예에서, 발효를 위한 유산균의 배양 온도가 상기 상한선 이상인 경우, DHNA의 생산 수율이 감소하고, 유산균이 증식하지 않으며, 유해 미생물이 증식할 위험이 있다.
본 발명의 흰점박이추출물의 용매 추출물의 발효물 제조를 위한 유산균의 접종량은, 1x108 내지 1x1015 cfu/ml, 1x108 내지 1x1012 cfu/ml, 또는 1x108 내지 1x1010 cfu/ml 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 발효 조건에 따라 적절히 변형하여 사용될 수 있다.
상기 유산균은, 유산균 발효를 위해 적절한 형태, 예를 들어, 정제된 유산균 또는 배양물의 형태로 첨가될 수 있다.
상기 흰점박이꽃무지의 열수 추출물의 유산균 발효물은, 흰점박이꽃무지 용매 추출물 및/또는 흰점박이꽃무지 진액배합물은 원심 분리 또는 여과 등 후처리 공정을 처리하여 발효 원료로 사용될 수 있다.
상기 흰점박이꽃무지 열수 추출물은 (i) 원심분리와 여과에 의해 흰점박이꽃무지 분말을 제거한 열수 추출물을 사용할 수 있으며, 또는 (ii) 상기의 흰점박이꽃무지 진액 배합물일 수 있다.
본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지 용매 추출물 및/또는 흰점박이꽃무지 진액 배합물의 유산균 발효물은, 상기 유산균 배양 및/또는 발효 단계 이후에 여과 및/또는 멸균 단계를 추가로 수행하여 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 비피도박테리움 속 균주의 성장 촉진용 조성물은, 하기의 특성으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상 또는 세 가지 특성을 가지는 것일 수 있다:
(1) DHNA 포함;
(2) 항산화 활성;
(3) 비피도박테리움 성장 촉진 활성.
본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물은 1, 4-디히드록시-2-나프토산(1, 4-dihydroxy-2-naphthoic acid; DHNA)을 포함한다. 상기 1, 4-디히드록시-2-나프토산(1, 4-dihydroxy-2-naphthoic acid; DHNA)은 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 유산균 발효에 의한 바이오컨버젼으로 인해 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 DHNA는 구조적으로 비타민 K(vitamin K) 방향족 유기화합물(hydroquinone)과 동일하고 쉽게 퀴논(Quinone: 방향족 탄솨수소의 벤젠고리에 결합하는 수소 2원자가 산소 2원자로 치환된 형태의 화합물)형태로 산화된다. DHNA는 메나퀴논(비타민K2)의 전구체로 박테리아 호흡 사슬에서 전자 공여체로 기능한다. 메나퀴논의 생합성은 DHNA와 이소프레노이드(isoprenoid) 합성의 두 개의 독립된 합성에 의해 진행된다. DHNA는 이소프리노이드 합체에 의해 메나퀴논으로 전환된다. 이론적으로 미생물 생산자로부터 생산된 DHAN 양은 그리셀알데하이드 삼 인산(glyceraldehyde-3-phosphate)과 파이루베이트(pyruvate)부터 생성되는 이소프리노이드 합성의 제한에 의해 증가할 수 있다. 본 발명의 고단백, 고영양 곤충식품 조성물이 DNNA를 함유함으로써, 장내 유익균 생성, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균의 억제를 통해 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 위선암, 위림프종 등에 대한 예방 또는 개선용 식품 또는 건강기능식품 조성물로 활용될 수 있다.
일 실시예에서, 유산균 첨가 과정을 거치지 않은 추출물 및 유산균을 이용한 추출발효물에 대한 DHNA 함량을 비교한 결과, 유산균을 첨가하여 발효 숙성을 거친 시료에서 DHNA를 나타내는 밴드가 진하게 나타나, DHNA의 함량이 증가하였음을 정성적으로 확인하였다.
본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물은 항산화 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물은 비피도박테리움 속 균주의 성장을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 비피도박테리움 속 균주는 제한 없이 이용 가능하며, 예를 들어, 비피도박테리움 어돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobactrium animalis), 비피도박테리움 아스테로이즈(Bifidobacterium asteroids), 비피도도박테리엄 카테눌라팀(Bifidobacterium catenulatu), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락틱스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 수도카테눌라텀(Bifidobacterium pseudocaenulatu), 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 균주일 수 있다. 일 예에서, 상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 론굼, 비피도박테리움 비피덤 및 비피도박테리움 브레브로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 또는 세 종류의 비피도박테리움 속 균주일 수 있다.
본 명세서에서 "비피도박테리움 속 균주"는 "비피더스균"으로도 표시될 수 있으며, "비피도박테리움 속 균주"와 "비피더스균"은 호환되어 사용될 수 있다. 본 명세서에서 별도의 언급이 없는 한, 성장 촉진의 대상이 되는 비피도박테리움 속 균주는 체내 및/또는 장내에 서식하는 비피도박테리움 속 균주를 의미한다.
본 발명이 제공하는 비피도박테리움 속 균주의 성장 촉진용 조성물은, 인간 또는 인간을 제외한 동물에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 인간 또는 가축 및/또는 반려동물에게 투여되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며 소화 기관을 가지는 동물에게 제한 없이 투여 가능하다. 상기 투여 대상은 성별 및/또는 연령에 관계 없이 적용 가능하며, 예를 들어, 태아, 영유아, 성장기, 성체 및/또는 노년기의 개체에 투여될 수 있다.
본 발명이 제공하는 비피도박테리움 속 균주의 성장 촉진용 조성물은 체내의 비피도박테리움 속 균주의 성장 촉진 목적 범위 내에서 투여 방법의 제한 없이 투여될 수 있으며, 예를 들어, 경구 투여, 정맥 투여, 근육 투어, 경막내 투여, 피하 투여, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 투여, 및 경피 투여로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명이 제공하는 비피보닥테리움 속 성장 촉진용 조성물은 건강기능식품인 것일 수 있다.
상기 건강기능식품의 제공 형태는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 프리바이오틱스, 포스트바이오틱스 및/또는 신바이오틱스의 형태로 제공될 수 있다. 상기 신바이오틱스는 프로바이오틱스(probiotics) 및 프리바이오틱스(prebiotics)를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 프로바이오틱스는 비피도박테리움 속 균주의 균체를 포함하는 것일 수 있다.
상기 비피도박테리움 속 균주는 본 발명의 겅강기능식품 조성물을 섭취한 개체의 장내에 서식하는 비피도박테리움 속 균주 및/또는 건강기능식품 조성물에 포함된 비피도박테리움 속 균주일 수 있다.
상기 비피도박테리움 속 균주는 제한 없이 이용 가능하며, 예를 들어, 비피도박테리움 어돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobactrium animalis), 비피도박테리움 아스테로이즈(Bifidobacterium asteroids), 비피도도박테리엄 카테눌라팀(Bifidobacterium catenulatu), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락틱스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 수도카테눌라텀(Bifidobacterium pseudocaenulatu), 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 균주일 수 있다. 일 예에서 상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 론굼, 비피도박테리움 비피덤, 및 비피도박테리움 브레브로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상 또는 세 종류의 비피도박테리움 속 균주일 수 있다.
일 예에서, 상기 건강기능식품 조성물에 포함되는 흰점박이꽃무지 용매 추출물 및/또는 흰점박이꽃무지 진액 배합물의 유산균 발효물의 제조 공정 중 상기 멸균 및/또는 여과 단계를 거치지 않는 경우, 유산균이 포함된 엑기스 및/또는 쥬스의 형태로 제공될 수 있다. 일 예에서, 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물 및/또는 흰점박이꽃무지 진액 배합물의 유산균 발효물의 제조 공정 중 여과 단계를 수행하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물은 유산균이 포함되지 않는 엑기스 및/또는 쥬스의 형태로 제공될 수 있다.
상기 유산균이 포함된 엑기스 및/또는 쥬스의 형태는 유산균으로 인해 유통기한이 짧아 질 수 있으나 프로바이오틱스(유산균), 프리바이오틱스(흰점박이꽃무지추출액/진액배합 발효물)및 대사산물(DHNA) 함께 섭취 할 수 있어 포스트바이오틱스 형태일 수 있다.
상기 멸균 단계는 본 발명이 제공하는 식품 조성물의 식미 특성을 유지하고, 유효 성분이 물리적 및/또는 화학적으로 손상되지 않는 범위에서 식품에 사용하기 위한 멸균 방법을 제한 없이 사용 가능하며, 예를 들어, 저온 장시간 살균(low temperature long time, LTLT), 고온 단시간 살균 (high temperature short time, HTST), 또는 초고온 살균 (ultra high temperature) 방법이 이용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지 용매 추출물 및/또는 흰점박이꽃무지 진액 배합물의 유산균 발효물을 포함하는 건강기능식품 조성물은, 식품, 사료, 식품 첨가물, 및/또는 사료 첨가물로 활용되기 적절한 염도, 당도 및 pH를 가져 식품으로서의 활용도가 우수하다.
본 발명은 또한, 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 유산균을 접종하여 배양하는 단계를 포함하는, 1, 4-디히드록시-2-나프토산(1, 4-dihydroxy-2-naphthoic acid; DHNA)의 제조 방법을 제공한다.
상기 유산균을 접종하여 배양하는 단계에서, 발효 원료, 유산균의 종류, 접종량 및 배양 조건은 상술한 바와 같다.
본 발명의 DHNA 제조 방법은, 상기 유산균 배양 단계 이후, 여과 및/또는 정제 단계를 추가로 수행하는 것일 수 있다. 상기 정제 단계는 추출물의 정제 및/또는 DHNA의 정제 단계일 수 있다.
본 발명이 제공하는 DHNA 제조 방법은, 식용 곤충으로 활용도가 높은 흰점박이꽃무지로부터 DHNA를 얻을 수 있어 식품, 건강기능식품, 및/또는 식품조성물로서의 활용도가 높다. 상기 DHNA는 장내 비피도박테리움 속 균주의 성장을 촉진할 수 있어, 인간 및/또는 인간을 제외한 동물의 장내 환경 개선 또는 치료용으로 활용될 수 있다.
본 발명이 제공하는 흰점박이꽃무지의 추출물 및/또는 흰점박이꽃무지 진액 배합물의 유산균 발효물은 DHNA를 포함하며, 항산화 활성 및 비피도박테리움 속 균주의 성장 촉진 기능이 우수하여 인간 또는 인간을 제외한 동물의 장내 환경 개선 또는 치료용 물질로 활용될 수 있다.
도 1은 흰점박이꽃무지의 열수추출물(HePb)과 상기 HePb에 탄소원을 첨가한 경우 및 흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea)에서의 유산균 발효시 유산균 생균수(LAB Counts, log cfu/ml)를 측정한 결과 그래프이다.
도 2는 흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea) 및 상기 PbTea에 전분을 첨가한 발효 원료에 유산균 3종을 접종 후 발효 시간에 따른 유산균 생균수(LAB Counts, log cfu/ml)의 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 흰점박이꽃무지의 열수추출물(HePb)및 상기 HePb에 다양한 탄소원을 첨가하여 제조된 유산균 발효물에서 DHNA 생성능을 확인한 얇은막 크로마토그래피(TLC) 결과이다.
도 4는 탄소원(전분) 첨가 유무에 따라 흰점박이꽃무지 열수추출물(HePb) 내 DHNA 함량을 분석한 HPLC 결과 그래프이다.
도 5는 흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea)에 각 유산균을 접종하여 제조된 각 발효물 내 DHNA 생성 여부를 확인한 TLC 결과이다.
도 6은 흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea)에 3종의 유산균을 공접종하여 제조된 각 발효물에서의 발효 시간에 따른 DHNA 함량의 변화를 확인한 TLC 결과이다.
도 7은 항산화 활성 확인을 위해, 실시예 4에 따라 제조된, 각 표시된 시료를 원료로 3종의 유산균을 공접종하여 제조된 발효물의 DPPH 억제율(%)을 측정한 실험의 결과 그래프이다.
도 8은 실시예 5에 따른 각 발효물의 발효 시간 및 비피도박테리움 배양 시간에 따른 비피도박테리움 론검의 성장(Growth)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 5에 따른 각 발효물의 발효 시간 및 비피도박테리움 배양 시간에 따른 비피도박테리움 비피덤의 성장(Growth)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 5에 따른 각 발효물의 발효 시간 및 비피도박테리움 배양 시간에 따른 비피도박테리움 브레브의 성장(Growth)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea) 및 상기 PbTea에 전분을 첨가한 발효 원료에 유산균 3종을 접종 후 발효 시간에 따른 유산균 생균수(LAB Counts, log cfu/ml)의 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 흰점박이꽃무지의 열수추출물(HePb)및 상기 HePb에 다양한 탄소원을 첨가하여 제조된 유산균 발효물에서 DHNA 생성능을 확인한 얇은막 크로마토그래피(TLC) 결과이다.
도 4는 탄소원(전분) 첨가 유무에 따라 흰점박이꽃무지 열수추출물(HePb) 내 DHNA 함량을 분석한 HPLC 결과 그래프이다.
도 5는 흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea)에 각 유산균을 접종하여 제조된 각 발효물 내 DHNA 생성 여부를 확인한 TLC 결과이다.
도 6은 흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea)에 3종의 유산균을 공접종하여 제조된 각 발효물에서의 발효 시간에 따른 DHNA 함량의 변화를 확인한 TLC 결과이다.
도 7은 항산화 활성 확인을 위해, 실시예 4에 따라 제조된, 각 표시된 시료를 원료로 3종의 유산균을 공접종하여 제조된 발효물의 DPPH 억제율(%)을 측정한 실험의 결과 그래프이다.
도 8은 실시예 5에 따른 각 발효물의 발효 시간 및 비피도박테리움 배양 시간에 따른 비피도박테리움 론검의 성장(Growth)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 5에 따른 각 발효물의 발효 시간 및 비피도박테리움 배양 시간에 따른 비피도박테리움 비피덤의 성장(Growth)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 5에 따른 각 발효물의 발효 시간 및 비피도박테리움 배양 시간에 따른 비피도박테리움 브레브의 성장(Growth)을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 발효 원료의 제조
1-1: 흰점박이꽃무지 열수추출물의 제조
흰점박이꽃무지 3령(종령) 유충을 35일간 키우고 3일동안 절식시켜 흰점박이꽃무지 유충의 내장을 깨끗하게 하였다. 상기 얻어진 유충을 60
에서 48시간동안 열풍건조하여 살충 및 건조하고, 식품용 분쇄기를 사용해 분말로 제조하였다. 구체적으로, 식품 분쇄기 사용에 의한 열 발생을 방지하기 위해 1분간 분쇄 후 3분간 휴지하는 분쇄 사이클을 5회 반복하여, 흰점박이꽃무지 유충의 분말(Pb)을 제조하였다.
상기 흰점박이꽃무지 유충의 분말(Pb)을 열수로 추출하고자, 흰점박이꽃무지 유충 분말(Pb) 100g과 물 900ml을 1 : 9 의 비율로 혼합한 후, 초음파를 750 watt, 10 kHz에서 10초 간격으로 5분간 조사하여 혼합하였다(Sonics Vibra-Cell, USA). 다음으로, 상기 혼합물을 60
의 열수에서 4 내지 6시간 동안 진탕하였다. 상기 진탕물을 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하고, 0.45 um corning bottle-top (Sigma, USA)를 사용하여 진공 여과(vacuum filter)하여 흰점박이꽃무지 액상 열수추출물(Hotwater Extract of Protaetia brevitarsis, HePb)을 약 800~ 900ml(80~90%)으로 제조하였다.
상기 액상 열수 추출물을 -70℃에서 보관 후 동결건조하거나 바로 동결건조하여 분말화한 후 이후 실험에 이용되었다.
1-2. 흰점박이꽃무지 진액 배합물 (PbTea) 제조
흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea)은 상기 실시예 1-1에서 제조된 흰점박이꽃무지 액상 추출물(HePb) 20 중량부, 혼합식물추출액 72.12 중량부 및 프락토올리고당 7.88 중량부를 추출 용기에 넣고 밀봉하여 98℃ 에서 6시간 이상 추출한 후, 상기 추출액을 1um의 필터로 여과하고 95℃로 예열한 후, 탈기 탱크에서 이취를 제거하여 제조하였다.
상기 혼합 식물 추출액은 당귀, 천궁, 황기, 숙지황, 작약, 백출, 백봉령, 건강, 대추, 인진쑥, 헛개나무 열매, 계피, 및 감초를 각각 100g씩 혼합하여 정제수 1L에 넣고 (총 1400g/L) 98 ℃에서 열수 추출하여 제조하였다.
실시예 2. 유산균 발효 조건 확립
2-1. 유산균의 분리
상기 실시예 1-1 또는 1-2에서 제조된 흰점박이꽃무지 열수추출물(HePb) 또는 흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea)을 발효 원료로 사용하여 유산균 발효물을 제조하기 위해, 먼저 락토바실러스 플란터룸(L. plantarum, Lp) 및 웨이셀라 파라메센테로이드(W. paramesenteroides, Wp)를 각각 해양심층수와 발효 톱밥에서 분리 및 동정하여 이용하였다.
락토바실러스 플란터룸(L. plantarum)은 해양심층수로부터 분리하였다. 상기 해양심층수는 2015년 11월부터 12월까지 울릉도 태하, 저동 및 현포에서 표층으로부터 수심 200m의 바닷물을 취수하여 냉장 상태로 운반하였다. 상기 해양심층수를 0.1%(v/v) BCP가 첨가된 MRS agar 배지에 도말하여 37℃에서 1일간 배양하였다. 이후 BCP와의 반응에 의해 형성된 노란색 콜로니의 선별을 반복하여 단일 종을 분리하였다.
웨이셀라 파라메센테로이드 균주는 식용 곤충의 먹이인 발효 톱밥에서 분리 및 동정되었다. 상기 식용 곤충의 먹이용 발효 톱밥은 영천곤충산업(대한민국)으로부터 구입하였다. 25℃에서 저장된 발효 톱밥을 PBS에 1%(w/v) 농도로 첨가 후 볼텍스하여 혼합하였다. 상기 발효톱밥 혼합액을 0.1%(v/v) BCP(Bromocresol purple, Sigma, USA)가 첨가된 MRS (Difco, USA) agar 배지에 도말 후 37℃에서 1일간 배양되었다. 상기 BCP는 유산균의 젖산에 의해 산성화되어 노란색 콜로니가 형성되도록 하는 기능을 수행한다. BCP와의 반응에 의해 형성된 노란색 콜로니만을 선별하여 MRS agar 배지에 도말하여 재선별하는 과정을 반복하여 단일 종 총 2종을 분리하였다.
상기 분리된 3종의 균주는 MRS 액체 배지에서 배양하여 50%(v/v) 글리세롤을 혼합하여 최종 글리세롤 농도가 25%가 되도록 한 후, -70℃에서 보관하였다.
2-2. 유산균의 동정
상기 분리된 각 유산균 균주는 16S rRNA의 염기서열 분석을 이용하여 동정되었다. 3종의 균주를 동정하기 위해, 우선 mini genomic DNA extraction kit(Promega)를 이용하여 각 균주의 유전체 DNA(genomic DNA)를 분리하였다.
상기 분리된 유전체 DNA를 주형으로, 하기의 27F 및 1492R 프라이머 세트 및 AccPower PCR premix kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 TaKaRa PCR Thermal Cycler(Japan)으로 상기 균주 3종의 16S rRNA 유전자 부위를 증폭하였다.
- 27F 프라이머 (서열번호 1): 5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3'
- 1492R 프라이머 (서열번호 2): 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
상기 PCR 산물은 PCR clean-up Gel extraction(Macherey Nagel, USA)로 정제하여 ABI3730 DNA analyzer(Applied Bioxyxtems, USA)로 유전자 서열을 분석하였다. 본 발명에서 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주의 16S rRNA 서열은 서열번호 3에, 웨이셀라 파라메센테로이드 균주 2종의 16S rRNA 서열은 서열번호 4 내지 5에 나타내었다.
상기 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주와 웨이셀라 파라메센테로이드 균주의 16s rRNA 서열정보를 이용하여 16S rRNA 서열 유사도 분석을 수행하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 해양심층수로부터 분리된 유산균은 16S rRNA 분석 결과 락토바실러스 플란터룸과 99%의 서열 유사도를 나타내었고, 발효톱밥으로부터 분리된 유산균은 웨이셀라 파라메센테로이드와 99%의 서열 유사도를 보여, 각각 락토바실러스 플란터룸 및 웨이셀라파라메센테로이드로 명명하였다.
| 번호 | 유산균 유래 | 분리 균주 | 근접종 16S rRNA | sequence identity |
| 1 | 해양심층수 | Lactobacillus plantarum DSW#2-4(서열번호 3의 16r RNA) | Lactobacillus plantarum MK311261.1 (서열번호 6) |
99% |
| 2 | 발효톱밥 | Weissella paramesenteroides D12 (서열번호 4의 16r RNA) |
Weissella paramesenteroides AB598954.1 (서열번호 7) |
99% |
| 3 | 발효톱밥 | Weissella paramesenteroides D20(서열번호 5의 16r RNA) | Weissella paramesenteroides LC094432.1 (서열번호 8) |
99% |
상기 분리된 락토바실러스 플란터룸 균주는 한국미생물보존센터(KCCM)에 2018년 8월 10일자로 기탁되었으며, 수탁번호는 KCCM12299P이다. 상기 웨이셀라 파라메센테로이드 균주는 2종 모두 2018년 8월 10일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁되었으며, 각각 Weissella paramesenteroides D12은 수탁 번호 KCCM12300P 및 Weissella paramesenteroides D20는 KCCM12301P을 받았다.
2-3. 유산균 발효 조건 최적화
실시예 1에서의 HePb 및 PbTea을 포함한 발효 원료의 발효 조건 최적화를 위해, 유산균 발효를 효과적으로 일어나게 할 수 있는 최적조건의 탄소원 첨가 필요 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
유산균 배양액(발효 원료)으로는 실시예 1에서 제조된 흰점박이꽃무지 열수추출물(HePb)과 상기 열수추출물과 혼합식물 추출액의 배합물(PbTea)을 각각 1L 이용하였다. 상기 HePb 원료에 각각 2%(w/v) 덱스트로스(D-glucose, Sigma, USA) 80mL, 1%(w/v) 전분(starch, Sigma, USA) 80mL, 2%(w/v) 수크로오스(sucrose, Sigma, USA) 80mL, 또는 2%(w/v) 말토오스(maltose, Sigma, USA) 80mL를 첨가하여 각 배지를 제조하고, 대조군으로는 유산균 배양에 일반적으로 이용되는 MRS 배지를 이용하였다.
상기 제조된 각각의 발효 원료에 L.plantarum (KCCM12299P), W.paramesenteroides (KCCM12300P), W.paramesenteroides (KCCM12301P)을 각각 1x108 cfu/ml 농도로 1mL씩 접종하고 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후의 LAB Counts(log cfu/ml)를 측정하여 최적 발효물 배양 조건을 확인하였다.
상기 LAB Counts는 각 배양액에 아가로스 (BD Difco, USA)를 첨가하여 제작한 고체 배지에 배양물을 1%(v/v)로 희석하여 1 ml을 LAB 플레이트에 도말 후 30℃에서 24시간 배양하여 형성된 콜로니의 수를 측정하여 수행하였다. 각 배양액에서의 유산균 배양 후 LAB Counts 측정결과를 도 1 및 하기 표 2에 나타냈다.
| 배양액 | 유산균 | LAB Counts (log cfu/ml) |
| MRS (대조군) | L. plantarum KCCM12299P | 6.26x109 |
| W. paramesenteroides KCCM12300P | 3.0x108 | |
| W. paramesenteroides KCCM12301P | 1.11x109 | |
| 열수추출물(HePb) | L. plantarum KCCM12299P | 8.0x103 |
| W. paramesenteroides KCCM12300P | 3.21x102 | |
| W. paramesenteroides KCCM12301P | 3.21x102 | |
| HePb + 2% 덱스트로스 |
L. plantarum KCCM12299P | 2.7x1011 |
| W. paramesenteroides KCCM12300P | 5.7x109 | |
| W. paramesenteroides KCCM12301P | 3.17x108 | |
| HePb + 1% 전분 |
L. plantarum KCCM12299P | 5.10x1011 |
| W. paramesenteroides KCCM12300P | 8.10x109 | |
| W. paramesenteroides KCCM12301P | 1.90x1011 | |
| HePb + 2% 수크로오스 |
L. plantarum KCCM12299P | 2.10x1012 |
| W. paramesenteroides KCCM12300P | 1.40x1013 | |
| W. paramesenteroides KCCM12301P | 1.10x1011 | |
| HePb + 2% 말토오스 |
L. plantarum KCCM12299P | 1.90x1011 |
| W. paramesenteroides KCCM12300P | 7.30x109 | |
| W. paramesenteroides KCCM12301P | 1.20x1013 | |
| PbTea | L. plantarum KCCM12299P | 2.40x1015 |
| W. paramesenteroides KCCM12300P | 3.50x1013 | |
| W. paramesenteroides KCCM12301P | 4.00x1014 |
MRS 배지에 L.plantarum을 접종한 경우, 24시간동안 배양한 후 LAB Counts가 6.26x109/ml(6.26E+09)로 측정되었으나, W. paramesenteroides KCCM12301P의 경우 4.53x108/ml (4.53E+08)로 측정되었다. 덱스트로스를 포함하지 않는 HePb 배지에 L. plantarum 을 접종하고 24시간동안 배양한 배양물의 유산균 수는 8.0x103/ml (8.0E+03)에 불과했으며, W. paramesenteroides를 접종한 경우에도 기탁번호 KCCM12300P 및 KCCM12301P 균주 모두 유산균 수가 3.21x102/ml (3.21E+02) 정도의 증식에 그쳤다.
반면, 덱스트로스, 전분, 수크로오스, 말토오스와 HePb 를 포함하는 배지에 L. plantarum 을 접종하고 24시간동안 배양한 배양물의 유산균 수는 각각2.7x1011/ml(2.7E+11), 5.10x1011/ml(5.1E+11), 2.10x1012/ml(2.1E+12), 1.90x1012/ml(1.9E+11)로 증식이 활발히 일어났다. W. paramesenteroides KCCM12300P 를 접종한 경우에 덱스트로스, 전분, 수크로오스, 말토오스 첨가한 배양물의 유산균 수는 각각 3.17x108/ml(3.17E+08), 8.1x109/ml(8.1E+09), 1.40x1013/ml(1.4E+13), 7.30x109/ml(7.3E+09)이고, W. paramesenteroides KCCM12301P를 접종하고 덱스트로스, 전분, 수크로오스, 말토오스 첨가한 배양물의 유산균 수는 각각 5.7x109/ml(5.7E+09), 1.9x1011/ml(1.9E+11), 1.10x1011/ml(1.1E+11), 1.20x1013/ml(1.2E+13)으로 탄소원이 첨가되지 않은 흰점박이꽃무지 추출물(HePb) 보다 증식이 활발하였다.
따라서, 덱스트로스, 전분, 수크로오스, 말토오스 등의 탄소원과 흰점박이꽃무지 추출물을 포함하는 배지가 탄소원을 첨가하지 않은 배지보다 유산균의 생장을 현저히 증가시킴을 확인할 수 있었다.
또한, 흰점박이꽃무지 열수추출물과 혼합 식물 추출물의 배합물(PbTea)을 24시간 배양한 후 LAB Counts가 2.40x1015/ml (2.40E+15)로 측정되었고, W. paramesenteroides KCCM12300P, KCCM12301P 의 경우 각각 3.50x1013/ml (3.50E+13), 4.00x1014/ml (4.00E+14)로 측정되었다. 이에, PbTea의 유산균 발효한 경우, 덱스트로스, 전분, 수크로오스, 말토오스의 탄소원과 HePb 를 포함하는 배지보다 30℃에서 24시간 동안 유산균 증식이 더 활발하여 유산균 배양에 적절함을 확인할 수 있었다.
2-4. PbTea 배양액에서의 유산균 공발효 조건 최적화
상기 흰점박이꽃무지 열수추출물을 포함하는 진액 배합물(PbTea) 배양액에서, 다시 전분의 유무에 따른 유산균의 공배양을 위한 최적 발효 시간 조건을 확인하였다.
상기 PbTea 또는 PbTea에 전분 1%(w/v) 80mL를 혼합한 배지(PbTea + Starch)에 3종의 유산균 L.plantarum (KCCM12299P), W.paramesenteroides (KCCM12300P, KCCM12301P)을 각각 1x108 cfu/ml 농도로 1mL씩 접종하고 30 ℃에서 24시간동안 공배양하였다. 24, 48, 72, 및 96시간 경과 후의 LAB Counts(log cfu/ml)를 측정하여 최적 발효물 배양 조건을 확인하였으며, 측정결과를 도 2 및 하기 표 3에 나타냈다.
| 배양배지 | 배양 시간별 LAB Counts (log cfu/ml) | |||
| 24h | 48h | 72h | 96h | |
| PbTea | 3.9x1014 | 1.1x1015 | 1.8x1013 | 1.0x1009 |
| PbTea + Starch | 5.1x1014 | 1.7x1015 | 1.3x1014 | 9.3x1012 |
PbTea 배지에 3종의 유산균을 접종한 경우, 24, 48시간 및 72 시간 동안 배양한 후 LAB Counts가 3.9x1014/ml(3.9E+14), 1.1x1015/ml(1.1E+15), 1.8x1013/ml(1.8E+13)로 측정되었으나, 96시간 배양이 이루어진 경우에는 1.0x109/ml (1.0E+09)로 측정되어 생균수가 감소하였다. 녹말이 포함된 PbTea + starch 배지에서는 24, 48, 72 시간 및 96시간동안 5.1x1014/ml(5.1E+14), 1.7x1015/ml(1.7E+15), 1.3x1014/ml(1.3E+14) 및 9.3x1012/ml (9.3E+12)로 시료 5의 96시간에 비교하여 더 많은 생균수가 확인 되었다.
실시예 3. 유산균 발효에 의한 DHNA 생성능 확인
3-1. HePb 유산균 발효물의 DHNA 생성능 확인
흰점박이꽃무지 열수추출물(HePb) 및 상기 열수추출물에 덱스트로스, 전분, 수크로오스 또는 말토오스를 첨가한 배양액에서 3종의 유산균을 배양하여 제조한 발효물에서의 DHNA의 생성 여부를 확인하기 위해, 얇은막 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 각 배양액으로는 실시예 2-3에서 사용된 HePb 및 HePb에 덱스트로스, 전분, 수크로오스 또는 말토오스를 첨가한 배양액을 사용하였으며, TLC 수행시 양성대조군으로는 DHNA 표준품(Sigma, USA)을 이용하였다.
각 배양액에는 L. plantarum(KCCM12299P), W. paramesenteroides (KCCM12300P, KCCM12301P)를 각각 접종하여 26℃에서 호기 상태로 96시간 동안 유산균을 배양(발효)하였고, 96시간의 유산균 배양 완료 후 유산균을 10,000 내지 13,000rpm으로 원심분리하여 상청액만을 수집한 후 TLC 시료로 이용하였다.
구체적으로 상기 시료는, 각 유산균 배양액에 동량의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 스핀 다운 후 하부의 물을 제거하고, 상청의 에틸아세테이트 부분만을 진공 농축하였다. 상기 농축된 부분을 메틸알코올(Methyl alcohol, MeOH) 500ul에 용해하여 제조하였으며, 상기 용매를 3ul씩 TLC 플레이트에 점적하여 사용하였다. 대조군으로는 DHNA 0.1%(w/v, 1mg/mL, 100ppm) 표준 용액을 Merck TLC silica GEL(TLC silica gel 60 F254, Merck)에 3 ul씩 점적한 후 용매로 분리하여 각 시료 내 DHNA의 유무를 확인하였다. 상기 TLC에서 분리에 사용된 용매는 메탄올(methanol):아세트산(acetic acid):물(water) 비율이 9:1:1의 부피비가 되도록 혼합하여 이용하였다.
용매 분리 후 결과는 UV램프로 발색하여 확인하였으며, 도 3에 발색 결과 사진을 나타내었다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 덱스트로스가 첨가된 HePb 배양액 및 전분이 포함된 HePb 배양액에서는 L.plantarum (KCCM12299P), W. paramesenteroides (KCCM12300P), W. paramesenteroides (KCCM12301P)의 각 배양액에서 DHNA가 약하게 확인되었으나, 수크로오스와 말토오스를 첨가한 HePb 배양액 시료에서는 DHNA가 확인되지 않았다.
도 3에서 확인 가능한 바와 같이, 발효 흰점박이꽃무지 추출액의 DHNA 함량과 비교하여, 각각 유산균 배양이 덱스트로스와 전분이 첨가된 상태에서 96시간 동안 수행하여 얻은 시료에서 DHNA 생성이 정성적으로 확인되었다.
3-2. 유산균 발효물 내 DHNA 정량분석
상기 실시예 3-1에서 제조되어 DHNA의 생성이 확인된 발효물 중 흰점박이꽃무지 열수추출물(HePb)에 별도의 탄소원 첨가물 없이 유산균을 배양하여 제조된 발효물과, HePb에 1%(w/v) 전분이 첨가된 배양액에 유산균을 배양하여 제조된 발효물의 2종에 대해 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용해 DHNA의 정량 분석을 실시하였다.
먼저, Lyophilized DHNA (sigma, USA) 표준물질을 이용해 DHNA 표준선을 얻었다. 실험군으로는, 실시예 1-1에서 제조된 흰점박이꽃무지 진액배합물 (PbTea) 또는 상기 PbTea 1L에 1%(w/v) 전분 80mL를 첨가하여 제조된 배양액(PbTea + Starch) 20 mL에 L. plantarum과 2종의 W. paramesenteroides 균주를 각각 1x108 cfu/ml 농도로 1mL씩 접종한 후 26℃에서 호기 조건으로 72 시간 배양하여 제조된 발효물과, 흰점박이꽃무지 열수추출물 (HePb) 또는 상기 HePb 1L에 1%(w/v) 전분 80mL를 첨가하여 제조된 배양액(HePb + Starch) 20 mL에 L. plantarum과 2종의 W. paramesenteroides 균주를 각각 1x108 cfu/ml 농도로 1mL씩 접종한 후 26℃에서 호기적인 조건으로 72 시간 배양하여 제조된 발효물을 이용하였다. 상기 발효물에서 상청액 20 mL만을 취하여 30 내지 35℃의 진공회전증발농축기(Eyela, Japan)로 농축하였다. 농축된 각 시료 2 mL에 4 mL 메탄올을 혼합하고 항산화제로 sodium-ascorbate(Sigma, USA)를 최종농도 0.2%(w/v)가 되도록 12 uL 첨가하였다. 상기 혼합물을 10분 정도 볼텍스하고, 3,600 rpm으로 4℃, 10분 동안 원심분리하여 상등액만을 회수하여 30 내지 35℃의 진공회전증발농축기(Eyela, Japan)로 200 uL로 농축하였다. 농축액 200 uL에 메탄올(Methyl alchol) 400ul를 혼합한 후 주사필터(0.45 um: sartorous, Germany)로 여과하여 그 여액을 HPLC 분석용 시료로 사용하였다.
HPLC용 컬럼은 Agilent HC-C18(4.6 x 150 mm, 5 um; Agilent Tech, USA)를 사용하였고 이동상 용액은 아세토니트릴(acetonitrile): 메탄올(methanol): 물(water): 아세트산(acetic acid)의 부피비가 15: 25:225:0.1가 되도록 혼합하여 사용하였으며 암모니아수 (ammonium hydroxide: Sigma, USA)를 이용하여 pH 를 5.5로 조정하였다. 컬럼의 온도는 45℃로 유지시켰으며 유속은 1ml/min으로 하였고, 시료 주입량과 검출파장은 각각 20 ul와 254 nm로 하였다. 도 4에 HPLC 결과 그래프를, 하기 표 4에 각 조건별 DHNA 함량을 나타내었다.
| 시료 | 발효 원료 | 발효 유산균 | DHNA 농도(ppm) |
| DHNA (대조군) | - | - | 1 |
| PbTea-Lp | 흰점박이꽃무지진액배합물 + 1% starch | L. plantarum(KCCM12299P) | 0.2 |
| PbTea-Wp1 | 흰점박이꽃무지진액배합물 + 1% starch | W. paramesenteroides(KCCM12300P) | 0.7 |
| PbTea-Wp2 | 흰점박이꽃무지진액배합물 + 1% starch | W. paramesenteroides (KCCM12301P) | 0.7 |
| HePb-Lp | 흰점박이꽃무지열수추출물 + 1% Starch | L. plantarum (KCCM12299P) | 0.2 |
| HePb-Wp1 | 흰점박이꽃무지열수추출물 + 1% Starch | W. paramesenteroides (KCCM12300P) | 0.6 |
| HePb-Wp2 | 흰점박이꽃무지열수추출물 + 1% Starch | W. paramesenteroides (KCCM12301P) | 0.6 |
| HePb | 흰점박이꽃무지열수추출물 | - | - |
대조군 DHNA는 1ppm로 제조되었다. PbTea + Starch, HePb + Starch에 L. plantarum(KCCM12299P, 시료1)과 2종의 W. paramesenteroides(KCCM12300P, KCCM12301P; 시료2, 3)를 각각 접종하여 72시간 배양한 발효물 내 DHNA는 각각 0.2, 0.7 및 0.7 ppm(0.002 mg/ml, 0.007 mg/ml, 및 0.007 mg/ml)와 0.2, 0.6 및 0.6 ppm(0.002 mg/ml, 0.006 mg/ml, 및 0.006 mg/ml) 였다. 그러나 유산균으로 발효하지 않은 HePb 추출물 내에서는 DHNA가 검출되지 않았다.
따라서 전분의 첨가에 따라 DHNA 생산이 유도되며, 특히 2종의 W. paramesenteroides(KCCM12300P, KCCM12301P)에 의한 발효물의 경우, L. plantarum(KCCM12299P)보다 높은 DHNA 함량을 보여, DHNA 생산에 있어서는 2종의 W. paramesenteroides(KCCM12300P, KCCM12301P)의 발효물의 효율이 보다 높음을 확인하였다(도 4).
3-3. PbTea 유산균 발효물의 DHNA 생성능 확인
상기 실시예 1-2에서 제조된 배합물 (PbTea) 및 상기 배합물에 1%(w/v)의 전분(Starch)가 첨가된 혼합물(PbTea+Starch)의 두 가지 시료에 대해 L.plantarum (KCCM12299P) 및 2종의 W. paramesenteroides (KCCM12300P, KCCM12301P)를 각각 접종해 배양하여, 발효물을 제조한 후, 각 발효물 내에서의 DHNA 생성 여부를 얇은 막 크로마토그래피(TLC)를 이용해 확인하였다.
구체적으로, 상기 PbTea 또는 PbTea+Starch에 각각 L.plantarum (KCCM12299P) 및 2종의 W. paramesenteroides (KCCM12300P, KCCM12301P)를 개별적으로 접종하여 26℃에서 호기 상태로 72시간 또는 96시간 동안 배양해 발효물을 제조하였다.
상기 발효물은 TLC 분석을 위해 상기 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 TLC 분석용 시료를 제조하였으며, 대조군으로는 DHNA 0.1%(w/v, 100ppm) 표준 용액을 사용하였다. 각 시료와 대조군은 Merck TLC silica GEL(TLC silica gel 60 F254, Merck)에 3 ul씩 점적한 후 용매로 분리하여 각 시료 내 DHNA의 유무를 확인하였다. TLC 분석 방법은 상기 실시예 3-1과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다.
도 5에 UV 램프로 발색 확인한 TLC 결과를 나타내었다. PbTea의 발효물에서도 일부 DHNA가 확인되었으나, PbTea+Starch 발효물에서 유산균의 종류에 관계없이 PbTea 발효물에 비해 보다 높은 DHNA 함량이 확인되었다.
3-4. PbTea 의 유산균 공배양에 따른 DHNA 생성능 확인
다음으로, PbTea 또는 상기 PbTea에 1%(w/v) 전분(Starch)이 첨가된 혼합물(PbTea+Starch)에 3종의 유산균을 공접종하여 발효 배양한 발효물 내에서 발효 시간의 경과(48시간, 72시간 및 96시간)에 따른 DHNA 생성량을 TLC 분석으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 PbTea 및 PbTea+Starch에 L.plantarum (KCCM12299P) 및 2종의 W. paramesenteroides (KCCM12300P, KCCM12301P) 를 함께 접종하여 26℃에서 호기 상태로 48시간, 72시간, 또는 96시간 배양하여 각 발효물을 제조하였다. 대조군으로는 DHNA 표준품(Sigma, USA)의 0.5%(w/v, 500ppm) 용액을 이용하였다.
TLC 분석은 상기 실시예 3-3과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었으며, 전개 용매로는 메탄올:물:아세트산 (methanol: water :acetic acid)을 7:3:1의 부피비로 혼합하여 사용하였고, 고정상으로는 TLC(TLC silica gel 60 RP-18 F254, Merck)를 이용하였다.
도 6에 대조군과 각 시료의 TLC 결과를 UV 램프로 발색한 결과를 나타내었다. PbTea의 발효물에서는 DHNA가 발효 시간의 경과에도 불구하고 매우 흐릿하게 관찰된 반면, 전분이 첨가된 PbTea+Starch의 발효물의 경우 모든 발효 시간대에서 PbTea에 비해 선명한(500ppm 이상의) DHNA가 확인되었다.
실시예 4. DHNA 함유 발효물의 항산화 기능성 확인
DHNA의 생산능이 확인된 발효 원료 중, HePb에 1%(w/v) 전분(Starch, Sigma, USA) 80ml이 첨가된 혼합물(HePb+Starch), 흰점박이꽃무지 진액 배합물(PbTea), 및 상기 PbTea에 1%(w/v) 전분(Starch, Sigma, USA) 80ml이 첨가된 혼합물(PbTea+Starch)에 각각 L.plantarum (KCCM12299P), W.paramesenteroides (KCCM12300P, KCCM12301P) 3종의 유산균을 1:1:1의 비율로 공접종하여 발효 배양하여 제조한 발효물의 항산화 기능을 DDPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 자유라디칼 소거 활성 분석을 이용해 확인하였다.
각 발효물은 공접종 후 26℃에서 24, 48, 또는 72시간 동안 유산균 배양을 수행하여 동결건조물로 제조되었으며, 각 제조된 발효물의 동결건조물은 10 mg/mL 농도로 제조하여 0.75%(w/v) NaCl용액에 희석해 1%(v/v) DDPH 분석용 시료로 이용하였다. 저장(Stock) 용액(100mM Tri-HCl, pH 7.4)은 메탄올 1mM에 DPPH를 용해하여 제조하였으며, 분석 실험에서는 100 μM 농도로 희석해 사용하였다.
이어서, 96 웰 플레이트에 앞서 제조한 1%(w/v) 농도의 각각의 시료용액을 10μL씩 분주하고, 대조군으로는 비타민 C(ascorbic acid, sigma)를 사용하였다.
상게 웰 플레이트에 100 μM DPPH를 100 μL씩 첨가하고 차광한 후에 실온에서 10 내지 30 분간 반응을 수행하였다. 이후 517 nm 파장의 빛을 조사해 각 샘플의 흡광도를 측정하였으며, 음성대조군으로는 메탄올 또는 물에 100uL DPPH를 처리하여 흡광도를 측정하여 영점 처리를 수행하였다. 상기 흡광도를 이용해 하기 수학식 1을 이용해 DPPH 억제율(scavenging activity, %)을 측정하여 발효 시간에 따른 항산화 효과의 변화를 확인하였다.
[수학식 1]
DPPH 억제율(scavenging activity, %) = (1-OD sample/OD blind) x 100
상기 수학식 1에서, OD sample은 각 시료(샘플)에서의 흡광도 값을, OD blind는 음성 대조군에서의 흡광도 값을 의미한다.
상기 DPPH 억제율 측정 결과를 하기 표 5 및 도 7에 나타내었다. 도 7은 각 시료에서 측정된 DPPH 억제율 그래프이다.
| 발효물 정보 | 발효시간 | DPPH 억제율 (%) |
| HePb+Starch 유산균 3종 공배양 |
0 | 11.48 |
| 24 | 23.74 | |
| 48 | 23.15 | |
| PbTea 유산균 3종 공배양 |
0 | 43.6 |
| 24 | 37.96 | |
| 48 | 33.82 | |
| PbTea+Starch 유산균 3종 공배양 |
0 | 42.63 |
| 24 | 50.57 | |
| 48 | 44.57 | |
| 비타민C (ascorbic acid, 대조군) | - | 91.7 |
HePb에 유산균 3종을 접종하여 24, 및 48 시간 발효하여 얻어진 발효물의 DPPH 억제율은 각각 23.74%, 및 23.15% 였고, PbTea 발효물의 DPPH 억제율은 배양전에는 43.6%, 24, 및 48 시간 배양물에서는 각각 37.96%, 및 33.82%로 발효 전에 비해 다소 낮은 DPPH 억제율을 나타내었다.
전분이 포함된 흰점박이꽃무지 진액배합물(PbTea+Starch)을 공발효한 발효물의 경우 배양 전 DPPH 억제율은 42.63%이었지만, 24, 및 48시간 배양물의 DPPH 억제율은 각각 50.57%, 및 44.57%로 발효 전에 비해 높은 DPPH 억제율을 나타내었다. 상기 발효물들은 DHNA 생성능이 거의 나타나지 않았던(도 6) PbTea의 경우를 제외하고는 미발효 추출물에 비해 약 2 내지 12%p 높은 DPPH 억제율을 나타내었다. 상기 발효물의 DPPH 억제율은 대조군인 비타민C의 항산화 수치보다는 낮았지만 비교적 높은 항산화 효능을 보였다. 따라서 DHNA를 일정 수준 이상 함유하는 흰점박이꽃무지의 추출물과 진액배합물의 유산균 발효물의 경우, 미발효 추출물과 비교해 항산화 효과가 상승됨을 확인하였다.
실시예 5. DHNA 함유 발효물의 비피도박테리움 속 균주에 대한 성장 촉진 효과 확인
비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 균은 대표적인 장내 유익균으로, 주로 대장에 분포하며 대장균의 증식 억제, 배변활동 강화 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
상기 실시예 4에서 30% 이상의 항산화 효과를 보인 흰점박이꽃무지의 진액 배합물(PbTea)과 1%(w/v) 전분 포함 PbTea(PbTea+Starch)의 각 유산균 발효물이 비피도박테리움 속 균주에 대한 성장 촉진 기능(Bifidogenic Growth Stimulation, BGS)을 갖는 지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 상기 각 발효물은 PbTea 또는 PbTea+Starch를 원료로 하여 L.plantarum (KCCM12299P) 및 2종의 W. paramesenteroides (KCCM12300P, KCCM12301P) 3종의 유산균을 모두 공접종하여 26℃에서 48시간, 72시간, 또는 96시간 동안 발효하여 제조하였다. 각 발효물은 3,600rpm으로 4℃, 10분 동안 원심분리한 후 주사 필터로(0.45 um, Millipore, USA)필터링하여 발효에 이용된 유산균을 제거한 필터액을 준비하였다.
시험 대상이 되는 비피도박테리움 속 균주로는 비피도박테리움 롱검(Bifidoacterium longum, KCCM11207), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum, KCCM3202) 및 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve, KCCM3220)를 이용하였으며, 각 비피도박테리움 속 균주는 RCM(Reinforced Clostridial Medium, Difco, USA) 배지 20mL에서 1x108 cfu/ml 농도로 1mL씩 접종한 후 37
에서 24시간 동안 전배양(pre-culture)하였다.
RCM 배지 5ml에 상기 준비된 발효물의 필터액 100ul를 첨가한 후, 상기 전배양된 비피도박테리움 속 균주를 각각 2%(v/v, 100ul) 접종하여 37
에서 10시간 동안 배양하여, 2, 4, 6, 8 또는 10시간 째에 각 비피도박테리움 속 균주의 성장(Growth)을 600nm에서 흡광도를 측정하여 (OD600) 조건에 따른 성장도를 비교하였다. 대조군으로는 표준 DHNA 0.01%(w/v) 용액을 RCM 배지에 첨가한 후 각 비피도박테리움 속 균주를 배양하였다.
도 8에는 B. longum의 성장 그래프를, 도 9에는 B. bifidum의 성장 그래프를, 도 10에는 B. breve의 성장 그래프를 각각 나타내었으며, 하기 표 6에 각 그래프에 해당하는 수치를 나타내었다.
| 비피도 박테리움 | 구분 | 발효 시간 | 배양 시간에 따른 OD600 | |||
| 0h | 2h | 4h | 8h | |||
| B.longum (KCCM11207) |
RCM 배지 | 24h | 0.1261 | 0.1494 | 0.1879 | 0.3026 |
| PbTea 유산균 공발효물 |
0h | 0.1363 | 0.1573 | 0.1988 | 0.2505 | |
| 48h | 0.1330 | 0.1601 | 0.1964 | 0.2594 | ||
| 72h | 0.1344 | 0.1632 | 0.1987 | 0.2624 | ||
| 96h | 0.1314 | 0.1508 | 0.1898 | 0.2579 | ||
| PbTea+Starch 유산균 공발효물 |
0h | 0.1035 | 0.1218 | 0.1684 | 0.5489 | |
| 48h | 0.1046 | 0.1236 | 0.1749 | 0.5735 | ||
| 72h | 0.1029 | 0.1033 | 0.1254 | 0.5956 | ||
| 96h | 0.1030 | 0.1248 | 0.1660 | 0.5381 | ||
| DHNA(10ppm) | - | 0.1190 | 0.1292 | 0.1280 | 0.1346 | |
| B.bifidum (KCCM3202) |
RCM 배지 | 24h | 0.0976 | 0.1219 | 0.1534 | 0.5693 |
| PbTea 유산균 공발효물 |
0h | 0.1120.16210.14020.40810.7493 | 0.1621 | 0.1402 | 0.4081 | |
| 48h | 0.1132 | 0.1258 | 0.1487 | 0.4376 | ||
| 72h | 0.1349 | 0.1489 | 0.1741 | 0.5009 | ||
| 96h | 0.1119 | 0.1255 | 0.1447 | 0.4163 | ||
| PbTea+Starch 유산균 공발효물 |
0h | 0.1055 | 0.1165 | 0.1669 | 0.6037 | |
| 48h | 0.1040 | 0.1180 | 0.1873 | 0.6524 | ||
| 72h | 0.1065 | 0.1151 | 0.1693 | 0.6394 | ||
| 96h | 0.1072 | 0.1183 | 0.1823 | 0.6640 | ||
| DHNA(10ppm) | - | 0.1047 | 0.1100 | 0.1230 | 0.2598 | |
| B.breve (KCCM3220) |
RCM 배지 | 24h | 0.1190 | 0.1463 | 0.2174 | 0.6805 |
| PbTea 유산균 공발효물 |
0h | 0.1213 | 0.1521 | 0.2069 | 0.2957 | |
| 48h | 0.1605 | 0.1535 | 0.2086 | 0.5718 | ||
| 72h | 0.1419 | 0.2220 | 0.2445 | 0.6622 | ||
| 96h | 0.1222 | 0.1529 | 0.2187 | 0.5810 | ||
| PbTea+Starch 유산균 공발효물 |
0h | 0.1219 | 0.1540 | 0.2981 | 1.0874 | |
| 48h | 0.1312 | 0.1713 | 0.3190 | 1.1662 | ||
| 72h | 0.1221 | 0.1776 | 0.3540 | 1.1527 | ||
| 96h | 0.1182 | 0.1613 | 0.3316 | 1.1263 | ||
| DHNA(10ppm) | - | 0.1130 | 0.1278 | 0.1613 | 0.3993 | |
PbTea의 3종 유산균 발효물(공발효물)보다 PbTea+Starch의 3종 유산균 발효물이 비피도박테리움 롱검(Bifidoacterium longum, KCCM11207) 성장을 약 2.2배이상 촉진하는 것으로 확인되었다. 또한 0.01% DHNA(10 ppm)를 기준으로 하였을 때 PbTea 3종 유산균 발효물(공발효물)에서 약 1.9배, PbTea+Starch의 3종 유산균 발효물은 약 4.4배 높은 성장을 보였다. 비피도박테리움 롱검은 96시간 발효물을 첨가하였을 때보다 48시간 또는 72시간 발효물을 첨가한 경우에 더 잘 성장하였다.
비피도박테리움 속 균주의 최적 배지로 알려져 있는 RCM 배지와 비교할 때, PbTea의 3종 유산균 발효물은 비슷한 성장 양상을 보였으며, PbTea+Starch 3종 유산균 발효물은 RCM 배지에서의 비피도박테리움 롱검의 성장보다 약 1.9배 높은 성장을 보였다.
비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum, KCCM3202)의 경우, PbTea의 3종 유산균 발효물보다 PbTea+Starch의 3종 유산균 발효물(공발효물)에서 발효 시간이 각각 48, 72, 및 96 시간일 때 비피도박테리움 비피덤 균의 성장을 각각 약 2.0배, 1.7배 및 1.9배 이상 촉진하는 것으로 확인되었다.
0.01% DHNA(10 ppm)을 기준으로, 72시간 PbTea 발효물 첨가시 비피도박테리움 비피덤의 성장이 약 1.9배 증가하였고, PbTea+Strach의 3종 유산균 발효물(96시간 발효) 첨가시에는 약 2.5배 높은 성장이 확인되었다. 발효물의 발효 시간을 달리하여 비피도박테리움 비피덤의 성장 촉진 여부를 확인한 결과, 48시간 또는 72시간 또는 96시간 발효물을 첨가한 경우에 모두 잘 성장하였다.
비피도박테리움 속 균주의 최적 배지로 알려져 있는 RCM 배지와 비교할 때, PbTea의 3종 유산균 발효물은 조금 낮은 성장 양상을 보였으며, PbTea+Starch 3종 유산균 발효물은 RCM 배지에서의 비피도박테리움 비피덤의 성장보다 약 1.2배 높은 성장을 보였다.
비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve, KCCM3220)의 경우, PbTea의 3종 유산균 발효물(공발효물)보다 PbTea+Starch의 공발효물이 48, 72, 및 96 시간 발효시 비피도박테리움 브레브 균의 성장을 각각 약 1.5, 1.3 및 1.6배 이상 촉진하는 것으로 확인되었다.
0.01% DHNA(10 ppm)을 기준으로 비피도박테리움 브레브의 성장을 살폈을 때, PbTea 3종 유산균 발효물 첨가시 성장은 72시간 배양에서보다 약 1.7배, PbTea+Strach의 3종 유산균 발효물 첨가시에는 48시간 배양에서보다 약 2.9배 높은 성장이 확인되었다.
비피도박테리움 속 균주의 최적 배지로 알려져 있는 RCM 배지와 비교할 때, PbTea의 3종 유산균 발효물(공발효물)이 첨가되었을 때에는 RCM 배지에서의 성장과 큰 차이를 보이지 않았으나, PbTea+Starch 3종 유산균 발효물이 첨가되었을 때 48시간 발효물에서 RCM 배지에서보다 약 1.7배 높은 비피도박테리움 브레브 균의 성장을 보였다.
비피도박테리움 롱검(Bifidoacterium longum, KCCM11207), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum, KCCM3202) 및 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve, KCCM3220)균은 인간뿐만 아니라 강아지나 고양이 등 동물의 장내에 서식하는 유익균으로 알려져 있다. 본 발명의 전분을 포함하는 흰점박이꽃무지 추출물 또는 진액배합물의 유산균 배양물의 경우, 유산균 접종 후 발효단계를 거침으로써, 장내 유산균의 90%를 차지하며 유해균에 대한 항균 및 면역력 향상 염증억제 등의 기능이 있는 비피도박테리움 롱검(Bifidoacterium longum), 여성질환 예방, 장내유해균 사멸, 백혈구 증식, 면역력 개선 등에 효능이 있는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 대장균 억제, 세균성 설사 억제 효능이 있는 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve)의 성장을 모두 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이로써 비피더스균(또는 비피도박테리움 속 균주)이 생성하는 비타민B1, B6, B12, 엽산 등을 통해 칼슘흡수를 촉진하고 배변활동을 원활하게 할 수 있다. 이에, 본 발명의 흰점박이꽃무지 진액배합물(PbTea)의 3종 유산균 공발효물은 인간 또는 인간을 제외한 동물의 장내 환경 개선 또는 치료용 물질로 사용할 수 있음을 확인하였다.
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fermented Protaetia brevitarsis
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<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 27F primer
<400> 1
agagtttgat cmtggctca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1492R primer
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1472
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus plantarum KCCM12299P 16SrRNA
<400> 3
gaagcagtgg cgggtgctat acatgcagtc gaacgaactc tggtattgat tggtgcttgc 60
atcatgattt acatttgagt gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aacctgccca 120
gaagcggggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgc ataacaactt ggaccgcatg 180
gtccgagctt gaaagatggc ttcggctatc acttttggat ggtcccgcgg cgtattagct 240
agatggtggg gtaacggctc accatggcaa tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg 300
gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360
cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaaggt ttcggctcgt 420
aaaactctgt tgttaaagaa gaacatatct gagagtaact gttcaggtat tgacggtatt 480
taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta cgtggcaagc 540
gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa 600
gccttcggct caaccgaaga agtgcatcgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac 660
agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720
ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag tatgggtagc aaacaggatt 780
agataccctg gtagtccata ccgtaaacga tgaatgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840
ttcagtgctg cagctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa 900
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagct 960
acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacata ctatgcaaat ctaagagatt agacgttccc 1020
ttcggggaca tggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tatcagttgc cagcattaag ttgggcactc 1140
tggtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc 1200
cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aacgagttgc gaactcgcga 1260
gagtaagcta atctcttaaa gccattctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca 1320
tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380
ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac ccaaagtcgg tggggtaacc 1440
ttttaggaac cagccgctaa gtgacagaat gg 1472
<210> 4
<211> 1345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Weissella paramesenteroides KCCM12300P 16SrRNA
<400> 4
cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgctttg tctttaactg atatgacgag 60
cttgctctga tgtgatttta tctgacaaag agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta 120
acctacctct tagcagggga taacatttgg aaacaagtgc taataccgta taataccaac 180
aaccgcatgg ttgttggttg aaagatggtt ctgctatcac taagagatgg acccgcggtg 240
cattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcaatg atgcatagcc gagttgagag 300
actgatcggc cacaatggga ctgagacacg gcccatactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttcca caatgggcgc aagcctgatg gagcaacgcc gcgtgtgtga tgaagggttt 420
cggctcgtaa aacactgtta taagagaaga acggcactga gagtaactgt tcagtgtgtg 480
acggtatctt accagaaagg aacggctaaa tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg 540
ttccaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg cagacggtta tttaagtctg 600
aagtgaaagc cctcagctca actgaggaat ggctttggaa actggatgac ttgagtgcag 660
tagaggaaag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720
gtggcgaagg cggctttctg gactgtaact gacgttgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa 780
acaggattag ataccctggt agtccacacc gtaaacgatg agtgctagat gttcgagggt 840
ttccgccctt gagtgtcgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca 900
aggttgaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc ttgctaatcc tagaaatagg 1020
acgttccctt cggggacaag gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080
gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta ttagttgcca gcatttagtt 1140
gggcactcta gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtgggggatg acgtcaaatc 1200
atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggcatataca acgagtcgcc 1260
aacccgcgag ggtgcgctaa tctcttaaag tatgtctcag ttcggattgt aggctgcaac 1320
tcgcctacat gaagtcggaa tcgct 1345
<210> 5
<211> 1347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Weissella paramesenteroides KCCM12301P 16SrRNA
<400> 5
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cttgctctga tgtgatttta tctgacaaag agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta 120
acctacctct tagcagggga taacatttgg aaacaagtgc taataccgta taataccaac 180
aaccgcatgg ttgttggttg aaagatggtt ctgctatcac taagagatgg acccgcggtg 240
cattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcaatg atgcatagcc gagttgagag 300
actgatcggc cacaatggga ctgagacacg gcccatactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttcca caatgggcgc aagcctgatg gagcaacgcc gcgtgtgtga tgaagggttt 420
cggctcgtaa aacactgtta taagagaaga acggcactga gagtaactgt tcagtgtgtg 480
acggtatctt accagaaagg aacggctaaa tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg 540
ttccaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg cagacggtta tttaagtctg 600
aagtgaaagc cctcagctca actgaggaat ggctttggaa actggatgac ttgagtgcag 660
tagaggaaag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720
gtggcgaagg cggctttctg gactgtaact gacgttgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa 780
acaggattag ataccctggt agtccacacc gtaaacgatg agtgctagat gttcgagggt 840
ttccgccctt gagtgtcgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca 900
aggttgaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc ttgctaatcc tagaaatagg 1020
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<211> 1345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Weissella paramesenteroides 16S rRNA reference AB598954.1
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acaggattag ataccctggt agtccacacc gtaaacgatg agtgctagat gttcgagggt 840
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aggttgaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc ttgctaatcc tagaaatagg 1020
acgttccctt cggggacaag gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080
gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta ttagttgcca gcatttagtt 1140
gggcactcta gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtgggggatg acgtcaaatc 1200
atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggcatataca acgagtcgcc 1260
aacccgcgag ggtgcgctaa tctcttaaag tatgtctcag ttcggattgt aggctgcaac 1320
tcgcctacat gaagtcggaa tcgct 1345
<210> 8
<211> 1347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Weissella paramesenteroides 16S rRNA reference LC094432.1
<400> 8
cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgctttg tctttaattg atatgacgag 60
cttgctctga tgtgatttta tctgacaaag agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta 120
acctacctct tagcagggga taacatttgg aaacaagtgc taataccgta taataccaac 180
aaccgcatgg ttgttggttg aaagatggtt ctgctatcac taagagatgg acccgcggtg 240
cattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcaatg atgcatagcc gagttgagag 300
actgatcggc cacaatggga ctgagacacg gcccatactc ctacgggagg cagcagtagg 360
gaatcttcca caatgggcgc aagcctgatg gagcaacgcc gcgtgtgtga tgaagggttt 420
cggctcgtaa aacactgtta taagagaaga acggcactga gagtaactgt tcagtgtgtg 480
acggtatctt accagaaagg aacggctaaa tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg 540
ttccaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg cagacggtta tttaagtctg 600
aagtgaaagc cctcagctca actgaggaat ggctttggaa actggatgac ttgagtgcag 660
tagaggaaag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720
gtggcgaagg cggctttctg gactgtaact gacgttgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa 780
acaggattag ataccctggt agtccacacc gtaaacgatg agtgctagat gttcgagggt 840
ttccgccctt gagtgtcgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca 900
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atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggcatataca acgagtcgcc 1260
aacccgcgag ggtgcgctaa tctcttaaag tatgtctcaa tttcggaatt gtaggctgca 1320
actcgcctac atgaagtcgg aatcgct 1347
Claims (14)
- 흰점박이꽃무지 용매 추출물의 유산균 발효물을 포함하며,
상기 유산균 발효물은, 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 덱스토로스 첨가배지에서 락토바실러스 플란터룸 (기탁번호 KCCM12299P)을 배양하여 얻어지거나,
상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 전분 첨가배지에서 락토바실러스 플란터룸 (기탁번호 KCCM12299P), 웨이셀라 파라메센테로이드(KCCM12300P) 또는 웨이셀라 파라메센테로이드(KCCM12301P)를 배양하여 얻어지거나,
상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 전분 첨가배지에서 락토바실러스 플란터룸 (기탁번호 KCCM12299P), 웨이셀라 파라메센테로이드(KCCM12300P) 및 웨이셀라 파라메센테로이드(KCCM12301P)를 배양하여 얻어진 것이며,
상기 발효물은 1, 4-디히드록시-2-나프토산(1, 4-dihydroxy-2-naphthoic acid; DHNA)을 포함하는 것인, 비피도박테리움 속 균주의 성장 촉진용 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 비피도박테리움인 것인, 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 발효원료는 식물 추출액 및 프락토올리고당을 더 포함하며,
상기 식물 추출액은, 당귀, 천궁, 황기, 숙지황, 작약, 백출, 백봉령, 건강, 대추, 인진쑥, 헛개나무 열매, 계피, 감초로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 식물의 용매 추출액인 것인, 조성물. - 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품인 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 건강기능식품은 프리바이오틱스 또는 신바이오틱스인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 비피도박테리움 속 균주는 장내에 서식하는 것인, 조성물.
- 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 유산균을 접종하여 배양하는 단계를 포함하는, 1, 4-디히드록시-2-나프토산(1, 4-dihydroxy-2-naphthoic acid; DHNA)의 제조 방법으로서,
상기 배양하는 단계는, 상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 덱스토로스 첨가배지에서 락토바실러스 플란터룸 (기탁번호 KCCM12299P)을 배양하거나,
상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 전분 첨가배지에서 락토바실러스 플란터룸 (기탁번호 KCCM12299P), 웨이셀라 파라메센테로이드(KCCM12300P) 또는 웨이셀라 파라메센테로이드(KCCM12301P)를 배양하거나, 또는
상기 흰점박이꽃무지 용매 추출물을 포함하는 발효 원료에 전분 첨가배지에서 락토바실러스 플란터룸 (기탁번호 KCCM12299P), 웨이셀라 파라메센테로이드(KCCM12300P) 및 웨이셀라 파라메센테로이드(KCCM12301P)를 배양하여 수행하는 것인,
제조방법. - 제9항에 있어서, 상기 발효 원료는 당귀, 천궁, 황기, 숙지황, 작약, 백출, 백봉령, 건강, 대추, 인진쑥, 헛개나무 열매, 계피, 감초로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 식물의 용매 추출물을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제9항에 있어서, 상기 유산균의 배양 단계는, 20 내지 40℃의 온도에서 12 내지 95시간 수행되는 것인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 유산균의 배양 단계 이후, 여과 및 정제 단계로 이루어지는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 공정을 추가로 수행하는 것인, 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190157749A KR102275731B1 (ko) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 흰점박이꽃무지 발효물을 포함하는 미생물의 성장 촉진용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190157749A KR102275731B1 (ko) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 흰점박이꽃무지 발효물을 포함하는 미생물의 성장 촉진용 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210068251A KR20210068251A (ko) | 2021-06-09 |
| KR102275731B1 true KR102275731B1 (ko) | 2021-07-12 |
Family
ID=76415142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020190157749A KR102275731B1 (ko) | 2019-11-29 | 2019-11-29 | 흰점박이꽃무지 발효물을 포함하는 미생물의 성장 촉진용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102275731B1 (ko) |
-
2019
- 2019-11-29 KR KR1020190157749A patent/KR102275731B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Shim, SY. et al., Journal of Life Science (2018) 28(7):827-834 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20210068251A (ko) | 2021-06-09 |
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