KR102267593B1 - Her2 및 her3의 헤테로다이머를 표적으로 하는 약물 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
HER2 및 HER3의 헤테로다이머를 분석하는 단계를 포함하는 HER2 및 HER3의 헤테로다이머를 표적으로 하는 약물 스크리닝 방법 및 HER2 및 HER3의 헤테로다이머 표적 약물에 관한 것이다.
Description
HER2 및 HER3의 헤테로다이머를 분석하는 단계를 포함하는 HER2 및 HER3의 헤테로다이머를 표적으로 하는 약물 스크리닝 방법 및 HER2 및 HER3의 헤테로다이머 표적 약물에 관한 것이다.
인간 상피 성장 인자 수용체 (Human epidermal growth factor receptors; HER)는 성장 인자 수용체 및 수용체 티로신 키나아제 (RTK)의 일원이다. HER 계열 수용체는 다양한 유형의 암에서 과발현되고 돌연변이를 일으킨다. 따라서 HER는 다양한 암에서의 주요한 치료 표적이 된다.
HER 계열 수용체들은 호모다이머, 헤테로다이머, 또는 다이머 이상의 올리고머를 형성하여, 이들의 세포질 내 도메인을 활성화시킨다. 특히, HER2와 HER3으로 구성된 헤테로다이머는 HER 계열 수용체의 가능한 조합 중에서 가장 높은 proliferating capability를 갖는다. 유방암 환자 샘플에서 HER2-HER3 헤테로다이머의 검출은 HER2-양성 유방암 환자의 negative prognosis와 상관 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 HER2-HER3 헤테로다이머를 특이 적으로 표적하는 약물의 개발이 지속적으로 진행되고 있지만, 약물 스크리닝 기술의 부족으로 인하여, 성공적인 개발이 이루어지지 못하는 실정이다.
일 예는 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3이고, 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 형성하며, 제2 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 HER2, HER3, 또는 이들 모두의 하위 단백질인, 세포 또는 조직 내에서의 HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)가 관여하는 신호전달경로의 활성화 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법을 제공한다. 다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머에서의 HER2 및/또는 HER3의 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는, HER2-HER3 헤테로다이머의 활성화 정도를 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법을 제공한다.
다른 예는 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3이고, 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 형성하며, 제2 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 HER2, HER3, 또는 이들 모두의 하위 단백질인, 세포 또는 조직, 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체(개별 환자)에 적용하기에 적합한, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물을 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머에서의 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 (예컨대, 타이로신 잔기의 인산화)를 측정하는 단계를 포함하는, HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 세포 또는 조직, 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체(개별환자)에 적용하기에 적합한, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물을 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 예는, 제1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물이 처리된 분리된 세포 또는 조직, 또는 상기 약물을 투여한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직에서 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3이고, 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 형성하며, 제2 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 HER2, HER3, 또는 이들 모두의 하위 단백질인, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다. 다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머를 표적을 하는 후보 물질이 처리된 세포 또는 조직, 또는 상기 약물을 투여한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직에서 HER2-HER3 헤테로다이머에서의 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 (예컨대, 타이로신 잔기의 인산화)를 측정하는 단계를 포함하는, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
다른 예는 제1 단백질 또는 제1 단백질이 고정화된 기판에 후보 물질 처리시와 미처리시의 제1 단백질 및 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정 및/또는 비교하는 단계를 포함하고, 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3이고, 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 형성하며, 제2 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 HER2, HER3, 또는 이들 모두의 하위 단백질인, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다. 다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머 또는 HER2-HER3 헤테로다이머가 고정화된 기판에 후보 물질 처리시와 미처리시의 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 (예컨대, 타이로신 잔기의 인산화)를 측정 및/또는 비교하는 단계를 포함하는, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 스크리닝 방법은, 상기 측정 및/또는 비교하는 단계 이전에, 제1 단백질 (또는 HER2-HER3 헤테로다이머) 또는 제1 단백질(또는 HER2-HER3 헤테로다이머)이 고정화된 기판에 제2 단백질을 처리하여 반응시키는 단계 및 상기 반응물에 후보 물질을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물은 항암제일 수 있다. 상기 항암제는 HER2-HER3 헤테로다이머가 검출되는 암에 대하여 항암 효과를 갖거나, 및/또는 HER2 또는 HER3 표적 치료제에 대하여 저항성을 갖는 암에 대하여 항암 효과를 갖는 것일 수 있다.
다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 HER2, HER3, 및/또는 HER2-HER3 헤테로다이머의 활성 저해용 조성물을 제공한다. 상기 HER2 및 HER3는 단독으로 존재하는 것 또는 HER2-HER3 헤테로다이머에 존재하는 것일 수 있다. 다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의, HER2, HER3, 및/또는 HER2-HER3 헤테로다이머의 활성 저해, 또는 HER2, HER3, 및/또는 HER2-HER3 헤테로다이머의 활성 저해용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 HER2-HER3 헤테로다이머의 활성 저해를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, HER2, HER3, 및/또는 HER2-HER3 헤테로다이머의 활성 저해 방법을 제공한다. 상기 HER2, HER3, 및/또는 HER2-HER3 헤테로다이머의 활성은 타이로신 카이네이즈 활성일 수 있다. 상기 HER2, HER3, 및/또는 HER2-HER3 헤테로다이머의 활성 저해는 HER2, HER3, 및/또는 HER2-HER3 헤테로다이머(예컨대, HER3의 Y1289, Y1197, Y1222, Y1276, Y1328, HER2의 Y1196, 또는 이들 중 2 이상의 조합 등)의 인산화 저해(인산화 수준 감소)를 의미할 수 있다. 상기 대상은 세포, 조직, 또는 개체 (인간 등의 포유 동물)일 수 있다.
다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, HER2-HER3 헤테로다이머 포함 세포 사멸용 조성물을 제공한다. 다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의, HER2-HER3 헤테로다이머 포함 세포 사멸, 또는 HER2-HER3 헤테로다이머 포함 세포 사멸용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 HER2-HER3 헤테로다이머 포함 세포의 사멸을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, HER2-HER3 헤테로다이머 포함 세포의 사멸 방법을 제공한다.
다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 HER2-HER3 헤테로다이머와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의, HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 또는 HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물의 투여 또는 이를 이용한 치료를 적용하기에 적합한 대상을 선별하기 위하여, 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 HER2-HER3 헤테로다이머를 검출하는 방법을 제공한다. 다른 예는 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 HER2-HER3 헤테로다이머를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물의 투여 또는 이를 이용한 치료를 적용하기에 적합한 대상의 선별 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 기재된 방법에 사용하기 위한 장치를 제공한다.
본 명세서에서, HER2-HER3 헤테로다이머의 하위 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용 및/또는 효소 활성 등의 측정은 single-molecule pull-down 및 co-immunoprecipitation (co-IP)를 기반으로 하는 것일 수 있다.
본 명세서에 제공된 일 예는 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3이고, 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 형성하며, 제2 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 HER2, HER3, 또는 이들 모두의 하위 단백질인, 세포 또는 조직 내의 HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)가 관여하는 신호전달경로의 활성화 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법 또는 활성화 측정에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머에서의 HER2 및/또는 HER3의 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는, HER2-HER3 헤테로다이머의 활성화 정도를 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법에 관한 것이다.
다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머에서의 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 (예컨대, 타이로신 잔기의 인산화)를 측정하는 단계를 포함하는, HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 세포 또는 조직, 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체(개별환자)에 적용하기에 적합한, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물을 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
다른 예는, 제1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물이 처리된 분리된 세포 또는 조직에서 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3이고, 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 형성하며, 제2 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 HER2, HER3, 또는 이들 모두의 하위 단백질인, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머를 표적으로 하는 후보 물질이 처리된 세포 또는 조직, 또는 상기 약물을 투여한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직에서 HER2-HER3 헤테로다이머에서의 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 (예컨대, 타이로신 잔기의 인산화)를 측정하는 단계를 포함하는, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 "HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물"은 HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)의 활성 (예컨대 타이로신 키나아제 활성)을 억제하는 것을 의미할 수 있다.
다른 예는 제1 단백질 또는 제1 단백질이 고정화된 기판에 후보 물질 처리 여부에 따른 제1 단백질 및 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정 및/또는 비교하는 단계를 포함하고, 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3이고, 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 형성하며, 제2 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 HER2, HER3, 또는 이들 모두의 하위 단백질인, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머 또는 HER2-HER3 헤테로다이머가 고정화된 기판에 후보 물질 처리 여부에 따른 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 (예컨대, 타이로신 잔기의 인산화)를 측정 및/또는 비교하는 단계를 포함하는, HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 상기 스크리닝 방법은, 상기 측정 및/또는 비교하는 단계 이전에, 제1 단백질 (또는 HER2-HER3 헤테로다이머) 또는 제1 단백질(또는 HER2-HER3 헤테로다이머)이 고정화된 기판에 제2 단백질을 처리하여 반응시키는 단계 및 상기 반응물에 후보 물질을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 보다 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용된 바로서, 용어 "단백질-단백질 상호작용 (protein-protein interaction: PPI)"은 제1 단백질과 제2 단백질 간의 물리적 및/또는 화학적 결합 또는 복합체 형성을 의미할 수 있으며, 예컨대, 결합 빈도, 결합 세기(강도), 및 결합 시간 등의 인자들 중에서 하나 이상으로 측정될 수 있다. 또한, 상기 제1 단백질과 제2 단백질 간의 상호작용 (결합)은 이들 간의 직접적인 상호작용 (결합)뿐 아니라 중간에 다른 단백질 (신호전달경로 중에서 제1 단백질 및 제2 단백질 사이에 위치하는 단백질)을 매개로 한 상호작용 (결합)도 포함할 수 있다. 본 명세서에서의 단백질-단백질 상호작용은 단분자 (single molecule) 반응 (1 분자의 제1 단백질과 1 분자의 제2 단백질 간의 반응)일 수 있다.
본 명세서에서, 제1 단백질은 HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2 protein; ErbB2) 및 HER3 (Human Epidermal growth factor Receptor 3 protein; ErbB3)이며, 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 이루는 것(HER2-HER3 헤테로다이머)일 수 있다.
HER2 및 HER3는 각각 HER 패밀리의 수용체 티로신 키나아제(RTKs)의 일원이다. HER2 또는 HER3의 세포외 도메인에 대한 리간드의 결합은 다른 ErbB 수용체와의 리셉터 호모- 또는 헤테로-이량체화를 유도하며, 이는 특이적인 타이로신 잔기의 세포내 자가인산화를 유발한다. HER2 및/또는 HER3의 자가인산화는 세포 증식, 혈관신생 및 전이에 영향을 미치는 MAPK 및 PI3K/Akt 활성화를 포함한 다운스트림 신호전달 네트워크를 이끈다. HER2 의 과발현, 유전자 증폭은 유방암과 위암에서 빈번히 관찰되며, 암 치료의 불량한 예후 및 나쁜 임상적 결과 등과 관련 있다. 한편 HER3는 여러 표적 약물 치료의 저항 기제로 잘 알려져 있다. 이러한 이유로, 이들 HER2 및/또는 HER3는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다. HER2 및 HER3는 인간 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, HER2는 GenBank Accession No. NP_001005862.1, NP_001276865.1, NP_001276867.1, NP_004439.2 등에 제공되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. HER3는 GenBank Accession No. NP_001005915.1, NP_001973.2 등에 제공되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 단백질은 다양한 생체 신호전달경로에 있어서 HER2 및/또는 HER3 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머)의 하위 단백질로서, HER2 및/또는 HER3 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머)와 상호작용(결합) 가능한 단백질 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 다른 예에서, 상기 하위 단백질은 타이로신 카이네이즈, 예컨대, HER2 및/또는 HER3 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머)와 상호작용(결합) 가능한 타이로신 카이네이즈들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법에서 수행되는 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계, 제1단백질 또는 제1단백질 효소의 활성화 정도를 측정하는 단계는 분리된 세포 또는 조직에 대하여 생체 외 또는 세포 외 (in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계는 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(1) 제1 단백질 또는 제1 단백질을 포함하는 시료를, 표면에 상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 제1 단백질이 고정된 기판을 준비하는 단계;
(2) 상기 준비된 제1 단백질이 고정된 기판에 표지된 (표지 물질이 결합된) 제2 단백질을 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(3) 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 측정).
다른 예에서, HER2-HER3 헤테로다이머에서의 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도 (예컨대, 타이로신 잔기의 인산화)를 측정하는 단계는 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(1-1) HER2-HER3 헤테로다이머 또는 HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 시료를, 표면에 HER2 및/또는 HER3에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 HER2-HER3 헤테로다이머가 고정된 기판을 준비하는 단계;
(2-1) 상기 HER2-HER3 헤테로다이머를 인산화시키고, 표지된 (표지 물질이 결합된) 인산화된 Tyr 특이적 결합 물질 (예컨대, 항체)를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(3-1) 단계 (2-1)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계 (타이로신 카이네이즈 활성화 측정).
상기 단계 (2-1)에서, 인산화시키는 단계는 상기 기판 또는 상기 기판에 고정된 HER2-HER3 헤테로다이머에 인산화제를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 인산화제는 HER2 및/또는 HER3를 인산화시킬 수 있는 모든 물질들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, ATP와 마그네슘 (예컨대, MgCl2 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 약물 스크리닝 방법에 있어서, 후보 물질은 단계 (2-1)에서 인산화 전, 후, 또는 동시에 처리될 수 있다. 상기 인산화 및/또는 후보 물질 처리 전, 후, 또는 동시, 및 단계 (3-1)의 활성화 측정 전에, 상기 기판 또는 기판에 고정된 HER2-HER3 헤테로다이머에 DGTN, GDN 등을 포함하는 콜레스테롤 유사 세정제 (detergent, 이하, 계면활성제와 상호 호환가능하게 사용됨)들 중에서 선택된 1종 이상의 세정제 (detergent)를 CMC(critical micellar concentration) 이상 또는 이를 초과하는 농도로 처리하여 HER2-HER3 헤테로다이머의 구조적 및/또는 기능적 활성을 유지시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 상기 단계를 보다 상세히 설명한다:
단계 (1) 또는 (1-1): 제1 단백질이 고정화된 기판 준비 단계
상기 단계 (1)은 제1 단백질 또는 제1 단백질을 포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 제1 단백질이 고정된 기판을 준비하는 단계이다.
상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3이며, 구체적으로, 이들이 이합체화된 HER2-HER3 헤테로다이머일 수 있다. 상기 제1 단백질을 포함하는 시료는 HER2 및/또는 HER3, 또는 HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하거나, HER2 및 HER3를 동시에 발현하는 세포, 세포 용해물, 또는 세포 파쇄물을 포함하는 것으로, 시험 대상 환자로부터 분리된 세포, HER2와 HER3를 동시에 발현하도록 조작된 재조합 세포 (예컨대, HER2를 (과)발현하는 세포에 HER3 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포, HER3를 (과)발현하는 세포에 HER2 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 재조합 세포 등), 또는 상기 세포의 용해물 또는 파쇄물일 수 있다.
일 예에서, HER2와 HER3의 헤테로다이머 형성을 위하여, HER2와 HER3를 동시에 포함하거나 발현하는 세포에 이합체화 제제를 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 이합체화 제제는 HER3의 리간드 (예컨대, Neuregulin β1 (NRG1-b1); NP_039250, NP_039250.2, 등), 콜레스테롤-유사 세정제 (Cholesterol-like detergent; 예컨대, DGTN(digitonin; CAS Number: 11024-24-1), GDN (glycol-diosgenin; CAS Number: 1402423-29-3) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서, HER2와 HER3를 동시에 발현하는 세포에 NRG1-b1을 처리(주입)하여 HER2-HER3 헤테로다이머를 형성하는 경우, 상기 NRG1-b1는 HER2와 HER3를 발현 후 용해(lysis) 전에 세포에 주입될 수 있다. 다른 구체예에서, HER2와 HER3를 동시에 발현(포함)하는 세포에 콜레스테롤-유사 세정제를 처리하여 HER2-HER3 헤테로다이머를 형성하는 경우, 상기 콜레스테롤-유사 세정제는 세포 용해 후 및 HER2 및/또는 HER3의 활성화 측정 전에 처리(첨가)될 수 있다 (일 예에서, 상기 세포는 NRG1-b1가 10ng/mL 내지 1000ng/mL, 50ng/mL 내지 200ng/mL, 또는 10ng/mL 내지 100ng/mL 의 양으로 주입된 것일 수 있음). 이 때, 사용되는 콜레스테롤-유사 세정제의 농도는 사용되는 세정제의 CMC(critical micellar concentration)을 초과하는 농도일 수 있으며, 예컨대, 세포 용해물 (cell lysis) 전체를 기준으로, DGTN의 경우 0.05%(w/v) 이상, 0.05%(w/v) 초과, 또는 0.06%(w/v) 이상, 예컨대, 0.05 내지 2%(w/v) 또는 0.06 내지 2%(w/v)일 수 있고, GDN의 경우 0.003%(w/v) 이상, 0.003%(w/v) 이상, 0.007%(w/v) 이상, 또는 0.01%(w/v) 이상, 예컨대, 0.003 내지 2%(w/v), 0.005 내지 2%(w/v), 0.007 내지 2%(w/v), 또는 0.01 내지 2%(w/v)일 수 있다. 사용되는 세정제의 농도가 CMC 이하인 경우 micelle 구조의 유지, 단백질의 세포막 투과 영역의 보호, 및 tyrosine kinase activity 유지가 어렵고, HER2-HER3 헤테로다이머의 활성도 (예컨대, 인산화 정도)가 낮아지고 복구되지 않음이 확인되어, 세정제는 상기 농도로 사용할 것을 제안한다. Digitonin은 용해시 상당히 불안정해지며, 수 시간 이내에 침전물이 생긴다. 따라서 용해시 10%(w/v) 내외 (5 내지 15%(w/v) 또는 8 내지 12%(w/v))의 glycerol을 첨가하면 좀 더 안정적으로 유지된다. GDN은 용해해도 수 일 동안 안정하다. 모든 용액은 HEPES 버퍼를 이용해 pH를 7 내지 8. 7.2 내지 7.6, 또는 7.4로 유지할 수 있다. 또 NaCl 150mM을 첨가해 적절한 이온 농도를 유지해주어야 한다. 세포 용해시 세포 내 protease에 의한 단백질 분해를 막기 위해 protease inhibitor cocktail을 첨가할 수 있다 (예컨대, Sigmaaldrich P8340, 약 2%(w/v)).
상기 시료는 개체로부터 분리된 세포, 조직, 세포 또는 조직의 용해물, 파쇄물, 또는 추출물, 체액 (예컨대, 혈액 (전혈, 혈장, 또는 혈청), 타액 등)일 수 있다. 상기 개체는 제1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 시험, 및/또는 효과적인 제1 단백질 표적 치료제의 선정 등을 수행하고자 하는 모든 포유류 (예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 일 예에서, 상기 개체는 제1 단백질과 관련된 질병을 갖는 환자일 수 있다. 상기 제1 단백질과 관련된 질병은 제1 단백질의 과발현 또는 제1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화와 관련된 질병일 수 있으며, 예컨대, 암일 수 있다.
상기 기판은 표면에 제1 단백질 (HER2, HER3, 또는 이들 모두)을 고정시킬 수 있는 모든 재질 및/또는 모든 구조를 갖는 것일 수 있다 (결정질 또는 비결정질 모두 사용 가능함). 일 예에서, 상기 기판은, 표지 신호의 검출 용이성을 고려하여, 빛의 굴절률이 생체 물질의 많은 부분을 차지하는 물의 굴절률 (약 1.3) 이상인 재질일 수 있다. 일 예에서, 상기 기판은 두께가 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.5 mm, 0.1 내지 약 0.25 mm, 또는 약 0.13 내지 약 0.21 mm 정도일 수 있으며, 굴절률이 약 1.3 내지 약 2, 약 1.3 내지 약 1.8, 약 1.3 내지 약 1.6, 또는 약 1.5 내지 약 1.54 정도인 것일 수 있다. 상기 기판은 상기 굴절률 범위를 만족시키는 모든 재질일 수 있으며, 예컨대 유리 (굴절률: 약 1.52), 석영 등으로 이루어진 군에서 선택된 재질로부터 얻어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 기판은 생물 시료 관찰에 통상적으로 사용되는 모든 형태를 갖는 것일 수 있으며, 예컨대, 웰 타입, 슬라이드 타입, 채널 타입, 어레이 형태, 미세유체칩, 미세관 (캐필러리) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 형광현미경 관찰시, 상기 시료가 적용된 기판 위에 커버글라스를 장착하여 관찰할 수 있으며, 커버글라스의 재질은 앞서 기판에서 설명한 바와 같고, 두께는 기판에서 설명한 범위 또는 이보다 얇을 수 있다 (예컨대, 굴절률 1.52, 두께 0.17mm일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아님).
상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 제1 단백질, 즉, HER2, HER3, 또는 이들 모두와 특이적으로 결합할 수 있는 모든 물질로부터 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, HER2, HER3, 또는 이들 모두에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편 (예컨대, 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등), 압타머 (단백질 또는 핵산분자), 소분자 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 때, 상기 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두)에 특이적으로 결합하는 물질은 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호작용을 방해하지 않는 부위, 즉, 제1 단백질과 제2 단백질이 상호작용(결합)하는 부위가 아닌 부위에서 제1 단백질과 결합하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 기판은 상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 물질 (예컨대, 항체 등)을 표면에 포함(고정)하기 위하여 적절히 표면개질되거나, 표면에 직접 상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질이 고정된 것일 수 있다. 상기 기판이 표면개질된 경우, 상기 기판은 일면에 상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 물질 (예컨대, 항체 등)을 고정화시킬 수 있는 작용기를 갖는 모든 화합물로 처리(예컨대, 도포)될 수 있으며, 예컨대, 알데히드기, 카르복실기 및 아민기로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 포함하는 화합물로 처리될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 알데히드기, 카르복실기 및 아민기로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 포함하는 화합물은 바이오틴(biotin), 소혈청알부민 (Bovine serum albumin; BSA), 바이오틴이 결합된 소혈청알부민, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG), 바이오틴이 결합된 PEG (폴리에틸렌글리콜-바이오틴; PEG-biotin), 폴리소베이트 (e.g., Tween20) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 표면 처리된 기판은 뉴트라비딘(neutravidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 처리(예컨대, 도포)될 수 있다.
단계 (2) 또는 (2-1): 제1 단백질과 제2 단백질을 반응시키는 단계 또는 HER2-HER3
헤테로다이머을
인산화시키고, 인산화된
타이로신
특이적 결합 물질과 반응시키는 단계
상기 단계 (2) 또는 (2-1)는, 상기 준비된 제1 단백질이 고정된 기판에, 표지된 제2 단백질을 첨가하거나 또는 제1 단백질을 인산화시키고, 표지된 인산화된 타이로신 특이적 결합 물질을 첨가하여 반응시키는 단계이다. 상기 표지된 인산화된 타이로신 특이적 결합 물질은 HER2 또는 HER3의 인산화된 타이로신에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
상기 제2 단백질은, 앞서 설명한 바와 같이, 다양한 생체 신호전달경로에 있어서 HER2 및/또는 HER3 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머)의 하위 단백질로서, HER2 및/또는 HER3 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머)와 상호작용(결합) 가능한 단백질 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 단계 (2-1)에서, 인산화시키는 단계는 상기 기판 또는 상기 기판에 고정된 HER2-HER3 헤테로다이머에 인산화제를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 인산화제는 HER2 및/또는 HER3를 인산화시킬 수 있는 모든 물질들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, ATP와 마그네슘 (예컨대, MgCl2 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 약물 스크리닝 방법에 있어서, 후보 물질은 단계 (2-1)에서 인산화 전, 후, 또는 동시에 처리될 수 있다. 상기 인산화 및/또는 후보 물질 처리 전, 후, 또는 동시, 및 단계 (3-1)의 활성화 측정 전에, 상기 기판 또는 기판에 고정된 HER2-HER3 헤테로다이머에, 앞서 단계 (1) 또는 (1-1)에서 설명한 바와 같은, DGTN, GDN 등을 포함하는 콜레스테롤-유사 세정제들 중에서 선택된 1종 이상의 세정제 (detergent)를 CMC(critical micellar concentration)를 초과하는 농도로 처리하여 HER2-HER3 헤테로다이머의 구조적 및/또는 기능적 활성을 유지시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 표지된 제2 단백질 또는 표지된 인산화된 타이로신 특이적 결합 물질은 제2 단백질 또는 표지된 인산화된 타이로신 특이적 결합 물질이 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되거나 (표지 물질이, 예컨대, 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적), 재조합적, 또는 물리적으로, 결합되거나), 표지물질이 결합될 수 있는 tag이 부착된 형태를 의미할 수 있다. 상기 검출 가능한 신호는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광, 및/또는 방사선 검출을 통하여 측정될 수 있는 모든 신호 (예컨대, 빛, 방사선 등)들 중에서 선택될 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 표지 신호를 발생시킬 수 있는 모든 소분자 화합물, 단백질, 펩타이드, 핵산분자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 형광 염료 (소분자 화합물; Cyanine, Alex, Dylight, Fluoprobes 등), 형광 단백질 (예컨대, 녹색형광단백질 (GFP, enhanced GFP), 황색형광단백질 (YFP), 청록색형광단백질(CFP), 청색형광단백질(BPF), 적색형광단백질(RPF), mcherry 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 tag은 His-tag / Ni-NTA 등과 같이 통상적으로 사용되는 모든 종류에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 표지 물질의 사용 농도는, 노이즈를 발생시키지 않고 정확하고 용이한 검출이 가능하도록 하기 위하여, 약 1uM 이하의 범위에서 적절하게 정할 수 있으며, 예컨대, 1nM 내지 1000nM, 1nM 내지 500nM, 1nM 내지 100nM, 10nM 내지 1000nM, 10nM 내지 500nM, 또는 10nM 내지 100nM 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 표지물질로부터 발생하는 신호는 이를 검출 또는 측정하는데 통상적으로 사용되는 모든 신호 검출 수단 (예컨대, 통상의 형광 현미경, 형광 카메라, 형광세기 측정 (정량) 장치 등)에 의하여 측정될 수 있다.
제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))을 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법에 있어서, 후속하는 단백질-단백질 상호작용 측정 단계 (단계 (3)) 전에, 상기 제1 단백질 또는 제1 단백질과 제2 단백질의 반응물에 후보 물질을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제1 단백질과 제2 단백질 간의 상호작용을 보다 정확하게 측정하기 위하여, 반응시키는 단계 (단계 (2))와 후속하는 단백질-단백질 상호작용 측정 단계 (단계 (3)) 사이에, 상기 반응이 일어난 기판을 통상적인 방법으로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
단계 (3) 또는 (3-1): 단백질-단백질 상호작용 측정 단계 또는
타이로신
잔기의
인산화 측정 단계
상기 단계 (3) 또는 (3-1)은 상기 단계 (2) 또는 (2-1)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계이다. 상기 신호 측정은 단계 (2) 또는 (2-1)에서 사용된 표지 신호(예컨대, 효소 반응, 형광, 발광, 또는 방사선 검출 등의 통상적인 방법을 통하여 측정 가능한 신호)를 검출 (또는 측정 또는 확인)할 수 있는 모든 수단을 사용하여 수행될 수 있다.
일 예에서, 단계 (3)에서의 단백질-단백질 상호작용 측정은 실시간 분석에 의한 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 표지 신호가 형광 신호인 경우, 상기 신호 검출은 상기 형광 신호를 발생시키는 표지 물질이 흡수하는 광원을 공급하여 발생하는 형광 신호를, 예컨대, 형광 현미경, 형광 카메라, 및/또는 형광 세기 측정 (정량) 장치 등을 사용하여, 영상화하거나 및/또는 정량할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 신호는 형광 신호인 경우, 상기 형광 신호는 형광 카메라를 이용하여 영상화 및/또는 정량할 수 있다.
상기 신호가 형광 신호인 경우, 단계 (3) (단백질-단백질 상호작용 측정 단계)은
(i) 상기 단계 (2)의 반응물에 광원을 공급하는 단계; 및
(ii) 상기 공급된 광원에 의하여 발생한 형광 신호를 검출하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 단계 (i)의 광원을 공급하는 단계는 상기 단계 (2)에서 얻어진 제1 단백질과 제2 단백질의 반응물에 광원을 공급하는 단계로서, 이와 같은 목적을 달성할 수 있다면, 광원의 공급 시기는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 광원은 단계 (1) 이전, 동시, 또는 이후부터 단계 (2) 이후까지 지속적으로 공급되거나, 단계 (2) 직전, 동시, 또는 직후에 소정의 시간 동안 공급될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 광원은 형광 신호에 해당하는 파장을 갖는 모든 광원일 수 있으며, 예컨대, 레이저, 할로겐 램프 등일 수 있다.
상기 광원의 파장은 사용된 형광 신호에 따라서 조절될 수 있으며, 예컨대, 약 300nm 내지 약 600nm 또는 약 350nm 내지 약 560nm 범위에서 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 녹색형광단백질은 약 480nm를 흡수하고, 황색형광단백질은 약 540nm를 흡수하고, 청색형광단백질은 약 375nm를 흡수하고, 청록색형광단백질은 약 425nm을 흡수하므로, 형광 신호로 녹색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 460 내지 약 500nm, 형광 신호로 황색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 520 내지 약 560nm, 형광 신호로 청색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 350 내지 약 400nm, 형광 신호로 청록색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 400 내지 약 450nm 범위에서 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 단계 (3)의 단백질-단백질 상호작용 측정 단계는 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscope) 또는 공초점 현미경 등을 사용하여 광원을 공급하고, 통상적인 방법으로 형광 신호를 관찰하여 수행될 수 있다. 다른 예에서, 상기 전반사 형광 현미경에 신호 영상화를 위한 형광 카메라, 예컨대 EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device) 카메라 또는 CMOS (Complementary metal oxide semiconductor) 카메라를 장착하여 사용함으로써, 광원 공급 및 형광 신호의 영상화 및/또는 정량을 수행할 수 있다.
다음에서는 단계 (3)의 단백질-단백질 상호작용 측정 단계를 전반사 현미경 및 형광 카메라를 사용하여 수행하는 경우를 예를 들어 보다 상세히 설명한다:
가) 상기 단계 (1) 또는 단계 (2)의 기판을 전반사 현미경에 장착시킨다. 전반사 현미경에서 광원의 공급 위치는 통상적으로 아래쪽이며, 전반사 현미경 종류에 따라서, 형광 신호를 기판의 위 (이 경우, 아래에서 위 방향으로, 광원 공급부, 기판, 렌즈, 또는 기판, 광원 공급부, 렌즈의 순서로 위치할 수 있음) 또는 아래에서 (이 경우, 아래에서 위 방향으로, 렌즈, 광원 공급부, 기판, 또는 광원 공급부, 렌즈, 기판, 또는 렌즈, 기판, 광원 공급부의 순서로 위치할 수 있음) 관찰할 수 있다.
나) 광원은 레이저일 수 있으며, 광원의 세기는 약 0.5 mW 내지 약 5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 4.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 4 mW, 약 0.5 mW 내지 약 3.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 3 mW, 약 0.5 mW 내지 약 2.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 2 mW, 약 1 mW 내지 약 5 mW, 약 1 mW 내지 약 4.5 mW, 약 1 mW 내지 약 4 mW, 약 1 mW 내지 약 3.5 mW, 약 1 mW 내지 약 3 mW, 약 1 mW 내지 약 2.5 mW, 약 1 mW 내지 약 2 mW, 약 1.5 mW 내지 약 5 mW, 약 1.5 mW 내지 약 4.5 mW, 약 1.5 mW 내지 약 4 mW, 약 1.5 mW 내지 약 3.5 mW, 약 1.5 mW 내지 약 3 mW, 약 1.5 mW 내지 약 2.5 mW, 또는 약 1.5 mW 내지 약 2 mW, 예컨대, 약 2 mW일 수 있으며, 광원의 파장은 앞서 설명한 바와 같이 형광 신호 또는 사용된 표지 물질, 및/또는 장비의 구성 (예컨대 감쇄필터를 사용하는 경우 세기가 센 광원을 사용할 수 있음)에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.
다) 상기 광원 공급에 의하여 발생한 형광 신호를 형광 카메라로 촬영하여 영상화 및/또는 정량할 수 있다.
상기 형광신호의 촬영 (또는 영상화)은, 표지 물질의 형광 신호 발생 유지 시간 (발광시간, lifetime)을 고려하여, 광원 공급과 동시 또는 상기 신호 발생 유지 시간 이내에 수행할 수 있다.
형광 카메라 (예컨대, EMCCD 카메라)로 형광 신호를 촬영(또는 영상화)함에 있어서, 1 프레임당 노출시간, 레이저 파워, 카메라 gain값, 총 촬영 프레임 등을 적절하게 조절할 수 있다. 예컨대, 1 프레임 당 노출시간이 짧을수록 1 프레임에 누적되는 신호가 줄어들게 되며, 이를 상쇄하기 위하여 레이저 파워를 높이거나, 형광 카메라의 감도를 높일 수 있다. 일 예에서, 1 프레임 당 노출시간을 약 0.001초 내지 약 5초, 약 0.001초 내지 약 3초, 약 0.001초 내지 약 2초, 약 0.001초 내지 약 1초, 약 0.001초 내지 약 0.5초, 약 0.001초 내지 약 0.3초, 약 0.001초 내지 약 0.1초, 약 0.01초 내지 약 5초, 약 0.01초 내지 약 3초, 약 0.01초 내지 약 2초, 약 0.01초 내지 약 1초, 약 0.01초 내지 약 0.5초, 약 0.01초 내지 약 0.3초, 약 0.01초 내지 약 0.1초, 약 0.05초 내지 약 5초, 약 0.05초 내지 약 3초, 약 0.05초 내지 약 2초, 약 0.05초 내지 약 1초, 약 0.05초 내지 약 0.5초, 약 0.05초 내지 약 0.3초, 약 0.05초 내지 약 0.1초, 약 0.07초 내지 약 5초, 약 0. 07초 내지 약 3초, 약 0. 07초 내지 약 2초, 약 0. 07초 내지 약 1초, 약 0. 07초 내지 약 0.5초, 약 0. 07초 내지 약 0.3초, 약 0.07초 내지 약 0.1초, 약 0.1초 내지 약 5초, 약 0.1초 내지 약 3초, 약 0.1초 내지 약 2초, 약 0.1초 내지 약 1초, 약 0.1초 내지 약 0.5초, 또는 약 0.1초 내지 약 0.3초, 예컨대 약 0.1초로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, EMCCD 카메라를 사용하는 경우, 표지 물질 (예컨대, eGFP)로부터 생성된 광자(photon)는 EMCCD의 소자를 통해 전자로 바뀌어 계측된다 (광전효과, photoelectric effect). 이 때, 광자 1개 당 생성되는 전자의 개수를 gain 값을 통해 변경할 수 있다. 설정된 gain값이 높을수록 광자 1개 당 생성되는 전자의 개수가 늘어나서, EMCCD의 감도가 높아지는 동시에 background noise도 함께 증가하므로 signal-to-noise 비율이 중요하다. 일 구체예에서, 우수한 signal-to-noise 비율을 얻기 위하여, gain값을 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 80, 약 10 내지 약 60, 약 10 내지 약 50, 약 20 내지 약 100, 약 20 내지 약 80, 약 20 내지 약 60, 약 20 내지 약 50, 약 30 내지 약 100, 약 30 내지 약 80, 약 30 내지 약 60, 또는 약 30 내지 약 50, 예컨대, 약 40 정도로 정할 수 있지만, 이에 한정되지 않고 카메라의 감도, 수명, 장비 구축 현황, 노이즈, 시험 조건 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다.
총 촬영 프레임 개수와 노출 시간을 곱하면 총 촬영 시간이 얻어진다 (노출시간 * 총 촬영 프레임 개수 = 촬영 시간). 형광 물질의 발광 시간 (lifetime) 이후에는 형광 신호가 사라지므로, 상기 촬영 시간이 발광시간 내에 진행되도록 총 촬영 프레임 개수 및/또는 노출 시간을 조절할 수 있다.
단백질-단백질 상호작용 측정 결과의 정확도를 높이기 위하여, 상기 영상화를 하나 이상, 예컨대, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 7개 이상, 또는 10개 이상 (상한값은 기판의 크기 및 영상화 가능한 면적에 따라서 결정됨)의 기판 또는 이를 포함하는 하나 이상의 채널 (각 채널은 2개 이상의 기판을 포함함)에서 수행하고, 신호가 나타난 spot (PPI complex라고도 함)의 개수를 구하여, 상기 얻어진 형광 신호를 정량화할 수 있으며, 이는 단백질-단백질 상호작용을 정량화한 것으로 볼 수 있다.
다른 예에서, 단계 (3)에서 측정된 형광 세기를 통상적인 장치를 이용하여 수치화함으로써 단백질-단백질 상호작용을 정량할 수도 있다. 이 때, 결과의 정확성을 위하여, 상기 결과를 시료 양 또는 시료 내 단백질 양을 기준으로 표준화 (normalization)시킬 수 있다.
제1 단백질 및/또는 제2 단백질을 2종 이상 사용하는 경우, 단계 (1) 내지 (3)은 각각의 제1 단백질과 제2 단백질 조합에 대하여 각각 수행될 수 있다 (즉, 단계 (1) 내지 (3)은 제1 단백질과 제2 단백질 조합의 수만큼 반복 수행될 수 있다).
단계 (3-1)의 타이로신 잔기의 인산화 측정 단계는 HER2-HER3 헤테로다이머와 표지된 HER2 또는 HER3의 인산화된 타이로신 잔기에 특이적으로 결합하는 물질 (예컨대, 항체) 간의 반응에서 발생하는 신호를 검출 및/또는 정량하는 단계를 포함할 수 있다. 일 예에서, 표지 물질로 형광 물질 (예컨대 형광 단백질)을 사용하는 경우, 상기 타이로신 잔기의 인산화는 앞서 설명한 바와 같이, 반응물에서 검출되는 형광 세기를 측정 및 정량화하여 측정될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법은, 앞서 설명한 단계 (1) 내지 (3) 또는 (1-1) 내지 (3-1)에 더하여, 다음의 단계 (4), 및/또는 단계 (5)를 추가로 포함할 수 있다:
단계 (4): 기준 시료와 비교하는 단계
단계 (4)는 상기 단계 (3) 또는 (3-1)에서 얻어진 결과(단백질-단백질 상호작용 수준 또는 타이로신 카이네이즈 활성화 정도)을 기준 시료에서 얻어진 결과(단백질-단백질 상호작용 수준 또는 타이로신 카이네이즈 활성화 정도)과 비교하는 단계이다.
상기 기준 시료는 발명의 목적에 따라서 적절하게 선택될 수 있다.
예컨대, 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법 또는 활성화 측정에 정보를 제공하는 방법의 경우, 상기 기준 시료는 (1) 정상 세포, 및/또는 (2) 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 알려진(확인된) 세포 (예컨대, 정상 세포 또는 암세포), 및/또는 (3) 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 알려진(확인된) 개체로부터 분리된 세포 (예컨대, 정상 세포 또는 암세포), 및/또는 (4) 그 외, HER2 및 HER3를 발현하여 HER2-HER3 헤테로다이머를 형성할 수 있는 세포 (예, 인위적(예컨대, 재조합적)으로 HER2 및 HER3를 발현하여 HER2-HER3 헤테로다이머를 형성하는 세포 등)를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우, 그 개체로부터 분리된 암세포와 동일 조직 또는 동일 기관의 정상 세포를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "정상 세포"는 비-병리적 상태의 모든 세포를 의미할 수 있으며, 상기 "비-병리적 상태"는 질병 상태가 아니거나, 돌연변이, 종양 형성, 기능적 및/또는 형태적 이상 등을 갖는 질병을 유발할 수 있는 상태가 아닌 것을 의미할 수 있다. 예컨대, 정상 세포는 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))과 관련된 질병 또는 시험 대상 약물의 치료 대상 질병을 갖지 않는 세포일 수 있으며, 시험 시료가 유래한 개체 또는 조직과 동종 또는 동일한 개체 또는 조직으로부터 유래한 것일 수 있다.
또한, 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))을 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법의 경우, 상기 기준 시료는 후보 물질이 처리되지 않은 시료 또는 상기 후보 물질 처리 전의 시료일 수 있다.
단계 (4)를 수행하기 위하여, 상기 방법들은, 단계 (4) 이전에, 상기 기준 시료에 대하여 제1 단백질 및 제2 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용 또는 타이로신 카이네이즈 활성화 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 단계는 앞서 설명한 단계 (1), (2), 및 (3), 또는 (1-1), (2-1), 및 (3-1)을 참조하여 수행할 수 있다.
단계 (5)
본 명세서에서 제공되는 방법은, 상기 단계 (4) 이후에, 단계 (4)에서 얻어진 비교 결과로부터 목적하는 사항을 확인(결정)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이를 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다:
(i) 세포 또는 조직 내의
HER2
및
HER3
헤테로다이머와
관련된 신호전달경로의 활성화 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법 또는 활성화 측정에 정보를 제공하는 방법
단계 (5)는 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
단계 (3)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준보다 높은 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 정상 세포의 활성화 정도 또는 기준시료에서 알려진(확인된) 활성화 정도보다 높다고 확인 (결정)하는 단계;
단계 (3)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준과 동등한 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 정상 세포의 활성화 정도 또는 기준시료에서 알려진(확인된) 활성화 정도와 동등하다고 확인 (결정)하는 단계; 및/또는
단계 (3)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준보다 낮은 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 정상 세포의 활성화 정도 또는 기준시료에서 알려진(확인된) 활성화 정도보다 낮다고 확인 (결정)하는 단계.
다른 예는 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3이고, 상기 HER2 및 HER3는 헤테로다이머를 형성하며, 제2 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 HER2, HER3, 또는 이들 모두의 하위 단백질이고, 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 후보 물질이 처리된 시료와 처리되지 않은 시료에서 수행하는, 제1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법 또는 제1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 효능 확인 방법, 또는 HER2-HER3 헤테로다이머 형성과 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물의 선별 방법 또는 상기 질병의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물의 효능 확인 방법을 제공한다. 다른 예는 HER2-HER3 헤테로다이머에서의 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 (예컨대, 타이로신 잔기의 인산화)를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 활성화를 측정하는 단계를 후보 물질이 처리된 HER2-HER3 헤테로다이머 또는 HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 시료와 처리되지 않은 HER2-HER3 헤테로다이머 또는 HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 시료에서 수행하는, HER2 및/또는 HER3 제1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법 또는 제1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 효능 확인 방법, 또는 HER2-HER3 헤테로다이머 형성과 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물의 선별 방법 또는 상기 질병의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물의 효능 확인 방법을 제공한다.
상기 방법은,
시험 시료에 후보 물질을 처리하는 (예컨대, 접촉시키는) 단계, 및
하기의 단계 (a), (b), (c), 및 (d)를 수행하는 단계를 포함할 수 있다:
(a) HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 시험 시료를 준비하거나, HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 시험 시료를 표면에 HER2 및/또는 HER3에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 HER2-HER3 헤테로다이머가 고정된 기판을 준비하는 단계;
(b) 상기 HER2-HER3 헤테로다이머를 인산화시키고, 표지된 인산화된 타이로신 특이적 결합 물질을 첨가하여 반응시키는 단계;
(c) 단계 (b)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 측정 또는 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도 측정); 및
(d) 상기 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료에 대하여 상기 단계 (c)에서 얻어진 각각의 결과를 서로 비교하는 단계.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 인산화된 타이로신 특이적 결합 물질은 HER2 및/또는 HER3의 인산화된 타이로신에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
상기 후보 물질은 상기 단계 (b)에서 처리될 수 있으며, 예컨대, 단계 (b)의 인산화 또는 인산화된 타이로신 특이적 결합 물질의 처리 전, 후, 또는 동시에 처리될 수 있다. 상기 단계 (b)의 인산화는 인산화제를 처리하여 수행될 수 있다. 상기 인산화제는 HER2 및/또는 HER3를 인산화시킬 수 있는 모든 물질들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, ATP와 마그네슘 (예컨대, MgCl2 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 (d)에서의 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료의 결과를 비교하기 위하여, 상기 단계 (a)-(c)는 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료에 대하여 각각 수행될 수 있다.
상기 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료와 처리된 시험 시료는 각각 후보 물질의 처리 전 시험 시료 및 처리 후 시험 시료를 의미하거나, 시험 시료를 분량하여 상기 후보 물질을 처리한 일부의 시험 시료 및 상기 후보 물질을 처리하지 않은 다른 일부의 시험 시료를 의미할 수 있다.
상기 단계 (d)에서의 비교 결과, 후보 물질이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도가 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 낮은 경우 (즉 상기 후보 물질이 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화를 억제하는 경우), 상기 후보 물질을 HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 후보 약물 또는 HER2-HER3 헤테로다이머와 관련된 질병 (예컨대, 암)의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물로 선택하거나, 상기 후보 물질이 HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 (즉, HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화를 억제하는) 약물로서 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.
따라서, 상기 후보 약물의 선별 방법 또는 후보 약물의 효능 확인 방법은, 상기 단계 (d) 이후에, 상기 단계 (d)에서의 비교 결과, 후보 물질이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도가 이 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 낮은 경우(즉 상기 후보 물질이 제1 단백질과 제2 단백질 간 상호 작용 또는 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화를 억제하는 경우), 상기 후보 물질을 HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는 후보 약물로 선택하거나, 상기 후보 물질이 HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)를 표적으로 하는(즉, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 억제하거나 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화를 억제하는) 약물로서 효과가 있는 것으로 확인하는 단계 (단계 (e))를 추가로 포함할 수 있다. 상기 후보 약물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도가 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 낮다고 함은 후보 약물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도가 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 HER2 및/또는 HER3의 타이로신 카이네이즈 활성화 정도의 75% 이하 (즉, 25% 이상 억제), 50% 이하 (즉, 50% 이상 억제), 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하 (즉, 75% 이상 억제), 20% 이하 (즉 80% 이상 억제), 15% 이하, 또는 10% 이하 (즉, 90% 이상 억제)인 것을 의미할 수 있다.
상기 후보 물질은 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))의 표적 약물로 사용 가능한 모든 생체적합성 물질 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 소분자 화학 약물 (small molecular chemicals), 단백질 (예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대, DNA, RNA (예컨대, siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머, 등), 식물 추출물, 동물 추출물, 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시험 시료는 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(특히, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))이 과발현 및/또는 (과)활성화된 세포 (예컨대, 세포 용해액 등) 또는 조직 (예컨대, 조직 용해액 등), 또는 제1 단백질과 관련된 질병 또는 선별하고자 하는 제1 단백질을 표적으로 하는 약물의 적용(치료) 대상 질병과 관련된 분리된 세포 (예컨대, 세포 용해액 등) 또는 조직 (예컨대, 조직 용해액 등)일 수 있으며, 일 예에서, 확립된 세포주 또는 상기 질병 (예컨대, 암)을 앓는 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다. 예컨대, 상기 시험 시료는 확립된 암 세포주 또는 암 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다 (상기 암은 제1 단백질의 과발현 및/또는 (과)활성화와 관련된 것일 수 있다).
상기 단계 (a) 내지 (e)는 in vitro에서 수행되는 것일 수 있다.
각 단계의 용어 설명은 앞서 기재한 바와 같다.
상기한 제1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법은 제1 단백질의 표적으로 하는 신약 개발에 있어서, 후보 약물로 개발된 약물의 효능 검정 (또는 확인 또는 시험)에 유용하게 적용될 수 있다.
후보 물질이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 낮은 경우, 상기 후보 물질을 제1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물로 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 후보 물질은 제1 단백질의 표적 약물로 사용 가능한 모든 생체적합성 물질 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 소분자 화학 약물 (small molecular chemicals), 단백질 (예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대, DNA, RNA (예컨대, siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머, 등), 식물 추출물, 동물 추출물, 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시험 시료는 제1 단백질이 과발현 및/또는 (과)활성화된 세포 (예컨대, 세포 용해액 등) 또는 조직 (예컨대, 조직 용해액 등), 또는 제1 단백질과 관련된 질병 또는 선별하고자 하는 제1 단백질을 표적으로 하는 약물의 적용(치료) 대상 질병과 관련된 분리된 세포 (예컨대, 세포 용해액 등) 또는 조직 (예컨대, 조직 용해액 등)일 수 있으며, 일 예에서, 확립된 세포주 또는 상기 질병 (예컨대, 암)을 앓는 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다. 예컨대, 상기 시험 시료는 확립된 암 세포주 또는 암 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다 (상기 암은 제1 단백질의 과발현 및/또는 (과)활성화와 관련된 것일 수 있다).
상기한 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법은 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))의 표적으로 하는 신약 개발에 있어서, 후보 약물로 개발된 약물의 효능 검정 (또는 확인 또는 시험)에 유용하게 적용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "제1 단백질을 표적으로 한다" 함은 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))의 활성을 촉진 또는 저해하는 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 제1 단백질(HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태))의 활성(타이로신 카이네이즈 활성)을 저해하는 것을 의미할 수 있다. 제1 단백질의 활성의 저해는 제1 단백질과 결합하거나, 및/또는 제1 단백질을 분해 및/또는 구조적 변형시켜 고유의 기능, 예컨대, 세포 및/또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "약물"은 약리적 효과를 나타내는 모든 물질, 예컨대, 소분자 화합물, 단백질 (예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대, DNA, RNA (예컨대, siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머, 등), 식물 추출물, 동물 추출물, 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "제1 단백질을 표적으로 하는 약물"은 제1 단백질의 활성을 저해하는 모든 물질, 예컨대, 제1 단백질의 활성을 저해하는 소분자 화합물(small molecule), 단백질 (예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대, DNA, RNA (예컨대, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), miRNA (microRNA), 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머, 등), 식물 추출물, 동물 추출물, 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, "제1 단백질을 표적으로 하는 약물"은 제1 단백질과 결합하거나, 및/또는 제1 단백질을 분해 및/또는 구조적 변형시켜 고유의 기능, 예컨대, 세포 및/또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는 모든 물질, 예컨대, 제1 단백질의 활성을 저해하는 소분자 화합물, 단백질 (예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대, DNA, RNA (예컨대, siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머, 등), 식물 추출물, 동물 추출물, 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "제1 단백질을 표적으로 하는 치료"는 제1 단백질의 활성을 저해하는 모든 의학적 및/또는 약학적 행위를 의미할 수 있으며, 예컨대, 앞서 설명한 바와 같은 제1 단백질의 활성을 저해하는 약물을 제1 단백질의 활성을 저해하는 것을 필요로 하는 대상에게 처방 및/또는 투여하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, "제1 단백질을 표적으로 하는 치료"는 제1 단백질과 결합하거나, 및/또는 제1 단백질을 분해 및/또는 구조적 변형시켜 고유의 기능, 예컨대, 세포 및/또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는 약물을 이를 필요로 하는 대상에게 처방 및/또는 투여하는 것일 수 있다.
상기 투여는 경구 또는 비경구 경로로 수행될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 병변 부위 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 또는 직장내 투여 등의 경로로 수행될 수 있다.
상기 개체, 환자 또는 대상은 모든 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등일 수 있고, 예컨대 제1 단백질과 관련된 질병을 갖는 환자일 수 있다. 상기 제1 단백질과 관련된 질병은 제1 단백질의 과발현 또는 제1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화와 관련된 질병일 수 있으며, 예컨대, 암, 염증, 그 외 면역질환 등일 수 있다. 구체예에서, 상기 개체, 환자 또는 대상은 암환자일 수 있다.
상기 암은 모든 고형암 및 혈액암 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대 제1 단백질의 과발현 또는 제1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화와 관련된 암일 수 있다. 예컨대, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암은 원발성 암뿐 아니라 전이성 암을 포함할 수 있다. 또한, 상기 암은 기존의 항암 치료에 대하여 저항성을 갖거나 획득한 암일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "약물에 대한 반응성"은 약물을 투여 받은 개체에서 상기 약물이 효과를 발휘하는 정도를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "효과"는 약물 또는 치료가 처치 대상에서 달성하고자 하는 의학적 및/또는 약학적 효과를 의미하는 것으로, 처치 대상이 갖는 질병의 예방 및/또는 치료, 및/또는 증상의 완화 및/또는 개선 등을 의미하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 약물이 항암제이고 치료가 항암 치료이고, 상기 처치 대상이 암환자인 경우, 상기 효과는 항암 효과(암의 예방 및/또는 치료 효과)일 수 있고, 상기 항암 효과는 암세포의 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동(migration), 침습(invasion), 및/또는 전이(metastasis) 등을 억제, 및/또는 암의 악화를 억제, 및/또는 저항성을 감소 또는 제거하는 효과 등을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예에서, 앞서 설명한 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정, 및/또는 약물의 스크리닝 방법에 사용하기 위한 분석 장치를 제공한다. 상기 분석 장치는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정용 장치, 및/또는 제1 단백질을 표적으로 하는 약물의 효능 확인용 장치로서 적용 가능하다. 상기 제1 단백질은 HER2, HER3, 또는 이들 모두(예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머 형태)이다.
상기 분석 장치는 앞서 설명한 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정, 및/또는 약물의 스크리닝 방법에 적용됨으로써, 소량의 시료에서의 생체 분자 간 상호 작용도 정확하고 효율적으로 관찰, 분석, 검출, 및/또는 측정할 수 있다는 이점을 갖는다. 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치 또는 이를 이용하는 분석 방법은 생검 (예컨대, needle biopsy) 시료와 같이 매우 소량의 시료에 대해서도 유용하고 효과적으로 적용될 수 있다. 또한, 상기 분석 장치 또는 이를 이용하는 분석 방법은 다양한 생체 분자 (예컨대, 단백질, 핵산 등) 간의 상호작용 또는 활성화 정도를 소량의 시료를 이용하여 정확하고 효율적으로 관찰, 분석, 검출, 및/또는 측정할 수 있다.
상기 분석 장치는,
제1 단백질에 특이적으로 결합하는 제1 단백질의 포획용 물질 또는 제1 단백질을 포함하는 반응부를 포함하거나,
여기에 더하여, 신호검출 수단을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3, 특히, HER2-HER3 헤테로다이머이다. 일 예에서, 상기 제1 단백질은 HER2-HER3 헤테로다이머, 또는 HER2-HER3 헤테로다이머를 세포 표면에 포함하는 (발현하는) 세포 또는 상기 세포의 용해물 형태로 사용될 수 있으며, 상기 반응부는 (1) HER2-HER3 헤테로다이머, 또는 HER2-HER3 헤테로다이머를 세포 표면에 포함하는 (발현하는) 세포 또는 상기 세포의 용해물, 또는 (2) 이들이 고정화된 기판을 포함하는 것일 수 있다. 상기 HER2-HER3 헤테로다이머를 세포 표면에 포함하는 (발현하는) 세포는 HER2 및 HER3를 발현하고, 하기의 설명되는 이합체화 제제 (예컨대, HER3의 리간드 (예컨대, Neuregulin 
1 (NRG1-b1) 등), 콜레스테롤-유사 세정제 (Cholesterol-like detergent; 예컨대, DGTN(digitonin; CAS Number: 11024-24-1), GDN (glycol-diosgenin; CAS Number: 1402423-29-3) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)이 처리된 것일 수 있으며, 예컨대, HER2 및 HER3를 발현하고, NRG1-b1이 처리된 세포로서, 임의로 DGTN 및 GDN로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 콜레스테롤-유사 세정제로 처리된 세포 또는 세포 용해물일 수 있다.
상기 분석 장치는 HER2 및 HER3, 특히, HER2-HER3 헤테로다이머어와 이들의 신호전달경로 상의 하위 단백질 간의 상호작용 (결합) 여부 및/또는 정도, 또는 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 (예컨대, Tyr 잔기의 인산화 정도)를 측정하는데 사용될 수 있다.
상기 반응부는 표면에 제1 단백질 포획용 물질이 고정화되거나, 상기 제1 단백질이 포획용 물질을 통하거나 통하지 않고(직접적으로) 고정화된 기판을 포함할 수 있다. 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3, 특히, HER2-HER3 헤테로다이머이며, 상기 제1 단백질 포획용 물질은 앞서 제1 단백질이 고정화된 기판 준비 단계 부분에서 설명한 제1 단백질 (HER2 및/또는 HER3)에 특이적으로 결합하는 물질, 예컨대, 항체 또는 이의 항원결합단편일 수 있다. 상기 반응부는 웰 (예컨대, 멀티웰) 타입, 슬라이드 타입, 채널 타입, 어레이 형태, 미세유체칩, 미세관 (캐필러리) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분석 장치는 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 장치일 수 있으며, 이를 위하여, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 제2 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 상기 분석 장치는 HER2 및/또는 HER3의 활성화 정도 (예컨대, Tyr 잔기의 인산화)를 측정하는 장치일 수 있으며, 이를 위하여 인산화된 Tyr에 특이적으로 결합하는 물질 (예컨대, 항체)를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 제2 단백질 또는 인산화된 Tyr에 특이적으로 결합하는 물질은 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되거나 (표지 물질이, 예컨대, 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적), 재조합적, 또는 물리적으로, 결합되거나), 표지물질이 결합될 수 있는 tag이 부착된 형태일 수 있다.
상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3, 특히, HER2-HER3 헤테로다이머이며, 제2 단백질은 앞서 설명한 바와 같다.
또한, 상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 신호 검출 수단에서 측정된 신호값을 제1 단백질의 수준으로 정상화 (normalization)시키기 위하여, 제1 단백질에 결합하는 탐지용 물질 및 상기 탐지용 물질에 결합하는 표지용 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 제1 단백질에 결합하는 탐지용 물질은 앞서 설명한 멀티 웰에 포함된 제1 단백질의 포획용 물질과 상이한 부위에서 제1 단백질과 결합하는 생물 분자 (예컨대, 항체)일 수 있으며, 상기 표지용 물질은 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되고 (표지 물질이, 예컨대, 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적으로 결합)) 상기 제1 단백질에 결합하는 탐지용 물질에 결합 가능한 생물 분자 (예컨대, 항체)일 수 있다.
상기 신호검출 수단은 사용된 표지 물질에서 발생시키는 신호에 따라서 통상적으로 사용되는 모든 신호 검출 수단일 수 있다. 예컨대, 상기 신호 검출 수단은 신호 자극부 및 신호 검출부를 포함할 수 있으며, 여기에 더하여 측정된 신호를 분석 (예컨대, 정량 또는 영상화)하는 신호 분석부를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 신호 자극, 신호 검출, 및 신호 분석은 각각 다른 부위에서 수행되거나, 이들 중 적어도 두 가지 이상이 하나의 부위에서 동시에 또는 연속하여 수행될 수 있다. 일 예에서, 상기 표지가 형광물질인 경우, 상기 신호 검출 수단은 형광 신호를 발생 및 검출할 수 있는 모든 수단들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 형광 신호 자극부 (예컨대, 광원), 및 형광 신호 검출부, 및/또는 형광 신호 분석부를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 신호 검출 수단은 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscope) 또는 공초점 현미경 (광원 및 형광신호 검출용)을 포함하거나, 여기에 더하여, 형광 카메라, 예컨대 EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device) 카메라 또는 CMOS (Complementary metal oxide semiconductor) 카메라를 추가로 포함하여, 광원 공급 및 형광 신호의 영상화 및/또는 정량을 수행할 수 있다. 상기 광원의 파장, 세기, 형광 카메라 측정 조건 (예컨대, 1 프레임당 노출시간, 레이저 파워, 카메라 gain값, 총 촬영 프레임 등)은 앞서 설명한 바와 같다.
본 명세서에 제공된 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 소량의 시료에서의 제1 단백질과 제2 단백질 간 상호 작용을 정확하고 효율적으로 관찰, 분석, 검출, 및/또는 측정할 수 있다는 이점을 갖는다. 따라서, 상기 멀티 웰 또는 이를 이용하는 분석 방법은 생검 (예컨대, needle biopsy) 시료와 같이 매우 소량의 시료에 대해서도 유용하고 효과적으로 적용될 수 있다.
다른 예는 HER2와 HER3의 헤테로다이머 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은, HER2와 HER3를 동시에 포함하거나 발현하는 세포에 이합체화 제제를 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 이합체화 제제는, 앞서 설명한 바와 같이, HER3의 리간드 (예컨대, Neuregulin β1 (NRG1-b1); NP_039250, NP_039250.2 등), 콜레스테롤-유사 세정제 (Cholesterol-like detergent; 예컨대, DGTN(digitonin; CAS Number: 11024-24-1), GDN (glycol-diosgenin; CAS Number: 1402423-29-3 등), 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법이 HER2와 HER3를 동시에 발현하는 세포에 NRG1-b1을 처리(주입)하는 단계를 포함하는 경우, 상기 NRG1-b1는 HER2와 HER3를 발현 후 용해(lysis) 전에 세포에 주입될 수 있다. 다른 구체예에서, HER2와 HER3를 동시에 발현하는 세포에 콜레스테롤-유사 세정제를 처리하는 단계를 포함하는 경우, 상기 콜레스테롤-유사 세정제는 세포 용해 후의 세척 단계에 처리(첨가)될 수 있다 (일 예에서, 상기 세포는 NRG1-b1가 10ng/mL 내지 1000ng/mL 또는 50ng/mL 내지 200ng/mL의 양으로 주입된 것일 수 있음). 이 때, 사용되는 콜레스테롤-유사 세정제의 농도는 사용되는 세정제의 CMC(critical micellar concentration) 를 초과하는 농도일 수 있으며, 예컨대, 세포 용해물 (cell lysis)을 기준으로, DGTN의 경우 0.05%(w/v) 이상, 0.05%(w/v) 초과, 또는 0.06%(w/v) 이상, 예컨대, 0.05 내지 2%(w/v) 또는 0.06 내지 2%(w/v)일 수 있고, GDN의 경우 0.003%(w/v) 이상, 0.003%(w/v) 이상, 0.007%(w/v) 이상, 또는 0.01%(w/v) 이상, 예컨대, 0.003 내지 2%(w/v), 0.005 내지 2%(w/v), 0.007 내지 2%(w/v), 또는 0.01 내지 2%(w/v)일 수 있다.
다른 예는 사피티닙(Sapitinib; 4-(3-Chloro-2-fluoroanilino)-7-methoxy-6-[[1-(N-methylcarbamoylmethyl)piperidin-4-yl]oxy]quinazoline; CAS No. 848942-61-0), AEE788 (6-[4-[(4-Ethylpiperazin-1-yl)methyl]phenyl]-N-[(1R)-1-phenylethyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine; CAS No. 497839-62-0), 다코미티닙(Dacomitinib; ((E)-N-(4-((3-chloro-4-fluorophenyl)amino)-7-methoxyquinazolin-6-yl)-4-(piperidin-1-yl)but-2-enamide; CAS No. 1110813-31-4), PD153035 (N-(3-Bromophenyl)-6,7-dimethoxy-4-quinazolinamine hydrochloride; CAS No. 183322-45-4), CUDC-101 (7-((4-((3-ethynylphenyl)amino)-7-methoxyquinazolin-6-yl)oxy)-N-hydroxyheptanamide; CAS No. 1012054-59-9), PD158780 (4-N-(3-bromophenyl)-6-N-methylpyrido[3,4-d]pyrimidine-4,6-diaminel CAS No. 171179-06-9), 펠리티닙(Pelitinib ((2E)-N-[4-[(3-Chloro-4-fluorophenyl)amino]-3-cyano-7-ethoxy-6-quinolinyl]-4-(dimethylamino)-2-butenamide; CAS No. 257933-82-7), 사라카티닙(Saracatinib; (N-(5-Chloro-1,3-benzodioxol-4-yl)-7-[2-(4-methyl-1-piperazinyl)ethoxy]-5-[(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)oxy]-4-quinazolinamine; CAS No. 379231-04-6), 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, HER2-HER3 헤테로다이머를 포함(또는 표면에 포함)하는 세포에서의 HER2 및/또는 HER3의 활성 (타이로신 카이네이즈 활성) 저해용 조성물; HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 세포 사멸용 조성물; 또는 HER2-HER3 헤테로다이머와 관련된 질병 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머가 검출되는 암)의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 사피티닙, AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 및 사라카티닙으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 세포, 또는 상기 세포를 포함하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HER2 및/또는 HER3의 활성 저해 방법; HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하는 세포 사멸 방법; 또는 HER2-HER3 헤테로다이머와 관련된 질병 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머가 검출되는 암)의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 약학적으로 허용가능한 염은 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 염에서 특별한 제한 없이 선택되어 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 브롬산, 술폰산(Sulfonate), 황산(Sulfate), 인산, 질산 등과 같은 무독성의 무기산; 또는 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 타르타르산, 시트르산, 파라톨루엔설폰산, 메탄설폰산 등과 같은 유기산을 이용하여 형성된 염들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예컨대, 염산염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
HER2-HER3 헤테로다이머는 정상세포 또는 저항성(예컨대, HER2 및/또는 HER3의 표적 치료(치료제)에 대한 저항성)을 갖지 않는 암세포에는 존재하지 않거나 활성이 없을 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 방법 및/또는 조성물이 적용되거나 방법 및/또는 조성물에 사용되는 세포, 질병, 또는 대상은 HER2-HER3 헤테로다이머가 존재하거나, 정상 세포 또는 저항성(예컨대, HER2 및/또는 HER3의 표적 치료(치료제)에 대한 저항성)을 갖지 않는 암세포와 비교하여 상대적으로 높은 수준으로 존재 또는 활성화된 세포 또는 이와 관련된 질병 또는 대상일 수 있다.
상기 HER2-HER3 헤테로다이머 포함 세포는 HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하거나 (예컨대, 세포 표면에 포함), 정상 세포보다 높은 수준으로 포함하는 세포일 수 있으며, 다른 표현으로, HER2-HER3 헤테로다이머가 통상적인 단백질 검출 수단에 의하여 검출 가능하거나, 정상 세포보다 높은 수준으로 검출되는 세포일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 HER2-HER3 헤테로다이머 포함 세포는 암세포, 예컨대, 앞서 설명한 특징을 갖는 암세포일 수 있다. 다른 예에서, 상기 암세포는 기존의 항암 치료, 예컨대, HER2 표적치료 및/또는 HER3 표적 치료에 대하여 저항성을 갖는 암세포일 수 있다. 다른 예에서, 상기 암세포는 HER2-HER3 헤테로다이머를 포함하거나 (예컨대, 세포 표면에 포함), 정상 세포보다 높은 수준으로 포함하고, 기존의 항암 치료, 예컨대, HER2 표적치료 및/또는 HER3 표적 치료에 대하여 저항성을 갖는 암세포일 수 있다.
일 예에서, 상기 HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병은 앞서 설명한 HER2-HER3 헤테로다이머 포함 세포와 관련된 질병일 수 있으며, HER2-HER3 헤테로다이머의 존재 (예컨대, 정상 세포보다 높은 수준으로 존재) 또는 검출 (예컨대, 정상 세포보다 높은 수준으로 검출)을 특징으로 하는 질병, 예컨대, 암일 수 있다.
일 예에서, 상기 암은 기존의 항암제, 예컨대, HER2 표적 치료 및/또는 HER3 표적 치료에 대하여 저항성을 갖는 암일 수 있다. 일 예에서, 상기 대상은 HER2-HER3 헤테로다이머 포함하는 세포, 또는 상기 세포를 포함하는 개체 (인간 등의 포유 동물)일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 대상은 암 환자일 수 있으며, 예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머가 존재(예컨대, 정상 개체 또는 HER2 표적치료 및/또는 HER3 표적 치료에 대하여 저항성을 갖는 개체보다 높은 수준으로 존재)하는 암 환자일 수 있다. 다른 예에서, 상기 대상은 기존의 항암 치료, 예컨대, HER2 표적치료 및/또는 HER3 표적 치료에 대하여 저항성을 갖는 암 환자일 수 있다. 따라서, 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, HER2-HER3 헤테로다이머가 존재(예컨대, 정상 개체 또는 HER2 표적치료 및/또는 HER3 표적 치료에 대하여 저항성을 갖는 개체보다 높은 수준으로 존재)하는 암 환자 또는 기존의 HER2 표적치료 및/또는 HER3 표적 치료에 대하여 저항성을 갖는 암 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 대상 또는 암환자는 세포, 조직, 또는 개체 (인간 등의 포유 동물)일 수 있다. 상기 기존의 항암 치료는 통상의 항암제를 사용하는 치료일 수 있다. 상기 HER2 표적 치료 및/또는 HER3 표적 치료는 통상의 HER2 표적 치료제 및/또는 HER3 표적 치료제를 사용하는 치료일 수 있다. 상기 통상의 항암제 또는 통상의 HER2 표적 치료제 및/또는 HER3 표적 치료제는, 예컨대, 네라티닙(neratinib), 라파티닙(lapatinib) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 예에서, 상기 약학 조성물은, 상기 유효성분에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 유화제 (계면활성제), 윤활제, 감미제, 향미제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 상기 약학 조성물이 적용되는 제형에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 약제학 분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 모든 보조제들 중에서 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 알르기니, 히스티딘, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유효성분의 유효량, 또는 상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 또는 병변부위 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 상기 약학 조성물은 활성 성분이 위에서의 분해되지 않도록 하기 위하여 활성 성분을 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호 가능한 제형으로 제형화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바로서, "약학적 유효량"은 소망하는 약리적 효과를 나타낼 수 있는 유효 성분의 약학 조성물 내 함량 또는 투여량을 의미하는 것일 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감수성과 같은 요인들에 의해 적절하게 정해질 수 있다. 예컨대, 상기 유효 성분의 1일 또는 1회 투여량은 0.0001 내지 1000 mg/kg (체중), 0.001 내지 500 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.1 내지 50 mg/kg, 또는 0.5 내지 20 mg/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 또는 1회 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물은 수성 또는 유성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 염소, 말 등을 포함하는 포유류, 또는 상기 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 또는 이들의 배양물일 수 있다.
다른 예는 상기 HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물의 투여 또는 이를 이용한 치료를 적용하기에 적합한 대상을 선별하기 위하여, 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 HER2-HER3 헤테로다이머를 검출하는 방법을 제공한다. 다른 예는 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 HER2-HER3 헤테로다이머를 검출하는 단계를 포함하는, 상기 HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물의 투여 또는 이를 이용한 치료를 적용하기에 적합한 대상의 선별 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 생물학적 시료에서 HER2-HER3 헤테로다이머가 검출되거나 정상 시료보다 높은 수준으로 검출되는 경우, 상기 대상을 HER2-HER3 헤테로다이머 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물의 투여 또는 이를 이용한 치료를 적용하기에 적합한 대상으로 확인(선택 또는 결정)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 확인(선택 또는 결정)하는 단계 이전에, 비교를 위하여, 정상 시료에서 HER2-HER3 헤테로다이머를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정상 시료는 병적 증상이 없는 세포, 예컨대, 암세포가 아닌 세포일 수 있다. 상기 대상을 인간 등의 포유동물일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 상기 대상으로부터 분리한 세포, 예컨대, 암세포일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법은 HER2-HER3 헤테로다이머를 이용하여 약물을 스크리닝하는 기술을 제공하는 것으로, HER2-HER3 헤테로다이머의 효과적인 억제제 또는 HER2-HER3 헤테로다이머와 관련된 질병 (예컨대, HER2-HER3 헤테로다이머를 발현하는 세포(암세포)와 관련된 질병 (암))의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물을 스크리닝하는데 유용하게 적용될 수 있다.
도 1a는 HER3-eGFP를 SKBR3에 발현한 뒤, NRG1-b1을 처리하여 HER2-HER3-eGFP heterodimer를 형성시키는 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 1b는 NRG1-b1 처리된 SKBR3 세포에 존재하는 HER3-eGFP의 양에 따라 HER2-HER3-eGFP heterodimer의 양이 비례함을 보여주는 그래프이다.
도 1c는 NRG1-b1를 세포 용해 전에 처리한 경우와 세포 용해 이후에 처리한 경우에 검출된 HER2-HER3 heterodimer의 양을 보여주는 그래프이다.
도 1d는 SKBR3 세포에 NRG1-b1을 처리하여 세포 내에 존재하는 HER2와 HER3의 heterodimer를 유도, 추출, 및 검출하는 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 1e는 기판에 첨가한 단백질 농도에 따라 검출된 HER2-HER3 heterodimer의 양을 보여주는 그래프이다.
도 1f는 HER2와 HER3를 발현하는 유방암 세포주 3 종 (SKBR3, BT474, 및 HCC1419)에 리간드(NRG1-b1)를 처리시 생성된 HER2-HER3 heterodimer 양을 보여주는 그래프이다.
도 1g는 NRG1-b1을 처리했을 때, EGFR-HER2 등과 같은 HER2-HER3가 아닌 다른 종류의 이합체가 존재하는지를 확인하기 위하여, EGFR 항체, HER2 항체, 또는 HER3 항체를 이용하여 이합체 존재를 측정한 그래프이다.
도 1h는 phospho-RTK array를 통하여 리간드 처리 전후 SKBR3 세포의 RTK 인산화 정도를 측정한 결과를 보여준다.
도 1i는 HER2-eGFP를 HEK293T 세포에 과발현시켜 HER2-eGFP-HER2-eGFP homodimer 형성하고 기판 (PEG, neutravidin, biotin, 및 anti-HER2 antibody를 표면처리된) 에 부착하는 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 1j는 도 1i에서 기판에 부착된 HER2-eGFP-HER2-eGFP homodimer 또는 HER2-eGFP monomer로부터 나오는 형광 신호를 측정한 결과를 보여준다.
도 1k는 도 1j에서 homodimer 또는 monomer로부터 얻은 형광신호에서 단분자 형광 신호 꺼짐 현상을 관찰하여, 2단계로 꺼짐 (dimer)과 2단계 이상으로 꺼짐 (oligomer)의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 1l은 detergent 종류에 따른 HER2와 HER3-eGFP의 이합체 생성 정도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 1m은 표기된 계면활성제와 리간드(EGF) 처리 유무에 따른 인산화 정도를 eGFP 표지된 p85a와의 상호작용으로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다..
도 2a는 HER2-HER3 heterodimer의 Tyr 인산화 수준 측정 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 2b는 HER2-HER3 heterodimer가 고정화된 기판에 ATP와 Mg2 +를 처리한 후 HER3 Tyr 잔기들의 인산화 정도 (HER3 pTyr counts)를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2c는 세포 용해물로부터 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer를 다양한 농도의 digitonin 또는 GDN을 사용하여 각각 세척한 뒤에 ATP와 Mg2+을 첨가하여, 인산화된 HER3 Y1289를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2d는 세포 용해물로부터 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer를 표시된 종류와 농도의 계면활성제를 이용하여 각각 세척한 뒤에 ATP와 Mg2+을 첨가하고, 인산화된 HER3 Y1289를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2e는 EGFR과 상응하는 단일 위치 변이를 각각 HER2와 HER3에 도입시키는 과정을 보여주는 개요도 이다.
도 2f는 도 2e에서 설명한 단일 위치 변이를 각각 HER2와 HER3에 시켰을 때, HER2-HER3 heterodimer의 활성화 정도를 측정한 그래프이다.
도 2g는 HER2-HER2 homodimer의 Tyr 인산화 수준 측정 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 2h는 HER2-HER2 homodimer 가 고정화된 기판에 ATP와 Mg2 +를 처리한 후 HER2 Tyr 잔기들의 인산화 정도 (HER2 pTyr counts)를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2i는 HER2-HER2 homodimer 형성 세포 용해물의 세척에 사용된 detergent 종류에 따른 HER2의 활성화 정도를 HER2 Y1196의 인산화 정도를 통하여 보여주는 그래프이다.
도 3a는 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer가 인산화 과정을 거쳤을 때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을 보여주는 모식도이다.
도 3b는 도 3a에서 설명한 실험의 실제 데이터로 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 의해 유도된 하위 신호전달 단백질(eGFP가 표지된 PLCgSH2)의 형광 신호를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3c는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3d는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85a)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3e는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PI3K : p85a - p110a complex)이 상호작용하는지를 형광신호의 크기로 보여주는 그래프이다.
도 3f는 기판에 부착된 HER2 homodimer가 인산화 과정을 거쳤을 때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을 보여주는 모식도이다.
도 3g는 하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3h는 하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 a)과 상호작용하는지를 형광신호 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3i는 하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PI3K : p85a - p110a complex)과 상호작용하는지를 각각 형광신호의 크기와 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3j는 표면에 부착된 HER2-HER3 heterodimer의 인산화된 타이로신을 PTPN1을 처리해 탈인산화 하는 것을 보여주는 개요도이다.
도 3k의 왼쪽 그래프는 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP와 Mg2+을 처리한 시간에 따른 인산화 정도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다 (HER3의 pY1289의 양을 측정), 오른쪽 그래프는 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP와 Mg2+을 처리해 HER3의 타이로신을 인산화시킨 뒤, PTPN1을 처리한 시간에 따른 인산화 정도를 측정한 결과를 보여준다 (HER3의 pY1289의 양을 측정).
도 3l은 표면에 부착된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP, Mg2+, PTPN1, 그리고 eGFP가 표지된 p85a를 한번에 처리해 세포 내의 타이로신 신호전달 체계를 모사하는 것을 표현하는 개요도이다.
도 3m은 도 3l에서 모사한 실험으로 부터 얻어진 형광 신호를 시간에 따라 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3n은 도 3m에서 얻어진 첫번 째 p85a 결합 이후에 새로운 p85a가 동일한 HER2-HER3 heterodimer에 결합되는 데 걸리는 시간을 모아서 한번에 보여주는 그래프이다.
도 4a는 HER2-HER3 heterodimer에 표기된 ATP와 Mg2+ 처리시 HER3 타이로신 잔기의 인산화를 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 4b는 HER2-HER3 heterodimer에 ATP 처리 농도를 증가시키면서 HER3 Tyr 잔기의 인산화 속도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4c는 HER2-HER2 homodimer를 사용하여 ATP 처리 농도를 증가시키면서 HER2 Tyr 잔기의 인산화 속도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4d는 HER2-HER3 heterodimer와 HER2 homodimer에 여러 농도의 Lapatinib을 선처리 한 뒤, ATP와 magnesium chloride를 후처리하여 얻어진 HER2의 활성화 정도를 Lapatinib 농도에 따라서 나타낸 그래프이다.
도 4e는 HER2-HER3 heterodimer와 HER2 homodimer에 Lapatinib, ATP, 및 magnesium chloride를 동시에 처리하여 얻어진 HER2의 활성화 정도를 Lapatinib 농도에 따라서 나타낸 그래프이다.
도 4f는 HER2-HER3 heterodimer 에 Lapatinib, ATP, 및 magnesium chloride를 다양한 농도의 PTPN1 (Protein Tyrosine Phosphatase, Non-receptor type 1)과 함께 처리하여 얻어진 HER3 Y1289 인산화 수준을 Lapatinib 농도에 따라서 나타낸 그래프이다.
도 5a는 HER2-HER3 heterodimer의 인산화를 억제하는 후보 약물의 스크리닝 과정(HER2-HER3 heterodimer (in vitro) assay)을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 5b는 HER2-HER3 heterodimer에 MCE(MedChemExpress)에서 제공하는 Tyrosine kinase inhibitor library의 280개 후보 물질을 10uM의 양으로 처리하여 얻어진 HER3 Tyr1289 인산화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 도 5b의 결과에서 HER3 Tyr1289 인산화 억제 효과가 우수한 것으로 선택된 33개 화합물을 1uM의 양으로 HER2-HER3 heterodimer에 처리하여 얻어진 HER3 Tyr1289 인산화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5d는 도 5c의 결과에서 HER3 Tyr1289 인산화 억제 효과가 우수한 것으로 선택된 8개 화합물과 억제 효과가 없었던 12개의 약물 HER2-HER3 heterodimer 양성 세포주인 HCC-1419, SK-BR-3, 및 BT-474와, HER2-HER3 heterodimer 음성 세포주인 MCF-7, MDA-MB-231, 및 HCC-1954에 처리하여 얻어진 세포 증식 결과를 보여준다.
도 5e는 도 5c의 결과에서 가장 우수한 3종의 약물(Sapitinib, AEE788, Dacomitinib)을 리간드(NRG1-b1)와 함께 SKBR3에 1시간 또는 18시간 동안 처리한 후, 세포의 활성화 정도를 여러가지 항체 (pHER3, pAkt, pErk 항체)를 이용한 면역 블롯으로 측정한 결과를 보여준다.
도 5f는 도 5c의 결과에서 가장 우수한 효과가 확인된 3종의 약물(Sapitinib, AEE788, Dacomitinib)의 HER3 인산화 저해정도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5g는 리간드 유무에 따른 SKBR3에 lapatinib을 처리한 경우의 cell viability를 나타낸 그래프이다.
도 5h는 리간드 유무에 따른 SKBR3에 dacomitinib을 처리한 경우의 cell viability를 나타낸 그래프이다.
도 5i는 리간드 유무에 따른 SKBR3에 CUDC-101을 처리한 경우의 cell viability를 나타낸 그래프이다.
도 5j는 리간드 유무에 따른 SKBR3에 Sapitinib을 처리한 경우의 cell viability를 나타낸 그래프이다.
도 5k는 dacomitinib의 항종양 효과를 SKBR3 이종 이식 쥐에서 확인하는 실험의 개요도 이다.
도 5l은 도 5k에서 표시된 날짜에 측정한 종양 조직의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 5m은 lapatinib과 dacomitinib을 단독 처리 (vehicle과 함께 처리)한 후 또는 lapatinib과 dacomitinib을 NRG1-b1과 함께 처리한 경우의 시험 개시 20일이 경과 후 쥐로부터 추출된 암 조직의 최종 무게를 나타낸 그래프이다.
도 1b는 NRG1-b1 처리된 SKBR3 세포에 존재하는 HER3-eGFP의 양에 따라 HER2-HER3-eGFP heterodimer의 양이 비례함을 보여주는 그래프이다.
도 1c는 NRG1-b1를 세포 용해 전에 처리한 경우와 세포 용해 이후에 처리한 경우에 검출된 HER2-HER3 heterodimer의 양을 보여주는 그래프이다.
도 1d는 SKBR3 세포에 NRG1-b1을 처리하여 세포 내에 존재하는 HER2와 HER3의 heterodimer를 유도, 추출, 및 검출하는 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 1e는 기판에 첨가한 단백질 농도에 따라 검출된 HER2-HER3 heterodimer의 양을 보여주는 그래프이다.
도 1f는 HER2와 HER3를 발현하는 유방암 세포주 3 종 (SKBR3, BT474, 및 HCC1419)에 리간드(NRG1-b1)를 처리시 생성된 HER2-HER3 heterodimer 양을 보여주는 그래프이다.
도 1g는 NRG1-b1을 처리했을 때, EGFR-HER2 등과 같은 HER2-HER3가 아닌 다른 종류의 이합체가 존재하는지를 확인하기 위하여, EGFR 항체, HER2 항체, 또는 HER3 항체를 이용하여 이합체 존재를 측정한 그래프이다.
도 1h는 phospho-RTK array를 통하여 리간드 처리 전후 SKBR3 세포의 RTK 인산화 정도를 측정한 결과를 보여준다.
도 1i는 HER2-eGFP를 HEK293T 세포에 과발현시켜 HER2-eGFP-HER2-eGFP homodimer 형성하고 기판 (PEG, neutravidin, biotin, 및 anti-HER2 antibody를 표면처리된) 에 부착하는 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 1j는 도 1i에서 기판에 부착된 HER2-eGFP-HER2-eGFP homodimer 또는 HER2-eGFP monomer로부터 나오는 형광 신호를 측정한 결과를 보여준다.
도 1k는 도 1j에서 homodimer 또는 monomer로부터 얻은 형광신호에서 단분자 형광 신호 꺼짐 현상을 관찰하여, 2단계로 꺼짐 (dimer)과 2단계 이상으로 꺼짐 (oligomer)의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 1l은 detergent 종류에 따른 HER2와 HER3-eGFP의 이합체 생성 정도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 1m은 표기된 계면활성제와 리간드(EGF) 처리 유무에 따른 인산화 정도를 eGFP 표지된 p85a와의 상호작용으로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다..
도 2a는 HER2-HER3 heterodimer의 Tyr 인산화 수준 측정 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 2b는 HER2-HER3 heterodimer가 고정화된 기판에 ATP와 Mg2 +를 처리한 후 HER3 Tyr 잔기들의 인산화 정도 (HER3 pTyr counts)를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2c는 세포 용해물로부터 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer를 다양한 농도의 digitonin 또는 GDN을 사용하여 각각 세척한 뒤에 ATP와 Mg2+을 첨가하여, 인산화된 HER3 Y1289를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2d는 세포 용해물로부터 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer를 표시된 종류와 농도의 계면활성제를 이용하여 각각 세척한 뒤에 ATP와 Mg2+을 첨가하고, 인산화된 HER3 Y1289를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2e는 EGFR과 상응하는 단일 위치 변이를 각각 HER2와 HER3에 도입시키는 과정을 보여주는 개요도 이다.
도 2f는 도 2e에서 설명한 단일 위치 변이를 각각 HER2와 HER3에 시켰을 때, HER2-HER3 heterodimer의 활성화 정도를 측정한 그래프이다.
도 2g는 HER2-HER2 homodimer의 Tyr 인산화 수준 측정 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 2h는 HER2-HER2 homodimer 가 고정화된 기판에 ATP와 Mg2 +를 처리한 후 HER2 Tyr 잔기들의 인산화 정도 (HER2 pTyr counts)를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2i는 HER2-HER2 homodimer 형성 세포 용해물의 세척에 사용된 detergent 종류에 따른 HER2의 활성화 정도를 HER2 Y1196의 인산화 정도를 통하여 보여주는 그래프이다.
도 3a는 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer가 인산화 과정을 거쳤을 때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을 보여주는 모식도이다.
도 3b는 도 3a에서 설명한 실험의 실제 데이터로 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 의해 유도된 하위 신호전달 단백질(eGFP가 표지된 PLCgSH2)의 형광 신호를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3c는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3d는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85a)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3e는 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PI3K : p85a - p110a complex)이 상호작용하는지를 형광신호의 크기로 보여주는 그래프이다.
도 3f는 기판에 부착된 HER2 homodimer가 인산화 과정을 거쳤을 때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을 보여주는 모식도이다.
도 3g는 하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3h는 하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 a)과 상호작용하는지를 형광신호 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3i는 하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PI3K : p85a - p110a complex)과 상호작용하는지를 각각 형광신호의 크기와 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3j는 표면에 부착된 HER2-HER3 heterodimer의 인산화된 타이로신을 PTPN1을 처리해 탈인산화 하는 것을 보여주는 개요도이다.
도 3k의 왼쪽 그래프는 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP와 Mg2+을 처리한 시간에 따른 인산화 정도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다 (HER3의 pY1289의 양을 측정), 오른쪽 그래프는 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP와 Mg2+을 처리해 HER3의 타이로신을 인산화시킨 뒤, PTPN1을 처리한 시간에 따른 인산화 정도를 측정한 결과를 보여준다 (HER3의 pY1289의 양을 측정).
도 3l은 표면에 부착된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP, Mg2+, PTPN1, 그리고 eGFP가 표지된 p85a를 한번에 처리해 세포 내의 타이로신 신호전달 체계를 모사하는 것을 표현하는 개요도이다.
도 3m은 도 3l에서 모사한 실험으로 부터 얻어진 형광 신호를 시간에 따라 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3n은 도 3m에서 얻어진 첫번 째 p85a 결합 이후에 새로운 p85a가 동일한 HER2-HER3 heterodimer에 결합되는 데 걸리는 시간을 모아서 한번에 보여주는 그래프이다.
도 4a는 HER2-HER3 heterodimer에 표기된 ATP와 Mg2+ 처리시 HER3 타이로신 잔기의 인산화를 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도 4b는 HER2-HER3 heterodimer에 ATP 처리 농도를 증가시키면서 HER3 Tyr 잔기의 인산화 속도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4c는 HER2-HER2 homodimer를 사용하여 ATP 처리 농도를 증가시키면서 HER2 Tyr 잔기의 인산화 속도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4d는 HER2-HER3 heterodimer와 HER2 homodimer에 여러 농도의 Lapatinib을 선처리 한 뒤, ATP와 magnesium chloride를 후처리하여 얻어진 HER2의 활성화 정도를 Lapatinib 농도에 따라서 나타낸 그래프이다.
도 4e는 HER2-HER3 heterodimer와 HER2 homodimer에 Lapatinib, ATP, 및 magnesium chloride를 동시에 처리하여 얻어진 HER2의 활성화 정도를 Lapatinib 농도에 따라서 나타낸 그래프이다.
도 4f는 HER2-HER3 heterodimer 에 Lapatinib, ATP, 및 magnesium chloride를 다양한 농도의 PTPN1 (Protein Tyrosine Phosphatase, Non-receptor type 1)과 함께 처리하여 얻어진 HER3 Y1289 인산화 수준을 Lapatinib 농도에 따라서 나타낸 그래프이다.
도 5a는 HER2-HER3 heterodimer의 인산화를 억제하는 후보 약물의 스크리닝 과정(HER2-HER3 heterodimer (in vitro) assay)을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 5b는 HER2-HER3 heterodimer에 MCE(MedChemExpress)에서 제공하는 Tyrosine kinase inhibitor library의 280개 후보 물질을 10uM의 양으로 처리하여 얻어진 HER3 Tyr1289 인산화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 도 5b의 결과에서 HER3 Tyr1289 인산화 억제 효과가 우수한 것으로 선택된 33개 화합물을 1uM의 양으로 HER2-HER3 heterodimer에 처리하여 얻어진 HER3 Tyr1289 인산화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5d는 도 5c의 결과에서 HER3 Tyr1289 인산화 억제 효과가 우수한 것으로 선택된 8개 화합물과 억제 효과가 없었던 12개의 약물 HER2-HER3 heterodimer 양성 세포주인 HCC-1419, SK-BR-3, 및 BT-474와, HER2-HER3 heterodimer 음성 세포주인 MCF-7, MDA-MB-231, 및 HCC-1954에 처리하여 얻어진 세포 증식 결과를 보여준다.
도 5e는 도 5c의 결과에서 가장 우수한 3종의 약물(Sapitinib, AEE788, Dacomitinib)을 리간드(NRG1-b1)와 함께 SKBR3에 1시간 또는 18시간 동안 처리한 후, 세포의 활성화 정도를 여러가지 항체 (pHER3, pAkt, pErk 항체)를 이용한 면역 블롯으로 측정한 결과를 보여준다.
도 5f는 도 5c의 결과에서 가장 우수한 효과가 확인된 3종의 약물(Sapitinib, AEE788, Dacomitinib)의 HER3 인산화 저해정도를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5g는 리간드 유무에 따른 SKBR3에 lapatinib을 처리한 경우의 cell viability를 나타낸 그래프이다.
도 5h는 리간드 유무에 따른 SKBR3에 dacomitinib을 처리한 경우의 cell viability를 나타낸 그래프이다.
도 5i는 리간드 유무에 따른 SKBR3에 CUDC-101을 처리한 경우의 cell viability를 나타낸 그래프이다.
도 5j는 리간드 유무에 따른 SKBR3에 Sapitinib을 처리한 경우의 cell viability를 나타낸 그래프이다.
도 5k는 dacomitinib의 항종양 효과를 SKBR3 이종 이식 쥐에서 확인하는 실험의 개요도 이다.
도 5l은 도 5k에서 표시된 날짜에 측정한 종양 조직의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 5m은 lapatinib과 dacomitinib을 단독 처리 (vehicle과 함께 처리)한 후 또는 lapatinib과 dacomitinib을 NRG1-b1과 함께 처리한 경우의 시험 개시 20일이 경과 후 쥐로부터 추출된 암 조직의 최종 무게를 나타낸 그래프이다.
본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예
1:
HER2
-
HER3
heterodimer
형성
기판에
HER2
부착
HER3의 세포내 도메인 말단에 eGFP가 연결된 HER3-eGFP 재조합 유전자(HER3: NM_001982.3 BC082992.1, eGFP: MH087225 링커: PTFLYKVVDPVPVAT 또는 GGGSGGGT, 벡터: pEGFP-N1 addgene, pEGFP-N1-FLAG))를 HER2-overexpressing SKBR3 breast cancer cells(한국세포주은행 또는 ATCC)에 electroporation을 통해 주입하여, HER3의 과발현을 유도한다. 5X10^6개의 SKBR3 세포에 30ug의 HER3-eGFP plasmid를 전기 천공법 (electroporation) 을 이용하여 transfection 한다 (전기 천공법 조건: 950V, 35ms, 2 pulse). 90mm culture dish에 1일동안 배양하여 (RPMI1640, FBS 10%) SKBR3가 HER3-eGFP를 발현할 수 있도록 하였다. 기존의 배지를 제거하고 FBS를 넣지 않은 배지 (RPMI1640) 로 12~18시간동안 배양하여 불특정한 생장인자의 영향을 제거하였다.
상기 준비된 SKBR3에 NRG1-b1 (100ng/ml)을 투입하여 10분동안 incubation 하여, 세포 표면에서의 HER2 단백질과 HER3-eGFP 단백질의 헤테로다이머를 형성을 유도하였다 (도 1a 참조).
HER3-eGFP 발현량에 따른 HER2-HER3-eGFP heterodimer 생성 수준을 전반사 단분자 형광현미경 (single-molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)으로 측정하여, 그 결과를 도 1b에 나타내었다. 도 1b에 나타난 바와 같이, SKBR3에 HER3-eGFP plasmid를 도입시킨 후 NRG1-b1를 처리하지 않은 경우 HER2-HER3 heterodimer가 거의 생성되지 않은 것에 반하여, NRG1-b1를 처리한 경우, HER2-HER3 heterodimer가 HER3-eGFP 발현량에 비례하여 증가함을 확인할 수 있다. 상기 결과는 NRG1-b1을 투입하여야, HER2-HER3 heterodimer를 생성시킬 수 있음을 보여준다.
또한, NRG1-b1를 세포 용해 전에 처리한 경우와 세포 용해 이후에 처리한 경우의 HER2-HER3 heterodimer 생성 수준을 전반사 단분자 형광현미경 (single-molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)으로 측정하여, 그 결과를 도 1c에 나타내었다. 세포 용해는 용해 버퍼 (1% Digitonin 또는 1% GDN, 10% glycerol, 50mM HEPES-NaOH [pH 7.4], 150mM NaCl, 2% protease inhibitor cocktail (Sigmaaldrich P8340) %농도는 모두 w/v)를 사용하여 수행하였다. 도 1c에서와 같이, NRG1-b1를 세포 용해 후에 처리한 경우 (즉, 세포 용해물에 NRG1-b1를 처리; Extract+NRG1-b1), HER2-HER3 heterodimer가 NRG1-b1를 처리하지 않은 경우와 유사한 정도로 거의 생성되지 않은 것에 반하여, NRG1-b1를 세포 용해 전에 처리한 경우, HER2-HER3 heterodimer 생성 수준이 현저하게 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 NRG1-b1를 세포 용해 이전에 투여하여야 HER2-HER3 heterodimer를 생성시킬 수 있으며, 세포 용해와 동시 또는 그 이후에 NRG1-b1를 투여하는 경우 HER2-HER3 heterodimer를 유의미한 수준으로 생성시킬 수 없음을 보여준다.
기판에
HER3
부착
도 1d는 SKBR3 세포에 NRG1-b1을 처리하여 세포 내에 존재하는 HER2와 HER3의 heterodimer를 유도, 추출, 및 검출하는 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다 (HER3 Ab : Novus Biologicals; Cat# BAM348, HER2 Ab : Thermo Fisher; Cat# MA5-15050, Cy3-labeled Ab : Jackson ImmunoResearch Labs; Cat# 111-165-046). 항-HER2 항체를 이용하여 HER2 immunolabeling count (전반사 단분자 형광현미경으로 측정한 형광 스팟 수)를 측정하여, HER2-HER3 heterodimer 생성양을 측정할 수 있다.
도 1d를 참조하여, NRG1-b1 처리시 및 무처리시의 HER2-HER3 heterodimer의 양을 측정하여, 그 결과를 도 1e에 나타내었다. 도 1e에 나타난 바와 같이, NRG1-b1 처리시 기판에 첨가한 단백질 농도가 증가할수록 HER2-HER3 heterodimer 양이 증가하는 반면, NRG1-b1 무처리시에는 첨가한 단백질 농도와 관련없이 HER2-HER3 heterodimer가 거의 생성되지 않음을 알 수 있다.
HER2와 HER3를 발현하는 유방암 세포주 3 종 (SKBR3, BT474, 및 HCC1419, 이상 한국세포주은행에서 입수)에 리간드(NRG1-b1)를 처리하여 HER2-HER3 heterodimer 생성을 유도하고, HER2-HER3 heterodimer 생성이 유도된 세포 용해물을 항-HER3 항체로 표면 처리된 기판 처리하여 HER2-HER3 heterodimer를 면역 침강시킨 후, 항-HER2 항체를 이용하여 HER2 immunolabeling count를 측정하여, HER2-HER3 heterodimer 생성양을 측정하였다. 상기 결과를 도 1f에 나타내었다. 상기 세포주 SKBR3, BT474, 및 HCC1419는 HER2 과발현 세포주이며, HER3를 함께 발현한다.
도 1d의 과정을 따라, 세포 용해물을 다양한 종류의 항체를 이용하여 기판에 부착했을 때, 리간드(NRG1-b1) 처리 여부 및 기판에 부착된 항체 종류를 다르게 하여 HER2-HER3 heterodimer 생성 정도를 측정한 결과를 도 1g에 나타내었다 (IP: 기판에 처리한 항체의 표적분자; Detection: 도 1d의 Detection 과정에서 사용된 항체의 표적). 도 1g에 나타난 바와 같이, 리간드를 처리하지 않았을 때의 EGFR-HER3, EGFR-HER2, HER2-HER3 heterodimer 및 리간드를 처리했을 때의 EGFR-HER3 heterodimer 생성량은 리간드를 처리했을 때의 HER2-HER3 heterodimer의 생성량에 비하여 매우 적다. 이러한 결과는 리간드 처리에 의하여 HER2-HER3 heterodimer가 특이적으로 생성됨을 보여준다.
phospho-RTK array (Phospho-RTK Array Kit; Cat# ARY001B, R&D systems)를 사용하여 리간드 처리 전후 SKBR3 세포의 RTK 인산화 정도를 측정하여 그 결과를 도 1h에 나타내었다. 상기 phospho-RTK array에는 표시된 각 위치에 해당 물질을 표적으로 하는 항체가 도포되어 있다. 각각 NRG1-b1이 미처리(-) 또는 처리(+)된 SKBR3 세포 추출물을 phospho-RTK array에 뿌려주어 array에 해당 단백질을 면역 침강한 뒤에 phospho-tyrosine 항체를 처리해 해당 단백질의 인산화 정도를 측정할 수 있다. 도 1h에서 스팟의 색이 진할수록 인산화 정도가 높음을 의미한다. 도 1h에 나타난 바와 같이, SKBR3에 NRG1-b1을 처리했을 때 HER3의 인산화 정도가 주요하게 증가하는 것을 확인할 수 있다.
계면활성제(detergent) 처리
세포 용해시의 계면활성제 처리
다양한 종류의 계면활성제 처리시의 HER2와 HER3-eGFP의 이합체 형성 정도를 eGFP count로 측정하여, 그 결과를 도 1l에 나타내었다. HER2 과발현 세포주인 SKBR3에 HER3-eGFP를 발현시킨 뒤에 도면에 표기된 다양한 계면활성제(1%(w/v); Digitonin, GDN, CHAPSO, DDM, 또는 TX100)를 이용해 세포 용해물을 얻었다. 항-HER2 항체를 이용하여 HER2-HER3 heterodimer를 기판에 면역 침강한 뒤에 eGFP 신호를 측정하여 정량하였다. Lysis는 1%(w/v) 농도로 진행하였다. HER2-HER3 heterodimer를 검출하는 데에는 다른 계면활성제를 사용해도 무방하다.
EGFR 이합체 (homodimer)의 인산화 활성도를 확인하기 위하여, 면역침강된 EGFR의 인산화 정도를 eGFP 표지된 p85a(eGFP-p85a)와의 상호작용으로 측정하여, 그 결과를 도 1m에 나타내었다. EGFR 발현 세포주인 HCC1666(한국세포주은행)에 EGF(Life Technologies PHG0311L)를 처리한 뒤에 도면에 표기된 계면활성제(1%(w/v); Digitonin 또는 TX100)를 이용해 세포 용해물을 얻었다. EGFR 항체(Thermo scientific MS-378-B1)를 이용하여 이합체를 기판에 면역 침강한 뒤에 ATP(200 uM)와 EDTA(1mM) 또는 Mg2+( 10mM)을 추가로 첨가하여 인산화 시켰다. 이러한 결과는 Digitonin을 사용하는 것이 모든 단백질의 활성도 유지에 적용할 수 있는 것은 아님을 보여준다. 하기하는 도 2d의 결과와 함께 고려할 때, EGFR의 활성도는 다른 종류의 detergent를 사용해도 유지가 되는 반면, HER2-HER3 heterodimer의 활성도는 digitonin 또는 GDN을 사용하는 경우에 유지됨을 확인할 수 있다. HER2-HER3 heterodimer 검출은 다른 종류의 detergent를 사용해도 무방하다.
세포
용해물로부터
기판에 부착된
HER2
-
HER3
heterodimer에
계면활성제 처리(세척)
상기와 같은 세포 용해 이후에, 상기 세포 용해물을 기판에 처리해 HER2-HER3 heterodimer를 기판에 부착한 뒤 detergent로 세척하였다. detergent 종류에 따른 HER3 활성화 정도를 시험하기 위하여, detergent로서, DGTN(digitonin) 0.10%(w/v), GDN 0.01%(w/v), CHAPSO (3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate) 1.00%(w/v), OG(n-octyl-
-D-glucoside) 1.00%(w/v), DDM(n-Dodecyl 
-D-maltoside) 0.01%(w/v), 및 TX100 0.10%(w/v)를 각각 사용하여 세척한 후, HER3의 Y1289의 인산화 정도를 전반사 단분자 형광현미경 (single-molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)으로 측정하여, 그 결과를 도 2d에 나타내었다.
도 2d에서와 같이, 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer를 세척시, detergent로서 digitonin 또는 GDN를 사용하는 경우, HER3의 Y1289의 인산화 정도가 높게 나타난 반면, CHAPSO, OG, DDM, 및 TX100를 사용한 경우에는 낮게 나타남을 알 수 있다.
또한, detergent 농도에 따른 HER3 활성화 정도를 시험하기 위하여, 대표적으로 digitonin와 GDN을 다양한 농도로 사용하여 세포 용해물을 세척한 경우의 HER3의 Y1289의 인산화 정도를 전반사 단분자 형광현미경 (single-molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)으로 측정하여, 그 결과를 도 2c에 나타내었다. 도 2c에서, 각각 점선으로 표시된 Digitonin과 GDN의 CMC(Critical Micelle Concentration) 농도의 전후로 면역 침강 후에 일어나는 인산화의 크기가 급격하게 바뀌는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터 면역 침강된 이합체의 활성도가 계면활성제에 의해 보호되는 세포막 투과 영역과 연관되어 있다고 할 수 있다 (그 이유는, CMC보다 낮은 농도에서는 계면활성제가 미셀(micelle)을 형성하지 않아서 소수성의 세포막 투과 영역을 감싸고 있을 수 없기 때문이다). 도 2c의 오른쪽에 기재된 기재는, 1%(w/v) 농도의 Digitonin 또는 GDN으로 SKBR3 세포를 용해한 뒤, 면역 침강하고; 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer를 다양한 농도의 계면활성제로 세척하고 (그래프에서 한 점이 해당 농도의 계면활성제로 세척한 독립적인 실험임); CMC 이상의 계면활성제 (Digitonin은 0.1%(w/v), GDN은 0.01%(w/v))가 첨가된 용액에 ATP와 Mg2+을 넣어 인산화를 유도함을 의미한다. 도 2c에 나타난 바와 같이, digitonin의 경우, 세포 세척시의 사용 농도를 약 0.05%(w/v) 이상으로 하는 경우에 HER3 활성화 정도가 우수하고, 이보다 낮은 경우, 활성화 정도가 감소함을 확인할 수 있다.
또한, 세포 용해물로부터 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer를 다양한 종류와 농도의 계면활성제(도 2d 참조)를 이용하여 각각 세척한 뒤에 ATP와 Mg2+을 첨가하고, 인산화된 HER3 Y1289를 측정하여, 그 결과를 도 2d에 나타내었다. 모든 경우에 해당 계면활성제의 CMC 이상에서 진행되었다. 상기 인산화 측정은 하기의 실시예 3 및 도 2a를 참조하여 수행하였다. 도 2d에 나타난 결과로부터 이 결과로부터 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer의 활성도는 특정 계면활성제 (Digitonin, GDN)을 이용할 때만 유지할 수 있다는 것을 알 수 있다. 도 2d의 오른쪽 기재는, 1%(w/v) 농도의 각 계면활성제로 SKBR3 세포를 용해한 뒤, 면역 침강하고; 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer를 다양한 종류의 계면활성제로 세척하고(그래프에서 한 점이 해당 농도의 계면활성제로 세척한 독립적인 실험임); CMC 이상의 Digitonin이 첨가된 용액에 ATP와 Mg2+을 넣어 인산화를 유도함을 의미한다.
HER2
-
HER3
heterodimer의
기판 부착
본 실시예에서 HER2-HER3 heterodimer를 기판에 부착시키는 과정은 다음과 같다: 기판(substrate)에 PEG, neutravidin, biotin, 및 anti-HER3 antibody를 표면처리 한 후 (아래 참조), 세포 용해물을 주입하여 HER2-HER3 heterodimer를 기판 표면에 부착한 뒤, digitonin (0.1%(w/v))로 세척한다.
(1) PEG 표면 처리
a. Coverslip과 quartz slide를 황산과 과산화수소 2:1 용액 (piranha 용액) 에 30분동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 18 MΩ 증류수에 10분동안 중화시켰다.
b. 중화된 coverslip과 slide를 18 MΩ 증류수에 5회 이상 세척하였다.
c. Coverslip과 slide를 aminosilane 용액 (3ml N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine, 5ml acetic acid, 92ml methanol) 에 20분동안 반응시키고, 반응이 끝나면 methanol로 2회 세척하고 methanol에 완전히 잠기게 두었다.
d. 압축 질소 가스를 이용해 준비된 coverslip과 slide를 건조시켰다. PEG 버퍼 (42mg Sodium bicarbonate, 347.5mg potassium sulfate을 5ml 18 MΩ 증류수에 용해)를 준비하였다.
e. Slide에 PEG 용액 (3mg biotin-PEG, 100mg mPEG, at 1ml of PEG 버퍼에 용해)을 도포한 뒤, coverslip으로 덮어 slide와 coverslip 사이에 PEG 용액이 골고루 묻게 하고, 2시간 동안 반응시켰다.
f. 반응이 끝난 coverslip과 slide를 18 MΩ 증류수로 씻어 내고 압축 질소 가스로 건조시켰다. 완성된 coverslip과 slide는 PEG용액이 처리된 면이 접촉되지 않도록 50ml tube에 넣어 진공 포장 후 냉동하였다 (-20℃). Coverslip과 slide의 PEG용액이 처리된 면에 어떠한 접촉도 없도록 하였다.
(2) 조립 및 사용
a. 얼려두었던 coverslip과 slide를 37℃ 인큐베이터에서 녹여 물방울이 맺히지 않도록 하였다.
b. PEG 처리된 coverslip과 slide의 면이 서로 마주보도록 하여 양면 테잎과 에폭시등을 이용하여 coverslip과 slide 사이에 반응 chamber를 만들었다.
c. 에폭시가 충분히 굳으면 neutravidin 용액 (100ug/ml neutravidin, PBS 또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)을 chamber에 넣고 5분동안 반응시켰다.
d. Chamber에 남아있는 neutravidin용액을 PBS로 씻어내고 biotin conjugated된 항 HER2 항체 (eBioscience, Cat.No. BMS120BT, clone 2G11) 또는 항 HER3 항체 (R&D systems, Cat.No. BAM348, clone: #66201) (2~5ug/ml, PBS 또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl) 를 넣고, 5분 동안 반응시켰다.
e. Chamber에 남아있는 항체를 PBS로 씻어내고, 상기 세포 용해물을 주입한 후, 15분 동안 반응시켰다.
f. Chamber에 남아있는 용해물을 washing buffer (0.1% digitonin, 또는 0.01% GDN, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl, 1% glycerol)로 세척하였다.
실시예
2.
HER2
-
HER2
homodimer
형성
실시예 1의 방법을 참조하여, HER2의 세포내 도메인 말단에 eGFP가 연결된 HER2-eGFP 재조합 유전자(HER2: NM_004448, 링커 PTFLYKVVDPVPVAT 또는 GGGSGGGT, eGFP: MH087225, 벡터: pEGFP-N1 addgene pEGFP-N1-FLAG)를 HEK293T 세포주(한국세포주은행, 또는 ATCC)에 electroporation을 통해 주입하여, HER2의 과발현을 유도하고, 상기 세포 표면에서의 HER2-HER2 homodimer(HER2 homodimer로도 표시함)의 형성을 유도하였다. 상기 준비된 HER2 homodimer 형성 세포를 용해(lysis)한 후, 기판에 처리해 HER2 homodimer를 부착하였다. 상기와 같은 HER2-HER2 homodimer 생성 및 기판 부착 과정을 도 1i에 모식적으로 나타내었다.
실시예 1의 과정을 참조하여, 기판(substrate)에 PEG, neutravidin, biotin, 및 anti-HER2 antibody를 표면처리 한 후, 세포 용해물을 주입하여, HER2 homodimer를 기판 표면에 부착시킨 뒤, 상기 DGTN(digitonin) 0.1%(w/v)로 세척하였다.
상기와 같이 기판에 부착된 HER2-eGFP-HER2-eGFP homodimer 또는 HER2-eGFP monomer로부터 나오는 형광 신호를 전반사 형광 현미경(TIRF)로 측정하여 그 결과를 도 1j에 나타내었다.
또한, 상기 도 1j에서 homodimer 또는 monomer로부터 얻은 형광신호에서 단분자 형광 신호 꺼짐 현상을 관찰하여, 2단계로 꺼짐 (dimer)과 2단계 이상으로 꺼짐 (oligomer)의 비율을 구하여, 도 1k에 나타내었다. 단분자 형광 신호 꺼짐 현상은, 형광 분자에 excitation laser를 계속 비춰서 형광 신호를 계속 얻다 보면 해당 형광 분자가 변성되어 형광 신호가 나오지 않게 되는데, 이러한 현상은 확률적으로 일어나기 때문에, 여러 개가 한 위치에 몰려 있는 경우 (예컨대 이합체 또는 그 이상의 다량체) 한 위치에서 계단 형태로 줄어드는 형광 신호를 관찰할 수 있으며, 이 때 계단의 개수를 세면 해당 위치에 몰려있는 형광 분자의 개수를 알 수 있다.
도 1k에서, 1-step으로 형광 세기가 감소하는 경우는 monomer에 해당하고, 2-step으로 형광 신호가 감소하는 경우는 dimer에 해당한다. 도 1k에서, 상대적으로 monomer로 존재할 가능성이 높은 eGFP와 HER3-eGFP와 비교하여 HER2-eGFP는 2-step의 비율이 높게 나왔으므로, HER2-eGFP homodimer의 생성을 증명할 수 있다. Hidden Markov Model에 기반하여 raw data로부터 가장 가능성이 높은 step (recursive calculation이 수렴하는 step)을 정하여 분석하였다.
부착된 HER2 homodimer를 detergent를 이용해 세척하였다. 실시예 1의 시험과정을 참조하여, 다양한 detergent를 다양한 농도로 사용하여 부착된 HER2 homodimer를 세척한 결과 얻어진 HER2 Y1196의 인산화 수준(활성화 정도)을 도 2i에 나타내었다. 도 2i에서와 같이, detergent로서 DGTN(digitonin)를 0.05%(w/v) 이상 또는 0.10%(w/v) 이상을 사용하거나, GDN 0.01%(w/v) 이상 사용하여 부착된 HER2 homodimer를 세척한 경우, HER2 활성화 정도가 높은 것으로 나타났다.
실시예
3.
HER2
-
HER3
heterodimer의
tyrosine
kinase의
활성도(activity) 측정
면역 침전된 HER2-HER3 heterodimer (실시예 1에서 기판에 처리된 항체에 결합한 HER2-HER3 heterodimer)의 반응 챔버에 ATP와 Mg2 +를 추가하고 5분동안 배양하여, Tyr 인산화를 유도하였다. 이후 pTyr-specific antibodies로 single-molecule immunolabeling하여 HER3 pTyr levels의 변화를 관찰하였다. 상기 시험 과정을 도 2a에 모식적으로 나타내었으며 (1. 세포 용해, 2. 기판에 dimer 부착, 3. 부착된 dimer 세척, 4. ATP와 Mg2+을 처리해 인산화, 5. HER3 또는 HER2의 인산화 Tyr 결합 항체 처리, 6. 형광 신호 검출), 그 구체적인 시험 방법은 다음과 같다:
실시예 1의 (2) 조립 및 사용에서, biotin conjugated HER3 antibody를 이용해 설명한 방법을 참조하여, 세포 용해물 (1~4 mg/ml)로부터 HER2-HER3 heterodimer를 표면에 pull-down한 뒤, 0.1% DGTN 또는 0.01% GDN, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl, 1% glycerol 를 이용해 남은 세포 용해물을 씻어내고, kinase assay 용액 (0.1% DGTN 또는 0.01% GDN, 200uM ATP, 10mM magnesium chloride, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl, 1% glycerol)을 처리하여 5분 동안 반응시켰다.
b. 남은 kinase assay 용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)로 씻어내고, HER3 pTyr antibody 용액 (HER3 pTyr antibody (monoclonal rabbit host) (Cell Signaling Technology, Cat.No.#4791S, clone:21D3) ~2ug/ml, PBS 또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl) 을 처리해 5분 동안 반응시켰다.
c. 남은 HER3 pTyr antibody 용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)로 씻어내고, cy3 conjugated anti-rabbit FC antibody 용액 (polyclonal goat host anti-rabbit FC antibody (Jackson ImmunoResearch Labs, Cat.No.111-165-046) at 5nM, PBS 또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)을 처리하고, 5분 동안 반응시켰다.
d. 남은 cy3 conjugated anti-rabbit FC antibody 용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)로 씻어내고 Total Internal Reflection Microscope을 이용해 이미징 및 정량하였다.
이와 같이 얻어진 HER3 pTyr levels을 도 2b에 나타내었다. HER3 tail의 Tyr residues는 총 9개이고, 본 실시예에서는 Y1197, Y1222, Y1276, Y1289, 및 Y1328의 총 5개의 Tyr 잔기를 시험하였다. 도 2b에 나타난 바와 같이, pTyr 잔기 모두 ATP와 Mg2+ 배양에 의해 인산화 정도가 증가하였다.
상기 세포 용해물 (1% digitonin 또는 1% GDN를 사용하여 용해 및 면역침전됨)로부터 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer를 다양한 농도의 digitonin 또는 GDN을 사용하여 각각 세척한 뒤에 ATP와 Mg2+을 첨가하여, 인산화된 HER3 Y1289를 측정하여, 그 결과를 도 2c에 나타내었다. 또한, 상기 세포 용해물(1% digitonin를 사용하여 용해 및 면역침전됨)로부터 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer를 도 2d에 표시된 종류와 농도의 계면활성제를 이용하여 각각 세척한 뒤에 ATP와 Mg2+을 첨가하고, 인산화된 HER3 Y1289를 측정하여, 그 결과를 도 2d에 나타내었다. 도 2c 및 도 2d에서와 바와 같이, 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer의 사용되는 계면활성제로서 digitonin 또는 GDN를 사용하는 경우, HER2-HER3 heterodimer의 인산화 정도가 현저히 높게 나타남을 확인할 수 있다.
도 2e는 HER2-HER3 heterodimer가 기존에 EGFR homodimer에 의해 알려진 것과 동일한 활성화 메커니즘을 따른다는 것을 보이기 위해, EGFR과 상응하는 단일 위치 변이를 각각 HER2와 HER3에 도입시키는 과정을 보여주는 개요도이다. HER2의 714번째 Isoleucine(I)을 Glutamine(Q)로 변이(I714Q)하면 HER2의 인산화효소가 다른 EGFR family 단백질들에 의해 활성화될 수 없다. HER2의 956번째 Valine(V)을 Arginine(R)으로 변이(V956R)하면 HER2가 다른 EGFR family 단백질들의 인산화효소를 활성화시킬 수 없다. HER3의 926 번째 Valine(V)을 Arginine(R)으로 변이(V926R)하면 HER3가 다른 EGFR family 단백질들의 인산화효소를 활성화시킬 수 없다.
상기와 같이 도 2e에서 설명한 단일 위치 변이를 각각 HER2와 HER3에 도입시켰을 때, HER2-HER3 heterodimer의 활성화 정도를 HER3의 Y1289의 인산화 정도로 측정하고, 그 결과를 도 2f에 나타내었다. HER2-HER3 heterodimer에서, HER2에 V956R 변이가 있어도 HER2-HER3 heterodimer의 인산화 기능은 저해되지 않는 반면, HER3에 V926R 변이가 있는 경우는 HER3가 HER2의 인산화효소를 활성화 시킬 수 없기 때문에 인산화 기능이 저해되고, 마찬가지로 HER2에 I714Q 변이가 있는 경우, HER3에 의해 HER2 인산화효소가 활성화될 수 없기 때문에 인산화 기능이 저해되는 것을 확인할 수 있다. 이 결과를 통해 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer가 기존에 알려진 EGFR family의 활성화 메커니즘을 따른다는 것을 확인할 수 있다.
실시예
4.
HER2
-
HER3
heterodimer
및
HER2
-
HER2
homodimer의
하위 신호전달 단백질과의 상호작용 측정
도 3a는 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer가 인산화 과정을 거쳤을 때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을 보여주는 모식도이다.
도 3a에서 설명된 시험 과정에 따라서, 하나의 HER2-HER3 heterodimer에 의해 유도된 하위 신호전달 단백질의 형광 신호를 관찰하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예에서 설명된 바와 같이 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer를 인산화한 후(도 3b에서 ②로 표기된 trace) 또는 인산화하지 않은 후(도 3b에서 ①로 표기된 trace), eGFP가 표지된 PLCgSH2(PLC-gamma-SH2)(PLC-gamma (NM_013187.1) 중에서 545-765 아미노산 또는 NP_002651.2 중에서 540-765 아미노산을 cloning 하여 사용하여 eGFP(MH087225)를 부착시킴)를 처리해 HER2-HER3 heterodimer와 PLCgSH2와의 상호작용을 형광세기로 측정하여, 그 결과를 도 3b에 나타내었다. 도 3b의 그래프는 단일 HER2-HER3 heterodimer에 결합한 PLCgSH2의 형광신호를 시간에 따라 측정한 것으로, 인산화 후에 PLCgSH2를 처리한 경우 여러 개의 PLCgSH2가 heterodimer에 결합해 있는 것을 단일 형광 분자꺼짐 (실시예 2, 도 1k 참조) 측정을 통해 확인할 수 있다.
도 3c는 하나의 HER2-HER3 heterodimer이 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3d는 하나의 HER2-HER3 heterodimer이 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 a; Human p85a (NP_852664.1))과 상호작용하는지를 형광신호의 크기 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3e는 하나의 HER2-HER3 heterodimer이 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PI3K : p85 a - p110 a (NM_006218.3) complex)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기로 보여주는 그래프이다.
단일 형광 분자는 일정 확률에 의해 형광을 내지 않는 상태로 변성된다. 만일 여러개의 형광 분자가 한 군데에 몰려 있는 것을 시간에 따라 관찰하면, 여러개의 형광 분자가 일정 확률로 꺼지기 때문에, 한번에 다 꺼지는 것이 아니라 무작위로 하나씩 꺼지는 것을 관찰할 수 있다. 전자 증폭식 전하결합소자 카메라를 이용해 이 신호를 측정하면, 여러 개의 계단형태의 신호를 얻을 수 있다. 계단의 개수(단일형광분자꺼짐 개수)를 세면 한 군데에 몇 개의 형광 분자가 몰려 있는지 알 수 있다.
도 3c, 3d, 및 3e에서, 상단의 두 개의 그래프는 eGFP가 표지된 PLCgSH2, p85a, 또는 PI3K들이 heterodimer에 결합했을 때 형광의 세기를 측정한 것이다 (왼쪽은 인산화 전, 오른쪽은 인산화 후). 하단 그래프는 eGFP가 표지된 PI3K들이 heterodimer에 결합했을 때 나오는 형광 신호를 시간에 따라 측정한 뒤에 단일 형광 분자 꺼짐의 갯수를 센 것이다.
도 3f는 기판에 부착된 HER2 homodimer가 인산화 과정을 거쳤을 때 eGFP 표지된 하위 신호전달 단백질과의 상호작용을 유도한다는 것을 보여주는 모식도이다.
도 3g는 하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PLC gamma 1)과 상호작용하는지를 형광신호의 크기 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3h는 하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (p85 a)과 상호작용하는지를 형광신호 및 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3i는 하나의 HER2 homodimer에 얼마나 많은 양의 하위 신호전달 단백질 (PI3K : p85a - p110a complex)과 상호작용하는지를 각각 형광신호의 크기와 형광신호로부터 얻은 단일 분자 꺼짐 현상의 개수로 보여주는 그래프이다.
도 3f, 3g, 및 3h에서, 상단의 두 개의 그래프는 eGFP가 표지된 PLCgSH2, p85a, 또는 PI3K들이 homodimer에 결합했을 때 형광의 세기를 측정한 것이다 (왼쪽은 인산화 전, 오른쪽은 인산화 후). 하단의 그래프는 eGFP가 표지된 PLCgSH2, p85a, 또는 PI3K들이 homodimer에 결합했을 때 나오는 형광 신호를 시간에 따라 측정한 뒤에 단일 형광 분자 꺼짐의 갯수를 센 결과를 보여준다.
도 3j는 표면에 부착된 HER2-HER3 heterodimer의 인산화된 타이로신을 PTPN1을 처리해 탈인산화시키는 과정을 보여주는 모식도이다. 세포 안에서는 HER2-HER3 heterodimer의 인산화가 일어나면서 동시에 탈인산화 효소들에 의해 탈인산화도 동시에 진행된다고 알려져 있다. 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP와 Mg2+을 처리해 인산화를 진행하는 동시에 탈인산화효소인 PTPN1(Protein Tyrosine Phosphatase, Non-receptor type 1; ProSpecbio, Cat.No. PKA-219))을 처리하면, 인산화와 탈인산화의 메커니즘을 확인할 수 있다.
도 3k의 왼쪽 그래프는 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP와 Mg2+을 처리한 시간에 따른 인산화 정도를 측정한 결과를 보여주고 그래프이다 (HER3의 pY1289의 양을 측정), 오른쪽 그래프는 면역 침강된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP와 Mg2+을 처리해 HER3의 타이로신을 인산화시킨 뒤, PTPN1을 처리한 시간에 따른 인산화 정도를 측정한 결과를 보여준다 (HER3의 pY1289의 양을 측정).
도 3l은 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP, Mg2+, PTPN1, 그리고 eGFP가 표지된 p85a를 한번에 처리하여, 세포 내의 타이로신 신호전달 체계를 모사하는 것을 표현하는 모식도이다.
도 3m은 도 3l에서 모사한 실험으로부터 얻어진 형광 신호를 시간에 따라 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. HER2-HER3 heterodimer를 면역 침강한 뒤에 ATP, Mg2+, PTPN1, 그리고 eGFP가 표지된 p85a를 한번에 처리한 뒤에 heterodimer에 결합한 p85a로부터 발생한 eGFP 형광 신호를 시간에 따라 측정하였다. 도 3m에서, Trace에 표시된 숫자는 p85a가 heterodimer에 결합할 때 증가하는 신호 계단의 개수를 나타내는 것으로, 하나의 heterodimer에 결합하고 있는 p85a의 개수를 대변한다. 첫 번째 p85a의 결합 이후에 추가로 p85a가 결합하는 데 걸리는 시간을 delta(Δ)_t로 표시하였다.
도 3n은 도 3m에서 얻어진 첫 번째 p85a 결합 이후에 새로운 p85a가 동일한 HER2-HER3 heterodimer에 결합되는 데 걸리는 시간을 모아서 한번에 보여주는 그래프이다. 도 3k에서 측정된 시간에 따른 인산화와 탈인산화와 그래프로부터 얻어진 인산화와 탈인산화 속도와 비교하여, 첫 번째 p85a 결합 이후에 새로운 p85a가 상대적으로 오랜 시간이 지난 후에도 결합하는 것으로 나타난다.
상기 결과들로부터 도 3l에서 고안된 실험에서 인산화, 탈인산화와 p85a의 결합이 순차적이 아닌 복합적으로 일어나는 것을 알 수 있다 (즉, heterodimer는 주어진 여러 개의 타이로신 위치들을 인산화하며, PTPN1은 인산화된 타이로신을 탈인산화하고, 그 와중에 남은 인산화 타이로신에 p85a가 결합한다).
실시예
5.
HER2
-
HER2
homodimer의
tyrosine
kinase의
활성도(activity) 측정
면역 침전된 HER2-HER2 heterodimer (실시예 2에서 기판에 처리된 항체에 결합한 HER2-HER2 homodimer)의 반응 챔버에 ATP와 Mg2 +를 추가하고 5분동안 배양하여, Tyr 인산화를 유도하였다. 이후 pTyr-specific antibodies로 single-molecule immunolabeling하여 HER2 pTyr levels의 변화를 관찰하였다. 상기 시험 과정을 도 2g에 모식적으로 나타내었으며, 그 구체적인 시험 방법은 다음과 같다:
a. 실시예 1의 (2) 조립 및 사용에서, biotin conjugated HER2 antibody를 이용해 설명한 방법을 참조하여, 세포 용해물로부터 HER2 homodimer를 표면에 pull-down한 뒤, 0.1% DGTN 또는 0.01% GDN 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl, 1% glycerol 를 이용해 남은 세포 용해물을 씻어내고, kinase assay 용액 (0.1% DGTN 또는 0.01% GDN, 200uM ATP, 10mM magnesium chloride, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl, 1% glycerol) 을 처리하여 5분 동안 반응시켰다.
b. 남은 kinase assay 용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)로 씻어내고, HER2 pTyr antibody 용액 (HER2 pTyr antibody (monoclonal rabbit host)(Cell Signaling Technology, Cat.No.#6942S, clone:D66B7) ~2ug/ml, PBS 또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl) 을 처리해 5분 동안 반응시켰다.
c. 남은 HER2 pTyr antibody 용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)로 씻어내고, cy3 conjugated anti-rabbit FC antibody 용액 (polyclonal goat host anti-rabbit FC antibody (Jackson ImmunoResearch Labs, Cat.No.111-165-046) at 5nM, PBS 또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl)을 처리하고, 5분 동안 반응시켰다.
d. 남은 cy3 conjugated anti-rabbit FC antibody 용액을 PBS (또는 0.1% Triton-X-100, 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl) 로 씻어내고 Total Internal Reflection Microscope을 이용해 이미징 및 정량하였다.
이와 같이 얻어진 HER2 pTyr levels을 도 2h에 나타내었다. 도 2h에 나타난 바와 같이, HER2 tail의 Tyr residues Y1139, Y1196, Y1121/1222 및 Y1248의 거의 대부분에서 ATP와 Mg2+ 배양에 의해 인산화가 증가하였다 (인산화 증가 정도: Y1139의 경우, 대조군 (ATP+EDTA) 대비 약 23배; Y1196의 경우, 대조군 대비 약 13배, Y1121/1222의 경우, 대조군 대비 약 10배, 및 Y1248의 경우, 대조군 대비 약 13배).
실시예
6.
HER2
-
HER3
heterodimer와
HER2
-
HER2
homodimer의
인산화 속도 비교
HER2-HER3 heterodimer를 사용한 실시예 3의 방법을 참조하여, 시간에 따른 HER3 Y1289의 인산화 정도를 측정하여, 도 4a에 나타내었다. HER2-HER3 heterodimer가 세포의 proliferation을 강하게 유도한다는 것은 알려져 있었지만 효소적 특성은 알려지지 않았다. 도 4a는 HER2-HER3 heterodimer의 효소적 성능을 측정한 것이라고 할 수 있다 (인산화에 사용되는 연료인 ATP의 특정한 농도에서 HER2-HER3 heterodimer가 얼마나 빨리 인산화를 진행하는지 보여줌). 도 4a에서 x축은 인산화에 걸린 시간, y축은 해당 시간동안 인산화된 Tyr의 양을 나타낸다.
또한, HER2-HER3 heterodimer를 사용한 실시예 3의 방법을 참조하여, ATP 농도를 증가시키면서 HER3 Tyr 잔기의 인산화 속도를 측정하였다. 이는 ATP의 농도에 따라 heterodimer가 인산화하는 속도가 어떻게 변하는지 알아보기 위한 것이다. 다양한 ATP 농도에서 인산화 속도를 측정하면 Kinase의 성능을 나타내는 척도인 KM(마이캘리스 상수)과 kcat;max (최대 인산화 속도)을 측정할 수 있다. KM은 인산화 속도가 최대 인산화 속도의 절반이 되는 ATP 농도이며, KM에 해당하는 ATP 농도에서 인산화 속도를 측정하면 최대 인산화 속도의 절반이 얻어지고, kcat;max는 최대 인산화 속도로 kinase가 도달 할 수 있는 최대 인산화 속도이다.
상기 얻어진 결과를 도 4b에 나타내었다 (점선은 붉은 선이 수렴하는 값을 나타냄). 도 4b의 데이터는 주로 HER3의 Tyr1289를 측정한 것으로, 다른 Tyr (1197, 1222, 1276, 1328)을 측정했을 때에도 비슷한 수준의 인산화 속도가 측정되는 것으로 보아 측정된 값이 특정 Tyr에만 해당하는 것이 아님을 알 수 있다. 도 4b에서와 같이, ATP 농도가 증가함에 따라서, HER3 Tyr 잔기의 인산화 속도도 증가함을 확인할 수 있다.
비교를 위하여, HER2-HER2 homodimer를 사용한 실시예 4의 과정을 참조하여, ATP 농도를 증가시키면서 HER2 Tyr 잔기 (Y1196)의 인산화 속도, KM, 및 kcat;max를 측정하여, 도 4c에 나타내었다.
도 4b 및 4c의 비교로부터 알 수 있는 바와 같이, HER2-homodimer의 kcat;max가 HER2-HER3 heterodimer보다 150배 정도 낮게 나타났으며, 이는 HER2-HER3 heterodimer의 인산화 속도가 HER2-homodimer보다 100배 이상 빠르다는 것을 의미한다. 반면, HER2-HER3 heterodimer에서의 인산화의 KM은 HER2-homodimer와 비교하여 2배 이하의 수치를 나타내어, 이 둘 간 ATP에 의한 영향은 큰 차이가 없음을 알 수 있다.
실시예
7.
HER2
-
HER3
heterodimer와
HER2
-
HER2
homodimer의
lapatinib에
대한 저항성 비교
HER2 억제제인 Lapatinib을 실시예 1에서 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer와 실시예 2에서 기판에 부착된 HER2 homodimer 에 각각 처리한 후, 실시예 3 및 4의 과정을 참조하여, ATP (100uM)와 magnesium chloride(10mM)를 처리하고 (이 때에도 DGTN은 0.1%로, GDN은 0.01%로 유지해야 함), 각 HER2 dimer들의 활성화 정도를 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 4d에 나타내었다. 도 4d에서, x축은 사용한 Lapatinib의 농도를 나타내고, y축은 표준화된 인산화 정도를 나타낸다. HER2-HER3 heterodimer의 활성화는 HER3 pY1289 항체를 이용해 측정한 것으로 Lapatinib이 없을 때를 100%로 하여 표준화하였고, HER2 homodimer의 활성화는 HER2 pY1196 항체를 이용하여 측정한 것으로 Lapatinib이 없을 때를 100%로 하여 표준화한 값이다. 도 4d에 나타난 바와 같이, Lapatinib은 Lapatinib에 저항성이 없는 HER2-homodimer와 HER2-HER3 heterodimer에 유사한 저해 곡선을 보이는 것으로 확인되었다.
실시예 1에서 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer와 실시예 2에서 기판에 부착된 HER2 homodimer에, Lapatinib, ATP (100uM), 및 magnesium chloride(10mM)를 함께 처리하고(이 때에도 DGTN은 0.1%로, GDN은 0.01%로 유지해야 함), HER2의 활성화 정도를 측정하여, 그 결과를 도 4e에 나타내었다. 도 4e에서와 같이, HER2 homodimer와 비교하여, HER2-HER3 heterodimer의 경우, HER2 homodimer와 비교하여, Lapatinib에 의한 저해 효과가 낮게 나타났다. 이러한 결과는 HER2-HER3 heterodimer 발현 세포가 ATP와 magnesium 존재 하에서 (Tyr 인산화 가능한 경우) Lapatinib에 대하여 저항성을 가짐을 보여준다. 앞서 실시예 5에서 HER2-HER3 heterodimer가 HER2-homodimer와 비교하여 인산화 속도가 현저히 빠르다는 것이 확인되었으므로, 이러한 인산화 속도가 저해제 (Lapatinib)에 대한 저항성과 관련이 있다고 할 수 있다 (즉, 인산화 속도가 빠를수록 저해제 저항성이 잘 나타난다고 볼 수 있음).
인산화 속도와 저해제 저항성 간의 상관 관계를 보다 명확하게 확인하기 위하여, HER2-HER3 heterodimer 발현 세포 용해액에, Lapatinib, ATP (100uM), 및 magnesium chloride(10mM)와 함께(이 때에도 DGTN은 0.1%로, GDN은 0.01%로 유지해야 함), PTPN1 (Protein Tyrosine Phosphatase, Non-receptor type 1; ProSpecbio, Cat.No. PKA-219)을 처리하고, HER3 Y1289의 인산화 수준을 측정하여, 도 4f에 나타내었다. PTPN1는 탈인산화 효소로서, Tyr 인산화와 탈인산화 과정 사이의 평형을 형성하고, HER2-HER3 heterodimer를 구조적으로는 변화시키지 않으면서 실질적 인산화 속도를 효과적으로 늦추는 역할을 한다. 도 4f에 나타난 바와 같이, PTPN1의 처리 농도가 높아짐에 따라 (도 4f에서 붉은색 그래프(가장 오른쪽)에서 보라색 그래프(가장 왼쪽)로 갈수록), 실질적인 인산화 속도가 느려지며, Lapatinib에 의한 인산화 저해 효과는 증가함 (즉, 더 낮은 농도의 Lapatinib에도 인산화가 저해 됨)을 확인할 수 있다.
실시예
8.
HER2
-
HER3
heterodimer의
인산화를 억제하는 약물의 스크리닝 예시
HER2-HER3 heterodimer의 인산화를 억제하는 후보 약물의 스크리닝 과정(HER2-HER3 heterodimer (in vitro) assay)을 도 5a에 모식적으로 나타내었다.
상기 HER2-HER3 heterodimer (in vitro) assay를 보다 구체적으로 설명하면, 실시예 3의 과정을 참조하여, 웰에 실시예 1에서 준비된 HER2-HER3 heterodimer 포함 세포 용해물 (NRG1-b1 treated SKBR3 extract; 농도는 1mg/ml이며, 웰 당 10ul이 주입)을 첨가해 HER2-HER3 heterodimer를 부착하고, 0.1% DGTN 또는 0.01% GDN 50mM HEPES[pH 7.4], 150mM NaCl, 1% glycerol 를 이용해 남은 세포 용해물을 씻어낸다. 웰에 부착된 HER2-HER3 heterodimer에 ATP (100uM) 및 magnesium chloride(10mM)를 첨가하여 인산화시키고(이 때에도 DGTN은 0.1%로, GDN은 0.01%로 유지해야 함), HER3 pTyr antibody (pTyr detection)를 사용하여 인산화 수준을 측정하였다. 이 때, 스크리닝하고자 하는 약물의 후보 물질(10 uM 양으로 사용)은 인산화 과정에서 ATP 및 magnesium chloride와 함께 투입하였다.
상기 후보 물질은 MCE(MedChemExpress)에서 제공하는 Tyrosine kinase inhibitor library(https://www.medchemexpress.com/screening/Protein_Tyrosine_Kinase_Compound_Library.html)의 280개 화합물을 사용하였다.
상기 280개 후보 물질을 10uM의 양으로 투입시의 HER3 Tyr1289의 인산화 수준을 측정하여 도 5b에 나내고, HER3 Tyr1289 인산화를 약물을 처리하지 않았을 때 기준으로 75% 이상 억제(즉, 인산화 정도가 약물을 처리하지 않았을 때 기준으로 25% 이하)한 33개 화합물을 선정하였다. 상기 75% 이상의 인산화 억제 수치는 측정 오차의 최대치가 23%임을 고려하여 정한 수치로, 각 시험에 따라서 다르게 정해질 수 있다.
상기 선정된 33개 화합물을 1uM 농도로 사용한 것을 제외하고, 앞서 설명한 HER2-HER3 heterodimer (in vitro) assay와 동일한 시험을 수행하여, HER3 Tyr1289의 인산화 수준을 측정하고, 그 결과를 도 5c에 나타내었다.
도 5c에서, HER3 Tyr1289 인산화를 약물을 처리하지 않았을 때 기준으로 75% 이상 억제한 12개 화합물 중 재현성을 나타내는 8개 화합물을 붉은 색으로 표시하였다 (Sapitinib, AEE788, Dacomitinib, PD153035, CUDC-101, PD158780, Pelitinib, 및 Saracatinib).
상기 최종 후보군으로 선정된 8개 화합물은 모두 EGFR에 대한 타이로신 카이네이즈 억제제이다.
상기 선정된 화합물의 HER2-HER3 heterodimer를 발현하는 세포에 대한 저해(사멸) 효과를 확인하기 위하여, 각 세포주에 NRG1-b1 (100ng/ml)과 후보 화합물(1uM)을 함께 처리하고 3일 동안 배양한 후, MTS assay를 통하여 세포주의 생존률을 측정하였다. 상기 세포주로서, HER2-HER3 heterodimer가 잘 발현되는 세포주인 HCC-1419, SK-BR-3, 및 BT-474와, HER2-HER3 heterodimer가 잘 발현되지 않는 세포주인 MCF-7, MDA-MB-231, 및 HCC-1954를 각각 사용하였다. 상기 세포주들은 모두 ATCC에서 입수하였다. 상기 HCC-1419, SK-BR-3, 및 BT-474 세포주들은 HER2 positive cell line으로 HER2 표적 치료에 반응성을 보이지만, HER2-HER3 heterodimer가 형성되면 HER2 표적 치료가 효과를 나타내지 못하게 된다. 본 실시예에서는 상기 세포주에 NRG1-b1을 처리하여 HER2-HER3 heterodimer 생성을 유도하여 시험에 사용하였다. 반면, MCF-7 및 MDA-MB-231는 HER2 negative이며 HER2 표적 치료가 효과를 나타내지 않는 세포들이고, HCC-1954는 HER2 positive cell line이지만 하위 신호전달 단백질에 변이가 생겨 HER2 표적 치료가 효과를 나타내지 않는다. 이들 세 종의 세포주는 HER2-HER3 heterodimer가 중요한 역할을 하지 않을 것으로 예상되어 negative control로 사용하였다.
상기 세포주들에 후보 화합물을 처리하여 얻어진 MTS assay 결과 (세포 증식 신호를 측정하여 표준화함; 후보화합물을 처리하지 않은 경우를 100으로 함)를 도 5d에 나타내었다. 도 5d에 나타난 바와 같이, 상기 도 5c에서 선정된 8개 화합물은 모두 HER2-HER3 heterodimer 양성인 암세포(HCC-1419, SK-BR-3, 및 BT-474)를 선택적으로 사멸시키는 반면, 다른 화합물들은 모두 HER2-HER3 heterodimer 양성인 암세포에 대한 선택적 사멸 효과를 보이지 않았다. 이러한 결과는 HER2-HER3 heterodimer를 이용하여 특정 암에 특이적 치료 효과를 보이는 치료 약물을 효과적으로 스크리닝할 수 있음을 보여준다.
도 5c의 결과에서 가장 우수한 효과가 확인된 3종의 약물(Sapitinib, AEE788, Dacomitinib)을 리간드(NRG1-b1)와 함께 SKBR3에 1시간 또는 18시간 동안 처리한 뒤에, 세포의 활성화 정도를 여러 가지 항체 (pHER3, pAkt, pErk 항체)를 이용한 면역 블롯으로 측정하여, 그 결과를 도 5e에 나타내었다. HER3, Akt, Erk, GAPDH 항체를 이용한 면역 블롯을 컨트롤로 사용하였다. 상기 사용된 항체들은 다음과 같다:
HER3 Ab : ab32121 (abcam)
pHER3pY1289 Ab : 4791L (Cell Signaling Technology)
Akt Ab : 2920S (Cell Signaling Technology)
pAkt Ab : 4060T (Cell Signaling Technology)
Erk Ab : 4695S (Cell Signaling Technology)
pErk Ab : 9101S (Cell Signaling Technology)
GAPDH Ab : 2118S (Cell Signaling Technology).
시간과 18시간 조건에서 3종의 약물 모두 Akt의 인산화와 pErk의 인산화의 저해 효과가 우수하고, 이 중에서 특히 Dacomitinib이 가장 우수한 Akt의 인산화 저해와 pErk의 인산화 저해 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
도 5c의 결과에서 가장 우수한 효과가 확인된 3종의 약물(Sapitinib, AEE788, Dacomitinib)의 HER3 인산화(HER3 pY1289) 저해정도를 측정하여 그 결과를 도 5f에 나타내었다. 기판에 부착된 HER2-HER3 heterodimer에 의한 HER3 Tyr1289의 인산화 변화를 약물 처리 농도에 따라 측정하였다. 도 5f는 HER2-HER3 heterodimer를 면역 침강한 뒤, ATP, Mg2+와 명시된 약물을 각 점에 해당하는 농도로 함께 처리한 뒤에 증가한 HER3의 pY1289의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5g 내지 도 5j는 리간드(NRG1-b1) 유무에 따른 SKBR3에 lapatinib (비교예; 도 5g), dacomitinib (도 5h), CUDC-101 (도 5i), 및 Sapitinib (도 5j)을 처리한 경우의 cell viability를 나타낸 그래프이다. 도 5g에서 보여지는 바와 같이, NRG1-b1을 처리하면 HER2-HER3 heterodimer의 signal이 강화되어, 항암 내성이 발생하고, 이로 인하여 기존의 HER2 표적치료제인 lapatinib의 경우 항암 (암세포 사멸) 효과가 떨어질 수 있다. 그러나, 도 5h 내지 도 5j에 나타난 바와 같이, NRG1-b1을 처리하여 HER2-HER3 heterodimer 형성을 유발하고, dacomitinib, CUDC-101, 및 Sapitinib (이상, HER2 및 HER3에 대한 표적 치료제로서 알려지 바가 없는 약물임)을 처리한 경우, NRG1-b1을 처리하지 않은 경우 (HER2-HER3 heterodimer 생성되지 않음)와 비교하여, 우수하거나, 적어도 동등 이상의 항암 효과를 보임을 확인할 수 있다.
도 5k는 앞서 효과가 확인된 우수 약물 중 하나인 dacomitinib의 저해 성능(항종양 효과)을 SKBR3 이종 이식 쥐에서 확인하는 실험의 개요도이다. 쥐에 SKBR3를 이식(Balb/c nude mouse의 옆구리 진피층 안쪽에 SKBR3 cell 을 개체당 1X10^7개의 양으로 Matrigel (Corning; Cat#356237)과 1:1 비율로 섞고 DPBS(Gibco; LS14190144)에 녹여서 주사함)하여 암을 유발한 뒤에 HER3 리간드인 NRG1-b1를 주사 (50ug/kg의 농도로 DPBS에 녹여서 복강주사) 및 dacomitinib을 경구투여로 투여하면서, 20일 동안 암의 크기 변화를 관찰하였다. 채워진 세모로 표시된 날짜마다 NRG1-b1과 dacomitinib을 투여하였고, 빈 세모로 표시된 날짜에 종양 조직의 크기(부피)를 측정하였다.
도 5k에서 종양 조직 크기 측정 날짜로 표시된 때에 종양 조직의 크기를 측정하여, 그 결과를 도 5l에 나타내었다. 버니어켈리퍼스로 종양 조직에 의해 튀어나온 혹의 크기를 측정하여 종양 조직의 크기를 측정하였다.
도 5m은 lapatinib과 dacomitinib을 단독 처리 (vehicle과 함께 처리)한 후 또는 lapatinib과 dacomitinib을 NRG1-b1과 함께 처리한 경우의 시험 개시 20일이 경과 후 쥐로부터 추출된 암 조직의 최종 무게를 나타낸 그래프이다. Dacomitinib은, lapatinib과 비교하여, NRG1-b1이 함께 처리된 경우에 더 우수한 항암 효과를 갖는 것으로 나타났다. 이로부터 dacomitinib이 NRG1-b1과 관련된 질병에 우수한 효과가 있음이 확인된다. 일 예로 NRG1-b1이 발현되어 HER2-HER3 heterodimer의 signal이 강화되어, 항암 내성에 의하여 lapatinib(HER2 표적치료제)이 효과가 떨어지더라도, dacomitinib을 처방하여 내성을 극복하거나, 또는 항암효과를 극대화할 수 있다.
Claims (13)
- AEE788, 다코미티닙, PD153035, CUDC-101, PD158780, 펠리티닙, 사라카티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, HER2-HER3 헤테로다이머와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, AEE788, 다코미티닙, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 약학 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 HER2-HER3 헤테로다이머와 관련된 질병은 HER2-HER3 헤테로다이머가 존재하거나 검출되는 특징을 갖는 질병인, 약학 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 HER2-HER3 헤테로다이머와 관련된 질병은 HER2-HER3 헤테로다이머가 존재하거나 검출되는 암인, 약학 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 암은 HER2 또는 HER3의 표적 치료제에 대하여 저항성을 갖는 암인, 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물이 처리된 분리된 세포 또는 조직에서 제1 단백질과 제2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 단백질은 HER2 및 HER3가 이합체화된 HER2-HER3 헤테로다이머이고, 제2 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 HER2, HER3, 또는 이들 모두의 하위 단백질인,
HER2-HER3 헤테로다이머가 존재하거나 검출되고 HER2 또는 HER3의 표적 치료제에 대하여 저항성을 가지는 암에 대하여 항암 효과를 갖는 항암제의 스크리닝 방법. - 제11항에 있어서, 상기 HER2 또는 HER3의 표적 치료제는 라피티닙인, 항암제의 스크리닝 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 HER2 또는 HER3의 표적 치료제는 라파티닙인, 약학 조성물.
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Also Published As
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