KR102255717B1

KR102255717B1 - 간암 치료를 위한 경구용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102255717B1
Application number: KR1020190178795A
Authority: KR
Inventors: 장용민; 장사정; 김연희; 엠디 캄룰 이슬람
Original assignee: (주)미래바이오팜
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-05-25
Also published as: US20220370417A1; CN114585361A; WO2021137439A1; EP4085911A1; EP4085911A4

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는, 간암의 치료를 위한 경구용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]

Description

간암 치료를 위한 경구용 약학 조성물 {ORAL PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING LIVER CANCER}

본 발명은 간암 치료를 위한 경구용 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 벤조사이아졸 아닐린(benzothiazole aniline) 유도체를 함유하는 간암 치료를 위한 경구용 약학 조성물에 관한 것이다.

간암은 암종으로 인한 사망의 원인 중 전세계에서 2위를 차지하는 예후가 불량한 악성 종양으로서, 한국을 포함한 아시아 지역에서 특히 발병률이 높다. 간암 환자의 70% 이상에서 근치적 수술이 불가능하고 근치적 절제술을 시행한 경우에도 5년 이내에 다른 부위에서 재발할 확률이 50% 이상이며, 5년 생존률이 12%가 되지 않는다. 또한, 진행성 간암에서 전신 항암요법에 반응할 가능성은 10% 이내로 매우 낮은 실정이다. 따라서, 간암 치료 효과가 뛰어난 간암 치료제에 대한 필요성이 있다. 특히, 한국은 간암 환자가 매년 평균 1만 6천명이 신규로 발생하고, 관련 치료제 시장도 연간 1조 2천억원 가량으로서, 2019년 전세계 간암 치료제 시장 규모는 1조 5천 7백억원에 이른 바, 효과적인 간암 치료제는 그 시장가치가 매우 높다고 할 것이다.

한편, 간암 치료를 위해 임상에서 사용되는 항암제로서, 세포 독성 항암제(세포 자체를 공격하여 세포의 성장과 분열을 억제하는 치료제)인 시스플라틴(cisplatin)은 간암의 종양을 줄어들게 하는 효과, 더 나빠지는 것을 막는 효과가 확인되었으나, 구토, 신장 기능 저하, 전해질 변화, 빈혈, 골수 억제 등과 같은 각종 부작용이 보고되었다. 특히, 암 환자의 일부는 시스플라틴의 1회 투여후 급격한 신장 기능의 저하를 경험한다고 한다. 이에, 이러한 부작용을 예방 또는 완화하기 위하여 기존의 항암제에 비해 독성이 완화된 항암제의 개발에 대한 요구도 크다.

한국특허공개 10-2019-0129738

본 발명의 일 목적은 독성은 완화되고 항암 효과는 우수한, 간암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 전술한 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는, 간암의 치료를 위한 경구용 약제학적 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있었다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

X₁는 NH, O 또는 S를 나타내고,

L은

또는

(n = 0 내지 5)를 나타내며,

A는 화학식 A-1을 나타낸다:

[화학식 A-1]

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 간암의 치료를 위한 것으로서, 이를 경구 투여할 경우 간암 치료의 효과, 구체적으로 간암 종양 크기가 줄어들게 하는 효과가 우수하면서도, 독성이 현저하게 완화된다.

도 1 은 실시예 2의 인간 간암 세포주를 이용한 간암 동물 모델에서의 항암 효과 시험에 따라 3주간 종양 크기 및 체중 변화를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 2는 실시예 2의 인간 간암 세포주를 이용한 간암 동물 모델에서의 항암 효과 시험 21일 후 동물 모델에서 분리한 종양의 상대적인 크기를 촬영한 사진이다.
도 3은 실시예 3의 독성 비교 시험에 따라 측정된 혈청 중 GOT 및 GPT 활성도이다.
도 4는 실시예 3의 독성 비교 시험에서 간암 동물 모델의 약물 투여후 획득한 간과 신장의 조직 사진이다.
도 5는 실시예 4에 따라 간암 동물 모델의 약물 투여후 생존률을 비교한 것이다.
도 6은 실시예 5의 인간 간암 세포주를 이용한 간암 동물 모델에서의 항암 효과 시험에 따라 4주간 종양 크기 및 체중 변화를 나타내는 그래프들을 도시한다.
도 7은 실시예 5의 인간 간암 세포주를 이용한 간암 동물 모델에서의 항암 효과 시험 28일 후 동물 모델에서 분리한 종양의 상대적인 크기를 촬영한 사진이다.
도 8은 실시예 5에 따라 간암 동물 모델의 약물 투여후 생존률을 비교한 것이다.

이하, 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 간암 치료를 위한 경구용 약제학적 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

X₁는 NH, O 또는 S를 나타내고,

L은

또는

(n = 0 내지 5)를 나타내며,

A는 화학식 A-1을 나타낸다:

[화학식 A-1]

상기 화학식 1에서, X₁는 S를 나타낼 수 있다. 또한, L은

(n = 0 내지 5)를 나타낼 수 있다. 따라서, 화학식 1로 표시되는 화합물은 예를 들어 X₁는 S를 나타내고 L은

(n = 0 내지 5)를 나타내는 것일 수 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 1-1로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 1-1]

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 염"은 모 화합물의 약물학적 활성을 유지하는 화합물 염을 의미하는 것으로서, 예를 들어 (i) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 및 인산과 같은 무기산과 형성된 염; (ii) 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르빈산, 팔미트산, 말레인산, 하이드록시말레인산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산 및 톨루엔설폰산과 같은 유기산과 형성되는 염; (iii) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 교체될 때 형성되는 염; (iv) 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민과 같은 유기 염기와의 배위체; 또는 (v) 알기네이트와 같은 아미노산의 염일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 단독으로 포함할 수 있으나, 그에 추가하여 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 더 포함할 수도 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 것일 수 있으며, 부형제 (예를 들어, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 락토스, 소르비톨, 만니톨, 셀룰로오스 등) 또는 희석제 (예를 들어, 생리식염수, 정제수 등)일 수 있다.

또한, 필요에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 이외의 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예를 들어, 결합제, 붕해제, 활택제, 제피제, 필름 코팅 기제, 장용성 필름 코팅 기제, 연질 캡슐 기제, 용해보조제, 유화제, 현탁화제, 안정화제, 완충제, 항산화제, 계면활성제, 감미제, 교미제, 보존제, 점증제, 방향제, 또는 착색제를 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 투여되는 것으로서, 고체 또는 액제 제형의 형태, 구체적으로는 액체 제형의 형태일 수 있다. 고체 제형은 예를 들어, 정제, 캡슐제(연질 & 경질 캡슐제), 산제, 과립제, 환제, 트로키제 등일 수 있으며, 액체 제형은 예를 들어, 엘릭서, 현탁액제, 유액제, 용액제, 시럽제, 리모나아데제 등의 형태일 수 있다. 정제의 경우, 활성 성분(화학식 1의 화합물 또는 이의 염) 이외에도, 락토스, 옥수수 전분 등과 같은 담체, 마그네슘 스테아레이트 등과 같은 활택제, 메틸셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 폴리비닐알코올 등과 같은 결합제, 벤토나이트, 알긴산나트륨 등과 같은 붕해제 등이 통상적으로 추가될 수 있다. 액제의 경우, 활성 성분을 정제수, 생리식염수 등과 같은 담체, 및 필요에 따라 모노스테아린산수크로스 등과 같은 용해보조제, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 안정화제 등과 함께 제제화할 수 있으며, 경구용 수성 현탁액제의 경우, 활성 성분을 현탁화제, 및 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정화제 등과 함께 제제화할 수 있다.

또한, 상기 약제학적 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 불활성율, 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 약제학적 조성물 중의 유효 성분인 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 1주일을 기준으로 0.005 내지 100 mg/kg 체중의 양, 예를 들어 1 내지 10 mg/kg 체중의 양을 1주일에 1회 또는 수회 분할하고, 이를 1일 1회 또는 수회로 나누어 경구 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 치료가 필요한 대상체에게 경구 투여하는 단계를 포함하는, 간암의 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은 상기 경구 투여 단계 이전에 상기 간암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

필요에 따라, 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 간암을 치료하기 위한 다른 항암제와 함께 병용 투여될 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명하고자 하며, 다음의 실시예에 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 간암 세포주에서의 항암 효과에 대한 시험

인간 간암 세포주 HepG2를 대상으로 CCK-8을 이용한 암세포의 세포 생존률 (cell viability) 분석을 다음과 같이 수행하였다. 본 실험에서 본 발명의 화합물로서 상기 화학식 1-1의 화합물이 사용되었다. 참고로, 상기 CCK-8(Cell counting kit-8)는 고수용성 테트라졸륨 염-SST-8을 이용하여 분석이 진행되는데, 상기 분석은 [2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐) (2,4-디설포페닐)-2H-테트라졸륨, 모노나트륨 염]이 전자 매개체의 존재 하에 환원 될 때 수용성 포르마잔 주황색 염료를 생성하며, 세포에서 탈수소 효소에 의해 생성되는 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포의 수에 직접 비례한다는 점을 기반으로 하는 것이다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.

인간 간암 세포주 HepG2는 10% 소 태아 혈청(Fetal bovine serum (FBS)), 1% Antibiotic-Antimycotic가 첨가된 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) 배지에서 성장되었고, 안정화된 세포는 세포 생존률 분석을 위해 1 ×10⁴개/well의 밀도로 200 μL의 배지에 부유 되어 96-well plate의 각 well에 심어졌다. 14시간 이상, 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 부착되고 안정화되기를 기다렸다. 다음 날 성장배지를 제거하고, EMEM serum free 배지 100 μL에 본 발명의 화합물 및 시스플라틴을 다양한 농도(0, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100 μM)로 희석하여 22시간 동안 37℃, 5% CO₂상태에서 배양하였다. CCK-8 용액 10 μL를 각 well에 첨가하고 2시간 추가 배양하였다. 배양이 완료된 플레이트는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 생존율 계산식:

(상기 식에서, A는 대조군 웰에서 측정된 흡광도 값이고, B는 약물이 들어간 웰에서 측정된 흡광도 값이다.)

계산된 값은 GraphPad Prism 응용 프로그램을 이용하여 그래프를 그렸다. 나온 수치의 통계적 유의성은 일원 분산 분석 (One-way ANOVA with Dunnett’multiple comparison test)을 통해 확인하였다. *** p<0.001 vs. Cisplatin의 유의성을 가짐을 나타낸다. 그 결과를 하기 표 1에 나타낸다.

[표 1]

상기 표 1에서 알 수 있듯이 본 발명의 화합물은 간암 세포주에서의 암세포 생존률에 기초하여 계산한 IC₅₀ 값 (μM)이 Cisplatin 에 비해 대략 9배 가량 더 작았고, 이는 본 발명의 화합물이 cisplatin 에 비하여 간암 세포를 현저히 더 잘 파괴한다는 것을 의미한다.

실시예 2. 인간 간암 세포주를 이용한 간암 동물 모델에서의 항암 효과 시험

인간 간암 세포주 HepG2는 10% 소 태아 혈청(Fetal bovine serum (FBS)), 1% Antibiotic-Antimycotic가 첨가된 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) 배지에서 성장되었고, 안정화된 세포는 간암 동물 모델 제작을 위해 5 ×10⁶개/마리의 밀도로 EMEM serum free media: Matrigel 의 1:1 혼합물 (100 μL)에 부유되어 누드 마우스 (5주령, 수컷)의 옆구리 피하로 이식하였다. 3주간 종양이 형성되기를 기다린 후, 종양의 체적이 200 mm³에 이르면, 체중과 종양 크기를 측정하여 무작위로 군을 분리하였다. 마우스를 3개의 군으로 나누고 각 군에 대해, saline 만을 단독으로 정맥 투여하거나 (Saline 투여군 (n=6, I.V.)), NaCl 수용액, HCl 수용액, NaOH 수용액을 이용하여 pH 4로 조정된 Cisplatin을 정맥 투여하거나 (Cisplatin 투여군 (n=6, I.V.)), saline 에 녹인 본 발명의 화합물 (화학식 1-1의 화합물)을 강제 경구 투여하였다 (본 발명에 따른 투여군 (n=6, P.O.)). 투여 간격 및 투여 횟수는 각 군에서 동일하며 3주간, 1주일에 2회 간격으로 1일 1회 투여하였다. 투여 용량은 cisplatin (정맥 투여)의 경우 1회 투여량이 5 mg/kg 이었으며 본 발명에 따른 투여군 (경구 투여)의 경우 1회 투여량이 100 mg/kg 이었다.

투여 직전 마취하여 체중 변화를 관찰하기 위해 몸무게를 측정하였다. 하기 계산식에 의해 시간에 따른 종양 크기의 변화를 관찰하였다.

평균 종양 용적 계산식:

(상기 식에서 A는 장축 길이이고 B는 단축 길이이다.)

전술한 바와 같이 3주간 관찰한 마우스의 체중 변화 및 종양 크기 변화를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있듯이, 간암 동물 모델에서, 본 발명의 화합물을 경구 투여한 경우 체중의 감소가 없는 것으로 보아 전체적으로 약물에 대한 독성은 나타나지 않았으며, 종양이 사라지거나 크기가 현저히 줄어들었음을 확인할 수 있다.

또한, 투여 21일 후, saline군에서 종양의 괴사 시작 시점을 실험 종료 시점으로 지정하고, 실험에 참여한 누드 마우스를 모두 희생하여 옆구리에서 종양만을 분리하고, 종양의 상대적인 크기를 촬영하였다. 촬영한 조직 사진은 도 2에 나타내었다. 도 2에서, 회백색의 점은 종양이 모두 사라져 종양 구분이 힘든 개체가 존재함을 의미한다. 도 2로부터, Saline 투여군이나 Cisplatin 투여군의 경우에는 종양 세포가 남아 있었으나, 본 발명의 화합물을 경구 투여한 경우 종양이 현저히 줄거나 모두 사라졌다는 것을 알 수 있다.

실시예 3. 혈액 및 조직학적 독성 비교 시험

GOT 및 GPT 의 활성 분석에 의해 독성을 비교하였다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다: 혈청 중 GOT 및 GPT 활성 측정은 Reitman-Frankel의 방법에 따라 조제된 시약 kit (아산제약)를 사용하여 측정하였다. 화합물을 투여한 마우스는 실험 종료 시점에 복대정맥에서 혈액을 수거하고, 혈청을 분리하였다. 혈청에 기질액을 가하여 일정시간 가온하면, 혈청 GOT의 작용으로 GOT 측정용 기질액 (Asparatate, a-ketoglutarate 혼합액)에서 oxalacetate와 글루타민산이 생기고, 한편 GPT 작용으로 GPT 측정용 기질액(Alanine, a-ketoglutarate 혼합액)에서 초성포도산(Pyruvate)와 글루타민산이 생긴다. 여기에 정색시액 2,4-Dinitropheny1hydrazone을 가하여, oxaloacetate 또는 Pyruvate의 2,4-Dinitropheny1hydrazone을 생성시켜, 또 NaOH를 가하여 발색시킨 후, 흡광도를 측정하였다 (505 nm). 혈청 중 GOT, GPT 의 활성도는 별도로 작성한 표준 검량곡선에서 산출하였다. 상기 혈청 중 GOT 및 GPT 활성도에 대해 도 3에 도시하였다.

실험 종료 시, 실험에 참여한 누드 마우스의 혈액을 관류하고 간과 신장을 획득하였다. 조직을 4% paraformaldehyde에 고정하고, 파라핀 포매 과정을 거쳐 4 μm 두께의 조직 절편을 제작한 다음, Sirius red staining을 실시하였다. 광학현미경을 통해 조직 사진을 획득하여 도 4에 도시하였다.

도 3 및 도 4에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 화합물의 경구 투여시 간과 신장에서의 독성이 현저히 낮았다.

실시예 4. 생존률의 비교

전술한 실시예 2에 따라 수행된 동물 모델 시험에서 관찰한 약물 투여후 시간에 따른 생존률을 비교하여 도 5에 도시하였다. 도 5에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 화합물의 투여시 생존률이 더 높았다.

실시예 5. 투여 경로 변경에 따른 항암 효과의 비교 시험

인간 간암 세포는 2 ×10⁶개/마리의 밀도로 EMEM serum free media: Matrigel 의 1:1 혼합물 (100 μL)에 부유되어 누드 마우스 (5주령, 수컷)의 옆구리 피하로 이식하였다. 4주간 종양이 형성되기를 기다린 후, 종양의 체적이 100 mm³에 이르면, 체중과 종양 크기를 측정하여 무작위로 군을 분리하였다. 마우스를 4개의 군으로 나누고 각 군에 대해, saline 만을 단독으로 정맥 투여하거나 (Saline 투여군 (n=6, I.V.)), NaCl 수용액, HCl 수용액, NaOH 수용액을 이용하여 pH 4로 조정된 Cisplatin을 정맥 투여하거나 (Cisplatin 투여군 (n=5, I.V.)), saline 에 녹인 본 발명의 화합물 (화학식 1-1의 화합물)을 정맥 투여하거나 (본 발명 화합물의 I.V. 투여군 (n=5, I.V.)), saline 에 녹인 본 발명의 화합물 (화학식 1-1의 화합물)을 강제 경구 투여하였다 (본 발명에 따른 투여군 (n=5, P.O.)). 투여 간격 및 투여 횟수는 각 군에서 동일하며 4주간, 1주일에 2회 간격으로 1일 1회 투여하였다. 투여 용량은 정맥 투여군의 경우 1회 투여량이 5 mg/kg 이었으며 경구 투여군의 경우 1회 투여량이 100 mg/kg 이었다. 투여 직전 마취하여 체중 변화를 관찰하기 위해 몸무게를 측정하였다. 그 결과를 앞서 실시예 1에서와 동일한 방식으로 4주간의 체중 변화, 종양 크기 변화에 대해 측정하여 도 6에 도시하였다. 실시예 2에서와 동일한 방식으로 종양을 분리하여 종양의 상대적인 크기를 촬영하고, 촬영한 조직 사진은 도 7에 나타내었다. 또한, 실시예 4에서와 동일한 방식으로 약물 투여후 시간에 따른 생존률을 비교하여 도 8에 나타내었다. 도 6, 7, 및 8에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 화합물을 정맥 주사 투여한 경우에 비하여 경구 투여하였을 경우, 체중의 변화에 따른 독성 여부 및 항암 효과가 현저히 더 뛰어나다는 것을 알 수 있다.

Claims

삭제
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하기 화학식 1-1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 간암의 치료를 위한 경구용 약제학적 조성물:
[화학식 1-1]
제3항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 치료를 위한 경구용 약제학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체가 부형제 또는 희석제인 것을 특징으로 하는 간암의 치료를 위한 경구용 약제학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 경구용 약제학적 조성물이 액체 제형의 형태인 것을 특징으로 하는 간암의 치료를 위한 경구용 약제학적 조성물.