KR102247784B1 - 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 선충 GABA 수용체의 활성 조절, 살선충 작용, 산란 제어 및 유충 사멸율에 있어서 우수한 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 살선충제의 제조에 이용할 수 있다.

Description

락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물{Composition for controlling harmful organism, including Lactobacillus sakei WiKim0118 strain or its culture}
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 선충 방제용 조성물에 관한 것이다.
선충 감염은 전 세계적으로 작물 생산에 있어서의 큰 스트레스 중 하나이다. 식물 기생성 선충은 주로 연작지 토양에서 대량 발생하여 작물에 막대한 피해를 주는 해충으로 전 세계적으로 해마다 78조 달러의 손실을 가져오고 있다. 이러한 식물 기생성 선충으로는 형태, 가해 양상 및 기주에 따라 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.), 시스트선충(Globodera spp.), 씨알선충(Anguina spp.), 줄기구근선충(Ditylenchus spp.), 줄기선충(Ditylenchus spp.), 뿌리썩이선충(Pratylenchus spp.), 잎선충(Aphelenchoides spp.), 감귤선충(Rotylenchulus spp.) 등이 있다.
이 중에서도, 뿌리혹선충은 작물의 뿌리에 기생하면서 물이나 양분의 이동 통로를 차단하여, 식물체의 비정상적 생육을 야기시키며, 결과적으로 열매의 생산량을 감소시킬 뿐만 아니라, 작물을 고사시키는 등으로 막대한 경제적 손실을 야기한다. 뿌리혹선충은 토양 속에서 식물의 뿌리에 서서히 피해를 주기 때문에 식물의 뿌리를 뽑아 확인하기 전에는 피해상황을 진단하기 어렵다. 따라서, 발생 초기 피해시점에 적절한 방제가 이루어지지 못하여 심각한 피해로 진행되기 쉽다.
국내에서도 특수작물에 대한 시설재배가 활발히 진행되면서 연작으로 인한 뿌리혹선충 피해가 점점 증가하여 농업 생산력을 악화시키는 실정이다. 대표적으로 땅콩 뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria)과 고구마 뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)이 주로 오이, 토마토, 멜론 등의 시설재배 작물에 피해를 주며, 당근 뿌리혹선충(Meloidogyne hapla)은 당근, 인삼 등의 노지 재배작물에 대한 심각한 피해를 초래하고 있다. 더욱이, 이들 선충은 호박, 수박, 참외, 가지, 딸기, 고추, 담배, 땅콩, 무, 상 추, 시금치, 우엉, 양파, 참께, 인삼, 콩, 포도, 복숭아, 장미대목 (찔레) 및 감자 등 다양한 농작물에 대하여 광범위한 피해를 입히고 있다.
뿌리혹선충병을 방제하는 방법으로는 윤작, 휴경, 저항성 품종 등의 재배적 방제법과 담수, 열처리 등의 물리적 방제법, 화학제를 처리하는 화학적 방제법, 그리고 천적을 이용하는 생물학적 방법이 알려져 있다. 그 중에서 저항성 품종이나 비기주 작물을 재배하는 윤작은 효과가 우수하지만, 경제성 있는 작물의 연속적인 재배가 행해지므로 실효성이 낮다. 담수 처리법이나 태양열을 이용한 열처리 등의 물리적 방법도 여름철에만 시행되는 등 기후조건에 영향을 받기 때문에 제한적인 방법이다. 입제 또는 훈증제로 대표되는 화학제는 뿌리혹선충 방제에 광범위하게 사용되어 왔지만, 토양 생태계 파괴, 약해, 잔류 독성 등으로 세심한 주의가 요구되고 있다. 국내에 고시된 살선충제로는 카보입제, 에토프입제, 타보입제, 카두사포스입제, 포스치아제트, 아조포유제, 다조메분제, 메탐소디움 등이 있다.
선충을 퇴치하기 위해서 기존의 다양한 방법으로 제어를 시도해왔으나, 최근 자연 생태계 환경 보전에 대한 중요성 및 및 인체 유해성이 인식되었기 때문에, 새로운 살선충제의 개발이 절실하게 되었다.
이에 따라 친환경적인 방법으로 살선충 미생물을 이용한 여러 가지 사례가 국내외로 보고되고 있는데, 그 중 아쓰로보트리스 속(Arthrobotrys spp.)과 트리토테시움 속(Trichothecium spp.), 파스테리아 속(Pasteuria spp.) 및 바실러스 속(Bacillus spp.) 등의 미생물을 이용한 기생성 선충 방제가 알려져 있으나 (한국공개특허 10-2009-0035368), 실제 농가에서 화학제를 대체할 수 있을 만한 살선충 효과가 미약하거나 실용화 가능성이 낮다는 한계점이 있다.
또한 토양훈증제, 유기물, 태양열 소독등 선충 방제법이 도입되고 있으나 선충 방제 효과가 뚜렷하지 않고, 선충 알의 부화 저해, 발육이나 번식 억제에 대한 효과가 매우 적었다.
이에 본 발명자들은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주의 배양액 상등액이 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)에 대하여 선충 GABA 수용체의 활성 조절, 살선충 작용, 산란 제어 및 유충 사멸율에 있어서 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 유해생물에 대한 방제 활성을 갖는 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물을 식물체, 토양 또는 식물종자에 처리하는 단계를 포함하는 유해생물 방제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주 또는 이의 배양액의 유해생물 방제 용도에 관한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 선충에 대한 방제 효과를 나타낸다.
본 발명자들은 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주의 배양액 상등액을 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)에 대하여 적용한 결과, 선충 GABA 수용체의 활성 조절, 살선충 작용, 산란 제어 및 유충 사멸율에 있어서 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 유해생물에 대한 방제 활성을 갖는 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주 또는 이의 배양액이다.
유해생물은 뿌리혹선충, 시스트선충(Globodera spp.), 씨알선충(Anguina spp.), 줄기구근선충(Ditylenchus spp.), 줄기선충(Ditylenchus spp.), 뿌리썩이선충(Pratylenchus spp.), 잎선충(Aphelenchoides spp.) 및 감귤선충(Rotylenchulus spp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, 뿌리혹선충인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물이다.
유해생물은 뿌리혹선충, 시스트선충, 씨알선충, 줄기구근선충, 줄기선충, 뿌리썩이선충, 잎선충 및 감귤선충으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 예를 들어, 뿌리혹선충인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주는 가바(GABA) 생산 균주로서, 선충에는 흥분성 가바 수용체(excitatory GABA receptor; EXP-1)가 존재하는 것으로 알려져 있다. 흥분성 가바 수용체는 선충 특이적인 것으로서 근육의 이완 기능을 담당하고 있으므로, WiKim0118 균주의 작용으로 인하여 단기적으로는 선충의 움직임을 중지시킬 수 있고, 장기적으로는 사멸에 이르게 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, WiKim0118 균주를 처리함으로써 선충의 운동성이 저하되고, 산란이 제어되고 또한 부화한 어린 선충의 생존율이 억제되었으므로, 이를 방제용 조성물로 활용함으로써 방제 효과를 달성할 수 있다.
상기 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주의 농도는 1 X 104 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 104 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 104 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 105 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 105 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 105 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 106 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 106 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 106 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 107 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 107 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 107 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 108 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 108 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 108 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 109 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml 또는 1 X 109 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 예를 들어, 1 X 109 개/ml 인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액의 농도는 3 내지 8 중량%, 3 내지 7 중량%, 3 내지 6 중량%, 3 내지 5 중량%, 4 내지 8 중량%, 4 내지 7 중량%, 4 내지 6 중량%, 4 내지 5 중량%, 5 내지 8 중량%, 5 내지 7 중량% 또는 5 내지 6 중량%, 예를 들어, 5 중량%인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액은 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 배양하고, 균주를 제거한 후 수득된 배양 상등액, 이의 농축물, 이의 분획물 또는 이의 동결건조물인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물을 식물체, 토양 또는 식물종자에 처리하는 단계를 포함하는 유해생물 방제방법이다.
상기 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주의 농도는 1 X 104 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 104 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 104 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 105 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 105 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 105 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 106 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 106 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 106 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 107 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 107 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 107 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 108 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml, 1 X 108 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 1 X 108 개/ml 내지 1 X 109 개/ml, 1 X 109 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml 또는 1 X 109 개/ml 내지 1 X 1010 개/ml, 예를 들어, 1 X 109 개/ml 인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액의 농도는 3 내지 8 중량%, 3 내지 7 중량%, 3 내지 6 중량%, 3 내지 5 중량%, 4 내지 8 중량%, 4 내지 7 중량%, 4 내지 6 중량%, 4 내지 5 중량%, 5 내지 8 중량%, 5 내지 7 중량% 또는 5 내지 6 중량%, 예를 들어, 5 중량%인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양액은 락토바실러스 사케이 CVL-001 균주를 배양하고, 균주를 제거한 후 수득된 배양 상등액, 이의 농축물, 이의 분획물 또는 이의 동결건조물인 것일 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 유해생물 방제용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 선충 GABA 수용체의 활성 조절, 살선충 작용, 산란 제어 및 유충 사멸율에 있어서 우수한 효과를 나타내므로, 이를 효과적으로 살선충제의 제조에 이용할 수 있다.
도 1은 인체 신경계 GABA 수용체(좌)와 선충 신경계의 GABA 수용체(우)의 메카니즘을 나타낸 모식도이다.
도 2는 선충 특이적 흥분성 가바 수용체 (excitatory GABA receptor; EXP-1)의 활성 조절 결과이다.
도 3은 15종 가바 생성 균주의 살선충 작용을 분석한 운동성 평가 결과 그래프이다.
도 4a는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주에 의한 선충의 산란율 제어 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주에 의한, 부화한 어린 선충의 생존율 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 가바 생성능이 우수한 유산균의 분리
세계김치연구소에서 보유중인 유산균 250종을 3% MSG(monosodium L-glutamate)를 첨가한 5 mL 액체배지에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양한 후, 원심분리(10,000 x g, 5 min)하였다. 원심분리하여 얻은 상등액은 배지 내 GABA(gamma-aminobutyric acid) 생성량을 분석하는 데 사용하였다. 배양액 내 GABA 생성량은 박층크로마토그래피(Thin layer chromatography; TLC)를 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 원심분리(10,000×g, 5 min)하여 얻은 상등액을 TLC 플레이트(Sigma-Aldrich Co., Germany)에 4 ul 점적한 후 아세트산(acetic acid, Merck Co., Germany):1-부탄올(1-butanol, Junsei Co., Japan):물 의 비율을 1:4:5(v/v)로 한 전개용매에 7 cm씩 두 번 전개한 후 0.5% 닌하이드린(ninhydrin, Lancaster Co., England) 용액에 담가 65℃에서 발색하였다. 표준물질로는 MSG와 GABA(standard:γ-aminobutyric acid, Sigma-Aldrich Co., Germany)를 사용하였고, TLC 플레이트(plate) 상에서 같은 위치에 GABA 스팟(spot)을 보이는 균주는 GABA 생성 균주인 것으로 확인하였다.
3% MSG가 함유된 MRS 액체배지 내에서 GABA 스팟이 가장 진하게 나오는 유산균(WiKim0118)을 선발하였다.
실시예 2: 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주의 동정
분리 균주 WiKim0118은 순수 분리한 후 마크로젠(서울)에 의뢰하여 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 상기 분리 균주 WiKim0118의 16S rRNA로 총 1,493 bp의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 1
명칭 WiKim0118 16S rRNA
서열 CTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCACTCTCGTTTAGATTGAAGGAGCTTGCTCCTGATTGATAAACATTTGAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTAAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAAACCTAACACCGCATGGTGTAGGGTTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTTAGGATGGACCCGCGGTGCATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGACCGTGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGTATCTGATAGTAACTGATCAGGTAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGAGGTAACCCTTCGGGGAGCCAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGA
염기서열 분석을 위하여 사용한 범용 프라이머 세트(universal primer set)의 서열은 하기 표 2와 같다.
서열번호 명칭 서열
2 27F 프라이머 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
3 92R 프라이머 GGATACCTTGTTACGACTT
상기 수행한 염기서열을 기초로 GeneBank 데이터베이스(database)에 등록된 정보를 대상으로 Blast 프로그램(www.ncbi.nlm.nhi.gov)에 의해 염기서열의 상동성 검사를 수행하였다. 그 결과, 락토바실러스 사케이 표준 균주 DSM20017(Lactobacillus sakei type strain DSM 20017)와 99.93%의 상동성을 나타냈으므로 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)로 최종 동정하였으며, 락토바실러스 사케이 WiKim0118로 명명하였다.
실시예 3: 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주의 선충 가바 수용체 활성 조절능 확인
도 1에서 확인할 수 있듯이, 포유동물(좌측)에는 억제성 가바 수용체(inhibitory GABA receptor)만 존재하지만, 선충(Caenorhabditis elegans; C. Elegans)(우측)에는 흥분성 가바 수용체(excitatory GABA receptor; EXP-1) 및 억제성 가바 수용체(UNC-49)가 모두 존재한다.
락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주에 의한 상기 수용체의 활성 조절능을 확인하기 위하여, 상기 흥분성 가바 수용체인 EXP-1를 클로닝하여 발현 세포에 도입 후, GABA 30 uM 및 100 uM, 그리고 20배로 희석한 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주의 배양 상등액을 각각 발현 세포에 처리하였다.
구체적으로, 흥분성 가바 수용체의 cDNA 수용체(NCBI Reference Sequence: NM_062828.5)를 합성한 후에 난모세포(Oocyte) 발현 벡터(vector)인 pGEM-HE내에 서브-클로닝(sub-cloning)하여, E. coli(XLI-blue competent cell) 내로 형질전환(transformation) 시키고 LB/앰피실린(Ampicillin) 한천 플레이트(agar plate)에 도포하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
배양된 미생물 콜로니를 채취하여 앰피실린이 첨가된 약 50 cc의 LB 배양액에서 다시 배양하고 키트(mini-prep kit, Qiagen, USA)를 사용하여 플라스미드(plasmid) DNA를 분리하였다. 플라스미드 벡터와 흥분성 가바 유전자의 핵산 절단효소지도를 이용하여 적절한 핵산 절단효소들을 선택 처리하고 아가로즈 겔(agarose gel) 전기영동을 시행 후 제한효소 지도(restriction map)와 핵산 염기 배열을 통해 올바른 DNA를 확인한 후 선택하였다.
선택된 플라스미드 DNA로부터 키트(maxiprep kit, Qiagen, USA)을 이용하여 cDNA를 얻었고, cDNA로부터 cRNA의 합성을 진행하였다. 플라스미드 DNA를 절단효소로 잘라 선형으로 만든 후 단백질분해효소(proteinase) K와 SDS를 처리하여 RNase가 없는 주형(template)을 준비하고 키트(T7 message machine kit, Ambion, USA)를 이용하여 제조회사의 설명서에 따라 cRNA를 합성하였다. EtOH 석출(precipitation)을 통해 얻은 정제된 cRNA는 OD 값 측정 후 1 ug/ul의 농도로 분취(aliquot) 후 -70℃에 보관하여 필요시 사용하였다.
전남대학교 동물 실험 윤리기준에 따라 난모세포를 갖고 있는 암컷의 제노푸스(Xenopus laevis)를 동면 마취시킨 후 외과적 방법으로 난모세포를 꺼내고 배스 솔루션(Ca free bath solution, 구성 mM: NaCl 96, KCl 2 MgCl 1, HEPES 5, pyruvate 2.5)에 두고 콜라겐 분해효소(collagenase, Sigma)로 약 1시간 동안 가열교반(shaking incubation) 후 난포층(follicular layer)을 제거하였다. 그 후 배양액(Bath ND96 solution, 구성 mM, NaCl 98, KCl 1, CaCl2 MgCl 4, HEPES 5, pH 7.4, Ampicillin 0.5, Penicillin l, Streptomycin 10 ul/ml)으로 충분히 씻은 후 현미경하에서 stage V - VI의 성숙한 난모세포를 골랐다.
당일 또는 다음날 풀러(Narishige puller pp-83)를 사용하여 유리 마이크로전극(glass microelectrode)의 끝을 6 내지 8 nm 크기로 만들어 현미경하에서 마이크로인젝터(microinjector)를 이용하여 난모세포 당 50 nl 가바 cRNA를 주입하고 이때 난모세포가 약간 부풀어 오르는 것을 확인하였다. 가바 수용체의 발현을 위해 ND96 용액 속에서 48 내지 96시간 동안 18℃에서 배양시켜 수용체를 발현시킨 후 전기생리 실험을 하였다, 난모세포의 배양 용액은 매일 교환하였다.
두 전극 전압 클램프(Two electrode voltage clamp, OC-725C, Warner Instrument, USA)와 소프트웨어(pClamp software, Axon Instrument, USA)를 사용하여 흥분성 가바 수용체를 통한 이온의 이동에 따른 전류 변화를 관찰 및 결과 분석하였다. 유리 마이크로전극을 풀러로 적당한 크기의 끝으로 만든 후 3M KCl로 채우고 마이크로포르주(microforge)를 이용하여 말단부를 3 내지 5 nm의 크기로 자른 후 저항을 13 microΩ으로 설정하여 유지 전류(holding current)가 0.2 uA 이내인 난모세포를 골라 실험하였다. 난모세포를 5 mm 크기의 기록 챔버(recording chamber)에 놓고 분당 1 ml/min의 속도로 ND 96 frog Ringer's 용액으로 관류시켰다.
실험 전 과정에서 홀딩 전압(holding voltage)은 -80 mV로 하였다. 약물의 관류는 프로그램(pClamp)에 의해 컴퓨터로 작동되는 2개의 솔레노이드 값(solenoid value)을 통하여 이루어졌으며, 흥분성 가바 수용체의 발현의 확인을 위하여 선택적인 가바의 길항제에 대한 반응으로 수용체의 발현을 확인하였다. 각종 약물에 대한 최대 효능이 날 때까지 충분히 관류시켰다. 처리된 단일 성분 가바의 농도는 30, 100 및 300 uM 농도를 처리하여 활성을 측정하였고, 배양액은 20배에서 200배로 ND96 배지로 희석하여 처리하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 다양한 조건하에서 가바 수용체는 크게 활성화되었다. 대조군으로 가바 30 uM의 활성 정도와 상등액의 20배 희석농도에서 유사한 활성을 나타내었다. 흥분성 가바 수용체는 선충 특이적인 것으로 근육의 이완 기능을 담당하고 있으므로, 선충 내에서 작용하게 된다면 단기적으로는 움직임을 중지시킬 수 있고, 장기적으로는 사멸에 이르게 할 수 있을 것으로 예측되었다.
실시예 4: 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주의 살선충 작용 확인
다양한 조건하의 시험관 내에서 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주에 의한 선충의 생장 및 길항작용 활성을 측정하기 위한 실험들을 수행하였다. 대상 선충으로는 장성에 위치한 전라남도 농업기술원에서 실제 농업에 피해를 주는 토양 유해 선충인 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)을 분리하여 사용하였다.
세계 김치연구소에서 제공받은 가바 생성 균주 30종의 살선충 작용을 분석한 후 다시 15종의 균주를 선별하고 반복 실험을 진행하여 분석하였다. 처리 미생물 균주는 배양액 접종 후에 1 X 109 개/ml으로 배양하여 60 mm dish 아가(agar)배지 위에 100 ul를 첨가하고 넓게 펼쳐서 건조하였다. 이로써 선충 배지내에 1 X 108/dish으로 처리되도록 적용하였다. 이후 선충과 알의 수를 측정하여 운동성 평가, 산란 제어 효과 및 어린 선충의 생존율을 비교하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 그 결과 상기 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주(361-2)가 가장 큰 살선충 효과를 나타내었다. 상기 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주(361-2)는 한국미생물보존센터에 수탁번호 KFCC11848P(2019.12.20.)로 기탁 완료하였다.
운동성 평가 값은 미생물 균주를 처리하지 않은 대조군(Con)을 기준으로 환산한 백분율로 표시하였다.
운동성 평가
(Mobility score)		 운동성 평가
(Mobility score)
Con 100 ± 0 215 91.5 ± 3.3
361-2 11.4 ± 4.4 214 77.6 ± 4.4
623 60.1 ± 7.1 227 44.6 ± 6.9
219 35.3 ± 6.3 222 74.6 ± 6.2
212-1 59.2 ± 7.2 554 40.0 ± 6.7
199 36.9 ± 7.0 627 56.1 ± 5.9
211-1 31.5 ± 6.7 638 63.0 ± 7.9
148-1 36.1 ± 7.8 637 76.9 ± 5.1
도 4a, 4b 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 상기 락토바실러스 사케이 WiKim0118 균주(361-2)에 의해서 선충의 산란을 제어하고 부화한 어린 선충의 생존율을 크게 억제하는 것을 나타내었으며, 상기 균주의 2,000배 희석(5 X 105 개/ml) 배지에서 선충이 4일째에 완전히 사멸하는 것을 확인하였다.
Date 1 2 3 4
산란(개) 361-2 10 3.4 ± 1.1 0 0
Control 10 76.1 ± 6.2 279.5 ± 17.3 1120.1 ± 315.5
생존율(%) 361-2 100 10.4 ± 5.4 4.2 ± 1.5 0
Control 100 100 100 100
한국미생물보존센터 KFCC11848P 20191220
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Composition for controlling harmful organism, including Lactobacillus sakei WiKim0118 strain or its culture <130> PN190476 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1493 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus sakei WiKim0118 <400> 1 ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgaacgcact ctcgtttaga 60 ttgaaggagc ttgctcctga ttgataaaca tttgagtgag tggcggacgg gtgagtaaca 120 cgtgggtaac ctgccctaaa gtgggggata acatttggaa acagatgcta ataccgcata 180 aaacctaaca ccgcatggtg tagggttgaa agatggtttc ggctatcact ttaggatgga 240 cccgcggtgc attagttagt tggtgaggta aaggctcacc aagaccgtga tgcatagccg 300 acctgagagg gtaatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 360 agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa 420 gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tggagaagaa tgtatctgat agtaactgat 480 caggtagtga cggtatccaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 540 atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttc 600 ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt gcatcggaaa ctgggaaact 660 tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga 720 agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcat 780 gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaggtg 840 ttggagggtt tccgcccttc agtgccgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 900 acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 960 tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctt tgaccactct 1020 agagatagag ctttcccttc ggggacaaag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1080 gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttattac tagttgccag 1140 catttagttg ggcactctag tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggacgac 1200 gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac 1260 gagttgcgag accgcgaggt ttagctaatc tcttaaaacc attctcagtt cggattgtag 1320 gctgcaactc gcctacatga agccggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1380 gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca 1440 aagccggtga ggtaaccctt cggggagcca gccgtctaag gtgggacaga tga 1493 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 92R primer <400> 3 ggataccttg ttacgactt 19

Claims (12)

  1. 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)에 대한 방제 활성을 갖는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주.
  2. 삭제
  3. 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.) 방제용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서, 균주의 농도는 1 X 104 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml인 것인, 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.) 방제용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 배양액의 농도는 3 내지 8 중량%인 것인, 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.) 방제용 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 배양액은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주를 배양하고, 균주를 제거한 후 수득된 배양 상등액, 이의 농축물, 이의 분획물 또는 이의 동결건조물인 것인, 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.) 방제용 조성물.
  8. 수탁번호 KFCC11848P로 기탁된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.) 방제용 조성물을 식물체, 토양 또는 식물종자에 처리하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.) 방제방법.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 균주의 농도는 1 X 104 개/ml 내지 1 X 1011 개/ml인 것인, 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.) 방제방법.
  11. 제8항에 있어서, 배양액의 농도는 3 내지 8 중량%인 것인, 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.) 방제방법.
  12. 제8항에 있어서, 배양액은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) WiKim0118 균주를 배양하고, 균주를 제거한 후 수득된 배양 상등액, 이의 농축물, 이의 분획물 또는 이의 동결건조물인 것인, 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.) 방제방법.
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