KR20160053113A

KR20160053113A - 신규한 락토바실러스 사케이 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160053113A
Application number: KR1020140149612A
Authority: KR
Inventors: 오세종; 윤보현; 박성수; 박동준; 김범근; 이상훈; 이창호
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 한국식품연구원
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2016-05-13

Abstract

본 발명은 김치로부터 분리된 신규한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주에 의한 병원성 미생물 및 부패성 미생물의 감염에 효과가 있어 약품 조성물, 음료수 정장제, 생균용 조성물, 사료첨가제, 식품첨가제 및 기타 발효제품의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 사케이 및 이의 용도{Novel Lactobacillus Sakei and Use Thereof}

본 발명은 신규한 락토바실러스 사케이 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 김치로부터 분리된 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주에 의한 병원성 미생물 및 부패성 미생물의 감염에 효과가 있어 약품 조성물, 음료수 정장제, 생균용 조성물, 사료첨가제, 식품첨가제 및 기타 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)에 관한 것이다.

인체나 동물의 장에 서식하면서 여러 가지 유익한 작용을 하는 미생물들이 있는데 이러한 미생물을 프로바이오틱스(Probiotics)라고 하며, 여기에 속하는 미생물 중 유산균(Lactic acid bacteria)은 대표적인 프로바이오틱스 중 하나이다.

유산균은 보통 젖산균이라고도 칭하며, 포도당 또는 유당과 같은 탄수화물을 분해 및 이용하여 최종 대사산물로 젖산을 상당량 생산하는 박테리아로, 지금까지 밝혀진 유산균은 300 내지 400여 종류로 알려지고 있다. 유산균은 사람이나 동물의 소화관, 우유, 요쿠르트, 치즈, 김치, 식물 및 토양 등 자연계에 널리 분포되어 있으며, 이들 유산균은 인류의 생활에 직·간접적으로 밀접한 관계를 맺고 있는 유익한 공생체이다. 최근에는 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되어 일반식품뿐만 아니라 건강식품 및 의약품으로써 이용되는 등 그 응용범위가 넓어지고 있으며 여기에 속하는 세균들로는 스트렙토코코스(Streptococcus)속, 페디오코커스(Pediococcus)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacilus)속과 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등이 있다. 상기균들은 그람 양성균으로써 혐기성이거나 편혐기성인 성질을 지니고 있으며 동물의 장내에 서식하면서 동물이 섭취한 영양분 및 섬유소 등을 분해시켜 에너지원으로 사용하여 젖산 및 항생물질을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로써 장내 건강 유지 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다

본 발명자들은 김치로부터 분리된 미생물, 즉 프로바이오틱스(Probiotics) 중 병원성 미생물 및 부패성 미생물의 감염에 효과적이고, 면역증강 효과를 갖는 유산균을 발굴하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명의 신규한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주가 내산성 및 내담즙산성을 나타내고, 유해한 미생물 생육을 억제하며, 면역 증강 효과를 갖는다는 것을 규명함으로써 본 발명의 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 락토바실러스 사케이 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 장내 유해 미생물 생육 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 락토바실러스 사케이 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 락토바실러스 사케이 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 락토바실러스 사케이 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 신규한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) JNU 830 (KCCM11586P) 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이 JNU 830 (KCCM11586P) 또는 이의 배양물을 포함하는 장내 유해 미생물 생육 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이 JNU 830 (KCCM11586P) 또는 이의 배양물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이 JNU 830 (KCCM11586P) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이 JNU 830 (KCCM11586P) 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 신규한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 제공한다.

(b) 본 발명은 본 발명의 신규한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주가 내산성 및 내담즙산성을 나타내고, 유해한 미생물 생육을 억제하며, 면역 증강에 우수한 효과를 갖는다는 것을 규명함으로써, 본 발명의 락토바실러스 사케이 균주는 약품 조성물, 음료수 정장제, 생균용 조성물, 사료첨가제, 식품첨가제 및 기타 발효제품에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 락토바실러스 사케이의 내담즙산성을 평가한 그래프를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 사케이의 내산성을 평가한 그래프를 나타낸 도이다.
도 3은 비병원성 대장균 OP50 섭취 후 병원성 미생물인 스태필로카커스 오리어스 RN6390 섭취군의 생존율을 나타낸 도이다.
도 4는 면역이 결핍된 예쁜꼬마성충을 이용한 유산균의 효과를 재검증하기 위하여 생존율을 측정한 실험결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 발명의 락토바실러스 사케이 JNU 830 (기탁기관: 한국 미생물보존센터, 수탁번호: KCCM11586P, 수탁일자: 2014년 10월 20일)는 김치로부터 분리하여 생리 식염수로 연속적으로 희석한 후 등록특허공보 제10-0871904호에 기재된 브로로클레졸 퍼플(bromocresol purple)이 함유된 MRS 고체 배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 노란색을 나타내는 집락을 얻었다.

1. 내담즙산성 평가

도 1는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이의 내담즙산성을 평가한 그래프이다. 이때, 도 1의 김치에서 총 70개의 집락을 분리하여 내담즙산성을 평가하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 사케이의 담즙산에 대한 내성은 0.5%의 담즙산(Oxgall)이 함유된 MRS 배지에서의 생육 상태를 조사함으로서 알 수 있다.

즉, 본 발명의 락토바실러스 사케이를 18℃에서 18시간 동안 항온수조에서 배양한 다음 원심분리기를 이용하여 셀을 침전시킨 후 생리적 식염수로 침전된 셀을 2회 세척한 후 담즙산이 함유된 배지에서 48시간 동안 생육한 후 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 김치에서 분리된 총 70개의 집락 중 락토바실러스 사케이를 포함한 43개의 집락에서 도 1에 도시된 그래프에서 나타내는 바와 같이 0.5% 담즙산을 함유한 배지에서도 사멸하지 않아 우수한 담즙산 내성을 보였다.

따라서, 본 발명의 락토바실러스 사케이 및 그의 배양물은 사람 또는 동물이 섭취하여도 사람 또는 동물의 답즙산에 의해 사멸되지 않음으로 사람이 섭취할 수 있는 약품 조성물, 식품 조성물로, 사료용 조성물 및 항균 조성물 등으로 이용될 수 있음을 보여 준다.

2. 내산성 평가

우선, pH(hydrogen ion concentration)를 2.5로 조정하여 멸균된 MRS 액체 배지에 0.22 마이크론 필터로 제균시킨 펩신을 배시 밀리리터당 1000 유닛이 되도록 첨가하여 내산성 측정용 인공위액을 준비하였다.

본 발명의 락토바실러스 사케이을 18℃에서 18시간 동안 항온 수조에서 배양한 다음 원심분리기를 이용하여 세포들을 침전시킨 후 생리적 식염수로 침전된 셀을 2회 세척하였다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 셀을 상기에서 상술한 바와 같은 인공위액에 1, 2 및 3시간 배양시킨 후 생균수를 측정하였다. 이때, 상기 생균수 측정시에는 2 중량부의 베타-글리세로 포스페이트가 함유된 MRS 배지를 이용하였다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이의 내산성을 평가한 그래프이다. 이때, 도 2의 김치에서 총 70개의 집락을 분리하여 내담즙산성을 평가하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 김치에서 분리된 총 70개의 집락 중 락토바실러스 사케이를 포함한 16개의 집락에서 pH 2.5에서 3시간 처리했을 때에도 사멸율이 낮다는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 락토바실러스 사케이 및 그의 배양물은 사람 또는 동물이 섭취하여도 사람 또는 동물의 위산에 의해 사멸되지 않음으로 사람이 섭취할 수 있는 약품 조성물, 식품 조성물로, 사료용 조성물 및 항균 조성물 등으로 이용될 수 있음을 보여 준다.

표 1은 본 발명의 일실시예에 따른 최종적으로 내담즙산성과 내산성이 높은 유산균을 선별하여 12종을 나타낸 것이다.

2-1. 예쁜꼬마선충의 준비

예쁜꼬마선충의 알만을 모으기 위하여 60φ 아가(agar) NGM 한천평판(염화나트륨 3g/L, 아가 17g/L, 박토 펩톤 25g/L, 1M 황산마그네슘 1㎖/L, 1M 인산칼륨 25㎖/L, 1M 염화칼슘 1㎖/L, pH6.0)을 준비하고 5M KOH 500μl, NaClO(MW 74.44) 500 μl 및 NGM 버퍼 500 μl을 포함하는 블리칭 솔루션을 준비하였다. 배양 중인 플레이트를 검경하여 예쁜꼬마선충 주변에 1-2개의 알을 확인하였다. 각 아가(agar)에 1 ml씩의 NGM 버퍼로 세척한 후 수거하여 이튜브(e-tube)에 옮겼다. 5000 rpm으로 스핀다운(spin-down)한 다음, 상등액을 제거하였고 최종 부피는 700 μl이 되었다. 그 후, 블리칭 솔루션(bleaching solution) 300 μl을 첨가하여 2분 30초 동안 약하게 볼텍싱(vortexing)을 수행하였다. 검경하여 예쁜꼬마선충의 알을 확인하고 예쁜꼬마선충이 많이 보이면 볼텍싱(vortexing)을 추가로 수행하여 모두 잔여물(debris)이 될 때까지 처리하였다. 5000 rpm에서 1-2분 동안 원심분리를 한 후 상등액을 제거하자 최종 부피가 100 μl이 되었다. 이 과정을 총 3번 반복하였다. 충분히 건조시킨 플레이트(OP50 없는 플레이트)에 100 μl씩 계대하고 이를 검경(30-40 egg/site)하였다. 플레이트에 고루 퍼뜨린 후 건조시켜 배양기로 이동시키고, 이후에 알에서 선충이 깨어난 후 OP50을 도말한 플레이트로 옮겨 L4 상태가 될 때까지 배양하였다.

2-2. 세균 배양 및 분석용 플레이트 준비

비병원성 대장균 OP50을 LB배양액 (Luria-bertani broth; 트립톤 10g/L, 효모추출물 5g/L, 염화나트륨 10g/L)을 이용하여 37℃에서 배양하였다. 스태필로카커스 오리어스 RN6390을 TSA배양액(Trypticase Soy Broth; 트립톤 15g/L, 소이톤 5g/L, 염화나트륨 5g/L)을 이용하여 37℃에서 배양하였다. 김치에 분리된 유산균을 MRS 배양액을 이용하여 37℃에서 배양하였다.

배양된 비병원성 대장균 OP50과 유산균들은 각각 충분히 건조시킨 NGM 플레이트에 100 μl씩 도말하여 사용하였다.

병원성 미생물인 스태필로카커스 오리어스 RN6390은 충분히 건조시킨 NGM 플레이트에 10 μl씩 도말하여 사용하였다.

2-3. 예쁜꼬마선충의 생존률 분석

유산균에 따른 예쁜꼬마선충의 생존률을 분석하기 위하여 L4 상태의 예쁜꼬마선충, 스트렙토마이신 무첨가(streptomycin free) NGM 한천평판(35φ), 스태필로카커스 오리어스 RN6390, OP50 및 유산균(김치에서 분리)을 준비하였다. L4상태의 예쁜꼬마선충을 유산균이 도말되어 있는 NGM 한천배지 위에 옮기고 25℃에서 24시간 동안 배양하였다.

유산균에 24시간 노출된 예쁜꼬마선충을 스태필로카커스 오리어스 RN6390 10 μl이 도말되어 있는 NGM 한천배지 위에 옮기고 25℃에서 배양하면서 매일 현미경을 통해 살아있는 선충의 개수를 계수하였다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 비병원성 대장균 OP50 섭취 후 병원성 미생물인 스태필로카커스 오리어스 RN6390 섭취군은 5일째에 생존율이 50%이하로 떨어진 것으로 나타났다. 하지만 유산균을 섭취 후 병원성 미생물을 섭취군에서는 5일 이후에도 50% 이상의 생존율을 보였으며, 그 중 락토바실러스 사케이는 9일째에 생존율이 50% 이하로 떨어져 대조군보다 약 2배 정도의 생존율을 보였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 면역이 결핍된 예쁜꼬마성충을 이용한 유산균의 효과를 재검증하기 위하여 생존율을 측정할 것으로 도 3에서 균주(strain)별로 가장 높은 생존율을 나타낸 유산균을 섭취시킨 후 스태필로카커스 오리어스 RN6390 섭취 후 매일 현미경을 통해 살아있는 선충의 개수를 계수하였다.

그 결과, 비병원성 대장균 OP50 섭취군과 차이가 없음을 확인하였으며, 유산균의 섭취는 예쁜꼬마성충의 면역을 증진시켜 생존율을 높인 것으로 판명된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11586P

20141020

Claims

락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) JNU 830 (KCCM11586P).
제 1 항에 있어서, 상기 락토바실러스 사케이 JNU 830 균주는 내산성 및 내담즙산성을 나타내는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 사케이 JNU 830 KCCM11586P)
락토바실러스 사케이 JNU 830 (KCCM11586P) 또는 이의 배양물을 포함하는 장내 유해 미생물 생육 억제용 조성물.
락토바실러스 사케이 JNU 830 (KCCM11586P) 또는 이의 배양물을 포함하는 면역 증강용 조성물.
락토바실러스 사케이 JNU 830 (KCCM11586P) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 조성물.
락토바실러스 사케이 JNU 830 (KCCM11586P) 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 조성물.