KR102275395B1 - 마이크로 스트립 공진기의 다중공진모드를 이용한 병원성 세균검출장치 - Google Patents

마이크로 스트립 공진기의 다중공진모드를 이용한 병원성 세균검출장치 Download PDF

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Abstract

마이크로 스트립 공진기의 다중공진모드를 이용한 병원성 세균검출장치는, 반파장(λ/2) 마이크로스트립 공진기를 구성하는 신호라인과, 신호라인의 일단 및 타단과 소정의 갭을 두고 배치되는 제1 및 제2 포트전극을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

마이크로 스트립 공진기의 다중공진모드를 이용한 병원성 세균검출장치{Pathogenic Bacteria Detection System Using Multiple Resonance Mode of Microstrip Resonator}
본 발명은 병원성 세균검출장치에 관한 것으로서, 더 상세하게는 마이크로 스트립 공진기의 다중공진모드를 이용한 병원성 세균검출장치에 관한 것이다.
감염성 질환은 병원균에 의해 발생하는데, 그 중 박테리아(세균)는 음식과 물에서 가장 흔히 발견되는 병원균이다. 각각의 병원성 박테리아에 의해 서로 다른 질병들이 발생한다. 식품이나 물 샘플에서 병원성 박테리아의 빠른 검출과 실시간 확인은 확산 속도와 강한 저항성을 특징짓고 더 나은 예후를 위한 치료법을 안내하는 데 매우 중요하다
특히 일부 병원성 박테리아는 활성 감염을 일으켜 치명적인 질병으로 변할 수 있다. 예를 들어, 식중독균인 대장균(O157:H7 )은 매우 적은 수가 음식이나 물에서 발견되더라도 치명적인 대장 패혈증을 일으킬 수 있다(10-2 CFU/ml 이하의 농도). 따라서 실시간 및 지속적인 모니터링 시스템을 통해 식품과 물 환경의 병원성 박테리아 오염을 파악하는 것이 중요하다.
지난 수십 년 동안 박테리아 검출에는 현미경, 생리학, 면역학, 분자생물학 기술 등 다양한 전략과 방법이 적용되었다. 이러한 검출 절차는 농축, 선정, 확인의 3단계로 구성된다. 그러나 농축과정은 보통 박테리아 배양 때문에 상당한 시간(균형별에 따라 1~5일)이 소요된다. 이는 병원성 세균의 신속하고 실시간 검출 및 모니터링에 결정적인 단점이다.
따라서 병원성 박테리아에 대한 신속하고 비침습적이며 비접촉적이며 신뢰성 있는 검출, 예를 들어 THz 분광 및 영상, 광학 밀도법, 임피던스 흐름 세포측정법 기법을 위한 새로운 방법이 제안되었다. 그러나 이러한 검출 시스템은 광범위한 영상 또는 신호 처리가 필요하다. 더욱이 이 기구들은 부피가 크고, 비용이 많이 들며, 작업하기 힘들 수 있으며, POC(Point-of-Care) 진단을 위한 소형화 및 후속 개발 가능성이 부족할 수 있다.
M.A. Hahn, P.C. Keng, T.D. Krauss, Flow cytometric analysis to detect pathogens in bacterial cell mixtures using semiconductor quantum dots, Anal. Chem. 80 (2008) 864-872.
본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 다중공진모드 기법을 이용하여 박테리아의 농도별 구분과 이종 박테리아의 식별을 명확하게 할 수 있는 병원성 세균검출장치를 제공한다.
상기 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따르면, 다중공진모드에 따른 공진 주파수, 투과계수(S21) 및 품질인자(Q-factor)의 변화를 토대로 병원성 박테리아의 종류와 농도를 검출하는 병원성 세균검출장치가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 반파장(λ/2) 마이크로스트립 공진기를 구성하는 신호라인과, 신호라인의 일단 및 타단과 소정의 갭을 두고 배치되는 제1 및 제2 포트전극을 포함하는 병원성 세균검출장치가 제공된다.
또한 본 발명에서 신호라인의 일단에 병원성 박테리아의 샘플이 위치한 상태에서 다중공진모드에 따른 공진 주파수, 투과계수(S21) 및 품질인자(Q-factor)의 변화를 토대로 병원성 박테리아의 종류와 농도를 검출하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서 병원성 박테리아는, Escherichia coli 대장균(O157:H7 ) 또는 바실루스 세레우스(Bacillus cereus )인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에 따른 병원성 세균검출장치는 다중공진모드 기법을 이용하여 박테리아의 농도별 구분과 이종 박테리아의 식별을 명확하게 할 수 있다.
즉, 1차에서 4차에 해당하는 다중공진모드의 공진 주파수, 품질인자(Q-factor), 투과계수(S21)를 동시에 고려함으로써 박테리아 오염여부와, 박테리아 간의 차이를 빠르게 구분할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 병원성 세균검출장치의 구성도와 시뮬레이션 결과를 나타낸 도면
도 2는 병원성 세균검출장치를 포함하는 측정 시스템을 나타낸 도면
도 3은 농도가 다른 대장균(O157:H7) 박테리아를 측정한 결과를 나타낸 도면
도 4는 농도가 다른 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 박테리아를 측정한 결과를 나타낸 도면
도 5는 바실루스 세레우스(Bacillus cereus, ATCC 13061)와 대장균(O157:H7, ATCC 43889) 사이의 주파수 패턴을 나타낸 도면
도 6은 바실루스 세레우스(Bacillus cereus, ATCC 13061)와 대장균(O157:H7, ATCC 43889) 사이의 공진 감지 파라미터를 나타낸 도면
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명하기 위하여, 본 발명의 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 설명하기로 한다.
본 발명에서는 식품 매개 병원체인 Escherichia coli 대장균(O157:H7) 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)를 감지하고, 각 병원성 박테리아를 구분할 수 있는 마이크로 스트립 공진기의 다중공진모드를 이용한 병원성 세균검출장치를 제공한다.
병원성 세균검출장치에 병원성 박테리아 샘플 (~ 2 μl)을 로딩 할 때, 각 공진모드의 주파수는 병원성 박테리아의 농도의 증가와 함께 더 낮은 주파수 영역으로 이동한다.
이와 동시에 감소된 투과계수(S21) 및 품질인자(Q-factor)에 기초하여 병원성 박테리아의 존재가 감지 될 수 있다. 공진모드에 따라 감지 파라미터, 즉 공진 주파수, 투과계수(S21) 및 품질인자(Q-factor)의 포괄적인 변화에 기초하여, 병원성 박테리아는 수 나노 초 내에 빠르게 검출되고 구별 될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 병원성 세균검출장치의 구성도와 시뮬레이션 결과를 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하면, 병원성 세균검출장치는 반파장(λ/2) 마이크로스트립 공진기를 구비하는데, 도 1의 (a)와 같이 신호라인(공진기), 제1 및 제2 포트전극(공급라인), 기판 및 접지면으로 구성된다.
도 1의 (b)는 0.5 - 10GHz 주파수 범위에서 시뮬레이션된 병원성 세균검출장치의 투과계수(S21, 빨간색 피크)의 다중공진모드를 나타낸다.
특히, 다중공진모드의 투과계수(S21)는 신호라인(공진기)와 포트전극(공급라인) 사이의 결합 갭(g)에 따라 달라진다. 병원성 세균검출장치는 모멘트 방법에 기초한 전자기 솔버(a full-wave electromagnetic solver)를 사용하여 시뮬레이션 되었다. 결합 갭(g)을 적용에 따라 조절될 수 있다.
도 1의 (c)는 각 공진모드에서 평균 표면 전류 분포를 나타낸다. 즉, f1 = 2.4GHz(제1차 공진 모드), f2 = 4.8GHz(제2차 공진 모드), f3 = 7.2GHz(제3차 공진 모드), f4 = 9.6GHz(제4차 공진 모드). 여기서 빨간색 영역은 녹색 영역에 비해 높은 전류 강도를 나타낸다.
도 1의 λ/2 마이크로스트립 공진기를 구비하는 병원성 세균검출장치는 다음과 같이 제작된다. 먼저 기판 표면에 포토 레지스터(PR)를 스핀 코팅(εr = 9.8, tanδ = 0.0035)한 후 포토 레지스터를 마스크를 통해 자외선에 노출시켰다. 현상 후 인쇄회로기판(PCB) 에칭제를 사용하여 패턴 기판을 식각하였다. 다음으로 아세톤/PR 제거제를 사용하여 나머지 포토 레지스터를 제거했다.
구체적으로는 접착층으로서의 니켈층(두께 범위 ~3~5μm)을 완성된 구리 패턴 상에 코팅한 후 금(두께 범위 ~0.03 - 0.07μm)을 도금하였다.
마지막으로, 솔더 마스크 PCB 잉크로 만들어진 마스킹 레이어 (두께 10 ~ 20 μm)는 측정에 사용된 신호라인(공진기)의 가장자리 부분과 전지전극을 제외한 λ/2 공진기 영역을 표시하는 데 사용된다.
본 발명에서 측정 시스템은 2- 포트 벡터 네트워크 분석기 (VNA) (MS46322A, Anritsu Co.)에 연결된 범용 테스트 고정 지그 (모델 3680-20, Anritsu Co.)를 포함한다. 이 시스템은 검체의 신뢰성 있는 데이터를 얻기 위해 교정 키트(모델 36804B-15M, Anritsu Co)를 사용하여 short-open-load-through 방식으로 정교하게 보정한 후 샘플을 측정한다.
도 2는 병원성 세균검출장치를 포함하는 측정 시스템을 나타낸 도면이다.
도 2의 (a)와 같이 병원성 박테리아의 액체 샘플 (~ 2 μl)이 센서(신호라인)의 가장자리 부분에 떨어졌을 때 - 액적(droplet)을 떨어뜨리는 방식임- , 도 2의 (b)에 도시된 바와 같이 샘플이 즉시 측정된다.
여기서, 세 가지 다른 시험 샘플, 즉, Luria-Bertani (LB) 배지 (대조군 샘플로 사용됨), Escherichia coli 대장균 O157 : H7 박테리아를 함유하는 배지 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus )를 함유하는 배지가 사용되었다.
도 2의 (c)는 신호라인(공진기)과 좌현 전극 사이의 베어 센서(왼쪽 아래 이미지)와 커플링 갭(오른쪽 아래 이미지)을 보여준다.
본 발명의 측정 시스템에서 신호라인(공진기)의 가장자리 부분에 병원성 박테리아가 있는 액체 샘플을 떨어뜨리면 공진 주파수가 즉시 낮은 주파수 영역으로 이동할 뿐만 아니라 공진 피크도 동시에 낮은 투과계수(S21) 레벨로 변화한다.
도 3은 농도가 다른 E-coli 대장균(O157:H7 ) 박테리아를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3을 참조하면, 도 3의 (a)는 샘플 구성, 즉 샘플이 없는 베어센서, LB 매체가 있는 센서 및 대장균이 있는 센서와 관련하여 다중공진모드 기반 센서의 주파수 및 투과계수(S21) 레벨의 전체 변화를 나타낸다.<각각의 농도는 순서대로 0.1 OD / ml (8 × 108 CFU / ml), 0.05 OD / ml (4.0 × 107 CFU / ml) 및 0.01 OD / ml (8.0 × 106 CFU / ml)>
여기서 LB 배지는 시험 샘플의 배경을 최소화화기 위해 빈칸으로 처리되었다. 또한 테스트 샘플에서 E-coli 박테리아를 식별하기 위해 형광 현미경으로 E-coli(GFP) 태그를 붙인 녹색 형광 단백질(GFP)이 이미징 되었다(도 3의 (b))
또한 공진모드에 따른 샘플 구성의 공진 변동을 조사하기 위해 동일한 주파수 대역(Δf = 1GHz) 및 S21 레벨 간격(ΔS21 = 35dB)에 따른 각 공진모드에서 주파수와 투과계수(S21) 레벨이 관측되었다(도 3의 (c) ~ (f)).
도 4는 농도가 다른 바실루스 세레우스(Bacillus cereus ) 박테리아를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4를 참조하면, 도 4의 (a)는 바실루스 세레우스(Bacillus cereus ) 샘플 구성에 관한 다중공진모드 기반 센서의 공진 주파수 및 투과계수(S21)의 전반적인 변화를 보여준다.
LB가 장착된 베어센서와 농도가 서로 다른 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 센서 - (0.1 OD/ml(8 × 108 CFU/ml), 0.05 OD/ml(4.0 × 107 CFU/ml), 0.01 OD/ml(8.0 × 106 CFU/ml) - 가 각 주파수 영역에서 관측되었으며, 이는 Escherichia coli 대장균(O157:H7 ) 샘플과 유사하다.
측정 결과, 바실루스 세레우스(Bacillus cereus ) 박테리아의 공진변화는 일반적으로 Escherichia coli 대장균(O157:H7 )과 유사했다. 도 4의 (b)에 도시된 바와 같이, LB 배지에서 바실루스 세레우스(Bacillus cereus ) 박테리아로 표시된 적색 형광 단백질 (RFP)은 형광 현미경 하에서 이미지화되었다.
앞서 언급한 Escherichia coli 대장균(O157:H7 ) 조사와 마찬가지로, LB 매체와 바실루스 세레우스(Bacillus cereus ) 샘플 구성에 대한 공진편차가 동일한 주파수 대역(Δf = 1GHz) 및 S21 레벨 간격(ΔS21 = 35dB)에 따른 각 공진모드에서 Escherichia coli 대장균(O157:H7 )과 유사하다는 것이 확인되었다(도 4의 (c)-(f)). 이것은 대장균 샘플 구성에서 얻은 결과를 지지하고 각 공진모드에서 공진 피크 패턴의 유사성을 나타낸다.
도 5는 바실루스 세레우스(Bacillus cereus, ATCC 13061)와 대장균(O157:H7, ATCC 43889) 사이의 주파수 패턴을 나타낸 도면이다.
도 5는 다중공진모드에서 각각 3가지 농도를 갖는 Escherichia coli 대장균(O157:H7 )과 바실루스 세레우스(Bacillus cereus )간의 공진변화를 나타낸다.
우선, 공진모드가 높을수록 공진 주파수의 변화는 두 병원성 박테리아의 동일한 농도에서 차이가 더 커지지만, 네 번째 공진모드(도 5의 a4)는 세 번째(도 5의 a3)와 유사한 주파수 변화를 보여주고 있다.
또한, 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 박테리아는 일반적으로 각각의 공진모드에서 Escherichia coli 대장균(O157:H7 ) 보다 낮은 투과계수(S21) 레벨 - 신호 전송 수준 - 을 나타낸다. 그러나 도 5의 c4에서는 바실루스 세레우스(Bacillus cereus ) 박테리아는 Escherichia coli 대장균(O157:H7 ) 보다 더 높은 투과계수(S21) 레벨을 보여주고 있다.
투과계수(S21) 레벨의 차이는 병원성 박테리아, 대장균(Gram- negative)과 B.cereus (Gram-positive)의 세포 구조가 다르기 때문에 발생할 수 있다. 도 5를 전체적으로 고려할 때, 공진 모드의 증가와 함께 낮은 품질 요인(Q-인자)이 되는 공진피크의 넓이를 보여주고 있다.
본 발명에서는 세 가지 감지 매개 변수 - 주파수, 투과계수(S21), 품질인자(Q-factor) - 를 기반으로 다른 샘플 구성을 측정하고 정량적으로 분석했다.
여기에서 품질인자(Q-factor)는 로드된 Q이며, 각 공진모드의 최대에서 3dB의 전체 너비로 측정된다. 즉, 에너지가 가장 높은 주파수에서 양쪽으로 3dB씩 떨어지는 즉, 1/2가 되는 지점의 주파수 대역폭을 의미한다. 즉, Q 값이 높다는 것은 에너지가 샤프하게 집중되는 의미를 갖는다.
로드된 Q 는 <수학식 1> 과 같이 표시할 수 있다.
<수학식 1>
Figure 112019119005921-pat00001
여기에서 fr은 공진주파수이고, △f3db = f2-f1은 3dB 대역폭이다. 데이터는 도 6과 같이 각 공진모드에서 감지 파라미터의 평균값(the mean average values)으로 표시되었다.
도 6은 바실루스 세레우스(Bacillus cereus, ATCC 13061)와 대장균(O157:H7, ATCC 43889) 사이의 공진 감지 파라미터를 나타낸 도면이다. 도 6은 각 샘플 구성과 관련하여 감지 파라미터의 전체 변형을 보여준다.
도 6의 a1-a4에서 공진모드의 증가에 따라 베어 샘플과 LB 샘플의 주파수 변동이 현저하게 증가한다.
또한, 더 높은 병원성 박테리아 (E. coli 및 B. cereus) 농도에서, 주파수 변동 (Δf, 0.01-bare, Δf, 0.05-bare 및 Δf, 0.1-bare)은 점차 낮은 주파수 영역으로 향한다.
이 두 박테리아는 첫 번째 및 두 번째 공진모드와 비교해서 세 번째 및 네 번째 공진모드에서의 주파수 변화로부터 더욱 명확히 구분된다.
또한, 이는 도 6의 b1-b4와 같이 각각의 공진모드에서 투과계수(S21) 레벨 -ΔS21,LB-bare, ΔS21,0.01-bare, ΔS21,0.05-bare, and ΔS21,0.1-bare - 의 변화로부터 구분될 수 있다. 참고적으로 두 번째, 세 번째 및 네 번째 공진모드에서 S21 레벨의 LB 샘플과 관련하여 예상치 못한 결과가 나타났으나, 이는 샘플 특성, 물방울 모양 및 센서에서 물방울 위치 때문일 수 있다.
유사하게, 도 6의 c2는 대장균 농도가 0.1 OD / ml 일 때 바람직하지 않은 결과를 보여준다. 그럼에도 불구하고, 도 6의 c1-c4에서 두 개의 병원성 박테리아는 각각의 공진모드에서 전체적인 품질인자(Q-factor) 변화(ΔQ,LB-bare, ΔQ,0.01-bare, ΔQ,0.05-bare, and ΔQ,0.1- bare) 를 통해 구별될 수 있다.
3가지 감지 파라미터의 종합적인 차이를 고려하여 병원성 박테리아 농도를 명확히 추정하고 각 공진모드에서 병원성 박테리아를 식별할 수 있다. 결과적으로 공진모드가 증가(공진 주파수 증가)함에 따라 서로 다른 두 종의 빈도 차이가 뚜렷하게 높다. 병원성 박테리아는 더 높은 공진모드에서 더 명확하게 구별된다.
결론적으로 본 발명에서 수 나노초 이내에 다중공진모드에 근거해 λ / 2 마이크로파 공진기를 사용하여 병원성 박테리아를 쉽게 검출 할 수 있음을 보여주었다. 특히 액체 샘플의 생체 물질 검출은 주파수 분해능이 낮고 공진 피크 레벨이 낮기 때문에 단일공진모드를 통해 평가하기가 쉽지 않다.
한 방울의 물 또는 식품 시료의 한 부분에서도 병원체를 검출 할 때 단일공진모드의 한계를 극복하기 위해 다중공진모드 기반 센서가 제안되었다. 또한, 이 바이오 센싱 체계는 각 공진모드에서 주파수, S21 레벨 및 Q- 인자의 변동에 기초하여 종합적인 분석물 검출기능을 제공 할 수 있다.
병원성 박테리아의 유전적 특성이 공진모드에 따라 달라지기 때문에 각 공진모드의 변동에 따라 두 가지 유형의 병원성 박테리아와 농도를 구별할 수 있다. 더욱이 공진모드가 증가함에 따라 두 종류의 병원성 박테리아 사이의 불일치가 더욱 뚜렷하게 나타났다.
이것은 박테리아 탐지를 위한 기존의 단일 모드 저항 기반 방법보다 상당한 장점이다. 감지 파라미터는 샘플 구성, 즉 LB 매개체, 대장균 및 바실루스 세레우스(Bacillus cereus ) 박테리아에 대해 빠르고 실시간 반응을 보였다.
Q-인자와 관련하여 성능을 개선하고 강력한 바이오칩 장치에 바람직하지 않은 요소를 제거할 여지가 있지만, 제안된 신속 검출 시스템의 감지 전략은 병원성 박테리아 비침습 검출의 근본적으로 새로운 패러다임을 나타낸다. 이러한 접근방식은 향후 다른 생체 물질 목표물의 실시간 및 신속한 탐지에 좋은 전략이 될 것으로 기대된다.
본 발명의 실시예에 따른 병원성 세균검출장치는 다중공진모드 기법을 이용하여 박테리아의 농도별 구분과 이종 박테리아의 식별을 명확하게 할 수 있다.
즉, 1차에서 4차에 해당하는 다중공진모드의 공진 주파수, 품질인자(Q-factor), 투과계수(S21)를 동시에 고려함으로써 박테리아 오염여부와, 박테리아 간의 차이를 빠르게 구분할 수 있다.
이와 같이, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 반파장(λ/2) 마이크로스트립 공진기를 구성하는 신호라인; 및
    상기 신호라인의 일단 및 타단과 소정의 갭을 두고 배치되는 제1 및 제2 포트전극;을 포함하고,
    상기 신호라인의 일단에 액적(droplet)형태의 병원성 박테리아의 샘플이 제공된 상태에서 수 나노초 이내에 공진 주파수를 증가시키면서 다중공진모드에 따른 공진 주파수, 투과계수(S21) 및 품질인자(Q-factor)의 변화를 토대로 상기 병원성 박테리아의 종류와 농도를 검출하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균검출장치.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 ,
    Escherichia coli 대장균(O157:H7 ) 또는 바실루스 세레우스(Bacillus cereus )인 것을 특징으로 하는 병원성 세균검출장치.
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