KR102273171B1 - 갑상선암 예후 예측용 바이오 마커 - Google Patents

갑상선암 예후 예측용 바이오 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 핵산 또는 이로부터 인코딩된 단백질에 특이적으로 결합하는, 프라이머, 프로브, 또는 항체 중 적어도 하나를 포함하는, 갑상선암 예후를 예측하기 위한 키트를 제공한다.

Description

갑상선암 예후 예측용 바이오 마커 {Biomarkers for predicting prognosis of thyroid cancer}
본 발명은 갑상선암 예후(prognosis)를 예측할 수 있는 바이오 마커에 관한 것이다.
갑상선암은 유병율이 5%에 달할 정도로 흔한 질병으로, 최근 갑상선암에 대한 표적치료제가 개발되고 있으며, 예를 들어, RET/PTC-RAS-MEK-ERK 경로를 표적으로 하는 약물로서 소라페닙(Sorafenib), 파네실 단백질 전이효소 억제제(Farnesyl protein transferase inhibitors), 및 MEK 억제제(MEK inhibitor), 타이로신 키나ㅇ아제를 표적으로 하는 약물로서 모테사닙(motesanib), 악시티닙(Axitinib), 수니티닙(Sunitinib), 반데타닙(Vandetanib), 게피티닙(Gefitinib), 및 c-Met 저해제, 및 VEGF와 bFGF 억제제인 탈리도마이드(Thalidomide), 골수기질세포 억제제인 레날리도마이드(Lenalidomide)와 같은 물질이 승인되거나 임상 연구가 진행 중에 있다.
갑상선암은 최근 조기 진단을 통하여 작은 크기의 암이 급증하면서 매우 좋은 예후를 보이고 있으나, 여전히 일부에서는 전이 및 재발이 진행되어 사망에 이르기 때문에, 진단 초기에 예후를 정확히 예측하여 저위험군에 대해서는 불필요한 치료를 줄이고, 고위험군은 적극적으로 치료하고 관리하는 것이 임상적으로 필요하다.
갑상선암의 예후 인자로서 BRAFV600E 유전자 변이, TERT 프로모터 유전자 변이 등이 알려져 있으나, BRAFV600E 변이는 갑상선암 환자의 60-70%에서 발견될 정도로 흔하지만 암 형성의 초기 단계에 발생하므로, 암의 전이 또는 갑상선암으로 인한 사망과는 직접적인 연관성이 낮은 것으로 여겨진다. 또한 TERT 프로모터 변이는 갑상선암 환자의 약 2-5 % 미만에서 발견될 정도로 드물어서 예후 예측에 큰 도움이 되지 않는 문제가 있다.
Sun Wook Cho, et al., CXCL16 signaling mediated macrophage effects on tumor invasion of papillary thyroid carcinoma, Endocrine-Related Cancer, 2016, vol. 23, pp. 113-124
본 발명은 갑상선암의 예후를 예측할 수 있는 바이오 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 갑상선암의 예후를 예측하기 위한, 패널을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 CXCL16, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 갑상선암의 예후 예측용 키트.
2. 항목 1에 있어서, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 추가로 포함하는, 키트.
3. CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 CXCL16, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 갑상선암의 예후 예측용 조성물.
4. 항목 3에 있어서, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 추가로 포함하는, 조성물.
5. 시료에 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 조성물, 또는 시료에 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하고, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준 또는 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 증가된 경우 갑상선암의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는, 갑상선암 예후를 예측하기 위한 정보 제공 방법.
6. 항목 5에 있어서, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준을 측정하거나, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 정보 제공 방법.
7. 항목 6에 있어서, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, 및 HBEGF 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 증가되거나, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, 및 HBEGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 의해 인코딩되는 단백질의 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 증가되는 경우 갑상선암의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는, 정보 제공 방법.
8. 항목 6에 있어서, RIMBP2, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 감소되거나, RIMBP2, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 의해 인코딩되는 단백질의 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 감소되는 경우 갑상선암의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는, 정보 제공 방법.
9. 항목 5에 있어서, 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는 것은, 갑상선암이 더 높은 TNM (Tumor Node Metastasis) 단계로 진행될 것으로 예측하는 것인, 정보 제공 방법.
10. CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 서열을 포함하는 세포에 분석 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 핵산의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 핵산의 발현량이 감소되는 경우 상기 시료는 갑상선암의 예방 또는 치료용 물질인, 갑상선암 치료용 물질의 스크리닝 방법.
11. 항목 10에 있어서, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, RIMBP2, PGF, 및 EGF 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 세포에 분석 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 핵산의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
12. 항목 11에 있어서, 분석 대상 시료를 접촉시켰을 때 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, 및 HBEGF 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준이 증가된 경우, 상기 시료는 갑상선암의 예방 또는 치료용 물질인, 스크리닝 방법.
13. 항목 11에 있어서, 분석 대상 시료를 접촉시켰을 때 RIMBP2, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준이 감소된 경우, 상기 시료는 갑상선암의 예방 또는 치료용 물질인, 스크리닝 방법.
기존의 암 유전자 패널은 진단의 정확성에 초점을 두었으나, 본 발명은 갑상선암의 초기 진단 시, 또는 일차 수술 후 예후를 예측할 수 있는 유전자 분석 패널에 관한 것으로서, 복수 개의 유전자 조합을 이용함으로써, 예후 진단에 특이도를 높여, 진단 초기부터 불필요한 치료 및 경과 관찰의 수고를 줄일 수 있다. 이를 통해 환자 맞춤형 치료를 통해 환자의 삶의 질을 향상시키고, 의료비용을 절감할 수 있다.
도 1은 다양한 갑상선 조직에서 CXCL16의 발현을 나타낸 것이다: (A)는 CXCL16의 면역 조직화학적 염색 결과로서 대표 이미지 및 정상 갑상선 조직, 양성 종양, 및 유두갑상선암에서 핵 면적당 CXCL16+ 세포의 백분유을 정량화한 것이고, (B)는 SNUH 데이터세트에서 정상 갑상선 조직, 양성 종양, 및 유두갑상선암에서 CXCL16의 mRNA 발현을 나타낸 그래프이고, (C)는 TCGA 데이터세트에서 정상 갑상선 조직, 및 유두갑상선암에서 CXCL16의 mRNA 발현을 나타낸 그래프이고, (D)는 정상 갑상선 조직 및 유두 갑상선암에서 CXCR6의 조직화학적 염색 결과이고, (E)는 정상 갑상선 조직 및 유두 갑상선암에서 CXCR6의 mRNA 발현을 나타낸 그래프이다.
도 2는 TCGA 데이터세트의 인간 유두갑상선암 조직에서 CXCL16의 고발현은 M2 대식세포 및 혈관 신생 관련 유전자와 관련됨을 보여주는 도면이다: (A)는 CXCL16 발현에 따른 BRAFV600E-RAS 점수 (BRS), M2 대식세포- 및 혈관신생-관련 유전자 발현의 히트맵(heat map) 분석 결과이고, (B) 내지 (F)는 각각 CXCL16High 및 CXCL16Low 군에서 M2 대식세포, 혈관 신생, ERK 경로, PI3K/AKT 경로, 및 MAPK 경로를 단일 시료 유전체 세트 증폭 분석을 통해 비교한 결과이다.
도 3은 TCGA 데이터세트로부터 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 고발현이 인간 유두갑상선암에서 나쁜 예후와 관련되어있음을 보이는 그래프이다. (A) CXCL16 단독; 또는 (B) CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2; (C) CXCL16, AHNAK2, THBS2, 및 PLAU 조합에 대한 무재발 생존 Kaplan-Meier 곡선이다.
도 4는 shCXCL16를 사용하여 내인성 CXCL16을 저해함으로써 세포 생존을 감소시킬 수 있음을 나타낸 도이다. 적응용 배지에서 (A)는 BHP10-3SCpshCXCL16 및 BHP10-3Spcontrol 세포 의 CXCL16 농도를 나타낸 것이고, (B)는 FROshCXCL16 and FROcontrol 세포의 CXCL16 농도를 나타낸 것이고, (C)는 BHP10-3SCpshCXCL16 및 BHP10-3Spcontrol 세포의 생존률을 48시간 및 72시간째에 비교한 결과이고; (D) FROshCXCL16 및 FROcontrol 세포의 생존률을 48시간 및 72시간째에 비교한 결과이다.
도 5는 shCXCL16를 이용하여 CXCL16를 저해시키면 이종 이식편 마우스 모델에서 유두갑상선암의 종양 성장을 저해시킬 수 있음을 나타낸다. (A)는 BHP10-3SCpshCXCL16 또는 BHP10-3Spcontrol 세포가 누드 마우스 (군 당 7~9마리)에 피하 이식시킨 후의 대표 이미지 및 피하 세포로부터 종양의 성장 곡선이고, (B)는 (A)의 이종이식편 모델의 종양 조직에서 항-CXCL16, 항-ERG, 및 항-F4/80 항체로 IHC 기법으로 염색한 결과의 대표 이미지 (x400) 및 CXCL16+, ERG+, F4/80+ 세포의 백분율을 나타낸 것이고, (C)는 이종 이식편에서 M2 대식세포 및 혈관 형성 관련 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 것이고, (D)는 FROshCXCL16 또는 FROcontrol 세포가 피하 이식된 누드 마우스(군 당 8마리)에서 FROshCXCL16 또는 FROcontrol 세포로부터의 종양 성장 곡선이다. 대조군 대비 *P < 0.05.
이제 본 발명은 첨부된 도를 참조로 하기에서 더욱 충분히 기술될 것이며, 그러나 본 발명의 전부가 아닌 단지 일부의 구체예가 예시된다. 실제로, 이들 발명은 많은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에 제시된 구체예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수 형태는 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수한 대상을 포함한다.
다양한 케모카인이 암에서 전-종양형성 활성을 갖지만, CXCL16의 작용은 여전히 논란의 대상이었다. 본 발명에서는 CXCL16을 발현하는 유두갑성산암의 분자적 특징을 조사하였다. CXCL16은 양성 또는 정상 갑상선 조직에 비하여 유두갑상선암에서 유의미하게 더 높게 발현되었다. 유두갑상선암에 대한 TCGA 데이터세트에서, CXCL16 발현 증가는 M2 대식세포- 및 혈관 형성-관련 유전자 및 더 높은 TNM 단계를 포함하는 더 나쁜 예후 인자, 및 BRAF V600E 변이와 연관되어 있다. CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2를 포함하는 3개 유전자가 고발현되는 유두갑상선암 군은 발현량이 더 낮은 군에 비하여 좋지 않은 무재발 생존률을 보였다. 또한 shCXCL16을 BPH10-3SCp 세포에 도입하여 내인성 CXCL16을 결손시키고 상기 세포를 무흉선 마우스에 피하 주사한 결과, BHP10-3SCpshCXCL16로부터의 종양은 BHP10-3SCpcontrol로부터의 종양에 비하여 ERG+ 내피 세포 및 F4/80+ 대식 세포 수가 감소되면서 종양 성장이 지연되었다. AHNAK2 및 THBS2를 포함하는 CXCL16 관련 유전자는 BHP10-3SCpcontrol에 비하여 BHP10-3SCpshCXCL16로부터의 종양에서 하향조절되었다. 결론적으로, CXCL16 발현이 증가되는 것은 대식 세포- 및 혈관 형성-관련 유전자와 관련되어 유두갑상선암에서 더 공격적인 표현형과 연관된다.
세포들 중에서 특히 대식세포는 암 발달 전 과정에서 풍부하게 나타나는 세포이다. 임상 연구나 생쥐를 활용한 연구에서 대식세포는 일반적으로 암을 촉진하는 역할을 하는 것으로 나타났다. 원발성 종양(primary tumor)에서, 대식세포는 종양의 혈관 신생성을 자극하고 암 세포의 침윤, 이동능 및 혈관 내 침윤을 증가시킨다. 전이 과정에서 대식세포는 전이 부위를 준비시키며, 암 세포의 혈관 외 탈출, 생존 및 지속적인 성장을 촉진한다. 또한 대식세포는 암의 진행 과정이나 항암 치료 이후의 회복 과정에서 발생하는 자연살해세포(Natural Killer, NK cell)나 T 세포의 암세포 공격을 막는 등 면역억제 역할을 하기도 한다.
본 발명의 일 실시예에서 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 CXCL16, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 갑상선암의 예후 예측용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 조성물은 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, CXCL16, AHNAK2, THBS2, 및 PLAU의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 CXCL16, AHNAK2, THBS2, 및 PLAU에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 갑상선암의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 CXCL16, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 갑상선암의 예후 예측용 키트를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 키트는 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 추가로 포함하는, 갑상선암의 예후 예측용 키트를 더 제공한다. 상기 키트는 키트를 사용하기 위한 방법이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 “바이오 마커”, “유전자 마커” “예후 예측용 마커”, “예후를 예측하기 위한 마커” "진단용 마커”, “진단하기 위한 마커” 또는 “진단 마커”는 상호 교환적으로 사용 가능하고, 생체 내에 존재하는 생물학적 표지물질로써 질병의 진단, 예후, 치료에 대한 반응 등을 나타내거나 예측할 수 있는 물질을 의미하고, 저위험군 갑상선암 환자 유래 세포에 비하여 고위험군 갑상선암 환자 유래 세포에서 증가 양상을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들어, DNA, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 갑상선암 예후 예측용 마커는 CXCL16, 및 AHNAK2, THBS2, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자로서, 고위험군 갑상선암 환자 유래 세포에서 CXCL16, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, 및 HBEGF는 증가된 발현 양을 보이고, RIMBP2, PGF, 및 EGF는 감소된 발현 양을 보인다. 이러한 마커들은 어느 하나의 유전자에 대한 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 어느 하나의 단백질, 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다.
본 발명의 키트가 마이크로어레이(microarray)인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있고, 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.
본 발명의 "프라이머"는 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는, 템플레이트의 특정 위치에 상보적으로 결합할 수 있는 핵산 서열을 의미한다.
프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.
본 발명의 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고 타깃 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오티드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃조건으로 세척하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "항체" 또는 “결합 단백질”이란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 전체 항체 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩티드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 본 발명에서, 상기 항체는 미소입자와 접합된 항체일 수 있다. 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다. 본 발명에서, 상기 항체는 상기 서술한 유전자 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있고, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 키트는 면역분석용 키트이고, 일 실시예에서 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.
상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트는 본 발명에 따른 유전자 마커로부터 코딩된 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.
본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, ELISA 키트, 또는 면역학적 도트 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 예를 들어, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 약 10 bp 내지 30 bp의 길이일 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 복합 마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 갑상선암 예후 예측에 필요한 정보를 제공할 수 있다. 본 발명의 상기 단백질 마이크로어레이는 슬라이드에 결합된 상기 단백질에 대한 다클론 항체 및 상기 단백질에 대한 단일클론 항체와 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 효소 결합 2차 항체를 포함할 수 있다.
단백질 발현수준 측정은 ELISA법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 갑상선암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 갑상선암 예후를 예측할 수 있다.
상기 갑상선암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 갑상선암의 예후를 예측할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 갑상선암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
상기 갑상선암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시할 수 있다. 정상 간 조직 및 갑상선암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
상기 갑상선암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 갑상선암의 예후를 예측할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 “예후”는 환자의 상태나 질병의 치료 결과에 대한 예측을 의미하는 것으로, “예후가 좋다”는 피검자가 저위험군으로 예측되는 경우에 사용되고, 재발 가능성이 낮은 경우, 전이성 암이 아니거나 전이될 가능성이 낮은 경우, 1기 또는 2기 갑상선암이거나 3기 또는 4기 갑상선암으로 발전될 가능성이 낮은 경우, 갑상선암으로 사망할 가능성이 낮은 경우에 사용한다. “예후가 좋지 않다”는 피검자가 고위험군으로 예측되는 경우에 사용되고, 재발 가능성이 높은 경우, 전이성 암이거나 전이될 가능성이 있는 경우, 3기 또는 4기 갑상선암이거나 3기 또는 4기 갑상선암으로 발전될 가능성이 있는 경우, 갑상선암으로 사망할 가능성이 높은 경우를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 예후가 좋지 않은 환자는 시간이 지남에 따라 해당 환자의 갑상선암이 더 높은 TNM (Tumor Node Metastasis) 단계로 진행될 것으로 예측되는 환자를 의미한다.
본 발명의 용어 “예후 진단”은 “예후 예측”과 상호 교환적으로 사용 가능하고, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (예를 들어, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정, 치료에 대한 암의 반응성 결정, 또는 고위험군 및 저위험군의 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예를 들어, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
TNM 단계에서 T는 종양이 발생된 부위와 그 크기 정도를 의미하고, 1기 내지 4기로 구분된다: T0은 종양에 대한 증거가 없는 것을 의미하고, T1에서 a는 종양의 크기가 0.5cm 이하인 것, b는 종양의 크기가 0.5 내지 1cm인 것, c는 종양의 크기가 1 cm내지 2cm인 것을 의미하고, T2는 종양의 크기가 2cm 보다는 크지만 5cm 보다는 크지 않은 것을 의미하고, T3는 종양의 크기가 5cm 이상인 것을 의미하고, T4는 종양의 크기가 매우 크다는 것을 의미한다. TNM 단계에서 N은 주변 림프조직에 종양이 퍼져 있는 것 의미하고, 0기 내지 3기까지로 구분하며, 숫자가 높을수록 주변 림프조직에 종양이 많이 퍼져있고 멀리까지 분포된 것을 의미한다: N0는 림프조직에 종양이 침범되지 않았다는 것을 의미하고, N1 내지 N3은 림프 조직에 종양이 침범한 증거가 나타났다는 것을 의미한다. TNM 단계에서 M은 다른 장기로 전이되었는지 여부를 표시하는 것으로, 0기 내지 1기로 구분하며, 종양이 발생된 부위의 세포와 다른 부위에 나타난 세포가 같을 때 전이가 되었다고 말한다: M0은 종양이 다른 곳으로 전이되지 않았다는 것을 의미하고, M1은 종양이 근접 장기와 부위에 전이됐다는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 “전이”는 장기 또는 조직에 발생한 암 병소로부터 암 세포가 이동하여 다른 장기 또는 조직에 결합하여 증식하는 상태를 의미한다.
본 발명에 따른 갑상선암의 예후 예측 방법은 종양 관련 대식세포(Tumor associated macrophage; TAM)의 침윤과 갑상선암의 나쁜 예후가 연관성이 있음에 기초하여, TAM의 암 진행에 기여를 매개하는 CXCL16과 함께 발현하는 AHNAK2, 및 THBS2유전자를 표적 핵산 서열, 예를 들어 DNA 서열 또는 RNA 서열을 기초로 분석하거나, 표적 단백질 서열을 기초로 분석하여, 정상인의 갑상선 조직에서 측정된 CXCL16의 발현 수준에 비하여 CXCL16 발현 수준이 증가되고 AHNAK2, 및 THBS2 중 하나 이상의 발현이 증가된 경우, 고위험군으로 진단한다.
상기 키트는 AFP 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가적으로 포함하며, 가장 바람직하게는 상기 키트는 AFP 및 CRP 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가적으로 포함하여 갑상선암의 진단 또는 예후를 분석한다. 상기 키트에 AFP 및 CRP의 뉴클레오티드 또는 이에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가하여 갑상선암을 진단하는 경우, 갑상선암 진단의 특이성(specificity) 및 정확성(accuracy)이 매우 높아 진다.
상기 키트는 CRP 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가적으로 포함하여 갑상선암의 진단 또는 예후를 분석할 수 있다.
생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있으며, 본 발명에서 마커로 사용되는 상기 유전자 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열은, 이들 서열과 동일성을 갖는 염기서열 또는 그로부터 코딩되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "발현"은 코딩 서열에 의해 코딩된 생성물의 생물학적 생산을 지칭한다. 대부분의 경우에서, 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열은 전사되어 메신저-RNA(mRNA)를 형성한다. 이어서, 상기 메신저 RNA는 번역되어 관련 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 생성물을 형성한다. 또한, 발현 과정은 RNA 전사 생성물에 대한 추가 가공 단계(예를 들면, 인트론을 제거하기 위한 스플라이싱), 및/또는 폴리펩티드 생성물의 번역-후 가공을 포함할 수 있다.
본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 소변을 의미한다.
핵산에 대해, 본 발명의 용어 "실질적 동일성"은 2개의 핵산 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교되는 경우에 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실과 함께 뉴클레오티드의 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 내지 95%, 또는 적어도 약 98% 내지 99.5%에서 동일한 것을 나타낸다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대해, 용어 "동일한"은 최적으로 정렬되고, 적절한 삽입 또는 결실과 함께 비교되는 경우 2개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다.
2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 개수 / 위치의 전체 개수 × 100)이다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적인 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 이용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미 노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 문헌[Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
예로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 동일, 즉, 100% 동일할 수 있거나, 이는 참조 서열에 비해 특정 정수 개수 이하의 뉴클레오티드 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은 적어도 하나의 뉴클레오티드 결실, 변이 및 변위를 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 변경은 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치, 또는 참조 서열 내의 뉴클레오티드 중 개별적으로 산재된 상기 말단 위치 사이 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적 군 내에 어디에서도 발생할 수 있다. 뉴클레오티드 변경의 개수는 참조 서열 내의 뉴클레오티드의 전체 수에 (100으로 나누어진) 각각의 동일성 퍼센트의 숫자상 퍼센트를 곱 한 후, 참조 서열 내의 뉴클레오티드의 상기 전체 수에서 상기 곱을 공제하거나, 하기 식에 의해 결정된다:
nn≤xn - (xn·y).
상기 식에서, nn은 뉴클레오티드 변경의 개수이고, xn은 참조 서열 내의 뉴클레오티드의 전체 수이고, y는 50% 동일성에 대해 0.50, 60%에 대해 0.60, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85, 90%에 대해 0.90, 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97 또는 100%에 대해 1.00이고, xn 및 y의 임의의 비정수 곱은 xn으로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다. 참조 서열의 폴리뉴클레오티드 서열의 변경은 이러한 코딩 서열에 넌센스, 미스센스 또는 틀이동 돌연변이를 일으켜, 상기 변경 이후 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드를 변경시킬 수 있다.
유사하게, 또 다른 예에서, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 참조 서열과 동일, 즉, 100% 동일할 수 있거나, 이는 % 동일성이 100% 미만이 되도록 참조 서열에 비해 특정 정수 개수 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은 적어도 하나의 아미노산 결실, 보존성 및 비-보존성 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 변경은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 또는 카르복시-말단 위치, 또는 참조 서열 내의 아미노산 중 개별적으로 산재된 상기 말단 위치 사이 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적 군 내에 어디에서도 발생할 수 있다. 제공된 동일성 %에 대한 아미노산 변경의 개수는 참조 서열에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체 수에 (100으로 나누어진) 각각의 동일성 퍼센트의 숫자상 퍼센트를 곱한 후, 폴리펩티드 참조 서열 내의 아미노산의 상기 전체 수로부터 상기 곱을 공제하거나, 하기 식에 의해 결정된다:
na≤xa - (xa·y).
상기 식에서, na는 아미노산 변경의 개수이고, xa는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체 수이고, y는, 예를 들어, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85 등이고, xa 및 y의 임의의 비-정수 곱은 xa로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다.
본원에서 사용되는 용어 "또는 이의 조합"은 이 용어 앞에 나열된 아이템의 모든 순열 및 조합을 나타낸다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 및 특정 상황에서 순서가 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 시료에 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 조성물, 또는 시료에 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는 조성물을 접촉시킨 후, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준 또는 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질 수준을 측정함으로써 갑상선 암의 예후를 예측할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준 또는 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 증가된 경우 갑상선암의 예후가 좋지 않을 것으로 예측한다.
또한, 본 발명에 따른 정보 제공 방법은 CXCL16, 및 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준을 측정하거나, CXCL16, 및 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있고, 이 때, CXCL16, 및 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, 및 HBEGF 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 증가되거나, CXCL16, 및 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, 및 HBEGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 의해 인코딩되는 단백질의 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 증가되는 경우 갑상선암의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하고/거나, RIMBP2, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 감소되거나, RIMBP2, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 의해 인코딩되는 단백질의 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 감소되는 경우 갑상선암의 예후가 좋지 않을 것으로 예측한다.
또한 본 발명의 일 실시예에서, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 서열을 포함하는 세포에 분석 대상 시료를 접촉시키는 단계 및 상기 핵산의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 핵산의 발현량이 감소되는 경우 상기 시료는 갑상선암의 예방 또는 치료용 물질인 것으로 판단하는, 갑상선암 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 방법은 CXCL16, 및 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현량을 더 측정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 분석 대상 시료를 접촉시켰을 때 CXCL16, 및 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, 및 HBEGF 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준 또는 단백질 발현 수준이 증가된 경우, 상기 시료는 갑상선암의 예방 또는 치료용 물질로 판단할 수 있고, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 분석 대상 시료를 접촉시켰을 때 RIMBP2, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준 또는 단백질 발현 수준이 감소된 경우, 상기 시료는 갑상선암의 예방 또는 치료용 물질로 판단할 수 있다.
CXCL16 (NM_022059)은 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 16 (chemokine (C-X-C motif) ligand 16; CXCL16)을 인코딩하는 유전자로서, CXCL16 단백질은 CXC 케모카인 패밀리에 속한 작은 사이토카인이다. CXC 케모카인 도메인, 뮤신-유사 스토크(musin-like stalk), 막관통 도메인 및 SH2에 결합될 수 있는 잠재적 타이로신 포스포릴화 영역을 함유하는 세포질 테일로 구성된다. 염증성 사이토카인 IFN-감마 및 TNF-알파에 의해 CXCL16의 발현이 유도된다.
MMP9 (NM_004994)은 매트릭스 메탈로펩티다아제 9 (matrix metallopeptidase 9; MMP9)를 인코딩하는 유전자로서, MMP9 단백질은 92kDa 타입 IV 콜라게나아제, 또는 92kDa 겔라티나아제 B로 알려져 있으며, 세포외 기질의 분해에 연관된 아연-메탈로프로테이나아제 패밀리에 속하는 효소이다. MMP 패밀리의 단백질들은 배아 발달, 생식, 혈관 생성, 골 발생, 상처 치료, 세포 이동과 같은 통상의 생리학적 프로세스에서 세포외 기질의 분해뿐만 아니라, 관절염, 뇌출혈 및 전이와 같은 병리학적 프로세스에도 관련된다.
XDH (NM_000379)은 잔틴 데하이드로게나아제(xanthine dehydrogenase; XDH)를 인코딩하는 유전자이며, XDH는 퓨린의 산화 대사에 관여되어 있는 몰리브데늄-함유 수산화효소로서, 호모다이머로 존재한다. XDH는 가역적인 설프하이드릴기의 산화 또는 비가역적 단백질 분해 변형에 의해 잔탄 옥시다아제로 전환될 수 있다.
CYTIP (NM_004288)는 사이토헤신-상호 작용 단백질(cytohesin-interacting protein; CYTIP)을 인코딩하는 유전자로서, 2개의 루신 지퍼 도메인 및 C-말단 핵 표적 시그널로 추정되는 펩티드를 포함하고, 소수성 영역을 갖지 않는다. 휴지기의 NK 및 T 세포에서는 거의 발현되지 않는다.
IL8 (NM_000584, NM_001354840)은 인터루킨 8(interleukine 8; IL8)을 인코딩하는 유전자로, IL8은 대식세포 및 표피세포, 기도평활근 세포(airway smooth muscle cell), 및 내피세포 등에 의해 생산되는 케모카인이다. CXCR1 및 CXCR2와 같은 IL8에 결합할 수 있는 다양한 수용체가 세포 막 상에 존재한다. 호중구주성인자로서 알려진 IL8은 표적 세포에서 주화성을 유도하여 감염된 위치로 호중구나 다른 과립구들을 이동시키고, 이들이 도착했을 때 식세포 작용을 촉진한다.
SERPINF1 (NM_002615, NM_001329903, NM_001329904, NM_001329905)는 세르핀 F1 (serpin F1) 또는 PEDF(Pigment epithelium-derived factor)를 인코딩하는 유전자로, 항-혈관 신생, 항-종양 형성 및 향신경 기능을 갖는 다기능성 분비 단백질이다. 포유동물에서 발견되며, 50kDa의 크기를 가지고, 신생혈관(choroidal neovascularization), 심장 질환 및 암과 같은 질병의 치료제로서 연구되고 있다.
PLAU (NM_001145031, NM_002658, NM_001319191)는 세린 프로테아제인 유로키나아제(urokinase) 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화제(urokinase-type plasminogen activator; uPA)를 인코딩하는 유전자이다. 세린 프로테아제는 세포외 기질의 분해 및 종양 세포 이동 및 증식에 연관되어 있고, 플라스미노겐의 Arg-Val 특이적 절단을 통해 플라스미노겐을 플라스민(plasmin)으로 전환시킨다. PLAU 유전자의 특정 다형성은 후발성 알츠하이머와 연관되어 있을 것으로 예상되고,
THBS2 (NM_003247)는 트롬보스폰딘-2(thrombospondin-2)를 인코딩하는 유전자로, 트롬보스폰딘-2는 세포-세포 상호작용 및 세포-매트릭스 상호작용을 매개하는 이황화 결합된 호모트라이머 당단백질이다. 암의 발달에 있어서 역할에 관하여 긍정적인 역할 및 부정적인 역할을 하는 것으로 논란이 있으나, 간엽성 세포의 세포 표면 특성을 조절하고, 세포 부착 및 이동에 연관되어 있는 것으로 발표되었다.
AHNAK2 (NM_138420)는 AHNAK 핵단백질 2(AHNAK nucleoprotein 2; AHNAK2)를 인코딩하는 유전자로, AHNAK2는 상대적으로 짧은 N-말단 및 상대적으로 긴 C-말단 도메인을 갖는다. N-말단의 PSD-95/Discs-large/ZO-1 (PDZ)-유사 도메인은 안정적인 호모다이머를 형성하는 것으로 예상되며, 칼슘 채널 단백질을 통해 칼슘 신호 전달에 역할을 할 것이다.
ADAM8 (NM_001109, NM_001164489, NM_001164490)은 ADAM8(A Disintegrin And Metalloproteinase domain-containing protein 8)을 인코딩하는 유전자로서, ADAM 패밀리에 속하며, 상기 패밀리는 뱀 독 디스인테그린(snake venom disintegrins)와 구조적으로 연관된 막 단백질이다. 수정, 근육 발달 및 신경 발생을 포함하는 세포-세포 상호 작용 및 세포-매트릭스 상호작용을 포함하는 다양한 생물학적 프로세스에 관여된다. ADAM8 단백질은 신경 발생 동안 세포 부착에 관여한다.
MYO1F (NM_012335, NM_001348355)는 미오신-If(myosin-If)를 인코딩하는 유전자로서, 면역계에서 주로 발현되고, 세포 부착 및 이동에 연관될 것으로 예상된다. MYO1F 유전자는 비증후군성 청각 장애와 관련되어 있을 것으로 예상된다.
TYMP (NM_001257989)은 종래에 ECGF1으로 알려지기도 하였고, 티미딘 포스포릴라아제를 인코딩하는 유전자이다. 티미딘 포스포릴라아제는 티미딘을 2-데옥시리보스 1-포스페이트 및 티미딘으로 전환시키고, 생체 내에서 혈관형성을 촉진하고 다양한 내피 세포들의 시험관 내 성장을 자극한다. TYMP 유전자의 변이는 MNGIE (mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy)와 연관된 것으로 보고되었다.
C1QB (NM_000491.4)는 혈청 보체계(serum complement system)의 제1 컴포넌트를 생산하는 C1r 및 C1s와 연관된 혈청 보체 서브컴포넌트 C1q의 B-사슬 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로서, C1q는 6개의 A-사슬, 6개의 B-사슬 및 6개의 C-사슬을 포함하는 18개의 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 각각의 사슬은 N-말단 콜라겐-유사 영역 및 C-말단 C1q 구형 도메인(globular domain)을 포함하고, C1q 결핍은 홍반성 루프스 및 사구체신염과 연관된 것으로 알려졌다.
CD68 (NM_001251, NM_001040059)은 CD68(Cluster of Differentiation 68)을 인코딩하는 유전자로, 단핵구 계통, 순환 중인 대식세포 및 조직 대식세포에 의해 다량 발현된다. CD68 단백질은 막관통 당단백질로, 단핵구, 조직 세포, 거대 세포, 쿠퍼 세포, 및 파골세포(osteoclast)를 포함하는 대식세포의 다양한 세포에서 마커로서 사용된다.
CTSK (NM_000396)은 카텝신 K(Cathepsin K; CTSK) 효소를 인코딩하는 유전자로서, CTSK 단백질은 골 재형성 및 재흡수와 관련된 리소좀 시스테인 프로테아제(lysosomal cysteine proteinase)이고, 주로 파골세포에서 발현된다.
AREG (NM_001657)은 암피레굴린(Amphiregulin; AREG)을 인코딩하는 유전자로서, AREG 단백질은 표피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF) 패밀리에 포함되고, 성상세포, 슈반 세포(Schwann cell) 및 섬유아세포에 대한 마이토겐(mitogen)이며, 자가분비(autocrine) 성장 인자이다. AREG는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)과 상호작용하여 정상 표피 세포의 성장을 촉진한다.
C1QC (NM_172369)는 C1r 및 C1s와 상호작용하여 제1 혈청 보체 시스템을 형성하는 혈청 보체 서브컴포논트인 C1q의 C-사슬 폴리펩티드이다. C1q는 6개의 A 사슬, 6개의 B 사슬 및 6개의 C 사슬을 포함하는 18개의 폴리펩티드로 구성된다.
GDF15 (NM_004864)는 성장/분화 인자 15(Growth/differentiation factor 15)로서, TGF-β 수퍼패밀리에 속한다. GDF-15는 대부분의 장기에서 낮은 농도로 발현되지만, 간, 신장, 심장 및 폐와 같은 장기 손상으로 인해 상향 조절된다. (Zimmers TA, Jin X, Hsiao EC, McGrath SA, Esquela AF, Koniaris LG (June 2005). "Growth differentiation factor-15/macrophage inhibitory cytokine-1 induction after kidney and lung injury". Shock. 23 (6): 543-8.; Hsiao EC, Koniaris LG, Zimmers-Koniaris T, Sebald SM, Huynh TV, Lee SJ (May 2000). "Characterization of growth-differentiation factor 15, a transforming growth factor beta superfamily member induced following liver injury". Molecular and Cellular Biology. 20 (10): 3742-51.; Ago T, Sadoshima J (February 2006). "GDF15, a cardioprotective TGF-beta superfamily protein". Circulation Research. 98 (3): 294-7.)
CD163 (NM_004244, NM_203416, NM_001370145, NM_001370146)은 헤모글로빈-헤모글로빈 복합체에 대한 높은 친화도의 청소 수용체이다. 단핵구/대식세포 계열로부터 세포 표지로 이용되고, 그람 양성 및 그람 음성균에 대한 내인성 면역 센서로서 역할을 한다.
RIMBP2 (NM_015347, NM_001351226, NM_001351227, NM_001351228, NM_001351229)와 연관된 질환은 CD40 리간드 결핍 및 스피노세레벨라 아탁시아 6를 포함한다.
INHBA (NP_002183, NP_002183.1)는 액티빈 및 인히빈 둘 모두의 서브유닛이고, 둘은 반대되는 생물학적 효과를 갖는 긴밀하게 관련된 당단백질이다. INHIBA A 서브유닛은 알파 서브유닛과 결합하여 복수의 FSH 분비 억제제를 형성한다. Inhibin은 생식샘 간질 세포 분화에 부정적으로 작용하고 종양 억제자로서 활성을 갖는 것으로 알려졌다. 또한, inhibin의 혈청 수준은 과립막 세포 종양의 크기를 반영하고, 따라서 초기뿐만 아니라 재발 질환에서도 마커로서 사용될 수 있다.
THBS1 (NM_003246)는 이황화 결합된 호모삼량체 단백질로서, 본 단백질은 세포간 및 세포-메트릭스간 상호작용을 매개하는 점착성의 당단백질이다. 상기 단백질은 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, V형 콜라겐, 및 인테그린 alpha-V/veta-1에 결합될 수 있다.
CCL2 (NM_002982)는 크로모좀 17의 q-아암(arm) 상에서 클러스터링 된 사이토카인 유전자 중 하나이다. 면역 조절 및 염증성 반응에 관여되는 분비 단백질의 수퍼패밀리이이다. 상기 수퍼패밀리는 성숙한 펩티드의 N-말단 시스테인 잔기의 배열에 기초하여 4개의 수퍼패밀리로 나뉜다. 본 케모카인은 2개의 인접한 시스테인 잔기로 특징지어지는 CC 서브패밀리의 일원이다.
IL1B (NM_000576)는 leukocytic pyrogen, leukocytic endogenous mediator, mononuclear cell factor, 및 lymphocyte activating factor로도 알려져 있는 사이토카인 단백질이다. IL-1β 전구체는 세포질 카스파아제 1 (또는 인터루킨 1 베타 전환효소)에 의해 절단되어 성숙한 IL-1β가 생성되며, IL-1β에 의해 유발된, 인플라마좀 수용체 NLRP3에서 변이로 인해 CAPS (Cryopyrin-Associated Periodic Syndromes)와 같은 수 가지의 상이한 자가 면역 질환을 야기한다.
HBEGF (NM_001945)는 EGF 패밀리의 일원으로, NRD1, zinc-finger 및 BTB 도메인 함유 단백질 16, 및 BAG1과 상호작용하는 성장인자이다. HBEGF는 세포 주기 진행, 분자 샤페론 조절, 세포 생존, 세포 기능, 부착 및 세포 이동을 매개하는 역할을 한다.
PGF (NM_002632, NM_001207012, NM_001293643)는 태반 성장 인자로, VEGF 서브패밀리의 일원이며, 혈관 신생에 중요한 역할을 한다. 죽상경화증에서 플라그 염증 및 신생혈관 성장과 관련되어있다. PGF는 자간전증(preeclampsia)에 대한 분자마커로 연구가 진행 중에 있다.
EGF는 상피세포성장인자(Epidermal growth factor)로서, 소변에서 발견되는 분비되는 단백질로서 알려졌고, 턱밑샘 및 이하선을 포함한 인간의 조직에서 발견되었다. EGF는 세포 분화, 증식 및 생존에 영향을 미치는 것으로 알려졌다. 특히 재조합된 인간 EGF는 당뇨병성 족부 궤양의 치료에 이용된다.
하기 실시예는 오직 예시목적으로 의도되며, 어떠한 식이든 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예
실시예 1. 방법
1.1 갑상선 조직 마이크로어레이
기존에 본 발명자가 확립한 갑상선 조직 마이크로어레이(Cho, S. W. et al. Therapeutic potential of Dickkopf-1 in wild-type BRAF papillary thyroid cancer via regulation of beta-catenin/Ecadherin signaling. J Clin Endocrinol Metab 99, E1641-1649 (2014))를 본 발명에서 사용하였다. 파라핀 포매 갑상선 조직 블록을 1993년 1월부터 2003년 12월까지 서울대학교 보라매병원에서 갑상선 수술을 받은 환자로부터 수득하였다.
1.2 서울대학교병원 및 TCGA (The Cancer Genome Atlas) 데이터세트로부터 유전체 데이터의 처리
본 발명자는 서울대학교병원 코호트로부터 77개의 유두갑상선암(papillary thyroid cancers; 유두갑상선암), 25개의 갑상선 소포선종, 및 81개의 정상 갑상선 조직의 mRNA 발현 데이터를 수득하였다. RNA 서열 분석은 종래 알려진 방법에 따라 수행하였으며 (Yoo, S. K. et al. Comprehensive Analysis of the Transcriptional and Mutational Landscape of Follicular and Papillary Thyroid Cancers. PLoS Genet 12, e1006239 (2016).), 검증 세트로서 TCGA의 mRNA 데이터를 사용하였다; 임상 정보, 및 492개의 유두갑상선암 및 59 쌍의 정상 갑상선 조직의 RNA 서열 분석으로부터 수득된 mRNA 발현 데이터를 UCSC Cancer Browser(https://genome-cancer.ucsc.edu)로부터 수득하였다. 조정된 로그 변환법으로 읽은 서열의 표준화된 미가공 계수를 사용하여 (Love, M. I., Huber, W. & Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol 15, 550 (2014).) 차별발현유전자 (differentially expressed genes; DEGs)를 DESeq2로 q-value < 0.05, |Log2(fold change)| ≥ 1, 및 baseMean ≥ 100이 되도록 정의하였다. 수 회의 실험 결과를 조정하기 위하여, Benjamini-Hochberg 정정으로 계산된 q-value를 사용하였다. 히트맵을 제작하기 위하여, Cluster 3.0을 이용하여 계층적 군집화 (hierarchical clustering)에 중심 rlog 값을 적용하였다. BRAF V600E 또는 RAS 변이에 대한 주어진 종양의 유전자 발현 프로필의 유사도를 정량하기 위하여, TCGA에 의해 개발된 mRNA에 기반한 S-score(Cancer Genome Atlas Research, N. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell 159, 676-690 (2014).)를 사용하였다. 음성 BRS 점수 (BRAF V600E-RAS score)를 가진 종양을 BRAF V600E-유사로 정의하고, 양성 BRS를 가진 종양을 RAS-유사로 정의하였다.
또한, GenePattern (http://software.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern/)의 단일 시료 유전체 세트 증폭 분석 (single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)를 각각의 시료에 대한 몇 가지 신호 경로의 활성을 평가하기 위해 사용하였다 (Barbie, D. A. et al. Systematic RNA interference reveals that oncogenic KRAS-driven cancers require TBK1. Nature 462, 108-112 (2009).). 분석 전에 DESeq2로부터의 baseMean 값 (<100)에 따라 전체 시료에 걸쳐 낮은 발현 수준을 갖는 유전자를 제외하였다. PI3K/AKT 및 MAPK 경로에 대하여, Molecular Signatures Database (MSigDB)에서 제공하는 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 데이터베이스를 사용하였다(Kanehisa, M., Sato, Y., Kawashima, M., Furumichi, M. & Tanabe, M. KEGG as a reference resource for gene and protein annotation. Nucleic Acids Res 44, D457-462 (2016).; Liberzon, A. et al. Molecular signatures database (MSigDB) 3.0. Bioinformatics 27, 1739-1740 (2011).). M2 대식 세포 및 혈관 형성에 대하여, 기존의 연구 (Landa, I. et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. J Clin Invest 126, 1052-1066 (2016).; Coates, P. J., Rundle, J. K., Lorimore, S. A. & Wright, E. G. Indirect macrophage responses to ionizing radiation: implications for genotype-dependent bystander signaling. Cancer Res 68, 450-456 (2008).; Lin, S. L. et al. Stimulation of Interferon-Stimulated Gene 20 by Thyroid Hormone Enhances Angiogenesis in Liver Cancer. Neoplasia 20, 57-68 (2018).)에 기초한 유전자 목록을 사용하였다. ERK 점수 역시 TCGA 연구로부터의 52개 유전자 목록을 갖는 ssGSEA로 계산하였다.
1.3 진행 예측 모델
CXCL16 및 M2 대식 세포-관련 유전자, 및 혈관 형성-관련 유전자의 발현으로 재발을 예측하기 위하여, 각각의 유전자 발현을 각각의 유전자의 중간 발현값에 기초하여 2개의 군 (높은 군 및 낮은 군)으로 구분하고, 2가지 내지 4가지 유전자의 조합을 만들었다. 모든 유전자 조합을 재발과의 유의미한 연관성을 찾기 위해 시험하였다. 높게 발현되는 유전자를 가지고 재발 없이 생존한 유두갑상선암 군을 다른 군과 Kaplan-Meier 생존 분석을 이용하여 비교하였다.
1.4 면역 조직 화학 염색
조직 마이크로어레이 또는 이종 이식편 종양으로부터의 포르말린 고정된, 파라핀 포매 조직 절편을 BenchMark XT 자동화 면역 조직 화학 슬라이드 염색 시스템 (Ventata)를 이용하여 설명서에 따라 CXCL16 (Abcam, Cambridge, MA, USA; dilution ratio 1:100), ERG (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA), F4/80 (eBioscience, San Diego, CA, USA, dilution ratio 1:200), 및 Ki-67 (Neomarkers, Fremont CA, USA, dilution ratio 1:500)에 대하여 면역 조직 화학을 이용하여 염색하였다. TUNEL 분석법 (Millipore, MA, USA)을 사용하여 이종 이식편 종양 절편에서 사멸 세포를 검출하였다. 면역활성을 분석하기 위하여, 종양의 중앙 영역을 4등분하고 각각의 등분 및 중앙 영역에서 5 영역을 무작위로 선택하였다. 400x 배율에서 면역활성인 세포를 2명의 임상의가 계수하였고 면적당 양성 세포의 백분율로 나타내었다.
1.5 동물 연구
6주령 암컷 BALB/c 누드 마우스 (Orient Bio, Seongnam-si, Korea)를 구입하여 사용하였다. 갑상선 암 이종 이식편 모델을 제조하기 위하여, shCXCL16를 갖는 세포 (5 × 106/100 μL PBS) 또는 FRO 세포 (2 × 106/100 μL PBS) 또는 대조군을 성장 인자가 최소화된 마트리젤 (70 μL, 4℃; BD Biosciences, San Jose CA, USA)과 혼합하고 누드 마우스의 등에 접힌 피부에 이식하였다. 대식 세포 함유 이소성 종양에 대하여, THP-1 세포 (1.25 × 106/100 μL PBS)를 BHP10-3SCp 세포와 함께 이식하였다. 종양 세포를 이식한 후, 항-CXCL16 항체 또는 IgG (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 복막내 주사로 주 1회 주사하였다. 캘리퍼로 종양 크기를 측정하고 하기와 같이 종양 부피를 계산하였다:
부피 = ½ × a × b 2
a = 장 종양 직경
b = 단 종양 직경.
5 내지 6주 후, 마우스를 안락사시키고 종양을 절제하여 10% 포르말린으로 고정하였다.
1.6 세포 배양
RET/유두갑상선암 재배열을 함유하는 BHP10-3M 세포주의 종양 형성 클론인 인간 유두갑상선암 세포주 BHP10-3SCp을 제조하였다 (Dr. Soon-Hyun Ahn (Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea) and Dr. Gary L. Clayman (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA)). BRAFV600E 및 TERTC250T 변이를 갖는 FRO 세포 (악성 갑상선 암 세포) 및 CDKN2A, RAS, 및 TP53 변이를 갖는 THP-1 세포 (인간 단핵구/대식 세포)를 각각 Dr. June-Key Chung 및 Dr. Hyo-Soo Kim (Seoul National University College of Medicine, Seoul, Republic of Korea)로부터 수득하였다. 모든 세포는 10% 우태아혈청 (FBS)가 포함된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 배지에서 배양하였다.
1.7 CXCL16 shRNA 형질 도입
갑상선 암 세포에서 내인성 CXCL16의 발현을 제거하기 위하여, CXCL16 shRNA를 BHP10-3SCp 및 FRO 세포에 혈질도입시켰다. 구체적으로, 인간 CXCL16-특이적 shRNA(Mission TRCN0000057990 and TRCN0000057991, 1 × 106 TU/mL, pLKO.1 벡터) 및 비-특이적 shRNA 대조군(SHC003) 렌티바이러스 형질도입 파티클을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 1.6 × 104 cells/well 농도로 분주하고 특정 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 파티클을 MOI 5로 형질감염 시켰다. 2일 후에, 형질감염되지 않은 세포가 완전히 사멸될 때까지 퓨로마이신 (Sigma-Aldrich)으로 선별하였다.
1.8 RNA 추출 및 RT-PCR 분석
이종 이식편 종양 및 세포로부터 mRNA를 추출하기 위하여 트리졸(Trizol, (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))을 사용하였고, Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 (Waltham, MA, USA)을 이용해 RT-PCR을 수행하였다. PCR 프라이머 세트는 하기 표 1에 기재하였다.
유전자 프라이머 서열 (5'→3')
IL-8 ForwardReverse TGT GAA GGT GCA GTT TTG CCA AGG
GTT GGC GCA GTG TGG TCC ACT C
MMP9 ForwardReverse TCG AAC TTT GAC AGC GAC AAG
GCA CTG AGG AAT GAT CTA AGC
PLAU ForwardReverse CTC ATC CTA CAC AAG GAC TAC
CAG GCA GAT GGT CTG TAT AGT
ADAM8 ForwardReverse CGA TGA TGC TGC CTG CGA TTG
CGC AGG TGG AGG GTG AAG TT
THBS2 ForwardReverse TTA CCG CTT CGT GCG CTT TGA C
AAC AGC GTG CCC CTG GAC TTG
AHNAK2 ForwardReverse TCC TGG TGG AAG CGA GAT TCA G
ACC ACC TGT GAC ACT GTA GCC A
XDH ForwardReverse GTG GAT GCT GTG GAG GAG AT
TGC TTC CGA GGA GTG TCT TT
GAPDH ForwardReverse TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC
GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG
1.9 통계적 분석
본 명세서에서 데이터는 평균 및 표준편차로 나타내었다. 연속 변수는 Kruskal-Wallis 테스트 또는 Mann-Whitney U 테스트로 분석하였다. 재발되지 않은 생존 곡선은 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 작성하였고 로그 순위 검정을 사용하여 비교하였다. 통계학적 분석은 윈도우용 SPSS version 22.0 소프트웨어(SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하였고, P < 0.05를 통계학적으로 유의미하게 간주하였다.
실시예 2. 결과
2.1 일반 갑상선 조직 또는 양성 종양에 비해 갑상선 암 조직에서 CXCL16 발현이 증가된다.
다양한 갑상선 조직에서 CXCL16의 발현을 비교하기 위하여, 항- CXCL16 항체를 사용하여 21개의 정상 갑상선 조직, 40개의 양성 종양, 및 148개의 유두갑상선압으로 구성된 조직 마이크로어레이 상에서 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. CXCL16 단백질 발현은 양성 종양 (P < 0.001) 또는 정상 갑상선 조직 (P < 0.001)에 비하여 유두갑상선암에서 현저하게 증가하였다 (도 1A). 또한, 81개의 정상 갑상선 조직, 25개의 갑상선 양성 종양, 및 77개의 유두갑상선암을 포함하는 SNUH 코호트의 RNA 서열분석 결과를 통해, CXCL16는 정상 갑상선 조직 또는 양성 종양에 비하여 유두갑상선암에서 현저하게 상향조절되었음을 확인하였다 (P < 0.001, 도 1B). 또한, 50개의 정상 갑상선 조직 및 492개의 유두갑상선암을 포함하는 TCGA 데이터세트에서도 유사한 경향을 확인하였다. CXCL16는 정상 갑상선 조직에 비하여 유두갑상선암에서 현저하게 상향조정 되었다 (P < 0.001, 도 1C). CXCL16의 수용체인 CXCR6의 유두갑상선암 조직에서의 발현은 종래 연구에서 설명된 바 있다 (Cho, S. W. et al. CXCL16 signaling mediated macrophage effects on tumor invasion of papillary thyroid carcinoma. Endocr Relat Cancer 23, 113-124 (2016).). CXCR6는 유두갑상선암 종양 미세환경에서 암 및 기질 세포 모두에서 발현되었다. 본 발명자는 정상 조직 및 유두갑상선암 조직에서의 CXCR6 발현을 비교하였다. 면역 조직 화학 염색을 통해, 정상 갑상선 상피 세포 및 유두갑상선암 암세포 사이에 발현 수준이 유사함을 확인하였다 (도 1D). 또한, SNUH 코호트의 RNA 서열분석 결과에서도 CXCR6는 정상 갑상선 조직과 유두갑상선암에서 유사하게 발현되었음을 확인하였다 (도 1E).
2.2 CXCL16의 mRNA 발현 증가는 인간 유두갑상선암에서 더 나쁜 예후와 관련된다.
CXCL16를 발현하는 유두갑상선암의 임상 병리학적 특징을 확인하기 위하여, TCGA 데이터세트를 추가로 분석하였다. 492명의 유두갑상선암을 CXCL16 발현값의 중앙값에 기초하여 CXCL16low 군과 CXCL16high 군으로 분류하고, 두 군 간의 임상 병리학적 특징을 비교하였다 (표 2).
Figure 112019116873662-pat00001
CXCL16low 군에 비하여 CXCL16high 군은 큰 세포 변이 (tall-cell variant), 갑상선 피막 침범(extrathyroidal extension), 림프절 전이, 및 더 높은 TNM 단계를 포함한 악성의 병리학적 표현형을 보였다 (P < 0.001; 표 2). CXCL16high 군은 CXCL16low 군에 비하여 BRAFV600E 변이가 더 많이 발견 되었다 (63.3% vs 31.2%, P < 0.001; 표 2). 또한, CXCL16 발현은 BRAFV600E-RAS 점수 (BRS)에 대하여 유의미하게 부정적인 연관성을 나타내었으며 (r = 0.772, P < 0.001), 이는 CXCL16high 군에서 종양이 BRAF V600E-유사 전사 프로필을 갖는다는 사실을 의미한다. 종합하여 보면, CXCL16의 고발현은 나쁜 임상병리학적 예후 인자와 관련됨을 알 수 있다.
2.3 CXCL16의 고 mRNA 발현은 M2 대식 세포 및 인간 유두갑상선암에서 혈관 형성 관련 유전자와 연관된다.
CXCL16high 군의 분자적 특징을 확인하기 위하여, 유두갑상선암에서 M2 대식세포의 증가된 침윤 및 증가된 혈관 형성이 종양의 공격성(aggressiveness)의 원인으로 알려져 있으므로, 55개의 M2 대식세포 관련 유전자 및 65개의 혈관 형성 관련 유전자를 포함한 120개의 유전자를 분석하였다. 총 120개의 유전자를 관찰하였고 26개의 유전자가 CXCL16low 군과 CXCL16high 군에서 상이하게 발현되었다 (도 2A). 상이하게 발현된 유전자(차별발현유전자)를 분석한 결과, 11개의 M2 대식 세포 관련 유전자 및 12개의 혈관 형성 관련 유전자가 유의미하게 상향조절되었고, 1개의 M2 대식세포 관련 유전자 (RIMBP2) 및 2개의 혈관 형성 관련 유전자 (PGF 및 EGF)가 CXCL16low 군에 비하여 CXCL16high 군에서 유의미하게 하향조절되었다 (도 2A, 및 표 3). 또한, 단일 시료 유전자 세트 증폭 분석 (single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)을 통해 68개의 유전자를 포함하는 M2 대식 세포 유전자 특성 (도 2B) 및 65개의 유전자를 포함하는 혈관 형성 관련 유전자 특성 (도 2C)이 CXCL16low 군에 비하여 CXCL16high 군에서 높게 발현됨을 확인하였다. 경로 분석을 통해 ssGSEA로부터 ERK score (P < 0.001; 도 2D), PI3K/AKT (P = 0.03; 도 2E) 및 MAPK (P = 0.03; 도 2F) 경로 관련 유전자가 CXCL16high 군에서 CXCL16low 군보다 현저하게 상향조절됨을 확인하였다.
baseMean Fold change
(log2)		 SE of log2 fold change p-value p-adj
CXCL16 3367.9 1.07 0.04 4.9229E-149 9.9212E-145
M2 대식세포 관련 유전자
ADAM8 421.3 1.53 0.09 2.35457E-64 6.87705E-62
MYO1F 787.8 1.31 0.09 1.81998E-49 1.23912E-47
AHNAK2 6327.5 1.82 0.13 2.09689E-45 1.0257E-43
C1QB 4223.1 1.47 0.11 1.19167E-43 4.90119E-42
CTSK 1686.3 1.45 0.10 1.76627E-43 7.14771E-42
C1QC 3234.7 1.35 0.10 3.15713E-41 1.04134E-39
CYTIP 464.6 1.54 0.12 1.33812E-37 3.42657E-36
XDH 167.8 1.79 0.21 4.09276E-18 2.527E-17
GDF15 6349.5 1.07 0.13 6.87204E-17 3.88368E-16
CD68 3755.0 1.46 0.09 6.65452E-57 8.82293E-55
CD163 1500.1 1.24 0.10 1.39156E-32 2.43861E-31
RIMBP2 217.3 -1.19 0.12 4.84637E-23 4.20987E-22
혈관 형성 관련 유전자
IL8 496.8 1.94 0.14 3.53832E-43 1.38731E-41
THBS2 2601.0 1.79 0.13 6.31159E-42 2.17804E-40
TYMP 2210.1 1.13 0.09 9.34866E-34 1.77238E-32
INHBA 203.5 1.64 0.14 1.93868E-32 3.36522E-31
SERPINF1 2210.7 1.35 0.11 3.36127E-32 5.71162E-31
PLAU 10500.5 1.50 0.13 1.77974E-31 2.86021E-30
THBS1 5572.3 1.32 0.12 3.13788E-30 4.59243E-29
CCL2 849.6 1.10 0.12 1.2055E-21 9.62918E-21
MMP9 2366.6 1.37 0.14 2.16025E-21 1.69663E-20
AREG 200.2 1.49 0.16 6.94046E-21 5.28014E-20
IL1B 166.7 1.00 0.12 7.57222E-16 3.97094E-15
HBEGF 3440.9 1.01 0.13 2.43054E-15 1.22212E-14
PGF 4565.0 -1.48 0.12 2.58213E-37 6.48849E-36
EGF 114.7 -1.29 0.14 6.22895E-21 4.7514E-20
2.4 CXCL16 및 관련 유전자의 조합을 통해 유두갑상선암 환자의 무재발 생존을 예측하였다.
CXCL16의 고발현 단독으로는 암 재발과 유의적으로 연관되지 않기 때문에 (표 2 및 도 3A), CXCL16 및 이의 관련 차별발현유전자를 조합함으로써 예측용 유전자 패널을 제조하였다. 흥미롭게도, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 3개 유전자의 조합은 병의 재발을 유의미하게 예측할 수 있었다 (도 3B). CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 3개 유전자가 고 발현되는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 더 짧은 무재발 생존을 보였다 (p=0.047). 또한, C1QC, TYMP, PLAU, MMP9, CYTIP, 또는 ADAM8를 포함하는 다른 4번째 유전자를 유전자 패널에 추가하면 예측 값을 강화시킬 수 있었다. 도 3C는 4 유전자 패널을 사용한 대표적인 Kaplan-Meier 곡선을 보여준다. CXCL16, AHNAK2, THBS, 및 PLAU 유전자가 더 높게 발현되는 유두갑상선암은 그렇지 않은 군에 비하여 더 짧은 무재발 생존을 나타냈다 (P=0.019).
2.5 유두갑상선암 종양에서 CXCL16 저해의 치료학적 효과 ( in vivo )
진행된 갑상선암에서 CXCL16를 저해시키는 것의 치료학적 유용성을 확인하기 위하여, 쥐 전이성 종양 이종 이식편 모델을 사용하여 동물 실험을 수행하였다. 먼저, shCXCL16를 2개의 암 세포주인 BHP10-3SCp 및 FRO에 형질전환시켜서 내인성 CXCL16을 유전적으로 결손시켰다. ELISA 분석을 통해, 분비된 CXCL16 농도가 BHP10-3SCpshCXCL16 및 FROshCXCL16의 적응용 배지(conditioned medium)에서 BHP10-3SCpcontrol 및 FROcontrol 세포 (형질전환되지 않은 세포를 의미함)에서 각각 67% 및 96%씩 감소하였다 (도 4A, B). 72시간 재의 세포의 생존력은 각각의 대조군 세포에 비하여 BHP10-3SCpshCXCL16세포에서 79.2%, FROshCXCL16세포에서 57.4%씩 유의미하게 감소하였다 (도 4C, D). 전이 종양 모델을 통해, 면역 조직 화학적으로 염색된 BHP10-3SCpshCXCL16세포로부터의 종양은 CXCL16 양성뿐만 아니라 ERG 양성 상피 세포 및 F4/80 양성 대식 세포가 BHP10-3SCpcontrol 세포에 비하여 BHP10-3SCpshCXCL16 세포로부터의 종양에서 유의적으로 감소하였다(도 5B).
TCGA 데이터세트에서 CXCL16low 및 CXCL16high 군 사이의 차별발현유전자가 CXCL16에 의해 직접적으로 조절되었는지 확인하기 위하여, BHP10-3SCpcontrol 및 BHP10-3SCpshCXCL16 세포의 전이 종양으로부터 전체 RNA를 수득하였다. 흥미롭게도 M2 대식세포 및/또는 혈관 형성 관련 차별발현유전자, 예를 들어, IL-8, MMP9, PLAU, ADAM±¡¾8, THBS2, AHNAK2, 및 XDH는 BHP10-3SCpcontrol 세포에 비하여 BHP10-3SCpshCXCL16 세포의 종양에서 유의미하게 하향조절되었다 (도 5C). 이와 동일하게, FROcontrol 세포에 비하여 FROshCXCL16 세포로부터의 종양에서 종양 성장이 유의미하게 지연되었다 (도 5D).
누적된 증거들을 통해 조직 특이적 방식으로 다양한 사이토카인이 전-종양생성 활성을 매개함을 확인하였다. 본 발명에서, TCGA 데이터세트 분석을 통해 CXCL16 발현이 증가되는 것은 M2 대식 세포 및 혈관 형성 관련 유전자 발현과 관련되고, BRAF V600E 변이 및 더 높은 TNM 단계를 포함한 나쁜 예후 인자와 연관됨을 확인하였다. CXCL16 단독은 질환 예후를 예측하지 못하였지만, CXCL16과 함께 AHNAK2, 및 THBS2의 2개의 관련된 차별발현유전자를 포함하는 3개 유전자의 조합을 통해 무재발 생존을 예측하였다. 쥐 전이 종양 모델에서, CXCL16이 결여된 유두갑상선암 세포는 종양 성장, 대식 세포 침윤, 및 종양 혈관 형성이 유의미하게 감소되었다. 또한, 인간 연구 종양으로부터 상향 조절된 CXCL16 관련 차별발현유전자는 CXCL16 결핍 세포로부터 종양에서 유의미하게 감소하였으며, 이는 CXCL16이 유두갑상선암 종양 미세환경의 전종양형성 조건을 적극적으로 조절할 수 있음을 암시한다. 종합하여보면, CXCL16을 포함하는 3개 유전자 패널은 유두갑상선암에 대한 좋지 않은 예후를 예측할 수 있다.
종래 연구에서, CXCL16을 종양 관련 대식 세포 (tumor associated macrophage, TAM)으로 묘사하면서 TAM-매개 세포 이동 및 유두갑상선암의 침임 잠재성을 뒷받침하였다. 본 발명에서는 CXCL16의 발현이 인간 유두갑상선암에서 TAM-관련 및 BRAF V600E-유사 대표 유전자와 연관되어 있음을 확인하였다. TAM은 갑상선 암을 포함한 다양한 인간 암에서 전-종양형성 역할을 갖는다는 사실이 알려져 있었기 때문에 (Riabov, V. et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Front Physiol 5, 75 (2014).), TAM을 항암 치료에서 표적화하는 것은 세포 및 분자 수준에서 심도 있게 연구되어왔다. 첫번째 접근법은 전신 결핍을 통해 대식 세포 자체를 표적으로 하는 것이었다. 그러나 대식 세포의 장기화된 전신 결핍은 숙주 면역 억제 및 기회 감염에 민감성을 야기시킬 수 있다. 따라서 TAM의 하류 매개자를 표적화하는 것이 좋은 대체 전략일 수 있다. VEGF-A 및 MMP9과 같은 몇몇 혈관 형성 인자는 조직 또는 장기에 따라 TAM의 활성을 중재한다. 따라서 조직 특이적 TAM 중재자를 확인하고 각각의 구체적인 장기에서 평가할 필요가 있다. M2 대식 세포 및/또는 혈관 형성 관련 유전자들인 TCGA 데이터세트로부터의 CXCL16 관련 차별발현유전자는 CXCL16-결핍 세포로부터의 이종 이식편 종양에서 하향 조절되었다. 이는 CXCL16이 TAM이 풍부한 종양 미세환경에서 중요한 역할을 함을 암시한다.
본 발명의 강점 중 하나는 CXCL16 발현의 임상적 의미가 인간 유두갑상선암에 대한 예후적 마커로 확인되었다는 점이다. 종양의 미세환경은 수많은 사이토카인과 성장 인자를 분비하는 다양한 세포 종류를 포함하는 매우 불균질한 복합체이다. 따라서 단일 인자에 대한 값을 예측하는 것은 한계가 있다. 본 발명은 CXCL16과 관련된 2개의 유전자를 포함하는, 유두갑상선암 예측용 유전자 패널의 신뢰할만한 예측 값을 제공한다. 또한 본 발명은 이 유전자 패널을 인간 유두갑상선암에 적용할 필요가 있다.
결론적으로, 더 높은 CXCL16 발현은 인간 유두갑상선암에서 대식세포-, 혈관 형성- 및 BRAFV600 유사 대표 유전자와 연관되어 있다. CXCL16과 관련된 3개 유전자 패널은 질환 예후를 예측하는 데에 사용될 수 있다.
예를 들어, 청구항 구성 목적을 위해, 이하 기재되는 청구항은 어떤 식으로든 이의 문자 그대로의 언어보다 좁게 해석되어선 안 되고, 따라서 명세서로부터의 예시적 구현예가 청구항으로 읽혀서는 안 된다. 따라서, 본 발명은 예시로서 기재되었고, 청구항의 범위에 대한 제한이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 발행된 특허, 특허 출원, 서적 및 저널 논문은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 각각 포함된다.

Claims (13)

  1. CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 CXCL16, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 갑상선암의 예후 예측용 키트.
  2. 청구항 1에 있어서, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 추가로 포함하는, 키트.
  3. CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 CXCL16, CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는, 갑상선암의 예후 예측용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브, 또는 ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 추가로 포함하는, 조성물.
  5. 시료에 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준을 측정하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 조성물, 또는 시료에 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 항체를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하고,
    CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2의 핵산 수준 또는 CXCL16, AHNAK2, 및 THBS2에 의해 인코딩되는 단백질 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 증가된 경우 갑상선암의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는, 갑상선암 예후를 예측하기 위한 정보 제공 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준을 측정하거나, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, RIMBP2, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, HBEGF, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 의해 인코딩되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 정보 제공 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, 및 HBEGF 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 증가되거나, ADAM8, MYO1F, C1QB, CTSK, C1QC, CYTIP, XDH, GDF15, CD68, CD163, IL8, TYMP, INHBA, SERPINF1, PLAU, THBS1, CCL2, MMP9, AREG, IL1B, 및 HBEGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 의해 인코딩되는 단백질의 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 증가되는 경우 갑상선암의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는, 정보 제공 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, RIMBP2, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 감소되거나, RIMBP2, PGF, 및 EGF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 의해 인코딩되는 단백질의 수준이 갑상선암을 갖지 않는 대상체에 비하여 감소되는 경우 갑상선암의 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는, 정보 제공 방법.
  9. 청구항 5에 있어서, 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는 것은, 갑상선암이 더 높은 TNM (Tumor Node Metastasis) 단계로 진행될 것으로 예측하는 것인, 정보 제공 방법.
  10. CXCL16의 핵산 서열을 포함하는 세포에 분석 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
    상기 핵산의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 핵산의 발현량이 감소되는 경우 상기 시료는 갑상선암의 예방 또는 치료용 물질인, 갑상선암 치료용 물질의 스크리닝 방법.
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